JPH02150298A - シクロスポリンの濃度測定のための方法とキット - Google Patents
シクロスポリンの濃度測定のための方法とキットInfo
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- JPH02150298A JPH02150298A JP1232660A JP23266089A JPH02150298A JP H02150298 A JPH02150298 A JP H02150298A JP 1232660 A JP1232660 A JP 1232660A JP 23266089 A JP23266089 A JP 23266089A JP H02150298 A JPH02150298 A JP H02150298A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、シクロスポリンおよびその生物学的に有効な
誘導体の濃度？＃１定方決方法する。この方法は、医学
および生物学研究所において利用できる。この測定は、
臓器移植および自己免疫疾患の患者において診断上重要
である。
誘導体の濃度？＃１定方決方法する。この方法は、医学
および生物学研究所において利用できる。この測定は、
臓器移植および自己免疫疾患の患者において診断上重要
である。
シクロスポリン濃度に関する情報は、治療上重要な薬剤
としてシクロスポリン成分を有する医薬品で治療してい
る患者において、治療監視に重要である。
としてシクロスポリン成分を有する医薬品で治療してい
る患者において、治療監視に重要である。
シクロスポリンおよびその生物学的に有効な誘導体の濃
度は、水系において、とりわけ生物学的液体、特に血清
または血漿中において、また体液、滑液、尿、または血
液細胞ないし組織均等質の懸濁液中で１１ｐ１定する。
度は、水系において、とりわけ生物学的液体、特に血清
または血漿中において、また体液、滑液、尿、または血
液細胞ないし組織均等質の懸濁液中で１１ｐ１定する。
主として、シクロスポリンおよびその誘導体の濃度測定
は、拒絶反応を避けるためにシクロスポリンのような化
合物を医薬品として投与している、臓器移植した患者に
おいて、治療上意義のある濃度範囲を調整および監視す
るために行なっている。
は、拒絶反応を避けるためにシクロスポリンのような化
合物を医薬品として投与している、臓器移植した患者に
おいて、治療上意義のある濃度範囲を調整および監視す
るために行なっている。
治療上意義のある医薬品投与の幅は比較的狭いので、投
与量が少なすぎる場合の臓器移植患者に対する免疫反応
を防ぐ、あるいは投与量が多すぎる場合の毒性副作用を
避けるために、患者の体液中の薬剤濃度を測定する必要
がある。さらに、医薬品の自然排除に個人差があること
、および長期の医薬品投与のために、医薬品の投与に差
を持たせるための前提条件となる、個人内の排除率が変
化することからも、濃度測定が必要になる。
与量が少なすぎる場合の臓器移植患者に対する免疫反応
を防ぐ、あるいは投与量が多すぎる場合の毒性副作用を
避けるために、患者の体液中の薬剤濃度を測定する必要
がある。さらに、医薬品の自然排除に個人差があること
、および長期の医薬品投与のために、医薬品の投与に差
を持たせるための前提条件となる、個人内の排除率が変
化することからも、濃度測定が必要になる。
通常、シクロスポリンおよびその誘導体の測定は、免疫
学的（１）またはクロマトグラフィー（２）による方法
で行なう。
学的（１）またはクロマトグラフィー（２）による方法
で行なう。
免疫学的方法は、問題のシクロスポリンに対する適当な
抗体を形成することに基づいている。
抗体を形成することに基づいている。
この抗体の助けにより、経費のかかる免疫効力検定法に
より、抗原の濃度を求めることができる。
より、抗原の濃度を求めることができる。
この方法の欠点は、特に部分的に非常に手間がかかるこ
と、および治療上効果がない化合物による交叉反応が起
こりうろことである。クロマトグラフィー法は、物理的
効果により、検出を妨げる物質から検出すべき物質を分
離することを利用している。検出感度は、検出器の品質
によっても、分離性能によっても大きな影響を受ける。
と、および治療上効果がない化合物による交叉反応が起
こりうろことである。クロマトグラフィー法は、物理的
効果により、検出を妨げる物質から検出すべき物質を分
離することを利用している。検出感度は、検出器の品質
によっても、分離性能によっても大きな影響を受ける。
この方法の特に大きな欠点は、例えば血漿中のシクロス
ポリン量を測定するのに、高価な装置と比較的大量の材
料が必要なことである。
ポリン量を測定するのに、高価な装置と比較的大量の材
料が必要なことである。
本発明の目的は、シクロスポリンで治療している患者の
体内物質中にある、生物学的に有効なシクロスポリンの
定量方法を提供することである。
体内物質中にある、生物学的に有効なシクロスポリンの
定量方法を提供することである。
本発明の課題は、その高い感度のため、シクロスポリン
を測定するための少量の試料を使って、Ｎ−末端基のペ
プチド結合をプロリンに異性化する酵素を一定量加えた
後、プロリンを含む基質の酵素触媒作用による異性化の
抑制量を測定し、そこから検量曲線により、シクロスポ
リンの濃度を求める簡単な方法を提供することである。
を測定するための少量の試料を使って、Ｎ−末端基のペ
プチド結合をプロリンに異性化する酵素を一定量加えた
後、プロリンを含む基質の酵素触媒作用による異性化の
抑制量を測定し、そこから検量曲線により、シクロスポ
リンの濃度を求める簡単な方法を提供することである。
シクロスポリンとしては、化学的にシクロスポリンの物
質区分から化学的に誘導体の意味で派生し、生物学的に
はシクロスポリンＡと同様の効果を有する化合物も当て
はまる。本方法の実施には、触媒活性があり、シクロス
ポリンに対して敏感なペプチジル−プロリルシス−トラ
ンスイソメラーゼ（ＰＰ−ラーゼ）を使用する。
質区分から化学的に誘導体の意味で派生し、生物学的に
はシクロスポリンＡと同様の効果を有する化合物も当て
はまる。本方法の実施には、触媒活性があり、シクロス
ポリンに対して敏感なペプチジル−プロリルシス−トラ
ンスイソメラーゼ（ＰＰ−ラーゼ）を使用する。
適当な基質は、Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａの型の化合物で
、それを使ってＰＰラーゼの反応が検出できるのである
。その際好ましくは、Ｙａａが例えばフェニルアラニル
−４−ニトロアニリドのような色原体群を、Ｘａａが例
えば５ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａの様なアミノアシル残基ま
たはペプチジル残基を表わす様な基質を使用する。適当
な基質のもう一つの特徴は、これらの蛋白質分解系に関
して公知の環境条件（ｐＨ値、緩衝液組成、温度および
イオン強度）下における、キモトリプシン、トロンビン
または人間の白血球エラスターゼなどの適当なプロテア
ーゼを使った、ＰＰラーゼの検出に必要な指示薬系に対
する基質特性である。シクロスポリンに対して敏感な分
子ｆｆ１１７ＫＤのＰＰラーゼは、例えば豚の腎臓（３
）から公知の方法により分離できる。シクロスポリン濃
度は、シクロスポリンがない場合の測定地（比較値）お
よびシクロスポリンを与えた場合のＰＰラーゼ活性の測
定値を比較することにより求められるが、その際、体独
自のイソメラーゼも検定中に含まれる異性化活性もシク
ロスポリン二を計るための尺度として役立つ。シクロス
ポリンの濃度測定を含めてＰＰラーゼの活性測定の実施
を、以下に二つの実施例により詳しく説明する。
、それを使ってＰＰラーゼの反応が検出できるのである
。その際好ましくは、Ｙａａが例えばフェニルアラニル
−４−ニトロアニリドのような色原体群を、Ｘａａが例
えば５ｕｅ−Ａｌａ−Ａｌａの様なアミノアシル残基ま
たはペプチジル残基を表わす様な基質を使用する。適当
な基質のもう一つの特徴は、これらの蛋白質分解系に関
して公知の環境条件（ｐＨ値、緩衝液組成、温度および
イオン強度）下における、キモトリプシン、トロンビン
または人間の白血球エラスターゼなどの適当なプロテア
ーゼを使った、ＰＰラーゼの検出に必要な指示薬系に対
する基質特性である。シクロスポリンに対して敏感な分
子ｆｆ１１７ＫＤのＰＰラーゼは、例えば豚の腎臓（３
）から公知の方法により分離できる。シクロスポリン濃
度は、シクロスポリンがない場合の測定地（比較値）お
よびシクロスポリンを与えた場合のＰＰラーゼ活性の測
定値を比較することにより求められるが、その際、体独
自のイソメラーゼも検定中に含まれる異性化活性もシク
ロスポリン二を計るための尺度として役立つ。シクロス
ポリンの濃度測定を含めてＰＰラーゼの活性測定の実施
を、以下に二つの実施例により詳しく説明する。
計算二通常、抑制物質の濃度は、検量曲線を使って、特
定の添加した酵素量の抑制率から測定する。その様な代
表的な検量曲線は、実施例１に対しては第１図に、実施
例２に対しては第２図に示す。
定の添加した酵素量の抑制率から測定する。その様な代
表的な検量曲線は、実施例１に対しては第１図に、実施
例２に対しては第２図に示す。
実施例１
緩衝液：０．０３５ｍＨＥＰＥＳ ｐＨ７，８キモト
リプシン：牛のすい臓から採取したアルファーキモトリ
プシン（３倍結晶化、べ−リンゴー／ドイツ連邦共和国
） 緩衝液４．２ｍｌ中に２４ ｍｇ 基質： Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
ＮＨＮｐ ジメチルスルホキシド１０ｍ１中に１４ｍｇＰＰラーゼ
：豚腎臓から分離 比活性−５００μモル／ｍｉｎ ｘ ｍｇＡｐ１定
装置：記録装置付きスペクトル線光度計測定波長：４１
０ｎｍ 予備保温時間＝２０分間 反応温度：５℃ 試料二人間の血漿プール、これに５．８．１８゜３０．
３６，４０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリン−Ａを添加 緩衝液 キモトリプシン溶液 ＰＰラーゼ溶液 試料 基質溶液 測定評価 空評価 ５００μｍ ５４０μｍ １００μｍ １００μｍ ２０μ１ ２０μ１ ５０μｍ ５０μｌ 活性測定：ａ） ｂ） 一次限時法による動力学の測定計 価（ｋ−ａ）Ｉ定評価）および空評価 （ｋ−空評価）の速度定数を計算 試料の測定した活性を次式により 計算 シクロスポリン濃度：第１図に示す検量曲線を使って求
める。
リプシン：牛のすい臓から採取したアルファーキモトリ
プシン（３倍結晶化、べ−リンゴー／ドイツ連邦共和国
） 緩衝液４．２ｍｌ中に２４ ｍｇ 基質： Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
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：豚腎臓から分離 比活性−５００μモル／ｍｉｎ ｘ ｍｇＡｐ１定
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３６，４０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリン−Ａを添加 緩衝液 キモトリプシン溶液 ＰＰラーゼ溶液 試料 基質溶液 測定評価 空評価 ５００μｍ ５４０μｍ １００μｍ １００μｍ ２０μ１ ２０μ１ ５０μｍ ５０μｌ 活性測定：ａ） ｂ） 一次限時法による動力学の測定計 価（ｋ−ａ）Ｉ定評価）および空評価 （ｋ−空評価）の速度定数を計算 試料の測定した活性を次式により 計算 シクロスポリン濃度：第１図に示す検量曲線を使って求
める。
実施例２
緩衝液：０．０３５ｍＨＥＰＥＳ ｐＨ７，８キモト
リプシン：牛のすい臓から採取したアルファーキモトリ
プシン（３倍結晶化、べ一すンガー／ドイツ連邦共和国
） 緩衝液４．２ｍｌ中に３５ｍｇ 基質： Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＨＮ ｐ ジメチルスルホキシド１０ｍ１中に１４ａ＋ｇＰＰラー
ゼ：豚腎臓から分離 比活性−５００μモル／ｍｉｎ ｘ ＩＩ１ｇＡｌ
ｌ定装置：記録装置付きスペクトル線光度計ｆｌｕ定波
長：４１０ｎｍ 予備保温時間：２０分間 反応温度：５℃ 試料二人間の血漿プール、これに５．８，１８゜３０．
３６．４０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリン−Ａを添加 測定評価、空評価および活性１１）１定は、実施例１と
同様にして行なった。
リプシン：牛のすい臓から採取したアルファーキモトリ
プシン（３倍結晶化、べ一すンガー／ドイツ連邦共和国
） 緩衝液４．２ｍｌ中に３５ｍｇ 基質： Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＨＮ ｐ ジメチルスルホキシド１０ｍ１中に１４ａ＋ｇＰＰラー
ゼ：豚腎臓から分離 比活性−５００μモル／ｍｉｎ ｘ ＩＩ１ｇＡｌ
ｌ定装置：記録装置付きスペクトル線光度計ｆｌｕ定波
長：４１０ｎｍ 予備保温時間：２０分間 反応温度：５℃ 試料二人間の血漿プール、これに５．８，１８゜３０．
３６．４０ｎｇ／ｍｌのシクロスポリン−Ａを添加 測定評価、空評価および活性１１）１定は、実施例１と
同様にして行なった。
シクロスポリン濃度：第２図に示す検量曲線を使って求
めた。
めた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、場合によりＮ−末端基のペプチド結合をプロリンに
異性化する酵素を一定量加えた後、プロリンを含む基質
に酵素触媒作用による異性化反応の抑制量を測定し、そ
こから検量曲線により、シクロスポリンの濃度を求める
ことを特徴とする、シクロスポリンの濃度を測定するた
めの方法および検定。 ２、異性化酵素として、ペプチジル−プロリルシス−ト
ランスイソメラーゼを使用することを特徴とする、請求
項１に記載の方法。 ３、基質として、Ｙａａが例えばフェニルアラニル−４
−ニトロアニリドまたはアラニル−４−ニトロアニリド
の様な色原体群を、Ｘａａが例えばＳｕｃ−Ａｌａ−Ａ
ｌａの様なアミノアシル残基またはペプチジル残基を表
わす様なＸａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａの型の化合物を使用す
ることを特徴とする、請求項１および２に記載の方法。 ４、メソメラーゼ基質が、例えばキモトリプシン、トロ
ンビンまたは人間の白血球−エラスターゼの様なプロテ
アーゼによる、イソメラーゼの抑制検出に必要な指示薬
系に対する基質特性をも備えていることを特徴とする、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５、（ａ）Ｎ−末端基のペプチド結合をプロリンに異性
化する酵素、好ましくはペプチジル−プロリル−シス−
トランス−イソメラーゼ、分子量１７ＫＤ、 （ｂ）キモトリプシン、トロンビン、人間の白血球エラ
スターゼの様なプロテアーゼ特性を持った助剤、および （ｃ）Ｙａａが色原体群を、ＸａａがＳｕｃ−Ａｌａ−
Ａｌａの様なアミノアシルまたはペプチジル残基を表わ
すＸａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａの型の基質および緩衝液、好
ましくはｐＨ７．８のＨＥＰＥＳ−緩衝液、 から成ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１
項に記載のシクロスポリンの濃度測定のための検定。 ６、Ｙａａがフェニルアラニル−４−ニトロアニリドま
たはアラニル−４−ニトロアニリドを表わすことを特徴
とする、請求項５に記載の検定。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD88319577A DD281659A5 (de) | 1988-09-07 | 1988-09-07 | Verfahren zur konzentrationsbestimmung von cyclosporinen |
| DD01N/319577-4 | 1988-09-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02150298A true JPH02150298A (ja) | 1990-06-08 |
| JP2860118B2 JP2860118B2 (ja) | 1999-02-24 |
Family
ID=5602261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1232660A Expired - Lifetime JP2860118B2 (ja) | 1988-09-07 | 1989-09-07 | シクロスポリンの濃度測定のための方法とキット |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0360029B1 (ja) |
| JP (1) | JP2860118B2 (ja) |
| AT (1) | ATE92536T1 (ja) |
| DD (1) | DD281659A5 (ja) |
| DE (1) | DE58905125D1 (ja) |
| ES (1) | ES2058425T3 (ja) |
| HU (1) | HU204132B (ja) |
| RU (1) | RU2074392C1 (ja) |
-
1988
- 1988-09-07 DD DD88319577A patent/DD281659A5/de unknown
-
1989
- 1989-08-26 DE DE8989115759T patent/DE58905125D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-26 EP EP89115759A patent/EP0360029B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-26 AT AT89115759T patent/ATE92536T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-08-26 ES ES89115759T patent/ES2058425T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-06 HU HU894650A patent/HU204132B/hu unknown
- 1989-09-06 RU SU894742104A patent/RU2074392C1/ru active
- 1989-09-07 JP JP1232660A patent/JP2860118B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD281659A5 (de) | 1990-08-15 |
| RU2074392C1 (ru) | 1997-02-27 |
| DE58905125D1 (de) | 1993-09-09 |
| HUT54809A (en) | 1991-03-28 |
| EP0360029A1 (de) | 1990-03-28 |
| JP2860118B2 (ja) | 1999-02-24 |
| HU204132B (en) | 1991-11-28 |
| ATE92536T1 (de) | 1993-08-15 |
| ES2058425T3 (es) | 1994-11-01 |
| EP0360029B1 (de) | 1993-08-04 |
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