JPH01266838A - ビーズの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチンを用い
た、ビーズの製法に関する。

〔従来の技術〕

従来、コラーゲンおよび／またはゼラチンからなるビー
ズが、細胞培養の支持基質、生体材料（たとえば、医用
生体材料など）、生物活性物質の担体などに用いられて
いる。このようなコラーゲンビーズの製法がいくつか提
案されている。

たとえば、特開昭５５−４７１３０号公報では、水と混
和しにくい有機溶媒（以下、「ｌｉ混和性有機溶媒」と
記す）にコラーゲン水溶液を滴下したり、あるいは、前
記有機溶媒中にコラーゲン水溶液を乳化したりしてコラ
ーゲン水溶液を球状とし、ついで、この球状コラーゲン
水溶液中のコラーゲンを架橋させることによりコラーゲ
ンビーズを得るという方法が提案されている。

また、特開昭６０−１７４７２５号公報では、コラーゲ
ン水溶液を難混和性有機溶媒中に多数の小滴として分散
させて乳化し、前記小滴を固化させることにより、コラ
ーゲンビーズを製造するという方法が提案されている。

得られたコラーゲンビーズを、大量培養する動物細胞の
支持基質に用いている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の製法では、コラーゲン水溶液を粒状とするために
、難混和性を機溶媒を使用している。従って、コラーゲ
ンを架橋させて形状を保持させてから、この有機溶媒を
除去する必要がある。ところが、この有機溶媒は、水だ
けで除去することができないという問題点がある。

ｎ混和性有機溶媒を、水と混和する有機溶媒（以下、「
混和性有機溶媒」と記す）で洗浄除去し、さらに、水ま
たは水溶液でこの混和性有機溶媒を洗浄除去している。

このため、洗浄に非常に手間がかかる。

しかも、上記コラーゲンビーズは、水分を多く含んだゲ
ル状であるので、柔らかく、洗浄中に壊れたり、潰れた
りする。このため、天皇に製造することが困難であった
。

そこで、この発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチ
ンを用い、有機溶媒を用いることなく、潰れたり壊れた
りしにくいビーズを製造できる方法を提供することを第
１の課題とする。

さらに、この発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチ
ンが流出しにくいビーズを製造できる方法を提供するこ
とを第２の課題とする。

さらに、この発明は、第１および第２の課題を解決し、
しかも、コラーゲンおよび／またはゼラチンからなるビ
ーズを製造できる方法を提供することを第３の課題とす
る。

〔課題を解決するための手段〕

請求項１，２および３の各発明にかかるビーズの製法は
、ビーズ形成剤、および、金属イオンと結合して水に不
溶性のゲルを形成する多糖類を含むビーズ形成剤水溶液
を、金属イオン水溶液に対して滴下することにより成形
して粒状のビーズ形成剤水溶液を得ると同時に、多糖類
をゲル化することにより粒状のビーズ形成剤水溶液を固
化させるようにしている。

請求項２および３の各発明にかかるビーズの調法は、以
上に加えて、さらに、多糖類のゲル化後にビーズ形成剤
を架橋させるようにしている。

請求項３の発明にかかるビーズの製法は、以上に加えて
、さらに、架橋後に、多糖類のゲル化物を除去するよう
にしている。

〔作　　　用〕

ビーズ形成剤水溶液を滴下することにより粒状に成形し
、金属イオン水溶液で多糖類をゲル化させることにより
粒状のビーズ形成剤水溶液を固化させるので、有ｕＭ４
媒を全（使用することなく、ビーズが得られる。このた
め、水または水溶液で洗浄できる。しかも、ビーズは、
多糖類のゲル化物を含んでいるので、強固であり、壊れ
にくく、潰れにくい。前記固化は、非常に短い時間、い
わゆる瞬時に生じさせることができる。

ビーズ形成剤を架橋することにより、ビーズ形成剤の拡
散による流出が防がれる。

ビーズ形成剤を架橋した後、多糖類のゲル化１！りを除
去することにより、コラーゲンおよび／またはゼラチン
からなるビーズが容易に得られる。

〔実　施　例〕

この発明では、コラーゲンおよびゼラチンの少なくとも
一方からなるビーズ形成剤、および、多ｔＳ類を含むビ
ーズ形成剤水溶液を使用する。

この発明に用いるコラーゲンの種類は特に限定されず、
種々のものが利用可能である。コラーゲンは、動物の体
の至る所に存在する繊維性の蛋白質であり、動物細胞の
培養用支持基質、生体材料、生物活性物質やＤＤＳなど
の担体などに用いるのに通している。

この発明に用いるゼラチンの種類も特に限定されず、種
々のものが利用可能である。ゼラチンは、コラーゲンか
ら誘導される蛋白質であり、コラーゲン同様に上記のよ
うな用途に適している。

この発明では、コラーゲンおよび／またはゼラチンとし
て、どのようなものでも使用可能である。これは、ビー
ズ形成剤水溶液が、多糖類のゲル化により非常に短い時
間で固化するので、コラーゲンおよび／またはゼラチン
の物性についての制限がほとんどなく、しかも、その固
化物の硬さなどは多糖類のゲルに依存しているからであ
る。

この発明で用いる多糖類は、ゲル化することにより、強
固なゲル化物を作ることができるものであれば、特に限
定はない。たとえば、アルギン酸、アルギン酸塩くたと
えば、アルギン酸ナトリウムなど）、ジュランガム、ペ
クチン、カラギーナンなどが挙げられる。

金属イオン水溶液は、前記多糖類をゲル化させるもので
あり、前記多糖類に応じて適宜選択して用いられる。た
とえば、多糖類として、アルギン酸、アルギン酸塩、ジ
ュランガム、ペクチンなどのうち１つまたは２つ以上が
用いられた場合、２価の金属イオン溶液が好ましく用い
られる。この２（ｉｌｌｉの金属イオン溶液としては、
たとえば、塩化カルシウム水溶液、塩化バリウム水溶液
などが挙げられる。また、多糖類として、カラギーナン
、ジュランガムなどのうち１つまたは２つ以上が用いら
れた場合、１価の金属イオン、たとえば、塩化カリウム
水溶液が好ましく用いられる。

前記ビーズ形成剤水溶液を前記金属イオン水溶液に対し
て滴下することにより成形およびゲル化を行い、粒状の
ビーズを得る。

前記ビーズ形成剤水溶液中の多糖類の濃度は、特に限定
はなく、金属イオンと結合してゲルが形成できる１度で
あればよい。たとえば、アルギン酸ナトリウムの場合、
金属イオン水溶液中の金属イオン、たとえば、カルシウ
ムイオンの濃度にも依存するが、約０．２重量％以上で
あるのが好ましく、０．５〜３重量％の範囲がより好ま
しい。これよりも高濃度であると、ビーズ形成剤水溶液
の粘度が高くなり、均一な量での滴下が困難となること
がある。

また、ビーズ形成剤の濃度も特に限定はなく、滴下がス
ムースに行われる溶液が得られる濃度以下であればよい
。ビーズ形成剤の濃度があまり低いと、当然のことなが
ら、多糖類を除去した後のビーズが微小となる。たとえ
ば、コラーゲンを単独で用い、ゼラチンを用いない場合
、ビーズ形成剤水溶液のコラーゲン濃度は０．１〜５．
０重量％の範囲が好ましい。

ビーズ形成剤と多糖類との比は、多糖類を除去した場合
に得られる、コラーゲンおよび／またはゼラチンのビー
ズの密度に関係する。すなわち、ビーズ形成剤／多糖類
の比が大きいほど、多糖類除去後に得られるビーズの密
度が高く、従ってビーズの強度が強くなる。得られるビ
ーズの必要な特性に応じてビーズ形成剤と多糖類との比
を適宜選ぶことができる。

金泥イオン水溶液に含有させる金属イオンは、使用する
多糖類に応じて決めればよい。たとえば、アルギン酸ナ
トリウムを使用する場合、カルシウムイオンが適当であ
り、塩化カルシウム、硫酸カルシウムなどの水溶液を用
いることができる。

この場合、一般にカルシウムイオン濃度が高い程、ゲル
化速度も早く、強いゲルが得られる。たとえば、塩化カ
ルシウムの場合、０．５〜３重量％水溶液が好ましい。

これよりも低い濃度だと、ゲル化が遅くなることがあり
、高い濃度だと、カルシウムイオンが過剰となるだけで
効果が上がらず、むだである。

金属イオン水溶液の温度は、コラーゲンを用いる場合、
その熱変性を避けるため、たとえば、１５℃以下で行う
のが好ましい。

ビーズ形成剤水溶液の滴下方法は、特に限定はなく、た
とえば、注射針や細管から滴下すればよい。得られるビ
ーズの粒径は、使用するビーズ形成剤水溶液中のビーズ
形成剤および多糖類の濃度にも関係するが、主に滴下す
る注射針や細管の径を変えることにより自由に設定する
ことができる。たとえば、コラーゲンを０．５［ｔ％、
アルギン酸ナトリウム１重量％を含むビーズ形成剤水／
８液を用いて、１重量％塩化カルシウム水溶液中に滴下
する場合、外径１１１１１の注射針を用いたときに得ら
れるビーズの平均径は約３朋であり、外径５１１の細管
では約９１璽である。

ビーズ形成剤水溶液は、金属イオン水溶液に対して滴下
されることによって粒状に成形されると同時に、その中
に含まれる多糖類が金属イオンと結合しゲル化すること
によって固化する。この固化物は、多糖類のゲル化物が
３次元的な網目状に分布していて、それらの間にビーズ
形成剤が存在している。このため、コラーゲンやゼラチ
ンがゲル化してなるビーズよりも強度が高く、潰れたり
壊れたりしにくくなっており、取り扱いが極めて容易で
ある。これに対して、有機溶媒中で成形して架橋する成
形法だと、固化に時間がかかり、ビーズが柔らかく、取
り扱いにくいのである。しかも、洗浄に手間がかかる。

上記のようにして得られたビーズ中のビーズ形成剤を架
橋させてもよい。架橋によってビーズ中からのビーズ形
成剤の拡散による流出を防ぐことができる。

ビーズ形成後のコラーゲンおよび／またはゼラチンの架
橋は、たとえば、架橋剤を用いたり、放射線、紫外線な
どを照射したりすることにより行われる。架橋剤として
は、たとえば、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭ
Ｄ　Ｉ　Ｃ）　、ゲルタールアルデヒド、ホルムアルデ
ヒドなどのアルデヒド類などが用いられる。前記放射線
としては、Ｘ線、Ｔ線などが用いられる。

上記のようにビーズ形成剤を架橋させたビーズは、架橋
したビーズ形成剤が３次元的に強固に結合している。そ
こで、多糖類のゲル化物を除去すれば、得られたビーズ
は、コラーゲンのみ、ゼラチンのみ、または、コラーゲ
ンおよびゼラチンのみの架橋体からなっているので、生
体親和性が良く、細胞接着性が良好である。このため、
動物細胞の大量培養に細胞の支持基質などとして用いる
のに好都合である。

多糖類のゲル化物の除去は、たとえば、そのゲル化物が
多糖類と２価の金属イオンとの結合により形成されてい
る場合には、キレート試薬を用いて水溶液で処理し、該
多ｔＦＪＩを溶解除去することにより行える。キレート
試薬としては、たとえば、ＥＤＴＡなどが用いられる。

なお、多糖類のゲル化物の除去方法は、これに限定され
ない。

この除去により、コラーゲンおよび／またはゼラチンか
らなるビーズが得られる。このビーズは、濡れたまま、
あるいは、乾燥させて、利用することができる。乾燥は
、たとえば、凍結乾燥により行われるが、これに限定さ
れない。

この発明の製法により得られたビーズは、必要に応じて
、水および／または水溶液で洗浄したり、滅菌したりし
て利用することができる。この発明の製法では、有ａ　
？６媒を用いる必要が全くないので、洗浄は水および／
または水溶液で行うことができる。しかも、ビーズ形成
剤水溶液を金属イオン水溶液に滴下することにより、成
形や固化を行うことができるので、操作が筒車であり、
しかも、非常に短い時間で行うことが可能である。

得られたビーズの用途は、たとえば、動物細胞を大量培
養するための支持基質、医用生体材料などの生体材料、
生物活性物質やＤＤＳ　（ドラッグプリハリ−システム
。いわゆる、徐放剤もこの中に含まれる）などの担体な
どが挙げられる。担体とする場合には、たとえば、生物
活性ｖＩＪ質その他の薬剤などを予めビーズ形成剤溶液
に含ませておき、ビーズを形成する。

以下に、より具体的な実施例および比較例を示すが、こ
の発明は下記実施例に限定されない・一実施例１− 酵素可溶化コラーゲン水溶液（ｐＨ３，０、濃度１゜０
重量％）をｐＨ７，０に調整し、よく攪拌し、コラーゲ
ン線維分散液を得た。次にアルギン酸ナトリウムを水に
溶解し、濃度２．０重量％、　ｐ）１７．４の溶液とし
、これをコラーゲン液と容量比１：１で混合し、アルギ
ン酸−コラーゲン混合？容ン夜とした。

これを注射筒容器に入れ、外側直径１１１の注射針から
１５℃の１％塩化カルシウム（２水塩）水溶液に滴下し
て、球状のビーズを形成した。２０分間放置後、ナイロ
ンメソシュで濾過してビーズを集め１５℃の水で充分に
洗浄した。得られたコラーゲン−アルギン酸より成るビ
ーズは直径約３菖重の均一なビーズで、非常に固い強度
をもっており、取扱いが極めて容易であった。

一実施例２一 実施例１で得たビーズを０．５％グルタールアルデヒド
水溶液（ｐＨ８，０）に加え、時々攪拌しながら２０℃
で１０時間処理を行い、その後充分に水洗を行った。

一実施例３一 実施例２で架橋処理したビーズを１％−ＥＤＴＡ水溶液
（ｐｔ（７，４）に移し２０″Ｃで２４時間ゆるやかに
攪拌した。ビーズ中のアルギン酸が溶解、除去され、コ
ラーゲンのみからなるビーズが得られた。その後、充分
に水で洗浄して直径３ｍｌのコラーゲンビーズが得られ
た。このコラーゲンビーズは、充分に満足のできる物理
的性質を持つものであった。

一実施例４一 実施例１においてコラーゲン線維分散液のかわりに３．
０重量％ゼラチン溶液（ｐｌｆ７．０）を用い、実施例
１と同様に処理して固いゼラチン−アルギン酸ビーズ（
直径約３１１）が得られた。但し、滴下溶液は４０°Ｃ
に保温し塩化カルシウム水溶液の温度は室温とした。

一実施例５一 実施例４で得られたゼラチン−アルギン酸ビーズを実施
例２と同様に処理する事によって架橋した。

一実施例６一 実施例５で得られた架橋したビーズを実施例３と同様に
処理することによって、直径約３ｍｌのゼラチンのみか
らなるビーズが得られた。このビーズも、充分な物理的
性質を持っていた。

一実施例７一 実施例１におけるコラーゲン線維分散液の代わりに、コ
ラーゲン線維分散液（ｐＨ７，０、濃度１．５重量％）
とゼラチン水溶液（ｐｌｆ　７．　Ｏ、？Ｈ度０，５重
量％）を容量比１：１に混合したものを用い、同様に処
理して、コラーゲン−ゼラチン−アルギン酸より成る固
いビーズを得た。

一実施例８一 実施例７で得たビーズを実施例２と同様に処理すること
によって架橋した。

一実施例９一 実施例８で得た架橋したビーズを実施例３と同様に処理
してコラーゲン−ゼラチンビーズを得た一実施例１０− アルカリ可溶化コラーゲン水溶液（ｐｌｆ８．０　、　
濃度１．０重量％）とジュランガム水溶液（ｐｌｆ７．
４　。

濃度２重量％）を容量比１：１に混合したものを用い、
ステンレス裂の内径３嘗菖の細管から１５℃の１％塩化
カルシウム水溶液に滴下して、後は、実施例１と同様に
行い、直径約８１１の固いコラーゲン−ジュランガムビ
ーズを得た。

一実施例１１一 実施例１０で得たビーズを実施例２と同様に処理するこ
とによって架橋した。

一実施例１２一 実施例１１で得た架橋したビーズを実施例３と同様に処
理してコラーゲンビーズを得た。

一実施例１３一 実施例１０において、ジュランガム水溶液の代わりにペ
クチン水溶液（ｐｌ＋　７．４、濃度２．０重量％）を
用い、外側直径１龍の注射針から１５℃の１％塩化カル
シウム水溶液に滴下して直径約３　ａｍの固いコラーゲ
ン−ペクチンビーズを得た。

一実施例１４一 実施例Ｉ３で得たビーズを実施例２と同様に処理するこ
とによって架橋した。

一実施例１５一 実施例１３で得た架橋したビーズを実施例３と同様に処
理してコラーゲンビーズを得た。

−比較例１− 酸可溶性コラーゲン８容蛍、リン酸緩衝液（０゜１Ｍ、
１．４Ｍ−ＮａＣ１）ｌ容Ｆｉｔ、０．０５Ｎ−ＮａＯ
Ｈ溶液１容量を、４°Ｃ下で混合し、注射筒容器に入れ
て、外側直径１ｍの注射針から、３７°Ｃに保温した１
０＋ｎＭのリン酸援衝水溶液に滴下した。コラーゲンが
ゲル化する前に水溶液中に拡散してしまい、その結果、
粒状のビーズを得ることはできなかった。

〔発明の効果〕

請求項１．２および３の各発明にかかるビーズの製法は
、打機）容器を用いることなく、潰れたり壊れたりしに
くいビーズを製造できる。

請求項２および３の各発明にかかるビーズの製法は、さ
らに、架橋していることにより、ビーズ形成剤がビーズ
から拡散して流出するのを防ぐことができる。

請求項３の発明にかかるビーズの製法は、さらに、ビー
ズ形成剤からなるビーズを得ることができる。

代理人　弁理士　　松　本　武　彦

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　コラーゲンおよびゼラチンの少なくとも一方からな
   るビーズ形成剤を含むビーズ形成剤水溶液を粒状に成形
   して固化させる工程を備えたビーズの製法であって、前
   記ビーズ形成剤水溶液に、金属イオンと結合して水に不
   溶性のゲルを形成する多糖類をも予め含ませておき、同
   多糖類をゲル化させる金属イオンを含む水溶液に対して
   前記ビーズ形成剤水溶液を滴下することにより同ビーズ
   形成剤水溶液を粒状化する成形を行うとともに、前記多
   糖類を前記金属イオン水溶液でゲル化することにより前
   記粒状のビーズ形成剤水溶液の固化を行うことを特徴と
   するビーズの製法。 ２　多糖類をゲル化した後、ビーズ形成剤を架橋する請
   求項１記載のビーズの製法。 ３　多糖類をゲル化した後、ビーズ形成剤を架橋し、前
   記多糖類のゲル化物を除去する請求項１記載のビーズの
   製法。