JPH01262457A - 電気泳動試料の注入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （利用分野） 本発明は、蛋白質、核酸等の溶液中で電荷を持ち得る高
分子物質を、その分子の荷電と分子量の相違に基づいて
分離、分析するために用いられる電気泳動装面に試料を
注入する方法、特にシャークステイースコウムを利用し
て試料を注入する方法に関する。

（従来技術とその欠点） 蛋白質、核酸、それらの分解物等を、＆！街液を含むゲ
ル膜、ろ紙等の膜状媒体中で、分子の荷電と分子量の相
違に基づいて分離、分析する電気泳動法が広く知られて
いる。

特に遺伝子工学の分野では、放射能標識した核酸の塩基
配列をオートラジオグラフィーを利用して決定する技法
が、広く利用されている。この技法では、放射能標識さ
れたＤＮＡまたはＤＮＡ断片の塩基特異的反応生成物（
混合物）を、電気泳動媒体の電場方向に沿って電気泳動
させる。このとき、複数の塩基特異的反応生成物を電場
方向に沿って、平行に泳動させるのが普通で、電気泳動
後に得られた複数列の電気泳動パターンをオートラジオ
グラフ像（オートラジオグラム）として得た後、各列の
泳動パターンを相互に比較、対照しながら、塩基配列の
決定が行なわれる。

電気泳動媒体として澱粉やポリアクリルアミドから成る
ゲル膜を用いる場合、従来はガラス板等の平坦な支持体
を用いて、実験者がその都度製作していた。実験者の大
きな負担となっていたこの作業を簡略化するために、２
枚の電気絶縁性・可どう性・水不透過性シート（支持体
シートとカバーシート）をそれらの幅方向の両端部に設
けた所定の厚さのスペーサーをはさんで対向させ、形成
された空間に電気泳動媒体となるゲル膜を収容した電気
泳動用シート材料も、最近市販されるようになった。

これらの電気泳動用材料を用いて電気泳動を行うに際し
ては、電気泳動を開始する前にまずゲル膜の端部（直立
型電気泳動装置を用いる場合は上端部）に、電気泳動す
べき試料液を注入する必要がある。そのためにはゲル膜
の上端付近に一端が解放した長方形のウェル（スロット
ともいう）を複数個設ける方法がある。しかしこの方法
では、隣接するウェルの間に１１１ｍ以上の間隔がある
ために、各試料の電気泳動領域（レーンと呼ばれる）の
間に同程度の間隙ができる。ＤＮＡ塩基配列解析の場合
のように、４種の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｔ）各断片の電気
泳動像の比較、照合を必要とする場合には、この間隙が
あると照合をしにくいので、電気泳動レーン間の間隙は
全くないか、僅かの距離にすることが望ましい、この要
求を満たすため、シャークステイースコウムと呼ばれる
鋸歯状の突出部（ティース）をもつ平板状の部材をゲル
膜の端に密接またはいくらか侵入させるようにして配置
し、ゲル膜の末端と隣接する突出部の端面とで形成され
るほぼ三角形の空間に、試料液を注入する方法がとられ
る。

一回の電気泳動操作により１枚の電気泳動媒体の上でで
きるだけ多数のＤＮＡまたはＤＮＡ分解物の電気泳動分
析を行うことが望まれている。それは、同時に電気泳動
をおこなった試料の間同士でなければ、相互比較による
精度のよい分析ができないからである。この要求から、
シャークステイースコウムを用いて試料注入を行うには
、このように注入口が狭いため注入針の細い（直径的０
．２１程度）マイクロシリンジを用いる必要があり、操
作に時間がかかる。また、電気泳動装置の斜め上方から
注入するので操作しにくく、また充分注意しないと針先
な曲げてしまう。

（解決しようとする技術的課題） シャークステイースコウムを用いる電気泳動分析におい
て、 （１）シャークステイースコウムにより形成された試料
注入部へのマイクロシリンジによる試料注入の困難を回
避すること、 （２）マイクロシリンジの注入針の損傷を防止すること （３）針先の太い（直径０６４１以上）マイクロシリン
ジや使い捨て可能のノズルチップ３用いて、試料注入部
への試料注入を可能にすることが、本発明で解決すべき
技術的課題である。

（技術的課題の解決手段） 上記課題は、シャークステイースコウムを用いる電気泳
動分析において、シャークステイースコウムにより形成
される試料注入部へマイクロシリンジ等の液供給手段で
試料液を注入する際に、を介して、試料注入部へ試料液
を供給する方法により解決された。

シャークステイースコウムのティースを曲げてコウムと
ゲル膜支持体またはカバー部材との間に形成される間隙
は、ゲル膜の厚さより広くする。

シャークステイースコウムを曲げるためには。

適当な治具を用いるのがよい、治具にはアクリル樹脂、
ポリ塩化ビニリデン、ポリカーボネート等の材料を用い
ることができる８泊具は、ゲル膜またはゲルシートをは
さむ剛性平面支持体の−Ｌ端、電気泳動装置の支柱の上
部等に保持させることができる。治具の上部には、注入
位置にマイクロシリンジ等を安定に保持するためのくぼ
み等を設けてもよい。あるいは、注入位置を示す表示を
設けてもよい。

コウムのティースの形状は、公知のもののごとく、先端
が尖っていてもよいが、先端が直線または円で切り取ら
れた形状でもよい、特願昭６１−１９０９９９号に記載
されたような、先端部が両側縁の間に０．１ないし０　
、５　ｒｏ　ｍの幅の直線部を有する形状のものは特に
好ましい。

ティースの形状は通常のように両側縁が直線でもよく、
一部あるいは全部が曲線から成ってもよい、隣接するテ
ィースの間のポケットの底部の形状は、三角形、矩形、
台形、五角形、六角形等の一部（−辺を除いた部分）、
円、楕円、放物線等の一部、その他種々の形状をとるこ
とができる。

コウムの材料としては、熱可塑性の合成または半合成高
分子が適しているが、ポリエチレンテレフタレートフィ
ルムが好ましい、透明でもよいが注入口の見易さのため
に半透明の方が望ましいく例えば東し製ルミラーフィル
ム＃２５０５ＩＯ１＃２５０　ＨＩＯ等）。

本発明の方法は、公知の縮型（直立型）の電気泳動装置
に適用することができるが、特開昭６１−２７８７５１
号に記載された装置は好ましい一例である。

しかし、電気泳動媒体を傾斜した位置で使用する装置で
もよい。

ゲル膜はガラス等の電気絶縁性・水不透過性かつ剛性材
料から成る平坦な支持体の間に形成させたものでもよい
し、２枚の電気絶縁性・可とう往水不透過性シート（支
持体シートとカバーシート）をそれらの幅方向の両端部
に設けた所定の厚さのスペーサーをはさんで対向させ、
形成された空間に電気泳動媒体となるゲル膜を収容した
電気泳動用シートでもよい、ゲル膜は、澱粉、ポリアク
リルアミド等、公知の電気泳動媒体から成る。

（発明の効果） シャークステイースコウムの試料注入部を以上のように
構成することにより、ゲル膜上端部における注入口が広
くなるので、針先の太いマイクロシリンジや、プラスチ
ック等のノズルチップを有する注入器（例えばＥ　ｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ社製品（例えばＮｏ、４７８０）やニチリ
ョウ社製品（ｐＡえばモデル８１００））を用いて試料
を注入することが可能となる。さらに同時に複数サンプ
ル（例えばＧ、Ａ、Ｔ。

Ｃ８塩基保有成分）の注入も可能となる。

また、垂直（鉛直）方向から試料を注入できるので、操
作が容易になり、針を曲げることがないので安全である
。

本発明をさらに具体的に説明するため、実施例を示す。

〔実施例１］ １）を止遍月人責立且隻 １００ｚ１中に アクリルアミド　　　　　　　　　７．６２Ｎ、Ｎ’−
メチレンビス アクリルアミド　　　　　　　０．４ｇ尿素　　　　　
　　　　　　　４２ｇ のほか１！Ｎ！１剤としてホウ酸、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタンおよびエチレンジアミン四酢酸ニ
ナトリウム塩を含有するアクリルアミド水溶液に、重合
開始剤として下記のものを加えた。

ベルオクソニＫＭアンモニウム　　　６５１ｇテトラメ
チルエチレンンジアミン　　３３μ１２）電を書４Ｈ汀
之：」野λ設花− 厚さ５■、幅２０ｃｍ、長さ４０ｃ＋ａのガラス板（支
持体）の幅方向の両端に沿って、厚さ２００Ｂｙ、幅１
０ｎ＋ｍのテープ状のポリエチレンテレフタレート製の
スペーサーを接着した。長さ方向の端に深さ約２０１１
ＩＩＩｌの切り欠けを有する同じ大きさのガラス板を被
せ、周囲に塩化ビニル樹脂テープを漏れがないように貼
り付け、スペーサーの間に形成された凹部に上記ゲル膜
組成物を流し込み、室温で１日放置して架橋重合させて
ポリアクリルアミドゲル膜を得た。ゲル化の前に切り欠
けのある一端から２４ＩＩＩＩＩｌの所まで矩形のプラ
スチック板を差し込んでおき、ゲル化後に除いた。こう
して電気泳動器具を製作した。

３）シャー　スーイースコウムの 上記電気泳動器具を用いて、第１図に示したような電気
泳動装置を組み立てた。

ガラス板の切り欠けの付近の電気泳動媒体ゲル膜の端に
試料注入口を形成するため、第１図Ｂに示すような厚さ
２５０μｌのシャークステイースコウム２６（試料注入
口の幅４．５ＪＩＪ１．隔壁の幅０．２ｚｚ）を挿入し
た。

４）ｉｎ　　および　−トラン　グラフィー第４図に示
すように治具２５を用いてシャークステイースコウムを
曲げ、ガラス板とコウムの間から、３２ｐで標識したサ
ンガー法によるＤＮＡ試料を、テルモ（株）製マイクロ
シリンジＭＳ−１０（針部直径０．５ｍｍ＞を用いてコ
ウムのティースの間へ注入した。

本発明の注入方法は、従来のように斜め後方からでなく
、直上から注入するので操作しやすく、試ｆｌ注入に際
しマイクロシリンジの針先をまげるおそれもない。

本発明の方法により試料注入した後オートラジオグラフ
ィーをおこない泳動像を得た。従来の方法と同じ正常な
泳動像が得られた。

［実施例２］ １）性態１肚に糎へ肝！ Ｌｏｏｓｌ中に アクリルアミド　　　　　　　　７．６ｇＮ、Ｎ’−メ
チレンビス アクリルアミド　　　　　　　０．４ｇ尿素　　　　　
　　　　　　　４２ｇ のほかＭＷ剤としてホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
塩を含有するアクリルアミド水溶液に、重合開始剤とし
て下記の６のを加えた。

ベルオクソニ硫酸アンモニウム　　　６５ｇｇテトラメ
チルエチレンンジアミン　　３３μｌリボフラビンリン
酸エステル ナトリウム塩　　　　　　　　　　１０ｇｇ２ＬｆｆＪ
ｊ　　−シートの　−作一 厚さ１７５μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ
）フィルムの幅２０ｃ＋―のウェブ（支持体シートとな
る）の両端部に厚さ２５０μｌ、幅１０Ｉ６１１１のテ
ープ状のポリエチレンテレフタレート製のスペーサーを
接着し、スペーサーの間に形成された四部に上記組成物
を２１０μｌの厚みに流延し、窒素雰囲気下で紫外線照
射して架橋重合させ、ポリアクリルアミドゲル膜を得た
。

このウェブを長さ４０ｃＩ１１に切断し、長手方向の一
端から２４ｍｍの所で直線状にゲルのみを切断して除く
とともに、露出しなＰＥＴフィルムの端部に深さ２０ｍ
ｍ、幅約１３０＋ｍの切り欠きを設けた後、厚さ６３μ
ｌのＰＥＴから成る、支持体と同じ寸法のカバーシート
をかぶせて電気泳動用媒体シートを製作した。

このゲルシートを用い第３図に示すように泳動装置にセ
ットした。実施例１と同様にマイクロシリンジ（針外径
０．５ｆｉｆｉ）を用いてサンプル注入を行なった。

本発明の方法はサンプルを容易に注入することができた
が、従来の方法（コウムとガラス板の間を拡げない方法
）では、本例に用いたマイクロシリンジで試料を注入す
ることができなかった。

本発明の注入法による電気泳動像オートラジオグラフは
正常な結果を示した。

し実施例３］ 実施例２と同様に、電気泳動装置に電気泳動シートとシ
ャークステイースコウム及び治具を装着させた。ピペッ
トとして、エッペンドルフ社製コンファーティブス“ク
リスタル′°を用い、試料の注入を行なった０本発明の
方法ではウェル（ゲル除去部）の上から緩やかに試料液
を落とすことにより、緩衝液との比重差を利用して注入
することができた。従来の方法では上記の型のピペット
による注入は不可能であった０本発明の電気泳動像は正
常な泳動パターンを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に適した電気泳動装置の１例を示
す斜視図、第１Ａ図は第１図の鎖線で囲まれた部分の立
面および断面拡大図である。 第２図は本発明の実施ｒ９ｇｉに用いた電気泳動ゲル膜
と注入治具のアセンブリを示す立面および断面図、第３
図は本発明の実施例２に用いた電気泳動シートと注入治
具のアセンブリの立面および断面図である６ただし第２
図および第３図の」１半は、注入治具装着前の状態を示
す、第４図は本発明に係る治具装着前後のシャークステ
イースコウムを示す斜視図である。 第５図は従来の注入方法による場斤のシャークステイー
スコウムとマイクロシリンジの関１系を７・す断面図で
ある。 １・・・支え台　　　　　　２・・・下部緩衝液槽３・
・・支社　　　　　　　４・・・上部緩衝液槽５・・・
白ご線　　　　　　５２Ｌ・・プラグ（陰極）６ａ・・
・プラグ（陽極）９・・・パツキン１０・・電気泳動シ
ートアセンブリ １１・・切り欠はガラス板　１２・・・ガラス平板２０
・・・ゲルシート　　２１．２２・・・可どう性シート
２３・・スペーサ　　　２４・・・ゲル膜２５−・治具
　　２６・・・シャークステイースコウム２６＾・・・
治具装着前のシャークステイースコウム２６Ｂ・・・治
具装着後のシャークステイースコウム３０・・・マイク
ロシリンジ（注液針）出願人　　富士写真フィルム株式
会社 第１図 第１Ａ図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 試料注入口の形成にシャークスティースコウムを用いる
   電気泳動分析において電気泳動媒体膜の端部付近にシャ
   ークスティースコウムにより形成される試料注入部へ液
   供給手段で試料液を注入する方法であって、シャークス
   ティースコウムをテイースの中央部または先端近くでコ
   ウムの面に垂直の方向に曲げ、これによりコウムとゲル
   膜支持体またはカバー部材との間に形成された間隙を介
   して、試料注入部へ試料液を注入する方法。