JPH02152991A - 大麦毒素からの免疫毒素 - Google Patents
大麦毒素からの免疫毒素Info
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- C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は複合免疫ｍ Ｍ （Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｍｍ
ｕｎｏｔｏｘ ｒ ｎ）及び複合免疫毒素の製法を提供
するものである。
ｕｎｏｔｏｘ ｒ ｎ）及び複合免疫毒素の製法を提供
するものである。
免疫毒素は抗体に共有結合（複合）した毒性物質を含有
する分子である。標的抗原に対して特異的に反応する能
力があるため、この抗体は毒素の運搬ベヒクルとして働
く。反対に、標的又は非標的細胞の表面に結合しないと
いうことはこの毒素の望ましい特性である。最近の技術
により、毒素と複合されて癌治療用の免疫毒素を製造し
うる広範囲の好適な七ツク［Ｉ−ナル抗体が得られる（
Ｂｊｏｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ４５
． １２１４〜１２２１゜１９８６参照）。
する分子である。標的抗原に対して特異的に反応する能
力があるため、この抗体は毒素の運搬ベヒクルとして働
く。反対に、標的又は非標的細胞の表面に結合しないと
いうことはこの毒素の望ましい特性である。最近の技術
により、毒素と複合されて癌治療用の免疫毒素を製造し
うる広範囲の好適な七ツク［Ｉ−ナル抗体が得られる（
Ｂｊｏｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ４５
． １２１４〜１２２１゜１９８６参照）。
抗体に４索を複合させるには種々の方法がある。
しばしば、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ビリジル
ジチ′Ａ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテ
［に官能性架橋結合剤が抗体と毒素との闇の１！Ａ橋を
行なうために使用される。免疫ｉＦ５索を形成する１例
としては、５ＰＤＰを抗体と反応させて、抗体の−ＮＨ
２１を含むペプチド結合を介してピリジルジチオンに共
有結合している抗体からなる生成物を形成する。この方
法で「活性化した」抗体を、次いで、例えば、−３Ｈ（
スルフヒドリル又はチオール）基を含有する毒素と結合
さける。毒素のスルフヒドリル基がチオピリジンを置換
して、活性化された抗体と毒素との間に新しいジスルフ
ィド結合を形成する。５ｐｏｐを他の架橋結合剤に代え
ることにより、活性化された抗体とお索との間の結合阜
にブ・オニ−チル又はアミド結合を形成することも可能
である［ Ｐａ５ｔａｎら、Ｃｅ１ｌ ４７： ６４
１〜６４８ 、 （１９８６） ｘ Ｇｈｏｓｅら、
Ｍｅｔｈ ｎｚｍｏｌ ９３： ２８０〜３３
３ 、 （１９８３） ：Ｇ１１ｌｉｌａｎｄら
、ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔ、 、Ａ、ｃａｄ 、３ｅｉ、
。
ジチ′Ａ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテ
［に官能性架橋結合剤が抗体と毒素との闇の１！Ａ橋を
行なうために使用される。免疫ｉＦ５索を形成する１例
としては、５ＰＤＰを抗体と反応させて、抗体の−ＮＨ
２１を含むペプチド結合を介してピリジルジチオンに共
有結合している抗体からなる生成物を形成する。この方
法で「活性化した」抗体を、次いで、例えば、−３Ｈ（
スルフヒドリル又はチオール）基を含有する毒素と結合
さける。毒素のスルフヒドリル基がチオピリジンを置換
して、活性化された抗体と毒素との間に新しいジスルフ
ィド結合を形成する。５ｐｏｐを他の架橋結合剤に代え
ることにより、活性化された抗体とお索との間の結合阜
にブ・オニ−チル又はアミド結合を形成することも可能
である［ Ｐａ５ｔａｎら、Ｃｅ１ｌ ４７： ６４
１〜６４８ 、 （１９８６） ｘ Ｇｈｏｓｅら、
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３ 、 （１９８３） ：Ｇ１１ｌｉｌａｎｄら
、ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔ、 、Ａ、ｃａｄ 、３ｅｉ、
。
ＵＳ△ ｖｏｌ、 ７５ ｐ５３２６． （１９
７８） ］ 。
７８） ］ 。
対象の毒素に一８Ｈ括がなく、上記の架橋結合法を望む
揚台には、毒素内に新しい一８Ｈ基を導入する必要があ
る。これは、例えば２−イミノチオランのようなチオー
ル化剤を使用することにより達成される［Ｊｕｅら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｉ １７ ： ５３９９〜５４０６ （１
９７８） ： Ｌａｍｂｃｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、
１７： ５４０６〜５４１６ （１９７８） ］。こ
のチオール化剤は毒素のＮＨ４Ｉと共有結合を形成する
。次に、チオール化した毒素を活性化した抗体と反応さ
せて免疫毒素を製造する。５ＰＤＰを含めた可能なチオ
ール化剤は、Ｃｕｍｂｅｒら、 ｅｔｈ −ｎＺ
ｍｏｌ １１２゜２０７〜２２５（１９８５）に概説
されている。
揚台には、毒素内に新しい一８Ｈ基を導入する必要があ
る。これは、例えば２−イミノチオランのようなチオー
ル化剤を使用することにより達成される［Ｊｕｅら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｉ １７ ： ５３９９〜５４０６ （１
９７８） ： Ｌａｍｂｃｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、
１７： ５４０６〜５４１６ （１９７８） ］。こ
のチオール化剤は毒素のＮＨ４Ｉと共有結合を形成する
。次に、チオール化した毒素を活性化した抗体と反応さ
せて免疫毒素を製造する。５ＰＤＰを含めた可能なチオ
ール化剤は、Ｃｕｍｂｅｒら、 ｅｔｈ −ｎＺ
ｍｏｌ １１２゜２０７〜２２５（１９８５）に概説
されている。
免疫毒素を製造するのに好適と思われる多くの毒素が植
物中で同定されてきている［Ｃｏｌｅｍａｎ及びＲｏｂ
ｅｒｔＳ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ 、 Ｂｉｏｐｈ ｓ
、 ＡＣｔａ ６９６． ２３９〜２４４（１９８２）
： Ｓ Ｎｒｐｅ及び３ ａｒｂｉｃｒｉＦ −Ｌｅ
ｔ旦ｒｓ １９５． １〜８（１９８６） ］。
物中で同定されてきている［Ｃｏｌｅｍａｎ及びＲｏｂ
ｅｒｔＳ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ 、 Ｂｉｏｐｈ ｓ
、 ＡＣｔａ ６９６． ２３９〜２４４（１９８２）
： Ｓ Ｎｒｐｅ及び３ ａｒｂｉｃｒｉＦ −Ｌｅ
ｔ旦ｒｓ １９５． １〜８（１９８６） ］。
しかしながら、免免疫系の製造において使用に成功した
毒素の数は比較的少ない。これらには、ジフテリア毒素
、シュード玉ナス外毒素Ａ、リチン。
毒素の数は比較的少ない。これらには、ジフテリア毒素
、シュード玉ナス外毒素Ａ、リチン。
アブリン、アメリカＡ７マゴボウ抗ウィルス蛋白質。
サボリン及びゲロニンがある（ＰａＳｔａｎら、上記参
照）。免疫毒素の製造に、１１３いては他の毒素を使用
する方法を見出す必要がある。
照）。免疫毒素の製造に、１１３いては他の毒素を使用
する方法を見出す必要がある。
ここで、我々は、新しい一連の免疫毒素の製造に使用し
つる毒素として大麦毒素を同定した。大麦ｉ５に素は大
麦の種子から単離された約３０． ＯＯＬ／ルトンの蛋
白質である（ＣＯｌｅｍａｎ及びＲｏｂｅｒｔｓ 、上
記参照）。この毒素はリポソーム不活性化蛋白質（ＲＩ
Ｐ）として知られている毒素群の１つてある。このよう
な蛋白質からなる免疫毒素は、移植物と受容物との反応
を防ぐ目的で、骨髄の異積移植物からＴ−リンパ球を除
去するために使用されている。
つる毒素として大麦毒素を同定した。大麦ｉ５に素は大
麦の種子から単離された約３０． ＯＯＬ／ルトンの蛋
白質である（ＣＯｌｅｍａｎ及びＲｏｂｅｒｔｓ 、上
記参照）。この毒素はリポソーム不活性化蛋白質（ＲＩ
Ｐ）として知られている毒素群の１つてある。このよう
な蛋白質からなる免疫毒素は、移植物と受容物との反応
を防ぐ目的で、骨髄の異積移植物からＴ−リンパ球を除
去するために使用されている。
本発明の目的は、比較的安価で入手し易い大麦毒素から
形成される一連の新しい免疫毒素を提供することである
。本発明の目的は、又、このような免疫毒素の製法を提
供することである。本発明の特徴は、製造される免疫毒
素が毒素の細胞毒性を保持していることである。これら
及び他の［１的、特徴及び利点は本発明により達成され
る。すなわち、本発明は、（Ｉ）大麦毒素の約２つのア
ミン基に結合基を導入して生物活性で複合可能なｔｊｉ
７１ （ＣＯｎｊＵＯａｔａｂｌｅ）を製造し、そし
て（■）生物活性な毒素と活性化した抗体とを反応させ
て免疫毒素を！！！Ｊ造するステップからなる複合免疫
毒素の製法を提供する。
形成される一連の新しい免疫毒素を提供することである
。本発明の目的は、又、このような免疫毒素の製法を提
供することである。本発明の特徴は、製造される免疫毒
素が毒素の細胞毒性を保持していることである。これら
及び他の［１的、特徴及び利点は本発明により達成され
る。すなわち、本発明は、（Ｉ）大麦毒素の約２つのア
ミン基に結合基を導入して生物活性で複合可能なｔｊｉ
７１ （ＣＯｎｊＵＯａｔａｂｌｅ）を製造し、そし
て（■）生物活性な毒素と活性化した抗体とを反応させ
て免疫毒素を！！！Ｊ造するステップからなる複合免疫
毒素の製法を提供する。
好ましい実施態様では、活性化した抗体との結合に使用
しうる又は使用しうるようになりうるチオール又はジス
ルフィド基を含有する結合剤に、大麦ｉｉ Ｘの２個以
下のアミノ基を結合させる。
しうる又は使用しうるようになりうるチオール又はジス
ルフィド基を含有する結合剤に、大麦ｉｉ Ｘの２個以
下のアミノ基を結合させる。
本発明の利点は、抗体の親和性及び特異性あるいは毒素
の細胞毒性のいずれも、複合 （Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）法により破壊されないとい
うことである。我々は、毒素に導入した一８Ｈの平均数
が５に近付く又は５を超えるにつれ、チオール化した毒
素の溶解度（従って、収Ｉｌ）が実質的に減少すること
を見出した。我々は、又、毒素に８人された−・ＳＨ基
の平均数が２を超えると大麦毒素の活性が失われること
も知得した（第３図参照）。従って、チオール化剤は、
毒素分子肖り平均２個以ドの−ＮＨ２ｕと反応するのが
好ましい。
の細胞毒性のいずれも、複合 （Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）法により破壊されないとい
うことである。我々は、毒素に導入した一８Ｈの平均数
が５に近付く又は５を超えるにつれ、チオール化した毒
素の溶解度（従って、収Ｉｌ）が実質的に減少すること
を見出した。我々は、又、毒素に８人された−・ＳＨ基
の平均数が２を超えると大麦毒素の活性が失われること
も知得した（第３図参照）。従って、チオール化剤は、
毒素分子肖り平均２個以ドの−ＮＨ２ｕと反応するのが
好ましい。
チオール化の程度は平均で表わされるので多少は変化し
つる。この平均は少なくとも０．５かつ２．０以下であ
ることが好ましい。
つる。この平均は少なくとも０．５かつ２．０以下であ
ることが好ましい。
第１図は、活性化したモノクローナル抗体の製造に５Ｐ
ＤＰを使用し、その優に、遊離スルフヒドリル基を含有
する毒素（「丁」と表わす）に複合することを示す図式
化した概略図である。
ＤＰを使用し、その優に、遊離スルフヒドリル基を含有
する毒素（「丁」と表わす）に複合することを示す図式
化した概略図である。
第２図は、２−イミノチオランを使用して大麦Ｒｍ （
ｒＢＴＪと表わす）にスルフヒドリルを導入し、続いて
活性化したモノクローナル抗体に複合することを示す図
式化した概略図である。
ｒＢＴＪと表わす）にスルフヒドリルを導入し、続いて
活性化したモノクローナル抗体に複合することを示す図
式化した概略図である。
第３図は、網状赤血球溶菌液（Ｉｙｓａｔｅ）からのリ
ポソームを使用するａｍを含まない蛋白質合成系におけ
る、大麦ＦＩｊＷｉ及び２−イミノチオランでチオール
化した誘導体の相対毒性を示すグラフである。
ポソームを使用するａｍを含まない蛋白質合成系におけ
る、大麦ＦＩｊＷｉ及び２−イミノチオランでチオール
化した誘導体の相対毒性を示すグラフである。
第４図は、トリチウムＦ！識したロイシンの取込みアッ
セイを使用した、非複合大１７ＲＪｌ！及びチオール化
した誘導体と比較した大麦毒素免疫毒素の結腸癌セルラ
イン（ＨＴ−２９）に対するｉｎ ｖｉｔｒ。
セイを使用した、非複合大１７ＲＪｌ！及びチオール化
した誘導体と比較した大麦毒素免疫毒素の結腸癌セルラ
イン（ＨＴ−２９）に対するｉｎ ｖｉｔｒ。
の細胞毒性を示すグラフである。
大麦毒素を基とする一連の有用な免疫毒素は次の方法で
効果的に製造しうる。第１図を参照すると、遊離−ＮＨ
２基を有するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）をヘテロ二
官能性架橋結合剤、例えば５ＰＤＰで活性化して、活性
化されたＭＡｂ、例えばＦ）Ｄ Ｔ −Ｍ Ａ ｂを形
成する。次に、第２図に示寸ように、大麦毒素（８丁）
を２−イミノチオランでチオール化して遊離のスルフヒ
ドリル基を導入する。ｆ−オール化した大麦毒素を、活
性化したＭＡｂと反応させて、ジスルフィド結合した免
疫毒素を形成す、る。
効果的に製造しうる。第１図を参照すると、遊離−ＮＨ
２基を有するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）をヘテロ二
官能性架橋結合剤、例えば５ＰＤＰで活性化して、活性
化されたＭＡｂ、例えばＦ）Ｄ Ｔ −Ｍ Ａ ｂを形
成する。次に、第２図に示寸ように、大麦毒素（８丁）
を２−イミノチオランでチオール化して遊離のスルフヒ
ドリル基を導入する。ｆ−オール化した大麦毒素を、活
性化したＭＡｂと反応させて、ジスルフィド結合した免
疫毒素を形成す、る。
次の実施例は、大麦島累分子当り平均約２個のチオール
基を導入するために用いて成功した実験条件を説明して
いる。開示されたパラメータは説明のためのもので、本
発明の範囲を限定することを意図するものではない。
基を導入するために用いて成功した実験条件を説明して
いる。開示されたパラメータは説明のためのもので、本
発明の範囲を限定することを意図するものではない。
友呈上
敷】：
蛋ｒ」￥１濃度は、ウシ血清アルブミンを標準どして使
用りるロウソー法（Ｒ，ト１． Ｌｏｗｒｙら、止工Ｒ
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３．２６５（１９５１）
）により測定した。
用りるロウソー法（Ｒ，ト１． Ｌｏｗｒｙら、止工Ｒ
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３．２６５（１９５１）
）により測定した。
蛋白質のブーオール化は、分子吸光係数（４１２ｎｍ）
？ＧｌａＺｅｒら、「蛋白質の化学的修飾（Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ＭｏｄｉｆｉｃａＮｏｎ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ 、丁、 Ｓ 、 Ｗｏｒｋ及び
Ｅ 、 Ｗｏｒｋ ＩＱ、 Ｅ！ｓｅｖｉｅｒＢｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、 Ｙ、、１９＋’５
ｐ１３３）。
？ＧｌａＺｅｒら、「蛋白質の化学的修飾（Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ＭｏｄｉｆｉｃａＮｏｎ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ 、丁、 Ｓ 、 Ｗｏｒｋ及び
Ｅ 、 Ｗｏｒｋ ＩＱ、 Ｅ！ｓｅｖｉｅｒＢｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、 Ｙ、、１９＋’５
ｐ１３３）。
友久亙ｊのチオユ五上：
反応のｐＨ，時間と温度及び／又は反応体の濃序を調節
づることにより、大安毒素分子当り２個以上のヂオール
塁を導入することができる。次の実施例は、この目的を
達成−する反応条件を説明している。大麦毒素［「ブー
オール化バッファ」、０、１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８
，０）及び０．００１Ｍエヂーレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）中３〜５Ｉｎｇ／！ｄ、］を、５０倍モル過剰
の２−イミノチオランくチオール化バッファ中０．４Ｍ
溶液として調製した〉と共に３０℃で１０分間インギ１
べ−１−シた。反応混合物を直ちに、０．１Ｍリン酸カ
リウム（ｔ）８７．０）及び０．００１Ｍ ＥＤＴＡ
４００容（４〜８時間毎に３回変える）に対して４℃
で透析した。
づることにより、大安毒素分子当り２個以上のヂオール
塁を導入することができる。次の実施例は、この目的を
達成−する反応条件を説明している。大麦毒素［「ブー
オール化バッファ」、０、１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ８
，０）及び０．００１Ｍエヂーレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）中３〜５Ｉｎｇ／！ｄ、］を、５０倍モル過剰
の２−イミノチオランくチオール化バッファ中０．４Ｍ
溶液として調製した〉と共に３０℃で１０分間インギ１
べ−１−シた。反応混合物を直ちに、０．１Ｍリン酸カ
リウム（ｔ）８７．０）及び０．００１Ｍ ＥＤＴＡ
４００容（４〜８時間毎に３回変える）に対して４℃
で透析した。
モノクローナル抗体のｔａｇ、：
５ＰＤＰ：抗体比２：４でもって、製造業者の指示（こ
れも参考として本明細力に包含する）に従って、Ｎ −
サクシンイミジル−３−（２−ビリジルジヂオ）プロピ
オネ−１へ（ＳＰＤＰ：ＰｈａｒＩｌｌａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｐ＋５ｃａｔａｖａｙ。
れも参考として本明細力に包含する）に従って、Ｎ −
サクシンイミジル−３−（２−ビリジルジヂオ）プロピ
オネ−１へ（ＳＰＤＰ：ＰｈａｒＩｌｌａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｐ＋５ｃａｔａｖａｙ。
モノクローナル抗体を活性化した。
大麦毒素とモノクローナル の 八：チオール化した
大麦毒素と活性化したモノクローナル抗体（Ｒ素：抗体
比は３〜５；１）とを室温で４時間又は４℃で一晩イン
キユベートした。例えば０．０５Ｍリン酸ナトリウム（
ｐＨ，７，５）と０，１ＭＮａＣｊ！で平衡化したＱｌ
”−２５０ＸＬカラム（Ｄｕｐｏｎｔ ｃｏ、、 Ｗ！
Ｉｍｔｎ（ｌｔｏｎ 、 ＤＥ）上でのゲル浸透り［コ
マトゲラフイーにより、免疫毒素から非複合大麦高木を
分離した。
大麦毒素と活性化したモノクローナル抗体（Ｒ素：抗体
比は３〜５；１）とを室温で４時間又は４℃で一晩イン
キユベートした。例えば０．０５Ｍリン酸ナトリウム（
ｐＨ，７，５）と０，１ＭＮａＣｊ！で平衡化したＱｌ
”−２５０ＸＬカラム（Ｄｕｐｏｎｔ ｃｏ、、 Ｗ！
Ｉｍｔｎ（ｌｔｏｎ 、 ＤＥ）上でのゲル浸透り［コ
マトゲラフイーにより、免疫毒素から非複合大麦高木を
分離した。
結果
２−イミノチオランと共にインキュベートし、１）Ｈγ
、 ｏ ｒ透析を行うと、チオール化した大麦毒素の収
量は通常８０％以上であった。ｐＨ８，０（チオール化
反応の１）Ｈ）ｔ’透析を行うと、収では通常３０％未
満であった。より高いｐＨでは追加のチオール填の取り
込みがより速く進むため、大麦毒素の溶解度が低下して
収量が低下するようであった。
、 ｏ ｒ透析を行うと、チオール化した大麦毒素の収
量は通常８０％以上であった。ｐＨ８，０（チオール化
反応の１）Ｈ）ｔ’透析を行うと、収では通常３０％未
満であった。より高いｐＨでは追加のチオール填の取り
込みがより速く進むため、大麦毒素の溶解度が低下して
収量が低下するようであった。
第３図で、上記手順で得たチオール化した大麦ホ索（号
素分子当り平均１，４個のスルフヒドリル基）の毒性（
黒丸）を、チオール化していない大麦毒素（白丸）及び
１本分子当り平均４．４個のスルフヒドリル基となるよ
うチオール化した大麦毒素（黒の三角）と比較した。、
１．４個のスルフヒドリル基の毒素は元の大麦毒素とほ
ぼ同等の毒性であったが、４．４個のスルフヒドリル基
の毒素では実質的に全ｍ性が消失した。−８Ｈ：毒素の
平均の比が５．０より大きい大麦毒素を製造すること【
よできなかった。これは多分、より置換度の高い誘導体
は不溶性になるためであった。
素分子当り平均１，４個のスルフヒドリル基）の毒性（
黒丸）を、チオール化していない大麦毒素（白丸）及び
１本分子当り平均４．４個のスルフヒドリル基となるよ
うチオール化した大麦毒素（黒の三角）と比較した。、
１．４個のスルフヒドリル基の毒素は元の大麦毒素とほ
ぼ同等の毒性であったが、４．４個のスルフヒドリル基
の毒素では実質的に全ｍ性が消失した。−８Ｈ：毒素の
平均の比が５．０より大きい大麦毒素を製造すること【
よできなかった。これは多分、より置換度の高い誘導体
は不溶性になるためであった。
第４図で、１．４個のスルフヒドリル基の；ｒｊＪと？
ウス抗ｌトランスフェリンレセプターモノクローナル抗
体とを複合して製造した免疫毒素の１ｎＶｉｔｒＯの細
胞ｉ５性（黒い三角）を、大麦毒素（白丸）及び１．４
個のスルフヒドリル基のチオール化大麦毒素（黒丸）と
比較した。免疫毒素は、５０％阻害Ｑ度で、どちらの非
複合毒素よりも３桁もより効果的であった。
ウス抗ｌトランスフェリンレセプターモノクローナル抗
体とを複合して製造した免疫毒素の１ｎＶｉｔｒＯの細
胞ｉ５性（黒い三角）を、大麦毒素（白丸）及び１．４
個のスルフヒドリル基のチオール化大麦毒素（黒丸）と
比較した。免疫毒素は、５０％阻害Ｑ度で、どちらの非
複合毒素よりも３桁もより効果的であった。
他の実施態様では、チオエーテル結合を介して大々ｉ＞
３素を抗体に結合することができる。これは、５ＰＤＰ
のチオピリジン基の代りに、マレイミジル基を含有する
ヘテロ二官能性架橋結合剤（例えば、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒトＯキシサクシンイミドエステル）を
使用して達成される。つまり、ナクシンイミジル基を介
して抗体のＮＨ２基に架橋結合剤を共有結合させて抗体
を活性化する。次に、活性化した抗体上のマレイミドベ
ンゾイル基を介して結合剤と複合可能な毒素との間にチ
オエーテル結合を形成して、チオエーテル結合で結合し
た免疫毒素を製造する。
３素を抗体に結合することができる。これは、５ＰＤＰ
のチオピリジン基の代りに、マレイミジル基を含有する
ヘテロ二官能性架橋結合剤（例えば、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒトＯキシサクシンイミドエステル）を
使用して達成される。つまり、ナクシンイミジル基を介
して抗体のＮＨ２基に架橋結合剤を共有結合させて抗体
を活性化する。次に、活性化した抗体上のマレイミドベ
ンゾイル基を介して結合剤と複合可能な毒素との間にチ
オエーテル結合を形成して、チオエーテル結合で結合し
た免疫毒素を製造する。
本発明の上述記載は種々の修飾、変化及び適応がなされ
うろことは理解されよう。そして、これらち又、特許請
求の意味、範囲及び等何物の内に包会されるものである
。
うろことは理解されよう。そして、これらち又、特許請
求の意味、範囲及び等何物の内に包会されるものである
。
第１図は、活性化したモノクローナル抗体の製造に５Ｐ
ＤＰを使用し、その後に、Ｍｆｌｉスルフヒドリル基を
含有する毒素（「Ｔ」と表わす）に複合することを示す
図式化した概略図である。 第２図は、２−イミノチオランを使用して大麦毒素（ｒ
ＢＴＪと表わす）にスルフヒドリルを導入し、続いて活
性化したモノクローナル抗体に複合することを示す図式
化した概略図である。 第３図は、網状赤血球溶菌液からのリポソームを使用す
る細胞を含まない蛋白質合成系における、人’ｌ ＴＨ
’ＩＡ及び２−イミノチオランでチオール化した誘導体
の相対毒性を示すグラフである。 第４図は、トリチｔクム標識したロイシン取込みアッセ
イを使用した、非複合大麦ｍｓ及びチオール化した誘導
体と比較した大麦毒素免疫毒素の結腸癌セルライン（）
（Ｔ−２９）に対するｔｎ ｖｔｔｒｏの細胞毒性を示
すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし）
ＤＰを使用し、その後に、Ｍｆｌｉスルフヒドリル基を
含有する毒素（「Ｔ」と表わす）に複合することを示す
図式化した概略図である。 第２図は、２−イミノチオランを使用して大麦毒素（ｒ
ＢＴＪと表わす）にスルフヒドリルを導入し、続いて活
性化したモノクローナル抗体に複合することを示す図式
化した概略図である。 第３図は、網状赤血球溶菌液からのリポソームを使用す
る細胞を含まない蛋白質合成系における、人’ｌ ＴＨ
’ＩＡ及び２−イミノチオランでチオール化した誘導体
の相対毒性を示すグラフである。 第４図は、トリチｔクム標識したロイシン取込みアッセ
イを使用した、非複合大麦ｍｓ及びチオール化した誘導
体と比較した大麦毒素免疫毒素の結腸癌セルライン（）
（Ｔ−２９）に対するｔｎ ｖｔｔｒｏの細胞毒性を示
すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし）
Claims (10)
- （１）大麦毒素と結合剤とを反応させて大麦毒素分子当
り平均約２個以下の結合基を大麦毒素に導入して複合可
能な生物活性大麦毒素を製造し；そしてその複合可能な
大麦毒素と活性化した抗体とを反応させて複合した生物
活性免疫毒素を製造するステップからなる複合免疫毒素
の製法。 - （２）結合剤がチオール化剤又はヘテロ二官能性架橋結
合剤であり、結合基がスルフヒドリル基である請求項１
の方法。 - （３）結合剤が２−イミノチオランであり、免疫毒素が
ジスルフィド結合した免疫毒素である請求項２の方法。 - （４）活性化した抗体がマレイミジル基を含有し、免疫
毒素がチオエーテル結合した免疫毒素である請求項２の
方法。 - （５）大麦毒素と結合剤とを反応させて大麦毒素分子当
り平均約２個以下の結合基を大麦毒素に導入して複合可
能な生物活性大麦毒素を製造し；そしてその複合可能な
生物活性大麦毒素を回収するステップからなる複合可能
な生物活性大麦毒素の製法。 - （６）結合剤がチオール化剤であり、結合基がチオール
基である請求項５の方法。 - （７）結合剤がヘテロ二官能性架橋結合剤であり、結合
基がチオール又はチオエーテル基である請求項５の方法
。 - （８）大麦毒素分子と、平均約２個以下の結合基により
大麦毒素分子に共有結合した抗体からなる免疫毒素。 - （９）平均約１個の結合基により抗体が大麦毒素分子に
共有結合している請求項８の免疫毒素。 - （１０）大麦毒素分子が平均約２個の結合基に共有結合
している請求項８の免疫毒素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15149988A | 1988-02-02 | 1988-02-02 | |
| US151,499 | 1988-02-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02152991A true JPH02152991A (ja) | 1990-06-12 |
Family
ID=22539046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1023662A Pending JPH02152991A (ja) | 1988-02-02 | 1989-02-01 | 大麦毒素からの免疫毒素 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0327169A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02152991A (ja) |
| KR (1) | KR890013045A (ja) |
| AU (1) | AU2883889A (ja) |
| DK (1) | DK43489A (ja) |
| FI (1) | FI890467A (ja) |
| IE (1) | IE890206L (ja) |
| PT (1) | PT89584A (ja) |
| ZA (1) | ZA89547B (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5977307A (en) * | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
| US5154924A (en) * | 1989-09-07 | 1992-10-13 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
| US5672683A (en) * | 1989-09-07 | 1997-09-30 | Alkermes, Inc. | Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein |
| US5527527A (en) * | 1989-09-07 | 1996-06-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
| US6329508B1 (en) | 1989-09-07 | 2001-12-11 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor reactive chimeric antibodies |
| US5182107A (en) * | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
| DE4014540A1 (de) * | 1990-05-07 | 1991-11-14 | Klaus Dr Tschaikowsky | Immunkonjugate zur prophylaxe und therapie von organschaeden bei entzuendlichen prozessen |
| DE4040954C2 (de) * | 1990-12-20 | 2001-05-17 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Erzeugung von pathogen-resistenten Pflanzen |
| US6015555A (en) * | 1995-05-19 | 2000-01-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4664911A (en) * | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| ATE87318T1 (de) * | 1985-11-29 | 1993-04-15 | Consolidated Pharmaceuticals L | Ricin-antikoerper-konjugate. |
-
1989
- 1989-01-24 ZA ZA89547A patent/ZA89547B/xx unknown
- 1989-01-24 IE IE890206A patent/IE890206L/xx unknown
- 1989-01-27 EP EP89200178A patent/EP0327169A3/en not_active Withdrawn
- 1989-01-27 AU AU28838/89A patent/AU2883889A/en not_active Abandoned
- 1989-01-31 DK DK043489A patent/DK43489A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-02-01 JP JP1023662A patent/JPH02152991A/ja active Pending
- 1989-02-01 KR KR1019890001150A patent/KR890013045A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-02-01 FI FI890467A patent/FI890467A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-02-01 PT PT89584A patent/PT89584A/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2883889A (en) | 1989-08-03 |
| DK43489A (da) | 1989-08-03 |
| KR890013045A (ko) | 1989-09-21 |
| PT89584A (pt) | 1989-10-04 |
| DK43489D0 (da) | 1989-01-31 |
| FI890467A0 (fi) | 1989-02-01 |
| EP0327169A3 (en) | 1990-07-11 |
| IE890206L (en) | 1989-08-02 |
| EP0327169A2 (en) | 1989-08-09 |
| FI890467A (fi) | 1989-08-03 |
| ZA89547B (en) | 1989-10-25 |
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