JP2658165B2 - Modified cholesterol oxidase and method for determining steroids using the same - Google Patents
Modified cholesterol oxidase and method for determining steroids using the sameInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は有機溶剤に可溶な修飾されたコレステロール
オキシダーゼに関し、またこの有機溶媒に可溶な性質を
利用した有機溶媒中でのステロイド類、とくに３β−ヒ
ドロキシステロイド類の定量方法に関する。The present invention relates to a modified cholesterol oxidase soluble in an organic solvent, and steroids in an organic solvent utilizing the property of being soluble in the organic solvent. In particular, the present invention relates to a method for quantifying 3β-hydroxysteroids.
コレステロールオキシダーゼはステロイド類に作用し
て過酸化水素を発生させる酵素として知られており、ま
たこの性質を利用してステロイド類の定量に用いられて
いる。Cholesterol oxidase is known as an enzyme that acts on steroids to generate hydrogen peroxide, and is used for quantification of steroids by utilizing this property.
たとえば、コレステロールオキシダーゼをコレステロ
ールに使用させると４−コレステン−３−オンと過酸化
水素を生ずる。この過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下にｏ−フエニレンジアミンなどの酸化されて発色す
る化合物と反応させ、比色定量する方法がある。この方
法は血清中のコレステロールの定量に用いられている
（クリニカル ケミストリー（Clinical Chemistry）第
20巻第470−475頁（1974））。For example, the use of cholesterol oxidase in cholesterol produces 4-cholesten-3-one and hydrogen peroxide. There is a method in which this hydrogen peroxide is reacted with an oxidized color developing compound such as o-phenylenediamine in the presence of peroxidase to perform colorimetric determination. This method has been used for the determination of cholesterol in serum (Clinical Chemistry No.
20, 470-475 (1974).
ところが、コレステロールオキシダーゼは水以外の有
機溶媒には溶解しがたく、血液中のステロイド類の定量
でも特殊な界面活性剤を併用する必要があつて、その操
作は繁雑で熟練を要するものであつた。However, cholesterol oxidase is difficult to dissolve in organic solvents other than water, and it is necessary to use a special surfactant even in the determination of steroids in blood, and the operation is complicated and requires skill. .
ステロイド類は元来水溶性ではなく、有機溶媒には極
めて溶け易い性質があるので、水不溶性の有機溶媒中で
作用できるコレステロールオキシダーゼ変成体が要望さ
れていた。Since steroids are not originally water-soluble and have a property of being very soluble in organic solvents, there has been a demand for a modified cholesterol oxidase that can act in a water-insoluble organic solvent.
この問題を解決すべく、本発明者らは鋭意検討した結
果、特定の構造の共重合体と化学反応させたコレステロ
ールオキシダーゼ、すなわち修飾されたコレステロール
オキシダーゼが水不溶性の有機溶媒によく溶解し、有機
溶媒中でのステロイド類の定量に適していることを見出
し、本発明に到達した。In order to solve this problem, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, cholesterol oxidase chemically reacted with a copolymer having a specific structure, that is, modified cholesterol oxidase is well dissolved in a water-insoluble organic solvent, The present inventors have found that the method is suitable for the determination of steroids in a solvent, and have reached the present invention.
すなわち、本発明は平均分子量3,000〜400,000の一般
式（１）で示されるポリオキシアルキレンアルケニルエ
ーテル−無水マレイン酸共重合体で修飾されたコレステ
ロールオキシダーゼおよび有機溶媒中で修飾されたコレ
ステロールオキシダーゼとステロイド類とを反応させ、
発生した過酸化水素を修飾されたペルオキシダーゼの存
在下にｏ−フエニレンジアミンと反応させたのち、比色
定量することを特徴とするステロイド類の定量方法であ
る。That is, the present invention provides a cholesterol oxidase modified with a polyoxyalkylene alkenyl ether-maleic anhydride copolymer represented by the general formula (1) having an average molecular weight of 3,000 to 400,000, a cholesterol oxidase modified in an organic solvent, and a steroid. And react with
A method for quantifying steroids, comprising reacting generated hydrogen peroxide with o-phenylenediamine in the presence of a modified peroxidase, followed by colorimetry.
（ただし、Ｘは水素原子またはCH3、Ｒは炭素数１〜24
の炭化水素基、AOは炭素数２〜18のオキシアルキレン
基、ａ＝１〜２、ｎ＝１〜100、ｐ＝２〜200である。） 一般式（１）の化合物において、ｎが１〜100に限定
されるのは、ｎが１未満であると、有機溶媒への溶解性
が悪くなり、また100を越えると界面活性が強くなつ
て、水と有機溶媒が共存する系では乳化しやすくなり、
作業性が悪くなるので不都合である。またｐが２〜200
あるいは平均分子量が3,000〜400,000に限定されるの
は、ｐが２未満あるいは平均分子量が3,000に満たない
と有機溶媒への溶解性が悪くなり、またｐが200を越え
たりあるいは平均分子量が400,000を越えると、界面活
性が強くなつて水と有機溶媒とが共存する系では乳化し
やすくなり、作業性が悪くなるので不都合なためであ
る。 (However, X is a hydrogen atom or CH 3 , R is a C 1-24
Is an oxyalkylene group having 2 to 18 carbon atoms, a = 1 to 2, n = 1 to 100, and p = 2 to 200. In the compound of the general formula (1), n is limited to 1 to 100. When n is less than 1, solubility in an organic solvent becomes poor, and when it exceeds 100, surface activity becomes strong. Therefore, it is easy to emulsify in a system where water and an organic solvent coexist,
This is inconvenient because workability deteriorates. Also, p is 2-200
Alternatively, the average molecular weight is limited to 3,000 to 400,000 because if p is less than 2 or the average molecular weight is less than 3,000, the solubility in an organic solvent becomes poor, and p exceeds 200 or the average molecular weight becomes 400,000. If the amount exceeds the above range, the surface activity becomes strong, and emulsification becomes easy in a system in which water and an organic solvent coexist, and workability is deteriorated, which is inconvenient.
ポリオキシアルキレンアルケニルエーテルのアルケニ
ル基としては、アリル基、メタリル基、３−ブテニル
基、２−メチル−３−ブテニル基などがあり、Ｒで示さ
れる炭素数１〜24の炭化水素基としては、メチル基、エ
チル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソ
ブチル基、第三ブチル基、アミル基、イソアミル基、ヘ
キシル基、ヘプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチ
ル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル
基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル
基、イソヘキサデシル基、オクタデシル基、イソオクタ
デシル基、オクチルドデシル基、ドコシル基、デシルテ
トラデシル基、オレイル基、エルシル基、フエニル基、
ペンジル基、クレジル基、ブチルフエニル基、ジプチル
フエニル基、オクチルフエニル基、ノニルフエニル基、
ドデシルフエニル基、ジオクチルフエニル基、ジノニル
フエニル基などがあり、AOで示される炭素数２〜18のオ
キシアルキレン基としては、オキシエチレン基、オキシ
プロピレン基、オキシプチレン基、オキシテトラメチレ
ン基、オキシドデシレン基、オキシテトラデシレン基、
オキシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン基など
がある。Examples of the alkenyl group of the polyoxyalkylene alkenyl ether include an allyl group, a methallyl group, a 3-butenyl group, a 2-methyl-3-butenyl group, and a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms represented by R. Methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, amyl, isoamyl, hexyl, heptyl, 2-ethylhexyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl Group, dodecyl group, isotridecyl group, tetradecyl group, hexadecyl group, isohexadecyl group, octadecyl group, isooctadecyl group, octyldodecyl group, docosyl group, decyltetradecyl group, oleyl group, ersyl group, phenyl group,
Pendyl group, cresyl group, butylphenyl group, dibutyl phenyl group, octylphenyl group, nonylphenyl group,
There are a dodecylphenyl group, a dioctylphenyl group, a dinonylphenyl group, and the like.Examples of the oxyalkylene group having 2 to 18 carbon atoms represented by AO include an oxyethylene group, an oxypropylene group, an oxybutylene group, an oxytetramethylene group, and an oxydemethylene group. Silene group, oxytetradecylene group,
Examples include an oxyhexadecylene group and an oxyoctadecylene group.
また、AOは２種以上の混合物であつてもよく、この場
合はブロツク状に付加していてもランダム状に付加して
いてもよい。AO may be a mixture of two or more kinds, and in this case, it may be added in a block shape or in a random shape.
本発明に使用するポリオキシアルキレンアルケニルエ
ーテル−無水マレイン酸共重合体は通常のラジカル重合
反応によつて得られ、たとえば特公昭45−31950号公報
に示された方法によつて容易に得ることができる。The polyoxyalkylene alkenyl ether-maleic anhydride copolymer used in the present invention can be obtained by a usual radical polymerization reaction, and can be easily obtained, for example, by the method disclosed in JP-B-45-31950. it can.
この共重合体とコレステロールオキシダーゼは水溶液
中で溶液のpHを７〜10、好ましくは８〜９に調節するこ
とにより、共重合体の酸無水物部分とコレステロールオ
キシダーゼのアミノ基とが反応するので容易に得ること
ができる。The copolymer and cholesterol oxidase can be easily prepared by adjusting the pH of the solution in an aqueous solution to 7 to 10, preferably 8 to 9, since the acid anhydride portion of the copolymer and the amino group of cholesterol oxidase react. Can be obtained.
ステロイド類の定量に用いる修飾されたペルオキシダ
ーゼは有機溶媒に可溶なものであればいかなるものでも
よく、たとえばポリエチレングリコールで修飾されたも
の（バイオケミカル アンド バイオフイジカル リサ
ーチ コミユニケーシヨンズ（Biochemical and Biophi
ca1 Research Communications）第121巻第261−265頁
（1984））や本発明で用いる一般式（１）の共重合体で
修飾されたものなどがある。The modified peroxidase used for the quantification of steroids may be any as long as it is soluble in an organic solvent, for example, those modified with polyethylene glycol (Biochemical and Biophysical Research Commiunications (Biochemical and Biophid).
ca1 Research Communications, Vol. 121, pp. 261-265 (1984)) and those modified with a copolymer of the general formula (1) used in the present invention.
ステロイド類の定量は、水に不溶の有機溶媒、たとえ
ばベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロ
ロホルム、四塩化炭素、トリクロルエタン、トリクロル
エチレン等を用いて行なうことができる。The quantification of steroids can be performed using an organic solvent insoluble in water, for example, benzene, toluene, xylene, methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, trichloroethane, trichloroethylene and the like.
これらの有機溶媒中で、ステロール類、修飾されたコ
レステロールオキシダーゼ、修飾されたペルオキシダー
ゼおよびｏ−フエニレンジアミンを室温で混合し、一定
時間経過後に490nmの酸化されたｏ−フエニレンジアミ
ンの吸光度を測定すると、酸化されたステロール類の量
が決定される。In these organic solvents, sterols, modified cholesterol oxidase, modified peroxidase and o-phenylenediamine are mixed at room temperature, and after a certain period of time, the absorbance of oxidized o-phenylenediamine at 490 nm is measured. Then, the amount of oxidized sterols is determined.
本発明はコレステロールオキシダーゼを平均分子量3,
000〜400,000のポリオキシアルキレンアルケニルエーテ
ル−無水マレイン酸共重合体と化学縮合させて修飾した
ことにより、有機溶媒中でも活性を示す修飾されたコレ
ステロールオキシダーゼである。また、この修飾された
コレステロールオキシダーゼ、修飾されたペルオキシダ
ーゼおよびｏ−フエニレンジアミンを用いることによ
り、有機溶媒中でステロイド類の定量が容易かつ正確に
行なえる。The present invention provides cholesterol oxidase with an average molecular weight of 3,
It is a modified cholesterol oxidase that is active in organic solvents by being chemically condensed with 000 to 400,000 polyoxyalkylene alkenyl ether-maleic anhydride copolymers and modified. In addition, by using the modified cholesterol oxidase, modified peroxidase and o-phenylenediamine, quantification of steroids can be easily and accurately performed in an organic solvent.
以下に実施例を記載する。 Examples will be described below.
実施例１（修飾されたコレステロールオキシダーゼの製
造） 20mgのノカルデイア属由来のコレステロールオキシダ
ーゼ（EC 1.1.3.6）オリエンタル酵母（株）製を含む
0.2モルホウ酸緩衝液（pH8.5）4mlに、100mgのポリオキ
シエチレン（33モル）メチルアリルジエーテル−無水マ
レイン酸共重合体（平均分子量13,000）を加え、25℃で
30分かくはんしたのち、０℃に冷却した100mlのリン酸
緩衝液（pH7.0）を加えて反応を停止した。ダイアフロ
ー・メンプランＡ−50T（ウスバツクサービス社製）を
用いた限外過により反応混合物から未反応の共重合体
を除去し、水による透析と凍結乾燥を行つて修飾された
コレステロールオキシダーゼ（No.1）90mgを得た。Example 1 (Production of Modified Cholesterol Oxidase) 20 mg of Nocardia cholesterol oxidase (EC 1.1.3.6) containing Oriental Yeast Co., Ltd.
100 mg of polyoxyethylene (33 mol) methylallyl diether-maleic anhydride copolymer (average molecular weight: 13,000) was added to 4 ml of 0.2 morphic borate buffer (pH 8.5).
After stirring for 30 minutes, the reaction was stopped by adding 100 ml of phosphate buffer (pH 7.0) cooled to 0 ° C. The unreacted copolymer was removed from the reaction mixture by ultrafiltration using Diaflow Memplan A-50T (manufactured by Usbak Service Co., Ltd.), and the modified cholesterol oxidase (dialysis with water and lyophilization were performed). No. 1) 90 mg was obtained.
同様の操作を、100mgの共重合体を加えて30分かくは
んしたのち、さらに100mgの共重合体を加えて30分かく
はんしたもの（修飾されたコレステロールオキシダーゼ
No.2）、さらに100mgの共重合体を加えて30分かくはん
したもの（修飾されたコレステロールオキシダーゼNo.
3）、さらに100mgの共重合体を加えて30分かくはんした
もの（修飾されたコレステロールオキシダーゼNo.4）に
ついて行なつた。The same procedure was followed by adding 100 mg of the copolymer and stirring for 30 minutes, and then adding 100 mg of the copolymer and stirring for 30 minutes (modified cholesterol oxidase).
No. 2), and further added 100 mg of the copolymer and stirred for 30 minutes (modified cholesterol oxidase No. 2).
3) The reaction was further carried out for the mixture (modified cholesterol oxidase No. 4), which was further added with 100 mg of the copolymer and stirred for 30 minutes.
得られた４種類の修飾されたコレステロールオキシダ
ーゼの修飾化率をアナリテイカル バイオケミストリー
（Analitical Biochemistry）第14巻328〜336ページ（1
966）に示された方法で未反応のアミノ基を測定するこ
とにより、また水を溶媒としたときの酵素活性をクリニ
カル ケミストリー（Clinical Chemistry）第20巻470
〜475ページ（1974）に示された方法で測定した。ま
た、各コレステロールオキシダーゼのベンゼン、クロロ
ホルムの１重量％溶液を調製して溶解性を調べた。The modification rates of the obtained four types of modified cholesterol oxidases were determined by Analytical Biochemistry, Vol. 14, pp. 328-336 (1).
966) by measuring the unreacted amino group and measuring the enzyme activity when using water as a solvent. Clinical Chemistry, Vol. 20, 470
475 475 (1974). Further, a 1% by weight solution of each cholesterol oxidase in benzene and chloroform was prepared and the solubility was examined.
以上の結果をまとめて表１に示す。なお、表１中の酵
素活性は、修飾されていない酵素の活性（12.0μ mol/m
in/mgたんぱく質）を100％とした相対活性で示した。Table 1 summarizes the above results. The enzyme activity in Table 1 is the activity of the unmodified enzyme (12.0 μmol / m
(in / mg protein) as 100%.
表１より、コレステロールオキシダーゼは一般式
（１）で示されるポリオキシアルキレンアルケニルエー
テル−無水マレイン酸共重合体に修飾され、また修飾化
物は有機溶媒に溶解するとともに酵素活性を保持するこ
とがわかる。Table 1 shows that cholesterol oxidase is modified to a polyoxyalkylene alkenyl ether-maleic anhydride copolymer represented by the general formula (1), and that the modified product dissolves in an organic solvent and retains the enzyme activity.
実施例２（修飾されたコレステロールオキシダーゼの酵
素活性の確認） 表１中No.4で示した修飾されたコレステロールオキシ
ダーゼについて、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム含有10
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、未修飾のコ
レステロールオキシダーゼが存在しないことを確認した
のち、ベンゼンに溶解してベンゼン中での酵素活性の確
認を行なつた。 Example 2 (Confirmation of Enzyme Activity of Modified Cholesterol Oxidase) For the modified cholesterol oxidase shown in No. 4 in Table 1, 10% sodium dodecyl sulfate containing 10%
After confirming the absence of unmodified cholesterol oxidase by% polyacrylamide gel electrophoresis, it was dissolved in benzene and the enzymatic activity in benzene was confirmed.
微量の水と酸素を含有するベンゼン6mlにコレステロ
ール10mMと修飾されたコレステロールオキシダーゼ75μ
ｇを溶解させ、25℃に保持した。一定時間経過後、一部
を取り出してメタノールを混合して反応を止め、ウオー
ターズ600多溶媒送出装置（ウオーターズ社）を用いて
逆相高速液体クロマトグラフイーを行なつた。移動層の
溶媒としてメタノール−水（95:5V/V）を用い（流速20m
l/min、圧力29kg/cm2）、カラム（0.8×10cm）はμ Bon
dapak C18 radical−pak cartrige（ウオーターズ社）
を用いた。また、修飾されたコレステロールオキシダー
ゼを加えないものについても同様の実験を行なつた。Cholesterol oxidase 75μ modified with 10mM cholesterol in 6ml of benzene containing trace amounts of water and oxygen
g was dissolved and kept at 25 ° C. After a certain period of time, a portion was taken out and mixed with methanol to stop the reaction, and reversed-phase high-performance liquid chromatography was performed using a Waters 600 multi-solvent delivery device (Waters). Methanol-water (95: 5 V / V) was used as a solvent for the moving bed (flow rate 20 m
l / min, pressure 29kg / cm 2 ), column (0.8 × 10cm) is μ Bon
dapak C 18 radical-pak cartrige (Waters)
Was used. Further, the same experiment was carried out for the case where the modified cholesterol oxidase was not added.
結果を図１に示す。 The results are shown in FIG.
図１において、Ａは修飾されたコレステロールオキシ
ダーゼを含有するものであり、Ｂは含有しないものであ
る。まら、ピークのうちａはコレステロール、ｂは５−
アンドロステン−３β−オール（標準物質として添加し
たもの）、Ｃは４−コレステン−３−オンである。In FIG. 1, A contains a modified cholesterol oxidase, and B does not. Of the peaks, a is cholesterol and b is 5-
Androsten-3β-ol (added as a standard), C is 4-cholesten-3-one.
図１から修飾されたコレステロールオキシダーゼの存
在下、ベンゼン中でコレステロールが酸化されて４−コ
レステン−３−オンが生成していることがわかる。FIG. 1 shows that cholesterol was oxidized in benzene in the presence of the modified cholesterol oxidase to produce 4-cholesten-3-one.
なお、修飾されたコレステロールオキシダーゼの酵素
活性は0.6μ mol/min/mgたんぱく質であつた。In addition, the enzyme activity of the modified cholesterol oxidase was 0.6 μmol / min / mg protein.
実施例３（ステロイド類の定量） 修飾されたコレステロールオキシダーゼと修飾された
ペルオキシダーゼを用いてステロイド類の定量をベンゼ
ン中で行なつた。Example 3 (Quantification of steroids) Steroids were quantified in benzene using modified cholesterol oxidase and modified peroxidase.
なお、修飾されたペルオキシダーゼはバイオケミカル
アンド バイオフイジカル リサーチ コミユニケー
シヨンズ（Biochemical and Biophysica1 Research Com
munications）第121巻第261−265頁に記載の方法で調製
し、これも有機溶媒に可溶であり、また有機溶媒中で活
性であつた。In addition, the modified peroxidase is used for Biochemical and Biophysical Research Comi-Unices.
munications, Vol. 121, pp. 261-265, which was also soluble and active in organic solvents.
つぎに実験方法の一例を示す。 Next, an example of the experimental method will be described.
ふたつきの石英セル中、コレステロール19.2mM、ｏ−
フエニレンジアミン19.2mM、修飾されたペルオシダーゼ
18.5μｇ、および表１中No.4で示した修飾されたコレス
テロールオキシダーゼ12.5μｇからなるベンゼン溶液の
反応混合物2.6mlについて、分光光度計を用いて490nmの
吸光度を測定して酸化されたｏ−フエニレンジアミン
（ベンゼン中のモル吸光係数2.0×103M-1cm-1）を定量
し、これから酸化されたコレステロールの量を算出し
た。In a quartz cell with a lid, cholesterol 19.2 mM, o-
Phenylenediamine 19.2 mM, modified perosidase
For a reaction mixture of 2.6 ml of a benzene solution consisting of 18.5 μg and 12.5 μg of the modified cholesterol oxidase shown in No. 4 in Table 1, the absorbance at 490 nm was measured using a spectrophotometer to oxidize o-fe Nilendiamine (molar extinction coefficient in benzene 2.0 × 10 3 M −1 cm −1 ) was quantified, and the amount of oxidized cholesterol was calculated from this.
コレステロールの濃度を19.2mMにして修飾されたコレ
ステロールオキシダーゼの量を変えた場合のコレステロ
ール酸化速度を図２に、修飾されたコレステロールオキ
シダーゼの量を12.5μｇにしてコレステロールの濃度を
変えた場合のコレステロール酸化速度を図３に示す。Figure 2 shows the cholesterol oxidation rate when the cholesterol concentration was changed to 19.2 mM and the amount of modified cholesterol oxidase was changed, and cholesterol oxidation when the amount of modified cholesterol oxidase was changed to 12.5 μg and the concentration of cholesterol was changed. The speed is shown in FIG.
この結果から、修飾されたコレステロールオキシダー
ゼを用いて有機溶媒中でコレステロールが定量できるこ
とがわかる。This result indicates that cholesterol can be quantified in an organic solvent using the modified cholesterol oxidase.
また、コレステロールの代りに他のステロイド類を用
い、前記と同様の実験を行なつて修飾されたコレステロ
ールオキシダーゼの活性を測定し、コレステロールに対
する活性を100％とした場合の相対活性を表２に示す。
なお、ステロイド類の濃度は19.2mMで測定した。Further, the same experiment as above was carried out using other steroids in place of cholesterol, and the activity of the modified cholesterol oxidase was measured. The relative activity when the activity on cholesterol was 100% is shown in Table 2. .
The steroid concentration was measured at 19.2 mM.
表２より、３β−ヒドロキシステロイド類のコレステ
ロール、シトステロールおよびフコステロールが容易に
酸化させることがわかる。Table 2 shows that cholesterol, sitosterol and fucosterol of the 3β-hydroxysteroids are easily oxidized.
【図面の簡単な説明】 図１はコレステロールがベンゼン中で修飾されたコレス
テロールオキシダーゼにより酸化されることを示す高速
液体クロマトグラムであり、Ａは修飾されたコレステロ
ールオキシダーゼを含有し、Ｂは含有しないものであ
る。ピーク中ａはコレステロール、ｂは５−アンドロス
テン−３β−オール、ｃは４−コレステン−３−オンで
ある。 図２は修飾されたコレステロールオキシダーゼの量によ
るコレステロール酸化速度を示す図、図３はコレステロ
ールの濃度によるコレステロール酸化速度を示す図であ
る。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a high performance liquid chromatogram showing that cholesterol is oxidized by modified cholesterol oxidase in benzene, where A contains modified cholesterol oxidase and B does not. It is. In the peak, a is cholesterol, b is 5-androstene-3β-ol, and c is 4-cholesten-3-one. FIG. 2 is a graph showing the cholesterol oxidation rate depending on the amount of the modified cholesterol oxidase, and FIG. 3 is a graph showing the cholesterol oxidation rate depending on the cholesterol concentration.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小寺 洋 東京都中野区弥生町５―５―22 (72)発明者 松島 瑞子 埼玉県浦和市辻２―20―31 (72)発明者 斎藤 佑尚 神奈川県横須賀市若松町１―８ 審査官 新見 浩一 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (72) Inventor Hiroshi Kodera 5-5-22 Yayoi-cho, Nakano-ku, Tokyo (72) Inventor Mizuko Matsushima 2-20-31 Tsuji, Urawa-shi, Saitama 1-8 Wakamatsucho, Yokosuka City, Kanagawa Prefecture Examiner Koichi Niimi
Claims (2)
で示されるポリオキシアルキレンアルケニルエーテル−
無水マレイン酸共重合体で修飾されたコレステロールオ
キシダーゼ。 （ただし、Ｘは水素原子またはCH3、Ｒは炭素数１〜24
の炭化水素基、AOは炭素数２〜18のオキシアルキレン
基、ａ＝１〜２、ｎ＝１〜100、ｐ＝２〜200である。）1. A compound represented by the general formula (1) having an average molecular weight of 3,000 to 400,000.
Polyoxyalkylene alkenyl ether represented by-
Cholesterol oxidase modified with a maleic anhydride copolymer. (However, X is a hydrogen atom or CH 3 , R is a C 1-24
Is an oxyalkylene group having 2 to 18 carbon atoms, a = 1 to 2, n = 1 to 100, and p = 2 to 200. )
ゼ、修飾されたペルオキシダーゼおよびｏ−フエニレン
ジアミンを用いて比色定量するに際し、コレステロール
オキシダーゼとして請求項１記載の修飾されたコレステ
ロールオキシダーゼを用い、有機溶媒中で測定すること
を特徴とするステロイド類の定量方法。(2) When the steroids are colorimetrically determined using cholesterol oxidase, modified peroxidase and o-phenylenediamine, the modified cholesterol oxidase according to claim 1 is used as cholesterol oxidase in an organic solvent. A method for quantifying steroids, characterized by measuring.
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