JPH0211523A - Immunoadsorbent for remedy of malignant tumor, etc., and remedying method using the same agent - Google Patents
Immunoadsorbent for remedy of malignant tumor, etc., and remedying method using the same agentInfo
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Landscapes
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、悪性腫瘍や自己免疫疾患の治療に有用な免疫
吸着剤およびそれを用いた治療方法、ならびに治療用組
成物に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Industrial Application Field) The present invention relates to an immunoadsorbent useful for treating malignant tumors and autoimmune diseases, a therapeutic method using the same, and a therapeutic composition.
(従来の技術)
悪性腫瘍の有効な治療方法のひとつとして特開昭58−
86168号公報には、ブドウ状球菌の一種であるスタ
フィロコッカス オーレウス ヨー9フ1株(Sta
h Iococcus aureus Cowan
I)の細胞膜成分であるプロティンA (SPA)を不
活性担体に担持させた免疫吸着剤を用いる方法が開示さ
れている。この吸着剤に生体からの血液を分離して得ら
れた血漿を接触させ、接触後の血漿を再び血液固形分と
合わせて全血とし、生体に戻すと悪性腫瘍細胞が壊死す
ることが確認されている。(Prior art) Unexamined Japanese Patent Publication No. 1983-1989 as one of the effective treatment methods for malignant tumors.
Publication No. 86168 describes Staphylococcus aureus 9f 1 strain (Staphylococcus aureus), which is a type of staphylococcus.
h Iococcus aureus Cowan
A method using an immunoadsorbent in which protein A (SPA), a cell membrane component, is supported on an inert carrier in I) is disclosed. Plasma obtained by separating blood from a living body is brought into contact with this adsorbent, and when the plasma after contact is combined with blood solids again to make whole blood and returned to the living body, it has been confirmed that malignant tumor cells become necrotic. ing.
通常、悪性11ijJ&を有する生体内には、正常な生
体には存在しない物質が増加することが知られている。It is known that substances that do not exist in a normal living body usually increase in a living body with malignant 11ijJ&.
このような物質とは、悪性腫瘍細胞表面が特異抗原とな
り、この特異抗原により生成する抗体;抗原−抗体結合
物にさらに補体が結合して大きなマトリックスを形成し
た免疫複合体;特殊な免疫グロブリンなどである。これ
らは血清中の正常な免疫系を阻止する因子(血清阻止因
子)となるため、これらが存在することによりさらに悪
性腫瘍の増殖が助長される。Such substances include antibodies produced by the specific antigen on the surface of malignant tumor cells; immune complexes formed by complement binding to the antigen-antibody complex to form a large matrix; and special immunoglobulins. etc. Since these act as factors in serum that inhibit the normal immune system (serum inhibitory factors), their presence further promotes the growth of malignant tumors.
上記公報の方法で使用されているSPAは、はとんどの
哺乳動物の免疫グロブリン(Ig;主として免疫グロブ
リンG (IgG) )のPc部分と結合する性質を有
する。そのため、 SPAが担持された吸着剤に血漿を
接触させると、上記血清阻止因子を包含するIgが吸着
・除去され、その結果、正常な免疫系が復活してIII
瘍細胞が排除されるものと考えられる。上記方法におい
ては、また、SPAと接触後の血漿中には悪性腫瘍と特
異的に反応してMm瘍細胞を壊死させうる腫瘍特異性抗
体が増加することも報告されている。さらに、白木らは
悪性腫瘍患者血清中の免疫複合体がSPAと接触すると
変性を受け、変性を受けた免疫複合体から腫瘍特異性抗
体が離脱し5 このnm瘍特異性抗体が悪性腫瘍を壊死
させるとの考察を行っている(臨床免疫; 1985年
4月号)。SPA used in the method of the above-mentioned publication has the property of binding to the Pc portion of most mammalian immunoglobulins (Ig; mainly immunoglobulin G (IgG)). Therefore, when plasma is brought into contact with an adsorbent carrying SPA, Ig containing the above-mentioned serum inhibitory factors is adsorbed and removed, and as a result, the normal immune system is restored and III
It is thought that tumor cells are eliminated. In the above method, it has also been reported that tumor-specific antibodies that can specifically react with malignant tumors and cause necrosis of Mm tumor cells increase in plasma after contact with SPA. Furthermore, Shiraki et al. reported that when immune complexes in the serum of patients with malignant tumors come into contact with SPA, they undergo denaturation, and tumor-specific antibodies are released from the denatured immune complexes.5 These nm tumor-specific antibodies cause necrosis of malignant tumors. (Clinical Immunology; April 1985 issue).
このように、SPAを免疫吸着剤とした治療法ではSP
AがIgを吸着・除去するだけでなく、Igと何らかの
相互作用を起こすことにより腫瘍細胞が壊死するものと
考えられる。その詳しいメカニズムはいまだ不明である
が、血液中のIgとSPAのFc結合領域との相互作用
が抗n1m作用の出発点となっているものと考えられる
。In this way, in treatment methods using SPA as an immunoadsorbent, SP
It is thought that A not only adsorbs and removes Ig, but also causes some kind of interaction with Ig, resulting in tumor cell necrosis. Although the detailed mechanism is still unclear, it is thought that the interaction between Ig in the blood and the Fc binding region of SPA is the starting point for the anti-n1m action.
上記方法で使用されるSPAは、スタフィロコッカス
オーレウス ヨー9フ1株の菌体から得られる。ぞの精
製工程は繁雑であるためSPAは高価である。SPA
1 otgは1例えば、ヒトIgG 8〜10mgと結
合する能力を存する。そのため5例えば、悪性腫瘍を治
療するために血液中のIgGの10%をSPAと結合除
去する。もしくはSPAと相互作用を起こさせるために
は、数100■のSPAを必要とし、治療が非常に高価
となる欠点がある。さらに、 SPAは微生物由来のタ
ンパクであるため、治療に用いた場合にアレルギー反応
の原因となる恐れがある。The SPA used in the above method is Staphylococcus
Obtained from the cells of one strain of E. aureus 9fu. SPA is expensive because the purification process is complicated. SPA
1 otg has the ability to bind 1, for example, 8-10 mg of human IgG. For example, 10% of IgG in the blood is combined with SPA and removed to treat malignant tumors. Alternatively, in order to cause an interaction with SPA, several hundreds of SPA are required, which has the drawback that the treatment is very expensive. Furthermore, since SPA is a protein derived from microorganisms, it may cause allergic reactions when used for treatment.
これらの問題を解決するために5発明者らはヒエルムら
(l(jelm、Het al、、Eur、J、Bio
chem、 55゜395−403 (1975) )
の方法によりSPAをトリプシンなどのタンパク分解酵
素で処理して、 IgGのFC領域との結合能力を有す
る5種類の比較的低分子量のポリペプチドフラグメント
A、B、C,DおよびEのン昆合物を得、これを悪性!
lI瘍などの治療に用いることを試みた(特開昭62−
721322号公報)。上記ポリペプチドフラグメント
のうちA、B、CおよびDは極めて類似した構造をもち
、それぞれ約60個のアミノ酸残基から構成されること
が知られている。これらは単独でIgに結合する能力を
もち、 SP/l抗体と反応することが知られている。To solve these problems, the inventors proposed Hjelm et al.
chem, 55°395-403 (1975))
By treating SPA with a proteolytic enzyme such as trypsin, five relatively low molecular weight polypeptide fragments A, B, C, D and E, which have the ability to bind to the FC region of IgG, are combined. Get stuff and make this malignant!
Attempted to use it for the treatment of II tumors etc.
721322). It is known that among the above-mentioned polypeptide fragments, A, B, C and D have extremely similar structures and are each composed of about 60 amino acid residues. These have the ability to bind to Ig alone and are known to react with SP/1 antibodies.
つまりSPAと同様の反応性を示す。このようにSPA
を各フラグメントに分解することにより、 Igとの結
合能力かもとのSPAに比べて約2.2倍高くなるとい
う利点を有する。上記ポリペプチドフラグメントのうち
フラグメントA、B、CおよびDの分子量はいずれも1
万以下と低い。そのため、従来のSPAを担持した吸着
剤を用いたときに認められる菌体由来タンパクであるが
ゆえに起こると考えられているアレルギー反応がほとん
ど発生しないという利点を有する。ポリペプチドフラグ
メントのうちフラグメントEはSP八へ〇末端の約15
0のアミノ酸残基から構成されており、このフラグメン
トはリンパ球に対してマイトジェネシティー作用(細胞
増殖を盛んにすること)がある。さらに、リンパ球前駆
細胞から形成されるB細胞刺激活性を有する。このよう
にポリペプチドフラグメントEはリンパ球に作用してそ
の免疫機能を向上させる機能を有すると考えられる。し
かし、このポリペプチドフラグメントEは、上記ポリペ
プチドフラグメントA、B。In other words, it exhibits reactivity similar to SPA. In this way SPA
By decomposing SPA into each fragment, it has the advantage that its ability to bind to Ig is approximately 2.2 times higher than that of the original SPA. Among the above polypeptide fragments, fragments A, B, C and D all have molecular weights of 1.
It's low, less than 10,000. Therefore, it has the advantage that allergic reactions, which are thought to occur when conventional SPA-supported adsorbents are used because they are bacterial cell-derived proteins, hardly occur. Among the polypeptide fragments, fragment E is approximately 15 minutes from the SP 8 to 0 end.
It is composed of 0 amino acid residues, and this fragment has a mitogenic effect (enhancing cell proliferation) on lymphocytes. Furthermore, it has B cell stimulatory activity that is formed from lymphoid progenitor cells. Thus, polypeptide fragment E is thought to have the function of acting on lymphocytes and improving their immune function. However, this polypeptide fragment E is different from the polypeptide fragments A and B described above.
CおよびDよりも分子量が大きいため、抗原性が高く、
アレルギー反応を引き起こすことがある。Because it has a larger molecular weight than C and D, it has higher antigenicity;
May cause allergic reactions.
そのため、アレルギー反応を生じない治療のためには、
ポリペプチドフラグメントEのような好ましくない画分
を除去することが望まれる。Therefore, for treatment that does not cause allergic reactions,
It is desirable to remove undesirable fractions such as polypeptide fragment E.
さらに、これらのポリペプチドフラグメントを得るため
の上記方法においては、タンパク分解酵素として基質特
異性の広いトリプシンを使用している。そのため、酵素
反応の反応条件によっては。Furthermore, in the above methods for obtaining these polypeptide fragments, trypsin, which has a wide substrate specificity, is used as a proteolytic enzyme. Therefore, depending on the reaction conditions of the enzymatic reaction.
得ようとする大きさのポリペプチドフラグメントよりも
大きなフラグメントまたは小さなフラグメントが生成さ
れてしまう恐れがある。このように、目的とする大きさ
のポリペプチドフラグメントを高い収率で得るためには
反応条件を厳密にする必要があり、該条件の制御が難し
い。、(発明が解決しようとする課題)
本発明は、上記従来の欠点を解決するものであり、その
目的とするところは、 SPA I)Fc結合領域を構
成する純度の高いポリペプチドを調製し、活性が高くか
つ安価に供給されうる悪性腫瘍治療用免疫吸着剤および
それを用いた治療方法、ならびに治療用組成物を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、遺伝子組換え技術
を用いて上記ポリペプチドを調製し、上記価れた性質を
有する悪性腫瘍治療用免疫吸着剤およびそれを用いた治
療方法、ならびに治療用組成物を提供することにある。There is a risk that fragments larger or smaller than the desired polypeptide fragment size may be generated. As described above, in order to obtain a polypeptide fragment of the desired size in high yield, it is necessary to use strict reaction conditions, and it is difficult to control these conditions. (Problems to be Solved by the Invention) The present invention solves the above-mentioned conventional drawbacks, and its purpose is to: prepare a highly pure polypeptide constituting the SPA I) Fc-binding region; An object of the present invention is to provide an immunoadsorbent for treating malignant tumors that has high activity and can be supplied at low cost, a treatment method using the same, and a therapeutic composition. Another object of the present invention is to prepare the above-mentioned polypeptide using genetic recombination technology, and to provide an immunoadsorbent for treating malignant tumors having the above-mentioned valuable properties, a therapeutic method using the same, and a therapeutic composition. It is about providing.
(課題を解決するための手段)
本発明の悪性腫瘍等治療用免疫吸着剤は、スタフィロコ
ッカス オーレウス コーワン1株(Sta h 1o
coccus aureus Cowan I)由来
のプロティンA (SPA)の、免疫グロブリン(Tg
)のFcjJ域と結合し得るFc結合領域を構成するポ
リペプチドフラグメントのN末端もしくはC末端にシス
ティンを付加したポリペプチドを遺伝子組換え技術によ
り生産し、不活性担体に共有結合的もしくは非共有結合
的に担持させて得られ、そのことにより上記目的が達成
される。(Means for Solving the Problems) The immunoadsorbent for the treatment of malignant tumors, etc. of the present invention is obtained from Staphylococcus aureus Cowan 1 strain (Sta h 1o
Coccus aureus Cowan I)-derived protein A (SPA), immunoglobulin (Tg
) A polypeptide with cysteine added to the N-terminus or C-terminus of the polypeptide fragment constituting the Fc-binding region capable of binding to the FcjJ region of The above-mentioned object is achieved.
本発明の悪性腫瘍等の治療方法は、上記免疫吸着剤に生
体からの血漿、血清、もしくは全血を接触させる工程;
および該接触後の血漿、血清、もしくは全血を該生体ま
たは同種の生体内に注入する工程を包含し、そのことに
より上記目的が達成される。The method for treating malignant tumors, etc. of the present invention includes a step of bringing plasma, serum, or whole blood from a living body into contact with the immunoadsorbent;
and injecting the plasma, serum, or whole blood after the contact into the living body or a similar living body, thereby achieving the above object.
本発明の悪性腫瘍等の治療用組成物は、上記免疫吸着剤
に生体からの血漿、血清、もしくは全血を接触させるこ
とにより得られる処理血漿、血清。The composition for treating malignant tumors, etc. of the present invention is a treated plasma or serum obtained by bringing plasma, serum, or whole blood from a living body into contact with the immunoadsorbent.
もしくは全血を主成分とし、そのことにより上記目的が
達成される。Alternatively, the main component is whole blood, thereby achieving the above purpose.
本発明に使用されるポリペプチドは、免疫グロブリン(
Ig)のFc領域と結合し得るSPへのFc結合領域を
構成するポリペプチドフラグメントのN末端もしくはC
末端にシスティンを付加したポリペプチド(以下、 S
PA活性フラグメントという)であり。The polypeptide used in the present invention is an immunoglobulin (
The N-terminus or C
Polypeptide with cysteine added to the end (hereinafter referred to as S
PA active fragment).
これは遺伝子組換え技術を用いて調製される。以下に、
遺伝子組換え技術を用いたこのSPA活性フラグメント
の調製を工程の順に詳細に説明する。It is prepared using recombinant genetic technology. less than,
The preparation of this SPA active fragment using genetic recombination technology will be explained in detail in the order of steps.
SPAのFc結合領域(これは、 IgのFc領域と結
合活性を有する領域をを指していう)を構成するポリペ
プチドフラグメントは9次のアミノ酸配列で代表される
。The polypeptide fragment constituting the Fc-binding region of SPA (this refers to the region that has binding activity to the Fc region of Ig) is represented by the 9th amino acid sequence.
ADNKFNKE(IQNAFYErLIILPNLN
EE(]RNGFI(ISLKDDPS(IsANLL
AIEAKKLNDA口APに
(1)−1ここで、上記アミノ酸配列
を構成する記号は、それぞれ次の意味を有する:A:ア
ラニン、D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、F:
フェニルアラニン、G;グリシン、H:ヒスチジン、I
:イソロイシン、に:リジン、L:ロイシン1M:メチ
オニン、N:アスパラギン、Pニブロリン。ADNKFNKE (IQNAFYErLIILPNLN
EE(]RNGFI(ISLKDDPS(IsANLL
AIEAKKLNDA mouth AP
(1)-1 Here, the symbols constituting the above amino acid sequence have the following meanings: A: alanine, D: aspartic acid, E: glutamic acid, F:
Phenylalanine, G; Glycine, H: Histidine, I
: Isoleucine, Ni: Lysine, L: Leucine 1M: Methionine, N: Asparagine, P-nibroline.
Q:グルタミン、R:アルギニン、S:セリン。Q: Glutamine, R: Arginine, S: Serine.
Y:チロシン。Y: Tyrosine.
この配列はSPAのFc結合領域を構成するポリペプチ
ドフラグメントの代表的なアミノ酸配列の1つであるが
、必ずしもこの配列に限定されず、同様にIgのFc領
域との結合活性を有する類似の配列が包含される。Although this sequence is one of the typical amino acid sequences of polypeptide fragments constituting the Fc binding region of SPA, it is not necessarily limited to this sequence, and similar sequences having similar binding activity to the Fc region of Ig can be used. is included.
SPAのFc結合領域を構成するポリペプチドフラグメ
ントをコードする遺伝子を挿入した組換えプラスミドを
導入して形質転換した宿主細胞を培養することにより、
B亥ポリペプチドフラグメントは培養物中に融合タンパ
クとして発現する。この融合タンパクからSPAのFc
結合領域を構成するポリペプチドフラグメントのみを得
るためには、 SPAのFc結合領域はメチオニンを含
有しないポリペプチドであることを利用して2例えば、
上記アミノ酸配列(1)−1のN末端にシアノゲンブロ
マイド(CNBr)により切断され得るメチオニン(M
)を付加するのが好ましい。By culturing host cells transformed by introducing a recombinant plasmid into which a gene encoding a polypeptide fragment constituting the Fc-binding region of SPA has been inserted,
The B-polypeptide fragment is expressed as a fusion protein in culture. From this fusion protein, the Fc of SPA
In order to obtain only the polypeptide fragments constituting the binding region, taking advantage of the fact that the Fc binding region of SPA is a polypeptide that does not contain methionine2, for example,
Methionine (M
) is preferably added.
SPAのFc結合領域を構成するポリペプチドフラグメ
ントを固相担体等に結合して用いる場合は緩和な条件で
結合し易くするために2例えばN末端またはC末端にシ
スティン(C)のような活性水素をもつアミノ酸を付加
しておくのが好ましい。When using the polypeptide fragment constituting the Fc-binding region of SPA bound to a solid support, etc., an active hydrogen such as cysteine (C) is added at the N-terminus or C-terminus to facilitate binding under mild conditions. It is preferable to add an amino acid with
なぜなら、システィンが新たに付加されても、もとのポ
リペプチドフラグメントにはシスティンが存在しないた
め分子内架橋が起こらず、その立体構造は影響を受けな
いと推定されるからである。This is because even if cysteine is newly added, intramolecular crosslinking does not occur because cysteine does not exist in the original polypeptide fragment, and its three-dimensional structure is presumed to be unaffected.
したがって1本発明に用いられるSPA活性フラグメン
トのアミノ酸配列として次の配列を設計した:門へDN
KFNKEGQNAFYEILIILPNLNEEQI
?NGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKL
NDへロAIIIKC(1) −2このようなアミノ
酸の配列に対応するデオキシリボヌクレオチドのトリプ
レットコドンとしては。Therefore, the following sequence was designed as the amino acid sequence of the SPA active fragment used in the present invention:
KFNKEGQNAFYEILIILPNLNEEQI
? NGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKL
ND Hero AIIIKC (1) -2 as a deoxyribonucleotide triplet codon corresponding to such an amino acid sequence.
宿主となる微生物が好むコドンが望ましいこと言うまで
もないが、特にそれに限定されない。このデオキシリボ
ヌクレオチド配列は、 SPAのFc結合領域を構成す
るポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子の5′
末端にメチオニン開始コドン(ATG)が、そして3゛
末端にシスティンのコドン(TGY)が付加されている
。It goes without saying that codons preferred by the host microorganism are preferable, but the codons are not particularly limited thereto. This deoxyribonucleotide sequence is located at the 5' end of the gene encoding the polypeptide fragment that constitutes the Fc-binding region of SPA.
A methionine initiation codon (ATG) is added to the end, and a cysteine codon (TGY) is added to the 3' end.
次いで、3″末端に転写終止コドン(TAAおよび/あ
るいはTAG )が付加される。さらに、このようにし
て得られた遺伝子をプラスミドベクターに組み込めるよ
うに、ヌクレオチド配列5゛末端(上記開始コドンのさ
らに上流側)および3°末端(上記転写終止コドンのさ
らに下流側)に制限酵素の認識部位が形成される。例え
ば5”側にはのようなEcoRIの認識部位が、さらに
3゛側にはのようなりan旧の認識部位が付加される。Next, a transcription stop codon (TAA and/or TAG) is added to the 3'' end.Furthermore, in order to integrate the gene thus obtained into a plasmid vector, a nucleotide sequence at the 5'' end (further than the above start codon) is added. (upstream side) and the 3° end (further downstream of the above transcription stop codon).For example, an EcoRI recognition site like this is formed on the 5'' side, and an EcoRI recognition site on the 3'' side is formed. An old recognition site is added like this.
本発明に用いられるSPA活性フラグメントのアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列として。As a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the SPA active fragment used in the present invention.
次の配列を設計した:
へへTTCATGGCXGAYAAYAARTTYAA
YAARGARCARCARAAYGCXTTYTAY
GAl?ATZJJJcAYJJJCCXAAYJJJ
AAYGARGARCARCGXAAYGGXTTYA
TYCARLLLJJJAARGAYGAYCCXLL
LCARLLLGCXAAYJJJJJJGCXGAR
GCXAARAARJJJAAYGAXGCXCARG
CXCCXAARTGYTAATAGG
(It )ここで
、上記ヌクレオチド配列を構成する記号はそれぞれ次の
意味を有する:A:アデニン、Gニゲアニン、C:シト
シン5 T:チミン、R:AまたはG、Y:CまたはT
、Z:A、CまたはTX:A、G、CまたはT、JJJ
:Leuに対応するコドン、LLL:Serに対応する
コドン。I designed the following sequence: hehe TTCATGGCXGAYAAYAARTTYAA
YAARGARCARCARAAYGCXTTYTAY
GAL? ATZJJJcAYJJJCCXAAYJJJ
AAYGARGARCARCGXAAYGGXTTYA
TYCARLLLLJJJAARGAYGAYCCXLL
LCARLLGCXAAYJJJJJGCXGAR
GCXAARAARJJJAAYGAXGCXCARG
CXCCXAARTGYTAATAGG
(It) Here, the symbols constituting the above nucleotide sequence have the following meanings: A: Adenine, Gnigeanine, C: Cytosine 5, T: Thymine, R: A or G, Y: C or T.
, Z: A, C or TX: A, G, C or T, JJJ
: Codon corresponding to Leu, LLL: Codon corresponding to Ser.
上記のように設計されたポリヌクレオチドを合成するに
あたり、まず第1図に示したような、上方ストランド1
3本および下方ストランド12木の計25本のオリゴヌ
クレオチドを文献上公知の方法(固相法)により合成し
た。ここでオリゴヌクレオチドの大きさは、精製が容易
なように一般に10〜20数品体程度の大きさで合成し
た。また各オリゴマーは1次のような注意を払って設計
した。To synthesize the polynucleotide designed as described above, first, the upper strand 1 as shown in Figure 1 is synthesized.
A total of 25 oligonucleotides, 3 oligonucleotides and 12 lower strands, were synthesized by a method known in the literature (solid phase method). Here, the size of the oligonucleotides was generally about 10 to 20 oligonucleotides synthesized to facilitate purification. Each oligomer was designed with the following precautions taken.
A)宿主としてエセリシア・コリー(E、 coli
)を想定して、 E、 coliのコドン使用表から
最も使用頻度の高いコドンを優先して用いた。A) E. coli (E. coli) as host
), we prioritized and used the most frequently used codon from the E. coli codon usage table.
B)合成の際、3゛末端がA(アデニン)の場合にはデ
プリネーションが生じ易いので、3′末端はなるべくA
以外となるようにした。B) During synthesis, if the 3′ end is A (adenine), depurination is likely to occur, so the 3′ end should be A (adenine) as much as possible.
I made it so that it was something other than that.
C)オリゴマーを結合するときに望ましくない結合が起
こらないように、充分にコンピューター解析による配列
分析を行った。C) Thorough computational sequence analysis was performed to ensure that no undesirable binding occurred when linking the oligomers.
このようにして合成されたオリゴヌクレオチドの各フラ
グメントについてその塩基配列を確認した。次いで第2
図に示したように、各断片をSPA活性フラグメントの
塩基配列に従って、リガーゼを用いて結合させ、2本鎖
を形成させることにより2本発明に用いられるSPA活
性フラグメントの遺伝子を化学合成した。The base sequence of each oligonucleotide fragment thus synthesized was confirmed. Then the second
As shown in the figure, the genes of the two SPA active fragments used in the present invention were chemically synthesized by linking each fragment using ligase to form a double strand according to the base sequence of the SPA active fragment.
刊JL=’71i必参」911策
本発明で用いられる組換えプラスミドは、前記の方法で
化学合成されたSPA活性フラグメントをコードする遺
伝子をλplac5 DNAのラクトースオペロンのプ
ロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプ
ラスミドベクターに導入して得られる。 まず、 SP
A活性フラグメントをコードする遺伝子を組み込むため
のプラスミドベクターを次のようにして構築した。The recombinant plasmid used in the present invention contains the gene encoding the SPA active fragment chemically synthesized by the method described above, the promoter of the lactose operon of the λplac5 DNA, and the β-galactosidase region. Obtained by introducing it into a plasmid vector. First, SP
A plasmid vector for incorporating the gene encoding the A active fragment was constructed as follows.
pBR322とλplac5のDNAをそれぞれ制限酵
素で消化し、得られた消化物をライゲーション反応にに
より連結する。制限酵素としては1例えば、 EcoR
Iが好適に用いられる。また、ライゲーション反応に使
用する酵素としてはT、 DNAリガーゼが好ましい。The DNAs of pBR322 and λplac5 are each digested with restriction enzymes, and the resulting digests are linked by a ligation reaction. Examples of restriction enzymes include EcoR
I is preferably used. Furthermore, as the enzyme used for the ligation reaction, T and DNA ligase are preferred.
このようにして得られたプラスミドDNAを用いてE、
coliを形質転換する。例えば、 K−12株)
IBIOIが好ましい。次いで、形質転換体からプラス
ミドを単離し、 Hindll[で消化した後、アガロ
ースゲル電気泳動法によりプロモーターおよびβガラク
トシダーゼ領域の方向性を調べ、望ましい方向性を有す
るプラスミドを選別する。Using the plasmid DNA thus obtained, E.
Transform E. coli. For example, K-12 strain)
IBIOI is preferred. Next, a plasmid is isolated from the transformant, digested with Hindll, and then the orientation of the promoter and β-galactosidase region is examined by agarose gel electrophoresis to select a plasmid with the desired orientation.
このプラスミドにはEcoRI切断部位が2ケ所あるの
で、そのうちβ−ガラクトシダーゼプロモーターに近い
部位を除去する。そのためには、プラスミドをEcoR
Iで部分消化し、消化物からアガロースゲル電気泳動法
により目的とするDNA断片を分離する。この断片は末
端にEcoRIによる切断で生じた1本鎖部分を有する
ので、これにT4DNAポリメラーゼを作用させてその
1本鎖部分を2本鎖として平滑末端を作る。次いでT、
DNAリガーゼを作用さセテ閉環し、 EcoRIに
よる切断部位が1ケ所のプラスミドを得る。このプラス
ミドを用いて前記のように、肛競旦を形質転換し、テト
ラサイクリン耐性株を選択する。この株のコロニーから
プラスミドDNAを単離し、 EcoRlおよびHin
dI[Iで消化し。Since this plasmid has two EcoRI cleavage sites, the site close to the β-galactosidase promoter is removed. To do so, convert the plasmid into EcoR
Partial digestion is performed with I, and the target DNA fragment is separated from the digested product by agarose gel electrophoresis. Since this fragment has a single-stranded portion at the end resulting from cleavage with EcoRI, T4 DNA polymerase is applied to this fragment to convert the single-stranded portion into double strands to create a blunt end. Then T,
The circle is closed using DNA ligase to obtain a plasmid with one EcoRI cleavage site. This plasmid is used to transform antrum as described above, and tetracycline-resistant strains are selected. Plasmid DNA was isolated from colonies of this strain, and EcoRl and Hin
Digested with dI[I.
性成するDNA断片の大きさをアガロースゲル電気泳動
法で調べて、2ケ所あったEcoRI切断部位のどちら
が除去されているかを決定する。所望の1ケ所、すなわ
ちβ−ガラクトシダーゼプロモーターに近い切断部位が
除去されたプラスミドを選択する。The size of the resulting DNA fragment is examined by agarose gel electrophoresis to determine which of the two EcoRI cleavage sites has been removed. A plasmid with one desired cleavage site removed, ie, a cleavage site near the β-galactosidase promoter, is selected.
このようにして得られたプラスミドをEcoRIおよび
BamH1で完全に消化し、アガロースゲル電気泳動に
より大きい方のDNA断片を得る。この断片に。The plasmid thus obtained is completely digested with EcoRI and BamH1, and the larger DNA fragment is obtained by agarose gel electrophoresis. to this fragment.
上記の化学合成されたSPA活性フラグメントの遺伝子
をライゲーション反応により結合することにより1本発
明で用いられる組換えプラスミドを構築する。ライゲー
ション反応は、 T、 DN^リガーゼおよびATPを
用いて行うのが好ましい。A recombinant plasmid used in the present invention is constructed by ligating the above chemically synthesized SPA active fragment genes through a ligation reaction. Preferably, the ligation reaction is carried out using T, DN^ligase and ATP.
組 えプラスミドによる 主 の
本発明で用いられる形質転換体は、前記の方法で構築さ
れた組換えプラスミド(SPA活性フラグメントをコー
ドする遺伝子が組込まれたプラスミド)を9例えばLc
olt K−12株1! B I Q lのようなエセ
リシア(Escherichia)属の菌株を宿主とし
て形質転換して得られる。宿主細胞は特にエセリシア属
の菌株に限定されず1例えばバチルス属やシュードモナ
ス属の菌株、酵母およびその他の真凹類、ヒトおよびそ
の他の動物の培養細胞あるいは植物の培養細胞を宿主と
してもよい。The transformant used in the present invention using a recombinant plasmid is a recombinant plasmid constructed by the method described above (a plasmid into which a gene encoding a SPA active fragment has been integrated), for example, Lc.
olt K-12 stock 1! It is obtained by transforming a strain of the genus Escherichia such as B I Q 1 as a host. The host cell is not particularly limited to strains of the genus Ethelicia, but may also be, for example, strains of the genus Bacillus or Pseudomonas, yeast and other true cones, cultured cells of humans and other animals, or cultured cells of plants.
まず1本発明で用いられる組換えプラスミドをあらかじ
めCaCl z処理したL co旦に導入する。First, the recombinant plasmid used in the present invention is introduced into a Lcoat tube that has been previously treated with CaClz.
ここで2本発明で用いられる組換えプラスミドにおいて
は、そのテトラサイクリン耐性遺伝子中にSPA活性フ
ラグメントをコードする遺伝子が組み込まれているため
、このプラスミドで形質転換された菌株は、テトラサイ
クリン感受性(Tc’)である。但し、アンピシリン耐
性遺伝子は外来遺伝子により分割されていないので、形
質転換株はアンピシリン耐性(Ap’)となる。従って
、 SPA活性フラグメントをコードする遺伝子を発現
する形質転換株をアンピシリン含有培地9次いでテトラ
サイクリン含有培地を用いてスクリーニングし 6pr
でかつTc″のコロニーを選1尺する。これらのコロニ
ーを幾つか任意に選んで、それらから得られたプラスミ
ドDNAをEcoRIおよびBam1llで消化し、生
成したDNA断片の大きさと塩基配列とを調べ、試験し
た全てについてSPA活性活性フラグメントコードする
遺伝子に一致することをrlf:認する。得られた形質
転換株をE、 coli K225PA−Fcと命名
した。Here, in the recombinant plasmid used in the present invention, a gene encoding a SPA active fragment is integrated into its tetracycline resistance gene, so that the strain transformed with this plasmid has tetracycline sensitivity (Tc'). It is. However, since the ampicillin resistance gene is not divided by the foreign gene, the transformed strain becomes ampicillin resistant (Ap'). Therefore, transformed strains expressing genes encoding SPA active fragments were screened using an ampicillin-containing medium followed by a tetracycline-containing medium.
Select some of these colonies and digest the plasmid DNA obtained from them with EcoRI and Bam1ll, and examine the size and base sequence of the generated DNA fragment. rlf: was found to correspond to the gene encoding the SPA activity fragment for all the genes tested.The obtained transformed strain was named E. coli K225PA-Fc.
に るSPA フーグメン の
上記の形質転換株を培養すればSPA活性フラグメント
が菌体内に生成する。このSP^活性フラグメントはそ
の遺伝子がβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子内に挿入
されているので、β−ガラクI・シダーゼとの融合タン
パクとして発現される。しかし、上記SPA活性フラグ
メントのヌクレオチド配列には5゛末端にメチオニンの
コドン(ATG)が付加されているため2発現されたS
PA活性フラグメントのN末端にはメチオニンが挿入さ
れている。When the above-mentioned transformed strain of SPA fugumen is cultured, SPA active fragments are produced within the bacterial cells. This SP^ active fragment is expressed as a fusion protein with β-galactosidase because its gene is inserted into the structural gene of β-galactosidase. However, since the nucleotide sequence of the above SPA active fragment has a methionine codon (ATG) added to the 5' end, 2-expressed S
A methionine is inserted at the N-terminus of the PA active fragment.
従って2例えばシアノゲンブロマイド(CNBr)で処
理することにより、この融合タンパクからSP^活性フ
ラグメントを分離できる。例えばまず、上記の形質転換
株をアンピシリンを含有するし一ブロス中で培養し、培
養物から遠心分離して得られる菌体をシアノゲンブロマ
イドで処理する。次に。Therefore, the SP^ active fragment can be separated from this fusion protein by treatment with, for example, cyanogen bromide (CNBr). For example, first, the above-mentioned transformed strain is cultured in broth containing ampicillin, and the cells obtained by centrifuging the culture are treated with cyanogen bromide. next.
処理液の凍結乾燥物をIgG固定化アフィニティーカラ
ムで精製することによりSPA活性フラグメントを分離
精製することができる。SPA active fragments can be separated and purified by purifying the lyophilized product of the treated solution using an IgG-immobilized affinity column.
このようにして得られたSPA活性フラグメントは 5
OS−ポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE
)による分子量(約7,000)、マウス血清中のIg
G結合能力、アミノ酸組成、およびアミノ酸配列の解析
において全て理論値と一致するデータを示す。The SPA active fragment thus obtained is 5
OS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE
) molecular weight (approximately 7,000), Ig in mouse serum
Analysis of G-binding ability, amino acid composition, and amino acid sequence all show data consistent with theoretical values.
また、その収率は細胞−個当り3X10’分子である。Also, the yield is 3 x 10' molecules per cell.
上記の方法で得られるSPA活性フラグメントは。The SPA active fragment obtained by the above method is.
そのアミノ酸配列のN末端あるいはC末端にシスティン
が挿入されているため、そのチオール基の反応性を利用
して温和かつ容易な条件で担体に固定化できる。更に、
チオール基の交換反応を利用することにより、カラムの
再生も容易であり、大きなメリットをHする。 また、
チオール基を利用して担体に固定した場合(実施例1
(11)項)と比べ、シアノゲンブロマイドで活性化さ
れた担体にチオール基以外の基2例えば、リジンのアミ
ノ基などを用いて結合させた場合には、 SPA活性フ
ラグメントの活性は大幅に低下することも判明した。Since cysteine is inserted at the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence, it can be immobilized on a carrier under mild and easy conditions by utilizing the reactivity of its thiol group. Furthermore,
By utilizing the exchange reaction of thiol groups, the column can be easily regenerated, providing a major advantage. Also,
When immobilized on a carrier using a thiol group (Example 1
(11)), when a group other than a thiol group 2, such as the amino group of lysine, is bonded to a cyanogen bromide-activated carrier, the activity of the SPA active fragment is significantly reduced. It was also found that
このようにして、従来のSPA製品よりも高いIgG結
合活性を有する状態で担体に安定に固定することが可能
なSPA活性フラグメントが調製される。In this way, SPA active fragments are prepared that can be stably immobilized on carriers with higher IgG binding activity than conventional SPA products.
本発明で用いられる免疫吸着剤を得るには、上記SPA
活性フラグメントを不活性担体に担持させる。不活性担
体としては9例えば、活性炭、シリカゲル、ガラス、セ
ルロース、アガロース、コロジオン、ポリアミノスチレ
ンなどのプラスチックが挙げられる。SPA +活性フ
ラグメントをこれら不活性担体に担持させるには1例え
ば、物理的に吸着(非共有結合的に担持)させる方法;
臭化シアンで活性化したアガロースなとの担体に化学的
に結合(非共有結合的に担持)させる方法がある。To obtain the immunoadsorbent used in the present invention, the above-mentioned SPA
The active fragment is supported on an inert carrier. Examples of inert carriers include activated carbon, silica gel, glass, cellulose, agarose, collodion, and plastics such as polyaminostyrene. In order to support SPA + active fragments on these inert carriers, for example, a method of physically adsorbing (non-covalently supporting);
There is a method of chemically bonding (non-covalently supporting) to a carrier such as agarose activated with cyanogen bromide.
このようにして得られた免疫吸着剤は、悪性腫瘍;特異
抗原、特異抗体、免疫複合体が病因と考えられる自己免
疫疾患;などの治療に有効である。The immunoadsorbent thus obtained is effective in treating malignant tumors; autoimmune diseases thought to be caused by specific antigens, specific antibodies, and immune complexes; and the like.
上記免疫吸着剤を用いて治療を行うには、患者の体液(
例えば血液や腹水)を該免疫吸着剤と接触させた後、再
び患者の体内へ戻せばよい。血液を利用する場合には、
全血を用いると免疫吸着剤との接触時に血球が損傷する
おそれもあるため。To carry out treatment using the above immunoadsorbent, the patient's body fluid (
For example, blood or ascites) may be brought into contact with the immunoadsorbent and then returned to the patient's body. When using blood,
If whole blood is used, blood cells may be damaged when they come into contact with the immunoadsorbent.
血漿もしくは血清を用いることが推奨される。生体の静
脈または動脈からチューブなどを介して連続的に血液を
抜き、血漿分離膜にかけて血漿を得。It is recommended to use plasma or serum. Blood is continuously drawn from a living body's veins or arteries through a tube, etc., and then passed through a plasma separation membrane to obtain plasma.
この血漿を上記免疫吸着剤が充填されたカラムに導き、
このカラムを通過した血漿を再び血球成分と合わせて全
血とし生体静脈内へ注入する潅流法が好適に用いられる
。上記免疫吸着剤と体液とを接触させることにより得ら
れる処理後の体液(例えば、処理血漿、血清、全血など
)に、必要に応じて他の薬剤を添加した治療用組成物を
あらかじめ調製しておくことも可能である。このような
治療用組成物は、上記と同様、静脈を介して投与される
。治療に用いられる免疫吸着剤に含有されるSPA活性
フラグメントの量は、疾患の程度などに応じて異なるが
5通常、患者の体重1 kgあたり0.1〜Longで
ある。治療は、疾患の程度に応じて1回ないし1日から
数日おきに複数回(例えば、10回程度)繰り返して行
われる。このような治療により、悪性腫瘍であれば、腫
瘍組織が壊死もしくは縮小するのが認められる。This plasma is introduced into a column filled with the above immunoadsorbent,
A perfusion method is preferably used in which the plasma that has passed through this column is combined with blood cell components again to form whole blood and injected into the veins of the living body. A therapeutic composition is prepared in advance by adding other drugs as necessary to the treated body fluid (e.g., treated plasma, serum, whole blood, etc.) obtained by bringing the above-mentioned immunoadsorbent into contact with the body fluid. It is also possible to keep it. Such therapeutic compositions are administered intravenously, as described above. The amount of SPA active fragment contained in the immunoadsorbent used for treatment varies depending on the degree of the disease, etc.5, but is usually 0.1 to long per 1 kg of the patient's body weight. The treatment is repeated once or every few days (for example, about 10 times) depending on the severity of the disease. With such treatment, if the tumor is malignant, necrosis or shrinkage of the tumor tissue is observed.
本発明によれば,■gを吸着もしくはIgと相互作用し
うるSPA活性フラグメントを担持した免疫吸着剤を用
いて,悪性RrJ.瘍や自己免疫疾患に対して有効な治
療がなされうる。使用されるSPA活性フラグメントは
, SPAそのものに比べてIgとの結合能力が重量あ
たり約3.5倍であるため.担持盪が少量であっても優
れた効果が得られる。さらに, SPA活性フラグメン
トの分子量は約7,000と小さいため.従来のSPA
を担持した吸着剤を用いたときに認められる,菌体由来
のタンパクであるがゆえに起こると考えられるアレルギ
ー反応がほとんど発生しない。従って.本発明の免疫吸
着剤や組成物を用いて安全に治療を行なうことが可能で
ある。According to the present invention, malignant RrJ. Effective treatments can be provided for cancers and autoimmune diseases. The SPA active fragment used has approximately 3.5 times the Ig binding ability per weight compared to SPA itself. Excellent effects can be obtained even with a small amount of support. Furthermore, the molecular weight of the SPA active fragment is as small as approximately 7,000. Traditional SPA
Almost no allergic reactions occur when using adsorbents that carry . Therefore. It is possible to safely perform treatment using the immunoadsorbent and composition of the present invention.
(実施例) 以下に本発明を実施例につき説明する。(Example) The invention will be explained below with reference to examples.
尖隻桝土
(SPA活性フラグメント固定化カラムの作製)特開昭
62−111688号に記載のSPA様物質の製造方法
に従って, SPA活性フラグメントの精製物を以下の
ように調製した。Purified SPA active fragments were prepared as follows according to the method for producing SPA-like substances described in JP-A-62-111688 (Preparation of SPA active fragment immobilization column).
このSPA活性フラグメントのアミノ酸配列は,SP八
の4つのボリペフ゜チドフラグメントであるA,B,C
およびDのうち,最も活性が強いと考えられるポリペプ
チドフラグメントBに相当する配列から構成される。こ
のポリペプチドフラグメントBのアミノ酸配列のC末端
にシステイン(C)がそしてN末端にはメチオニン(M
)が付加された次のような配列を設計した:
MADNKFNKEQ(INAFYEILIILPNL
NEEQRNGFIQSLκDDPSQSANLLAE
AKKLNDAQAPKC
( 1 ) − 2ここで.上
記アミノ酸配列を構成する記号は.それぞれ次の意味を
有する:A:アラニン,D=アスパラギン酸,E:グル
タミン酸,F:フェニルアラニン,G:グリシン,H:
ヒスチジン,I:イソロイシン,K:リジン,L:ロイ
シン,M:メチオニン,N:アスパラギン,P:プロリ
ン,Q:グルタミン.R:アルギニン.S:セリン,Y
:チロシン。The amino acid sequence of this SPA active fragment consists of the four polypeptide fragments A, B, and C of SP8.
and D, it is composed of a sequence corresponding to polypeptide fragment B, which is considered to have the strongest activity. The amino acid sequence of this polypeptide fragment B has cysteine (C) at the C-terminus and methionine (M
) was added to the following sequence: MADNKFNKEQ(INAFYEILIILPNL
NEEQRNGFIQSLκDDPSQSANLLAE
AKKLNDAQAPKC
(1)-2Here. The symbols that make up the above amino acid sequence are. Each has the following meaning: A: Alanine, D = Aspartic acid, E: Glutamic acid, F: Phenylalanine, G: Glycine, H:
histidine, I: isoleucine, K: lysine, L: leucine, M: methionine, N: asparagine, P: proline, Q: glutamine. R: arginine. S: Serin, Y
: Tyrosine.
上記アミノ酸配列(N− 2をコードするヌクレオチド
配列として次の塩基配列を設計した:AATTCATG
GCTGACAACAAATTCAACAAGGAAC
AGCAG^^TGCTTTCTATGAAATCTT
GCATCTGCCTAACTTG八八CGAAGAG
CAGCGTAACGGCTTCATCCAGTCCC
TT八八GGACGACCCTAGCCAATCCGC
TAACCTCCTCGCGGAGGCTAAGAAG
CTGAACGATGCTCAGGCTCCGAAGT
GCTAATAGG
( II ) ”ここで,上記ヌクレオ
チド配列を構成する記号は,それぞれ次の意味を有する
:A:アデニン,G:グアニン,C:シトシン,T:チ
ミン。The following base sequence was designed as the nucleotide sequence encoding the above amino acid sequence (N-2: AATTCATG
GCTGACAACAAAAATTCAACAAGGAAC
AGCAG^^TGCTTTCTATGAAATCTT
GCATCTGCCTAACTTG88CGAAGAG
CAGCGTAACGGCTTCATCCAGTCCC
TT88GGACGACCCTAGCCCAATCCGC
TAACCTCCTCGCGGAGGCTAAGAAG
CTGAACGATGCTCAGGCTCCGAAGT
GCTAATAGG
(II) ``Here, the symbols constituting the above nucleotide sequence have the following meanings: A: adenine, G: guanine, C: cytosine, T: thymine.
各断片が第1図に示す塩基配列を有する25本(上方ス
トランド13本([1−013),下方ストランド12
本(Ll − L12)よりなる各オリゴヌクレオチド
は,固相法により合成した。縮合方法としては,例えば
トリエステル法やホスファイト法が採用され得.今回は
次に示すトリエステル法により行った。Each fragment has 25 base sequences (13 upper strands ([1-013), 12 lower strands] as shown in Figure 1.
Each oligonucleotide consisting of this (Ll-L12) was synthesized by a solid phase method. As the condensation method, for example, a triester method or a phosphite method can be adopted. This time, the following triester method was used.
固相法の担体としては.1%ジビニルベンゼンを含むポ
リスチレン樹脂(Miyoshi K. et al.
Nucleic Acids Res.8,5507
(1980))またはシリカゲル(MaLteucci
M.D.,Caruthers M.l+., J
Am. Chem.Soc., 103.3185 (
1981))が好ましく,本実施例ではポリスチレン樹
脂を用いた。As a carrier for solid phase method. Polystyrene resin containing 1% divinylbenzene (Miyoshi K. et al.
Nucleic Acids Res. 8,5507
(1980)) or silica gel (MaLteucci
M. D. , Caruthers M. l+. , J
Am. Chem. Soc. , 103.3185 (
1981)) is preferred, and polystyrene resin was used in this example.
まず.4種類のデオキシリボヌクレオチド.すなわち,
デオキシシチジン,デオキシアデノシンデオキシグアノ
シン,デオキシチミジンを常法によりそれぞれ3゜−コ
ハク酸エステルとした(BrokaC. et a
l., Nucleic Acids Res.
8.5461 (1980))これを上記担体の
アミノ基と結合したもの(ヌクレオシド担体)を,前記
オリゴヌクレオチトの3″末端に用いた。次いで,これ
らの3゛末端ヌクレオシド担体に,所望のジヌクレオチ
ドを.縮合剤を用いて順次5゛方向に結合させた。縮合
剤としては,メシチレンスルホニル−3−ニトロトリア
ゾリド(?ISNT), 2, 4. 6−トリ
イソブロビルベンゼンスルホニル−3−ニトロトリアゾ
リド(TPSNT) ,メシチレンスルホニルーテトラ
ゾリド(MSTe), 24.61−リイソブロピル
ベンゼンスルホニルーテトラゾリド(TPSTe)など
が適当である。first. Four types of deoxyribonucleotides. That is,
Deoxycytidine, deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxythymidine were each made into 3°-succinate esters by a conventional method (Broka C. et al.
l. , Nucleic Acids Res.
8.5461 (1980)) bonded to the amino group of the above-mentioned carrier (nucleoside carrier) was used at the 3'' end of the oligonucleotide.Next, the desired nucleoside carrier was attached to these 3'' end nucleoside carriers. Nucleotides were sequentially bonded in the 5' direction using a condensing agent.The condensing agents included mesitylenesulfonyl-3-nitrotriazolide (?ISNT), 2, 4.6-triisobrobylbenzenesulfonyl-3- Suitable examples include nitrotriazolide (TPSNT), mesitylenesulfonyltetrazolide (MSTe), and 24.61-lyisopropylbenzenesulfonyltetrazolide (TPSTe).
上記方法に使用されるジヌクレオチドは、4種類のヌク
レオシドの順列に応じて16種類が必要である。その合
成法は2例えば第3図に示す方法によることができる。Sixteen types of dinucleotides are required to be used in the above method, depending on the permutation of the four types of nucleosides. The synthesis method can be, for example, the method shown in FIG.
第3図において、 DMTrは4′。In FIG. 3, DMTr is 4'.
4”−ジメトキシトリチル基を示す。BおよびB′は6
−N−ベンゾイルアデニン−9−イル基、4N−ヘンジ
イルシトシン−1−イル基、2−Nイソ−ブチリルグア
ニン−9−イル基およびチミン−1−イル基から選ばれ
る基であり、同一であっても異なっていてもよい。MS
NTはメシチレンスルホニル−3−ニトロトリアゾリド
を示す。4"-dimethoxytrityl group. B and B' are 6
-N-benzoyladenine-9-yl group, 4N-hendiylcytosin-1-yl group, 2-N iso-butyrylguanine-9-yl group and thymine-1-yl group, and are the same may be different. M.S.
NT represents mesitylenesulfonyl-3-nitrotriazolide.
この方法をオリゴヌクレオチドLll (5’CTTC
GGAGCCTGAGCATCGTT3°)の場合を例
に挙げて具体的に説明する。まず、デオキシシチジン担
体(ポリスチレン樹脂担体にデオキシシチジンを担持さ
せたもの)をピリジン中室温で放置後1次の操作により
反応を行った。This method was applied to oligonucleotide Lll (5'CTTC
GGAGCCTGAGCATCGTT3°) will be specifically explained using an example. First, a deoxycytidine carrier (deoxycytidine supported on a polystyrene resin carrier) was allowed to stand in pyridine at room temperature and then reacted by the following operation.
(1)デオキシシチジン担体をジクロロメタン−メタノ
ールで洗浄する。(1) Wash the deoxycytidine carrier with dichloromethane-methanol.
(2) 2%ヘンゼンスルホン酸(ジクロロメタンメタ
ノール)溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し。(2) After adding 2% Hensensulfonic acid (dichloromethane methanol) solution, wash with the same solvent.
操作をくり返して発色しなくなるまで行う。Repeat the operation until the color stops appearing.
(3)ピリジンで洗浄後、ジヌクレオチドのピリジン溶
液を加え、減圧溶媒留去し、さらにメシチレンスルホニ
ル−3−ニトロトリアゾリド(縮合剤)のピリジン溶液
を加え放置した後、ピリジンで洗浄する。(3) After washing with pyridine, a dinucleotide solution in pyridine is added, the solvent is distilled off under reduced pressure, a pyridine solution of mesitylenesulfonyl-3-nitrotriazolide (condensing agent) is added, and the mixture is left to stand, followed by washing with pyridine.
(4)0.1Mジメチルアミノピリジン溶液および無水
酢酸を加えて放置後、ピリジンにより洗浄する。(4) Add 0.1M dimethylaminopyridine solution and acetic anhydride, leave to stand, and then wash with pyridine.
このような操作を、各ジヌクレオチドについて順次繰り
返して10回行った後、得られた樹脂を0.5Mトリメ
チルシリルグアニジウム−ピリジン−2−アルドオキシ
メート(Reere C,B、 et al、、Tet
rahedron Lett、、 2727(1978
))のジオキサン−水の溶液中で振盪した。さらに、こ
の樹脂をピリジン水で洗浄し、濾液と洗液とを合わせて
減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水を加え、加温した。After repeating this operation 10 times for each dinucleotide, the resulting resin was treated with 0.5 M trimethylsilylguanidium-pyridine-2-aldoximate (Reere C, B, et al., Tet
rahedron Lett, 2727 (1978
)) in a dioxane-water solution. Furthermore, this resin was washed with pyridine water, the filtrate and washing liquid were combined and concentrated under reduced pressure, concentrated ammonia water was added to the residue, and the mixture was heated.
アンモニアを留去し、 Dowex 50などのピリジ
ニラ12型樹脂を加え、この樹脂をピリジン−水により
洗浄し、濾液と洗液とを合わせて濃縮した。濃縮液に少
量の水を加え酢酸エチルでオキシムを抽出除去した。水
層を一定量に希釈し、その一部を用いてジメトキシメチ
ルトリチル基の定量を行って全体計を推定した。Ammonia was distilled off, a pyridinyl type 12 resin such as Dowex 50 was added, the resin was washed with pyridine-water, and the filtrate and washings were combined and concentrated. A small amount of water was added to the concentrated solution, and the oxime was extracted and removed with ethyl acetate. The aqueous layer was diluted to a certain amount, and a portion thereof was used to quantify dimethoxymethyltrityl groups to estimate the total amount.
次いで、水層を減圧乾固し、残渣に80%酢酸を加えた
後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、 DEAE−1−ヨバール(Toyop
earl)等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを
行った。Next, the aqueous layer was dried under reduced pressure, 80% acetic acid was added to the residue, the solvent was distilled off, the residue was dissolved in water and ethyl acetate, and the aqueous layer was concentrated.
Ion-exchange chromatography was performed using a method such as earl).
適当な緩衝液中、リン酸塩の濃度勾配で溶出し。Elute with a phosphate gradient in an appropriate buffer.
U、ν、吸収によりオリゴヌクレオチドを検出した後。U, ν, after detecting the oligonucleotide by absorption.
セファデックスG−25カラムクロマトグラフイーによ
り脱塩した。IIPLC(高速液体クロマトグラフィ:
Cz+ シリカゲル担体)および−次元ホモクロマト
グラフィーで単一であることにより純度を判定した。Desalting was performed by Sephadex G-25 column chromatography. IIPLC (high performance liquid chromatography:
Purity was determined by homochromatography (Cz+ silica gel support) and -dimensional homochromatography.
同様の操作を行って、 111−013 、 Ll−L
ll、およびL12の各オリゴヌクレオチドを合成した
。By performing the same operation, 111-013, Ll-L
Oligonucleotides ll and L12 were synthesized.
: SF4活 フラグメントをコードするUn逝片9j
已Vこ巾宿葭認
(+)項で得られた各オリゴヌクレオチドの配列分析を
、二次元ホモクロマトグラフィーにより、基本的には、
ハムバラらの方法により行った。(Bambara、
J、E、、 et al、、 Nucleic
Ac1ds Res、+ 1+331(197
4))。オリゴヌクレオチドLllの二次元ホモクロマ
トグラフィーの結果を例にあげて第4図に示す。: SF4 live fragment code Unteiha 9j
Basically, the sequence analysis of each oligonucleotide obtained in the (+) section was carried out by two-dimensional homochromatography.
This was done by the method of Hambara et al. (Bambara,
J.E., et al., Nucleic
Ac1ds Res, + 1 + 331 (197
4)). An example of the results of two-dimensional homochromatography of oligonucleotide Lll is shown in FIG.
(2)項で塩基配列の確認されたオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの各断片を第2図に従って、 T4DNAノ
ガーゼを用いて以下の方法により結合させた。The oligodeoxyribonucleotide fragments whose nucleotide sequences were confirmed in Section (2) were ligated using T4 DNA nogase according to the following method according to FIG.
まず、ulおよびL12以外の各断片についてその5’
−OH末端を次のように、各々T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼで別々にリン酸化した。First, for each fragment other than ul and L12, its 5'
The -OH termini were each phosphorylated separately with T4 polynucleotide kinase as follows.
DN八へリゴマー断片1 nmolを、T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ1単位および(r −”p ) ATP
(7400Ci/mM) 20 u Ciと、全!1t
lOμffiの50mM )リス塩酸緩衝液(pH8,
0)、 lomM MgCh、 10mMジチオスレイ
トール(DTT)中で30分間37°Cで反応させた。1 nmol of DN 8-heligomeric fragment was combined with 1 unit of T4 polynucleotide kinase and (r-”p) ATP.
(7400Ci/mM) 20 u Ci and all! 1t
lOμffi 50mM) Lis-HCl buffer (pH 8,
0), lomM MgCh, 10mM dithiothreitol (DTT) for 30 minutes at 37°C.
次にすべての5”−〇〇末端をリン酸化するために前記
反応液に50nmolとなるようにATP添加し、37
°Cで1時間さらに反応させ1次いで、90°Cで5分
間加熱することにより反応を停止した。リン酸化の遂行
は。Next, in order to phosphorylate all 5''-〇〇 ends, ATP was added to the reaction solution in an amount of 50 nmol, and 37
The reaction was further allowed to proceed at 1 hour at 90°C, and then the reaction was stopped by heating at 90°C for 5 minutes. The execution of phosphorylation.
−次元ホモクロマトグラフィー後、ラジオオートグラフ
ィーで確認した。■およびL12断片は1次のライゲー
ション反応の過程で目的の遺伝子からの5“末端粘着部
位(EcoRIおよびBam1ll)で結合が起こらな
いように、5”−011末端のリン酸化は行わなかった
。-Dimension homochromatography was followed by radioautography. The 5''-011 end of the (2) and L12 fragments was not phosphorylated to prevent binding at the 5'' end sticky site (EcoRI and Bamll) from the gene of interest during the primary ligation reaction.
このようにして得られたリン酸化されたオリゴヌクレオ
チドU2〜013 、 Ll−Lll 、およびリン
酸化されていないオリゴヌクレオチド11. L12を
第5図に従って、 T4DNAリガーゼを用いて結合さ
ゼた。まず、SP^活性フラグメントに対応する遺伝子
(01−[113およびLl−L12)を適当な群0例
えば次の様な3群に分け、下記のライゲーション反応を
行なった。(第5図)。The thus obtained phosphorylated oligonucleotides U2-013, Ll-Lll and non-phosphorylated oligonucleotide 11. L12 was ligated using T4 DNA ligase according to FIG. First, the genes corresponding to the SP^ active fragments (01-[113 and Ll-L12) were divided into appropriate groups, for example, the following three groups, and the following ligation reaction was performed. (Figure 5).
第1群
第2群
第3群
(以下余白)
上記条件で得られたオリゴヌクレオチド各5μPずつ(
0,5nmolずつ)を混合し、ライゲース緩衝液を加
えて、70mMトリス塩酸緩衝液(pH7,5)、
7mMMgC1z、 10mM DTT、 70 u
M ATP に8周製し、 T4DNAリガーゼ
2単位を用いて、全量50μlとし、15°Cで1晩イ
ンキユベートしてライゲーション反応を行った。反応液
を65゛Cで5分間加熱して反応停止後。Group 1, Group 2, Group 3 (blank below) 5 μP each of the oligonucleotides obtained under the above conditions (
0.5 nmol), add ligase buffer, 70 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5),
7mM MgC1z, 10mM DTT, 70u
The mixture was prepared 8 times in M ATP, the total volume was adjusted to 50 μl using 2 units of T4 DNA ligase, and the ligation reaction was performed by incubating overnight at 15°C. After heating the reaction solution at 65°C for 5 minutes to stop the reaction.
エタノールで沈澱させ、ゲル電気泳動を行なって精製し
た。It was precipitated with ethanol and purified by gel electrophoresis.
得られた第1群から第3群の断片を、上記と同様の方法
でリガーゼにより結合し、 SPA活性フラグメントを
コードする構造遺伝子(196ffi体ヌクレオチド)
を得た。収量は約50pmo+であり、収率は約10%
であった。The obtained fragments of groups 1 to 3 were ligated using ligase in the same manner as above to obtain a structural gene (196ffi nucleotides) encoding the SPA active fragment.
I got it. Yield is about 50 pmo+, yield is about 10%
Met.
ニブラスミドベクターの
SPA活性フラグメントをコードする遺伝子を組み込む
ための、λplac5 DNAラクトースオペロンのプ
ロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプ
ラスミドヘクターを以下のようにして構築した。A plasmid hector containing the promoter and β-galactosidase region of the λplac5 DNA lactose operon for incorporating the gene encoding the SPA active fragment of the niblasmid vector was constructed as follows.
pBR322DNA O,5pg と λplac
5 DNA 1.Ougを各々30ulの100
mM )リス塩酸緩iJi液(pH7,3)5 mM
MgChおよび50mM NaC1?”iJ液液中制
限エンドヌクレアーゼEcoRI 4単位を用い、37
°Cで60分間消化した。反応液を65°Cで30分間
加熱して酵素を不活性化し、各反応液に2.5倍容量の
エタノールを加えてDNAを沈澱させた。各々の沈澱を
T4DN^リガーゼ緩衝液〔20ff1Mトリス塩酸緩
衝液(PI+7.6)10mM MgC1z) 20u
lに溶解した後、各々の溶解液を混ぜ合わせATPと
DTTをそれぞれ最終濃度0.4mM 。pBR322DNA O, 5pg and λplac
5 DNA 1. 100 ug of 30ul each
) Liss hydrochloric acid mild iJi solution (pH 7,3) 5 mM
MgCh and 50mM NaCl? 37 using 4 units of restriction endonuclease EcoRI in iJ solution.
Digested for 60 minutes at °C. The enzymes were inactivated by heating the reactions at 65°C for 30 minutes, and 2.5 volumes of ethanol was added to each reaction to precipitate the DNA. Add each precipitate to T4DN^ligase buffer [20ff 1M Tris-HCl buffer (PI+7.6) 10mM MgC1z] 20u
After dissolving each lysate in 100ml, each solution was mixed and ATP and DTT were added to a final concentration of 0.4mM.
10mMになるように加え、 T、 DNAリガーゼ2
単位を用いて、14°Cで20時間反応した。次いで2
.5倍容量のエタノールを加えてDNAを沈澱させ、得
られたDNA沈澱を100 mM トリス塩酸緩衝液(
pH7,3)50mM NaC1,5mM MgCl
2よりなる溶液102μfに溶解した後、その溶液10
0uffをE、 coli K−12株118IOI
を形質転換(註)するのに用いた。形質転換は、テトラ
サイクリン10μg7mllを含有する[MBラクトー
ス培地(ポリペプトン8g、酵母エキス1.0g、 N
aC15g、KzlIPO42,5g、エオシン360
mg、メチレンブルー60■、ラクトース10g、水
10100Oり上で培養することによって行い、濃い金
属色のコロニーを選択した。これらのコロニーからプラ
スミドDNAを単離し、プロモーターとβ−ガラクトシ
ダーゼ領域の方向性を調べた。すなわち、約0.5μg
のプラスミドDNAを11011Iトリス塩酸緩衝液(
pH7,0)。Add to 10mM, T, DNA ligase 2
The unit was reacted for 20 hours at 14°C. then 2
.. DNA was precipitated by adding 5 times the volume of ethanol, and the resulting DNA precipitate was added to 100 mM Tris-HCl buffer (
pH7,3) 50mM NaCl, 5mM MgCl
After dissolving in 102 μf of a solution consisting of 2, 10 μf of the solution
E, coli K-12 strain 118 IOI
was used for transformation (Note). Transformation was performed using [MB lactose medium (8 g polypeptone, 1.0 g yeast extract, N
aC15g, KzlIPO42.5g, Eosin 360
Colonies with a deep metallic color were selected by culturing on 10,100 mg of methylene blue, 10 g of lactose, and 10,100 O of water. Plasmid DNA was isolated from these colonies and the orientation of the promoter and β-galactosidase region was examined. That is, approximately 0.5μg
The plasmid DNA was dissolved in 11011I Tris-HCl buffer (
pH 7,0).
50mM NaCl、 10+nM MgChを含有
する水溶液、20ulに溶解し、制限酵素旧ndulを
5単位加えDNAを消化した。得られたDNA断片を0
.7%アガロースゲル電気泳動法で解析することにより
、 pBR322プラスミドのEcoR1部位に挿入さ
れたλplac5のプロモーターとβ−ガラクトシダー
ゼ領域の方向性を調べた。その結果、望まれる方向性す
なわちβ−ガラクトシダーゼ領域の転写がテトラサイク
リン耐性遺伝方向へ進むものを以後の実験に用いた。The DNA was dissolved in 20ul of an aqueous solution containing 50mM NaCl and 10+nM MgCh, and 5 units of the restriction enzyme old ndul was added to digest the DNA. The obtained DNA fragment is
.. The orientation of the λplac5 promoter and β-galactosidase region inserted into the EcoR1 site of the pBR322 plasmid was investigated by analysis using 7% agarose gel electrophoresis. As a result, those in which transcription of the β-galactosidase region proceeds in the desired direction, that is, in the direction of inheriting tetracycline resistance, were used in subsequent experiments.
(註)形質転換の方法 ξ 吐の菌株をL−プロス(ポリペプトン10g。(Note) Transformation method ξ vomiting strain of L-pros (polypeptone 10g.
酵母エキス5g 、 NaC15g 、グリコース5g
および水1000IIIIl、 pH7,2)30戚に
接種し、37°CでODa。。=0.7まで培養し、0
°Cにて6,000rpm、 10分間遠心することに
より集菌した。菌体をO,1M MgCIz30厩に懸
濁し、O″Cにて6.OOOrpm、 10分間さらに
遠心し、集めた菌体を0.1M CaCl□15m1に
懸濁し、水中に1時間放置した。その後、0°Cにて6
,000rpm。Yeast extract 5g, NaC 15g, glycose 5g
and water 1000IIIL, pH 7,2) and ODa at 37°C. . = 0.7, 0
Bacteria were collected by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes at °C. The bacterial cells were suspended in 30 ml of 0.1 M MgCIz and further centrifuged for 10 minutes at 6.00 rpm at O''C.The collected bacterial cells were suspended in 15 ml of 0.1 M CaCl and left in water for 1 hour. , 6 at 0°C
,000rpm.
10分間遠心を行い fiめた菌体を0.IM CaC
Iz 1.5mlに懸濁した。このCaCIz処理菌体
懸濁液0.2mlに適当量のDNAを加えたEcoRI
反応緩衝液(100mM トリス塩酸、 50mM N
aC1、5mM MgCIz、 pH7,3)100μ
mを加え、0°Cで60分間放置した。このCaC1z
処理菌体とDNAを含有する混合物0.3allを上記
の1□−プロス2.5mlに加え、37°Cで、90分
間振盪培養を行った。得られた培養物を希釈して選択培
地上にプレコーティングし、37°Cにて1日間培養を
行い形質転換コロニーを得た。選択培地は、特に記載し
ない限り、L−プロス栄養寒天培地1.5%にアンピシ
リンおよびテトラサイクリンを最終濃度がそれぞれ40
ug/mlおよび10ug/rtrlとなるように加え
たものを用いた。この選択培地を用いてアンピシリン耐
性株、テトラサイクリン耐性株を選択した。Centrifuge for 10 minutes and remove the microbial cells to 0.0%. IM CaC
It was suspended in 1.5 ml of Iz. An appropriate amount of DNA was added to 0.2 ml of this CaCIz-treated bacterial cell suspension.
Reaction buffer (100mM Tris-HCl, 50mM N
aC1, 5mM MgCIz, pH7,3) 100μ
m was added and left at 0°C for 60 minutes. This CaC1z
0.3all of the mixture containing treated bacterial cells and DNA was added to 2.5ml of the above 1□-pros, and cultured with shaking at 37°C for 90 minutes. The obtained culture was diluted and pre-coated on a selective medium, and cultured at 37°C for 1 day to obtain transformed colonies. The selection medium was L-pros nutrient agar 1.5% with ampicillin and tetracycline at a final concentration of 40% each, unless otherwise specified.
ug/ml and 10 ug/rtrl were used. Ampicillin-resistant strains and tetracycline-resistant strains were selected using this selection medium.
上記の方法で得られたプラスミドはEcoRI切断部位
が2ケ所あるので、そのうちβ−ガラクトシダーゼプロ
モーターに近い部位を以下のようにして除去した。Since the plasmid obtained by the above method had two EcoRI cleavage sites, the site close to the β-galactosidase promoter was removed as follows.
プラスミドDNA 10ugを制限酵素EcoRI 1
.6単位を用いて部分消化した後1反応液を0.7%ア
ガロースゲル電気泳動にかけることにより部分消化した
DNA断片を分離した。DNA断片はエチジウムフロマ
イト(0,5gg/Id)で染色することにより確認し
た。ゲルから目的とするDNA断片を電気泳動法で?8
出し、フェノールを用いてエチジウムブロマイドを抽出
除去した。水相よりエタノール沈澱法を用いて目的とす
るDNA断片を沈澱として得た。Add 10ug of plasmid DNA to restriction enzyme EcoRI 1
.. After partial digestion using 6 units, one reaction solution was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to separate partially digested DNA fragments. DNA fragments were confirmed by staining with ethidium furomite (0.5 gg/Id). Is the desired DNA fragment extracted from the gel by electrophoresis? 8
Then, ethidium bromide was extracted and removed using phenol. The desired DNA fragment was obtained as a precipitate from the aqueous phase using an ethanol precipitation method.
このDNA沈澱にT、 DNAポリメラーゼ緩衝液〔1
00mM)リス塩酸緩衝液(pl+8.8)、10+w
M MgC1z、25mM(NH4) zS04,11
01I EDTA 25.Ou g / m”牛血清ア
ルブミン)40μ2を加えて溶解させた。次いでこの溶
液に、 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGT
P、各々4mM溶液より各々5μ!ずっと、 100
mMβ−メルカプトエタノール5μlを加えた後、 T
4DNAポリメラーゼl単位を加えて37“Cにて30
分間反応させた。次いで。Add T to this DNA precipitate, DNA polymerase buffer [1
00mM) Lis-HCl buffer (pl+8.8), 10+w
M MgC1z, 25mM (NH4) zS04,11
01I EDTA 25. 40μ2 of bovine serum albumin (Oug/m”) was added and dissolved. Then, to this solution were added dATP, dTTP, dCTP, dGT.
P, 5μ each from 4mM solution! Forever, 100
After adding 5 μl of mM β-mercaptoethanol, T
Add 4 l units of DNA polymerase for 30 minutes at 37"C.
Allowed to react for minutes. Next.
反応液を65°Cにて10分間加熱し、2.5倍容量の
エタノールを加えてDNAを沈澱させた。得られたDN
A沈澱をT、 DNAリガーゼ緩衝液(20mM )リ
ス塩酸緩衝液(pH7,6)、10mM MgC1z
) 40u lに溶解し、 ATP。The reaction solution was heated at 65°C for 10 minutes, and 2.5 times the volume of ethanol was added to precipitate the DNA. Obtained DN
A, precipitate, DNA ligase buffer (20mM), Lis-HCl buffer (pH 7,6), 10mM MgC1z
) ATP dissolved in 40ul.
DTTを各々最終濃度0.4 mM、 10mM4こな
るよう添加し、 Ta DNAリガーゼ2単位を加え1
4°Cで20時間反応させた。エタノールでDNAを沈
澱させた後、−旺C9Li−に一12株11B(Olを
形質転換するのに用いた。テトラサイクリン10μl
/ mlを加えた栄養寒天培地で培養してテトラサイク
リン耐性コロニーを1ltffした。DTT was added to a final concentration of 0.4 mM and 10 mM, respectively, and 2 units of Ta DNA ligase was added.
The reaction was carried out at 4°C for 20 hours. After precipitating the DNA with ethanol, it was used to transform 112 strain 11B (Ol) into -C9Li-. 10 μl of tetracycline
/ml was cultured on a nutrient agar medium to obtain 1ltff of tetracycline-resistant colonies.
出現したコロニーからプラスミドDNAを分離し。Plasmid DNA was isolated from the colonies that appeared.
制限酵素EcoRTとHindnlで消化した後、得ら
れたDNA断片の大きさをアガロースゲル電気泳動法で
調べることにより、断片中2ケ所あったEcoR1部位
のどちらの部位が消失しているかを明らかにすることが
できた。その結果、所望のEcoR1部位、すなわちβ
−ガラクトシダーゼプロモーターに近接するEcoR1
部位が1ケ所消失していることが確認されたプラスミド
を、 SPA活性フラグメントをコードする遺転子のク
ローニング用プラスミドベクターとした。After digestion with the restriction enzymes EcoRT and Hindnl, the size of the resulting DNA fragment is examined by agarose gel electrophoresis to determine which of the two EcoR1 sites in the fragment has been lost. I was able to do that. As a result, the desired EcoR1 site, namely β
-EcoR1 close to the galactosidase promoter
A plasmid in which it was confirmed that one site had been deleted was used as a plasmid vector for cloning a gene encoding a SPA active fragment.
このプラスミドベクターはEcoRIおよびBam1l
l制限酵素切断部位をそれぞれ1ケ所有する。従って化
学合成により、またはプラスミドより得たEcoRTお
よびBam旧の粘着末端をもつ遺伝子を、ライゲーショ
ン反応を用いてこのプラスミドベクターに容易に導入す
ることができる。さらに、この組換えプラスミドでE、
coliに一12株)IBIOIを形質転換すると
、AprかつTc’であるコロニーを選択することによ
り目的とするクローンを容易に得ることができる。This plasmid vector contains EcoRI and Bam1l
Each has one restriction enzyme cleavage site. Therefore, genes with sticky ends of EcoRT and Bam obtained by chemical synthesis or from plasmids can be easily introduced into this plasmid vector using a ligation reaction. Furthermore, with this recombinant plasmid, E.
When E. coli is transformed with IBIOI, the desired clone can be easily obtained by selecting colonies that are Apr and Tc'.
(4)項で得られたプラスミドベクターに(3)項で得
られたSPA活性フラグメントをコードするDNA配列
を組み込んだ組換えプラスミドを以下のようにして構築
した(第6図参照)。A recombinant plasmid in which the DNA sequence encoding the SPA active fragment obtained in section (3) was incorporated into the plasmid vector obtained in section (4) was constructed as follows (see Figure 6).
まず、(3)項で得られたSPA活性フラグメントをコ
ードするDNA 1.0 μgを20mM トリス塩酸
緩衝液(pH,7,6)、10mM MgCIzからな
る溶液23μ!中で95°Cにて2分間加熱し、氷水中
で冷却後、 ATP 1.2 nmolT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ5単位、 DTT 10mMを加え、3
7°Cで20分間反応させてDNAの5°−011末端
をリン酸化した。すべての5”−011末端をリン酸化
するために1反応液を95°Cで2分間再度加熱し。First, 1.0 μg of the DNA encoding the SPA active fragment obtained in section (3) was added to 23 μg of a solution consisting of 20 mM Tris-HCl buffer (pH, 7,6) and 10 mM MgCIz. After heating at 95°C for 2 minutes in a tube and cooling in ice water, 1.2 nmol of ATP, 5 units of T4 polynucleotide kinase, and 10 mM of DTT were added.
The reaction was carried out at 7°C for 20 minutes to phosphorylate the 5°-011 end of the DNA. One reaction was reheated at 95°C for 2 minutes to phosphorylate all 5''-011 ends.
水中で冷却後1反応液量の1/10容量の100mM
DTTおよび5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを
加え、37”Cで20分間さらに反応させ1次いで95
°Cで2分間加熱した後ゆっくりと室温にもどした。After cooling in water, 100mM in 1/10 volume of 1 reaction solution volume
Add DTT and 5 units of T4 polynucleotide kinase and incubate for 20 minutes at 37"C.
After heating at °C for 2 minutes, the mixture was slowly returned to room temperature.
次に(4)項で得られたプラスミドベクターDNA 5
μgを制限酵素EcoRIとBamHI各々10単位を
用いて完全に消化したものを0.7%アガロースゲル電
気泳動法で分離し、大きいON^断片を電気泳動法によ
り回収した。Next, the plasmid vector DNA obtained in section (4) 5
μg was completely digested using 10 units each of restriction enzymes EcoRI and BamHI, and the resulting product was separated by 0.7% agarose gel electrophoresis, and large ON^ fragments were recovered by electrophoresis.
このようにして得たプラスミドベクターのEcoRI/
BamHTの断片oNA1μgと、先に得た5°−OH
末端をリン酸化したSPA活性フラグメントをコードす
るDNA 25ngとを20mMトリス塩酸緩衝液(p
H7,6) 、 10mMMgCh、10mM DTT
、 0.4 mM ATPからなる溶液30μεに溶か
し、 T、 DNAリガーゼl単位を用いて5°Cで1
6時間反応させた。反応液に2倍容量のエタノールを加
え1組換えプラスミドDNAを沈澱物として得た。EcoRI/ of the plasmid vector thus obtained
1 μg of BamHT fragment oNA and the previously obtained 5°-OH
25 ng of DNA encoding a terminally phosphorylated SPA active fragment was added to 20 mM Tris-HCl buffer (p
H7,6), 10mM MgCh, 10mM DTT
, dissolved in 30 με of a solution consisting of 0.4 mM ATP and incubated at 5 °C using 1 unit of T, DNA ligase.
The reaction was allowed to proceed for 6 hours. Twice the volume of ethanol was added to the reaction solution to obtain one recombinant plasmid DNA as a precipitate.
(5)項で得られた組換えプラスミドDNAの沈澱を1
00 mM トリス塩酸緩衝液(pH7,6)、6mM
MgCl2,66mMNaClよりなる?8液100
μgに?8解させた。The precipitate of recombinant plasmid DNA obtained in section (5) was
00mM Tris-HCl buffer (pH 7,6), 6mM
Consists of MgCl2, 66mM NaCl? 8 liquid 100
To μg? I made them understand 8.
他方、L 匹旦に一12株11BIOIの新鮮な一夜培
養菌液をL−ブロスl:lOOに希釈し、37°Cで振
盪培養して00.。。−0,1−0,15まで増殖させ
た。菌体をペレット状に集め(日立CR26+1遠心機
のRPRW90−ターにより5°Cで5分間、 500
0rpmの遠心による)、もとの半容量の水冷50mM
MgC1,; 10mMNaCzH+Oz+ pH5
,6中に再懸濁させ、そしてO′Cにて20分間静置し
た。前記と同様にペレット状に集め、氷冷100mMM
gC1z ; 75mM CaC1z ; 10mM
NaCzHzOz。On the other hand, a fresh overnight culture of 112 strains of 11 BIOI was diluted into L-broth 1:100 and cultured with shaking at 37°C. . . -0,1-0,15. Collect the bacterial cells into a pellet (500 ml for 5 minutes at 5°C using an RPRW90-ter of a Hitachi CR26+1 centrifuge)
(by centrifugation at 0 rpm), half the original volume of water-cooled 50mM
MgC1,; 10mM NaCzH+Oz+ pH5
, 6 and left at O'C for 20 minutes. Collect into pellets in the same manner as above, and add ice-cold 100mM
gC1z; 75mM CaC1z; 10mM
NaCzHzOz.
pl+5.6中に再懸濁させた。Resuspend in pl+5.6.
このようにしてCaC1,処理したE、 coli
K−12株118101と先に得た組換えプラスミドD
NAの溶液とをO″Cにて混合後(総量200μi)、
0°Cにて10分間放置し2次いで42°Cで1分間ヒ
ートショックし、さらに25°Cにて20分間放置後、
1−のL−ブロス(1%Bacto−tryptone
、 0.5%酵母エキス。In this way, CaC1, treated E. coli
K-12 strain 118101 and previously obtained recombinant plasmid D
After mixing with the NA solution at O″C (total amount 200μi),
After leaving at 0°C for 10 minutes, heat shock at 42°C for 1 minute, and then leaving at 25°C for 20 minutes.
1-L-broth (1% Bacto-tryptone
, 0.5% yeast extract.
1%NaC1)を加えて、1時間振盪した。この溶液を
50μg/allのアンピシリンを含む1.5%寒天し
一ブロス上に接種し、37°Cで1夜インキユヘートし
た。8XIO5コロニ一/μg DNAの形質転換効率
が恒常的に観察された。1% NaCl) was added and shaken for 1 hour. This solution was inoculated onto 1.5% agar broth containing 50 μg/all ampicillin and incubated overnight at 37°C. A transformation efficiency of 8XIO5 colonies/μg DNA was consistently observed.
以上の方法で得られた形質転換株は、アンピシリン40
μg/m1およびグルコース0.5%を含む栄養寒天培
地にて37°Cで一夜培養し、生じたコロニーを15μ
g/mllのテトラサイクリンを含む栄養寒天培地にレ
プリカして Tc Sのコロニーをffl tJeした
。100個の4prコロニーのうち85個がTc′″で
あった。The transformed strain obtained by the above method is ampicillin 40
Cultured overnight at 37°C on nutrient agar medium containing μg/ml and 0.5% glucose, and the resulting colonies were divided into 15μ
Colonies of TcS were replicated onto a nutrient agar medium containing g/ml of tetracycline. 85 out of 100 4pr colonies were Tc''.
: えプラスミドONへの
lOμg/mlのアンピシリンを含むし一ブロス中で一
夜プレカルチャーした培養菌液をト9培地に1%となる
ように加え、ロータリー・インキュベーター(25Or
pm)により37°Cで、 0D600が0.6に達す
るまで増殖させた。次いでクロラムフェニコールを25
0■/1添加し、さらに培養液を37°Cで一夜振盪し
培養を続けた。菌体は遠心分離(5,OOOrpm10
分、4°C1日立CR26H) して収菌し、このペレ
ットを水冷したTE緩衝液にて洗浄した後、再び遠心分
離した(5.000rpm、 10分、4°C8日立C
R26H)。: To plasmid ON, add a culture solution containing 10 μg/ml of ampicillin and precultured overnight in broth to 1% to 9 medium, and incubate in a rotary incubator (25 or
pm) at 37°C until 0D600 reached 0.6. Then 25% of chloramphenicol
0/1 was added, and the culture solution was further shaken at 37°C overnight to continue culturing. The bacterial cells were centrifuged (5, OOOrpm10
The pellet was washed with water-cooled TE buffer and centrifuged again (5.000 rpm, 10 minutes, 4°C, 8 Hitachi CR26H).
R26H).
このベレットを水冷下、溶菌緩衝液(20mM トリス
塩酸緩衝液(pl+8.0) 、 2mM EDTA
、 25%シヨ11り20dに懸濁し、これに20m
g/dのリゾチームを2戚加え、水冷下10分間溶菌さ
せた。次いで、 500mMEDTAを1 ml加え、
10分間放置した後、1%トリトンX−100を1In
1加え、さらに水冷下にて1時間溶菌させた。このライ
ゼートを40,000rpm、 4°Cで1時間超遠心
分離し、この上清液をメスシリンダーにデカンテーショ
ンした。これにエチジウムブロマイド100 ug 7
mMおよびCsC12を0.95g 7mMとなるよう
に加え、25°Cにて40,000rpmで16時間超
遠心分離し、プラスミド画分を採取した。エチジウムブ
ロマイドの除去はイソアミルアルコールで3回抽出して
行なった。このプラスミドは、−夜T[緩衝液で透析し
、エタノール沈澱することによって回収した。The pellet was cooled with water and mixed with lysis buffer (20mM Tris-HCl buffer (pl+8.0), 2mM EDTA).
, suspend in 20d of 25% water, add 20m to this
2 g/d of lysozyme was added and the cells were lysed for 10 minutes under water cooling. Next, add 1 ml of 500mMEDTA,
After standing for 10 minutes, add 1 In of 1% Triton X-100.
1 was added, and the bacteria were further lysed for 1 hour under water cooling. The lysate was ultracentrifuged at 40,000 rpm for 1 hour at 4°C, and the supernatant was decanted into a graduated cylinder. Ethidium bromide 100ug 7
mM and CsC12 were added at 0.95 g to 7 mM, and the mixture was ultracentrifuged at 25°C and 40,000 rpm for 16 hours to collect the plasmid fraction. Ethidium bromide was removed by extraction with isoamyl alcohol three times. The plasmid was recovered by dialysis against T buffer and ethanol precipitation.
(8:DN八へ置のl〕
DNA配列の決定はマキサム−ギルバートらの方法(M
axam、A、M、、 et al、、 Proc、N
atl、Acad、Sci。(8: DN8) The DNA sequence was determined using the method of Maxam-Gilbert et al. (M
axam, A.M., et al., Proc.N.
atl, acad, sci.
11、s、A、、 74.560(1977) )で行
なった。11, S. A., 74.560 (1977)).
まず、Aρ′でかつTc’のコロニーをいくつか任意に
選び、それらから得られたプラスミドDNAをEcoR
IとBamtllとで消化し、生成した小さい方の…P
I/BamHI DNA断片の大きさと塩基配列を調べ
たこのことにより、試験した全てについてSP^活性フ
ラグメントをコードするDNAに一致することが6童認
された。First, some Aρ' and Tc' colonies were arbitrarily selected, and the plasmid DNA obtained from them was transformed into EcoR.
The smaller...P produced by digestion with I and Bamtll
By examining the size and base sequence of the I/BamHI DNA fragments, it was found that all of the tested fragments matched the DNA encoding the SP^ active fragment.
得られた形質転換株でSPAP性フラグメントをコード
する遺伝子を保持する株をE、 coli K125P
A−Fcと命名した。The resulting transformed strain, which retains the gene encoding the SPAP fragment, was transformed into E. coli K125P.
It was named A-Fc.
SP八部活性フラグメントコードするDNAが組み込ま
れた組換えプラスミドを保有するE、 co旦に12
5PA−Fcを、グルコースを除き、 50gg 7m
Mのアンピシリンを含むL−ブロスで5X10’細胞/
mlまで増殖させた。次に、イソプロピルβ−ローチ
オガラクトピラノシド([PTG)を1mMとなるよう
に力Uえ、さらに増殖を2時間継続した。遠心分離(5
,00Orpm、 4 ’Cで10分間)して得られた
菌体を、シアノゲンブロマイド5 mg / mlおよ
び0.1Mのメルカプトエタノールを含む70%ギ酸に
懸濁し、室温で24時間暗所に放置した。E,co dan 12 harboring a recombinant plasmid into which DNA encoding the SP octopartite active fragment has been integrated.
5PA-Fc, excluding glucose, 50gg 7m
5X10' cells/in L-broth containing ampicillin of M.
It was grown to ml. Next, isopropyl β-lowthiogalactopyranoside ([PTG) was added to 1 mM, and proliferation was continued for an additional 2 hours. Centrifugation (5
, 00 Orpm for 10 min at 4'C), the resulting bacterial cells were suspended in 70% formic acid containing 5 mg/ml cyanogen bromide and 0.1 M mercaptoethanol, and left in the dark at room temperature for 24 h. did.
反応液を凍結乾燥後、 251mMリン酸緩衝液(pH
7,0)を加えて残渣を熔解させ、この溶液を10mM
のメルカプトエタノールを含む25mMリン酸緩衝液(
pH7,0)に対して透析した。得られた溶液をIgG
−セファロースカラム(タンパク1■当たりベツドポリ
ニーム20−)に添加し、カラムをIh&。で測定した
ときカラムからもはやタンパクが流出しなくなるまで0
.1Mリン酸緩衝液(ρ)17.0)で洗浄した。After freeze-drying the reaction solution, 251mM phosphate buffer (pH
7,0) to dissolve the residue, and this solution was diluted to 10mM
25mM phosphate buffer containing mercaptoethanol (
Dialyzed against pH 7.0). The resulting solution was IgG
- Added to a Sepharose column (20 ml of Betupolyneem per 1 ml of protein) and added the column to Ih&. 0 until no more protein flows out of the column when measured at
.. Washed with 1M phosphate buffer (ρ) 17.0).
SPAP性フラグメントは0.1Mグリシン−塩酸緩衝
液で溶出した。回収されたタンパクを80%飽和硫酸ア
ンモニウムで沈澱濃縮し、 10mMのメルカプトエタ
ノールを含む10mMリン酸緩衝液(pH7,0)に対
して透析し3次いで凍結乾燥した。SPAP fragments were eluted with 0.1M glycine-hydrochloric acid buffer. The recovered protein was precipitated and concentrated with 80% saturated ammonium sulfate, dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM mercaptoethanol, and then lyophilized.
表1に、E、co旦 K125PA−Fcより、得られ
たSPAP性フラグメントの各精製段階での収率を示す
。この結果より計算すると、ξ coli K125P
A−Pcは少なくとも細胞1個あたり3X105分子の
SPAP性フラグメントを生成していることがわかる。Table 1 shows the yield of the SPAP fragment obtained from E. codan K125PA-Fc at each purification step. Calculating from this result, ξ coli K125P
It can be seen that A-Pc produces at least 3×10 5 molecules of SPAP fragments per cell.
(以下余白)
得られたSP八へ性フラグメントは、ポリアクリルアミ
ド電気泳動(SO5−PAGE )による分子量(約7
.000)、マウス血清中のIgG結合能力、アミノ酸
組成、およびアミノ酸配列の解析において全て理論値と
一敗するデータを示した。(Margins below) The obtained SP octahedral fragment has a molecular weight (approximately 7
.. 000), the analysis of the IgG binding ability, amino acid composition, and amino acid sequence in mouse serum all showed data that were in direct agreement with the theoretical values.
・(10) : SP八 フラグメント カラム
Iの tlll+このようにして得られたSPA活性フ
ラグメント精製物を用い、 SPA活性フラグメント固
定化カラムIを作製した。まず、凍結乾燥粉末のCNB
r結合セファロースCL−4B 15gをIn+M塩酸
200瀬を用いて1時間膨潤させた。活性化されたCN
BrセファロースCL−48を、 50mgのSPA活
性フラグメントを含むカップリング緩衝液(0,5M
NaCl、 0.1M炭酸水素ナトリウム)中に4°C
にて一夜懸濁させ、これに上記(9)項で得られたSP
A活性フラグメントを結合させた。SPA活性フラグメ
ントが結合しなかったCNBr結合セファロースCL−
4B上の残存する活性基を除くために、 1Mエタノー
ルアミン100dを加え、4時間処理した。次いでこの
ゲルをカップリング緩衝液500mj!および0.5M
NaClを含有する001M酢酸緩衝液(pH4,0
) 500 tailで洗浄することによりSPA活性
フラグメント固定化不活性担体を調製した。このSPA
活性フラグメント固定化不活性担体の10m1 (SP
A活性活性フラグメント約10拮用いてSPA活性フラ
グメント固定化カラムIを作製した。・(10): SP8 Fragment tllll of Column I + SPA active fragment immobilized column I was prepared using the SPA active fragment purified product thus obtained. First, freeze-dried powder CNB
15 g of r-linked Sepharose CL-4B was swollen for 1 hour using 200 g of In+M hydrochloric acid. activated CN
Br Sepharose CL-48 was added to coupling buffer (0.5 M
NaCl, 0.1M sodium bicarbonate) at 4°C.
The SP obtained in the above (9) was added to this suspension overnight.
A active fragment was ligated. CNBr-bound Sepharose CL- to which no SPA active fragment was bound
To remove the remaining active groups on 4B, 100 d of 1M ethanolamine was added and treated for 4 hours. This gel was then soaked in 500 mj of coupling buffer! and 0.5M
001M acetate buffer (pH 4.0) containing NaCl
) A SPA active fragment-immobilized inert carrier was prepared by washing with 500 tails. This SPA
10 ml of active fragment immobilized inert support (SP
Approximately 10 A-active active fragments were used to prepare SPA active fragment-immobilized column I.
(11) : SPA フラグメント カラム
Hの(9)項で得られたSt”A活性フラグメント精製
物を用い, SPA活性フラグメント固定化カラム■を
作製した。まず、凍結乾燥粉末のチオールセファロース
48 10gを10mMリン酸緩衝液(pH5.0)2
00m1を用いて1時間膨潤させた。活性化されたチオ
ールセファロース4Bを20mgのSPA活性フラグメ
ントを含むカップリング緩衝液(0.5 M NaC1
.0.1 M炭酸水素ナトリウム)中に4°Cにて一夜
懸濁させ。(11): SPA active fragment immobilization column ■ was prepared using the purified St”A active fragment obtained in section (9) of SPA fragment column H. First, 10 g of lyophilized powder of Thiol Sepharose 48 was diluted with 10 mM Phosphate buffer (pH 5.0) 2
00ml was used to swell for 1 hour. Activated thiol Sepharose 4B was added to coupling buffer (0.5 M NaCl) containing 20 mg of SPA active fragment.
.. Suspended in 0.1 M sodium bicarbonate) at 4°C overnight.
上記(9)項で得られたSPA活性フラグメントを結合
させた。次いでこのゲルをカップリング緩衝液500
tnlおよび0,5 M NaC1を含有する0.1
M酢酸緩衝液(p)14.0)500m!で洗浄するこ
とによりSPA活性フラグメント固定化不活性担体を調
製し,このSPA活性フラグメント固定化不活性担体の
5mf(SPA活性フラグメント約2.5■結合)を用
いてSPA活性フラグメント固定化カラム■を作製した
。The SPA active fragment obtained in section (9) above was conjugated. This gel was then soaked in coupling buffer 500%
0.1 containing tnl and 0.5 M NaCl
M acetate buffer (p) 14.0) 500m! Prepare a SPA active fragment-immobilized inert carrier by washing with water, and use 5 mf (approximately 2.5 μ of SPA active fragments bound) of this SPA active fragment-immobilized inert carrier to apply a SPA active fragment-immobilized column. Created.
尖謄拠I
(潅流法による治療)
家兎にュージーランドホワイト)2羽の背部皮内に腫瘍
細胞(VX2)をそれぞれ約5X10’個ずつ移植して
腫瘍を発生させた。腫瘍細胞移植10日後に,実施例1
で作製したSPA活性フラグメント固定化カラム■を用
いて,第7図に示すように家兎1羽に該SP八へ性フラ
グメント固定化カラムI6をチューブ1を介して連結し
,血液の体外潅流を1時間行った。家兎10の大腿静脈
からの血液はポンプ3を介して血漿分離膜4に至り,該
分離膜4で分離されて得られた血漿はポンプ5を介して
SPA活性フラグメント固定化カラム6に供給される。Tip I (Treatment using perfusion method) Approximately 5 x 10' tumor cells (VX2) were each implanted into the dorsal skin of two domestic rabbits (New Zealand White) to generate tumors. Example 1 10 days after tumor cell transplantation
As shown in Figure 7, using the SPA active fragment-immobilized column 1 prepared in 1, the SP 8 active fragment-immobilized column I6 was connected to one rabbit via tube 1 to allow extracorporeal perfusion of blood. I went for an hour. Blood from the femoral vein of the rabbit 10 reaches the plasma separation membrane 4 via the pump 3, and the plasma obtained by separation by the separation membrane 4 is supplied via the pump 5 to the SPA active fragment immobilization column 6. Ru.
このカラム6を通過した血漿は血漿分離膜4で分離され
た血液の固形成分と合流して全血となり家兎大腿静脈へ
注入される。血液の流速は5 tul/l1Iinとし
,血液の凝固を防ぐため家兎にばあらかじめヘパリン5
00Uを耳介静脈に注射した。さらに、ヘパリンをIO
U/minの割合で上記潅流系に2の位置で投与し、家
兎に返血する直前に7の位置でプロタミンを加えて中和
した。20日後に腫瘍の状態を観察したところ、血液潅
流を行った家兎の腫瘍は血液潅流を行わなかった家兎の
腫瘍に比べて著しく縮小しているのが明らかであった。The plasma that has passed through the column 6 is combined with the solid components of the blood separated by the plasma separation membrane 4 to become whole blood and injected into the femoral vein of the rabbit. The blood flow rate was 5 tul/l1in, and the rabbits were pre-treated with 5 tul/l1in of heparin to prevent blood coagulation.
00U was injected into the auricular vein. In addition, heparin was added to IO
It was administered to the perfusion system at a rate of U/min at position 2 and neutralized by adding protamine at position 7 just before blood was returned to the rabbit. When the state of the tumor was observed after 20 days, it was clear that the tumors in the rabbits that received blood perfusion were significantly smaller than the tumors in rabbits that did not receive blood perfusion.
実施±1
(バッチ処理法)
SDラット雌にN−メチル−N−二トロソウレアを体重
100 gあたり3.0■の割合で尾静脈注射で投与し
、3ケ月後に乳腺癌を得た。このラッI・の尾静脈から
血液を採取し、血漿1#l12を分離して得た。実施例
1 (10)項で得られたSPA活性フラグメント固定
化不活性担体1 、5 mlを用いて作成したカラムに
この血漿約1IIdlを流し、非吸着血漿1.5 !r
dlを得た。この治療用組成物を上記ラットの尾静脈に
投与した。この治療を週1回ずつ4週間にわたって行っ
た。その結果、腫瘍が漸次縮小するのが観察された。Implementation ±1 (Batch Processing Method) N-methyl-N-nitrosourea was administered to female SD rats by tail vein injection at a rate of 3.0 μm per 100 g of body weight, and mammary adenocarcinoma was obtained 3 months later. Blood was collected from the tail vein of this rat I, and plasma 1#l12 was separated and obtained. About 1 II dl of this plasma was poured into a column prepared using 1.5 ml of the SPA active fragment-immobilized inert carrier obtained in Section (10) of Example 1, and 1.5 ml of non-adsorbed plasma was added. r
I got dl. This therapeutic composition was administered into the tail vein of the rats. This treatment was performed once a week for 4 weeks. As a result, the tumor was observed to gradually shrink.
7JJ脳汁士
(SPA活性活性フラグメント固定化カラム用いた潅流
法による治療)
SP八へ性フラグメント固定化カラム■の代わりにSP
A活性活性フラグメント固定化カラム用いて。7JJ Neurosurgery (Treatment by perfusion method using SPA active fragment immobilization column)
A activity using an active fragment immobilized column.
実施例2と同様に潅流法による治療を行った。Treatment by perfusion method was performed in the same manner as in Example 2.
20日後に腫瘍の状態を観察したところ、実施例2の結
果と同様に、血液潅流を行った家兎の腫瘍は血液潅流を
行わなかった家兎の腫瘍に比べて著しく縮小しているの
が明らかであった。When the state of the tumor was observed after 20 days, it was found that, similar to the results of Example 2, the tumors in the rabbits that received blood perfusion were significantly smaller than those in the rabbits that did not receive blood perfusion. It was obvious.
災施桝五
実施例2のSI’A活性フ活性フラグメント固定化カラ
ム−た潅流法による治療を5種々の固形癌を有する7匹
の家兎に対して行った。治療は、血液潅流の流速を2〜
10In1/minとし、1時間体外潅流することによ
り行った。Treatment using the perfusion method using the SI'A active fragment immobilized column in Example 2 was carried out on 7 domestic rabbits with 5 different types of solid tumors. Treatment is to increase the flow rate of blood perfusion to 2~
This was performed by extracorporeal perfusion for 1 hour at a flow rate of 10 l/min.
3日後に腫瘍の状態を観察したところ、治療を行った全
ての家兎について腫瘍組織の壊死および縮小が認められ
、この治療は種々の固形癌に有効であることが示された
。この結果をまとめて表2に示す。When the state of the tumor was observed after 3 days, necrosis and shrinkage of the tumor tissue were observed in all treated rabbits, indicating that this treatment is effective against various solid cancers. The results are summarized in Table 2.
(以下余白)
表2
乳腺癌
乳腺癌
乳腺癌
繊維肉腫
繊維肉腫
血管肉腫
血管肉腫
+:軽度、++:中程度、 +++:高度(発明の効
果)
本発明によれば、悪性腫瘍や自己免疫疾患の治療に有効
な免疫吸着剤7組成物およびこれらを用いた治療方法が
提供される。この免疫吸着剤に用いられるSPA活性フ
ラグメントは遺伝子組換え技術により得られ、単位重量
あたりのIgとの結合能力が高い。そのため、担持量が
少量であっても十分な治療効果が得られ、安価に治療が
なされうる。(Leaving space below) Table 2 Breast cancer Breast cancer Breast cancer Fibrosarcoma Fibrosarcoma Angiosarcoma Angiosarcoma +: Mild, ++: Moderate, +++: Severe (effects of the invention) Seven therapeutically effective immunoadsorbent compositions and therapeutic methods using the same are provided. The SPA active fragment used in this immunoadsorbent is obtained by genetic recombination technology and has a high ability to bind Ig per unit weight. Therefore, even if the supported amount is small, a sufficient therapeutic effect can be obtained and treatment can be performed at low cost.
本発明で用いられるSPA活性フラグメントは、遺伝子
組換え技術を用いて大腸菌に生産させているため、 S
PAが含有される微生物(ブドウ状球菌)に由来すると
考えられるアレルギー成分を含有せず、 SPAに比べ
てはるかに低分子であり、かつ純度が高いため、アレル
ギー反応がほとんど発生しない。The SPA active fragment used in the present invention is produced in Escherichia coli using genetic recombination technology.
It does not contain allergic components thought to be derived from microorganisms (staphylococci) in which PA is contained, and has a much lower molecular weight and higher purity than SPA, so allergic reactions hardly occur.
1−」酊1Q葡1す01吸
第1図は本発明に用いられるSP^活性フラグメントの
遺伝子を化学合成するときに用いられるオリゴヌクレオ
チド(上方ストランド13本(01−013) 。Figure 1 shows oligonucleotides (13 upper strands (01-013)) used when chemically synthesizing the SP^ active fragment gene used in the present invention.
下方ストランド12本(Ll −L12)の塩基配列を
示す配列図;第2図は本発明に用いられるSPA活性フ
ラグメントの遺伝子を含む2本鎖ポリヌクレオチドの塩
基配列を示す配列図;第3図はオリゴヌクレオチドの合
成に用いるジヌクレオチドの合成反応例を示す説明図;
第4図はオリゴヌクレオチドLllの二次元ホモクロマ
トグラフィーの結果を示す泳動図;第5図は各オリゴヌ
クレオチドを結合してSPA活性フラグメントをコード
する構造遺伝子を得る方法を示す説明図;第6図はSP
A活性フラグメントの遺伝子を有する組換えプラスミド
の構築を示す説明図;第7図は家兎体内からの血液を本
発明で用いられる免疫吸着剤に潅流させて悪性腫瘍の治
療を行う説明図である。A sequence diagram showing the base sequence of the 12 lower strands (Ll-L12); Figure 2 is a sequence diagram showing the base sequence of the double-stranded polynucleotide containing the gene of the SPA active fragment used in the present invention; Figure 3 is a sequence diagram showing the base sequence of the double-stranded polynucleotide containing the gene of the SPA active fragment used in the present invention; An explanatory diagram showing an example of a synthesis reaction of dinucleotides used for oligonucleotide synthesis;
Figure 4 is an electrophoresis diagram showing the results of two-dimensional homochromatography of oligonucleotide Lll; Figure 5 is an explanatory diagram showing how to combine each oligonucleotide to obtain a structural gene encoding an SPA active fragment; Figure 6 is SP
An explanatory diagram showing the construction of a recombinant plasmid having the gene of the A active fragment; Fig. 7 is an explanatory diagram showing the treatment of malignant tumors by perfusing blood from the body of a rabbit through the immunoadsorbent used in the present invention. .
4・・・血漿分離膜、6・・・SPA活性フラグメント
固定化カラム、 10・・・家兎。4... Plasma separation membrane, 6... SPA active fragment immobilized column, 10... Domestic rabbit.
以上that's all
Claims (1)
eus¥Cowan I )由来のプロテインAの、免疫
グロブリン(Ig)のFc領域と結合し得るFc結合領
域を構成するポリペプチドフラグメントのN末端もしく
はC末端にシステインを付加したポリペプチドを遺伝子
組換え技術により生産し、不活性担体に共有結合的もし
くは非共有結合的に担持させた悪性腫瘍等の治療用免疫
吸着剤。 2、特許請求の範囲第1項に記載の免疫吸着剤に生体か
らの血漿、血清、もしくは全血を接触させる工程;およ
び 該接触後の血漿、血清、もしくは全血を該生体もしくは
同種の生体内に注入する工程; を包含する悪性腫瘍等の治療方法。 3、特許請求の範囲第1項に記載の免疫吸着剤に生体か
らの血漿、血清、もしくは全血を接触させることにより
得られる処理血漿、血清、もしくは全血を主成分とする
悪性腫瘍等の治療用組成物。[Scope of Claims] 1. Staphylococcus aureus Scowan I strain (\Staphylococcus\\aur
Genetic recombination technology produces a polypeptide in which cysteine is added to the N-terminus or C-terminus of a polypeptide fragment that constitutes an Fc-binding region that can bind to the Fc region of immunoglobulin (Ig) of protein A derived from Eus\Cowan I). An immunoadsorbent for the treatment of malignant tumors, etc., produced by and covalently or non-covalently supported on an inert carrier. 2. A step of bringing plasma, serum, or whole blood from a living body into contact with the immunoadsorbent according to claim 1; A method for treating malignant tumors, etc., comprising: a step of injecting into the body; 3. Processed plasma, serum, or whole blood obtained by contacting the immunoadsorbent described in claim 1 with treated plasma, serum, or whole blood, or treatment with malignant tumors, etc., whose main component is plasma, serum, or whole blood. Therapeutic composition.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63164188A JPH0211523A (en) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | Immunoadsorbent for remedy of malignant tumor, etc., and remedying method using the same agent |
Applications Claiming Priority (1)
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JP63164188A JPH0211523A (en) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | Immunoadsorbent for remedy of malignant tumor, etc., and remedying method using the same agent |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH0211523A true JPH0211523A (en) | 1990-01-16 |
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ID=15788362
Family Applications (1)
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JP63164188A Pending JPH0211523A (en) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | Immunoadsorbent for remedy of malignant tumor, etc., and remedying method using the same agent |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2005527581A (en) * | 2002-04-10 | 2005-09-15 | プロタレックス, インコーポレイテッド | Protein A composition and method of use |
JP2008513457A (en) * | 2004-09-15 | 2008-05-01 | プロタレックス, インコーポレイテッド | Protein A composition and method of use thereof |
-
1988
- 1988-06-30 JP JP63164188A patent/JPH0211523A/en active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2005527581A (en) * | 2002-04-10 | 2005-09-15 | プロタレックス, インコーポレイテッド | Protein A composition and method of use |
JP2010031050A (en) * | 2002-04-10 | 2010-02-12 | Protalex Inc | Protein a composition and method of use |
US8168189B2 (en) | 2002-04-10 | 2012-05-01 | Protalex, Inc. | Protein A compositions and methods of use |
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