JPH01239448A - ピルビン酸測定用酵素センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のピルビン酸の濃度測定に用いられる
酵素センサに関するものである。

（従来の技術） ピルビン酸の定量は、臨床化学検査分野において、肝機
能及び心筋梗塞の診断の指標として血中のグルタミン酸
−ピルピン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の活性の測
定に使われており、その活性測定では、生成するピルビ
ン酸の定量的測定が行われており、また、血液中の中性
脂肪あるいはクレアチニンの測定方法に関してもピルビ
ン酸を経由する分析方法が知られており、ピルビン酸の
簡便で、迅速な定量法が要望されている。

従来のピルビン酸を定量する方法として、ピルビン酸に
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンヲ作用させて比色
定量するライトマン・フランケル法（、奥田清著、「臨
床化学検査マニュアル」、医歯薬出版、　第１７２頁参
照）、ピルビン酸にピルビン酸オキシダーゼを、続いて
パーオキシダーゼを作用させ、さらに色原体９例えば４
−アミノアンチピリン−フェノール系と反応させて比色
定量する方法あるいはパーオキシダーゼΦ代わりにカタ
ラーゼを用いて比色定量するハンチ法（奥田清著、「臨
床化学検査マニュアル」、医歯薬出版、第４８〜４９頁
参照）などが知られている。

これらは、いずれも高い感度でもって測定することが可
能であるが１発色効率、呈色の安定性等の条件が微妙で
、呈色に長時間を要し、操作上のわずかな変動による誤
差が生じやすいという欠点を有している。

このため、現在では乳酸脱水素酵素を用いた定量用試薬
にて測定する方法が最も一般的に採用されている。この
方法は、正確な定量が可能であるが、高価な分光光度計
が必要であり、高価な酵素試薬を使い捨てにすること、
測定に時間を要すること、及び試薬溶液調製後の寿命が
短いことなどの問題がある。

このため、基質特異性に優れた酵素と、簡便で迅速な分
析が可能である電極とからなる酵素センサが近年盛んに
開発されており、ピルビン酸測定用酵素センサとしては
、ピルビン酸オキシダーゼと酸素電極又は過酸化水素電
極とを組み合わせた酵素センサが提案されている（特開
昭５９−１８０３５’３号公報参照）。

（発明が解決しようとする課題） 上記の酵素センサは、ピルビン酸オキシダーゼを用いる
ため、試料中に存在する溶存酸素量によってピルビン酸
の測定可能な濃度が決まってしまい、その測定可能な範
囲は、極めて狭（なり、試料中のピルビン酸濃度が高濃
度の場合にあっては溶存酸素量が不足し、完全に酵素反
応が進行しないために試料を希釈する必要があり、操作
が煩雑になっていた。また、上記の酵素センサは、長期
安定性のために高価なフラビンアデニンジヌクレオチド
を使用しなければならないという問題もある。

（課題を解決するための手段） 本発明者はこのような問題点を解決すべく鋭意研究の結
果、酵素として乳酸脱水素酵素を用い。

かつトランスデユーサとしてｐＨ電極又はイオン感応性
電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いた酵素セン
サが、高価な試薬を使用しな（でも長寿命で、しかも広
範囲に、かつ高濃度のピルビン酸であっても精度良く測
定できることを見い出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明は、基質に特異的に作用する固定化酵
素と、酵素反応によって消費あるいは生成する物質の濃
度変化又は熱量変化を電気信号に変えるトランスデユー
サとからなる酵素センサにおいて、酵素が乳酸脱水素酵
素であり、トランスデユーサがｐＨ電極又はｌ５ＦＥＴ
であることを特徴とするピルビン酸測定用酵素センサを
要旨とするものである。

本発明に用いられるｐＨ電極としては２例えばガラス電
極と比較電極とを組み合わせたもの、複合型のものなど
があげられるが、微小化のためには複合型ｐＨ電極が好
ましい。また、ｌ５ＦＥＴとしては、水素イオン濃度を
測定するものであればどのようなものでもよいが、特に
ＳＯ３／ＩｓＦ　Ｅ　Ｔ　（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｏｎ　５
ａｐｐｈｉｒｅ／　Ｉ　Ｓ　Ｆ　Ｅ　Ｔ）が好ましい。

本発明に用いられる乳酸脱水素酵素としては。

微生物由来のもの、動物由来のものなど、各種のものを
使用することができる。中でも、最適生育温度が５０℃
ないし８５°Ｃである微生物の産出するものが好ましい
。そのような微生物としては。

例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス
・サーモブロテオリテイクス、バチルス・アシドカルダ
リウスなどのバチルス属、サーモアクチノマイセス属、
サーマス属、サーモミクロビウム属などの微生物があげ
られる。これらの中でも特に好ましい微生物としては、
バチルス・ステアロサーモフィルスであり、その具体例
としてはＡＴＣＣ７９３３，７９５４，１０１９４，１
２９８０、ＮＣＡｌ３Ｏ３，ＵＫ５６３株（微工研菌寄
第７２７５号、ＦＥＲＭＰ−７２７５，昭和５８年９月
２９日寄託）などがある。

本発明において、乳酸脱水素酵素とｐＨ電極又はｌ５Ｆ
ＥＴとから酵素センサを調製するには。

例えば、膜状の水不溶性担体に乳酸脱水素酵素を固定化
した状態で、ｐＨ電極又はｌ５ＦＥＴのｊ５応面に直接
被覆する方法が用いられる。被覆膜は薄いほど応答時間
が速くなるため１例えば、１〜１００μ、好ましくは１
０〜５０μの厚さにすればよい。

本発明において、乳酸脱水素酵素を水不溶性担体に固定
化させるには１例えば、千畑一部著「固定化酵素」講談
社（１９７５）に記載されているような、従来より公知
の共有結合法や吸着法を採用することができるし、また
、架橋化法あるいは包括法など、いずれの方法も採用す
ることができる。

共有結合法としては２例えば、アガロース膜やデキスト
ラン膜などを臭化シアンで活性化し、これに乳酸脱水素
酵素のアミノ基を結合させるペプチド法、芳香族アミノ
基を有する水不溶性膜を亜硝酸塩によりジアゾニウム塩
とし、これに乳酸脱水素酵素のチロシン残基をカップリ
ングさせるジアゾ法、アミノ基を有する水不溶性膜にグ
ルタルアルデヒドを結合させ、これに乳酸脱水素酵素の
アミノ基を結合させるシッフ塩基形成法などがあげられ
る。

吸着法としては１例えば、ＤＥＡＥ−セルロース膜やフ
ェノキシアセチルセルロース膜などの水不溶性膜に、乳
酸脱水素酵素をイオン結合的あるいは物理的な力で固定
する方法があげられる。

架橋化法としては１例えば、乳酸脱水素酵素とアルブミ
ンのアミノ基をグルタルアルデヒドで架橋して固定化す
る方法があげられる。

包括法としては１例えば、アクリルアミドモノマに架橋
剤であるＮ、　　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、
重合開始剤であるリボフラビン、ベルオキソニ硫酸塩１
重合促進剤であるＮ、Ｎ、Ｎ’。

Ｎ゛−テトラメチルエチレンジアミンなどを乳酸脱水素
酵素溶液に加えて、窒素気流中で光照射して重合させて
乳酸脱水素酵素を包括固定化する方法、コラーゲンフィ
ブリル懸濁液に乳酸脱水素酵素を加えて風乾する方法な
どがあげられる。

本発明の酵素センサを用いてピルビン酸を測定するには
１例えば固定化乳酸脱水素酵素をｐＨ電極又はＴＳＦＥ
Ｔ惑応面に直接被覆したものをニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含む緩衝液に浸し、試料
としてのピルビン酸溶液の添加により生ずるｐＨ変化を
測定すればよい。

すなわち９次の反応 乳酸脱水素酵素 ピルビン により減少するＨ゛によるｐＨ変化をｐＨ電極又はＩＳ
ＦＥＴで測定すればよい。

測定用の溶液としては，例えば、　ＮＡＤ）ｌを０．１
〜３０ｍＭ．好ましくは０．５〜１０ｍＭとなるように
，１〜２００ｍＭ，好ましくは３〜１００ｍＭのトリス
−塩酸，イミダゾール酢酸などの緩衝液（ｐ　Ｈ　４〜
１０．好ましくは５．５〜９．５）に溶解したものを用
いればよい。

また、測定温度は５〜７５°Ｃ，好ましくは１５〜５５
℃が用いられる。

（作　用） 本発明の酵素センサは．次の反応 により減少するＨ゛によるｐＨ変化を，　−ｐ　Ｈ電極
又はＩＳＦＥＴで検出することにより構成されている。

（実施例） 次に，本発明を実施例によって具体的に説明する。

実施例１ バチルス・ステアロサーモフィルス由来の乳酸脱水素酵
素１０μｆｆ（１．４ユニツト）と２５ｗ／ｖ−％の牛
血清アルブミン溶ン夜５μ２及び１ｗ／ｖ−％のグルタ
ルアルデヒド溶液１５μβを混合し，その混合液４μ！
をＩＳＦＥＴのゲート上に滴下した。

これを４°Ｃで一昼夜反応させ，固定化膜を形成させた
のち，ｐＨ８．５の０．　１　Ｍグリシンーカ性ソーダ
緩衝液に１５分間浸し．最後に蒸溜水で洗浄することに
より，乳酸脱水素酵素を固定化したＴＳＦＥＴを調製し
た。

次いで．ｐＨ７．０の１０ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝
液及び４ｍＭのＮＡＤＨからなる反応溶液２５ｍβに，
乳酸脱水素酵素固定化ＩＳＦＥＴ及び対照として乳酸脱
水素酵素を固定化していないｒｓＦＥＴ（対照用ＩＳＦ
ＥＴ＞を浸し，さらに、溶液の電位を一定に保つため，
Ａｇ／ＡｇＣβ電極を浸した。これらの各電極は，第１
図に示した測定回路を形成し，両ＩＳＦＥＴ１．２のソ
ース・ドレイン間の電圧は２．０■に１　また、Ａｇ／
ＡｇＣ１電極３への印加電圧は３．０■とした。これに
ピルビン酸溶液を添加すると，ＩＳＦＥＴ界面で反応が
起こり１局部的にｐＨが変化するので、２木のｌ５ＦＥ
Ｔの差動出力値として測定することができる。

なお、温度は３０“Ｃ一定とし、また２反応液の攪拌は
２００ｒｐｍ一定にて行った。

試料として用いたピルビン酸溶液の濃度を１゜２．５，
１０．２０，５０，１００ｍＭにして行い、それぞれ得
られた差動出力との関係を第２図に示した。このように
ピルビン酸濃度１〜１００ｍＭの範囲において、ピルビ
ン酸濃度の対数と出力との間に良好な直線関係が得られ
、ピルビン酸の定量が可能であることが判明した。

なお、応答時間は５分程度であった。

比較例１ ピルビン酸オキシダーゼを固定化した酵素センサを次の
ようにして調製した。

まず、０．６重量％のコラーゲン）懸濁ン夜（ｐＨ４゜
０）１０ｇを良く攪拌した後、ピルビン酸オキシダーゼ
（東洋醸造社製）の凍結乾燥標品１００ｍｇ（２１ユニ
ット／ｌＴ１ｇ）を添加して軽く１押して真空ポンプを
用いて１分間脱泡した。得られた懸濁液をテフロン板（
４ｃ＋＋＋Ｘ５ｃｍ）上に展開し２２８℃で３時間風乾
した後、テフロン板から剥離した膜をｌ　ｃｍ　ｘ　ｌ
　ｃｍに裁断し、これを０．１重量％のグルタルアルデ
ヒド水溶液（ｐＨ８，０）を用いて気相中で２８°Ｃで
１０分間架橋処理することによってピルビン酸オキシダ
ーゼ固定化膜を作成した。

次に酸素透過性膜で白金電極を被覆してなるポーラログ
ラフ式酸素電極の感応部に上記のピルビン酸オキシダー
ゼ固定化コラーゲン膜を被覆し。

さらにその上をセルロースアセテート製限外ろ過膜（厚
み；約４８μｍ）の粗密層で被覆して酵素センサを２周
製した。

この酵素センサを作用電極とし、対照電極として塩化銀
電極を用いた。

これらの電極を０．０５ｍＭのフラビンアデニンジヌク
レオチド、１．０ｍＭのチアミンピロホスフェート及び
１．０ｍＭの塩化マグネシウムを含むｐ　ｌ−１７，４
の０．１Ｍリン酸緩衝液２５ｍ１に浸し、これにピルビ
ン酸溶液を添加すると１作用電極界面で酸素の減少が起
こり、電極電流に変化が生じ、この変化値を記録計で読
み取ることでピルビン酸の濃度を測定した。

なお、温度及び反応液の攪拌は、実施例１と同様に行い
、試料として用いたピルビン酸溶液の濃度は実施例１と
同じものを用いた。

また、測定時間は、５分程度であった。

得られた電流変化とピルビン酸濃度との関係を第３図に
示す。

第３図から明らかなごと＜、５０ｍＭ以上のピルビン酸
濃度域において、電流の値には濃度依存性がなく、一定
の値を示すだけであった。

実施例２ ０．０４モルのジイソシアン酸トリレンと０．０１モル
のポリエチレングリコールをン昆合し、８０℃で３０分
間反応させてウレタンプレポリマを合成した。次に、１
ｇの融解状態にしたウレタンプレポリマに１．５ｍｌ　
（１５ユニツト）の乳酸脱水素酵素溶液を加えて室温で
かきまぜた後１発泡し。

ウレタンプレポリマが生成したところで、ガラス板上に
広げて固定化膜を作成した。

この固定化膜を極微量用複合型ｐＨ電極（セントラル科
学社製、検体測定用５Ｅ−１６００ＧＣ）に装着するこ
とにより酵素センサを構築し、実施例１と同様にしてそ
の電位変化を３０°Ｃで測定した。

第４図にピルビン酸濃度と得られた電位変化の関係を示
す。

（発明の効果） 本発明の酵素センサは、高価な試薬を使用しなくても長
寿命で、しかも広範囲に、かつ高濃度のピルビン酸であ
っても精度良く測定できるという優れた性能を有してい
る。

また９本発明の酵素センサは、測定するピルビン酸が酵
素の単独反応で生成するものでだけでなく、２種以上の
酵素反応の共役により生成するものも含まれるので１種
々の生化学物質を試料とすることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、乳酸脱水素酵素を固定化しているｌ５ＦＥＴ
１．乳酸脱水素酵素を固定していないＩ５ＦＥＴ２及び
Ａｇ／Ａｇ（１！電極３からなる測定回路を示す図であ
り、第２図は、乳酸脱水素酵素とｌ５ＦＥＴとを組み合
わせた本発明の酵素センサを用いた場合のピルビン酸濃
度と差動出力との関係を示す図で、第３図は、ピルビン
酸オキシダーゼと酸素電極とを組み合わせた公知の酵素
センサを用いた場合のピルビン酸濃度と電流値との関係
を示す図であり、第４図は、乳酸脱水素酵素と複合型ｐ
Ｈ電極とを組み合わせた本発明の酵素センサを用いた場
合のピルビン酸濃度と差動出力との関係を示す図である
。 特許出願人　　ユニ亭力株式会社 じ１ｂビン股嬉康（ｍＭ） ヒ０ルビ／町灸フ度Ｌ　幅間）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）基質に特異的に作用する固定化酵素と、酵素反応
   によつて消費あるいは生成する物質の濃度変化又は熱量
   変化を電気信号に変えるトランスデューサとからなる酵
   素センサにおいて、酵素が乳酸脱水素酵素であり、トラ
   ンスデューサがｐＨ電極又はイオン感応性電界効果トラ
   ンジスタであることを特徴とするピルビン酸測定用酵素
   センサ。