JPH01257498A

JPH01257498A - 油性物質の分析方法

Info

Publication number: JPH01257498A
Application number: JP63086192A
Authority: JP
Inventors: Masao Karube; 征夫軽部; Kazuaki Suzuki; 鈴木　一昭; Hiroko Kameda; 亀田　裕子
Original assignee: Asahi Denka Kogyo KK
Current assignee: Adeka Corp
Priority date: 1988-04-07
Filing date: 1988-04-07
Publication date: 1989-10-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は酵素固定化電極を用いた油性物質の分析方法に
関するものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕従来、
酵素センサーによる油性物質の測定はコレステロールセ
ンサー、中性脂肪センサー、リン脂質センサー等を使用
して行われているが、これらは緩衝液等の水溶液中で、
或いは牛血清アルブミン等の蛋白質や、界面活性剤を添
加することによって油性物質を乳化してから測定を行っ
ている。

しかし、このような従来の方法で油性物質を分析しよう
とする場合、反応は、水相と油相或いは水相と油相と界
面活性剤の界面で行われるため、試料中のごく一部の基
質しか反応せず、感度が低く、酵素反応速度も遅いため
、分析に長時間を要した。

従って、本発明の目的は、感度が高く、酵素反応速度の
速い、即ち、分析時間の短い、油性物質の分析方法を提
供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、酸化酵素を固定化した酵素電極を用いて、有
機溶媒に対する水の溶解度が１０重量％未満（２０℃）
であり支持塩を溶解することにより実質的に電流を流す
ことのできる有機溶媒中で、油性物質をアンペロメトリ
ックに測定することを特徴とする油性物質の分析方法を
提供することにより、上記目的を達成したものである。

以下、本発明の、油性物質の分析方法について詳述する
。

本発明において使用する酸化酵素としては、コレステロ
ールオキシターゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、グルコ
ースオキシターゼ、アルコールオキシターゼ、尿酸オキ
シターゼ等公知の酸化酵素を挙げることができるが、油
性物質を基質とし、酵素反応により過酸化水素を生成す
る酸化酵素が好ましく、特にコレステロールオキシター
ゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ等が好ましい。

本発明における酸化酵素の固定化方法としては何等限定
されず、公知の方法でよく、例えば、担体結合法、架橋
化法、包括法等の方法を使用することができる。

酸化酵素固定用の担体としては、特に限定されず、電極
表面に密着し、酵素反応が滞りなくおこなわれる程度に
ポーラスなものであればよいが、酵素を失活させるよう
な樹脂、例えば硬化時にラジカルを発生させるようなも
の等が好ましくないのは勿論のことである。

又、上記のような担体の中で、作業性の点から好ましい
のは、光等の放射線によって架橋可能な樹脂であり、例
えば、光硬化性のポリビニルアルコール、アクリル樹脂
、エポキシ樹脂等が挙げられ、これらのなかでも、ステ
ィルバゾリウム基を有するポリビニルアルコール或いは
ポリエチレングリコール及び／又はポリプロピレングリ
コールを主鎖成分とし両末端にアクリロイル基を有する
ポリマー等が好ましい。

酸化酵素を固定化する下地電極としては、酵素反応によ
り生成或いは消費される過酸化水素を測定することがで
きるものであれば制限されるものではなく、例えば、白
金電極、金電極、カーボン電極等を使用することができ
る。

本発明において、過酸化水素を測定する電極方式として
は二極方式（作用極、対極、参照電極）を用いることが
好ましい。

作用極は上記酵素固定化電極であり、対極としては例え
ば金電極、白金電極、カーボン電極等公知のものでよく
、参照電極も例えば飽和カロメル電極、銀／塩化銀電極
等公知のものが使用できる。

これらの電極は各々単独で一つの電極装置を構成して使
用してもよいが、これらの電極を一体化して一本の電極
装置を構成して使用してもよい。

これらの電極を各々単独で一つの電極装置を構成して使
用する場合は、少なくとも酸化酵素を固定化して作用極
を有機溶媒に浸漬する。

他の対極及び参照電極は必ずしも作用極と同じ有機溶媒
に浸漬する必要はな〈従来使用されていたような水溶液
に浸漬することができ、この場合はＨ型セル等を使用す
れば良い。

本発明において使用される有機溶媒は、該有機溶媒に対
する水の溶解度が１０重量％未満（２０℃）、好ましく
は１重量％未満（２０℃）、更に好ましくは０．５重量
％未満（２０℃）であり、且つ支持塩を溶解させること
により実質的に電流を流すことのできる有機溶媒であり
、特に常圧において１０〜４０″Ｃの範囲で液体、固定
化膜が不溶である有機溶媒が好ましく、具体的な例とし
ては、例えば１，１．１−トリクロロエタン、１．２−
ジクロロエタン、ジクロロメタン、クロロホルム、２−
ブタノン、１−ペンタノール等が挙げられ、これらのな
かでも１，１．’１１−リクロロエタンが特に好ましい
。

使用する有Ｊａ溶媒に対する水の溶解度が上記範囲外で
あると、固定化された酵素から水分を吸収し酵素を失活
させることがあまり好ましくない。

又、支持塩を充分に溶解できず実質的に導電性を示さな
い有ａ溶媒では油性物質の測定が困難となる。

本発明において使用される支持塩は、上記有機溶媒に溶
解可能であり実質的に導電性を与えるものであれば特に
限定されず、例えばＮ　ａ　ＣＩ　Ｏａ、Ｌ　ｉ　ＣＩ
　Ｏ，、Ｒ４ＮＸ、Ｒ，ＮＣＩ　Ｏ，、Ｒ。

ＮＢＦ、　、Ｒ，ＮＣＦ、ＳＯ３（但し、Ｒはアルキル
基、アルケニル基、アリール基であり、Ｘはハロゲンを
表す）等が使用できるが、Ｒが炭素原子数１〜５のアル
キル基であるものが好ましく、ホウフッ化テトラ−ｎ−
ブチルアンモニウム、ホウフッ化テトラエチルアンモニ
ウム等が特に好ましい。

上記支持塩の使用量は上記有機溶媒に実質的に導電性を
与える量販上であれば特に限定されず、飽和型でもよい
。

ここで、［実質的に導電性となる」とは、使用する測定
装置中の電極間における電流値を、たとえその電流値が
如何に小さい値であっても、測定結果として有効な数値
として測定することが可能であることを意味する。

本発明において使用される有機ン容媒中には酸化酵素を
活性化させるために少量の水分を含有することが好まし
く、水分を含有させる場合の水分含量は、有機溶媒に対
して０．０１〜５、好ましくは０．０１〜１重里％であ
る。水分含量が上記範囲外であると、酵素反応速度及び
感度の点で好ましくない。

また、本発明の実施に際しては、バイオセンサーとして
、第５図に示す如く、作用極、対極及び参照電極を一体
化した電極装置１２を用いることもでき、その場合、セ
ル１３としてはＩＩ型のものに変えて図示のものが用い
られる。

〔実施例〕

本発明の分析方法を、まずその−船釣な実施塊様につい
て図面を参照し乍ら説明し、次いで具体的な実施例を挙
げて説明する。

第１図は、本発明の一実施態様の概略を、本発明に使用
するバイオセンサーの一例を含めて示すフロー図で、作
用極ｌは、電極表面が酵素固定化１朶２で被覆されてい
る酵素固定化電極である。この作用極１をＨ型セル５の
片側に浸漬するが、この時、測定溶媒として、テトラフ
ルオロはう酸テトラーｎ−ブチルアンモニウムなどの支
持塩を添加した有ａ溶媒６を用いた。Ｈ型セル５の他の
側には、支持塩を添加した有機溶媒或いは水性電解液７
を用い参照電極３と対極４を浸漬した。これら、作用極
、参照電極、対極をポテンシオスタット１０とレコーダ
ー１１に接続し、ＩＩ型セル５は恒温槽８の中に入れ、
スターク−９で撹拌した。

測定溶媒６の中へ測定対象物質を添加し該測定対象物質
が拡散されると固定化酵素膜２の中で酵素反応が起こっ
た。この際に生成あるいは消費される過酸化水素量をポ
テンシオスタット１０で一定の電位に保つことにより、
電流変化量から測定対象物質４度を求めることができた
。

実施例１上記実施態様に準じて次のような実験を行い、コレステ
ロール濃度を測定した。

まず、０．１Ｍとなるようにテトラフルオロテト−）−
ｎ−ブチルアンモニウムを支持塩として溶かした１、１
．１−　）リクロロエタン（１，１，１−トリクロロエ
タンに対する水の溶解度＝０．０５ｗｔ％（２０℃）〕
をＨ型セルの片側に入れ、他方には０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐ　Ｈ７，０）を入れた。作用極として、光架橋化
性ポリマーであるスティルバゾリウム基を有するポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ−３ＢＱ：構成ビニルアルコー
ルに対してスティルバゾリウム基を１．３ｍｏ１％導入
）によりコレステロールオキシターゼ（ＣＯ）を包括固
定化した白金電極を使用した。参照電極３として飽和カ
ロメル電極（ｓ、ｃ、Ｅ）　、対極として白金線を使用
した。酵素反応により生成する過酸化水素の酸化電位で
ある＋７００ｍＶに電位を保持し、温度４０℃でコレス
テロールをアンペロメトリックに測定した。コレステロ
ールの標準サンプルをそれぞれ特定量ずつ測定溶媒６に
添加し、それぞれの濃度の異なるコレステロール溶液中
における定常電流値の経時変化量を測定した。その結果
を第２図に示す。

また、コレステロール標準サンプル添加の前後の定常電
流値の差を計算し、それを濃度変化に対応させてプロッ
トしたものを第３図に示す。第２図及び第３図から判る
ように、本発明の分析方法は、感度が高く、測定時間の
短いものである。

実施例２測定溶媒として有機溶媒に対して飽和の水要添加した１
、２ジクロロエタンを用い、また測定は温度３０℃で行
った。その他の条件については、実施例１と同様にして
、コレステロールを測定した。

上記の測定において、コレステロール濃度と電流増加値
の間に直線関係が得られた。応答時間は実施例１と同様
に１分以内であった。

実施例３酵素固定化担体として、光架橋化性ポリマーを用い、カ
ンペＢＥＬ−ＥＮＴ２０００とカンペＢＥＬ−巳ＮＴＰ
２０００（共に関西ペイント製）の１；１混和物を用い
てコレステロールオキシダーゼを包括固定化した電極を
酵素電極として使用した。測定溶媒、温度などのその他
は実施例１と同様に実施した。得られた測定結果は、実
施例１の結果を示す第３図とほぼ同じであった。

比較例１ −Ｈ型セル５の中に入れる測定媒体として、有機溶媒を
使用せずに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）を用い
た。この時：作用極側には、測定対象としての油性物質
を乳化するために、牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎ　ｓ
ｅｒｕｍ　ａｉｂｕｗｉｎ、　Ｂ　Ｓ　Ａ　）を添加し
た。また、この場合、緩衝液には電解質が含まれている
ため、これにさらに支持塩を添加する必要はない。その
他の構成、条件については、実施例１と同様にして行っ
た。

得られた測定結果を、第４図に示す。第４図から判るよ
うに、コレステロールｆｉＪ１．０２〜０．１５ｍＭの
範囲で濃度と電流増加値の間に直線関係が得られらたが
、実施例の結果と比較すると、生血７ｎアルブＡンを用
いて乳化するために、激しく撹拌しなければならず、又
、感度の悪いものであった。

また、本発明の実施に用いられるバイオセンサーとして
は、第５図に示す如く、作用極、対極及び参照電極を一
体化した電極装置１２を用いることもでき、その場合、
セル１３としてはＩＪ型のものに変えて開示のものが用
いられる。

〔発明の効果〕

本発明の油性物質の分析方法によれば、油性物質を短時
間で分析できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施態様の概略を、本発明に使用す
るバイオセンサーの一例を含めて示すフロー図、第２図
〜第４図は何れも測定結果を示すもので、第２図は、実
施例１における電流値−コレスチロール濃度のグラフ、
第３図は実施例１における電流値−時間のグラフ、第４
図は比較例における電流値−コレスチロール濃度のグラ
フ、第５図は本発明の他の実施態様の概略を、バイオセ
ンサーの他の例を含めて示すフロー図である。１・・・作用極、　　　　　２・・・酵素固定化電極３
・・・参照電極、　　　４・・・対極５・−Ｈ型セル、
　　　　６・・・有機溶媒７・・・有機溶媒（水性電解
液）８・・・恒温槽、　　　　　９・・・スターラー１０−
・・ポテンシオスタット１１−・・レコーダー、　　１２−・・電極装置１３−
・・セル特許出願人　　　旭電化工業株式会社時間（ｍｉへ）第４図コレステロール濃度（ｍＭ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酸化酵素を固定化した酵素電極を用いて、有機溶
媒に対する水の溶解度が１０重量％未満（２０℃）で且
つ支持塩を溶解することにより実質的に電流を流すこと
のできる有機溶媒中で、油性物質をアンペロメトリック
に測定することを特徴とする油性物質の分析方法。