JPH01273585A - Modified cholesterol oxidase and quantitative determination of steroids using the same enzyme - Google Patents
Modified cholesterol oxidase and quantitative determination of steroids using the same enzymeInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は有機溶媒に可溶な修飾されたコンスチロールオ
キシダーゼに関し、またこの有機溶媒に可溶な性質を利
用した有機溶媒中でのステロイド類、トくに３β−ヒド
ロキシステロイド類の定量方法に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention relates to a modified constyrol oxidase that is soluble in organic solvents, and also to the production of steroids in organic solvents by utilizing this property of being soluble in organic solvents. In particular, it relates to a method for quantifying 3β-hydroxysteroids.
コレステロールオキシダーゼはステロイド類に作用して
過酸化水素を発生させる酵素として知られており、また
この性質を利用してステロイド類の定量に用いられてｂ
る。Cholesterol oxidase is known as an enzyme that acts on steroids to generate hydrogen peroxide, and this property is also used to quantify steroids.
Ru.
たとえば、コレステロールオキシダーゼをコレステロー
ルに作用させると４−ブレステン−３−オンと過酸化水
素を生ずる。この過酸化水素をペルオキシダーゼの存在
下に。−フェニレンジアミンなどの酸化されて発色する
化合物と反応させ、〔発明が解決しようとする課題〕
ところが、コレステロールオキシダーゼは水板外の有機
溶媒には溶解しがたく、血液中のステロイド類の定量で
も特殊な界面活性剤を併用する必要があって、その操作
は繁雑で熟練を要するものであった。For example, when cholesterol oxidase acts on cholesterol, it produces 4-bresten-3-one and hydrogen peroxide. This hydrogen peroxide in the presence of peroxidase. - By reacting with a compound that develops color when oxidized, such as phenylene diamine, [the problem to be solved by the invention] However, cholesterol oxidase is difficult to dissolve in organic solvents outside the water plate, and even in the determination of steroids in blood. It was necessary to use a special surfactant in combination, and the operation was complicated and required skill.
ステロイド類は元来水溶性ではなく、有機溶媒には極め
て溶は易い性質があるので、水不溶性の有機溶媒中で作
用できるコレステロールオキシダーゼ変成体が要望され
ていた。Since steroids are not inherently water-soluble and are extremely soluble in organic solvents, there has been a need for modified cholesterol oxidases that can act in water-insoluble organic solvents.
この問題を解決すべく、本発明者らは鋭意検討した結果
、特定の構造の共重合体と化学反応させ九六コレステロ
ールオキシダーゼ、すなわち修飾されたコレステロール
オキシダーゼが水不溶性の有機１岱媒によく溶解し、有
機溶媒中でのステロイド類の定量に適していることを見
出し、本発明に到達した。In order to solve this problem, the present inventors conducted extensive research and found that 96-cholesterol oxidase, modified cholesterol oxidase, was produced by chemically reacting with a copolymer with a specific structure, and that it dissolves well in a water-insoluble organic solvent. However, they discovered that it is suitable for quantifying steroids in organic solvents, and arrived at the present invention.
すなわち１本発明は平均分子ｉ３．ｏｏｏ〜４゜ｏ、
ｏ ｏ ｏの一般式（１）で示されるポリオキシアルキ
レンアルケニルエーテル−無水マンイン酸共重合体で修
飾されたコレステロールオキシダーゼおよび有機溶媒中
で修飾されたコレステロールオキシダーゼとステロイド
類とを反応させ、発生した過酸化水素を修飾されたベル
オキ／ダーゼの存在下にｏ−フェニレンジアミンと反応
させたのち、比色定量することを特徴とするステフィト
類の定遣方法でちる。That is, 1 the present invention has an average molecule i3. ooo~4゜o,
Cholesterol oxidase modified with a polyoxyalkylene alkenyl ether-mannic anhydride copolymer represented by the general formula (1) of o o o and cholesterol oxidase modified with steroids in an organic solvent are reacted to generate a A method for determining stephites is used, which is characterized in that hydrogen peroxide is reacted with o-phenylenediamine in the presence of a modified belooxidase, followed by colorimetric determination.
（ただし、Ｘは水素原子オたはＣ）（３、Ｒは炭素数１
〜２４の炭化水素基、ＡＯは炭素ａ２〜１８のオキシア
ルキレン基、ａ ＝ １−２、ｎ＝１−１００、ｐ＝２
〜２００である。）
一般式（１）の化合物において、ｎが１〜１００に限定
されるのは、ｎが１未満であると、有機溶媒への溶解性
が悪くなり、また１００を越えると界面活性が強くなっ
て、水と有機溶媒が共存する系では乳化しゃすくなり、
作業性が悪くなるので不都合である。またｐが２〜２０
０あるいは平均分子量が３，０００〜４００． ＯＯＯ
に限定されるのは、ｐが２未満あるいは平均分子量が３
． ＯＯＯに満たないと有機ｍ媒への溶解性が悪くなり
、またｐが２００を４えたυあるいは平均分子量が４０
ｏ、 ｏ ｏ ｏを越えると、界面活性が強くなって水
と有機溶媒とが共存する系では乳化しやすくなり、作業
性が悪くなるので不都合なためである。(However, X is a hydrogen atom or C) (3, R is a carbon number 1
~24 hydrocarbon group, AO is an oxyalkylene group of carbon a2-18, a = 1-2, n = 1-100, p = 2
~200. ) In the compound of general formula (1), n is limited to 1 to 100 because if n is less than 1, the solubility in organic solvents will be poor, and if it exceeds 100, the surface activity will be strong. Therefore, in systems where water and organic solvent coexist, emulsification becomes difficult.
This is inconvenient because it impairs workability. Also, p is 2 to 20
0 or average molecular weight of 3,000 to 400. OOO
is limited to p less than 2 or average molecular weight 3
．． If it is less than OOO, the solubility in organic medium will be poor, and if p is less than 400 or the average molecular weight is 40
This is because if it exceeds o, o o o, the surface activity becomes strong and emulsification tends to occur in a system where water and an organic solvent coexist, resulting in poor workability, which is disadvantageous.
ポリオキシアルキレンアルケニルエーテルのアルケニル
基としては、アリル基、メタリル基、３−ブテニル等、
２−メチル−３−ブテニル基などがあり、Ｒで示される
炭素数１〜２４の炭化水素基としては、メチル基、エチ
ル基、プロピル基、イソブチル基、ブチル基、イソブチ
ル基、第三ブチル基、アミル基、インアミル基、ヘキシ
ル基、ヘプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基
、ノニル基、テシル基、ウンデシル基、ドテシル基、イ
ソトリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデフル基、イ
ソへキテデシル基、オクタデシル基、イソオクタデシル
基、オクチルドデシル基、トコシルＬ デジルテトラデ
シル基、オレイル基、工ゝルシル基、フェニル基、ベン
ジル基、クレジル基、−Ｉ＋ルフェニル基、ジブチルフ
ェニル基、−Ａ−りｆルフェニル基、ノニルフェニル基
、ドデシルフェニル基、ジオクチルフェニル基、ジノニ
ルフェニル基などかあシ、ＡＯで示される炭素数２〜１
８のオキシアルキレン基としては、オキシエチレン基、
オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラ
メチレン基、オキシアルキレン基、オキシテトラメチレ
ン基、オキシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン
基などがある。The alkenyl group of polyoxyalkylene alkenyl ether includes allyl group, methallyl group, 3-butenyl, etc.
Examples of hydrocarbon groups having 1 to 24 carbon atoms represented by R include 2-methyl-3-butenyl group, methyl group, ethyl group, propyl group, isobutyl group, butyl group, isobutyl group, and tert-butyl group. , amyl group, inamyl group, hexyl group, heptyl group, 2-ethylhexyl group, octyl group, nonyl group, tesyl group, undecyl group, dotecyl group, isotridecyl group, tetradecyl group, hexadefur group, isohekitedecyl group, octadecyl group, Isooctadecyl group, octyldodecyl group, tocosyl L decyltetradecyl group, oleyl group, polycyl group, phenyl group, benzyl group, cresyl group, -I+ruphenyl group, dibutylphenyl group, -A-ruphenyl group, nonyl Phenyl group, dodecylphenyl group, dioctylphenyl group, dinonylphenyl group, etc. 2 to 1 carbon atoms represented by AO,
As the oxyalkylene group of 8, oxyethylene group,
Examples include oxypropylene group, oxybutylene group, oxytetramethylene group, oxyalkylene group, oxytetramethylene group, oxyhexadecylene group, and oxyoctadecylene group.
また、ＡＯは２ｈ１以上の混合物であってもよく、この
場合はブロック状に付加していてもランダム状に付加し
ていてもよい。Further, AO may be a mixture of 2h1 or more, and in this case, it may be added in blocks or randomly.
本発明に使用するポリオキシアルキレンアルケニルエー
テル−無水マレイン酸共重合体は通常のラジカル重合反
応によって得られ、たとえば特公昭４５−３１９５０号
公報に示された方法によって容易に得ることができる。The polyoxyalkylene alkenyl ether-maleic anhydride copolymer used in the present invention can be obtained by a conventional radical polymerization reaction, and can be easily obtained, for example, by the method disclosed in Japanese Patent Publication No. 31950/1983.
この共、１体とコレステロールオキシダーゼは水溶液中
でｍ液のｐＨを７〜１０、好ましくは８〜９に調節する
ことにより、共重合体の酸無水物部分トコレスチロール
オキシダーゼのアミノ基とが反応するので容易に得るこ
とができる。In this case, the acid anhydride moiety of the copolymer and the cholesterol oxidase are reacted with the amino groups of the tocholestyrol oxidase by adjusting the pH of the m liquid in an aqueous solution to 7 to 10, preferably 8 to 9. So you can easily get it.
ステロイド類の定量に用いる修飾されたペルオキシダー
ゼは有機溶媒に可溶なものであればいかなるものでもよ
く、たとえばポリエチレングリコ２６５頁（１９８４）
）や本発明で用いる一般式（１）の共重合体で修飾され
たものなどがある。Any modified peroxidase used for the determination of steroids may be used as long as it is soluble in organic solvents, such as polyethylene glyco, p. 265 (1984).
) and those modified with a copolymer of general formula (1) used in the present invention.
ステロイド類の定１は、水に不溶の有機直媒、＆、！−
、ｔばベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、
クロロホルム、四塩化炭素、 ） ＩＪ り０ ＃エ
タン、トリクロルエチレン等を用いて行なうことができ
る。Steroids are organic direct solvents that are insoluble in water &,! −
, benzene, toluene, xylene, methylene chloride,
This can be carried out using chloroform, carbon tetrachloride, ethane, trichlorethylene, etc.
これらの有機溶媒中で、ステロール類、修飾さレタコレ
ステロールオキシグーゼ、修飾されタベルオキシグーゼ
および０−フェニレンジアミンを室温で混合し、一定時
間Ｊ過仮に４９０ｎｍの酸化すれｆｃｏ−７二二レンジ
アミンの吸光度を測定すると、酸化されたステロール類
の量が決定される。In these organic solvents, sterols, modified letacholesterol oxyguse, modified Tabell oxyguse, and 0-phenylene diamine were mixed at room temperature, and for a certain period of time the oxidation of 490 nm was performed. Measuring the absorbance of the amine determines the amount of oxidized sterols.
本発明はコレステロールオキシダーゼを平均分子！３，
０００〜４００，０００のポリオキシアルキレンアルケ
ニルエーテル−無水マレインＶ共重合体と化学結合させ
て修飾したことにより、有機溶媒中でも活性を示す修飾
されたコレステロールオキシダーゼである。また、この
修飾されたコレステロールオキシダーゼ、修飾されたペ
ルオキシダーゼおよび０−フェニレンジアミンを用いる
ことにより、有機溶媒中でステロイド類の定量が容易か
つ正確に行なえる。The present invention uses cholesterol oxidase as an average molecule! 3,
It is a modified cholesterol oxidase that exhibits activity even in organic solvents by chemically bonding it with a polyoxyalkylene alkenyl ether-anhydride maleic V copolymer having a molecular weight of 000 to 400,000. Furthermore, by using the modified cholesterol oxidase, modified peroxidase, and O-phenylenediamine, steroids can be easily and accurately quantified in an organic solvent.
以下に実施例を記載する。 Examples are described below.
実施例１（修飾されたコレステロールオキシダーゼの！
！！造）
２０■のコレステロールオキシグーゼム含むα２モルホ
ウ酸緩ＩＩ液（ｐＨ＆５）４−に、１００■のポリオキ
シエチレン（３３モル）メチルアリルジエーテル−無水
マレイン酸共重合体（平均分子量１３，０００）を加え
、２５℃で３０分かくはんしたのち、０℃に冷却した１
００ｍ１のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて反応を
停止した。ダイアフロー・メンプランＡ−５０Ｔ（ウル
バソク丈−ビス社ａ）を用いた限外ＰＡにより反応混合
物から未反応の共重合体を除去し、水による透析と凍結
乾燥を行って修飾されたコレステロールオキシダーゼ（
扁１）９０ｆｆｉ７を得た。Example 1 (Modified cholesterol oxidase!
! ! 100 μm of polyoxyethylene (33 mol) methylallyl diether-maleic anhydride copolymer (average molecular weight 13,000 ), stirred at 25℃ for 30 minutes, and cooled to 0℃.
The reaction was stopped by adding 00 ml of phosphate buffer (pH 7.0). Unreacted copolymer was removed from the reaction mixture by ultra-PA using Diaflow Menpuran A-50T (Ulbasoku Jyo-Bis Co., Ltd.), followed by dialysis with water and freeze-drying to obtain modified cholesterol oxidase. (
1) 90ffi7 was obtained.
同様の操作を、１００■の共重合体を加えて３０分かく
はんしたのち、さらに１００ηの共重合体を加えて３０
分かくはんしたもの（修飾されたコレステロールオキシ
ダーゼ４２）、さらＫＩＯｏｌｌｖの共重合体を加えて
３０分かくはんしたもの（修飾されたコレステロールオ
キシグーゼム３）、さらに１００１１１９の共重合体を
加えて３０分かくはんしたもの（修飾されたコレステロ
ールオキシグーゼム４）について行なった。The same operation was carried out by adding 100 η copolymer and stirring for 30 minutes, then adding 100 η copolymer and stirring for 30 min.
Stir (modified cholesterol oxidase 42), add KIOolv copolymer and stir for 30 minutes (modified cholesterol oxygoosem 3), then add 1001119 copolymer and stir for 30 minutes. (modified cholesterol oxyguzem 4).
得られた４ｓ類の修飾されたコレステロールオ第１４巻
３２８〜３３６ページ（１９６６）に示された方法で未
反応のアミン基を測定することにより、また水を溶媒と
したときの酵素活性をジ（１９７４）に示された方法で
測定した。また、各コレステロールオキシダーゼのベン
ゼン、クロロホルムの１重＃％＠液を調製して溶解性を
調べた。By measuring the unreacted amine groups of the obtained 4s-series modified cholesterol by the method described in Vol. (1974). In addition, a single #% solution of benzene and chloroform of each cholesterol oxidase was prepared to examine the solubility.
以上の結果をまとめて表１に示す。なお、表１ 。The above results are summarized in Table 1. In addition, Table 1.
中の酵素活性は、修飾されていない酵素の活性（１ ｚ
Ｏｐ ｍｏｌ／ ｍｉｎ／■たんばく買）を１００係と
した相対活性で示した。The enzyme activity in is equal to that of the unmodified enzyme (1 z
The relative activity is expressed as Op mol/min/■ Protein purchase) as a factor of 100.
表１よす、コレステロールオキシダーゼは一般た修飾化
物は有機溶媒に溶解するとともに酵素活性を保持するこ
とがわかる。From Table 1, it can be seen that the modified cholesterol oxidase is soluble in organic solvents and retains enzymatic activity.
実施例２（修飾されたコレステロールオキシダーゼの酵
素活性の確認）
表１中ム４で示した修飾されたコレステロールオキシダ
ーゼについて、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム含有１
０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、未修飾の
コレステロールオキシダーゼが存在しないことを確認し
たのち、ベンゼンに溶解してベンゼン中での酵素活性の
確認を行なった。Example 2 (Confirmation of enzyme activity of modified cholesterol oxidase) Regarding the modified cholesterol oxidase shown in column 4 in Table 1, 0.1% sodium dodecyl sulfate containing 1
After confirming the absence of unmodified cholesterol oxidase by 0% polyacrylamide gel electrophoresis, it was dissolved in benzene and the enzyme activity in benzene was confirmed.
微量の水と酸素を含有するベンゼン６ｄにコレ、ｘ、ｆ
ロール１０ ｍＭ ト修飾すｈタコレスチロールオキ
シダーゼ７５μ２を溶解させ、２５℃に保持した。一定
時間経過後、一部を取り出してメタノールを混合して反
応を止め、ウォーターズ６００多溶媒送出装置（ウォー
ターズ社）を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを
行なった。移動層の溶媒としてメタノール−水（９５：
５Ｖ／Ｖ）を用い（流速２．Ｏａ／ ／ ｍｉｎ 、
圧力２９汚／ｍ）、カラム（０，８Ｘ１０ｃｒｎ）はｐ
Ｂｏｎｄ＆ｐａｋ ０１ＢｒａｃＨｃａｌ−ｐａｋ
ｃａｒｔｒｉｇｉ（（ウオーターズ社）を用いた。ま
た、修飾されたコレステロールオキ７ダーゼを加えない
ものについても同様の実験を行なった。This, x, f for benzene 6d containing trace amounts of water and oxygen
75μ2 of 10mM modified cholestyrol oxidase was dissolved and kept at 25°C. After a certain period of time, a portion was taken out and mixed with methanol to stop the reaction, and reversed phase high performance liquid chromatography was performed using a Waters 600 multi-solvent delivery device (Waters Inc.). Methanol-water (95:
5V/V) (flow rate 2.Oa//min,
Pressure 29 dirt/m), column (0.8 x 10 crn) p
Bond&pak 01BracHcal-pak
Cartrigi ((Waters)) was used. Similar experiments were also conducted using one without the addition of modified cholesterol oxidase.
結果を図ＩＫ示す。The results are shown in Figure IK.
図１において、Ａは修飾されたコレステロールオキシダ
ーゼを含有するものであり、Ｂは含有しないものである
。また、ピークのうちａはコレステロール、ｂは５−ア
ンドロステン−３β−オール（標準物質として添加した
もの）、Ｃは４−コンステン−３−オンである。In FIG. 1, A contains modified cholesterol oxidase, and B does not. Further, among the peaks, a is cholesterol, b is 5-androsten-3β-ol (added as a standard substance), and C is 4-consten-3-one.
図１から修飾されたコレステロールオキシダーゼの存在
下、ベンゼン中でコレステロールが酸化されて４−プレ
ステン−３−オンが生成していることがわかる。It can be seen from FIG. 1 that in the presence of modified cholesterol oxidase, cholesterol is oxidized in benzene to produce 4-presten-3-one.
なお、修飾されたコレステロールオキシダーゼの酵素活
性は０，６μｍｏｔ／ ｍａｎ ／ηたんばく賞であっ
た。The enzyme activity of the modified cholesterol oxidase was 0.6 μmot/man/η protein.
実施例３（ステロイド類の定量）
修飾されたコレステロールオキシダーゼと修飾されたペ
ルオキシダーゼを用いてステロイド類の定量をベンゼン
中で行なった。Example 3 (Quantification of steroids) Quantification of steroids was carried out in benzene using modified cholesterol oxidase and modified peroxidase.
なお、修飾されたペルオキシダーゼはＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａ１２１巻第２６１−２６５頁に記載の方法で調製し
、これも有機溶媒に可溶であり、また有機溶媒中で活性
であった。In addition, the modified peroxidase is manufactured by Biochemi
It was prepared by the method described in Vol. CA 121, pages 261-265, and was also soluble in organic solvents and active in organic solvents.
つぎに実験方法の一例を示す。Next, an example of the experimental method will be shown.
ふたつきの石英セル中、コレステロール１９．２ｍＭ、
ｏ−フェニレンジアミン１９．２ｍＭ、修飾されたペル
オキシダーゼ１＆５μ２および修飾されたコレステロー
ルオキシダーゼ１′２．５ｐｆからなるベンゼン溶液の
反応混合＊２−６ｔｄについて、分光光度Ｊｔを用いて
４９０ ｎｍの吸光度を測定して酸化されたＯ−フェニ
レンジアミン（ベンゼン中のモル吸光係数Ｚ ＯＸ １
０−３Ｍ−１ｃｍ” ）を定量シ、コれから酸化された
コレステロールの１を算出した。Cholesterol 19.2mM in a quartz cell with a lid,
For the reaction mixture *2-6td of a benzene solution consisting of 19.2mM o-phenylenediamine, modified peroxidase 1 & 5μ2 and modified cholesterol oxidase 1'2.5pf, the absorbance at 490 nm was measured using spectrophotometry Jt. oxidized O-phenylenediamine (molar extinction coefficient in benzene Z OX 1
The amount of oxidized cholesterol was calculated from this.
コレステロールの濃度を１９．２ｍＭにして修飾サレタ
コレステロールオキシダーゼの量を変えた場合のコレス
テロール酸化速度を図２に、修飾されたコレステロール
オキシダーゼの量を１１５７ｊ１にしてコレステロール
の濃度を変えた場合のコレステロール酸化速度を図３に
示す。Figure 2 shows the rate of cholesterol oxidation when the concentration of cholesterol is 19.2mM and the amount of modified Saleta cholesterol oxidase is changed, and the rate of cholesterol oxidation when the amount of modified cholesterol oxidase is 1157j1 and the concentration of cholesterol is changed. is shown in Figure 3.
この結果から、（多筒されたコレステロールオキシダー
ゼを用いて有機ｍ媒中でコレステロールが定量できるこ
とがわかる。This result shows that cholesterol can be quantified in an organic medium using multi-tubed cholesterol oxidase.
また、コレステロールの代υに他のステロイド類を用い
、前記と同様の実験を行なって修飾されたコレステロー
ルオキシダーゼの活性を測定し、コレステロールに対す
る活性を１００％とした、場合の相対活性を表２に示す
。なお、ステロイド類の濃度は１９．２ｍＭで測定した
。In addition, the activity of the modified cholesterol oxidase was measured by conducting the same experiment as above using other steroids as a substitute for cholesterol, and the relative activity is shown in Table 2, assuming that the activity against cholesterol was 100%. show. Note that the concentration of steroids was measured at 19.2 mM.
表２より、３β−ヒドロキシステロイド類ノコレスチロ
ール、シトステロールおよびフコステロールが容易に酸
化されることがわかる。Table 2 shows that the 3β-hydroxysteroids nocholestyrol, sitosterol, and fucosterol are easily oxidized.
表 ２Table 2
図１はコレステロールがベンゼン中で修飾されたコレス
テロールオキシダーゼにより酸化されることを示す高速
液体クロマドグツムであシ、人は修飾されたコレステロ
ールオキシダーゼを含有し、Ｂは含有しないものである
。ピーク中ａはコレステロール、１）ｉｉ５−７ンドロ
ステンー３β−オール、ｃｌｄ４−プレステン−３−オ
ン−１する。
図２は修飾されたコレステロールオキシダーゼの１によ
るコレステロール酸化速度を示す図、図３はコレステロ
ールのｆｉｌｆＫよるコレステロール酸化速度を示す図
である。
特許出願人 日本油脂株式会社
（法 人番
保 持 時 間 （ｍｉｎ）
図 １
修飾されたコレステロールオキシダーゼ（μｇ）図
２
コレステロール（＋ｎＭ）
図 ３FIG. 1 is a high performance liquid chromatogram showing that cholesterol is oxidized by modified cholesterol oxidase in benzene; humans contain modified cholesterol oxidase and B does not. In the peak, a represents cholesterol, 1) ii5-7 androsten-3β-ol, and cld4-presten-3-one-1. FIG. 2 is a diagram showing the rate of cholesterol oxidation by modified cholesterol oxidase 1, and FIG. 3 is a diagram showing the rate of cholesterol oxidation by filfK of cholesterol. Patent applicant: NOF Corporation (corporate number) Retention time (min) Figure 1 Modified cholesterol oxidase (μg) diagram
2 Cholesterol (+nM) Figure 3
Claims (1)
１）で示されるポリオキシアルキレンアルケニルエーテ
ル−無水マレイン酸共重合体で修飾された レステロールオキシダーゼ。 ▲数式、化学式、表等があります▼……………………（
１） （ただし、Ｘは水素原子またはＣＨ＿３、Ｒは炭素数１
〜４の炭化水素基、ＡＯは炭素数２〜１８のオキアルキ
レン基、ａ＝１〜２、ｎ＝１〜１００、ｐ＝２〜２００
である。） ２、ステロイド類をコレステロールオキシダーゼ、修飾
されたペルオキシダーゼおよびｏ−フェニレンジアミン
を用いて比色定量するに際し、コレステロールオキシダ
ーゼとして請求項１記載の修飾されたコレステロールオ
キシダーゼを用い、有機溶媒中で測定することを特徴と
するステロイド類の定量方法。[Claims] 1. General formula (
1) Losterol oxidase modified with a polyoxyalkylene alkenyl ether-maleic anhydride copolymer. ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼……………………(
1) (However, X is a hydrogen atom or CH_3, R is a carbon number of 1
~4 hydrocarbon group, AO is an oxyalkylene group having 2 to 18 carbon atoms, a = 1 to 2, n = 1 to 100, p = 2 to 200
It is. 2. When colorimetrically quantifying steroids using cholesterol oxidase, modified peroxidase and o-phenylenediamine, the modified cholesterol oxidase according to claim 1 is used as cholesterol oxidase, and the measurement is carried out in an organic solvent. A method for quantifying steroids, characterized by:
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|---|---|---|---|
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