JPH02111789A

JPH02111789A - 合成ペプチド、その抗体およびその抗体の製法

Info

Publication number: JPH02111789A
Application number: JP26397288A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 泰三宇田; Akira Takeyasu; 武安　明; Tetsuo Kawaguchi; 哲男川口; Yukio Nakajima; 中島　由紀生
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1988-10-21
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1990-04-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ヒトＭｎスーパーオキシドジスムターゼ（以
下、ヒトＭｎ−５ＯＤと略記する。）および特定の合成
ペプチドと反応性を有する抗体、並びに、前記特定の合
成ペプチドを動物に用いる前記抗体の製造法に関するも
のである。

〔従来の技術〕

ヒトＭｎ−３ＯＤは、ミトコンドリアのマトリックス部
分に存在する酵素（１ドメインの分子量が約２５，００
０であり、そのダイマーまたはテトラマーからなると考
えられている。）であり、次に示すように、毒性酸素の
主要な分子種であるスーパーオキシドアニオンラジカル
（０□−）を不均化する反応を触媒する。

２０ｚ　　＋　２　Ｈ−〉Ｈｚ　　Ｏｔ　　＋　０２と
ころで、肝疾患における血清中のヒトＭｎ−３ＯＤ濃度
の測定には、ポリクローナル抗体を用いた検討によって
、高い診断的意義が存在すると考えられている（医薬ジ
ャーナル；稲垣、訳本、１度、１．１９８４年。第５回
腫瘍マーカー研究会；飯塚、新井ら、１９８５年）。ま
た、呑口らも、ヤギに免疫して作製したポリクローナル
抗体を用いた免疫学的な方法で、ヒトＭｎ−３ＯＤ濃度
が肺癌で高いことを示しており〔ジャーナル・オプ・ナ
ショナル・カンサー・インスチチュート（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ）　、７叉、５．１９８４年〕、血清中のヒ
トＭｎ−３゜Ｄ濃度の測定の重要性が指摘されている。

従来、ヒトＭｎ−３ＯＤに対するポリクローナル抗体を
作製するためには、ヤギなどの動物に免疫原として用い
るヒトＭｎ−３ＯＤを、ヒトの胎盤、肝臓、肺などのヒ
ト臓器から分離精製して用いる必要があった。しかし、
それらの臓器からヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤを分離精製す
るのは容易でなく、また、たとえそれらの臓器を得るこ
とができても人道的には好ましくないという問題があっ
た。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、ヒトＭｎ−３ＯＤと反応性を有する抗
体を生産する時に使用される抗原であるヒトＭｎ−３Ｏ
Ｄのかわりに使用することができるヒトＭｎ−３ＯＤの
アミノ末端側のアミノ酸配列の一部分に対応した合成ペ
プチドを動物に免疫することによってヒトＭｎ−３ＯＤ
と反応性を有する抗体を生産する方法を提供することで
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、本発明の合成ペプチドを動物に免疫すること
によって、ヒトＭｎ−８ＯＤと抗原抗体反応する抗体を
生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、（１）次式；％式％で示されるＬ体のアミノ酸配列を有する合成ペプチド（２）前記（１）の合成ペプチドを動物に免疫すること
によって生産された抗体（３）前記（１）の合成ペプチドを動物に免疫すること
を特徴とする抗体の製造法に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の合成ペプチドは、ヒトＭｎ−３ＯＤのＮ末端側
（アミノ末端側）のアミノ酸配列に対応したＬ体のアミ
ノ酸からなるペプチドのＬｙｓ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ｆ、ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　　Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ（カルボキシル末端側）である。

本発明における合成ペプチドの作製は、液相法または固
相法などの通常の方法によって行うことができるが、好
ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前
記ペプチドのＣ末端側（カルボキシル末端側）からその
アミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド
結合によって結合して行くのが良い。

そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリ
フルオロメタンスルホン酸（以下、ＴＦＭＳＡと略記す
る。）、フッ化水素などを用いてポリマー性の固相支持
体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆
相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）などを用いた通常の方法で精製することができ
る。そして、その合成ペプチドのアミノ酸配列は、アミ
ノ酸分析によって確認することができる。

本発明のヒｈＭｎ−３ＯＤと抗原抗体反応することがで
きる抗体は、本発明の合成ペプチドを動物に免疫するこ
とによって、その免疫動物から抗血清あるいは精製抗体
として得ることができる。

本発明の合成ペプチドの免疫方法は、本発明の目的を達
成することができる限り特に限定されないが、例えば、
本発明の合成ペプチドを水、中性の緩衝液（例えば、ト
リス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液など。）などの溶媒に
適当量溶解したもの（例えば、数μｇ　／　ｍ　１〜数
ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌで、被免疫動物あたり数μｇ〜数ｍ
ｇ、）を数週間〜数カ月間隔で数回投与することで行う
ことができる（なお、この方法だけで該合成ペプチドに
対して十分量の抗体を得ることができない場合には、ミ
ヨウパン、結核死菌体および／または核酸などを含むア
ジュバントを混合して得られたエマルジョンを用いるこ
ともできる。）。

本発明の合成ペプチドを免疫するために用いる動物とし
ては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなど
の動物を挙げることができる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。

なお、これらの実施例は、本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１〔合成ペプチドの作製〕Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−ｐ−メトキシベンジ
ルシスティン樹脂６８６ｍｇ（システィン含量；　Ｏ−
７３ｍ　ｍ　ＯＩｌ　Ｚ　ｇ　ｓスチレン−１％−ジビ
ニルベンゼン共重合体）を出発原料とし、ペプチド自動
合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い
た固相法によってヒトＭｎ−５０ＤのＮ末端側のアミノ
酸配列に相当する１６個のアミノ酸残基からなる合成ペ
プチドＬｙｓ−Ｈｉ　５−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒ−ｏ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃ；１ｙ
−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（Ｃ末端側）を作製した。

まず、前記の１６個のアミノ酸配列からなるペプチドを
、常法通り、そのＣ末端側のＰｒｏ側からアミノ酸を順
次１個づつ前記の出発原料と反応させることによって、
１．５ｇの保護したペプチド結合樹脂を得た（なお、こ
のとき用いたアミノ酸の側鎖官能基は、Ｈｉｓではトシ
ル基で、ＡｓｐまたはＧｌｕではベンジルエステルで、
Ｌｙｓでは２−クロロベンジルオキシカルボニル基で、
Ｔｙｒは２−ブロモベンジルオキシカルボニル基で保護
した。）。

この保護したペプチド結合樹脂１ｇを、５００μｌのエ
タンジチオールと１ｍｆのエタンジオールからなる混合
液に懸濁して、室温で１０分間攪拌後、水冷下で１０ｍ
ｌのトリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）を
加え、さらに１０分間攪拌した。

この混合物にＴＦＭＳＡ　（）リフルオロメタンスルホ
ン酸）を１ｍ１滴下し、室温で３０分間攪拌した後、３
０ｍｆの無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて
分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、
減圧下で乾燥した。

このようにして得られた粗生成の合成ペプチド１００ｍ
ｇを２ｍｊ２の蒸留水に溶解した後、濾過して得られた
濾液をＡＱＵＡＰＯＲＥ　　ＲＰ−３００（１０Ｘ１０
０ｍｍ）（アプライド・バイオシステムズ社製）にのせ
、（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水および（Ｂ）０．１
％ＴＦＡを含有した７０％ＣＨ３ＣＮからなる溶媒を用
いて、６０分間で（Ａ）が９５＃０％のリニアグラデイ
エンドモードで溶出した。

３つの大きなピークを示した溶出画分のうちの最初の溶
出画分を分取し、濃縮後凍結乾燥することによって目的
とする合成ペプチドを３０ｍｇ得た。

この合成ペプチドは、ＨＰＬＣによる分析では９９％以
上の純度であり、そのアミノ酸配列は前記に示したヒト
Ｍｎ−３ＯＤのＮ末端側のアミノ酸配列に相当する１６
個のアミノ酸残基からなるペプチドであることを確認で
きた。

実施例２〔合成ペプチドに対する抗体の作製〕実施例１で作製した免疫原である１ｍｇの合成ペプチド
を溶解した１ｍｌのＰＢＳ　（リン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７
，４）と１ｍｆのフロイントの完全アジュバントとを十
分に混合して得られたエマルジョンをウサギ（日本白色
種糸、生後４力月）の背部皮下に投与した。

さらに、１力月後に、あらたに前記と同様にして調製し
たエマルジョンを同ウサギの背部皮下に投与した。

さらに、１力月後に、最終免疫として、フロイントの完
全アジュバントのかわりにフロイントの不完全アジュバ
ントを用いて前記と同様にして調製したエマルジョンを
同ウサギの背部皮下に投与した。

最終免疫から１週間後に、このようにして免疫されたウ
サギの心臓から注射器を用いて採血し、５０ｍｊ２の抗
血清（−次元平板免疫拡散法によって測定した抗体量は
、５００ｍｇであった。）を得た。

この血清中に含有された抗体とヒ）Ｍｎ−３゜Ｄとの抗
原抗体の反応性を、次のようなＥＬＩＳＡ（エンザイム
・リンクド・イムノソーベント・アッセイ）で検討した
。

まず、９６ウエル平底ＥＬＩＳＡプレート（以下、ＥＬ
ＩＳＡプレートと略す。）の各ウェルにヒトＭｎ−３Ｏ
Ｄ溶液（１０ｕ　ｇ／ｍｌ、　ｐ　Ｈ９゜６の０．０５
　Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液に溶解）を５０μ！づつ分注
し、４°Ｃで１晩静置した（このような処置によって、
ヒトＭｎ−３ＯＤが各ウェルの接触面に非特異的に吸着
する。）。

次に、それらの各ウェルを洗浄液（０，０５％のＴｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳ、）で洗浄した後、０．５％の卯
白アルブミン溶液（０，１％ＮａＮ、を含有する。）を
各ウェルに１００μｌづつ分注して室温で３０分間静置
した。これらの各ウェルを同洗浄液で洗浄し、前記のウ
サギ血清をＰＢＳで２００．５００．１０００．２００
０．５０００倍に希釈した溶液をそれらの各ウェルに５
０μ２づつ分注して１時間静置した（陰性対照試料には
、非免疫ウサギの血清を同様に希釈して用いた。）。

次に、前記の各ウェルを同洗浄液で洗浄し、ウサギ免疫
グロブリンに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗
体溶液を、各ウェルに５０μｐづつ分注し、室温で１時
間静置した。そして、これらの各ウェルを同洗浄液で洗
浄後、０−フェニレンジアミン溶液（２０ｍｇの０−フ
ェニレンジアミン、１０μ！３５％Ｈ，Ｏ□をＰ　Ｈ５
，０の０．１Ｍクエン酸緩衝液５０ｍ１に溶解）を１０
０μεづつ分注し、室温で３０分間反応後、２ＮのＨ２
ＳＯ４を５０μβづつ分注して西洋ワサビペルオキシダ
ーゼの反応を停止し、このＥＬＡＴＳＡプレート用の吸
光度測定装置を用いて各ウェルの４９２ｎｍにおける吸
光度を測定した結果、本発明の合成ペプチドを免疫原に
用いて作製された抗体は、ヒトＭｎ−３ＯＤと抗原抗体
反応することがわかった。その結果を第１図に示す。

〔発明の効果〕

本発明の合成ペプチドは、ヒト疾患の診断に有効と考え
られているヒトＭｎ−３ＯＤ濃度の測定時に用いるポリ
クローナル抗体の作製において、免疫原として従来用い
られていた貴重なヒトＭｎ−３ＯＤのかわりとして使用
できるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の合成ペプチドを免疫原に用いて作製
された抗体とヒトＭｎ−３ＯＤとの反応性を示す（・）
〔非免疫ウサギの血清を用いた時の陰性対照も同時に示
した（○）。〕。第１図特許出願人　　宇部興産株式会社血清の希釈倍率

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次式；【遺伝子配列があります】で示されるＬ体のアミノ酸配列を有する合成ペプチド。
（２）請求項１の合成ペプチドを動物に免疫することに
よって生産された抗体。
（３）請求項１の合成ペプチドを動物に免疫することを
特徴とする抗体の製造法。