JP7846887B2 - 分子イメージング装置およびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質結晶のイメージングを行うための電子ビーム装置に関する。

ブラッグ回折では、位相の情報が不足している。これは、Ｘ線/電子結晶学のセントラルドグマである。位相の情報がない場合、記録されたブラッグ回折パターンから対象物の構造を再構築することができない。１９７５年に、ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＵｎｗｉｎは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）をデフォーカスさせることで撮影したノイズの多い実画像をフーリエ解析することにより、２次元結晶（無染色の、周期性のある生体試料）の位相を再構築した。そして、その位相と電子回折パターンを組み合わせ、紫膜タンパク質（現在では光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンとして知られている）および酵素カタラーゼの構造を決定した。また、試料を傾けることで、紫膜の３次元モデルを作成した。これらのタンパク質は、２次元の分子配列を形成するという特性を有していた。

しかしながら、ほとんどのタンパク質は３次元結晶を形成する傾向がある。そのため、同じ方法を適用したり、ＴＥＭ下でより直接的に分子配列をイメージングしたりするためには、多くの課題がある。現在まで、ダイレクトイメージングによって３次元タンパク質結晶の構造決定に成功したという報告はない。その困難な点は、次の通りである。（１）利用可能な画像を得るための最小電子線量が回折の場合よりも著しく高いため、非常にノイズが大きい画像となり、高度な処理を必要とする点。（２）実空間イメージングは、試料ドリフトおよび試料の振動に対して感度が高く、高度なアライメントおよび再構築の手法を要する点。（３）ランダムに配向する結晶の実空間イメージングは、複数の回折ビームが干渉するために、検出画像において複雑なモアレパターンとなる点。

これらの背景には、以下のような本質的な問題がある。（ａ）タンパク質の原子密度は水に非常に近いため、散乱コントラストが非常に低い。（ｂ）タンパク質結晶は多くの水分子を含んでおり、重量の５０％に達することもある。水分子は電子をランダムに散乱させるため、バックグラウンドのノイズが大きくなる。（ｃ）動力学的電子回折が、ＴＥＭ下の実像に種々の混乱を生じさせる。

上記の困難を克服し、ＴＥＭ下でタンパク質の構造を決定するために、以下の手法を用いる。（ｉ）晶帯軸で投影画像を撮影する。晶帯軸は、例えば、［１００］，［０１０］，［００１］，［１１０］，［０１１］，［１０１］，［－１１０］，［０－１１］，［１０－１］である。なお、“－”はその直後の指数に付されるバーを意味する。後述するように、晶帯軸において得ることができる最大数の散乱格子点を得ることで、隣接する分子への画像の重なりを減少させることができる。低電子線量画像、または回折モードのＴＥＭをリアルタイムで高速フーリエ変換（ＦＦＴ）し、結晶を回転させると、軸を見つけることができる。

（ｉｉ）ダメージ限界までの最大電子線量をワンショットで与え、高解像度の画像を得る。そして、次の微小結晶に移行する。このとき、その軸における動力学的回折の影響を無視できないことに留意する。この影響を緩和するために、角度をつけてスキャン光を照射する。そして、高解像度エッジ付近の格子点から、回折データを収集する。

（ｉｉｉ）高解像度画像を得ることができれば、既知のビルディングブロックである、アミノ酸および小さなペプチドまたαヘリックスの構造を利用することで、例えば１３枚以上の限られた数の晶帯軸画像から、タンパク質の３次元構造を再構築することができる。

（ｉｖ）上記の方法は、ＡＩ（人工知能）が発展中である画像処理技術の一部である。タンパク質が、どのようにアミノ酸の直鎖から３次元形状に丸まり、自然なコンフォメーションを形成するかをＡＩにより予測するという分野も、急速に成長している。したがって、タンパク質の構造解析、誤りの検査、および構造の変更において、ＡＩは大きな助けとなり得る。

本明細書では、タンパク質結晶における分子配列の高解像度画像を得るシステム及び方法を説明する。はじめに、ＭｉｃｒｏＥＤ（微結晶電子回折）の技術を改良し、ブラッグ回折の位相を構造位相に変換する。次に、ビームエキスパンダにより干渉縞を拡大する。次に、エワルド球および格子点に基づいて出力された画像を解明し、実測を行う。

近年、ＭｉｃｒｏＥＤが利用可能となり、多くのタンパク質構造が決定されている。この技術は、単一生体分子に対するＸ線結晶構造解析またはクライオ電子顕微鏡法に代わる強力な手法となりつつある。回折データを３次元構造へ再構築するようなデータ処理を直接行うことに成功しているが、現在では、この技術の使用は小分子に限定されている。Ｘ線結晶構造解析では、同型置換法（ＩＲ：重金属を結晶に染み込ませる）および異常散乱法（ＡＳ：Ｘ線の波長を変えて重金属にエネルギーを蓄積させ、位相をオフセットさせることで元の位相を推定する）によりこの課題を解決してきたが、ＭｉｃｒｏＥＤでは、これまで、このような位相決定法は実施されておらず、さらなる調査が必要な研究分野である。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、結晶の３次元スキャンを行う装置であって、入射電子ビームをシフトさせることにより、前記入射電子ビームをタンパク質結晶に対して所定の角度で入射させる１つまたは複数のスキャンコイルと、前記タンパク質結晶から回折した電子ビームを拡大する１つまたは複数のレンズを含むビームエキスパンダと、電子検出器と、を備える。

本願の第２発明は、第１発明の装置であって、前記１つまたは複数のスキャンコイルは、回転し、前記電子ビームは、前記タンパク質結晶に対して、特定パターンのスキャンを行う。

本願の第３発明は、第２発明の装置であって、前記特定パターンのスキャンは、スパイラルスキャンである。

本願の第４発明は、第２発明の装置であって、前記特定パターンのスキャンは、ラスタースキャンである。

本願の第５発明は、第１発明の装置であって、前記ビームエキスパンダは、第１の焦点距離を有する第１レンズと、第２の焦点距離を有する第２レンズと、を備え、前記第１レンズと前記第２レンズとの間の距離は、前記第１の焦点距離と前記第２の焦点距離との和である。

本願の第６発明は、ａ）タンパク質結晶を所定の角度で角度スキャンする工程と、ｂ）前記タンパク質結晶から回折したビームを拡大する工程と、ｃ）回折波と参照波との干渉パターンに基づいて、前記所定の角度で行われた前記角度スキャンの出力画像を生成する工程と、を含む、方法である。

本願の第７発明は、第６発明の方法であって、前記ａ）工程は、複数の異なる角度で、前記タンパク質結晶に対して複数の角度スキャンを行う工程であり、前記ｃ）工程は、前記複数の異なる角度で行った前記複数の角度スキャンの、複数の出力画像を生成する工程であり、ｄ）前記複数の出力画像を組み合わせることにより、３次元構造を構築する工程をさらに含む。

本願の第８発明は、第６発明の方法であって、前記角度スキャンは、スパイラルスキャンである。

本願の第９発明は、第６発明の方法であって、前記角度スキャンは、ラスタースキャンである。

本願の第１０発明は、第６発明の方法であって、前記ｂ）工程では、前記ビームを第１の焦点距離を有する第１レンズに通過させた後に、第２の焦点距離を有する第２レンズに通過させ、前記第１レンズと前記第２レンズとの間の距離は、前記第１の焦点距離と前記第２の焦点距離との和である。

本願の第１～第１０発明によれば、ダイレクトイメージングによりタンパク質結晶の３次元構造を決定することができる。

図面は、本開示の態様を明確にし、強調するために、本明細書に含まれる。
格子面（ｈｋｌ）からのブラッグ回折が、参照波と重なり合い、結晶からすぐ近くの下流に位置する像面において干渉縞を形成する様子を示す図である。 逆格子面上の波数ベクトルを示す図である。曲線は、曲率が強調されたエワルド球を示す。電子線結晶構造解析では、波長が極めて短いため、エワルド球はほぼ平坦な面となる。 像面を上方に移動させることにより、上流に位置する干渉縞が結晶内部の格子面に合う様子を示す図である。 異なる格子面（ｈ’ｋ’ｌ’）におけるブラッグ条件を示す図である。入射ビームは傾いており、拡張された干渉縞は格子面に一致する。 ２つのコヒーレントなビームがビームエキスパンダにより拡大され、同時に干渉縞が拡大される様子を示す図である。 配置した結晶に対してコヒーレントな電子波Ψ_１を角度θで照射することで、回折波Ψ_２として角度θで（ｈｋｌ）格子において反射する様子を示す図である。検出器上の格子の像は拡大されている。 ２００ｋＶの電子ビームを用いた、１０ｎｍの単位胞における（半分の）逆空間を示す図である。 タンパク質結晶の分子イメージングを行うための実際の装置を示す図である。 不足の格子点を、ビームを傾けることで収集する様子を示す図である。 スパイラルスキャン、ラスタースキャン、およびサークルプリセッションスキャンの３種類の角度スキャンを示す図である。 スパイラルプリセッションビームにより解像度が向上することを示す図である。 それぞれ同一な２つの凸レンズを用いた３つの光学系を示す図である。

＜ブラッグ回折＞
ブラッグ回折は、１９１３年にローレンス・ブラッグおよびその父親ウィリアム・ヘンリー・ブラッグにより初めて発見された。「劈開面を鏡として利用する試みであり、雲母が劈開面から鏡のようにビームを反射することを発見した」と報告した。ここで重要なのは、ブラッグ回折は、結晶において規則的に並んだ原子からの「反射現象」であるということであった。入念な実験から、彼らは有名な数式を発見した。

λはＸ線の波長、ｎは整数、ｄは結晶の格子面間隔、およびθは反射角（＝入射角）である。この発見は、鉱物やタンパク質などの結晶構造解析など、結晶構造解析の長い成功の歴史の出発点であった。

ブラッグらの言葉を言い換えると、「劈開面を鏡として用いる試みにより、雲母が劈開面を鏡として、ビームの反射像を与える事が判明した」ということである。狭いスペクトル光に対しては、結晶は反射鏡として機能する。ここで、顕微鏡を用いて鏡の上で原子の観察を試みることに意味はあるのかという疑問がある。日常生活において分かるように、我々は鏡を通して反射像を見るが、鏡がきれいな状態では鏡面に何も見つからない。

さらに、鏡は、太陽光を一方向に反射し、かつそのパワーを吸収しない、非常に効率的な道具であることがわかっている。レンズを用いて、紙面へ反射光の焦点を合わせようとすると、鏡の像ではなく、焦点のあった太陽の像が観察される。紙は、その点に極度に収束したパワーにより、発火する。

結晶から反射したパワーがある方向に局在化し、周囲の方向に一様に散乱しないため、従来のイメージングのコンセプトが機能しないという大きな問題がある。この問題の解決策の一つとして、本明細書において後述するビームエキスパンダを用いることが挙げられる。

＜干渉縞＞
図１は、結晶９の周囲における顕微鏡下の様子を示す模式図であり、（ｈｋｌ）格子面（ブラッグ面）は、反射角２θで入射波１１を反射する。整数（ｈ，ｋ，およびｌ）は、格子面のミラー指数である。図１上の平面（紙面）は、格子面に対して垂直な面を選び、入射波１１とブラッグ回折１２とが同一平面上にあるようにしている。便宜上、入射波１１は上部から入射し、ｚ軸に沿って結晶９の内部を通過するとする。複数の入射波１１は、コヒーレントであり、同位相である。

図２は、逆空間における波数ベクトルを示す。入射波数ベクトルｋ_０は逆格子点（ｈｋｌ）によってｋ’に散乱される。散乱ベクトルは、以下の式で与えられる。

回折過程でエネルギーの増減がないと仮定した場合、ｋ_０およびｋ’は等しいベクトル長ｋ_０となる。

上記の式から、格子面間隔は、次のようになる。

ｄは、常に基本の結晶格子の大きさより小さいことに留意する。単純立方晶系の場合、次のようになる。

上記の式を用いると、隣接する２つの格子面からの２つの反射波の位相差は次のようになる。

したがって、反射波は強め合うように干渉し、反射角２θの強い平面波を形成する。

図１に示すように、像面２０を結晶９のすぐ近くに配置する。ブラッグ回折１２と参照波１３（コヒーレントな入射電子ビーム）が重なり合い、ヤングの干渉縞と同様に、干渉縞が像面に形成される。像面２０上において隣接する２つの輝点の経路差は、次式の波長と等しくなる。

ブラッグの法則を用いると、像面上の干渉縞の間隔は次のようになる。

像面２０上の干渉縞の間隔ｄ’は、結晶格子ｄよりわずかに大きくなる。

図３に示すように、像面２０を上方に移動させ続けると、２つの波１１，１２間の開口角が一定になる。そのため、同じ間隔の干渉縞が観察される。平均面ＯＯ’（２波の平均角）上では、２つの波１１，１２間の経路長差は同じまま（０またはｎλ）である。そのため、干渉縞の中心の明るい面は、平均面ＯＯ’上にとどまる。格子面ＰＰ’と平均面ＯＯ’とは平行である。像面２０を上方に移動させると、干渉縞が左側へ連続的に移動する様子が観察される。

結晶９の内部へ像面２０を移動させ続けると、なお干渉縞が観察される。これは、上流の原子からの回折波と結晶９を通る入射波１１とが存在し、これらが干渉するためである。像面２０が反射点Ｐに到達すると、２つの波１１，１２間の経路差も０になる。したがって、この格子面は、結晶９の内部の明るい干渉縞と完全に重なっていると結論づけることができる。したがって、この干渉縞は、結晶格子のレプリカであるといえる。

入射ビームを傾けた場合も同様である。図４に示すように、格子面（ｈ’ｋ’ｌ’）がｚ軸に平行な場合、ブラッグ条件に基づいて、ビームをｚ軸からθ’傾ける。像面２０上では、干渉縞の間隔はｄ’となり、格子面間隔ｄ’と等しくなる。すなわち、干渉縞と格子面間隔は互いに重なり合う。

後述するように、より多くの格子点をカバーするために、ビーム傾斜角度スキャンを導入する。ブラッグ条件が満たされると、反射波と入射波１１とが干渉することにより干渉縞が形成され、その全てが格子面を表す。角度スキャン中にシャッターを開けたまま、顕微鏡を通して、２次元電子検出器１０８に１フレームで静止画像を撮像する。そして、２次元検出器１０８上に、ビームでスケッチが描かれるように、多くの線（今回の場合は、干渉縞）により影が描かれる。このようにして、２次元分子密度マップ（クーロンポテンシャルマップ）が２次元検出器１０８上に図示される。

重要なのは、プリセッション電子回折における下流側の補正器を用いると、図示が不鮮明になることである。したがって、下流の光学系は結晶９に焦点を合わせたまま、変化させない。

散乱現象は、特定の位相シフト、すなわち、Ｘ線トムソン散乱では－π、位相対象物（生体分子）からの電子波散乱では－π／２の位相シフトを伴う。しかしながら、この位相シフトはすべての散乱波で共通に発生するため、画像の再構築に対する影響はない。しかし、電子線結晶構造解析では、ビーム軸が結晶の長軸に近づくと、動的散乱が支配的となり、出射波の位相は急激に変化する。入射波の角度が変化することで干渉縞がシフトするため、この現象は本明細書で説明するイメージング手法に対して弊害となる。そのため、干渉縞は格子の位置を表現していない。そこで、入射波の角度を動かすことで、つまり干渉縞の画像を塗りつぶすことで、動的散乱の影響を排除することができる。

タンパク質分子の密度は鉱物よりもはるかに低く、タンパク質分子の周囲には水分子が残存している（セル間のチャネルは水分子で満たされている）。これにより、結晶軸に沿って伝播する電子波の強度は更に弱まる。タンパク質結晶は、５０％近くの水分子を含むことが多い。そのため、ランダムに配向した水分子からの散乱により、画像にノイズが発生する。したがって、動的散乱の影響はあまり重大ではなくなる。

結晶内部のクーロンポテンシャルによる平均内部電位は、屈折率の変化として作用する。上述したように、タンパク質結晶は鉱物結晶よりはるかに密度が低い。そのため、２００～３００ｋｅＶの電子線をＴＥＭで照射した場合における、平均内部電位の変化による実際の波長の変化は、無視できるほど小さい。また、可視光では、ガラス内部の構造はわずかにずれた位置で見えることがあり、表面が滑らかな場合は画質の劣化が起こらないことが分かっている。したがって、タンパク質結晶をさらに高解像度でイメージングするには、氷に包埋した微小結晶が適しており、氷の表面は滑らかで汚れがないことが望ましい。

＜ビームエキスパンダによる干渉縞の拡大＞
前項において、干渉縞は結晶格子のレプリカであることがわかった。現在の、高度な原子分解能を有する電子顕微鏡を用いて干渉縞を拡大すると、結晶格子を観測することができる。ここでは、結晶９内の単一原子（または分子）１つ１つの像を得ようとしているのでなく、格子の像（格子面の断面画像）を観測する。

ここで、２つのコヒーレントビームΨ_１，Ψ_２を、ビームエキスパンダにより変換する。２つのビームを開口角２αで入射させると、干渉縞の間隔は次のようになる。

電子顕微鏡の場合、ビームの角度は、α＝０．００１～０．０１ｒａｄと常に非常に小さい。そのため、ｓｉｎ（２α）＝２αの近似が良好に成り立つ。２つのビームはΨ_１，Ψ_２に拡大され、下流の像面２１で再び重なり合う。そして、干渉縞の間隔は次のようになる。

交差角が非常に小さくなるため、干渉縞の間隔は大きくなる。像面２１に２次元検出器１０８を配置すると、図５の円中に示すような、拡大された干渉縞が得られる。

重要なのは、焦点面において、ブラッグ回折の回折点に対応する２つの輝点があるということである。コヒーレントな光学系では、焦点面画像は像面２０のフーリエ変換である。干渉縞（振幅）は正弦波状に変調されたパターンであり、そのフーリエ成分は対称的な２点である。

後述するように、対象物のＡ点は像面２１のＡ’点に投影され、Ｂ点はＢ’点に投影される。Ａ－Ｄ_１－Ａ’とＡ－Ｄ_２－Ａ’とでは経路長が等しい。同様に、Ｂ－Ｄ_１－Ｂ’とＢ－Ｄ_２－Ｂ’とでは経路長が等しい。像面２０から像面２１へ向かう２つの波Ψ_１とΨ_２との間に位相差はない。本方法において、像面２０（対象物）上の干渉縞は像面２１（検出器１０８）において再構成される。

興味深いことに、検出器１０８のＺ位置を像面２１の周りで動かしても、記録される干渉縞は変化しない。これは、ブラッグ回折のイメージングにおいてＣＴＦ関数が存在しないため、デフォーカスさせた画像という構想が機能しないことを示している。

結晶９を対象物として配置し、コヒーレントな電子波Ψ_１を角度θで照射すると、図６に示すように、回折波Ψ_２として（ｈｋｌ）格子面において角度θで反射する。２つの波はレンズ系を伝播し、格子面（ｈｋｌ）のレプリカとして検出器１０８上に干渉縞を形成する。

有名な外村彰の実験では、二重スリット（バイプリズム）にコヒーレントな電子ビームを低電流で照射すると、通過した電子が２次元検出器上で検出された。個々の電子は１つずつスリットを通過していると考えられるが、どちら側のスリットを通過したかはわからない。しかし、十分な累積時間が経過すると、多数の電子により干渉縞が形成される。この実験により、電子の波動と粒子の二重性が証明された。電子が自由空間を動くとき、確率波動関数Ψが伝播している。そのため、両側のスリットを通過して干渉縞が形成される。波が検出器に入射すると、「事象」として波動関数が一点に収縮し、シリコン検出器にエネルギーが蓄積される。この事象の確率は｜Ψ｜^２である。

図６では、２つのスポット、すなわち０次ビーム（入射波Ψ_１）およびブラッグ回折Ψ_２が焦点面に存在する。電子の確率波は、この２つのスポットを同時に通過する。位相情報は保存されているため、検出器上の正しい位相（輝点の位置）に干渉縞が形成される。焦点面にフィルムまたは検出器を配置すると、２つのスポットは得られるが、位相は失われる。

０次ビームスポットの回折パターンは、中心より下側に現れることに注意する。プリセッション電子回折（ＰＥＤ）では、入射ビームを軸の周りで傾けることにより回折像を取得する。光学系は、レンズのパワーを上げる、すなわちＦ_２を短くすることで調整され、回折パターンを検出器に結像させる。０次ビームスポットを軸上に保つために、回折像の位置は下流の補正コイル（イメージシフトコイル）によって補正される。しかし、本イメージング手法においては、イメージシフト方式では検出器１０８上の格子像が劣化する。そのため、角度スキャン中は、結像光学系を変化させないようにする。

画像のコントラストを高めるためには、ＦＦＴデジタルフィルタが有用である。検出器１０８に記録された干渉縞にＦＦＴを適用すると、２つのスポットではなく、結晶９からのブラッグ回折１２、入射ビーム、および中央のバイアスの、３つのスポットが存在することとなる。コントラストを向上させるためには、中央のスポットを除去するというのは間違った考えであり、そうすると全く異なるコントラストになる。格子点間のノイズ信号を除去することもできるが、その場合、中央のスポットは変化しないようにするか、ノイズ振幅を除去することにより低下させるようにする。

＜結晶による散乱および分子形状因子＞
本イメージング手法は、回折分析に依存しない。しかし、電子顕微鏡下で観察した結晶の様子を理解するためには、Ｘ線構造解析の理論的根拠に注目することが非常に有効である。簡単のために、以下の議論ではフーリエ変換における正規化係数は記載していない。

結晶は、単位胞の並進的なコピーで形成されている。タンパク質結晶には種々の空間群が存在するが、ここでは単純なケースについて扱う。全域の密度分布は次のように表すことができる。

結晶は並進ベクトルａ、ｂ、およびｃをもち、ａ方向にｎ_１個、ｂ方向にｎ_２個、ｃ方向にｎ_３個の単位胞を有する。Ｘ線結晶構造解析において、ρ（ｒ）は単位胞内の電子密度（確率分布関数）である。電子線結晶構造解析では、ρ（ｒ）は正の原子核および負の電子遮蔽によるクーロンポテンシャルに関連する散乱カーネルの密度である。ρ（ｒ）は、分子内の原子密度分布として近似することができる。

結晶からの散乱振幅は次式で与えられる。

ここで、Ｓは散乱ベクトル（Ｓ＝ｋ’－ｋ_０）である。畳み込み積分の定理を用いると、

ここで、Ｆ（Ｓ）はＮ原子系（１分子）の分子形状因子であり、次のように表すことができる。

数学的には、上式は３次元フーリエ変換と等価である。分子形状因子Ｆ（Ｓ）がわかっていれば、逆フーリエ変換により分子構造ρ（ｒ）が導かれる。Ｆ（Ｓ）は複素数であり、すなわち位相Ｆ＝｜Ｆ｜・ｅ^ｉαが含まれる。

上式の３つの和は干渉効果を表し、これは形状因子、すなわち図２中の格子点に対する標本化関数として作用する。ＭｉｃｒｏＥＤの場合、電子の波長は極めて短くなる。そのため、図７に示すように、単位胞の大きさが１０立方ｎｍ、結晶の大きさが５００立方ｎｍ、各指数に対して５０個の配列、そして電子線ビームのエネルギーが２００ｋＶとすると、エワルド球はほぼ平坦になる。格子点は有限の大きさΔ＝１／Ｎ_{ａｒｒａｙ}＝０．０２を持つ。ビームの入射角度が結晶軸に正確に合っていると、エワルド球はｈ＝－１４から１４付近の格子点に一致するため、分解能は０．７ｎｍに制限される。より高い分解能で回折を集めるには、入射角を傾ける必要がある。１Åの解像度を得るためには、格子点を１００まで集めなければならず、このときに必要な傾斜角はθ＝λ／２δ±１２．５ｍｒａｄである。

角度スキャンを使用して、入射ビームに垂直な格子点を集める。つまり、図７の場合では、ほとんどｌ＝０である。本明細書にて説明した数式から、次のようになる。

ここでρ（ｘ，ｙ）は、２次元に投影された密度である。逆フーリエ変換により、投影された密度が次のように得られる。

本イメージング方法では、レンズ系を通して干渉縞の連続的な画像が収集されることにより、上式の積分が自動的に行われる。高解像度成分では、ｌ＝±１の点が含まれるため、縦方向の変動が観測されることとなる。したがって、最良の解像度を得るためには、結晶９の内部においてＴＥＭの焦点位置を調整する必要がある。高解像度成分は、例えば１０ｎｍの単位胞の周期で、出現と消失とを繰り返す。

結晶９の任意の方向において、傾斜角度スキャンにより、ビーム軸の横断面上に密度マップが投影される。ブラッグ回折１２の位相は常に含まれている。

＜実際の計測装置＞
図８は、本明細書において提案するタンパク質結晶９の分子イメージング装置の概念図である。電子ビームは、上から下に向かって進む。

（１）電子源１０１は、一般的なＴＥＭに用いられるコヒーレントな電子源１０１である。

（２）コンデンサレンズ１０２は、試料へ向かう平行な電子流へとビーム形状を調整し、エッジビームを排除することでコヒーレンシを向上させる。

（３）角度スキャンコイルのセット１０３は、回転するように構成され、ビーム位置を横方向にシフトさせる。これにより、対物レンズ１０４（前側、対物レンズ全体の半分）を通過するビームの角度を変化させる。

（４）タンパク質結晶９は対物レンズ１０４の中央に位置する。便宜上、レンズ１０４を前側と後側の２つに分ける。

（５）タンパク質結晶９は、液体窒素で－１６０度以下に冷却されたＴＥＭホルダのサンプルグリッド上に置かれる。これは、タンパク質結晶９の周囲において、ガラス状の透明な氷を保持し、不要な回折を発生させないようにするために重要である。また、冷却することにより、タンパク質結晶９を電子ビームの照射および損傷から保護することができる。

（６）タンパク質結晶９をホルダの軸の周りで回転させ、結晶９への適切な入射角を選択する。例えば、ダブルチルトホルダが使用される。

（７）角度スキャンは、スパイラル（螺旋状）、ラスタースキャン（鋸歯状）、または角度スキャンコイルを回転させることによるサークルプリセッション（歳差運動）のいずれでもよい。全体のスキャン幅は、２００ｋｅＶのＴＥＭで３０ｍｒａｄ程度である。

（８）試料ドリフトおよび振動による像の不鮮明化を抑制するため、スキャン速度は速い方がよい。具体的には、１回のスキャンは１秒未満であることが好ましい。

（９）環状スリット１０５は、不要なノイズを除去する。環状スリット１０５は、鮮明な画像を得るために重要な部品である。

（１０）データの取得中は、下流（結晶９の後方）の光学系は一定とし、変化させない。

（１１）下流の光学系はビームエキスパンダ１０６として機能する。デスキャンコイルは設置されていない。ＰＥＤのデスキャンコイルは回折パターンを得るのに必要であるが、実像を壊すため、ここでは使用しない。

（１２）２次元電子検出器１０８上でブラッグ回折１２と参照波１３（透過型照明）とが重なり合い、干渉縞を形成する。角度スキャンを１回実行する間、２次元検出器の画像取得機能をオンにしておくため、上記の数１７の式で表されるρ（ｘ，ｙ）の積分が実行される。

図９に示すように、ビームを傾けなければ、高解像度のフーリエ成分が含まれる、より高い指数（ｈｋ）において格子点を取得することができない。入射ビームを傾けることにより、これらの点からの回折を取得することができる。これにより、再構築された像は高解像度となる。これは、プリセッション電子回折（ＰＥＤ）と共通の考え方である。図式化すると、図１１に示す通りである。

実際に測定を行う際は、電子線量を低減し、ビームによる結晶９へのダメージを低減するために、直接電子検出器１０８を用いるのが好ましい。特定の角度設定において、１回のスパイラルプリセッションを行う間、およそ１秒間の露光時間において、シャッターを開けておく。その後、結晶９を次の角度設定まで回転させ、同じ工程を繰り返す。それぞれの画像に対して、一般的なデジタルノイズフィルタ処理を行い、これらの像を組み合わせることにより、３次元構造を構築する。各画像自体が完全なスライス画像であるため、一続きの角度での一続きの画像である必要はない。現在のクライオ電子顕微鏡法の高度な技術により、画像の分類および位置合わせは簡単になっている。

ＭｉｃｒｏＥＤの実験データによれば、５００立方ｎｍのタンパク質結晶９は、１０ｅ／Å^２の電子線量まで、詳細な構造を維持する。４ｋ×４ｋピクセルフォーマットの２次元電子検出器１０８を用いて、結晶９の１００ｎｍ×１００ｎｍの領域を見ると、０．２５Å／ピクセルあたりに合計１×１０^７個の電子、すなわちピクセルあたり０．６ｅ、１０×１０ビニングあたり１０ｅの電子が得られる。１０ｎｍ×１０ｎｍ×１０ｎｍの単位胞を仮定すると、１００ｎｍ×１００ｎｍ×５００ｎｍの箱に、５０００個の分子が入っていることになる。１０×１０の単位胞の画像を横方向に平均化することで、統計量は１０倍向上する。さらに、１Å^２の単位胞の画像が含む統計ノイズは１／√１００＝０．１程度と低く、十分に３次元構造を構築することができる。

＜ビームエキスパンダ＞
レーザービームエキスパンダは、可視光の光学系において、所望の倍率へビーム径を拡大または縮小するために頻繁に用いられる。ケプラー型のビームエキスパンダは、２つの凸レンズで構成される。もう１種類のガリレオ型ビームエキスパンダは、凹レンズを用いてビームを拡大するが、電子ビーム光学系では実現することができないため、ここでは扱わない。

＜ビームエキスパンダの光学系＞
図１２（ａ）は、ビームエキスパンダ１０６を示す。第１レンズである対物レンズ１０４および第２レンズである投影レンズ１０７という焦点距離の異なる２つのレンズを組み合わせ、総移動距離がこれらの焦点距離の和に等しくなる（焦点が共通となる）ように配置する。平行に入射したビームは、拡大され、平行なビームとなって出力される。全ての光線は共通の焦点を通過して広がるため、像は反転する。拡大倍率は、Ｍ＝Ｆ_２／Ｆ_１である。

図１２（ｂ）は一般的な顕微鏡である。光学系の構成は同じであるが、レンズの上流に距離Ｆ_１で点光源Ｏを配置することで、平行なビームが形成される。ビームは、レンズから距離Ｆ_２離れた点Ｏ’に集光する。出射したビームの半開口角をαとすると、集光角はα／Ｍとなる。対象物上において横方向にδ離れた２点Ｏ_１およびＯ_２は、拡大され、Ｍδ離れた点Ｏ_１’およびＯ_２’として像面に投影される。現在の電子顕微鏡では、Ｍ＝１～５０×１０^６の拡大を実現することができる。図１２（ｂ）は、光学顕微鏡における対物レンズの「無限遠補正光学系」とも同じである。ビームは、２つのレンズの間で平行な光路となるため、２つのレンズの間において距離を自由に選択することができる。さらに、ポラライザまたは照明といった光学装置を追加することもできる。

図１２（ｃ）はより一般的な場合であり、点Ｏを角度αで通過する平行ビームは、Ｍ倍に拡大され、角度がα／Ｍとなった平行ビームとして出力される。

９ ：結晶
１１ ：入射波
１２ ：ブラッグ回折
１３ ：参照波
２０ ：像面
１０１ ：電子源
１０２ ：コンデンサレンズ
１０３ ：角度スキャンコイル
１０４ ：対物レンズ
１０５ ：環状スリット
１０６ ：ビームエキスパンダ
１０７ ：投影レンズ
１０８ ：電子検出器

Claims (10)

1. 結晶の３次元スキャンを行う装置であって、
   入射電子ビームをシフトさせることにより、前記入射電子ビームをタンパク質結晶に対して所定の角度で入射させつつ回転方向に角度スキャンを行う１つまたは複数のスキャンコイルと、
   前記タンパク質結晶から回折した電子ビームを拡大する１つまたは複数のレンズを含むビームエキスパンダと、
   回折波と参照波との干渉パターンに基づいて、前記所定の角度で行われた前記角度スキャンの出力画像を生成する電子検出器と、
   を備える、装置。
2. 請求項１に記載の装置であって、
   前記１つまたは複数のスキャンコイルが、前記電子ビームの回転方向の角度を変化させることにより、
   前記電子ビームは、前記タンパク質結晶に対して、特定パターンのスキャンを行う、
   装置。
3. 請求項２に記載の装置であって、
   前記特定パターンのスキャンは、スパイラルスキャンである、装置。
4. 請求項２に記載の装置であって、
   前記特定パターンのスキャンは、ラスタースキャンである、装置。
5. 請求項１に記載の装置であって、
   前記ビームエキスパンダは、
   第１の焦点距離を有する第１レンズと、
   第２の焦点距離を有する第２レンズと、
   を備え、
   前記第１レンズと前記第２レンズとの間の距離は、前記第１の焦点距離と前記第２の焦点距離との和である、装置。
6. ａ）タンパク質結晶を所定の角度で角度スキャンする工程と、
   ｂ）前記タンパク質結晶から回折したビームを拡大する工程と、
   ｃ）回折波と参照波との干渉パターンに基づいて、前記所定の角度で行われた前記角度スキャンの出力画像を生成する工程と、
   を含む、方法。
7. 請求項６に記載の方法であって、
   前記ａ）工程は、複数の異なる角度で、前記タンパク質結晶に対して複数の角度スキャンを行う工程であり、
   前記ｃ）工程は、前記複数の異なる角度で行った前記複数の角度スキャンの、複数の出力画像を生成する工程であり、
   ｄ）前記複数の出力画像を組み合わせることにより、３次元構造を構築する工程
   をさらに含む、方法。
8. 請求項６に記載の方法であって、
   前記角度スキャンは、スパイラルスキャンである、方法。
9. 請求項６に記載の方法であって、
   前記角度スキャンは、ラスタースキャンである、方法。
10. 請求項６に記載の方法であって、
    前記ｂ）工程では、前記ビームを第１の焦点距離を有する第１レンズに通過させた後に、第２の焦点距離を有する第２レンズに通過させ、
    前記第１レンズと前記第２レンズとの間の距離は、前記第１の焦点距離と前記第２の焦点距離との和である、方法。