JPH02176456A - 拘束された均一電界によるゲル電気泳動 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高分子量ＤＮＡのゲル電気泳動に用いる装置に
関する。

（発明の背景） ＤＮＡ分子を大きさに基づいて分離するために電界を用
いてＤＮＡ分子を半固体ゲル中で移動させうろことが知
られている。小型の分子はゲルマトリックスから受ける
抵抗がより小さいため、大型の分子より速やかに移動す
る。約３０．０００塩基までの長さの分子はこの方法で
分離することができるが、これより大型の分子（多数百
方塩基の長さに及ぶもの）はすべてほぼ等しい速度で移
動するため分離するのがより困難である。

近年、標準的な電気泳動に際して経験される制限を少な
（するシステムが幾つか開発された。これらのシステム
はゲル中の電界の方向を周期的に変化させることによる
。たとえばカンタ−（Ｃａ１ｔｏｒ）らの米国特許第４
，４７３．４５２および４，６９５，５４８号は概して
不均一な電界がゲルの平面内で方向変換するシステムに
つき述べている。この電気泳動法が大型のＤＮＡ分子を
移動させるべく作動する機構は必ずしも十分に理解され
てはいないが、カンタ−らは交番電界を付与することに
よりらせん形ＤＮＡ分子がまず一方の電界の全般的方向
に配向する（以下同様）ことによりゲルマトリックス中
へ押込まれると提唱している。さらに彼らは均一電界で
はなく勾配電界を用いることにより剪断効果が生じ、こ
れによってＤＮＡ分子が目的方向に伸展するのが補助さ
れると考えている。カール（Ｃａｒｌｅ　）らの米国特
許第４，７３７，２５１号は電界反転電気泳動法につき
述べている。この方法では電界の方向を１８０°変化さ
せる。一方向において他方向より長時間またはより高い
電圧を用いることによって、正味の移行が達成される。

チュー（Ｃｈｕ　）ら２３４　５ｃｉｅｎｃｅ　１５８
２．１９８６）は“外郭固定式（ｃｏｎｔｏｕｒｃｌａ
ｍｐｅｄ”または“均質電界“電気泳動と称する電気泳
動法につき述べている。この方法はゲルの周りの多数か
所において電位を固定し、これによりゲル内の電界を固
定するための、ダイオードおよび抵抗器の複雑なネット
ワークによる。この方法は不均一電界における電気泳動
にも採用できる。ラース（Ｌａａｓ）らの米国特許第４
，７４０．２８３号明細書およびジェネライン（ＧＥＮ
ＥＬＩＮＥ、商標）と題する１９８７年のペノクマ／・
インスツルメント広告は、ゲルの表面を横切る三次元電
界を与えるべく配向した電極配列を備えたパルス電界勾
配ゲル電気泳動装置につき述べている。サーワー（５ｅ
ｒｖｅｒ　）の米国特許第４．６９３，８０４号は第１
次元での電気泳動ののちゲルを移動させる必要なしに二
次元の電気泳動を行うための装置につき述べている。電
界を長方形に限定しかつ電気の通過を阻止するために、
バリヤーが設けられている。第１次元での電気泳動のの
ちこれらのバリヤーを取除き、新たなバリヤーを設けて
、第１のものに対し９０°に配向した長方形の新たな電
界を形成する。

（発明の要約） 本発明は安い経費で高分子量ＤＮＡ分子を良好に分離す
る電気泳動装置および方法を提供する。

一般にこの装置の電気泳動チャンバーは、高分子量ＤＮ
Ａが均一電界によって直線的ゲルレーン中に分離される
べ（横断方向に付与された２種の電界を拘束する形状を
もつ。本発明は調製用および高感度の作業を含めてゲル
電気泳動に普通に用いられるいかなる厚さのゲルおよび
いかなる導電率の緩衝液についても、高い信頼度で採用
できる。

高導電率の緩衝液は高分子量ＤＮＡの分離に特に好まし
い。電力消費もＤＮＡのゲル電気泳動に慣用される安価
な電源を必要とするにすぎない程度の低水準に維持する
ことができる。ゲルは必要に応じた大きさにすることが
でき、制限は電気的なものよりむしろ物理的なものであ
る。

従って本発明は第１の観点においては、互いに横断方向
に配向した第１および第２電界を発生させるための手段
、ならびに両型界を概して均−電界状に同時に（ｓｉｍ
ｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）形成する形状および外形を有
するゲルボックスを備えた、高分子量ＤＮＡ分子を分離
するためのゲル電気泳動装置である。

“均一電界“とは、特にＤＮＡ試料を装入して電気泳動
するゲルボックスの領域において、ゲルボックス内に発
生する電界の強さ（Ｖ／ｃｒＩＬ）がゲルボックス内の
平均値から２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに
は５％以下の変化を示すことを意味する。“同時に１と
は、ゲルボックスの形状または外形を変化させる必要な
しに、上記手段を始動させていずれかの電界を発生させ
た際に両型界を均−電界状に形成する形状および外形を
有することを意味する。

好ましい形態においては、この手段にはボックスの形状
を形作る壁面により定められるボックス外周付近に配置
された少なくとも４個の電極が含まれる。外周はゲルお
よび緩衝液を受容する形状であり、この外周は互いに９
０〜１３５°の角度で重ねた２個の長方形の形状をもち
、好ましくはこれらの長方形は等しい形状であり、かつ
一方の長方形の少なくとも１個のかどが他方の長方形の
１個のかどと一致し、きわめて好ましくはこれらの長方
形が２個のかどにおいて一致する。ゲルボックスには、
ゲルボックス内における不均一電界の形成を制限べく配
置および配列された不導電体で作成された少なくとも１
個のバフル（ｂａｆｆｌｅ）手段が含まれる。一般にバ
フル手段は第１電界の全般的方向に沿って配向しており
、第２電界内に不均一電界を生じるのを制限すべく配置
および配列されている。きわめて好ましくはバフル手段
は一組のバフル素子であり、この装置はこれらのバフル
素子を多数備えており、少なくとも１個のバフル素子、
好ましくはすべてのバフル素子が第１または第２電界の
全般的方向に浴って配向し、他方の電界に不均一電界が
形成されるのを阻止する。

バフル手段は好ましくはゲルボックスの外周および底面
と接触し、ゲルボックスのものと等しい高さをもつ。き
わめて好ましくは、各バフル素子がゲルボックスの外周
と接触し、第１または第２の均一電界の方向に沿って他
方の均一電界の縁まで伸びている。各電極は一般に同一
電極性の他のすべての電極から不導型体製バフルによっ
て分離されており、バフルはゲルボックス内の媒質を通
してこれらの電極間で直接的な電気伝導が生じるのを阻
止する。他の好ましい形態においては、この装置はＤＮ
Ａ配列決定に用いるのに適しており、２枚のプレートお
よび１個のバフル手段がポリアクリルアミドゲルをはさ
むべく配置される。

第２の観点においては本発明は、ＤＮＡ分子をゲルマト
リックス内に配置し；交番する横断方向に付与された均
一電界を発生させる手段を施し、そして２種の概して横
断方向の均一電界を同時に形成する寸法、形状および外
形を有するゲルボックス内にゲルマトリックスを配置し
、ゲルマトリックスをこれらの交番電界下に置く工程を
含む、高分子量ＤＮＡ分子の分離法である。

本発明の他の特色および利点は好ましい形態に関する以
下の記述および特許請求の範囲の記載から明らかであろ
う。

（好ましい形態の説明） 構造 本発明に用いられる電気泳動セルの一例は、般にＸ字形
を有し、Ｘ−ボックスと呼ばれる。互いに１２０°の角
変で交番する均一な電界が付与される。電界の均一性は
本発明の電気泳動セルの形状によって達成される。

第１および２図を参照すると、Ｘ−ボックス１０は不導
電体、たとえばアクリル系プラスチックの平らな底面１
２を備えている。垂直壁面１４は端面２０．２２．２４
および２６と合わせて外周を定め、底面はゲル１５およ
び緩衝液を収容するための容積を定める。バフル素子１
６．１７がそれぞれ端面２０．２６および端面２２．２
４から伸びている。バフル素子、壁面および端面もすべ
て不導電体で作成される。バフル素子は一般に底面およ
び端面に対し垂直に配置され、これらに結合している。

壁面、端面およびバフルは一般に同一の高さ、Ｈｌたと
えば約２〜３ｃＩｎのものであり、これＫよりボックス
はゲル、およびゲルを完全に浸漬するのに十分な容量の
電気泳動用緩衝液を収容する。

セルの基本的形状は、共通の中心をもち、長方形の端面
が１２面構造の４面を形成すべく配置された、互いに１
２０°の角度で重ねられた２個の等しい長方形である。

各長方形はボックスを横切って必襞な電位（十“および
“−“とじて示される）を付与すべく端面２０．２２．
２４および２６に沿って配置された多数の小電極対１８
（たとえば６個が図示されている）を備えている。不導
電性バフル１６．１７が各電極１８間に、各端面に沿っ
て、それらの各長方形の側面に平行に配置される。バフ
ルはそれらの各長方形の端面２０．２２．２４および２
６から２個の長方形に共通な領域の縁まで伸びている。

この共通な領域は点線３０．３２．３４および３６によ
り示されるひし形の形状である。各バフル素子はそれが
含まれる長方形の長さに平行に配向し、従ってバフル素
子はその長方形の長さに沿って設定された電界の均一性
にほとんど影響を与えない。各バフルは、そのバフル素
子を含まない長方形の長さに沿った電界の不均一性を制
限すべく配置および配列されている。従って各素子は一
方の長方形の端面から他方の長方形の最も近接する縁ま
で伸びている。さらに各電極は同一極性をもつ他のすべ
ての電極からバフル素子によって分離されている。

第４図を参照すると、ゲルボックス１０にはオフ状態に
ある電極間で電流が流れるのを防ぐべく断路された各電
極１８が配線されている。これは各電極をダイオード４
０により接続することにより達成される。この配線プラ
ンはわずか２本の電線、入力１および入力２と表示され
るものによって接続しうるという付加的利点をもつ。入
力１が正であり、入力２が負である場合、電流は一方の
長方形を流れ；入力が逆転すると、電流は他方を流れる
であろう。この簡単な様式によってＸ−ボックスを安価
な反転式制御器、たとえばＰＰＰＰｌ−２００（リサー
チ：ＭＡ）と共に用いることが可能となる。再び第１図
を参照すると、これらのダイオードは不注意による破損
の機会を少なくするためにプラスチック材料３３で覆わ
れている。

ゲルボックス１０内の緩衝液の温度およびｐＨの均一性
を維持するために、ゲルを走行させるために用いる緩衝
液を再循環させることが望ましい。

緩衝液を再循環させる流路は細く保たれ、従ってそれら
を通る電流はご（わずかである。例示にすぎないが、緩
衝液再循環口のプランが第３図に示される。細い（たと
えば直径１〜２　ｍｍ　）の流路４２が側壁１４を取付
ける前にボックス１０の底面に形成される。ボックス１
０の外側にある流路はボックス１０に接着されたプラス
チックストリップにより覆われ、２か所の開口４４以外
はすべてシールされたシステムを与える。緩衝液が一方
の開口から他方へとポンプ送りされる。この様式の利点
は、それが最も必要な場所、すなわち最長バフルの領域
にお（・て最大量の再循環流が起こることである。

操作法 第１および２図を参照すると、長方形の一方の両端２２
．２４間に電位が与えられた場合、この長方形を横切っ
て電界３８が形成される。この長方形内のバフルは電界
の方向に平行に配向しており、従って電界に影響を与え
ることはない。しかし電圧を印加されていない長方形内
のバフルはこの電界に対して６０°の角度で配向されて
おり、従って電界を概して長方形の形状に拘束する。概
して長方形の形状に拘束された電界はほぼ均一である。

バフルを備えた、または備えていないＸ　−ボックス内
のゲル領域における電界の強さおよび方向を測定したも
のを第５〜５Ｅ図、および６〜６０図に示す。これらの
図は、バフルが設げられている場合ゲルボックス内のゲ
ル領域の電界の強さの変動は６．６％以内で均一であり
、バフルが無い場合は５０％程度も変動する可能性があ
ることを証明する。第５および５Ａ、ならびに６および
６Ａ図において電界の強さおよび方向は、各線の長さに
より、およびＸ−ボックス内の種々の位置に関する矢印
の頭により表わされる。バフルが無い場合は電界の強さ
が大幅に変動し、バフルがある場合これは均一な大きさ
および方向である。第５Ｂ図は２種の電界における電界
の強さの測定値を重ねたものを表わし、これを各Ｘ−ボ
ックスにつきそれぞれ第５Ｃおよび６Ｂ図にまとめる。

これはゲルを用いてＤＮＡにより経験した全般的な電界
の強さおよび方向である。バフルを備えていないボック
スについては電界の強さおよび方向は直線から有意にゆ
がんでいるが、バフルを備えたボックスについては電界
の強さおよび方向はゆがんでいない。第５Ｄ図は電界の
強さを測定するためのグリッドを示す。これらの測定結
果を第５Ｅおよび６０図に示す。電界の強さ（Ｖ／ｃｒ
！Ｌ）を示す。バフルが設けられている場合、電界の強
さの測定値はゲル全体に関する平均値から３．３％以上
変動することはないが、バフルが無い場合は５０％以上
変動する。従って本発明の場合、電界は均一である。

第１図を参照すると、標準的ゲル１５をバフル装填した
Ｘ−ボックス１０の底面に乗せた状態で配置し、２種の
長方形の電界を交互に等しい期間（たとえば１０〜６０
秒間）付与する。ゲル内を移動するＤＮＡ分子は１２０
°方向転換したジグザグの経路をたどり、結果的には矢
印４９により示す直線的な正味移行を示す。

操作の原理は緩衝液の導電率、ボックス内の緩衝液の深
さ、およびボックスの寸法とは無関係であり、Ｘ−ボッ
クスはいかなる寸法にも容易に設計することができる。

他の形態 他の形態は前記の特許請求の範囲に示される。

たとえば本発明のゲルボックスおよびその使用法をＤＮ
Ａ配列決定用に調整することができる。標準的な配列決
定用ゲルを２枚のガラス板間に調製し、電界を均一とな
るように拘束するためにガラス板間に適合する０、　４
　ｍｍ　（またはこれ以下の厚さ）のプラスチック製ス
ペーサーを挿入する。たとえば第７図を参照すると、電
気泳動は不導電体、たとえばガラス製の２枚の平板６０
．６２０間に装入したゲルを用いて行われる。２枚の平
板は不導電体、たとえばプラスチックの薄層からなる外
周およびバフル手段６４によって一般に１ｙ＋ｍ以下の
一定間隔に保たれる。この外周およびバフル手段はＸ−
ボックスについて述べたと同様な外周およびバフル素子
を形成すべく形作られる。電気泳動はこの装置を水平位
に置いて行われる。この位置で下側平板は外周およびバ
フル手段よりあらゆる方向において大きい限り、いかな
る寸法および形状であってもよい。上側平板は外周およ
びバフル手段全体を覆うが、ただしこれは両方の長方形
の各末端にゲルへの入口６６を備えており、従って緩衝
液を収容した緩衝液チャンバー（図示されていない）お
よび電極はゲルと接触しうる。少なくとも１個の緩衝液
チャンバーおよび電極が各長方形の各末端に存在する。

上側平板はゲルに試料を施すために上側平板を貫通した
孔６８をも含む。

幾何学的形状はＸ−ボックスのものと同様である。

平板間のゲル材料はポリアクリルアミドまたはその均等
物である。この種の装置は１，５００塩基までのＤＮＡ
分子の分離に適しており、これによって標準的な配列決
定用ゲルから得られるより多量の情報がＤＮＡ配列に関
して得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の電気泳動セルのそれぞれ
等測投影図および上面図である。 第３図は電気泳動セルにおける再循環口を示す略図であ
る。 第４図は電気泳動セルの配線の模式図である。 第５．５Ａおよび５Ｂ図は電気泳動中のセル領域の電界
の強さおよび方向を示す、バフルを備えていない電気泳
動セルの上面図であり、第５Ｃ図はこれらの電界の強さ
のベクトル和を示し、第５Ｄ図は電界の強さを測定する
ために用いるグリッドの配置を示し、第５Ｅ図は一電界
における電界の強さの数値（Ｖ／ｃ！ｎ）を示す。 第６および６Ａ図は電気泳動中のセル領域の電界の強さ
を示す、バフルを備えた電気泳動セルの上面図であり、
第６Ｂ図は電界の強さのベクトル和を示し、第６Ｃ図は
一電界における電界の強さの数値（ｖ／ｃｒＩＬ）を示
す。 第７図はＤＮＡ配列決定に用いるのに適した電気泳動セ
ルの等測投影図である。 これらの図忙おいて記号は下記のものを表わす。 １２：入力 １０：Ｘ−ボックス １２：底面 １４：壁面 １５ニゲル １６．１７：バフル素子 １８：電極 ２０．２２．２４．２６：端面 ３８：電界 ４０：ダイオード ４２：緩衝液流路 ４４　： ６０． ６４： ６６　： ６８　＝ ４２の開口 ６２：平板 外周およびバフル手段 ゲルへの入口 試料装入用の孔 図面の浄書（内容に変更なし） ＭＨＪＺ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５Ｄ ＦＩＧ、７ 事件の表示 ３１シ成１年 特許願第２０９９８８号 発明の名称 拘束された均一電界によるゲル電気泳動補正をする者 事件との関係　　特許…願人 住所 名　称　　エムジエイ・リサーチ・インコポレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、互いに横断方向に配向した第１および第２電界を発
   生させるための手段、ならびに 第１および第２電界の双方を概して均一電界状に同時に
   形成する形状および外形を有するゲルボックス からなる高分子量ＤＮＡ分子を分離するためのゲル電気
   泳動装置。 ２、該手段が少なくとも４個の電極からなる、請求項１
   に記載の装置。 ３、ゲルボックスがゲルボックスの形状およびゲルボッ
   クスの外周を定める壁面を備え、該外周および底面が一
   緒になってゲルおよび緩衝液を受容するための容積を定
   め、該外周が９０〜１３５°の角度で互いに重ねて配置
   された２個の長方形の形状を有する、請求項１に記載の
   装置。 ４、電極がボックスの外周領域に配置された、請求項２
   に記載の装置。 ５、長方形が等しい形状を有し、一方の長方形の少なく
   とも１個のかどが他方の長方形の１個のかどと一致する
   、請求項４に記載の装置。 ６、ゲルボックスが不導電体で作成されたバフル手段を
   含み、該バフル手段がゲルボックス内に不均一電界の形
   成を制限すべく配置および配列されている、請求項１に
   記載の装置。 ７、バフル手段が一電界の全般的方向に沿って配向して
   いる、請求項６に記載の装置。 ８、バフル手段が第１電界の全般的方向に沿って配向し
   ており、かつ第２電界における不均一電界の形成を制限
   すべく配置および配列されている、請求項７に記載の装
   置。 ９、バフル手段が複数のバフル素子からなる、請求項７
   または８に記載の装置。 １０、複数のバフル素子が第１電界の全般的方向に沿っ
   て配向しており、かつ第２電界を概して均一となるよう
   に拘束すべく配列されている、請求項９に記載の装置。 １１、バフル手段がゲルボックスの外周と接触している
   、請求項６に記載の装置。 １２、バフル手段がゲルボックスの底面と接触している
   、請求項６に記載の装置。 １３、バフル手段がゲルボックスのものと等しい高さを
   有する、請求項１２に記載の装置。 １４、複数のバフル手段がゲルボックスの外周と接触し
   、かつ第１の均一電界の全般的方向に沿って第２の均一
   電界の縁まで伸びている、請求項９に記載の装置。 １５、各電極が不導電体で作成されたバフル素子によっ
   て同一極性の他の電極から分離されており、該バフル素
   子がゲルボックス内に配置された媒質による、同一極性
   の電極間での直接電気伝導を阻止する、請求項２に記載
   の装置。 １６、ゲルボックスがそれらの間にゲルをはさむ状態で
   配置された２枚の不導電性平板からなる、請求項１に記
   載の装置。 Ｉ７、ゲルボックスが長さ１，５００塩基以下のＤＮＡ
   分子を分離するための寸法および形状を有し、かつ平板
   間にバフル手段を含む、請求項１６に記載の装置。 １８、ゲルボックスがポリアクリルアミドゲルからなる
   、請求項１７に記載の装置。 １９、ＤＮＡ分子をゲルマトリックス内に配置し、交番
   する横断方向に付与された均一電界を発生させるための
   手段を施し、そして ２種の概して横断方向の均一電界を同時に形成する形状
   および外形を有するゲルボックス内にゲルマトリックス
   を配置し、該ゲルマトリックスを交番電界下に置く工程
   からなる、高分子量ＤＮＡ分子の分離法。