JP7906015B2 - 抗体の最適化 - Google Patents

Description

本発明は、医薬品の分野に属する。より具体的には、本発明は、治療用抗体及びそのコンジュゲートを開発、設計、及び産生する方法を提供する。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、抗体又は抗体薬物コンジュゲートの開発可能性の改善、例えば、粘度及び／又は凝集の低減を提供する。

治療用抗体は、多数の疾患を治療するために開発されてきた。治療用抗体の開発において直面する一般的な課題としては、例えば、高粘度、凝集、低溶解度、半減期の延長、及び免疫原性が挙げられる。これらの課題のうちのいくつかは、治療用抗体の安定性に影響を与える可能性があり、送達のために製剤化する場合に更に深刻になる可能性がある。治療用抗体は一般に静脈内（intravenous、ＩＶ）注入を介して投与されるが、皮下投与は、より効果的な薬物動態プロファイル、頻繁な長期投薬を必要とする慢性疾患にとって重要である自己投与の選択肢など、ＩＶを上回るいくつかの利点を提供する。更に、皮下投与は、すぐに使用できる充填済み送達デバイスを可能にし、より大きな患者の快適さ、治療時間の短縮、コンプライアンスの潜在的な改善、治療転帰、及びコストの低減を提供する。

しかしながら、皮下投与に好適な治療用抗体製剤の開発は、複数の課題があり、特に、皮下投与に利用可能な限られた体積は、高度に濃縮された抗体溶液を必要とする。高度に濃縮された抗体溶液は、粘度の増加及び／又は凝集をもたらし得る。高粘度は、注射時間及び注射部位での痛みを増加させ、患者のコンプライアンスに影響を与える可能性があり、また、バイオプロセス中に原薬を不安定化し、薬物動態プロファイル、生物活性、製造コストの増加、及び薬物の開発の前進の潜在的な妨げに影響を与える可能性がある。同様に、高濃度溶液への傾向によりタンパク質間相互作用の可能性が高くなり、それによって凝集が促進されるため、凝集は大きな問題である。

抗体治療薬の粘度を低減させるアプローチが研究されている。そのような方法には、ｐＨの調整、緩衝剤条件、イオン強度、又は他の賦形剤の添加などの製剤条件の改変が含まれる。しかしながら、これらの方法は、より広範な抗体治療薬についての粘度の問題への対処において限定されることが証明されている。例えば、いくつかの例では、製剤条件を改変することは、製造、衝撃安定性、凝集、免疫原性、及び／又は薬物動態プロファイルにおいて余分なプロセス工程を必要とする場合があり、これらの全ては、コストがかかり、抗体治療薬の開発を妥協する可能性がある。更に、粘度を低減させるためにＩｇＧ１の可変領域におけるアミノ酸配列を最適化する試みが報告された（Ｔｏｍａｒ ａｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ ２０１６，８（２）：２１６－２２８）。しかしながら、そのような方法は、最適化される特定の抗体可変領域に限定される。したがって、高濃度で治療用抗体の粘度を低減させる更なる方法であって、その方法が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体などの広範な抗体治療薬にわたって適用可能であり、目的の特定の治療薬に限定されず、そのような方法が、親和性、安定性、凝集、免疫原性、又は生物学的機能に負の影響を及ぼさず、コストのかかるプロセス又は製剤の変更を必要としない、方法が依然として必要とされている。

時間延長のために抗体のＦｃ部分にペプチドを融合するなど、ペプチド及び小タンパク質の半減期を改善するためのアプローチが研究されている。いくつかの例では、そのような方法は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインから構成される抗体ＦｃのＮ又はＣ末端上でのより小さなタンパク質又はペプチドの発現を含む。この種類の融合は、例えば、腎クリアランスを減少させることによって半減期を改善することができる。しかしながら、そのような融合は、融合タンパク質の粘度の増加又はｐＨ安定性の減少をもたらす可能性があり、これは、大幅な製剤最適化又はペプチド若しくはタンパク質配列の更なる操作を必要とする可能性がある。

したがって、本開示は、高濃度での抗体又は抗体薬物コンジュゲートの粘度を低減させ、かつ／又は半減期を改善することなどによって、抗体治療薬の開発可能性を改善するための代替組成物及び方法を提供することによって、上記の必要性のうちの１つ以上に対処する。具体的には、本開示は、抗体の定常領域を改変することを含む組成物及び方法を提供し、その方法は、抗体親和性、凝集、及び／若しくは安定性、又はエフェクター機能などの生物学的機能に負の影響を及ぼさないか、又は製剤及び下流の製造プロセスにおいてコストのかかる変更を必要としない。より具体的には、本開示は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体治療薬などの抗体治療薬の幅広いプラットフォームにわたって適用可能であり得る、抗体のＩｇＧ重鎖定常ドメインにおけるアミノ酸置換を含む組成物及び方法を提供する。

したがって、特定の実施形態では、本開示は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｅ１３７Ｇ、Ｄ２０３Ｎ、Ｑ２７４Ｋ、Ｑ３５５Ｒ、Ｅ４１９Ｑ（全ての位置は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）のうちの１つ以上を含む改変されたヒトＩｇＧ重鎖（heavy chain、ＨＣ）定常領域を有する抗体を提供する。したがって、特定の実施形態では、本開示は、定常重鎖１（constant heavy chain 1、ＣＨ１）ドメイン、定常重鎖２（constant heavy chain 2、ＣＨ２）ドメイン、及び定常重鎖３（constant heavy chain 3、ＣＨ３）ドメインを含むヒトＩｇＧ ＨＣ定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖（light chain、ＬＣ）定常領域と、を含む、抗体であって、ヒトＩｇＧ ＨＣ定常領域が、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；又はＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギンを含む、抗体を提供する。

特定の実施形態では、本開示は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｅ１３７Ｇ、Ｄ２０３Ｎ、Ｑ２７４Ｋ、Ｑ３５５Ｒ、Ｅ４１９Ｑ、Ｒ４０９Ｋ（全ての位置は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）のうちの２つ以上を含む改変されたヒトＩｇＧ重鎖（ＨＣ）定常領域を有する抗体を提供する。したがって、特定の実施形態では、本開示は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｅ１３７Ｇ、Ｄ２０３Ｎ、Ｑ２７４Ｋ、Ｑ３５５Ｒ、Ｅ４１９Ｑ、Ｒ４０９Ｋ（全ての位置は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）のうちの３つ以上を含む改変されたヒトＩｇＧ重鎖（ＨＣ）定常領域を有する抗体を提供する。

いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ ＨＣ定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、抗体であって、ヒトＩｇＧ ＨＣ定常領域が、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；又はＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、抗体を提供する。

更なる実施形態によれば、本開示は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ ＨＣ定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、抗体であって、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、抗体を提供する。

更なる実施形態では、本開示の抗体は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）及び軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）を含み、ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、インビボでＩｇＧ４ Ｆａｂアーム交換を低減させる、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ番号付け）を含む改変されたヒトＩｇＧ４ヒンジ領域を含む（Ｌａｂｒｉｊｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，２７（８）：７６７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、Ｆｃエフェクター機能が低減又は排除された改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有する（すなわち、ＩｇＧ４ Ｆｃエフェクターヌル（effector null））。そのような抗体は、例えば、ＦｃγＲへの結合を低減するために、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域にアミノ酸残基改変Ｆ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａを含む（全ての残基は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、残基２２８にプロリンを含むＩｇＧ４ヒンジ領域と、残基２３４及び２３５にアラニンを含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域と、を含む（全ての残基は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、配列番号８、９、１０、１２、１３、又は１６のうちのいずれか１つを含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む。

いくつかの実施形態において、本開示はまた、本明細書に開示される抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、抗体の粘度を低減させ、かつ／又は安定性を改善する改変されたヒトＩｇＧ ＨＣ定常領域を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体又は抗体薬物コンジュゲートは、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む野生型抗体と比較した場合、低減された粘度を有する。本開示の更なる実施形態では、抗体又は抗体薬物コンジュゲートの粘度は、野生型抗体と比較した場合、約２５パーセント～約８０パーセント低減される。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、野生型ヒトＩｇＧ４ ＨＣ定常領域と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｅ１３７Ｇ、Ｄ２０３Ｎ、Ｑ２７４Ｋ、Ｑ３５５Ｒ、Ｅ４１９Ｑ（全ての位置は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）のうちの１つ以上を含む改変されたヒトＩｇＧ４ ＨＣ定常領域を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、野生型ヒトＩｇＧ４ ＨＣ定常領域と比較して、以下のアミノ酸置換：Ｑ２７４Ｋ、Ｑ３５５Ｒ、Ｅ４１９Ｑのうちの１つ以上を含む改変されたヒトＩｇＧ４ ＨＣ定常領域を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体又は抗体薬物コンジュゲートは、抗体の粘度を約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約１００％低減させる改変されたヒトＩｇＧ４ ＨＣ定常領域を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、患者への送達のために治療的に許容される粘度を有する。そのような実施形態では、粘度は、１４ｃＰ未満、１２ｃＰ未満、又は１０ｃＰ未満である。いくつかの実施形態では、抗体は、皮下投与又は静脈内投与によって投与される。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、以下のアミノ酸残基：Ｅ１３７Ｇ、Ｄ２０３Ｎ、Ｑ２７４Ｋ（全ての位置は、ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）のうちの１つ以上を含む改変されたヒトＩｇＧ２ ＨＣ定常領域を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、アミノ酸残基Ｑ２７４Ｋ（ＥＵ番号付けに従って番号付けされる）を含む改変されたヒトＩｇＧ３ ＨＣ定常領域を有する。そのような実施形態では、ヒトＩｇＧ２抗体及び又はヒトＩｇＧ３抗体は、野生型ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ３重鎖定常領域を含むそれぞれの野生型抗体と比較した場合、低減された粘度を有する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＩｇＧ４抗体の粘度を低減させる方法であって、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、ヒトＩｇＧ４抗体のバリアントを生成することを含み、改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；又はＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及びＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギンを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＩｇＧ４抗体の粘度を低減させる方法であって、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、ヒトＩｇＧ４抗体のバリアントを生成することを含み、改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；又はＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＩｇＧ４抗体の粘度を低減させる方法であって、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、ヒトＩｇＧ４抗体のバリアントを生成することを含み、改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及びＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体をコードする核酸配列が提供される。本開示のいくつかの実施形態では、抗体のＨＣ又はＬＣをコードする核酸が提供される。本開示のいくつかの実施形態では、抗体のＶＨ又はＶＬをコードする核酸が提供される。本開示のいくつかの実施形態は、抗体ＨＣ又はＬＣをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。本開示のいくつかの実施形態は、抗体ＶＨ又はＶＬをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。

本開示の核酸は、例えば、核酸が発現制御配列に作動可能に連結された後に、宿主細胞において発現され得る。作動可能に連結された核酸の発現が可能な発現制御配列は、当該技術分野において周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進する１つ以上のシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。目的の核酸（例えば、抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸）を含む発現ベクターは、周知の方法、例えば、安定的又は一過性のトランスフェクション、形質転換、形質導入又は感染によって宿主細胞に移植され得る。追加的に、発現ベクターは、所望の核酸配列で形質転換された宿主細胞の検出を助けるために、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ等の１つ以上の選択マーカーを含み得る。

別の態様において、本明細書に記載の核酸、ベクター、又は核酸組成物を含む細胞、例えば宿主細胞が本明細書に提供される。宿主細胞は、本明細書に記載の抗体の全部又は一部分を発現する１つ以上の発現ベクターで安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染された細胞であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本開示の抗体のＨＣ及びＬＣポリペプチドを発現する発現ベクターで、安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体のＨＣポリペプチドを発現する第１のベクター及びＬＣポリペプチドを発現する第２のベクターで安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染され得る。そのような宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞は、本明細書に記載のヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する抗体を発現し得る。抗体を発現することができることが知られている哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、及びＮＳ０細胞が含まれる。

いくつかの実施形態では、細胞、例えば、宿主細胞は、本明細書で提供される抗体をコードする核酸配列を含む第１のベクター及び第２のベクターを含む。更なる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。

本開示は、上記の宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞を、抗体が発現されるような条件下で培養し、発現された抗体を培養培地から回収することによって、本明細書に記載の抗体又はその抗体結合断片を産生するためのプロセスを更に提供する。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術によって精製され得る。タンパク質精製の様々な方法が採用され得、そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３－８９（１９９０）、及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載される。

本開示は、本明細書に記載のプロセスのうちのいずれかによって産生される抗体又はその抗体結合断片を更に提供する。

別の態様では、本明細書に記載の抗体、核酸、又はベクターを含む医薬組成物が本明細書で提供される。そのような医薬組成物はまた、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含み得る。医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法によって調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．（２０１２），Ａ．Ｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）。

いくつかの実施形態では、本開示は、療法における使用のための抗体及び抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態は、本開示は、医学的状態の治療における使用のための抗体及び抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、医学的状態は、がん、心血管疾患、自己免疫疾患、又は神経変性疾患である。

更なる実施形態では、本開示は、がん、心血管疾患、自己免疫疾患、又は神経変性疾患の治療のための薬剤の製造における抗体及び抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。

更なる実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示される抗体又は抗体薬物コンジュゲートを投与する方法であって、抗体又は抗体薬物コンジュゲートが、静脈内投与される、方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示される抗体又は抗体薬物コンジュゲートを投与する方法であって、抗体又は抗体薬物コンジュゲートが、皮下投与される、方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性若しくは多重特異性抗体、又はコンジュゲート抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であってもよい。

本明細書で互換的に使用される「抗体コンジュゲート」又は「コンジュゲートされた抗体」又は「抗体薬物コンジュゲート」という用語は、抗体又はその断片の複合体を指し、断片は、抗体の抗原結合断片又はその抗体の定常ドメイン断片、及び非抗体分子を含み得る。一実施形態では、抗体及び非抗体分子は、リンカーによって接続される。

「非抗体分子」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子ではない分子を指す。一実施形態では、非抗体分子は、２つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドである。更なる実施形態では、非抗体分子は、小分子薬物である。更なる実施形態では、非抗体分子は、オリゴヌクレオチドである。

更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、化学的に改変される。

例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成された免疫グロブリンＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖の各々のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成される。定常領域とは、抗体重鎖のＦｃ領域及びＣＨ１ドメインを含む、抗体の領域を指す。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に更に分割され得る。定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに基づく。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９９１）。ＥＵインデックス番号付け又はＥＵ番号付けという用語は、本明細書では互換的に使用される。

ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework regions、ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域に更に細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））、又はＩＭＧＴ（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照されたい）に記載のものを含む周知のスキームに従って実行され得る。Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲ定義は、本明細書に記載のヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する抗体について使用される。

本開示の実施形態にはまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄ断片などの抗体断片又は抗原結合断片が含まれ、これは、例えば、Ｆｃ領域又はＩｇＧ重鎖定常領域に融合され得る。

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む抗体の領域を指す。任意選択で、Ｆｃ領域は、抗体重鎖のヒンジ領域の一部分又はヒンジ領域全体を含み得る。エフェクター機能などの生物活性は、抗体のアイソタイプによって異なるＦｃ領域に起因する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（antibody-dependent cell mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方制御（例えば、Ｂ細胞受容体）、及びＢ細胞活性化が挙げられる。

本明細書で言及される「野生型」抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体の天然Ｆｃを含む天然重鎖定常領域と、天然軽鎖定常領域と、を含む、抗体である。

本明細書で使用される「結合する」という用語は、別段の定めがない限り、化学結合又は別のタンパク質若しくは分子との引力相互作用を形成するタンパク質又は分子の能力を意味することを意図しており、当該分野において既知である一般的な方法によって決定されるように、２つのタンパク質又は分子の近接をもたらす。

本明細書で互換的に使用される「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチド、改変されたヌクレオチド、及び／又はヌクレオチドの類似体を組み込んだ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡ分子などの一本鎖及び／又は二本鎖ヌクレオチド含有分子を含むヌクレオチドのポリマーを指す。本開示のポリヌクレオチドはまた、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は合成反応によってその中に組み込まれた基質を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、限定されるものではないが、ヒト、チンパンジー、類人猿、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモットなどを含む哺乳動物を指す。好ましくは、対象はヒトである。

本明細書で使用される「阻害する」という用語は、例えば、生物学的応答又は活性の低減、低下、減速、減少、停止、破壊、抑止、拮抗、又は遮断を指すが、必ずしも生物学的応答の完全な排除を示すわけではない。

本明細書で使用される「治療」又は「治療すること」という用語は、本明細書に開示される障害若しくは疾患の進行の減速、制御、遅延、若しくは停止、又は障害、若しくは疾患の症状の改善であり得る全てのプロセスを指すが、必ずしも全ての障害又は疾患の症状の完全な排除を示すわけではない。治療は、患者、特に、ヒトにおける疾患又は状態の治療のためのタンパク質又は核酸又はベクター又は組成物の投与を含む。

本明細書で使用される「約」という用語は、５％以内を意味する。

本明細書で使用される場合、本開示の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語及び同様の用語は、本明細書で別段の定めがない限り、又は文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、抗体であって、前記ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；又は
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギンを含む、抗体。
２．ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含み、前記ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；又は
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、上記１に記載の抗体。
３．前記ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、上記２に記載の抗体。
４．前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、上記１～３のいずれかに記載の抗体。
５．前記抗体が、ヒトＩｇＧ２抗体、ヒトＩｇＧ３抗体、又はヒトＩｇＧ４抗体である、上記１～４のいずれかに記載の抗体。
６．前記抗体が、ヒトＩｇＧ４抗体である、上記５に記載の抗体。
７．配列番号８、９、１０、１２、１３、又は１６のうちのいずれか１つを含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む、抗体。
８．上記１～７のいずれかに記載の抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート。
９．前記抗体又は抗体薬物コンジュゲートが、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む野生型抗体と比較して、低減された粘度を有する、上記１～７のいずれかに記載の抗体又は上記８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
１０．前記粘度が、前記野生型抗体と比較した場合、約２５パーセント～約８０パーセント低減される、上記９に記載の抗体又は抗体薬物コンジュゲート。
１１．ヒトＩｇＧ４抗体の粘度を低減させる方法であって、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、前記ヒトＩｇＧ４抗体のバリアントを生成することを含み、前記改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン；又は
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、及び前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギンを含む、方法。
１２．前記改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン；
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；又は
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、上記１１に記載の方法。
１３．前記改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：
前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミンを含む、上記１１又は１２に記載の方法。
１４．前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、上記１１～１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記バリアントヒトＩｇＧ４抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを生成することを更に含む、上記１１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．前記抗体が、野生型ヒトＩｇＧ４抗体と比較して、低減された粘度を有する、上記１１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記粘度が、前記野生型ヒトＩｇＧ４抗体と比較した場合、約２５パーセント～約８０パーセント低減される、上記１６に記載の方法。
１８．上記１～７のいずれかに記載の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする配列を含む、核酸。
１９．上記１８に記載の核酸を含む、ベクター。
２０．上記１９に記載のベクターを含む、細胞。
２１．前記細胞が、哺乳動物細胞である、上記２０に記載の細胞。
２２．抗体を産生するプロセスであって、前記抗体が発現されるような条件下で、上記２１に記載の細胞を培養することと、前記発現された抗体を培養培地から回収することと、を含む、プロセス。
２３．上記２２に記載のプロセスによって産生される、抗体。
２４．上記１～１０又は２３のいずれかに記載の抗体又は抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、医薬組成物。
２５．上記１～１０又は２３のいずれかに記載の抗体又は抗体薬物コンジュゲートをそれを必要とする対象に投与する方法であって、前記抗体が、前記対象に皮下投与される、方法。

ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４重鎖ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインについてのアミノ酸配列アラインメントを示し、ＧＮＫＲＱアミノ酸残基を強調している。 ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４重鎖ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインについてのアミノ酸配列アラインメントを示し、ＧＮＫＲＱアミノ酸残基を強調している。 ＨＣ ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにおいてＫＲＱアミノ酸置換を有する及び有さないヒトＩｇＧ４Ｐ抗体バリアントの示差走査熱量測定（differential scanning calorimetry、ＤＳＣ）サーモグラムを比較する。 ＩｇＧ４Ｐ抗体の重鎖ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにおけるＫＲＱアミノ酸置換が、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くＩｇＧ４Ｐ抗体に対して、Ｃ１ｑ Ｅｌｉｓａ結合親和性に影響を及ぼさないことを示す。 ＩｇＧ４Ｐ抗体の重鎖ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにおけるＫＲＱアミノ酸置換が、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くＩｇＧ４Ｐ抗体に対して、ＡＤＣＣ活性に影響を及ぼさないことを示す ＩｇＧ４Ｐ抗体の重鎖ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにおけるＫＲＱアミノ酸置換が、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くＩｇＧ４Ｐ抗体に対して、ＣＤＣ活性に影響を及ぼさないことを示す。 ＩｇＧ４Ｐ抗体の重鎖ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにおけるＫＲＱアミノ酸置換が、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くＩｇＧ４Ｐ抗体に対して、Ｂ細胞（６Ａ）又は単球細胞（６Ｂ）における細胞結合に影響を及ぼさないことを示す。 ＩｇＧ４Ｐ抗体の重鎖ＣＨ１及びＣＨ２ドメインにおけるＫＲＱアミノ酸置換が、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くＩｇＧ４Ｐ抗体に対して、Ｂ細胞（６Ａ）又は単球細胞（６Ｂ）における細胞結合に影響を及ぼさないことを示す。

実施例１：抗体の生成及び操作
抗体の操作、発現、及び精製：例示された抗体分子１、２、３、４、５、６、及び７を重鎖（ＨＣ）定常ドメインにおいて操作して、ＦａｂとＦｃとの間の潜在的な静電相互作用を軽減するための電荷平衡化を介して粘度を改善した。ヒトＩｇＧ４抗体のＨＣ ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＨＣ定常ドメインと比較した場合、不均一な電荷分布に起因して、より低い等電点（ｐＩ）を有する（表１）。ＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインにおける５つのアミノ酸残基が、電荷平衡に影響を与えることが特定された：１）Ｅ１３７（ＣＨ１ドメイン）、２）Ｄ２０３（ＣＨ１ドメイン）、３）Ｑ２７４（ＣＨ２ドメイン）、４）Ｑ３５５（ＣＨ３ドメイン）、及び５）Ｅ４１９（ＣＨ３ドメイン）。ヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域とのヒトＩｇＧ４ ＨＣ定常領域のアラインメント（図１）は、これらのアミノ酸残基の類似位置が、ヒトＩｇＧ１ ＨＣ定常領域において異なることを示し、各ドメインの全体的なｐＩに影響を及ぼすことが見出された。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４ ＨＣ定常領域のアラインメント（図１）もまた、ＧＮＫＲＱアミノ酸の類似位置がある特定の位置で異なることを示した。

ＩｇＧ４抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインの両方のｐＩをＩｇＧ１抗体に一致させるため、及び免疫原性ペプチドの潜在的な導入を最小化するために、ＩｇＧ４ Ｆｃにおける５つの特定された位置のうちの３つでの残基を、ＩｇＧ１野生型Ｆｃにおいて見出された対応する残基に変換した。アミノ酸残基置換には、２７４位の中性荷電のグルタミンに対して置換された正荷電のリジン（Ｑ２７４Ｋ）、３５５位の中性荷電のグルタミンに対して置換された正荷電のアルギニン（Ｑ３５５Ｒ）、及び４１９位の負荷電のグルタミン酸に対して置換された中性荷電のグルタミン（Ｅ４１９Ｑ）が含まれた。得られたＩｇＧ４ Ｆｃを「ＫＲＱ」と称した。ＩｇＧ４のＣＨ１ドメインのｐＩをＩｇＧ１のｐＩに一致させるために、１３７位及び２０３位の残基を、ＩｇＧ１野生型ＣＨ１ドメインに見出される対応する残基に変換した。アミノ酸置換には、１３７位の負荷電のグルタミン酸に対して置換された中性荷電のグリシン（Ｅ１３７Ｇ）、及び２０４位の負荷電のアスパラギン酸に対して置換された極性のアスパラギン（Ｄ２０３Ｎ）が含まれた。５つのアミノ酸置換全てを有する得られたＩｇＧ４ Ｆｃを、「ＧＮＫＲＱ」と称した。

更に、「ＲＱ」と称されるＣＨ３ドメインのみに焦点を当てたＱ３５５Ｒ及びＥ４１９Ｑアミノ酸置換を含む二重変異体、並びにＣＨ２ドメインに焦点を当てたＱ２７４Ｋアミノ酸置換を含む単一変異体も評価した。

分子１～６のバリアントを生成するために、ＩｇＧ４ Ｆｃの２つのバージョンを利用した：１）ヒンジを安定化し、アーム交換を防止するＳ２２８Ｐアミノ酸残基置換を有するＩｇＧ４ Ｆｃは、「ＩｇＧ４Ｐ」と称され、又は２）「ＩｇＧ４ＰＡＡ」と称された、エフェクター機能を最小化することが知られているＦ２３４Ａ及びＬ２３５Ａアミノ酸置換と組み合わせてＳ２２８Ｐアミノ酸残基置換を有するＩｇＧ４ Ｆｃ。分子１～６の各々の可変ドメインを、ＩｇＧ４ＰＡＡ Ｆｃ、ＩｇＧ４ＰＡＡ ＫＲＱ Ｆｃ、ＩｇＧ４ＰＡＡ ＧＮＫＲＱ Ｆｃ、及び野生型ＩｇＧ１ Ｆｃにクローニングして、６つの分子の各々について、それぞれの抗体バリアントを生成した。分子７については、可変ドメインを、ＩｇＧ４Ｐ Ｆｃ、ＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ Ｆｃ、及びＩｇＧ４ＰＡＡ ＫＲＱ Ｆｃにクローニングした。分子７のバリアントはまた、抗体薬物コンジュゲート（antibody drug conjugate、ＡＤＣ）の生成において小分子のための結合点として使用された、重鎖の１２４位及び３７８位の操作されたシステイン（本明細書において「ｅＣｙｓ」と称される）を含んだ。分子１～７の各々について、ヒトＩｇＧ４及びＩｇＧ１の野生型ＣＨ１ドメインを、それぞれ、野生型及びＫＲＱバリアントにおいて使用し、一方、軽鎖可変ドメインを、全ての分子についてヒトカッパ定常領域上にクローニングし、一致ペアを一緒に発現させて、粘度及び生物物理学的評価のために必要な無傷の抗体を生成した（図１－ＩｇＧ４Ｐ ＧＮＫＲＱ ｅＣｙｓを参照されたい）。

分子１～７の抗体バリアントは、当該技術分野で周知の方法によって合成、発現、及び精製され、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovarian cells、ＣＨＯ）などの適切な宿主細胞は、２つのベクターが使用された場合、所定のＨＣ：ＬＣベクター比、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードする単一ベクター系を使用する、抗体を分泌するための発現系で、一過性又は安定的のいずれかでトランスフェクションされた。抗体が分泌された清澄培地を、一般的に既知の技術を用いて精製した。分子１～７の抗体バリアントについてのＨＣ定常ドメイン及びヒンジ配列を表２に示す。アミノ酸置換を有する及び有さない各重鎖ドメインについての理論的ｐＩ（ｐＩは、分子の正味電荷が中性であるｐＨである）を、当該技術分野で周知のソフトウェア分析方法を使用して計算及び比較した（多くの場合、翻訳後クリッピングを受けるＣ末端リジンなしで、全て計算された）。

表１に示される結果は、ｈＩｇＧ４抗体バリアントの個々の重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの理論的ｐＩが、野生型ＩｇＧ４と比較した場合、ＩｇＧ４ ＨＣ定常領域に導入されたアミノ酸置換の結果として、それぞれのＩｇＧ１ドメインのｐＩと同様の値まで増加したことを示す。

実施例２：例示された抗体バリアントの生物物理学的特性
分子１～７についての例示された抗体バリアントの生物物理学的特性を評価した。

固有粘度：例示された分子１～６の抗体バリアントを、５ｍＭのヒスチジン、２８０ｍＭのマンニトール、ｐＨ６緩衝液（Ｈ６Ｍ）中で１３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、分子７のバリアントを、１２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質濃度を調製し、可変経路長ＳｏｌｏＶＰＥ装置（ＣＴｅｃｈ）を使用してそのまま定量した。各抗体の固有粘度を、９回の反復測定の平均を使用して、１５℃でＶＲＯＣ（登録商標）イニシウム（initium）（ＲｈｅｏＳｅｎｓｅ）を使用して測定した。最小の３５μＬを、２７μＬの試料引き抜きで使用し、システムを自動試験モードに設定して、これをＢ０５チップ上に注射し、流量を調節してフルスケールの５０％の圧力読み取り値を達成した。

表３に示される結果は、分子１、３、４、及び６についてのＩｇＧ４ＰＡＡ ＫＲＱ抗体バリアントが、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くそれぞれのＩｇＧ４ＰＡＡバリアントと比較した場合、約７４％～約３０％の範囲の粘度の有意な低減を有したことを示す。更に、驚くべきことに、６つのＩｇＧ４ＰＡＡ ＫＲＱ抗体バリアントのうちの５つ（分子２、３、４、５、６について）は、それぞれのＩｇＧ１バリアントと比較した場合、粘度の低減を示した。特に、分子２、３、及び４についてのＩｇＧ４ＰＡＡ ＫＲＱバリアントは、それぞれのＩｇＧ１バリアントと比較した場合、約８２％～約４８％の範囲の粘度の低減を示した。ＫＲＱアミノ酸置換を欠くそれぞれのＩｇＧ４ＰＡＡバリアントと比較した場合、ＣＨ１ドメインにおけるＥ１３７Ｇ及びＤ２０４Ｎ変異の付加を有する、分子１、３、４及び６についての粘度の更なる改善が観察された。ＩｇＧ４ＰＡＡに対する初期粘度が置換前に低かった分子２及び５については、ＫＲＱ置換と比較した場合、ＣＨ１置換の付加による利益は観察されなかった。しかしながら、驚くべきことに、６つのＩｇＧ４ＰＡＡ ＧＮＫＲＱ抗体バリアントのうち５つ（分子１、２、３、４、６）は、それぞれのＩｇＧ１バリアントと比較した場合、粘度の低減を示した。特に、分子３、４及び６についてのＩｇＧ４ＰＡＡ ＫＲＱバリアントは、それぞれのＩｇＧ１バリアントと比較した場合、約８３％～約５５％の範囲の粘度の低減を示した。

更に、表４に示される結果は、分子７のＩｇＧ４Ｐ ＧＮＫＲＱ ｅＣｙｓ（９．６ｃＰ）、ＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ（１１．６ｃＰ）、ＩｇＧ４Ｐ ＲＱ ｅＣｙｓ（１４．９ｃＰ）、及びＩｇＧ４Ｐ Ｋ ｅＣｙｓ（２１．０ｃＰ）抗体バリアントが、ＧＮＫＲＱアミノ酸置換のうちのいずれかを欠く分子７のＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ（４３ｃＰ）バリアントと比較した場合、それぞれ約７８％～約５１％の粘度の低減を有し、したがって、変異の組み合わせの相加効果を示していることを示した。

ｃＰ＝センチポアズ

抗体薬物コンジュゲートフォーマットでの分子７の抗体バリアントの固有粘度：分子７の抗体バリアントＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ、ＩｇＧ４Ｐ ＧＮＫＲＱ及びＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓの固有粘度を、抗体薬物コンジュゲートフォーマットで試験した。簡単に述べると、分子７のＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ、ＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ、及びＩｇＧ４Ｐ ＧＮＫＲＱ抗体バリアントの重鎖における１２４位及び３７８位の操作されたシステインを使用して、短いリンカーを有する親油性小分子を使用した抗体薬物コンジュゲートを生成した。コンジュゲーションは、還元剤ジチオスレイトールの存在下での短い還元、続く、還元剤を除去するための脱塩工程、及びデヒドロアスコルビン酸の存在下での短い酸化工程によって行った。還元工程及びその後の脱塩工程は、細胞培養発現中に起こる、重鎖の１２４位及び３７８位の操作されたシステイン上の任意のシステイニル化を除去した。酸化工程は、ヒンジにおける２つのジスルフィド対及び重鎖と軽鎖との間の１つのジスルフィド対を含む天然のジスルフィド結合を再形成した。次いで、操作されたシステイン残基の遊離チオールと反応するマレイミドベースの化学を使用して、小分子を抗体にコンジュゲートした。本質的に上記のとおり、粘度を測定した。

表５に示される結果は、分子７のＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ ＡＤＣ（１２．２ｃＰ）及び分子７のＩｇＧ４Ｐ ＧＮＫＲＱ ｅＣｙｓ ＡＤＣ（１０．２ｃＰ）が、ＧＮＫＲＱアミノ酸残基置換を欠く分子７のＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ ＡＤＣ（５９２ｃＰ）と比較した場合、それぞれ４８倍及び５８倍の粘度低減を有したことを示し、したがって、変異の組み合わせの相加効果を示している。

ｃＰ＝センチポアズ

熱安定性：示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、例示された分子１～７のバリアントの熱変性に対する安定性を評価した。ＤＳＣは、Ｍａｌｖｅｒｎ ＭｉｒｃｏＣａｌ ＶＰ－ＤＳＣ装置を使用して実行した。試料を、２０℃から１１０℃まで６０℃／時間の一定速度で加熱した。分析方法を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ自動分析プログラムを使用して実施した。ベースライン補正が実施され、Ｔｏｎｓｅｔ及びＴＭ１が決定された。ＣＨ２、ＣＨ３、及びＦａｂを含む３つのドメインのアンフォールディングの転移温度は、ＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ又はＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓのいずれについても十分に解消されなかったが、分子７のＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ及びＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体バリアントの熱融解温度をＰＢＳ、ｐＨ７．２緩衝液中で測定した。

表６及び図２に示される結果は、アミノ酸残基ＫＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体の熱安定性に負の影響を及ぼさなかったことを示す。

熱凝集の開始（thermal aggregation、Ｔａｇｇ）：高感度キャピラリーを備えたＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｐａｎｔａ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、固有蛍光（Intrinsic fluorescence、ＩＦ）及び光散乱測定を実施した。試料を、ＰＢＳ、ｐＨ７．２緩衝液中に０．５ｍｇ／ｍＬで調製し、凝集の開始（Ｔａｇｇ）を、１℃／分の一定速度で２０～９５℃の温度勾配を使用して決定した。ＰＲ Ｐａｎｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｘ６４）ソフトウェア（Ｖ１．０．２）を使用して、凝集の開始を、ベースラインから０．５％増加の閾値を用いて、３８５ｎｍでの後方反射シグナルに基づく２状態適合を使用して決定した。

表６に示される結果は、凝集の開始が分子７のＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓとＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ抗体バリアントとの間で同等であったことを示し、したがって、アミノ酸残基ＫＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体の熱安定性に負の影響を及ぼさなかったことを示している。

全ての値は摂氏度（℃）である

温度ストレス時の凝集：例示された分子のバリアントの経時的な溶液安定性を、賦形剤を含む一般的な５ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０緩衝液中、約１００ｍｇ／ｍＬで評価した。濃縮試料を５℃及び３５℃で、それぞれ４週間の期間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、試料を、サイズ排除クロマトグラフィ（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）で、高分子量種のパーセンテージ（high molecular weight、％ＨＭＷ）について分析した。

表７に示される結果は、ＫＲＱアミノ酸残基置換が５℃又は３５℃のいずれかで４週間の期間にわたって凝集に有意に影響を及ぼさなかったことを示し、具体的には、結果は、ＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体の高濃度溶液の安定性が、ＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ抗体バリアントと同等であることを示した。

凍結／解凍安定性を、－７０℃に置かれた大量のバルク原薬の凍結／解凍条件を模倣する、３回繰り返される、緩慢な制御された温度サイクルを使用して評価する。試料を、５ｍＭのヒスチジン、２８０ｍＭのマンニトール、０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ６（Ｈ６ＭＴ）、及び５ｍＭのヒスチジン、２８０ｍＭのスクロース、０．０５％のＰＳ８０、ｐＨ６（Ｈ６ＳＴ）の両方において評価した。インキュベーション後、試料を、分析用サイズ排除クロマトグラフィ（analytical size exclusion chromatography、ａＳＥＣ）で、高分子量種のパーセンテージの変化（Δ％ＨＭＷ）について分析した。試料はまた、相分離又は沈殿形成について視覚的に検査された。

表７に示される結果は、アミノ酸残基ＫＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体の凍結／解凍安定性に影響を及ぼさないことを示す。具体的には、分子７のＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体バリアントは、Ｈ６ＭＴにおいてΔ３．４％ＨＭＷ及びＨ６ＳＴにおいてΔ０．５％ＨＭＷを示し、これは、３回の凍結解凍サイクル後にａＳＥＣによって測定された場合に、Ｈ６ＭＴにおいてΔ２．５％ＨＭＷ及びＨ６ＳＴにおいてΔ０．３％ＨＭＷを示したＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ抗体と同等である。目視観察は、ＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ又はＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ抗体バリアントのいずれについても、任意の層分離又は沈殿を示さなかった。

溶解度：溶解度は、１００ｍｇの抗体バリアントを、３０ｋＤａ分子量カットオフの遠心フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）で約０．５ｍＬの体積に濃縮することによって評価した。Ｓｏｌｏ ＶＰＥ分光光度計（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって、試料の最終濃度を測定した。インキュベーション後、試料を、分析用サイズ排除クロマトグラフィ（ａＳＥＣ）で、高分子量（％ＨＭＷ）種のパーセンテージについて分析した。試料はまた、相分離又は沈殿形成について視覚的に検査された。

表７に示される結果は、Δ０．６％ＨＭＷを示す分子７のＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体バリアントが、ａＳＥＣによって測定された場合に、Δ０．４％ＨＭＷを示す分子７のＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ抗体と同等であることを示す。目視観察は、ＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ又はＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓのいずれについても、任意の層分離又は沈殿を示さなかった。

生物物理学的分析は、アミノ酸残基ＫＲＱをＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに導入することが、ＫＲＱアミノ酸置換を欠くＩｇＧ４Ｐ抗体と比較した場合に、抗体の凝集、溶解度、又は熱安定性に負の影響を及ぼすことなく粘度を有意に低減させたことを示した。

実施例３．エフェクター機能活性
インビトロＦｃγ受容体結合、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣアッセイを行って、抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸置換がＦｃ機能を変化させたかどうかを評価した。

ヒトＦｃγ受容体結合：分子７のＩｇＧ４抗体バリアントのヒトＦｃγ受容体への結合親和性を、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）分析によって評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｂｉａｃｏｒｅ試薬、及びＳｃｒｕｂｂｅｒ２ Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ２００８）をＳＰＲ分析に使用した。シリーズＳ ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１００５３０）を、製造業者のＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング法（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ１０００５０）を使用して調製した。要約すると、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注射することによって４つ全てのフローセル（ＦＣ）の表面を活性化させた。タンパク質Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｐ／Ｎ ５３９２０２）を、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸緩衝液で１００μｇ／ｍＬまで希釈し、１０μＬ／分の流速で７分間の注射によって４つ全てのＦＣ上に約４０００ＲＵまで固定化した。未反応部位を、１０μＬ／分で７分間のエタノールアミンの注射によってブロッキングした。ｐＨ１．５の２×１０μＬのグリシン注射を使用して、非共有付随タンパク質を除去した。泳動用緩衝液は１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋（ＴＥＫＮＯＶＡ、Ｐ／Ｎ Ｈ８０２２）であった。ＦｃγＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｒ、及びＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｈ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｖ、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｆ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を、安定したＣＨＯ細胞発現から産生し、ＩｇＧセファロース及びサイズ排除クロマトグラフィを使用して精製した。ＦｃγＲＩ結合のために、抗体を泳動用緩衝液中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、ＦＣ２～４で約１５０ＲＵの各抗体を捕捉した（ＲＵ捕捉）。ＦＣ１は参照ＦＣであったため、ＦＣ１では抗体が捕捉されなかった。ＦｃγＲＩ ＥＣＤを泳動用緩衝液中で２００ｎＭまで希釈し、次いで、泳動用緩衝液中で２倍連続希釈して０．７８ｎＭにした。各濃度の２連注射は、全てのＦＣに４０μＬ／分で１２０秒間注射され、その後１２００秒の解離フェーズが続いた。再生を、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン１５μＬを３０μＬ／分で全てのＦＣに注射することによって実施した。参照減算データを、ＦＣ２ ＦＣ１、ＦＣ３－ＦＣ１、及びＦＣ４－ＦＣ１として収集し、測定値を２５℃で得た。親和性（ＫＤ）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２ Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いた定常状態平衡分析又はＢＩＡ評価における「１：１（ラングミュア）結合」モデルのいずれかを使用して計算した。ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａの結合では、抗体を泳動用緩衝液中で５μｇ／ｍＬに希釈し、約５００ＲＵの各抗体をＦＣ２～４で捕捉した（ＲＵ捕捉）。ＦＣ１は、ここでも参照ＦＣであった。Ｆｃγ受容体ＥＣＤを泳動用緩衝液中で１０μＭに希釈し、次いで、泳動用緩衝液中で２倍連続希釈して３９ｎＭにした。各濃度の二重注射を、全てのＦＣ上に４０μＬ／分で６０秒間注射し、１２０秒の解離相が続いた。再生を、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン１５μＬを、３０μＬ／分で全てのＦＣに注射することによって実施した。参照減算データを、ＦＣ２－ＦＣ１、ＦＣ３－ＦＣ１、及びＦＣ４－ＦＣ１として収集し、測定値を２５℃で得た。親和性（ＫＤ）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２ Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いた定常状態平衡分析を使用して計算した。各受容体を少なくとも２回アッセイした。

表８に示される結果は、分子７のＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ及びＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ抗体バリアントが、Ｆｃγ受容体の各々に対して同等の結合親和性を有したことを示し、したがって、アミノ酸残基ＫＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体のＦｃ結合活性に影響を及ぼさなかったことを示している。

Ｃ１ｑ結合：ヒトＣ１ｑに対する分子７のＩｇＧ４抗体バリアントの結合を、Ｅｌｉｓａによって評価した。９６ウェルマイクロプレートを、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＨｙＣｌｏｎｅ）中で１０μｇ／ｍＬ～０．１９μｇ／ｍＬに希釈された、１００μＬ／ウェルの分子７のＩｇＧ４ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体バリアントでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティング試薬を除去し、プレートを、２００μＬ／ウェルのカゼインブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）でブロッキングし、室温（room temperature、ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含む１×ＴＢＥ）で３回洗浄し、カゼインブロッキング試薬中に希釈された１０μｇ／ｍＬのヒトＣ１ｑ（MS Biomedical）を１００μＬ／ウェルで添加し、ＲＴで３時間インキュベートした。ヒト化ＩｇＧ１及びヒト化ＩｇＧ４Ｐアイソタイプ対照抗体を、それぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１：８００倍希釈液のカゼインブロッカー中のヒツジ抗ヒトＣ１ｑ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ番号ａｂ４６１９１）を添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、７分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１ＮのＨＣｌを添加し、反応を停止させた。光学密度を、比色マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍで直ちに測定した。データを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．１データ取得及び分析ソフトウェアを使用して分析した。

図３に示される結果は、分子７のＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体バリアントが、ＩｇＧ４Ｐ対照と同等であるＣ１ｑ結合を有したことを示し、したがって、アミノ酸残基ＫＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体の補体結合に影響を及ぼさなかったことを示している。

抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：分子７の抗体バリアントのインビトロＡＤＣＣアッセイを、レポーター遺伝子ベースのＡＤＣＣアッセイで評価した。

簡単に述べると、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ、番号ＣＣＬ－２１３）及びヒトＣＤ２０標的細胞株、並びにエフェクター細胞株として機能的ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用した。全ての試験抗体バリアント及び細胞を、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（non-essential amino acid、ＮＥＡＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ－グルタミン、５００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、及び０．１％ｗ／ｖのＢＳＡを含むＲＰＭＩ－１６４０（フェノールレッドなし）を含有するアッセイ培地中で希釈した。試験抗体を、まず、３．３μｇ／ｍＬの３×濃度に希釈し、次いで、１：４の比で７回連続希釈した。５０μＬ／ウェルの各抗体を、白色不透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、番号３９１７）に二重で等分した。ＣＤ２０抗体を陽性対照として使用した。次いで、Ｄａｕｄｉ標的細胞を５０μＬアリコート中５×１０^４細胞／ウェルでプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、Ｊｕｒｋａｔ Ｖ１５８細胞を、ウェルに５０μＬアリコート中１５０，０００細胞／ウェルで添加し、３７℃で４時間インキュベートし、続いて、１００μＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｅ８１３０）を添加した。プレートシェーカーを低速で用いてプレートの内容物を混合し、室温で５分間インキュベートし、０．２ｃｐｓの積分を用いてＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（BioTek Instruments）で発光シグナルを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用してデータを分析し、各抗体濃度についての相対発光単位（relative luminescence unit、ＲＬＵ）を、抗体濃度対ＲＬＵの散乱フォーマットでプロットした。結果は、２つの独立した実験を表すものであった。

図４に示される結果は、分子７の抗体バリアントＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ及びＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓが、レポーター遺伝子ベースのＡＤＣＣアッセイにおいて同等のＡＤＣＣ活性を有したことを示し（すなわち、ＡＤＣＣ活性を誘導しなかった）、したがって、アミノ酸残基ＫＲＱをＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体のエフェクター機能活性に影響を及ぼさなかったことを示している。陽性対照ＣＤ２０抗体は、強力なＡＤＣＣ活性を示した。

補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）：分子７のＩｇＧ４抗体バリアントのインビトロＣＤＣアッセイを、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ、番号ＣＣＬ－２１３）を使用して行った。全ての試験抗体、補体、及び細胞を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、５００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、及び０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＲＰＭＩ－１６４０（フェノールレッドなし）からなるアッセイ培地で希釈した。試験抗体を、まず、１００μｇ／ｍＬの３×濃度に希釈し、次いで、１：４の比で７回連続希釈した。５０μＬ／ウェルの各抗体を、白色不透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、番号３９１７）に二重で等分した。次いで、Ｄａｕｄｉ標的細胞を、例示された抗体とともに５０μＬアリコート中５０，０００細胞／ウェルで添加し、ＣＤ２０陽性対照抗体を３７℃で１時間インキュベートした。次に、３７℃の水浴中で迅速に解凍したヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、＃Ａ１１３）をアッセイ培地中で１：６に希釈し、５０μＬ／ウェルでアッセイプレートに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、続いて１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｇ７５７１）を各ウェルに添加した。プレートシェーカーを低速で用いてプレートの内容物を混合し、室温で５分間インキュベートし、０．２ｃｐｓの積分を用いてＢｉｏＴｅｋマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で発光シグナルを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９を使用してデータを分析し、各抗体濃度についての相対発光単位（ＲＬＵ）を、抗体濃度対ＲＬＵの散乱フォーマットでプロットした。

図５に示される結果は、分子７のＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓ及びＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ抗体バリアントが、Ｄａｕｄｉ細胞において同等のＣＤＣ活性を有したことを示し、したがって、アミノ酸残基ＫＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体のＣＤＣ活性に影響を及ぼさなかったことを示している。ＣＤＣアッセイの陽性対照ＣＤ２０抗体は、強力なＣＤＣ活性を示した。

Ｆｃγ、Ｃ１ｑ結合アッセイ、並びに細胞性エフェクター機能ＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイの結果は、ＫＲＱアミノ酸残基の抗体バリアントの定常ドメインへの導入が、抗体のＦｃ機能に影響を及ぼさなかったことを示した。

実施例４．バリアントの細胞結合
Ｂ細胞及び単球細胞への結合：例示された分子７のＩｇＧ４Ｐ抗体バリアントのＢ細胞及び単球細胞への結合を、蛍光活性化細胞選別（Fluorescence Activated Cell Sorting、ＦＡＣＳ）アッセイにおいて試験した。標準的なＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ｐｌｕｓ（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）密度勾配遠心分離法によって、ヒト血液試料からヒトＰＢＭＣを単離した。新たに単離された細胞ＰＢＭＣを、２００万細胞／ｍＬで再懸濁し、室温で１５分間静置し、次いで、１００μＬ／ウェルで丸底９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ（登録商標））に播種し、ＦＡＣＳ緩衝液（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）からの２％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳ）で洗浄した。製造業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７にコンジュゲートされた例示されたＩｇＧ４Ｐ抗体バリアントを、６６．６７ｎＭでウェルに添加し、二重で４倍希釈した。次いで、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００抗ヒトＣＤ４抗体（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）から）、ＣＤ２０モノクローナル抗体（２Ｈ７）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＣＤ１４ ＰＥ－Ｃｙ（商標）７マウス抗ヒトＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する等体積の２×抗体カクテルを、ウェルに添加した。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬの最終体積のＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ、Ｓｙｔｏｘ（商標）ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、試料をフローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０；ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）を介して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータ分析を実施し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用して統計分析を実施する。データは、２人のドナーからのＣＤ２０ Ｂ細胞及びＣＤ３／ＣＤ２０陰性、ＣＤ１４陽性単球細胞集団からの陽性細胞のパーセンテージの平均±ＳＥＭを表した。曲線は、個々の細胞集団からのＡｂ陽性発現細胞のｌｏｇ（Ａｂ濃度）対パーセントのシグモイド曲線を適合させることによって作成された。

表９並びに図６Ａ及び図６Ｂに示される結果は、例示された分子７の抗体バリアントＩｇＧ４Ｐ ＫＲＱ ｅＣｙｓ、ＩｇＧ４Ｐ ＲＱ ｅＣｙｓ、及びＩｇＧ４Ｐ ｅＣｙｓが、ＰＢＭＣ単離Ｂ細胞（それぞれ、０．２０ｎＭ、０．１８ｎＭ、及び０．１７ｎＭのＥＣ_５０）及び単球細胞（それぞれ、１．０４ｎＭ、０．９０ｎＭ、及び１．００ｎＭのＥＣ_５０）に対する同等の親和性で結合したことを示し、したがって、アミノ酸残基ＫＲＱ又はＲＱを抗体のＩｇＧ４定常ドメインのＣＨ２及びＣＨ３に導入することが、得られる抗体の可変領域の結合に影響を及ぼさなかったことを示している。

配列表

Claims (15)

1. 配列番号８、９、１０、１２、１３、又は１６のうちのいずれか１つを含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含む、抗体。
2. 請求項１に記載の抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート。
3. ヒトＩｇＧ４抗体の粘度を低減させる方法であって、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域と、ヒトＩｇＧ軽鎖定常領域と、を含む、前記ヒトＩｇＧ４抗体のバリアントを生成することを含み、前記改変されたヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下のアミノ酸残基：
   ａ）前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン；
   ｂ）前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；
   ｃ）前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン；又は
   ｄ）前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３７（ＥＵ番号付け）にグリシン、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基２０３（ＥＵ番号付け）にアスパラギン、前記ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２７４（ＥＵ番号付け）にリジン、前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３５５（ＥＵ番号付け）にアルギニン、及び前記ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基４１９（ＥＵ番号付け）にグルタミン
   を含む、方法。
4. 前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記バリアントヒトＩｇＧ４抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを生成することを更に含む、請求項３に記載の方法。
6. 前記抗体が、野生型ヒトＩｇＧ４抗体と比較して、低減された粘度を有する、請求項３に記載の方法。
7. 前記粘度が、前記野生型ヒトＩｇＧ４抗体と比較した場合、約２５パーセント～約８０パーセント低減される、請求項６に記載の方法。
8. 請求項１に記載の抗体の重鎖をコードする配列を含む、核酸。
9. 請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
10. 請求項９に記載のベクターを含む、細胞。
11. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の細胞。
12. 抗体を産生するプロセスであって、前記抗体が発現されるような条件下で、請求項１１に記載の細胞を培養することと、前記発現された抗体を培養培地から回収することと、を含む、プロセス。
13. 請求項１２に記載のプロセスによって産生される、抗体。
14. 請求項１又は１３に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、医薬組成物。
15. 請求項１又は１３のいずれか一項に記載の抗体を含む、がん、心血管疾患、又は自己免疫疾患を処置するための組成物であって、皮下投与される、組成物。