JPH01124380A - 帯電粒子を用いた細胞培養液のメンブランフイルトレ−シヨン法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は細胞層ｇＩ液たとえば発酵ブイヨン（ｆ−デｔ
ｈａｓｔａｔｉｏｓ　ｂｒｏｔｈｓ　）を、濾過助剤と
しての帯電粒子の使用により濾過する方法、より詳細に
は帯電粒子が正および負に帯電した微小粒子の組合わせ
でるるメンプランフイルトレーシヨン法に関する。

発明の背景 細胞培養液、たとえば発酵液のメンプランフイルトレー
シヨンに濾過助剤として帯電粒子を使用することは知ら
れている。米国特許第４，２００゜６９５号明細′４！
（チヨンら）には正および負に帯電した微小粒子を混合
することによｐ調製されたフロックおよびこれらのあら
かじめ調製されたフロックを発酵ブイヨンの濾過助剤と
して用いることが記載され、負または正に帯電した粒子
を個々に中空ファイバーの内腔で限外濾過しうることが
示唆されている（９欄５９行〜１０欄４４行）。

チヨンらの明細書の他の箇所（１２欄、１７〜３０行）
には負および正に帯電した粒子を液体に添加することに
より処理および濾過すべきその液体中でフロックを調製
することが記載されている。

微粒状の正および負に帯電した高分子吸着剤の組合わせ
も順次他の目的のために、たとえば飲料水から、塩素と
反応して有毒なトリハロメタンを生成させる腐植質を除
去するために（米国特許第４．５３７，６８３号明細書
に記載、イサコフおよびニーレイ）、あるいは不純な糖
液を同時に脱色および澄明化するために（米国特許第４
，２４７．３４０号明細書に記載、カーテイヤー）用い
られている。

発明の概要 本発明者ちは意外にも、第１の微小帯電粒状物質を細胞
培養液と混合し、得られた懸濁液をメンプランフイルト
レーシヨン処理すると、幾つかの重要な利点が得られる
ことを見出した。これらおよび他の利点Ｆｉまた、混合
物を次いで第１の帯電粒状物質のものと反対の電荷をも
つ第２の微小帯電粒状物質と混合した場合にも得られ、
あるいは向上させることができる。

このような利点は濾過膜を通る流量が２０％ないし数倍
増加することである。これは、少なくとも一部は膜の表
面で粒子および／または溶質の二次層（ゲル化して膜を
目詰りさせる傾向を示す）が形成される〔濃淡分極現象
（ｃｏｎｃｅｎｔデαｔｉｏ％ｐｏｌａデ１ｔａｔｔｏ
ｎ　ｐｈａｓｏｍａｎｏｓ）〕のが実質的に減少するこ
とにより、また一部は膜の除去率（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ
　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　）が変化することにより生
じるものである。このような利点の商業上の利点は自明
である。

この明細書中で′″細胞培養液”という表現は発酵ブイ
ヨンを意味する。すなわち、生物学的物質が増殖した液
体培地、または発酵ブイヨンから得６た戸液もしくは液
体画分であり、これらは細胞、細胞溶解（行った場合）
により生じる細胞破片その他の物質を含むか、あるいは
含まない。生物学的物質には植物、動物および微生物の
細胞、遺伝子工学的に・処理された細胞、ならびにそれ
らの産生物が含まれる。

本発明方法に有用な好ましい帯電粒状物質は粒径の小さ
な樹脂であり、たとえば前記の特許明細書：木国特許第
４，２００，６９５号明細書（チヨンら）、および米国
！許第４，５３７，６８３号明細書（イサコフら）に記
載されている。これらの明細書をここに診考のため引用
する。他の型、機能および／または交換容ｔをもつ微小
帯電粒子も使用できる。これらはたとえば＠濁重合法そ
の他の方法で製造された一般的な樹脂である。ただしこ
れらの樹脂は本発明に用いるために有効な電荷密度およ
び粒径をもつものである。これらの樹脂の粒径は必璧に
応じ既知の方法で粉砕することにより低下させることが
できる。この種の樹脂はたとえば米国特許第３，０３７
，０５２号；同第３，６３７゜５３５号；同第３，８４
３，５６６号；同第３，７９１゜８６６号；同第３，２
７５，５４８号；および同第３．３５７，１５８号明細
書に記載されている。これらをすべてここに参考のため
引用する。本発明に有用な他の帯電粒子には２．５μ偽
以下の直径をもち、液体培地（この中でこれらの粒子を
使用する予定のもの）に不溶性であり、それらの界面に
液体培地中の他の成分との相互作用に用いられる電荷を
備えた粒子が含まれる。たたしこれらに限定されない。

チョンらおよびイサコフらの特許における樹脂は、それ
らが正または負のいずれに帯電しているものであっても
、約０．０１〜１．５μｍの範囲の直径をもつほぼ球形
ビーズの形の架橋ポリマーからなる。有用な樹脂はモノ
マー単位当たり約０．１〜１．５個の官能基を保有する
。これらの基は強酸性（たとえば−８Ｏ，Ｈ基）、弱酸
性（たとえば−ＣＯＯＨ基）、強塩基性（たとえば第四
アンモニウム基）、捷たは弱塩基性（たとえば第三アミ
ン、基）のいずれであってもよい。

本発明により濾過てきる発酵ブイヨンは真菌、酵母、細
菌その他の生物学的由来の細胞を一般の液体培地中で増
殖させることによ＃）調製される。

微生物の増殖および発酵が終了したのち、ブイヨンは細
胞、細胞破片、使用隣み栄養素、生物学的産物、および
％種汚染物質を含有するでおろう。

ブイヨン自体を本発明方法により濾過するか、あるいは
固形物質をまず遠心分離、一般の濾過法、その他の分離
法により除去し、その上層成またはいずれかの画分につ
いて本発明を実施することができる。本発明は発酵ブイ
ヨンについて、またその液体部分または一分（上層液を
含む）の双方について実施することもできる。

いずれの特定の場合においても使用する個々の帯電粒子
は、細胞培養液中の固体および溶質の電荷および電荷密
度を考慮して、周知の微生物学および発酵生化学の原理
に基づいて選ばれ、これは当業者が容易になし５るもの
である。ここで用いる１ｇ電粒子”および１帯電粒状物
質”という語は液体培地中の他の成分との相互作用に用
いられる電荷（粒子界面に限定された電荷を含む）を保
有するすべての粒子を含むと解されるものである。

これは意図的に官能化した粒子および天然の電荷をもつ
もの双方、ならびに液体培地に可溶性および不溶性の粒
子の双方を含む。

本発明方法は、選ばれた第１帯電粒状物質を細胞培養液
に添加し、次いで混合物を懸濁液が均質になる１で撹拌
することにより行われる。好ましい実施態様においては
、第１物質のものと反対の電荷をもつ選ばれた第２帯電
粒状物質を、次いで撹拌下にブイヨンに添加する。培地
中に生じたフロックは帯電粒子、微生物細胞（存在する
場合）、ならびに粒状成分および帯電成分（存在する場
合）を含めて他のブイヨン成分を含有する。

本発明方法のより好ましい実施態様においては、第１帯
電粒状物質は正に帯電して訃り、ブイヨンの負に帯電し
た成分と共に速やかにフロックを形成する。所望により
その後添加される負に帯電した物質は、正に帯電した物
質および他のブイヨン成分と相互作用することにより、
先きに形成されたフロックを安定化し、その寸法を増大
させる。

帯電粒子それぞれの量は通常はブイヨンの約０．０１〜
０．５容量％、好ましくは０．１〜０．２５％の範囲で
ある。

次いで、得られた懸濁液を常法によりメンブランフィル
タ−に導通する。一般にメンブランフィルタ−は溶解ま
たは分散した物質を限外濾過またはミクロフィルトレー
ジョンにより除去しつることが当技術分野で知られてい
る半透膜である。ただし溶存塩類を逆浸透として知られ
ている方法により分離するものは除外される。

以上要約すると、細胞培養液の経膜フラックス量（／ｊ
％ｚｒａｔａ）が本発明により微小帯電粒子を組合わせ
て使用することによって大幅に改善され、この高いフラ
ックス量が場合により少なくとも培地の５倍儂度にわた
って一定に保たれる。同時に蛋白質、酵素その他のｆＲ
裂または回収すべき産生物を含有する培養液について本
発明を実施する場合、濃淡分極が減少し、かつメンズラ
ンプイルトレーションによるこれらの産生物の除去率が
低下する。これによシ、これらの生成物がより完全に分
離され、回収率が改善される。これらの利点は第１帯電
粒状物質を添加した際のフロックの形成による。他の利
点は後続の第２帯電粒状物質の添加によるフロックの安
定化による。この安定化は、複合体を形成した細胞（ま
たは他の物質）、正に帯電した粒子、溶質および負に帯
電した粒子がイオン性相互作用により結合した結果であ
ると考えられる。フロックが未処理培養液のフラックス
量の低さに関与する成分を吸着し、液体培地から除去す
ると考えられる。細胞培養液の粘度がフロックの存在下
で高まった場合ですら、結果として起こるフラックス量
の減少は濃淡分極により膜上に形成されるゲル層の減少
によって相殺される。

以下の具体例を参照することにより当業者は容易に本発
明を実施しつるであろう。当業者は示された主題に基づ
いて種々の変法を構成すること、たとえば成分の蛍を提
示されたものかられずかに、ただし有意でない程度に変
更すること、無害な物、質を添加すること、あるいは提
示されたものを均等なまたはｔｌぼ均等な成分と置換す
ることができるであろう。これらの変更はすべて本発明
の着想の一部であると考えられる。これらの具体例にお
いて部および％はすべて特に指示しない限９重量による
。

各実施例の帯電粒状物質は米国特許第４，２００゜６９
５号および同第４，５３７，６８３号明細書に記載され
た乳化１（合法により製造され、下記の特性をもつ。

樹脂Ａ：強塩基、第四アミン官能化、スチレン−ジビニ
ルベンゼン−アミノアルキルメタクリレートゲル状コポ
リマー、架橋剤５％、陰イオン交換容ｆｉ（＝　２．８
　ｍｍｑ　／　ｔ　（乾燥）および平均粒子直径＝０．
１１±０．０２μｍをもつ、クロリド形。

樹脂Ｂ：強酸、スルホン酸官能化、スチレン−ジビニル
ベンゼンゲル状コポリマー、架橋剤７．３％、陽イオン
交換容量＝５．１情−ｑ／？（乾燥）および平均粒子直
径＝０．２６±０．０２μ偽をもつ、水素形。

ＳａＣ：強塩基、第四アミン官能化、スチレン−ジビニ
ルベンゼン、ゲル状コポリマー、架橋剤１．８％、陰イ
オン交換容量＝３．８倶−ｑ／２（乾燥）および平均粒
子直径＝Ｏ１２２±０．０２μ鴬をもつ。

樹脂り二強塩基、第四アミン官能化、スチレン−ジビニ
ルベンゼン巨大網状コポリマー、架橋剤３％、陰イオン
交換容量＝４．０憔−ｑ／ｆｆ（乾燥）をもつ、平均粒
径１．１μ溝、および０．４μ溝未満から５μ倶までの
範囲に粉砕。

実施例１および２はそれぞれ樹脂Ａおよび樹脂Ｂによる
発酵ブイヨンの処理がフラックス量および蛋白質回収率
に与える影響を、組合わせた樹脂による処理（実施例３
）と比較するために記載したものである。実施例４は組
合わせ樹脂によ他処理された発酵ブイヨンの限外−過、
および分離、再懸濁されたフロックの限外濾過による＃
縮について記載する。実施例５は実施例４の調製物の無
粒子上層液を組合わせ樹脂により限外濾過した場合のフ
ラックス量および蛋白質回収率を示す。実施例６は実施
例５と同様であるが、組合わせ樹脂・による限外濾過が
無細胞上層液に与える影響を示す。実施例７および８は
樹脂Ａで処理した発酵ブイヨンのそれぞれ限外濾過およ
びミクロフィルトレージョンのフラックス量に与える影
響ヲ示す。

実施例９は他の微小陰イオン交換樹脂が発酵ブイヨンの
ミクロフィルトレージョンに与える影響を示す。実施例
１Ｏおよび１１は組合わせ樹脂ＡおよびＢが酵母細胞懸
濁液の限外濾過およびミクロフィルトレージョンに与え
る影響を示す。一方、実施例１２は組合わせ樹脂Ａおよ
びＢがアルブミン試料のミクロフィルトレージョンに与
える影響を示す。

実施例１゜ を、デンプン３％、グルコース１％、大豆粉加水分解物
５％、リン酸アンモニウム１％、塩化カリウム０．０３
％および硫酸マグネシウム０．０２％を含有する液体培
地中で３０℃、ｐＨ７，０において４日間増殖させた。

最終乾燥細胞ｆｉｔは１０２／ｌであった。培養終了後
に粗発酵ブイヨン１ｔを室温で牛氾をＭＷｌｏ　０，０
００の多孔性中空繊維ｐ過モジュール（ロミコン（Ｒｏ
ｍｉｃｏｎ　）　ＨＦ　−１−４３Ｆ１−４３Ｆを用い
る限外濾過法によシ濃縮した。中空繊維モジュールはポ
リスルホン族の膜からなっていた。このモジュールは内
径１．１１１Ｉ。

表面積９３０儂２および長さ４０ｃ！ｌＬの繊維２５本
を含んでいた。採用した操作パラメーターは平均膜内外
圧差１１７　ｋＰａおよび再循環流量２１７分であった
。

平均フラックス透過量を測定し、樹脂Ａの添加により生
成したフロックを発酵ブイヨンに添加した場合に得られ
たものと比較した。初期細胞外蛋白質、膜に吸着された
蛋白質、および蛋白質の除去率もｍ１１１定した。

平均経膜戸液フラックス撞をこの実施例および後続の実
施例にシいて既知の方法で、５〜７倍の細胞濃縮に相当
する濾過時間にわたって得られたフラックスＩｎＪの積
分の形のシンプソンの法則を用いて計算した。

この式において Ｊは瞬間フラックス量であり、 Ｃは時間であり、 ｔ、は特定の濃度に達するのに要する時間である。

測定結果を表１に示す。これから、対照を上回るフラッ
クス蓋の改善が得られ、改善度は樹脂Ａの濃度と共に増
大することが認められるであろう。

我　　　１ 微小陰イオン交換樹脂がバチルス・５４’ｙニフオルミ
スのブイヨンの限外濾過特性に与える影響 （％、Ｗ／ν）　　　　　　（ｔ／時間／惰２）０　　
　　　　　　　　　　１２．５ ０．０５　　　　　　　　　　１９．６０．１０　　　
　　　　　　　２６．９０．２５　　　　　　　　　　
３）．５実施例２゜ 実施例１の操作を本質的な点すべてにおいて反復した。

ただし樹脂Ａの代わりに樹脂Ｂを用いた。

ブイヨンを樹脂Ｂと混合した際にフロックは形成されな
かった。結果を表２に示す。これは実施例１で樹脂Ａを
用いて達成されたよりも実質的に効率が低かったことを
示す。

表　　　２ 微小陽イオン樹脂がバチルス・ライケニフオルミスブイ
ヨンの限外濾過性に与える影響０　　　　　　　　　　
１２．５ ０．０５　　　　　　　　１７．０ ０．１０　　　　　　　　１９．（１ ０，２５２１，９ 実施例３゜ 実施例１の操作を本質的な点すべてにおいて反復した。

ただし樹脂Ａおよび樹脂Ｂの双方を添加することにより
限外濾過性に与えられる影響を調べた。表３は結果を対
照（衣１）と比較したものを示す。同一濃度の樹脂を用
いた処理を比較すると、添加の順序を逆転させた場合に
実質的なフラックス量の増加が得られることが認められ
るであろう。樹脂Ａののち樹脂Ｂの場合は、樹脂Ｂのの
ち樹脂Ａの操作の場合よりも２４．７％のフラッグス蛍
増茄を表わす。

膜によって効果的に除去（デーｊａｅｔ　）された蛋白
質は、濃縮画分中に存在していた蛋白質と膜に付随する
濃淡分極ゲル層中の総蛋白質との総量であると定める。

ゲル層中の蛋白質（Ｐ）は出発ブイヨンの清澄化された
上層液中に存在していた総蛋白質と、濾過後の涙液（透
過液）および清澄化された濃縮液中の蛋白質の和との差
により得られる。

この実施例および後続の実施例において蛋白質の除去率
は溶液中の出発蛋白質のうち涙液中に回収できなかった
ものの％として表わされる。計算は次式により行われる
。

この式において ＰｆはＰ液画分中の蛋白質（〜）であり、Ｖｆは涙液画
分の容積（−）でちゃ、 Ｐｉは溶液中の初期蛋白質（■）であり、Ｖｉは初期溶
液容積（−）である。

表　　　３ 濾過性に与える影響 なし　　　なし　　　１２．５　　０．９１　０．１８
樹脂Ｂ　　　樹脂Ａ （０，１０％）　　（０，１０％）　　　２０−３　　
０．８９　０．０８（０，２５％）　　（０，１０％）
　　　２９．８　　０．８８　０．１４実施例４゜ （Ａ）本質的には実施例１に記載したと同様にして細胞
培養を４８時間行った。得られた乾燥細胞重量は４２／
ｌであった。発酵ブイヨン１ｔに樹脂Ａを、次いで樹脂
Ｂを、それぞれ最終的に０．２５％および０．１０％濃
度になるように添加した。対照試料は発酵ブイヨンｌｔ
であった。

（Ｂ）バエ上Ｚ−−ンフオルぐス細胞および凝集構造物
（混合樹脂、全細胞および媒地成分を含む）を７．００
０１’で１０分間の遠心分離により上記（Ａ）の対照お
よび処理済み試料から分離した。

粒状物質、全細胞、またはフロックを蒸留水１ｔで洗浄
し、１０分間遠心分離し、初期試料と同容積（１ｔ）で
蒸留水に再懸濁させた。水懸濁した全細胞（対照）およ
び水懸濁したフロックを実施例１に記載したものと同じ
カートリッジを用いて限外濾過することにより濃縮した
。平均フラックス量を弄４に示す。樹脂ＡとＢの組合わ
せが７ラツクス量を大幅に高めたことが認められるであ
ろう。

表　　　４ 混合イオン交換樹脂フロックがバチルス・ライケニフオ
ルミス水懸濁液のフラックス量に与える影響 （洗浄細胞） 樹脂Ａ（０，２５％）　　　　　　　　１０４十 実施例５゜ 実施例４の操作を本質的な点すべてにおいて反りした。

ただし実施例４に記載した調製物の上層液の限外濾過能
を測定した（表５）。組合わせ樹脂により得られた実質
的な改良が容易に認められる。

表　　　５ 粗製および樹脂処理済み全細胞ブイヨンの無粒子上層液
の限外濾過 対照　　　　　　　　　　　８．１３ 樹脂Ａ（０，２５％）　　　　２８．５十 樹脂Ｂ（０，１０％） 実施例６、 実施例５の操作を本質的な点すべてにおいて反復した。

たたし樹脂Ａを、次いで樹脂Ｂを、無細胞上層液にそれ
ぞれ０．２５％および０．１０％ノ最終濃度で添加した
。イオン交換処理された無細胞上層液の限外濾過性が改
良されたことが聚６に示される。

宍　　　６ 組合わせ樹脂で処理した無細胞上層液の限外濾過 対照（無細胞上層液）　　　　　　　　８．１３樹脂Ａ
（０，２５％）　　　　　　　　２２．８＋ 樹脂Ｂ（０，１０％） 実施例７゜ バエ止五ＰＡＡＴＣＣ２１５３６の全細胞を、デンプン
２％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％、リン酸
−カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、お
よび炭酸す）　ＩＪウム１％を含有する液体培地上で３
７℃、ｐＨ１０，０において３日間増殖させた。ブイヨ
ン試料中の細胞を沈殿させ、細胞ペレットを洗浄し、こ
れを８０℃で３０時間乾燥させ、秤量することにより測
定した最終乾燥細胞濃度は４．６ｔ／ｌであった。培養
終了時に粗発酵ブイヨン１ｔを実施例１および３に記載
したと同様に限外濾過により濃縮した。用いた樹脂およ
び結果を表７に示す。これは樹脂Ａを発酵培地に添加し
た場合に７ラツクス撞が実質的に改良されたことを示す
。すなわち、樹脂Ａによりあらかじめ形成されたフロッ
クに樹脂Ｂを添加することによりフラックス量が５９．
３％増加した。

表　　７ なし　　　　　　　１４．１　　　　０．９４樹脂Ａ（
０，１％）　　　　　１９．９　　　　　０．９３樹脂
Ａ（０，１％） ＋ 樹脂Ｂ　（０，０４％）３）．７　　　　　０．８５実
施例８゜ 実施例７の操作を反復した。ただし全発酵ブイヨンを室
温で、０．１μｍの細孔をもつ中空繊維テ過モジュール
（ロミコンＨＦ−１−４７ＭＰ）を用いるミクロフィル
トレージョンによシ濃縮した。

このモジュールは内径１．１朋、底面積９３０ｃがおよ
び長さ４０ｃｍの繊維２５本を含んでいた。平均フラッ
クス量を測定し、樹脂Ａをバチルス属菌発酵ブイヨンに
添加した際に得られた値と比較した。測定結果を表８に
示す。これから対照に比して５５％のフラックス量の改
善が得られたことが認められる。

懺　　８ なし　　　　　　　　　　１５．４ ０．０５　　　　　　　　　　　２８．７０．１０　　
　　　　　　　　　２３．９実施例９゜ 実施例８の操作を反復した。ただし他の微小陰イオン交
換樹脂を４日後の濃度のバチルス属菌発酵ブイヨンに用
いた。ミクロフィルトレージョンに際して得た平均フラ
ックス量を表９に示す。これは本発明に有用な微細樹脂
の添加によって実質的な改善が得られることを示す。

表　　　９ 樹脂Ａ（０，１０％）　　　（Ｌ１２　　　　　３）．
９樹脂Ｃ（０，１０％）　　　０．２２　　　　　３２
．７樹脂Ｄ（０，１８％）　　　１．０　　　　　　２
６．２実施例１０゜ ｔ）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，０）に懸濁
した。４ｔずつの２区分を本発明に有用な樹脂で、まず
９１０に示した量の樹脂Ａを添加し、次いで同表に示し
た量の樹脂Ｂを添加することによって処理した。処理済
み区分および未処理＠１＠液を実施例１の記載と同様に
限外濾過することにより濃縮した。結果な懺ｌＯに示す
。樹脂のふ加によりフラックス量が５３％および８２％
増加した。

宍　　　１０ なし　　　　　　　　　　　　３８．４樹脂Ａ（０，０
０１％） ＋ 樹脂Ｂ（０，０００４％）　　　　　　　５８．８樹脂
Ａ（０，０Ｏ５％） ＋ 樹脂Ｂ（０，００２％）６９゜９ 実施例１１゜ 実施例１０の操作を反復した。ただし酵母細胞懸濁液を
実施例８に記載したと同様にミクロフィルトレージョン
により濃縮した。表１１は樹脂Ａならびに組合わせ樹脂
ＡおよびＢが平均フラックス量に与える形番を示す。

宍　　　１１ なし　　　　　　　　　　　３５．０ 樹脂Ａ（０，００５％）　　　　　　　５０．５樹脂Ａ
（０，００５％） ＋ 樹脂Ｂ（０，００２％）　　　　　　　５７．０実施例
１２゜ 実施例１１の操作を反復した。ただし０．５ｒ／ｌのウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を酵母細胞懸濁液に添
加し、蛋白質除去率を測定した。嚢１２は組合わせ帯電
樹脂ＡおよびＢがフラックス量および蛋白質除去率を改
善しうろことを示す。

＊　　　１２ なし　　　　　　　４５．５　　　　０．７５樹脂Ａ（
０，００１％） 十

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）細胞培養液に、モノマー単位当たり０．１
   〜１．５個の官能基を保有し、約０．０１〜約２．５μ
   ｍの平均直径をもつ第１帯電粒状物質を有効量添加して
   培養液中に懸濁物を形成させ、そして （ｂ）この懸濁物を含有する培養液をメンプランフイル
   トレーシヨンする ことを特徴とする細胞培養液の成分をメンプランフイル
   トレーシヨンにより分離するための改良法。
2. （２）工程（ａ）において、第１帯電粒状物質を培養液
   に導入したのち、第１粒状物質のものと反対の電荷を保
   有し、モノマー単位当たり０．１〜１．５個の官能基を
   保有し、約０．０１〜約２．５μｍの平均直径をもつ第
   ２帯電粒状物質の有効量を培養液に導入する特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。
3. （３）第１粒状物質が陰イオン交換樹脂である特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）陰イオン交換樹脂が約１．５μｍ以下の平均粒子
   直径をもつ特許請求の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）第１粒状物質が陰イオン交換樹脂であり、第２粒
   状物質が陽イオン交換樹脂である特許請求の範囲第２項
   に記載の方法。
6. （６）陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂が約１
   ．５μｍ以下の平均粒子直径をもつ特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。
7. （７）第１粒状物質が強塩基性であり、第２粒状物質が
   強酸性である特許請求の範囲第２項に記載の方法。
8. （８）細胞培養液が発酵ブイヨンからなる特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。
9. （９）細胞培養液が発酵ブイヨンからなる特許請求の範
   囲第２項に記載の方法。
10. （１０）発酵ブイヨンが細菌のものである特許請求の範
    囲第８項に記載の方法。
11. （１１）発酵ブイヨンが細菌のものである特許請求の範
    囲第９項に記載の方法。
12. （１２）発酵ブイヨンが酵母のものである特許請求の範
    囲第８項に記載の方法。
13. （１３）発酵ブイヨンが酵母のものである特許請求の範
    囲第９項に記載の方法。
14. （１４）第２帯電粒状物質の導入後に、培養液の固体成
    分を培養液から分離し、第２の水性液体培地に再懸濁さ
    せ、次いでメンプランフイルトレーシヨン処理する特許
    請求の範囲第２項に記載の方法。
15. （１５）第２帯電粒状物質の導入後に、培養液の固体成
    分を培養液から分離し、次いでこの培養液をメンプラン
    フイルトレーシヨン処理する特許請求の範囲第２項に記
    載の方法。