JPH02135096A - 抗原蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、成人性歯周炎の原因細菌であるバクテロイデ
ス　ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏ＋ｄｅｓ　ｇ＋ｎｇ
＋−ＶａｌｉＳ）の生産する特異抗原に関する。さらに
詳しくは、歯周炎の免疫学的診断に有効なアミノ酸配列
を有する特異抗原に関する。

［従来の技術］ 近年、歯周病の種々の病型の発症に、それぞれ特定の微
生物が関与する可能性が示唆され、歯周病の診断・治療
に特異病原細菌の同定が要求されている。しかし歯周病
病原菌の多くは嫌気性菌であるために、歯肉縁下歯垢の
細菌検査は日當的な臨床レベルでは困難であり、実際に
はほとんど実施されていないのが現状である。またエイ
ズ等の例のように、感染症患者血清中の特異抗体価を測
定することにより、感染の進行度および関与した病原細
菌の同定が可能であり、これが診断・治療に利用されて
いる。成人性歯周炎においても原因菌バクテロイデス　
ジンジバリスに対する患者血清中の抗体価と病態進行度
との間に相関性があることや、歯周炎治療後に抗体価が
減少することが報告されている。しかし種々の病型の病
原菌に対する血清抗体価は、必ずしもその病態進行度と
相関しないという研究結果も報告されており、これら矛
盾した研究結果が歯周病の免疫学的な臨床検査の推進を
立遅れさせてきた。矛盾した研究結果を生む原因として
、病原菌の抗原の調製方法が同じでなかったことと、さ
らに菌体抽出液といっな極めて多種の抗原を含む不純な
試料が用いられてきたことが考えられる。すなわち、こ
れらの試料の中には、他の菌種と免疫学的に交叉反応す
るものや、診断に重要な抗原を含まない可能性があった
。これらのことから、抗体価の測定には診断に有用な特
異精製抗原の使用が渇望されていた。

そこで安孫子らは遺伝子操作技術を利用して、バクテロ
イデス　ジンジバリスの特異抗原遺伝子をクローニング
し、大腸菌にその特異抗原を生産させることに成功した
。精製されたこの特異抗原に対するヒト血清中の抗体価
を測定したところ、成人性歯周炎患者では抗体価が正常
人に比べて増大していることが明らかになり、このクロ
ーン化特異抗原の臨床診断への応用が期待されている（
Ｙ、Ａｂｉｋｏ　＆　Ｈ，Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ：Ｊ、Ｄ
ｅｎｔ、Ｒｅｓ、　６５　Ａｂｓ、１０６　（１９８６
））。

バクテロイデス　ジンジバリスに特異的な抗原蛋白質の
全アミノ酸配列が明らかになれば、歯周病の診断に有用
な該蛋白質を、高純度で大量に製造することができる。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、バクテロイデス　ジンジバリスに特異的な抗
原蛋白質の化学合成法もしくは遺伝子組換法Ｃごよる合
成を可能ならしめ、純度の高い該蛋白質を大量に得るこ
とを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、第１図のアミノ酸配列を有するバクテロイデ
ス　ジンジバリスの特異抗原蛋白質、及びそれをコ−ド
する遺伝子を提供するものである。

本発明の特異抗原蛋白質は第１図に示される３２３個の
アミノ酸配列からなる蛋白質であるが、それと実質的に
同等の生物活性が保持されているならば、上記アミノ酸
配列に部分的な置換、欠失、挿入などがなされて構成さ
れる蛋白質も本発明に含まれる。

本発明の遺伝子は、上記特異抗原蛋白質をコドする遺伝
子であって、第１図の下段に示すＤＮＡ塩基配列を含む
ものがその代表例である。

本発明のバクテロイデス　ジンジバリスの特異抗原蛋白
質のアミノ酸配列を明らかにするには、まず高純度の該
蛋白質を得る必要がある。該蛋白質は、該蛋白質をコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡを組み込んだプラスミドを有
する大腸菌（Ｙ、Ａｂｉｋｏ　　Ｆｘ　　Ｈ，Ｔａｋｉ
ｇｕｃｈｉ、　　　Ｊ、Ｄｅｎｔ、Ｒｅｓ、　　６５．
八ｂｓ、１０６　　（１９８６））を培養すれば容易に
得られる。すなわちこの大腸菌を通常の方法で培養した
後、菌体を集めて破壊し、その破壊液の中から抗バクテ
ロイデスジンジバリス抗体と反応する蛋白質を精製する
ことによって得られる。精製方法としては疎水性・イオ
ン交換樹脂・ゲル）濾過等のカラムクロマトグラフィー
法を用いることができる。該抗原蛋白質の純度は、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて調べる
ことができる。

精製された蛋白質が得られたならば、Ｎ末端のアミノ酸
配列をアミノ酸シークエンサーを用いて解析することが
できる。またＮ末端から離れた部分のアミノ酸配列は、
次のようにして解析できる。

該抗原蛋白質を還元カルボキシメチル化などによりＳ−
８結合を開裂さぜな後に、■８プロテアゼ・リジルエン
ドペプチターゼなどのプロテアーゼを用いて限定分解し
て、生じたオリゴペプチドを高速液体クロマトグラフィ
ー（以下、ＨＰ　Ｌ　Ｃと略す）にかけて分収する。す
ると、それぞれのオリゴペプチドのＮ末端からのアミノ
酸配列が前述のアミノ酸シークエンサーを用いて解析で
きる。

このようにして得られたアミノ酸配列を遺伝子の塩基配
列から推定されるアミノ酸配列と対応させることにより
、蛋白質のアミノ酸配列が確定できる。また便法として
、限定分解によって得られたオリゴペプチドが比較的低
分子の場合には、そのアミノ酸組成を決定するだけで塩
基配列と対応させることが可能であり、アミノ酸配列を
確定することができる。

［実施例］ 以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１ 組換え型特異抗原の取得： バクテロイデス　ジンジバリス由来の特異抗原遺伝子を
含む２．ＯｋｂのＤＮＡをベクターｐＡら ＣＹＣｌ３４に挿入した組換えプラスミドｐＭＤ１０９
を持つ大腸菌ＨＢ　１０１　（Ｙ、Ａｂｉｋｏ　Ｆｘ　
ｌ−１，Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ、Ｊ、Ｄｅｎｔ、Ｒｅ５ｙ
６５　Ａｂｓ、　１０６（１９８Ｂ））を用いて抗原蛋
白質を生産させた。テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを
含む２０１のＬＢ培地にこの組換え大腸菌を植菌し、３
７℃で一夜、振盪培養した。

得られた菌体を遠心分離機を用いて集菌後、１００ｍ１
の１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社製）
中で４℃、３０分間静置してから超音波振動をかけて菌
体を破壊した。遠心分離機を用いて菌体破壊−上清を得
た後に、これを硫安濃度３０％飽和にして、その上清を
得た。これを′“ブチル−トヨパール６５０”　　（１
，５Ｘ３０ｃｍ、東洋曹達社製）にかけ、１０ｍＭＴｒ
ｉｓＨＣｌ　（ｐＨ８＞、１ｍＭＥＤＴＡを用いて溶出
した。このうち免疫反応した溶出画分を、イオン交換カ
ラム゛ＤＥＡＥ−５ＰＷ”　　（東洋曹達社製）にかけ
、塩化ナトリウム０→ＩＭの勾配をつけた同緩衝液で溶
出した。このうち免疫反応した溶出両分を、“ＣＸ−１
０°′　（ミリボア社製）を使って濃縮した後、ゲル沢
過カラム“Ｇ３０００ＳＷ”（東洋曹達社製）にかけ０
．ＩＭリン酸Ｍ街液（ｐＨ６，９）を用いて溶出した。

このうち免疫反応した溶出画分を、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけて純度を検討したところ、
分子量４０，０００の単一の蛋白質が検出された。

実施例　２ 特異抗原のアミノ酸配列の解析： 実施例１で得られた５０μｇの精製抗原蛋白質をＰＨＥ
ＮＹＬ−５ＰＷＲＰカラム（東洋曹達社製）にかけ、２
０→５０％アセトニトリル／３０分の勾配をつけた逆相
ＨＰＬＣを行なった。溶出した蛋白質画分をアミノ酸シ
ークエンサー４７０Ａ（アプライド　バイオケミカル社
製）にかけ、Ｎ末端からのアミノ酸配列の解析を行なっ
た。

また同じく逆相ＨＰＬＣで精製された１５０μｇの抗原
蛋白質を４００μｌの６Ｍ塩酸グアニジン水溶液に溶解
し、１μｍのメルカプトエタノールを加えて３７℃、３
時間保温してＳ−８結合を開裂させた後、１μｍの４−
ビニルピリジンを加えて３７℃、１時間保温してピリジ
ルエチル化した。これを上記と同じ逆相ＨＰＬＣにかけ
て試料の脱塩を行ない、溶出した蛋白質画分を凍結乾燥
した。これを１００μｌの１００ｍＭ酢酸アンモニウム
（ｐＨ４）に溶解し、２μｇの■８プロテアーゼ（マイ
ルズ社製）を加えて３７℃、２６時間保温して限定分解
を行なった。これをＣ１８４，６Ｘ２５ｃｍカラム（ビ
ダック社製）にかけ、５→５５％アセトニトリル１５０
分の勾配をつけた逆相ＨＰＬＣを行なった結果、５４種
類の限定分解物が分画された。それぞれを減圧乾固して
アミノ酸組成の解析あるいはアミノ酸配列の解析を行な
った。また、上記の還元ピリジルエチル化した抗原蛋白
質を２００μｌの０．２Ｍ２−アミノ−２−メチル−１
，３−プロパンジオール、４Ｍ尿素、ｐＨ９，５に溶解
し、１単位のりジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製
）を加えて、３７℃−夜保温して限定分解を行なった。

この限定分解物をアンハイドロトリプシンアガロースカ
ラム（贅酒造社製）にかけ、素通りした分画をＣ末端含
有ペプチドとして分取し、アミノ酸配列の解析を行なっ
た。

実施例　３ 蛋白質と遺伝子の一次構造の比較： 実施例２で得られた蛋白質の情報を遺伝子の情報と比較
することにより、第１表と第２表に示すように蛋白質と
遺伝子の一次構造を対応させることができな。その結果
、第１図に示すようにバクテロイデス　ジンジバリス由
来の特異抗原をコードする遺伝子部分を特定し、また該
蛋白質の一次構造を規定しな。

（以下余白） 第１表　アミノ酸配列と遺伝子の対応（その１）蛋白質
Ｃ末尾（＊は、終止コドンを示す）分画Ｎｏ、５ 分画Ｎ。

分画Ｎｏ、２８ 分画Ｎｏ、３２ 分画Ｎ００８ 分画Ｎｏ、１２ 分画Ｎｏ、１５ 分画Ｎｏ、１９ 分画Ｎｏ、２１ 分画Ｎｏ、３６ 第１表　アミノ酸配列と遺伝子の対応（その２）分画Ｎ
ｏ、３４ 間［ 分画Ｎ０１４５ 分画Ｎｏ、　５０ ［発明の効果］ 本発明によって、バクテロイデス　ジンジバリスの特異
抗原の一次構造が特定され、同時に該蛋白質をコードす
る遺伝子の一次構造も明らかになった。蛋白質の一次構
造が規定されたことにより、プロティンエンジニアリン
グの手法を用いて、該蛋白質の他菌種に対する免疫学的
な交叉反応をより減少させなり、該蛋白質をワクチンと
してより有効な形に改良する方法が開かれた。また遺伝
子の一次構造が明らかになったことにより、遺伝子操作
の手法を用いて、大腸菌に該蛋白質をより多く効率的に
生産させたり、大腸菌以外の他生物や細胞に該蛋白質を
生産させる方法が開かれた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のバクテロイデス　ジンジバリスの特異
抗原蛋白質のアミノ酸配列および該蛋白質をコードする
遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す。 特許出願人　学校法人　日本大学 １１ｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　ｌｈｒ　八ｓｐ　　Ｖ
ａｌ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　ＶａｌＡｌａ
　　Ａｓｎ　　もｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　Ｈｉｓ
　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ第１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示すアミノ酸配列を有するバクテロイデ
   スジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇｉｎｇｉｖ
   ａｌｉｓ）の特異抗原蛋白質およびその同効物。
2. （２）請求項１記載の特異抗原蛋白質またはその同効物
   をコードする遺伝子。
3. （３）第１図に示す塩基配列である請求項２記載の遺伝
   子。