JPH0143553B2 - - Google Patents

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JPH0143553B2
JPH0143553B2 JP57157676A JP15767682A JPH0143553B2 JP H0143553 B2 JPH0143553 B2 JP H0143553B2 JP 57157676 A JP57157676 A JP 57157676A JP 15767682 A JP15767682 A JP 15767682A JP H0143553 B2 JPH0143553 B2 JP H0143553B2
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JP
Japan
Prior art keywords
urokinase
saccharide
conjugate
monosaccharides
conjugates
Prior art date
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Expired
Application number
JP57157676A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPS5945881A (en
Inventor
Shoichi Myake
Kazumasa Yokoyama
Tadakazu Suyama
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GREEN CROSS CORP
Original Assignee
GREEN CROSS CORP
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Publication date
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Publication of JPS5945881A publication Critical patent/JPS5945881A/en
Publication of JPH0143553B2 publication Critical patent/JPH0143553B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は新規なウロキナーゼ誘導体及びその製
造法に関する。 フイブリンおよび血栓の溶解酵素であるウロキ
ナーゼは各種血栓症や塞栓性疾患の治療および制
癌剤との併用療法等に広く用いられており、優れ
た臨床効果をもたらしている。しかし生体に投与
されたウロキナーゼは、蛋白体としても又酵素活
性としてもいずれも速やかに血中より消失し、こ
のものの血中半減期はわずか1〜2分である。さ
らに投与されたウロキナーゼの酵素活性は血中の
ウロキナーゼ阻害因子による作用を受け、ある閾
値以上の量を投与しないと、血栓溶解能が発現し
ないことが判つている。 ウロキナーゼのこのような血中動態は、十分な
効果を得るためには必然的に大量投与へと進展せ
ざるを得ず、今日の大量投与療法になつていると
理解される。発明者らはかねてより血中における
ウロキナーゼの効力を持続させ、かつ血中の阻害
因子による影響を受けにくくすることを研究し、
実験及び検討を重ねた結果、水可溶性のウロキナ
ーゼ・単糖類、ウロキナーゼ・単糖類誘導体、ウ
ロキナーゼ・二糖類結合物を創製すると共に当該
結合物がウロキナーゼの単独投与時にみられる種
種の欠点を改善し得ること、及びウロキナーゼの
酵素活性を十分にかつ持続的に発揮しうることを
見出し、その医薬としての有用性に着目して本発
明を完成した。 即ち、本発明はウロキナーゼと単糖類、その
誘導体及び二糖類から選ばれた少なくとも一種の
糖とを直接的に又は間接的に共有結合させてなる
水可溶性のウロキナーゼ・糖類結合物、ウロキ
ナーゼと単糖類、活性化単糖類、活性化単糖類誘
導体及び活性化二糖類から選ばれた一種とを反応
させ必要に応じて還元反応に付すことによるウロ
キナーゼ・糖類結合物の製造法に関する。 本発明に用いるウロキナーゼは医薬として精製
されたものであれば、人尿、腎組織培養のいずれ
の由来のものでもよく、更に遺伝子工学の手法に
よりヒト由来のウロキナーゼ遺伝子を大腸菌に投
入し、培養後その大腸菌が生産するウロキナーゼ
でもよい、また分子量25000〜60000の範囲のもの
を使用することが好ましい。 本発明において用いられる単糖類としては、グ
ルコース、ガラクトース、フラクトースなどがあ
げられ、単糖類の誘導体としては、たとえばグル
クロン酸、ガラクチユロン酸などのウロン酸、グ
ルコサミン、N−アシルグルコサミン(たとえ
ば、N−アセチルグルコサミン)、2−アミノ−
2−デオキシン−D−グルコースなどのアミノ糖
及びアシル化アミノ糖、メチル−6−ブロモ−6
−デオキシ−グリコシドなどの配糖体などがあげ
られ、さらに二糖類としてはラクトース、マルト
ースなどあげられる。 本発明のウロキナーゼ・糖類は、ウロキナーゼ
と単糖類とをそのまま反応させるか、上記糖類を
活性化して得た活性化糖類とを反応させることに
よつて製造される。ここに活性化糖類とは、糖類
の水酸基をウロキナーゼ分子中のアミノと反応し
うるように活性化したものである。 ウロキナーゼ・糖類結合物は、より具体的には
次の如くして製造される。 (1) (第1法) 単糖類の反応性そのものを利用して直接ウロ
キナーゼと結合させる方法。 本方法は、単糖類のみに適用できる方法で、
単糖類のアルデヒド基又はケト基を官能基とし
て利用するものであり、単糖類としてグルコー
スを使用した場合を例として、本反応を式示す
れば次の通りである。 本法は、単糖類とウロキナーゼとを反応させ
て得られる化合物を還元することによつて行わ
れる。ウロキナーゼと単糖類との反応において
は、ウロキナーゼ1〜10重量部に対して単糖類
10〜3000重量部を反応させることが好ましい。
通常、単糖類は水に溶解して、またウロキナー
ゼは0.1〜1Mの緩衝液(たとえばリン酸緩衝
液、PH6〜8)に溶解して反応に供される。か
くして生成した反応生成物の還元は、通常水素
化シアンホウ素ナトリウムにて行われる。本反
応は、通常単糖類水溶液にウロキナーゼ緩衝液
及び還元剤を添加し、1〜10℃にて10〜30時間
撹拌することによつて行われる。 (2) 活性化した単糖類、その誘導体、あるいは二
糖類をウロキナーゼと結合させる方法。 本方法には、アルデヒド化法とアルキル化法
に大別される。以下、この二方法について記述
する。 (第2法) アルデヒド化法 単糖類およびその誘導体あるいは二糖類水酸
基をアルデヒド基に酸化して活性化させた後、
ウロキナーゼと反応させ、さらに還元すること
によりウロキナーゼ誘導体を製造する方法であ
る。これを模式的反応式で示せば次の通りであ
る。 本反応における酸化工程に使用される酸化剤
としては好ましくは過ヨウ素酸などが用いられ
る。当該酸化剤は糖類の180重量部に対して、
通常20〜240重量部の割合で使用され、また、
当該酸化は通常10〜60分間、室温、暗所にて行
われる。 かくして得られた活性化糖類をウロキナーゼ
と反応させる。この反応は通常、まず上記の反
応で得られた活性化糖類を1〜4Mのアルカリ
(例、水酸化ナトリウム)で中和し、次いで4
℃程度でウロキナーゼ10重量部を加えることに
よつて行われる。かくして得られた生成物は還
元剤(好ましくは水酸化シアンホウ素金属塩
0.6〜2重量部)にて還元することによつて、
ウロキナーゼ・糖類結合物へと導びくことがで
きる。還元処理における溶媒としては、たとえ
ば0.1〜1Mの緩衝液(例、リン酸緩衝液)PH6
〜8程度が使用される。また還元は4℃程度に
て15〜20時間撹拌することによつて行われる。 (第3法) アルキル化法 この方法を模式的に式示すれば次の通りであ
る。 (式中、X、X′はそれぞれハロゲン原子(た
とえば、プロム、クロル)を、nは1〜6の整
数を示す。) 単糖類、その誘導体あるいは二糖類1重量部
に対して例えばシアンブロマイドを0.1〜0.3重
量部の割合で添加して活性化糖類とし、次いで
二官能性化合物〔例えばジアミノエタン、ジア
ミノヘキサンなどの化合物()〕を作用させ
て後、ブロムアセチルブロミドなどの化合物
()を結合させる。かくして得られた活性化
糖類とウロキナーゼとを接触させウロキナーゼ
誘導体を得る。この結果反応は一般に、PH7.2
〜11に調整し、温度3〜25℃で12〜48時間接触
させることにより行なう。 かくして得られたウロキナーゼ・糖類結合物は
公知の分離、精製法、たとえばゲル過法、分子
篩別法、イオン交換法等にて分離、精製すること
ができる。回収したウロキナーゼ・糖類結合物
は、たとえば除菌過及び加熱処理等を行なつた
のち分注し、凍結乾燥する方法などによつてウロ
キナーゼ・糖類結合物製剤、即ち血栓溶解剤とす
ることができる。 このようにして得られるウロキナーゼ・糖類結
合物、即ちウロキナーゼ・単糖類、ウロキナー
ゼ・単糖類誘導体及びウロキナーゼ・二糖類の各
結合の特性は次の通りである。 水及び生理食塩液に容易に溶解する。 ウロキナーゼと各糖類とのモル比は1:5〜
1:1000である。 PH安定性、熱安定性、血漿中プロテアーゼ阻
害因子に対する抵抗性、血中持続性、急性毒性
は後記実験例に示した通りである。 なお、下記実験例において用いるウロキナー
ゼ・糖類結合物は、ウロキナーゼ・単糖類結合物
として第2法(アルデヒド化法)によつて製造し
たウロキナーゼ・グルコース、ウロキナーゼ・ガ
ラクトースの結合物を、ウロキナーゼ・単糖類誘
導体結合物として第3法〔アルキル化法、但し化
合物()としてジアミノエタンを使用〕によつ
て製造したウロキナーゼ・グルコサミン、ウロキ
ナーゼ・N−アセチルグルコサミンの結合物をウ
ロキナーゼ・二糖類結合物として第二法(アルデ
ヒド化法)により製造したウロキナーゼ・ラクト
ース、ウロキナーゼ・マルトースの結合物を用い
た。 実験例 1 PH安定性: ウロキナーゼ自体はPH3〜10の範囲にわたつて
比較的安定であるが、上記の種々のウロキナー
ゼ・糖類結合物は、さらに安定であり、PH2〜11
の広い範囲にわたつて力価の低下は認められなか
つた。 実験例 2 加熱安定性: ウロキナーゼが最も安定なPH8.0において60℃
の加温を行つたところ、ウロキナーゼ単独のもの
は2時間の加熱で、完全に失活したのに対し、上
記ウロキナーゼ・糖類結合物は加熱10時間後にお
いてもなお100%の残存活性を示し、熱に対して
非常に安定であることが認められた。 実験例 3 血漿中プロテアーゼ阻害因子に対する抵抗性: ヒト血漿を用いてウロキナーゼ、上記のウロキ
ナーゼ・単糖類、ウロキナーゼ・単糖類誘導体そ
してウロキナーゼ・二糖類の各結合物の血漿中プ
ロテアーゼ阻害因子に対する抵抗性を調べた。試
験方法は次の通りである。即ち、活性が100IU
(国際単位)/ml(国際単位については、医薬品
研究(3)、295〜308(1974)参照)になる様に稀釈
したウロキナーゼ単独又は上述の各結合物の溶液
225μに18%ヒト血漿アルブミン15μを混合
し、次いでこの混合液20μにそれぞれヒト血漿
80μを混ぜ、37℃にて1時間インキユベートし
たのちヒトフイブリン標準平板法(B.B.A.、24
278−282、1975年)にてウロキナーゼ活性を測定
し、ヒト血漿とのインキユベート前のウロキナー
ゼ活性を100%としてこれに対するウロキナーゼ
残存活性を算出した。試験結果は第1図に示す通
りであり、ウロキナーゼ単独の残存活性が1.5%
であるのに対し、ウロキナーゼ・グルコース、ウ
ロキナーゼ・ガラクトース、ウロキナーゼ・グル
コサミン、ウロキナーゼ・N−アセチルグルコサ
ミン、ウロキナーゼ・ラクトース、ウロキナー
ゼ・マルトースの各結合物の残存活性はそれぞれ
8%、7%、6%、7%、8%、9%であつた。
このことから、本発明結合物は、血漿中プロテア
ーゼ阻害因子の影響に対して抵抗性を有すること
が認められた。 実験例 4 血栓溶解能試験: チヤンドラループ法を用いて、ウロキナーゼ又
は上記の各種結合物の血栓溶解能を比較検討し
た。この試験方法は、新鮮で正常なヒト・クエン
酸血液1mlを内径3mm、長さ270mmのプラスチツ
ク・チユーブに入れ、この血液にさらに3.8%塩
化カルシウム・2水塩液0.1mlを添加したのち、
チユーブの両端に内径5mm、長さ15mmのシリコン
チユーブを接合してループにする。このチユーブ
を直ちに水平面より80℃の角度で毎分12回転する
ように設計された回転盤に載せ、37℃の恒温室に
て20分間回転させる。これにより血液カラムの先
端に長さ約13mmの人工血栓が生成する。この人工
血栓は病理組織学的にみて人体にできる混合血栓
に極めて近似した組織像を有するといわれてい
る。 ループをこの装置から取りはずしたのち、ルー
プ状にしたポリビニルチユーブの一端をシリコン
チユーブからはずし、試料液又は生理食塩液0.1
mlをチユーブ内に入れ、再度チユーブをループ状
にし、回転装置に架け、回転を続けた。 第1番目のループに就いて血栓溶解を開始して
から4時間後に、この第1番目のループを回転装
置から抜き取り、チユーブ内の血栓を10mlの蒸留
水にhomogenizeし、遠心し(3600rpm、5分
間)、上清の540nmに於ける吸光度を測定した。
第2番目以降のループも第1番目のループに引き
続いて抜き取り、先と同様に処理した。 なお、試料液添加群の血栓溶解率(Y)を次式
に従つて求めた。 Y=(1−A/Ac)×100(%) 但し、 A;試料液を添加したループについての540nm
における吸光度 Ac;生理食塩液を添加したループについての
540nmにおける吸光度の平均値 ウロキナーゼ単独とウロキナーゼ・グルコー
ス、ウロキナーゼ・ガラクトース、ウロキナー
ゼ・グルコサミン、ウロキナーゼ・N−アセチル
グルコサミン、ウロキナーゼ・ラクトース、ウロ
キナーゼ・マルトースの結合物のチヤンドラルー
プ法による血栓溶解試験の結果は、第2図に示す
如くである。第2図のグラフの横軸は、試料液
0.1mlをループ内に注入した時の最終力価を表示
しており、且つ力価はフイブリン平板法で測定し
た値である。このグラフより、上記の各種結合物
の血栓溶解曲線がウロキナーゼ自体の同曲線より
も左側に移動しており、本発明結合物の血栓溶解
能がウロキナーゼ自体よりも強くなつている事が
分る。よつてこれら本発明結合物がすぐれた血栓
溶解作用を有し、血栓溶解剤として有用であるこ
とが理解されるであろう。 実験例 5 血中持続性試験: ビーグル犬(雄、体重12〜15Kg)を用いて上記
各ウロキナーゼ・糖類結合物の血中維持効果を実
験し、ウロキナーゼの単独投与と比較した。標識
方法にはクロラミンT法(Biochem J.89、114、
1963年)を用い、ウロキナーゼ10万単位をリン酸
緩衝液0.5mlに溶解したのちこのウロキナーゼ水
溶液0.1mlに1mCi/mlのNa125I1mlを加え、さら
に0.05%クロラミン−T0.1mlを加えて室温にて2
分間反応させたのち0.1%亜硫酸水素ナトリウム
0.1mlを加えて反応を止め、この反応混液をセフ
アデツクスG−25カラムに通して125I−ウロキナ
ーゼと遊離のNaI125は分別過した。 このようにして得た125I−ウロキナーゼを2分
し、1つはそのまま動物実験用試料とし、他は分
子量50万の活性化した上記結合物の単糖類、その
誘導体あるいは二糖類と反応させ、125I−ウロキ
ナーゼ・糖類結合物を得て動物実験用試料とし
た。各125I−ウロキナーゼ・糖類結合物及び125I
−ウロキナーゼのそれぞれ2×106cpmをビーグ
ル犬に静脈内投与し、それぞれの血中濃度を10分
おきに求めた。実験結果は第1表に示す通りであ
り、125I−ウロキナーゼ単独に比較して血中半減
期は第1次減衰曲線と第2次減衰曲線において
125I−ウロキナーゼ・グルコース結合物では5.3倍
と4.7倍に、125I−ウロキナーゼ・ガラクトース結
合物では5.3倍と4.4倍に、125I−ウロキナーゼ・グ
ルコサミン結合物では5.9倍と5倍に、125I−ウロ
キナーゼ・N−アセチルグルコサミン結合物では
5.3倍と4.9倍に、125I−ウロキナーゼ・ラクトース
結合物では5.3倍と4倍に、125I−ウロキナーゼ・
マルトース結合物では5.9倍と4.4倍にそれぞれ延
長し、これらウロキナーゼ結合物が著るしい血中
維持効果を有することを認めた。
The present invention relates to a novel urokinase derivative and a method for producing the same. Urokinase, which is a fibrin and thrombus dissolving enzyme, is widely used in the treatment of various thrombosis and embolic diseases, as well as in combination therapy with anticancer drugs, and has excellent clinical effects. However, when urokinase is administered to a living body, it quickly disappears from the blood both as a protein and as an enzymatic activity, and its half-life in the blood is only 1 to 2 minutes. Furthermore, it is known that the enzymatic activity of administered urokinase is affected by urokinase inhibitors in the blood, and thrombolytic ability does not develop unless an amount exceeding a certain threshold is administered. It is understood that such blood dynamics of urokinase inevitably leads to large-dose administration in order to obtain sufficient effects, leading to today's high-dose therapy. The inventors have long researched ways to maintain the efficacy of urokinase in the blood and make it less susceptible to inhibitory factors in the blood.
As a result of repeated experiments and studies, we have created water-soluble urokinase/monosaccharides, urokinase/monosaccharide derivatives, and urokinase/disaccharide conjugates, and these conjugates can improve various drawbacks seen when urokinase is administered alone. The inventors have discovered that the enzymatic activity of urokinase can be sufficiently and sustainably exerted, and have completed the present invention by focusing on its usefulness as a medicine. That is, the present invention provides a water-soluble urokinase-saccharide conjugate formed by directly or indirectly covalently bonding urokinase and at least one sugar selected from monosaccharides, derivatives thereof, and disaccharides, and urokinase and monosaccharides. This invention relates to a method for producing a urokinase-saccharide conjugate by reacting activated monosaccharides, activated monosaccharide derivatives, and activated disaccharides with one selected from activated monosaccharides, and optionally subjecting them to a reduction reaction. The urokinase used in the present invention may be derived from either human urine or kidney tissue culture as long as it has been purified as a medicine. Furthermore, the human-derived urokinase gene is introduced into Escherichia coli using genetic engineering techniques, and after culturing, Urokinase produced by E. coli may be used, and it is preferable to use one with a molecular weight in the range of 25,000 to 60,000. Examples of monosaccharides used in the present invention include glucose, galactose, fructose, etc., and examples of monosaccharide derivatives include uronic acids such as glucuronic acid and galactyuronic acid, glucosamine, and N-acylglucosamine (e.g., N-acetylglucosamine). glucosamine), 2-amino-
Amino sugars and acylated amino sugars such as 2-deoxine-D-glucose, methyl-6-bromo-6
Examples include glycosides such as -deoxy-glycoside, and further examples of disaccharides include lactose and maltose. The urokinase/saccharide of the present invention is produced by reacting urokinase with a monosaccharide as it is, or by reacting it with an activated saccharide obtained by activating the above saccharide. Here, activated saccharide is one in which the hydroxyl group of saccharide is activated so that it can react with the amino in the urokinase molecule. More specifically, the urokinase-saccharide conjugate is produced as follows. (1) (Method 1) A method that utilizes the reactivity of monosaccharides to directly bind to urokinase. This method is applicable only to monosaccharides;
This reaction utilizes an aldehyde group or a keto group of a monosaccharide as a functional group, and the formula for this reaction is as follows, taking the case of using glucose as the monosaccharide as an example. This method is carried out by reducing a compound obtained by reacting a monosaccharide with urokinase. In the reaction between urokinase and monosaccharide, monosaccharide is added to 1 to 10 parts by weight of urokinase.
Preferably, 10 to 3000 parts by weight are reacted.
Usually, monosaccharides are dissolved in water, and urokinase is dissolved in a 0.1-1M buffer (for example, phosphate buffer, pH 6-8) for the reaction. Reduction of the reaction product thus formed is usually carried out with sodium cyanoborate hydride. This reaction is usually carried out by adding a urokinase buffer and a reducing agent to an aqueous monosaccharide solution and stirring the mixture at 1 to 10°C for 10 to 30 hours. (2) A method of binding activated monosaccharides, their derivatives, or disaccharides to urokinase. This method is broadly divided into an aldehyde method and an alkylation method. These two methods will be described below. (Second method) Aldehyde conversion method After oxidizing monosaccharides and their derivatives or disaccharide hydroxyl groups to aldehyde groups and activating them,
This is a method for producing urokinase derivatives by reacting with urokinase and further reducing it. This is shown as a schematic reaction formula as follows. As the oxidizing agent used in the oxidation step in this reaction, periodic acid or the like is preferably used. The oxidizing agent is based on 180 parts by weight of sugars,
It is usually used in a proportion of 20 to 240 parts by weight, and
The oxidation is usually carried out for 10 to 60 minutes at room temperature in the dark. The activated saccharide thus obtained is reacted with urokinase. This reaction usually involves first neutralizing the activated saccharide obtained in the above reaction with a 1-4M alkali (e.g., sodium hydroxide), and then
This is carried out by adding 10 parts by weight of urokinase at about 0.9°C. The product thus obtained is treated with a reducing agent (preferably a cyanoborohydride metal salt).
0.6 to 2 parts by weight),
It can lead to urokinase-saccharide conjugate. As a solvent in the reduction treatment, for example, a 0.1-1M buffer (e.g. phosphate buffer) PH6
~8 is used. Further, the reduction is carried out by stirring at about 4°C for 15 to 20 hours. (Third Method) Alkylation Method This method is schematically illustrated as follows. (In the formula, X and X' each represent a halogen atom (e.g., prom, chloro), and n represents an integer of 1 to 6.) It is added in a proportion of 0.1 to 0.3 parts by weight to form an activated saccharide, and then treated with a difunctional compound [for example, a compound such as diaminoethane or diaminohexane ()], and then combined with a compound such as bromoacetyl bromide (). let The activated saccharide thus obtained is brought into contact with urokinase to obtain a urokinase derivative. The resulting reaction generally has a pH of 7.2
-11 and contact at a temperature of 3 to 25°C for 12 to 48 hours. The urokinase-saccharide conjugate thus obtained can be separated and purified by known separation and purification methods, such as gel filtration, molecular sieving, and ion exchange. The recovered urokinase/saccharide conjugate can be made into a urokinase/saccharide conjugate preparation, that is, a thrombolytic agent, by, for example, performing sterilization and heat treatment, dispensing it, and freeze-drying it. . The properties of the urokinase/saccharide conjugates thus obtained, ie, urokinase/monosaccharides, urokinase/monosaccharide derivatives, and urokinase/disaccharide bonds, are as follows. Easily soluble in water and saline. The molar ratio of urokinase and each sugar is 1:5 ~
It is 1:1000. PH stability, thermostability, resistance to protease inhibitors in plasma, persistence in blood, and acute toxicity are as shown in the experimental examples below. The urokinase/saccharide conjugates used in the following experimental examples are urokinase/monosaccharide conjugates of urokinase/glucose and urokinase/galactose produced by the second method (aldehyde method). As a derivative conjugate, a conjugate of urokinase/glucosamine and urokinase/N-acetylglucosamine produced by the third method [alkylation method, using diaminoethane as the compound ()] was used as a second urokinase/disaccharide conjugate. A conjugate of urokinase/lactose and urokinase/maltose produced by the aldehyde method (aldehyde method) was used. Experimental Example 1 PH Stability: Urokinase itself is relatively stable over a PH range of 3 to 10, but the various urokinase-saccharide conjugates mentioned above are even more stable, ranging from PH 2 to 11.
No decrease in titer was observed over a wide range. Experimental example 2 Thermal stability: 60℃ at pH8.0, where urokinase is most stable
When heated, urokinase alone was completely inactivated after 2 hours of heating, whereas the above-mentioned urokinase/saccharide conjugate still showed 100% residual activity even after 10 hours of heating. It was found to be very stable to heat. Experimental Example 3 Resistance to plasma protease inhibitors: Using human plasma, we tested the resistance of urokinase, the above-mentioned urokinase/monosaccharide, urokinase/monosaccharide derivatives, and urokinase/disaccharide conjugates to plasma protease inhibitors. Examined. The test method is as follows. That is, the activity is 100IU
(International units)/ml (For international units, see Pharmaceutical Research (3), 295-308 (1974)) A solution of urokinase alone or each of the above-mentioned conjugates diluted to
Mix 15μ of 18% human plasma albumin with 225μ, then add human plasma to 20μ of this mixture.
After mixing 80μ and incubating for 1 hour at 37℃, human fibrin standard plate method (BBA, 24 ,
278-282, 1975), and the residual urokinase activity was calculated based on the urokinase activity before incubation with human plasma as 100%. The test results are shown in Figure 1, and the residual activity of urokinase alone was 1.5%.
In contrast, the residual activities of the conjugates of urokinase-glucose, urokinase-galactose, urokinase-glucosamine, urokinase-N-acetylglucosamine, urokinase-lactose, and urokinase-maltose are 8%, 7%, and 6%, respectively. They were 7%, 8%, and 9%.
From this, it was confirmed that the conjugate of the present invention is resistant to the effects of plasma protease inhibitors. Experimental Example 4 Thrombolytic ability test: Using the Chandra loop method, the thrombolytic ability of urokinase or the various conjugates listed above was comparatively investigated. In this test method, 1 ml of fresh, normal human citrated blood is placed in a plastic tube with an inner diameter of 3 mm and a length of 270 mm, and 0.1 ml of 3.8% calcium chloride dihydrate solution is added to the blood.
Join silicon tubes with an inner diameter of 5 mm and a length of 15 mm to both ends of the tube to form a loop. This tube was immediately placed on a rotary plate designed to rotate 12 times per minute at an angle of 80° from the horizontal plane, and rotated for 20 minutes in a thermostatic chamber at 37°C. This creates an artificial thrombus approximately 13 mm in length at the tip of the blood column. This artificial thrombus is said to have a histological image that is very similar to a mixed thrombus formed in the human body in histopathological terms. After removing the loop from this device, remove one end of the looped polyvinyl tube from the silicone tube, and add 0.1% of the sample solution or physiological saline.
ml was put into the tube, the tube was made into a loop again, and placed on a rotating device to continue rotating. Four hours after starting thrombolysis in the first loop, the first loop was removed from the rotating device, the thrombus in the tube was homogenized in 10 ml of distilled water, and centrifuged (3600 rpm, 5 ml). The absorbance of the supernatant was measured at 540 nm.
The second and subsequent loops were extracted following the first loop and processed in the same manner as before. In addition, the thrombolysis rate (Y) of the sample solution addition group was determined according to the following formula. Y=(1-A/Ac)×100(%) However, A: 540 nm for the loop to which the sample solution was added
Absorbance Ac; for the loop with saline added
Average value of absorbance at 540 nm The results of the thrombolytic test using the Chandra loop method for urokinase alone and the combination of urokinase/glucose, urokinase/galactose, urokinase/glucosamine, urokinase/N-acetylglucosamine, urokinase/lactose, and urokinase/maltose are as follows: , as shown in FIG. The horizontal axis of the graph in Figure 2 is the sample liquid.
The final titer when 0.1 ml was injected into the loop is shown, and the titer is the value measured by the fibrin plate method. From this graph, it can be seen that the thrombolytic curves of the various conjugates mentioned above are shifted to the left side of the curves of urokinase itself, indicating that the thrombolytic ability of the conjugates of the present invention is stronger than that of urokinase itself. It will therefore be understood that these conjugates of the present invention have excellent thrombolytic activity and are useful as thrombolytic agents. Experimental Example 5 Blood Persistence Test: Using beagle dogs (male, weight 12-15 kg), the effects of maintaining each of the above-mentioned urokinase-saccharide conjugates in the blood were tested and compared with administration of urokinase alone. The labeling method is the chloramine T method (Biochem J. 89 , 114,
(1963), dissolve 100,000 units of urokinase in 0.5 ml of phosphate buffer, add 1 ml of 1 mCi/ml Na 125 I to 0.1 ml of this urokinase aqueous solution, add 0.1 ml of 0.05% chloramine-T, and let the mixture cool to room temperature. te2
After reacting for a minute, 0.1% sodium bisulfite
The reaction was stopped by adding 0.1 ml, and the reaction mixture was passed through a Sephadex G-25 column to separate 125 I-urokinase and free NaI 125 . The 125 I-urokinase thus obtained was divided into two parts, one was used as a sample for animal experiments, and the other was reacted with a monosaccharide, a derivative thereof, or a disaccharide of the activated conjugate having a molecular weight of 500,000. A 125 I-urokinase-saccharide conjugate was obtained and used as a sample for animal experiments. Each 125 I-urokinase/saccharide conjugate and 125 I
- 2×10 6 cpm of each urokinase was administered intravenously to beagle dogs, and the blood concentration of each was determined every 10 minutes. The experimental results are shown in Table 1, and compared to 125 I-urokinase alone, the blood half-life is shorter in the first and second decay curves.
125 I-Urokinase glucose conjugate: 5.3 times and 4.7 times, 125 I-Urokinase galactose conjugate: 5.3 times and 4.4 times, 125 I-Urokinase glucosamine conjugate: 5.9 times and 5 times, 125 I -Urokinase/N-acetylglucosamine conjugate
5.3 times and 4.9 times, 125 I-urokinase lactose conjugate 5.3 times and 4 times, 125 I-urokinase conjugate
For the maltose conjugates, the increase was 5.9 times and 4.4 times, respectively, indicating that these urokinase conjugates had a significant blood maintenance effect.

【表】【table】

【表】 実験例 6 ウロキナーゼ・糖類結合物の急性毒性試験: 急性毒性試験をウイスター系ラツトの尾静脈内
投与により調べるため、体重1Kgにつき上記各ウ
ロキナーゼ結合物のウロキナーゼ50万IUをそれ
ぞれ静注し投与後7日間にわたつて一般症状の観
察と体重測定を行つたところ、すべて体重は順調
に増加して全く異常所見は認められなかつたし、
剖検ならびに組織学的検査の結果も全く異常を認
めなかつた。 本発明に係るウロキナーゼ・糖類結合物の臨床
使用における投与量および投与方法はたとえば次
の通りである。即ち、50〜30000IUの本品を日本
薬局方注射用蒸留水0.5〜5mlに溶解し、年令、
症状および経過に応じて適宜加減して静脈内注
射、点滴静注、、結膜下又は球後注射して用いる。 本発明に係るウロキナーゼ・糖類結合物は血中
で極めて安定であつて容易に解離や分解をせず、
熱に対しても著るしく安定であり、血中のウロキ
ナーゼ阻害因子の作用を受けにくく、ウロキナー
ゼ単独では血栓溶解作用を示さない低力価の投与
でも血栓溶解作用をもたらし、生体内に投与した
とき血中滞留時間が著るしく延長し、毒性もほと
んど検出されない等の優れた特性を有し、従来に
ない極めて有用性の高い医薬を提供できる効果が
ある。 実施例 1〜4 グルコース、ガラクトース、フラクトースまた
はラクトース180mgを秤取し、これに蒸留水3ml
を加え溶解させ、ウロキナーゼ6mgを含有する
0.1Mリン酸緩衝液(PH7)2mlと同緩衝液1ml
に2mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを溶かし
たものを加え、4℃にて24時間撹拌する。撹拌
後、上記緩衝液にて透析を行う。得られたもの
を、ミリポアフイルターによる除菌過を行い、
ウロキナーゼ力価を測定して、分注量を決めたの
ち、所定量を小分けして凍結乾燥し、モル比1:
58のウロキナーゼグルコース、モル比1:32のウ
ロキナーゼガラクトース、モル比1:46のウロキ
ナーゼフラクトース、モル比1:36のウロキナー
ゼ・ラクトースの結合物を得る。これらは前述し
たウロキナーゼ・単糖類結合物の種々の特性を有
していた。 実施例 5〜10 グルコース、ガラクトース、グルコサミン、N
−アセチルグルコサミン、ラクトース、マルトー
スのいずれか1gを秤取し、これに蒸留水20mlを
加え溶解させ、1.18gの過ヨウ素酸ナトリウムを
蒸留水5mlに溶解させたものを添加し、室温で暗
所にて30分間撹拌した。撹拌後、4Mの水酸化ナ
トリウム溶液で中和し、次いでウロキナーゼ10mg
を含有する水溶液4mlを添加し、4℃にて18時間
撹拌する。撹拌後、ミリポアフイルターによる除
菌過を行い、ウロキナーゼ力価を測定して分注
量を決めたのち、所定量を小分けして分注し、凍
結乾燥してモル比1:96のウロキナーゼ・グルコ
ース、モル比1:70のウロキナーゼ・ガラクトー
ス、モル比1:46のウロキナーゼ・グルコサミ
ン、モル比1:66のウロキナーゼ・N−アセチル
グルコサミン、モル比1:160のウロキナーゼ・
ラクトース、モル比1:140のウロキナーゼ・マ
ルトースの結合物を得る。これらは、前述した本
発明結合物の特性を有していた。 実施例 11 メチル−6−ブロモ−6−デオキシ−D−グル
コシド1gを0.1Mリン酸緩衝液(PH10)(10ml)
にとかし、10mgのウロキナーゼを含有する上記と
同じ緩衝液を加え、10mMの水酸化ナトリウムで
PHを10とし、4℃にて24時間撹拌する。撹拌後、
上記緩衝液にて透析を行う。得られたモル比1:
62のウロキナーゼ・メチル−6−デオキシ−D−
グルコシド結合物は前述の種々の特性を有してい
た。 実施例 12、13 グルクロン酸又はガラクツロン酸のいずれか1
gとジシクロヘキシルカルボジイミドを0.1Mリ
ン酸緩衝液(PH4.5)にとかし、1MHClでPHを4.5
とし、ウロキナーゼ10mgを含有する0.1Mリン酸
緩衝液(PH4.5)を加え、24時間反応させる。先
の実施例で既述した如く、透析、除菌過、凍結
乾燥して得られたモル比1:76のウロキナーゼ・
グルクロン酸、モル比1:83のウロキナーゼ・ガ
ラクツロン酸の結合物は前述の種々の特性を有し
ていた。 実施例 14、15 2−アミノ−2−デオキシ−D−グルコース又
は2−アミノ−2−デオキシ−D−ガラクトース
のいずれか1gとジシクロヘキシルカルボジイミ
ドを0.1Mリン酸緩衝液(PH4.5)にとかし、1M
塩酸でPHを4.5とし、ウロキナーゼ10mgを含有す
る0.1Mリン酸緩衝液(PH4.5)を加え、24時間反
応させる。反応終了後、透析、除菌過、凍結乾
燥して得られるモル比1:62のウロキナーゼ・2
−アミノ−2−デオキシ−D−グルコース又はモ
ル比1:50のウロキナーゼ・2−アミノ−2−デ
オキシ−D−ガラクトースの結合物は前述の種々
の特性を有していた。 実施例 16〜21 グルコース、ガラクトース、グルコサミン、N
−アセチルグルコサミン、ラクトース、マルトー
スのいずれか1gに蒸留水49mlを加えて溶かし、
次いでトリフエニルホスフイン3.2gとN−ブロ
モサクシイミド2.2gをテトラヒドロフラン1.5ml
に溶かした液を滴加して十分に撹拌する。この間
1M水酸化ナトリウムにてPH10.2〜10.5に維持す
る。反応開始より5分経過後に濃塩酸にてPH2.2
に下げ、ジアミノエタン2mlを加えてPH9.5に上
げ、PH9.5に保つて4℃で1夜静置する。この後
フラツシユカラムを用いた分配クロマトグラフイ
ーにより未反応物を除去したのち凍結乾燥してア
ミノエチルアミノ化した上述の化合物を得る。次
にこれを0.1Mリン酸緩衝液(PH7.0)25mlに溶解
し、ブロムアセチルブロミド1mlを滴下し、約2
時間1N水酸化ナトリウムでPH7.0に保つたのちフ
ラツシユカラムを用いた分配クロマトグラフイー
により未反応物を除去し、凍結乾燥して活性化し
た上述の化合物末を得る。その50mgを0.1M炭酸
緩衝液(PH9.5)0.4mlに溶かし、ウロキナーゼ2
万IUを加え、約5℃にて50時間静置して結合反
応を行う。反応終了後、透析、除菌過、凍結乾
燥してモル比1:130のウロキナーゼ・グルコー
ス、モル比1:150のウロキナーゼ・ガラクトー
ス、モル比1:116のウロキナーゼ・グルコサミ
ン、モル比1:120のウロキナーゼ・N−アセチ
ルグルコサミン、モル比1:260のウロキナー
ゼ・ラクトース、モル比1:310のウロキナー
ゼ・マルトースの結合物の製剤を得た。これら製
剤は前述の種々の特性を有していた。 前記各実施例にて得られた各生成物の特性は第
2表に示す通りであり、第2表において「UK」
は「ウロキナーゼ」を意味する。
[Table] Experimental Example 6 Acute toxicity test of urokinase-saccharide conjugate: To investigate the acute toxicity test by intravenous administration of urokinase to Wistar rats, 500,000 IU of urokinase of each of the above urokinase conjugates was intravenously injected per 1 kg of body weight. When general symptoms were observed and body weight was measured for 7 days after administration, the body weight increased steadily and no abnormal findings were observed.
No abnormalities were found in the results of autopsy and histological examination. The dosage and administration method for clinical use of the urokinase-saccharide conjugate according to the present invention are, for example, as follows. That is, dissolve 50 to 30,000 IU of this product in 0.5 to 5 ml of distilled water for injection in the Japanese Pharmacopoeia, and
Administer the drug by intravenous injection, intravenous drip, subconjunctival or retrobulbar injection, adjusting the dosage as appropriate depending on the symptoms and progress. The urokinase-saccharide conjugate according to the present invention is extremely stable in blood and does not easily dissociate or decompose.
It is extremely stable against heat, is not susceptible to the effects of urokinase inhibitors in the blood, and produces thrombolytic effects even when administered at a low titer, while urokinase alone does not exhibit thrombolytic effects, making it possible to administer it in vivo. It has excellent properties such as a significantly extended blood residence time and almost no detectable toxicity, and has the effect of providing an extremely useful medicine that has never existed before. Examples 1 to 4 Weigh out 180 mg of glucose, galactose, fructose or lactose, and add 3 ml of distilled water to this.
Add and dissolve, containing 6 mg of urokinase.
2ml of 0.1M phosphate buffer (PH7) and 1ml of the same buffer
A solution of 2 mg of sodium cyanoborohydride was added to the solution, and the mixture was stirred at 4°C for 24 hours. After stirring, dialysis is performed using the above buffer. The obtained material was sterilized using a Millipore filter,
After measuring the urokinase titer and determining the amount to dispense, divide the specified amount into small portions and freeze-dry them to obtain a molar ratio of 1:
A conjugate of 58 urokinase glucose, urokinase galactose in a molar ratio of 1:32, urokinase fructose in a molar ratio of 1:46, and urokinase-lactose in a molar ratio of 1:36 is obtained. These had various properties of the urokinase-monosaccharide conjugate described above. Examples 5-10 Glucose, galactose, glucosamine, N
- Weigh out 1 g of acetylglucosamine, lactose, or maltose, add 20 ml of distilled water to dissolve it, add 1.18 g of sodium periodate dissolved in 5 ml of distilled water, and store in the dark at room temperature. The mixture was stirred for 30 minutes. After stirring, neutralize with 4M sodium hydroxide solution and then add 10 mg of urokinase.
4 ml of an aqueous solution containing is added and stirred at 4°C for 18 hours. After stirring, sterilization was performed using a Millipore filter, the urokinase titer was measured and the amount to be dispensed was determined, and the specified amount was divided into small portions and lyophilized to obtain urokinase/glucose at a molar ratio of 1:96. , urokinase/galactose in a molar ratio of 1:70, urokinase/glucosamine in a molar ratio of 1:46, urokinase/N-acetylglucosamine in a molar ratio of 1:66, urokinase/N-acetylglucosamine in a molar ratio of 1:160.
A conjugate of lactose and urokinase/maltose in a molar ratio of 1:140 is obtained. These had the properties of the conjugates of the invention described above. Example 11 1 g of methyl-6-bromo-6-deoxy-D-glucoside was added to 0.1 M phosphate buffer (PH10) (10 ml)
Add the same buffer as above containing 10 mg of urokinase and dilute with 10 mM sodium hydroxide.
Adjust the pH to 10 and stir at 4°C for 24 hours. After stirring,
Dialysis is performed using the above buffer. Obtained molar ratio 1:
62 urokinase methyl-6-deoxy-D-
The glucoside conjugates had the various properties mentioned above. Example 12, 13 Either glucuronic acid or galacturonic acid
Dissolve g and dicyclohexylcarbodiimide in 0.1M phosphate buffer (PH4.5), and adjust the pH to 4.5 with 1MHCl.
Then, add 0.1M phosphate buffer (PH4.5) containing 10mg of urokinase and allow to react for 24 hours. As described in the previous example, urokinase and urokinase in a molar ratio of 1:76 were obtained by dialysis, sterilization, and freeze-drying.
Glucuronic acid, a conjugate of urokinase and galacturonic acid in a molar ratio of 1:83, had the various properties described above. Examples 14 and 15 1 g of either 2-amino-2-deoxy-D-glucose or 2-amino-2-deoxy-D-galactose and dicyclohexylcarbodiimide were dissolved in 0.1 M phosphate buffer (PH4.5), 1M
Adjust the pH to 4.5 with hydrochloric acid, add 0.1M phosphate buffer (PH4.5) containing 10 mg of urokinase, and allow to react for 24 hours. After the reaction is complete, urokinase 2 with a molar ratio of 1:62 is obtained by dialysis, sterilization, and freeze-drying.
-Amino-2-deoxy-D-glucose or a conjugate of urokinase and 2-amino-2-deoxy-D-galactose in a molar ratio of 1:50 had the various properties mentioned above. Examples 16-21 Glucose, galactose, glucosamine, N
-Add 49ml of distilled water to 1g of acetylglucosamine, lactose, or maltose and dissolve.
Next, 3.2 g of triphenylphosphine and 2.2 g of N-bromosuccinimide were added to 1.5 ml of tetrahydrofuran.
Add the solution dissolved in it dropwise and stir thoroughly. During this time
Maintain pH 10.2-10.5 with 1M sodium hydroxide. 5 minutes after the start of the reaction, adjust the pH to 2.2 with concentrated hydrochloric acid.
Add 2 ml of diaminoethane to raise the pH to 9.5, keep it at 9.5, and leave it at 4°C overnight. Thereafter, unreacted substances are removed by partition chromatography using a flash column, followed by freeze-drying to obtain the above-mentioned aminoethylaminated compound. Next, dissolve this in 25 ml of 0.1M phosphate buffer (PH7.0), add 1 ml of bromoacetyl bromide dropwise, and
After maintaining the pH at 7.0 with 1N sodium hydroxide for a period of time, unreacted substances were removed by partition chromatography using a flash column, and the activated compound powder was obtained by lyophilization. Dissolve 50mg of it in 0.4ml of 0.1M carbonate buffer (PH9.5) and add urokinase 2.
Add 10,000 IU and leave to stand at about 5°C for 50 hours to perform a binding reaction. After completion of the reaction, dialysis, sterilization, and lyophilization were performed to obtain urokinase/glucose at a molar ratio of 1:130, urokinase/galactose at a molar ratio of 1:150, urokinase/glucosamine at a molar ratio of 1:116, and urokinase/glucosamine at a molar ratio of 1:120. A preparation of a conjugate of urokinase/N-acetylglucosamine, urokinase/lactose in a molar ratio of 1:260, and urokinase/maltose in a molar ratio of 1:310 was obtained. These formulations had the various properties mentioned above. The characteristics of each product obtained in each of the above examples are as shown in Table 2, and in Table 2, "UK"
means "urokinase".

【表】【table】

【表】【table】 【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第1図は、血漿中プロテアーゼ阻害因子に対す
る抵抗性を示す図、第2図は、ウロキナーゼ及び
各種ウロキナーゼ結合物の血栓溶解曲線である。
第2図における1〜7は各々次の結合物について
の曲線である。 1……ウロキナーゼ、2……ウロキナーゼ・グ
ルコース、3……ウロキナーゼ・ガラクトース、
4……ウロキナーゼ・N−アセチルグルコサミ
ン、5……ウロキナーゼ・グルコサミン、6……
ウロキナーゼ・マルトース、7……ウロキナー
ゼ・ラクトース。
FIG. 1 shows resistance to plasma protease inhibitors, and FIG. 2 shows thrombolytic curves of urokinase and various urokinase conjugates.
1 to 7 in FIG. 2 are curves for the following combinations. 1... Urokinase, 2... Urokinase glucose, 3... Urokinase galactose,
4...Urokinase/N-acetylglucosamine, 5...Urokinase/glucosamine, 6...
Urokinase maltose, 7... Urokinase lactose.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1 ウロキナーゼと単糖類、その誘導体及び二糖
類から選ばれた一種の糖とを直接的に又は間接的
に共有結合させてなる水可溶性のウロキナーゼ・
糖類結合物。 2 ウロキナーゼ1モルに対して糖が5〜1000モ
ルの割合で結合してなる特許請求の範囲第1項記
載のウロキナーゼ・糖類結合物。 3 ウロキナーゼと単糖類、活性化単糖類、活性
化単糖類誘導体、活性化二糖類から選ばれる一種
とを反応させ、必要に応じて還元反応に付すこと
を特徴とする水可溶性のウロキナーゼ・糖類結合
物の製造法。
[Claims] 1. A water-soluble urokinase obtained by directly or indirectly covalently bonding urokinase and a type of sugar selected from monosaccharides, derivatives thereof, and disaccharides.
Sugar conjugates. 2. The urokinase-saccharide conjugate according to claim 1, wherein the saccharide is bound to 1 mole of urokinase at a ratio of 5 to 1000 moles. 3. A water-soluble urokinase-saccharide bond characterized by reacting urokinase with one selected from monosaccharides, activated monosaccharides, activated monosaccharide derivatives, and activated disaccharides, and subjecting it to a reduction reaction as necessary. How things are manufactured.
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