JPH01104161A - 雑種細胞および雑種植物体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 産業上の利用分野 本発明は、雑種細胞および雑種植物体に関するものであ
る。

従来の技術 植物の改良は、おもに交配すなわち性的交雑により行な
われている。しかし、性的交雑では同種間あるいはごく
狭い範囲の近縁種との間でしか雑種は得られず、導入で
きる形質も限られていた。

すなわち、種の壁が性的交雑による植物改良の障壁とな
っていた。

しかし、延部ら（Ｔａｋａｂｅ　ｅｔ、ａｌ、　（１９
７１）Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ　５８
．３１８−３２０　）により、細胞壁をもたぬ細胞であ
るプロトプラストから植物体を再生することができるこ
とが証明され、さらにプロトプラストを融合させて得た
雑種細胞からも植物体を再生させることができることが
示され（Ｃａｒｌｓｏｎ　Ｐ、Ｓ、　ｅｔ、ａｌ、　（
１９７２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ　８９．２２９２−２２９４）で
以来、性的交雑が不可能な組み合わせにおいても、細胞
融合による雑種作出が試みられた。その結果、ポマトと
して有名なバレイシーｓ　（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅ
ｒｏｓｕｍ　Ｌ、）とトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏ
ｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　Ｍｉｌｌ、すなわち、栽培
種のトマト）との雑種植物体が作出された（Ｍｅｌｃｈ
ｅｒｓ　ｅｔ、ａｌ、　（１９７８）　Ｃａｒｌｓｂｅ
ｒｇ　Ｒｅｓ。

Ｃｏｎ＋ｍｕｎ、　４３．２０３−２１８　）。

しかし、このボマトは先駆的産物であるとの栄誉は担う
ものの、本発明者らの知るところでは未だ完成されたも
のとはいい難い。すなわち、得られる雑種植物は、これ
をバレイショの変種としてみたときには生成する塊茎は
短小であるうえ、この雑種植物はつぎ木をしなければ圃
場で生育しないので、ジャガイモ栽培種と対抗すること
は困難である。また、このバレイショに導入された筈の
トマト由来の形質も、親トマトが栽培種のものであるこ
とに相当して、上記の問題点を相殺するほどに魅力的な
ものではない。

その後、より実育種に踏み込んだ細胞融合による雑種植
物体がタバコ（Ｋｕｉａｓｈｌｒｏ　ａｎｄ　Ｋｕｂ。

（１９８６）　Ｊａｐａｎ、　ノ、Ｂｒａｅｄ、、　　
３８．２８４−２９０）　、）７ト（大野ら（１９８５
）育種学雑誌、３５巻、別冊２、＋４−１５　）　、バ
レイショ（ＡｕｓＬｉｎ、　ｅＬ、　ａｌ、　（１９８
５）Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ、　３９．７５−８２
）などで作出され、特にバレイショでは互いに交配不能
な栽培種（Ｓ、　Ｌｕｂｅｒｏｓｕｏ＋　ｔ、、）と野
生種（Ｓ、　ｂｒｅｖｉｄｅｎｓ　Ｌ、）との細胞融合
による雑種が作出され、この雑種を栽培種に戻し交雑し
て、ジャガイモ葉巻きウィルス抵抗性の子孫が得られて
いる（Ａｕｓｔｌｎ　ｅｔ、ａｌ。

（１９’８６）、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、、　７Ｌ　６８２−６９０　）。

しかし、これらはすべて同属内での組みあわせで得られ
た種間雑種であって、属の壁をこえて有用性に富む細胞
融合によるバレイショとの雑種植物体が得られた報告は
ない。

トマト属野生種には、耐病性、環境ストレス耐性等バレ
イシフ育種上の有用形質を多々持つものがあり、特にり
、　ｐ１ｍｐｆｎｅｌｌｆｆ’ｏｌｆｕｍは青枯病、軟
腐病、疫病、炭そ病、葉かび病、斑点病、萎ちょう病、
輪紋病などの病害抵抗性、また耐暑性等の環境ストレス
抵抗性をもち（Ｃ，Ｍ、　Ｒｉｃｋ　（１９８２）Ｐｌ
ａｎｔ　　ＩＩｌｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｓｏｎ
＋ａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

ｐｐｌ−２８，Ａｃａｄｅｇ＋１ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉ
ｎｃ、および山川（１９８３）研究ジャーナル、８　、
　Ｎｏ、８．２８−３１　）　、バレイショ育種への有
用性に富んでいる。また、バレイショも耐冷性、低温着
果性などトマト育種上の有用形質をもつ。

しかし、バレイシ！　（Ｓ、　ｔｕｂｅｒｏｓｕｌｌ）
とトマト野生種（Ｌ、　ｐ１ｍｐｉｎｅｌｌｌｆ’ｏｌ
ｉｕｍ　）とは交配しても種子は得られず、Ｌ、　ｐｉ
ｍｐｌｎｅｌｌｌｆｏｌｉｕｉの有用特性をバレイショ
に導入することは不可能な状況にある。

〔発明の概要〕

発明が解決しようとする問題点 上ｇ己のよう１こ、Ｌ、　ｐｉＢｌｎｅｌｌｌｆ’ｏｌ
ｉｕｍおよびＳ。

ｔｕｂｅｒｏｓｕＩＩは、それぞれ数多くの有用形質を
持つにもかかわらず、両者は交配不能のため、その有用
形質を相互に活用することができなかった。

この問題を解決したのが、本発明である。

問題点を解決するための手段 本発明者は、Ｌ、　ｐ１ｍｐｌｎｅｌｌｌｌ’ｏｌｉｕ
ｍとＳ。

ＬｕＬ＋ｅｒｏｓｕｍとの融合雑種細胞の培養、および
増殖した雑種細胞からの雑種植物体作出について鋭意検
討した結果、雑種細胞の増殖、および増殖した雑種細胞
からの雑種植物体作出に成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明による雑種細胞は、バレイショ（Ｓｏ
ｌａｎｕｏ＋　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｌ、）の細胞とト
マト野生種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｅｏｎ　ｐｌｍｐｉｎ
ｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ　（Ｊｕｓｔ、）Ｍｉｌｌ、　’
）の細胞との細胞融合によって得られた、分裂増殖能を
有する、ものである。

本発明によるこの雑種細胞は、個々の細胞またはその細
胞由来カルスの外に、再分化した植物体の形態であって
もよい。

従って、本発明は植物体に関するものでもあって、この
植物体は、バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｎ＋Ｌｕｂｅｒｏ
ｓｕ＋＋＋　Ｌ、）の細胞とトマト野生種（Ｌｙｃｏｐ
ｅｒｓｌｃｏｎ　ｐ［ＩＩｐｉｎｅｌｌｌｆ’ｏｌｌｕ
ｎ＋　（Ｊｕｓｌ、）　Ｍｉｌｌ、）の細胞との細胞融
合によって得られた分裂増殖能を有する雑種細胞から再
生させて得たもの、である。

効果 Ｓ、　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍとり、　ｐｉｍｐｉｎｅｌｌ
ｌｆｏｌｉｕｍとの細胞融合による雑種細胞が得られて
、その再生分化生成物としての雑種植物体が作出された
ことによって、これまでいかなる手段をとっても不可能
であったり、　ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｌｆ’ｏｌｊｕｎ＋
のもつ有用形質をバレイショに導入することができる。

また、本発明の雑種植物体は、交配によりり、　ｐｉｍ
ｐｉｎｅｌｌｉｆ’ｏｌｉｕ＋ｎのもつ有用形質をバレ
イショに導入する利用法の他に、本発明の植物体を素材
に、種々の細胞工学的手法を施すことによりさまざまな
変異を誘導し、新たなさらに有用な育種素材や、その植
物自体が有用作物であるところの新型植物を作出すこと
もできる。

〔発明の詳細な説明〕

雑種細胞および雑種植物体 雑種細胞 本発明による雑種細胞は、先ず、バレイショ（Ｓ、　ｔ
ｕｂｅｒｏｓｕＩＩＩＬ、　）の細胞とトマト野生種（
Ｌ、　ｐｉｍｐｉｎｃｌｌＨ’ｏｌｌｕａ＋　（ｊｕｓ
ｌ、）　Ｍｉｌｌ、　）の細胞との細胞融合によって得
られたものである。

Ｓ、　ｔｕｂｅｒｏｓｕｒａは、一般に栽培されている
バレイショ（品種名二男しゃく、メイクイーン、紅九な
ど）である。

Ｌ、　ｐｌＩＩｌｐｉｎｃｌｌｉｆｏｌｉｕｍは、トマ
トの野生種であり、トマト育種に最も利用されている植
物である。

Ｌ、　ｐｉｍｐｉｎｅｌ１１ｆ’ａｌｌｕｍの原産地は
南アメリカのペルー、エクアドルである。本植物は、例
えばＴＩＩＥ　　Ａｓ１ａｎ　　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　
　Ｒｅ、５ｅａｒｃｈ　　ａｎｄ　　ＤｅｖｅｌｏｐＩ
ＩｅｎｔＣｅｎＬｅｒ　　（Ｓｈａｎｈｕａ、　　Ｔａ
１ｎａｎ、　　Ｔａｉｗａｎ、　　Ｒｅｐｕｂｌｊｃ　
　ｏｆＣＩ＋１ｎａ）より入手することができる。

そして、この雑種細胞には、これが雑種細胞であるとこ
ろから、これら両親のそれぞれの遺伝情報の少なくとも
一部が、活性を持つ状態で存在している。従って、たと
えば、この雑種細胞はそれを再生させて生じる雑種植物
体にバレイショ由来の耐冷性、低温着果性、塊茎形成性
などの特性のうち少なくともひとつの特性を、またトマ
ト野生種由来の青枯病、軟腐病、疫病、炭そ病、葉がび
病、斑点病、萎ちょう病、輪紋病などの病害抵抗性、ま
た耐暑性などの特性のうち少なくともひとつの特性を、
それぞれもたらす。特に、バレイショの育種において、
トマト野生種 （１，、ｐｉｍｐｉｎｅｌｌＲｏｌｉｕｍ　）の有する
青枯病、軟腐病、疫病および炭そ病に対する抵抗性をを
する雑種細胞は有用である。

本発明による雑種細胞は、分裂増殖能を有するものであ
る。植物育種の観点からは、雑種細胞はそれを再生させ
て雑種植物体を得ようとするためのものであるから、雑
種細胞は植物体への分化が可能であるように分裂増殖能
を持つものでなければならないが、プロトプラスト経由
の細胞融合法による場合には、そのような分裂増殖能を
持つ雑種細胞は、少なくともバレイショとトマト野生種
のとの間には知られていなかったのであって、本発明に
よってはじめて現実のものとなったのである。

このような雑種細胞から再生させて得られる本発明によ
る雑種植物体は、前記したように、両親由来の遺伝形質
のそれぞれ少なくとも一つを持つものである。すなわち
、この雑種植物体は、前記したように、バレイショ由来
の耐冷性、低温着果性、塊茎形成性などの特性のうち少
なくとも一つの特性を、またトマト野生種由来の青枯病
、軟腐病、疫病、炭そ病、葉かび病、斑点病、萎ちょう
病、輪紋病などの病害抵抗性、また耐暑性などの特性の
うち少なくともひとつの特性を、それぞれ具備している
。特に、バレイショ育種において、トマト野生種（Ｌ、
　ｐ１ｍｐｉｎｅｌｌｌｆ’ｏｌｉｕｍ　）の有する青
枯病、軟腐病、疫病および炭そ病に対する抵抗性を有す
る雑種植物体は有用である。

雑種細胞および雑種植物体の作成 作成工程 本発明による雑種細胞および雑種植物体は、下記の工程
からなる方法によって作出することができる。

（イ）　プロトプラストの調製工程、 （ロ）　プロトプラストの融合処理工程、（ハ）　融合
プロトプラストからのコロニー形成工程、 （ニ）　コロニーからの不定芽形成工程、および（ホ）
　植物体再生工程。

各工程の詳細は下記の通りである。なお、各工程で使用
する培地は、無機塩、ショ糖、植物ホルモン、ビタミン
等を含むものであって、装置（Ｖａｓｉｌ　（１９８４
）　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｏａ＋ａｔ
ｉｃＣｅｌｌ　Ｇａｎｅｌｌｃｓ　ｏｆ’　Ｐｌａｎｔ
ｓ、　Ｖｏｌ、　１．３２８−４０４）などに詳しい。

（イ）　プロトプラストの調製工程 プロトプラストを得るための植物の器官としては若い展
開葉を用いることが多いが、必要に応じて子葉、茎、花
粉、カルスなどを用いることができる。

プロトプラストを単離する方法は慣用のものであって、
例えばセルラーゼ、ペクチナーゼ等の細胞壁溶解酵素液
中で供試材料を２〜３時間処理し、更に精製して、プロ
トプラストを取得する。この酵素処理の前に、供試材料
をショ糖、無機塩、植物ホルモン等を含む培地で６時間
以上培養する処理（上記酵素処理の前処理）を行うとよ
り良い結果が得られることが多い。

この酵素処理の前処理に用いる培地（前処理培地）とし
ては、例えば、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｉｈｇｅａｎｄ　
Ｓｋｏｏｇ　（１９８２）　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　ＰＩａ
ｎＬ、１５　。

４７８−４９７）、Ｂ−５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９６８）ＩＥＸｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ
、、　５０．１５１−１５８）　　などの無機塩および
ビタミン類からなる培地に、１０〜５０ｇ／Ωのショ糖
、０．１〜５ｍｇ／Ｎの１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
等のオーキシン類および０．１〜５ｆｆｌｆｃ／１の６
−ベンジルアデニン（Ｂ　Ａ）等のサイトカイニン類を
添加したものを用いることができる。

（ロ）　プロトプラストの融合処理工程上記の方法によ
り、Ｓ、　ｔｕｂｃｒｏｓｕｒａおよびり。

ｐｉｍｐｉｎｅｌ　ｌｉｌ’ｏｌｌｕＩＩｌから調製し
たプロトプラストを１０〜１０Ｂ細胞／ｍ１程度の濃度
で０．　５Ｍ？ニトール溶液に懸濁させ、これに２０％
ポリエチレングリコール（Ｍ、Ｗ、３Ｂ５０）　、およ
び１０％ＤＭＳＯ（すなわち、ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌ
ｆ’ｏｘｉｄｅ　）を含む０．５Ｍマニトール溶液を滴
下し、２０分間インキュベーションして、プロトプラス
トの融合を開始させる。

その後、慣用の高ｐＨ高濃度カルシウム溶液（Ｋｃｌｌ
ｃｒ　ａｎｄ　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ　（１９７１）　Ｚ、
　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ。

２８Ｂ　、　７３７−７４１　）により希釈することに
よって、細胞融合したプロトプラストが得られる。この
融合処理は、電気パルスによっても行なうことができる
（Ｚｉｍｉｅｒｓａｎｎ　（１９８２）　Ｂｌｏｃｈｅ
Ｉｌ、　ＢＩｏｐｈｙｓ。

ＡｃＬａ、、　８９４．２２７−２７７　）。

（ハ）　融合プロトプラストからのコロニー形成工程 得られた雑種細胞を含むプロトプラストをプロトプラス
ト培養培地にて培養すると、プロトプラストは細胞壁を
再生し、分裂増殖してコロニー（細胞小集塊）を形成す
る。得られたコロニーは、コロニー増殖培地で培養する
ことによって、不定芽誘導に適切な大きさのコロニーと
なるまで増殖させる。

プロトプラスト培養培地としては、前記底置記載の培地
の他に、例えば、ＭＳ培地の無機塩（ただし、アンモニ
ウム塩２０ｍｇ／ｌ以下）およびビタミン類からなる培
地に２〜１０ｇ：／ＩＩのグルコース、２〜１０ｇ／Ｉ
Ｉのショ糖、５０〜１００ｇ／ｌのマニトール、０．　
０１〜ｌｒｎｇ／Ｉの２．４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）、０．１〜ｌｌｌ１ｇ／ｇの１−ナフタ
レン酢酸（ＮＡＡ）および０．０１〜２ＩＩ１ｇ／ｇの
ＢＡ等のサイトカイニン類を添加したものを用いると、
より良い結果が得られることが多い。また、コロニー増
殖培地としては、前記底置記載の培地の他に、例えば、
ＭＳ培地の無機塩（ただし、アンモニウム塩は５０〜５
００ｍｇ／Ｎ）およびビタミン類からなる培地に３〜５
０ｇ／ｆ！のショ糖、０〜９０ｇ：／ＩＩのマニトール
、０．０５〜１■／１のＮＡＡ等のオーキシン類および
０．　１〜２ｍｇ／ＮのＢＡ等のサイトカイニン類を添
加したものを用いると、良い結果が得られることが多い
。さらに、添加するホルモン類として、オーキシン類の
量に対し、サイトカイニン類の量が多くなるような比率
で添加した場合に、より好ましい結果が得られる。

（ニ）　コロニーからの不定芽形成工程前記工程で得ら
れたコロニーを不定芽誘導培地に移植して、不定芽を形
成させる。

不定芽誘導培地としては、前記底置記載の培地の他に、
例えば、ＭＳ培地の無機塩（ただし、アンモニウム塩は
５０〜１０００ｍｇ／ｌ　）およびビタミン類からなる
培地に５〜５０ｍ１／ｌのココナツミルク、１〜１０ｇ
／Ωのショ糖、１０〜５０ｇ／ＩＩのマニトール、０．
１〜０．５ｍｇ／Ｒのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）
等のオーキシン類（ただし、２．４−Ｄは除く）および
０．　５〜５ｆｆ１ｇ／ｊ７のゼアチンを添加したもの
を用いると、より良い結果が得られることが多い。

（ホ）植物体再生工程程 不定芽をＭＳホルモン無添加培地（Ｍｕｒｕｓｈｉｇｅ
ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　（１９８２）　　Ｐｈｙｓｉｏｌ
、　Ｐｌａｎｔ、　１５゜４７３−４９７　）等適切な
培地に移植して、植物体を再生させる。

雑種性の確認 細胞融合により作出された雑種植物体の雑種性の確認の
方法としては、■アイソザイム解析、■制限酵素による
葉緑体ＤＮＡないしミトコンドリアＤＮＡの解析、■ｒ
ＤＮＡ解析、■葉、花、毛など植物体の形態などがあっ
て、底置に詳しい（たとえば、Ｇｌｅｂａ　ａｎｄ　５
ｙｔｎｉｋ　（１９８４）　Ｐｒｏｔｏｐｌａ　　　　
Ｓｔ　Ｆｕｓｉｏｎ、　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｒ，Ｓｈ
ｏｅｍａｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、、お
よびＵｃｈｌｍｉｙａ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）　
Ｔｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　６４．１１７−１１８　
）。

また、雑種植物体を構成する個々の細胞の雑種性を確認
する方法として、雑種植物体のプロトプラストからさら
に再生した植物体について雑種性を確認する方法（クロ
ーニング）もある。

実験例 実施例 ■　融合雑種細胞の作出と雑種植物体の再生（１）プロ
トプラスト単離材料にはＭＳホルモン無添加培地にて、
２５℃、１６時間日長下、腋芽増殖したバレイシａ　（
Ｓ、　ｔｕｂｅｒｏｓｕｉ）およびトマト野生種（Ｌ、
　ｐｌａ＋ｐｉｎｅｌｌｉｆ’ｏｌｉｕＩ＋１）の葉を
用いた。

（２）各材料の葉細片を、酵素処理に先立って前処理培
地（表１）にて２５℃／暗黒下／１０〜４０時間の培養
に付した。

（３）前処理した葉細片を０．５Ｍマニトール液中で１
時間室温でインキュベーションした後、０．５Ｍマニト
ール、１％セルラーゼオノヅカＲＳ、０．１％ペクトリ
アーゼＹ２３、ｐＨ５，５の酵素液中で２５℃／３〜４
時間のインキュベーションを行なって、プロトプラスト
を単離した。

（４）単離されたそれぞれのプロトプラストを０．５Ｍ
マニトール液で洗浄後、５０ｍＭＣａ　Ｃ１・２　Ｈ２
０を含む０．５Ｍマニ）−ル液に、１：１の割合で約１
０６細胞／ｍｌの濃度に懸濁させ、０．５ｍｌづつシャ
ーレに分注した。

（５）約１０分静置後、１０％ＤＭＳＯ１１０ｍＭ　　
Ｃａ　Ｃ１２ｅ２　Ｈ２０−および０．３Ｍマニトール
を含む２０％　ＰＥＧ　（すなわちｐｏｌｙｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　　、Ｍ、Ｗ、　３３５０　）溶液
を０．５ｍ１滴下した。

（８）２０分静置後、５分間隔で２回、０．２Ｍマニト
ール、１００ｍＭ　　ＣａＣｌ２”２Ｈ２０゜および３
ｍＭ　　ＣＡＰＳ （すなわちｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａａ＋１ｎｏｐｒｏｐ
ａｎｅ　５ｕｌｌ’ｏｎｌｃａｃｉｄ）を含む高ｐＨ液
（ｐＨ１０，０）を０．３ｍｌずつ滴下した。

（７）さらに２０分間静置後、１０分間隔でプロトプラ
スト培養培地（表１）を１ｍｌずつ４回滴下して、融合
プロトプラストを作出した。

（８）融合プロトプラストをプロトプラスト培養培地（
表１）に移し、２５℃／暗黒下／７〜１０ロ間の培養に
付して、プロトプラスト由来のコロニーを得た。また（
４）〜（７）の操作のかわりに慣用法（前記Ｚ１ｍｎ＋
ｅｒｍａｎｎの文献参照）に従い、電気パルスによって
融合プロトプラストを作出し、同様にプロトプラスト由
来のコロニーを得た。

（９）得られたコロニーをコロニー増殖培地（表１）に
移し、２５℃／１６時間日長下の培養に付した。なお、
コロニーの生長に応じて、適宜コロニー増殖培地（表１
）を添加した。

（１０）　　直径２〜３ｍ１１に生長したコロニーのう
ち、形態的に雑種細胞のコロニーと思われるものを選ん
で不定芽誘導培地（表１）に移植した。その後、２５℃
／１６時間日長下の培養に付して、不定芽を誘導した。

（１１）得られた不定芽を、ホルモン無添加のＭＳ培地
に移植して、植物体を再生させた。

（１２）再生した植物体をポットに移植して、生育させ
た。

■　雑種性の確認 前記の方法で別々のコロニーより再生させた植物約２０
０系統を供試して、その雑種性を検定した。また、対照
として、雑種植物作成の両親に用いたバレイショ（Ｓ、
　ｔｕｂｅｒｏｓｕｉ）およびトマト野生種（Ｌ、　Ｐ
１ｍｐｉｎｅｌｌｉｆ’ｏｌｉｕｉ　）を供試した。

（１）ＭＤＨおよびＡＳＴのアイソザイムの解析各植物
の葉０．１ｍｇを５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，５
，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を
含む）中ですりつぶし、この摩砕液を遠心分離し、得ら
れた上清をアガロースフィルム中で電気泳動し、ＭＤＨ
（すなわちｉａｌａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　
）およびＡＳＴ　（すなわちａｓｐａｒｔａｔｅ　ａｍ
ｉｎｏｔｒａｎｓｒｅｒａｓｅ）の各酵素基質により染
色して、アイソザイムを解析した。

このＭＤＨおよびＡＳＴのアイソザイム解析には、Ａｕ
ｔｈｅｎｔ！　Ｋｉｔ　（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｈ
ｅ＋ｍ１ｓｔｒｙ、　Ｉｎｃ。

製）を使用し、方法もそのマニュアルに従った。

その結果、ＭＤＨのアイソザイム解析では、バレイショ
で２本、Ｌ、　ｐｆｍｐｆｎｅ１１ｆｌ’ｏｌｌｕｏ＋
で１本のそれぞれ移動度の異なるバンドが検出され、供
試した系統のうち、１３４系統でそれぞれ両親のバンド
と同じ移動度を持つ３本のバンドが検出された。ＡＳＴ
のアイソザイム解析では、バレイショおよびり、　ｐｉ
ｍｐｉｎｅｌｌｌｆｏｌｉｕａ＋とも多数のバンドが検
出されたが、上記１３４系統ではそれぞれ両親に特異的
なバンドと同じ移動度を持つバンドを併せ持っていた。

以上の結果より、この１３４系統はバレイショとり、　
ｐ１ｍｐｌｎｅｌｌｌｆ’ｏｌＪｕｎ＋の雑種であるこ
とが確認された。１３４系統のうち、１１系統（系統Ａ
−Ｋ）のアイソザイム解析結果を表２に示した。

（２）形態の解析 上記のアイソザイム解析により選出した１３４系統につ
いて、葉毛および葉の形態をそれぞれ顕微鏡および肉眼
で観察した。

その結果、葉毛の形態はいずれの系統においてもほぼバ
レイショ型であった。しかし、葉毛の密生度については
、バレイショ程度のものからバレイショに比べるとかな
り密生度の低いものまであった。葉形はバレイショ型に
近いものから、１４、ｐｉｍｐｉｎｅｌ　ｌ　Ｒｏｌ　
ｉｕｍ型に近いものまで種々のものがあった。

系統Ａ−にの１１系統については、それらの観察結果を
表２に示した。

添付の第１〜６図は葉の写真であって、それぞれバレイ
ショ、Ｌ、　ｐｉｍｐｉｎｃｌｌｉｆｏｌｉｕｍ　、系
統Ａ〜Ｄ１を示す。

（３）染色体数の解析 Ｃｏｎｎ’ｓ　Ｂｌｏｌｏｇｌｃａｌ　５ｔａ１ｎｓ　
（Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｌｉ１ｌｉｅ（１９７７）　４
７６−４７９．　Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｌ
ｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、）に記載されている方法に従い、各
植物の板端をカルノア液で固定後、アセトカーミン液で
染色し、押しつぶし法で染色体を観察した。その結果、
バレイショでは４８本、Ｌ、　ｐ！ｍｐｉｎｅｌｌｌｌ
’ｏｌｉｕｍでは２４本、の染色体が観察された。一方
、供試した系統では、いずれも両親の染色体数より多く
、両親の染色体数の合わせた本数の染色体を持っている
系統もあった。系統Ａ〜にの観察結果を第２表に示した
。

（４）クローニング 系統ＡおよびＤについて、再生植物体から実施例Ｉの（
１）〜（３）と同じ方法でプロトプラストを単離し、各
プロトプラストを実施例Ｉの（８）〜（９）と同じ方法
で培養して、多数のプロトプラスト由来のコロニーを得
た。これらのコロニーカラ無作為に系統ＡおよびＤ由来
のコロニーをそれぞれ５０個づつ供試し、ＭＤＩアイソ
ザイムを実施例■の（１）と同じ方法で解析した。その
結果、すべてのコロニーが、バレイショおよびトマト野
生種（Ｌ、　ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｌｆ’ｏｌｉｕｍ　）
にそれぞれ特有のアイソザイムを併せ持っていた。この
ことから、系統ＡおよびＤは、それぞれバレイショおよ
びトマト野生種（Ｌ、　ｐｉｍｐｌｎｅｌｌｉｆｏｌｌ
ｕｍ　）の雑種細胞で構成されていることが明らかとな
った。

■、雑種植物の特性 （１）圃場生育性 本発明で得られた雑種植物には、草分が強く、つぎ木な
しで圃場で旺盛に生育する系統が多数あった。添付の第
７図および第８図は圃場で生育させた系統Ｇの植物体の
写真である。

（２）　　亡花、結実性 本発明で得られた雑種植物には、旺盛に開花し、結実す
る系統があった。また、１株で４０個以上の果実をつけ
た系統もあり、各果実中には多数の種子が入っていた。

系統Ａ−にの種子形成能について、表２に示した。

第９〜１２図は系統Ｇの写真であって、それぞれ開花状
況、着果状況、果実および果実内より取り出した種子、
を示す。

（３）塊茎形成能 本発明で得られた雑種植物では塊茎形成能を有している
ことが多数の系統で確認された。系統Ａ〜にの塊茎形成
能を表２に示した。雑種植物に形成された塊茎の一例と
して、系統Ｃに形成されたものを第１３図（左：対照バ
レイショ、右：系統Ｃ）に示す。系統Ｃの塊茎は萌芽し
く第１４図）、再び土壌生育可能な完全な植物体に生育
した。

（４）青枯病抵抗性 ポットにて生育させた植物の根の先端をナイフにて切断
し、切断口のところへ青枯病に罹病したバレイショより
分離した青枯病菌 （Ｐｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕ
ｍ）の懸濁液を滴下した。その後、植物体を２６℃／１
６時間日長下／１４日間栽培することにより、抵抗性検
定を行なった。その結果、バレイショでは、下の葉から
黄変し、その後、急激に萎凋して、青枯病特有の病徴を
示した。

一方、Ｌ、　ｐｉｎ＋ｐｉｎｅｌｌｌｆｏ１１ｕｎ＋は
青枯病に罹ることなく順調に生育した。また、供試した
雑種植物でも多数の青枯病に抵抗性を示゛す多数の系統
が確認された。本検定結果の一部を表２に示した。

（５）軟腐病抵抗性 ポットにて生育させた植物の葉にナイフで傷をつけ、そ
こに軟腐病に罹ったバレイショより分離した軟腐病菌（
Ｅｒｗｉｎｌａ　ｅａｒｔｏｖｏｒａ　５ｕｂｓｐ。

ｃａｒｔｏｖｏｒａ　）の懸濁液を滴下した。その後、
約２ジ より、抵抗性検定を行なった。その結果、バレイショで
は、植物体全体が軟化腐敗し、軟腐病特有の病徴が観察
された。

一方、Ｌ、　ｐｉＩＩｌｐｌｎｅｌｌｌｆｏｌｉｕｍは
軟化腐敗することなく順調に生育した。また、供試した
雑種植物でも軟腐病抵抗性を示す多数の系統が確認され
た。

本検定結果の一部を表２に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第６図は、実施例のプロトプラスト単離材料と
同じ条件で、試験管内で無菌栽培中の植物の葉の写真で
ある。第１図はバレイショ（Ｓ、ｔｕｂｅｒｏｓｕｎ　
）　、第２図はトマト野生種（Ｌ、　ｐＩｍｐｆｎｅ１
口ｆＯＩｉｕｒａ）、第３図〜第６図はそれぞれ実施例
に示した系統Ａ−Ｄ、の葉の写真である。 第７図〜第１２図は、実施例に示した系統Ｇの写真であ
る。第７図および第８図は圃場で生育しているところの
植物体、第９図は開花状況、第１０図は着実状況、第１
１図は果実、第１２図は果実内より取り出した種子、の
写真である。 第１３図および第１４図は、実施例に示した系統Ｃの写
真である。第１３図は塊茎（左：対照バレイショ、右：
系統Ｃ）、第１４図は塊茎の萌芽、の写真である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 鳥７図 □ ）ＩＩＩｊａ図 地１１図 声１２図 嶌１３図 Ｐ５１４図 手続補正書（方式） 昭和６３年１０月２８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バレイシヨ（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ
   ．）の細胞とトマト野生種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ
   ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ（Ｊｕｓｌ．）Ｍｉ
   ｌｌ．）の細胞との細胞融合によって得られた、分裂増
   殖能を有する、雑種細胞。 ２、バレイシヨ（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ
   ．）の細胞とトマト野生種（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ
   ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ（Ｊｕｓｌ．）Ｍｉ
   ｌｌ．）の細胞との細胞融合によって得られた分裂増殖
   能を有する雑種細胞から再生させて得たものである、雑
   種植物体。