JP7843516B2 - 抗ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子抗体及びその製造方法と使用 - Google Patents

抗ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子抗体及びその製造方法と使用

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Description

本発明は、ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ｈＴＳＬＰ）抗体に関し、特にｈＴＳＬＰ活性を中和する抗体に関する。さらに、ｈＴＳＬＰ抗体分子を用いてｈＴＳＬＰ関連疾患を診断又は治療する方法に関し、ただし、前記疾患は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫である。
気管支喘息（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ、喘息とも略称される）は、最も一般的な慢性疾患の一つであり、近年、喘息の有病率は世界的に増加しつつある。現在、世界には少なくとも３億人の喘息患者がおり、中国には約３，０００万人がいる。アジア地域喘息疫学調査のデータによると、アジアにおける成人喘息の有病率は０．７％～１１．９％で、平均で５％以下であり、近年、喘息の平均有病率が上昇の傾向にある。現在の喘息の標準治療は、吸入グルココルチコイド＋／－長時間作用型β２刺激薬であるが、副作用が強く、免疫系の障害に繋がり、しかも５～１０％の患者にとって、現時点で有効な治療薬がない。中国喘息疫学調査の最新データによると、中国の喘息患者のうち、抑えることができたのは４０．５％しかない。特異性が高く、毒性・副作用が低く、対症療法として疾患を効果的に抑えることが可能な薬物は切望されている。
ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ｈｕｍａｎ ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｈＴＳＬＰ）は、ヒトインターロイキン７（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ ７、ｈＩＬ－７）様サイトカインであり、樹状細胞（ｄｅｎｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）を刺激することでアレルギー反応を開始させる。ｈＴＳＬＰは１５９個のアミノ酸からなるタンパク質であり、マウスＴＳＬＰと４３％の相同性を持ち、２８個の残基からなるシグナル配列と、６つのシステインと、２つの推定Ｎ－グリコシル化部位を含む。非変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析により、２３キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質が発現されているのに対し、計算された成熟タンパク質の分子量が１４．９ｋＤａであるため、ｈＴＳＬＰがグリコシル化されていることが示された。ｈＴＳＬＰは、７つの塩基性のＣ末端アミノ酸と、ジスルフィド結合の形成に関与すると考えられる６つのシステインを含む。ＴＳＬＰ受容体複合体は、ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＳＬＰＲ）とＩＬ－７受容体α（ＩＬ－７Ｒα）鎖からなるヘテロ二量体である。受容体は主に、単球、骨髄由来ＤＣ、及びＢリンパ球で発現される。
ＴＳＬＰは、環境刺激や炎症性刺激に応答して産生される上皮細胞由来のサイトカインであり、様々な炎症細胞や下流経路を活性化させる。ＴＳＬＰは喘息患者の気道で増加し、且つＴｈ２サイトカインやケモカインの発現と疾患の重症度に関連している。ＴＳＬＰはＴｈ２免疫性の調節に重要であるが、他の炎症経路においても重要な役割を果たす可能性もあるため、様々な喘息の表現型に関連している。
抗体医薬品は、標的抗原と高親和性で特異的に結合し、リガンドによる受容体の活性化を阻害することで、下流のシグナル伝達を効率的に遮断することができる。国際的には、ＴＳＬＰシグナル伝達経路を標的とする抗体医薬品はまだ市販されていないが、初歩的な臨床研究によると、抗ＴＳＬＰ抗体には重症持続性喘息の治療に広く適用される見込みがあり、血中好酸球数やその他のＴｈ２タイプのバイオマーカーが異なる患者集団にわたって同様に効率的な応答が示される。本発明は、ハイスループット・ハイブリドーマスクリーニング技術を活用し、同一の標的を持つ抗体医薬品よりも高い生物活性を有する高親和性ＴＳＬＰ抗体を開発・取得するものであり、国内外の喘息患者に新たな治療択肢を提供するためにさらなる開発が期待される。
図１は、ヒト化抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体によって、ＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化を阻害することである。 図２は、ヒト化抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体によって、ＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌を阻害することである。
本発明の発明者らは、数多くの実験を実施することで、ＴＳＬＰの細胞表面ＴＳＬＰ受容体への結合を特異的に遮断することによりＴＳＬＰシグナル伝達を遮断し、ＴＳＬＰに仲介される生物学的活性を遮断できるモノクローナル抗体のセットを得ることができた。
第一の様態において、本願は、重鎖可変領域を含み、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を提供し、前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ３配列を含み、さらにＨＣＤＲ１及び／又はＨＣＤＲ２配列も任意的に含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ３配列は、配列番号３、６、９及び１２から選ばれるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ２配列は、配列番号２、５、８及び１１から選ばれるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ１配列は、配列番号１、４、７及び１０から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号２６、３２、３８及び４４から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、或いは、前記重鎖可変領域は、配列番号２６、３２、３８及び４４から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３配列を含む。ある実施形態において、上記ＬＣＤＲ１配列は、配列番号１３、１６、１９及び２２から選ばれるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ＬＣＤＲ２配列は、配列番号１４、１７、２０及び２３から選ばれるアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、上記ＬＣＤＲ３配列は、配列番号１５、１８、２１及び２４から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号２９、３５、４１及び４７から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、或いは、前記軽鎖可変領域は、配列番号２９、３５、４１及び４７から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分の重鎖は、配列番号２７、３３、３９及び４５から選ばれるアミノ酸配列、或いは、上記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。任意的に、前記抗体又はその抗原結合部分の軽鎖は、配列番号３０、３６、４２及び４８から選ばれるアミノ酸配列、或いは、上記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
任意の実施形態において、上記抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、及び単一ドメイン抗体から選ばれる。
いくつかの実施形態において、第一の様態に記載のヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体は、マウス由来モノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、第一の様態に記載のヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体は、ヒト化抗体である。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗体又はその抗原結合部分は、ＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化を阻害することができる。他のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌を阻害することができる。
第二の様態において、本願は、以上に記載のヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子を提供する。
第三の様態において、本願は、以上に記載のヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、ｐＴＴ５、ｐＵＣ５７、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ、又はｐＣＨＯ １．０等である。
第四の様態において、本願は、以上に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）、又はＴＧ１等である。
第五の様態において、本願は、第一の様態にかかるヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を調製する方法を提供し、前記方法は、下記の工程を含む：
ａ）第四の様態にかかる宿主細胞に前記抗体又はその抗原結合部分を産生させることができる発現条件下で、前記宿主細胞を培養することで、前記抗体又はその抗原結合部分を発現させる；及び
ｂ）工程ａ）で発現された前記抗体又はその抗原結合部分を分離して精製する。
第六の様態において、本願は、第一の様態にかかる抗ヒトＴＳＬＰ抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、ヒトＴＳＬＰ関連疾患の治療に適用される。
いくつかの実施形態において、前記ヒトＴＳＬＰ関連疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫を含む。
他の様態において、本願は、その必要がある個体に、第一の様態にかかる抗体又はその抗原結合部分、或いは第六の様態にかかる医薬組成物を投与することを含む、ヒトＴＳＬＰ関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。
本発明にかかる抗ヒトＴＳＬＰ抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合することができ、以下の１種又は複数種の効果を有する：ヒトＴＳＬＰとｈＴＳＬＰＲの結合を遮断すること；ＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化を阻害できること；ＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌を阻害できること。本発明にかかる抗ヒトＴＳＬＰ抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＳＬＰ関連疾患、例えば免疫介在性炎症性疾患の予防又は治療に適用できる。
本願は、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合する新規な抗ｈＴＳＬＰ抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましい実施形態において、本願にかかる抗体又はその抗原結合部分は、高親和性でヒトＴＳＬＰと結合し、且つＴＳＬＰのＴＳＬＰＲへの結合活性を阻害する。本願はさらに、当該抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、当該抗体を調製して精製する方法、並びに前記抗体又はその抗原結合部分の医学的と生物学的な使用、例えばＴＳＬＰに関連する疾患又は病症の予防又は治療における使用も提供する。本願はさらに、前記抗体又はその抗原結合性フラグメントを用いたｈＴＳＬＰ検出方法及びｈＴＳＬＰ活性調節方法にも関連する。
本願を簡単に理解させるために、まず、本文で使用されるいくつかの用語を定義する。
本文に用いられるように、用語の「抗体」とは、４本のポリペプチド鎖、即ちジスルフィド結合を介して相互に接続された２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）からなる免疫グロブリン分子、及びその多量体（例えばＩｇＭ）を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略記される）と重鎖定常領域（ＣＨと略記される）を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略記される）と軽鎖定常領域（ＣＬと略記される）を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変領域に分けられることができ、フレーミング領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域はそれらに介在される。
本文に用いられるように、用語の抗体の「抗原結合部分」とは、抗原と結合する役割を担う完全な抗体分子の一部又はセグメントを指す。抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、又はその両方を含んでも良い。抗体の抗原結合フラグメントは、任意の適切な標準技術を用いて完全な抗体分子から調製することができ、前記標準技術には、タンパク質加水分解消化や組換え遺伝子工学技術などが含まれる。抗原結合部分の非制限的な実例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、単一ドメイン抗体、ｄＡｂフラグメント、及び抗体の高度可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小限の認識ユニット（例えば分離されたＣＤＲ）を含む。用語の「抗原結合部分」はさらに、例えば二重抗体、三重抗体、四重抗体、及びマイクロ抗体等の工学的分子も含む。
本文に用いられるように、用語の「重鎖可変領域（ＶＨ）」及び「軽鎖可変領域（ＶＬ）」とは、それぞれ、単一の抗体の可変的な重鎖及び軽鎖領域を指し、ＦＲ１、２、３及び４、並びにＣＤＲ１、２及び３を含む。
相補性決定領域（ＣＤＲ、通常はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、可変領域の中で抗体の親和性と特異性に対して最も大きな影響を与える領域であることは、当業者によく知られている。ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ配列の一般的な定義として、ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の２種類があり、例えばKabatら、"Sequences of Proteins of Immunological Interest"，National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991)；A1-Lazikaniら、J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997)；及びMartinら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA86:9268-9272 (1989)に参照する。所定の抗体の可変領域配列について、ＶＨ及びＶＬ配列におけるＣＤＲ領域の配列は、Ｋａｂａｔ定義又はＣｈｏｔｈｉａ定義に従って決定できる。本願の実施形態において、ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ定義を利用して定義される。本文において、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と略記され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と略記される。
所定の抗体の可変領域配列について、可変領域配列中のＣＤＲ領域の配列は、多くの方法で分析することができ、例えば、オンラインソフトウェアＡｂｙｓｉｓ（http://www.abysis.org/）を用いて決定できる。
本文に用いられる用語の「特異的結合」とは、例えば抗原性エピトープへの抗体の結合などの、２つの分子の間の非ランダム結合反応を指し、例えば、その非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍高い親和性でその特異的抗原と結合する抗体の能力を指す。しかし、抗体はその配列に関連する２種類以上の抗原と特異的に結合できることは、理解すべきである。例えば、本発明にかかる抗体は、ヒトと非ヒト（例えばマウスや非ヒト霊長類動物）のＴＳＬＰと特異的に結合できる。
本文に用いられるように、用語の「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、少数の個体で自然に生じた突然変異の可能性を除けば、集団を構成する個々の抗体が同一であるものを指す。本文に記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一または相同であり、且つ重鎖及び／又は軽鎖の残りが、別の種に由来するか、別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含み、且つ望ましい生物学的活性を示せることを前提として、このような抗体のフラグメントも含む（米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrisonら、Proc． Natl． Acad． Sci． USA 81：6851-6855 (1984)を参照する）。
本文に用いられるように、用語の「相同性」は、配列アライメント及びヌル位置の導入を経った後のアミノ酸又はヌクレオチド配列変異体における同一残基の百分率として定義し、且つ必要に応じて、達成された最大の百分率を相同性とする。比較に使用される方法とコンピュータプログラムは、本分野でよく知られている。本文に記載の「少なくとも８０％の相同性」とは、相同性が８０％～１００％の間のいずれかの値であることを意味し、例えば、８５％、９０％、９５％、９９％などである。
本文に用いられるように、用語の「ＴＳＬＰ関連疾患」は、ＴＳＬＰシグナル伝達経路の活性化に関連する疾患及び／又は症状を含む。例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫である。
一方、本願は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含み、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を提供する。下表３～６では、本願に開示される抗体に適用されるＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、重鎖と軽鎖のアミノ酸配列及び相応のヌクレオチド配列が例示的にリストされている。
具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号３、６、９及び１２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。他の具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号６、９及び１２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号９及び１２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号２、５、８及び１１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。他の具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号５、８及び１１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号８及び１１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号１、４、７及び１０に示されるアミノ酸配列から選ばれる。他の具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号４、７及び１０に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号７及び１０に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗体の重鎖可変領域は、配列番号２６、３２、３８及び４４から選ばれるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号２６、３２、３８及び４４から選ばれるアミノ酸配列からなる。
本文に開示される抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域を含んだ上で、軽鎖可変領域をさらに含んでも良い。
いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）は、配列番号１５、１８、２１及び２４に示されるアミノ酸配列から選ばれ、或いは配列番号１８、２１及び２４に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号２１及び２４に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４、１７、２０及び２３に示されるアミノ酸配列から選ばれ、或いは配列番号１７、２０及び２３に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号２０及び２３に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号１３、１６、１９及び２２に示されるアミノ酸配列から選ばれ、或いは配列番号１６、１９及び２２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号１９及び２２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２９、３５、４１及び４７から選ばれるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号２９、３５、４１及び４７から選ばれるアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗体の重鎖又は重鎖可変領域、軽鎖又は軽鎖可変領域は、上記に列挙したそれぞれの対応する具体的なアミノ酸配列に基づいて、少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失又は付加しても良く、得られた変異体は、ヒトＴＳＬＰと結合する活性を依然として保持する。
ある実施形態において、上記のようなアミノ酸の置換、欠失又は付加の数は、１～３０、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０である。好ましい実施形態において、配列変異体と元のアミノ酸配列の差異は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加である。より好ましい実施形態において、配列変異体と元のアミノ酸配列の差異は、約１、２、３、４又は５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加である。具体的な実施形態において、前記アミノ酸の置換は保存的置換である。
好ましい実施形態において、本文に開示される抗体は、抗体１１１Ｈ又は１６３Ｈであり、ただし、抗体１１１Ｈは、その重鎖配列が配列番号３９に示され、その軽鎖配列が配列番号４２に示され、その中で、ＬＣＤＲ配列が抗体１１１と同一であり、ＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ３が抗体１１１と同一であり、ＨＣＤＲ２配列が好ましく配列番号４９である；抗体１６３Ｈは、その重鎖配列が配列番号４５に示され、その軽鎖配列が配列番号４８に示され、その中で、ＣＤＲ配列が抗体１６３と同一である。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗体はモノクローナル抗体である。具体的な実施形態において、本文に開示される抗体はヒト化抗体である。
本文に開示される抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合できる。具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＳＬＰ又はカニクイザルＴＳＬＰと特異的に結合する。好ましい実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＳＬＰと特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＳＬＰとｈＴＳＬＰＲの結合を遮断できる；ＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化を阻害できる；ＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌を阻害できる。
本願はさらに、本文に開示される抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、並びに当該抗体を調製して精製する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識可能な制御配列と作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、適切な発現ベクターはいずれも本願に適用することができる。例えば、前記発現ベクターは、ｐＴＴ５、ｐＵＣ５７、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ及びｐＣＨＯ １．０のうちの一つであっても良い。発現ベクターは、適切な転写及び翻訳調節配列に連結された融合ＤＮＡ配列を含んでも良い。
いくつかの実施形態において、利用可能な宿主細胞は、上記発現ベクターを含む細胞であり、真核細胞であっても良く、例えば、哺乳類又は昆虫宿主細胞培養系はいずれも、本願にかかる抗体又はその抗原結合部分の発現に使用され得る。例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９やｓｆ２１などはいずれも本発明に適用できる。前記宿主細胞は、上記発現ベクターを含む原核細胞であっても良く、例えば、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）やＴＧ１などであっても良い。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を調製する方法は、以下のことを含む：発現条件下で宿主細胞を培養することで、抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を発現させる；及び発現された抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を分離して精製する。上記の方法を用いると、組換えタンパク質を、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動における単一バンドとして、実質的に均質な物質に精製することができる。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗ＴＳＬＰ抗体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて分離して精製することができ、利用されるアフィニティーカラムの特性に応じて、アフィニティーカラムに結合した抗ＴＳＬＰ抗体を、高塩緩衝液、ｐＨの変更などの通常の方法を用いて溶出することができる。
いくつかの実施形態において、本文に開示されるヒト化抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体は、実験室で調製されるヒトＴＳＬＰ抗原でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、より高い力価に達するまでマウスを免疫し繰り返した後、マウス脾臓細胞を採取してハイブリドーマ細胞と融合させ、ＴＳＬＰ阻害の機能活性を有するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングすることにより得られる。より具体的には、本願の発明者らは、数多くの実験により、まずヒトＴＳＬＰ抗原を個別に発現させ、これを基に異なるアジュバントと混合したヒトＴＳＬＰ抗原でマウスを免疫し、そして当該マウスの脾臓細胞をハイブリドーマ細胞株ｓｐ２／０と融合させ、融合したハイブリドーマからヒトＴＳＬＰ抗原を用いて陽性細胞株をスクリーニングし、ヒトＴＳＬＰＲ結合に対する阻害及びＴＳＬＰ機能に対する確実な阻害を実証した上で、標的細胞株を取得することに成功した。標的分子をヒト化した後、軽鎖と重鎖の両方の遺伝子を真核発現ベクターｐＣＨＯ１．０にクローニングした。上記発現ベクターをリポソーム法によりＣＨＯ細胞にトランスフェクトしてから、ピューロマイシンとメトトレキサートで陽性細胞クローンをスクリーニングし、スクリーニングして得られた高発現クローンを無血清培地で増幅培養し、ヒト化抗ヒトＴＳＬＰ抗原モノクローナル抗体をプロテインＡアフィニティーカラムにより分離又は精製した。
他のいくつかの実施形態において、例えばＰＣＲ変異誘発などの本分野の通常の技術を使用して、マウス由来の親抗体をさらに変更することで、抗体のキメラ又はヒト化形態、或いは他の変異形態を産生することができる。本願の親抗体は、例えば抗原の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメイン内で変異を誘発させることで変異抗体を産生することができ、例えば結合親和性（より低いＫＤ）、ＩＣ５０、特異性、優先的結合などの標的特性の存在についてスクリーニングすることができる。好ましくは、変異抗体における標的特性は、親抗体における特性に対して改善されたものである。アミノ酸置換変異抗体が好ましく、且つ親抗体分子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基が除去され、その代わりにそれらの位置に異なる残基が挿入される。置換変異誘発に用いられる最も注目される部位は、１つまたは複数のＣＤＲ領域であるが、フレームワーク領域（ＦＲ）での変更も考慮される。保存的アミノ酸置換が好ましいが、非保存的なアミノ酸変更を導入して、得られた変異抗体で標的特性をスクリーニングすることもできる。
いくつかの実施形態において、抗体のＦｃ領域の改変により、抗体の血清中半減期を延長させる。ヒトＦｃＲｎの抗体結合能を向上できるものとして確認された突然変異部位は主に、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｖ３０８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓであり、本実施形態において、これらの位置のアミノ酸の突然変異により、抗体の血清中半減期の延長を実現できる。ＡＤＣＣ効果を低減させるために抗体のＦｃ領域が改変され、報告されているＦｃ領域の突然変異部位は主に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅであり、本実施形態において、これらの位置のアミノ酸の突然変異により、ＡＤＣＣ効果の低減を達成できる。
本願は、本文に開示される抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本文に開示される上記抗ＴＳＬＰ抗体、例えば抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体と共に医薬品製剤に配合することで、より安定した治療効果を発揮できる。いくつかの実施形態において、これらの製剤は、本文に開示される抗ＴＳＬＰ抗体、例えば抗ヒトＴＳＬＰモノクロナル抗体のアミノ酸コア配列コンフォメーションの完全性を確保すると共に、タンパク質の多官能基を分解（凝集、脱アミド又は酸化を含むが、それらに限定されない）から保護することができる。いくつかの実施形態において、液体製剤の場合、通常は２℃～８℃で少なくとも１年間安定に保管することができる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥製剤の場合、３０℃で少なくとも６ヶ月間安定に保管することができる。
いくつかの実施形態において、前記抗ヒトＴＳＬＰ抗体モノクローナル抗体製剤は、懸濁液、水性注射剤、凍結乾燥製剤などの製薬分野で一般的に使用される製剤であってもよく、好ましくは水性注射剤又は凍結乾燥製剤であり、本文に開示される抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体の水性注射剤又は凍結乾燥製剤について、薬学的に許容される補助剤は、界面活性剤、溶液安定剤、等張性調節剤、緩衝液又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０又は８０）、ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシルサルコシン、オレイルサルコシン又はオクタデシルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴTMなどのノニオン性界面活性剤を含むが、それらに限定されず、抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体が粒状化する傾向を最小限に抑える量で添加すべきである。いくつかの実施形態において、溶液安定剤は、以下の列挙されるものの一種又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない：還元糖及び非還元糖などの糖類；グルタミン酸ナトリウム又はヒスチジンなどのアミノ酸；三級アルコール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのアルコール類など。溶液安定剤は、最終的に形成された製剤が、当業者が安定であると考える期間内で安定な状態を維持できる量で添加すべきである。等張性調節剤は、塩化ナトリウム、マンニトール又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。緩衝液は、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
本願はさらに、個体に抗ヒトＴＳＬＰ抗体、又は抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を含む組成物を投与することを含む、ＴＳＬＰ関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ヒトを含む動物への投与後に、抗免疫介在性炎症反応の効果は顕著である。具体的には、本文に開示される抗ヒトＴＳＬＰ抗体は、免疫介在性炎症反応を効果的に予防及び／又は治療することができ、抗炎症薬として使用できる。
本願はさらに、ヒトＴＳＬＰ関連疾患又は症状を予防又は治療するための医薬品の調製における、抗ヒトＴＳＬＰ抗体又は抗ヒトＴＳＬＰ抗体を含む組成物の使用も提供する。いくつかの実施形態において、前記ヒトＴＳＬＰ関連疾患又は症状は、免疫介在性炎症反応又は免疫介在性炎症性疾患である。
いくつかの実施形態において、前記免疫介在性炎症反応又は免疫介在性炎症性疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫を含むが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本文に開示される抗ヒトＴＳＬＰ抗体は、抗免疫介在性炎症反応薬として使用することができる。本願に記載の抗免疫介在性炎症反応薬とは、免疫介在性炎症反応を抑制及び／又は治療する能力を有する薬物を指し、例えば、免疫介在性炎症反応に関連する症状の進展を遅延させること、及び／又はそれらの症状の重症度を軽減させることができる薬物を指す。いくつかの実施形態において、前記薬物は、既存の炎症反応に伴う症状を軽減し、且つ他の症状の出現を防止することができる。いくつかの実施形態において、前記薬物はさらに、炎症反応の転移を低減又は防止することもできる。
本文に開示される抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体及びその組成物の投与量は、ヒトを含む動物に投与する場合、患者の年齢や体重、疾患の特徴や重症度、及び投与経路によって異なり、動物実験の結果や総合的な状況を参照することができるが、合計投与量は所定の範囲を超えてはいけない。
抗体又はその組成物の投与量と投与頻度は、疾患を予防するか治療するかによって変化しても良い。予防的な使用において、「予防的有効投与量」と定義される量で、本願の抗体又はその混合物を含む組成物をまだ病態になっていない患者に投与することで、患者の抵抗力を高める。この用途において、具体的な投与量はまた、患者の健康状態や全身的免疫力にも依存する。通常、頻度が比較的に少ない間隔で、比較的に低い投与量で長期間投与する。治療的な使用において、疾患の進行が遅くなるか終了するまで、好ましくは患者が疾患症状の一部的又は完全な改善を示すまで、比較的に短い間隔で比較的に高い投与量を投与することが必要な場合がある。それから、患者に予防的なプログラムを投与することができる。具体的な投与量と頻度は、当業者であれば実際の必要に応じて容易に把握できる。
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む」、「有する」及び「含有する」という言語は、「……を含むが、それらに限定されない」という意味を有し、且つ他の部分、添加物、成分又は工程を除外する意図を有していない。
本願の特定の様態、実施形態又は実施例において説明される特徴、特性、成分又は工程は、それらと矛盾しない限り、本文に記載される他の様態、実施形態又は実施例のいずれかに適用され得ることは、理解すべきである。
以上の開示は、本発明を一般的に説明するものである。以下の具体的な実施例は、本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものとして理解されるべきではない。実施例には、従来の通常方法の詳細な説明が含まれないが、そのような方法は、当業者によく知られており、多くの出版物、例えば分子クローニングのハンドブック、コールドスプリングハーバーの抗体技術実験マニュアルに記載されている。由来が明記されていない試薬は通常のものである。
＜実施例１ ヒトＴＳＬＰのｈＦｃタグ及びＦｌａｇタグ付き抗原、参照抗体Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂ、並びにヒトＴＳＬＰ受容体の細胞外セグメントのｈＦｃタグ付きタンパク質の調製＞
ヒトＴＳＬＰ抗原の配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９６９Ｄ９）より取得し、ホモサピエンスのコドン使用嗜好性に従ってコドン最適化を行い、Ｎ末端の２９～１５９位のアミノ酸フラグメントを遺伝子合成し、その配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングし、ｐＵＣ５７－ｈＴＳＬＰを得た。ｈＦｃフラグメントとＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｈＴＳＬＰフラグメントのＣ末端にＰＣＲで挿入し、ｐＴＴ５発現ベクター（研究所で保管されたもの）に構築し、ｐＴＴ５（ｈＴＳＬＰ－ｈＦｃ）とｐＴＴ５（ｈＴＳＬＰ－Ｆｌａｇ）を得てから、配列を決定し、完全に正しい配列を持つクローンを選択し、プラスミドを抽出してトランスフェクトした。
Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂのアミノ酸配列はＩＭＧＴから取得し、コドン最適化してから、重鎖の可変領域と軽鎖のヌクレオチド配列を全遺伝子合成した。重鎖の可変領域をＰＣＲでＩｇＧ２の定常領域にライゲーションしてから、ｐＴＴ５発現ベクターにクローニングし、軽鎖の配列もｐＴＴ５発現ベクターにクローニングし、配列決定で実証・確認した後で、プラスミドを抽出してトランスフェクションに備えた。
ヒトＴＳＬＰＲの配列はＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＨＣ７３）より取得し、ホモサピエンスのコドン使用嗜好性に従ってコドン最適化を行い、Ｎ末端の２３～２３１位のアミノ酸フラグメントを合成し、その配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングした。ｈＦｃフラグメントとＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｈＴＳＬＰＲ－ＥＣＤフラグメントのＣ末端にＰＣＲで挿入し、ｐＴＴ５発現ベクターに構築してから、配列を決定し、完全に正しい配列を持つクローンを選択してトランスフェクトした。
プラスミドをＰＥＩ法でＨＥＫ２９３Ｅ細胞株（研究所で保管されたもの）にトランスフェクトした。３ｍＭのバルプロ酸を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ社より購入）を用いて５日間培養した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より購入）又はＦｌａｇアフィニティークロマトグラフィー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社より購入）により細胞培養上清から標的タンパク質を精製した。タンパク質の定量は、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＢＣＡ）法で行い、精製されたタンパク質は、下記のさらなる分析・研究に使用した。精製されたタンパク質は、下記のマウス免疫及びさらなる分析・研究に使用した。
＜実施例２ ｈＴＳＬＰ－ｈＦｃによる免疫＞
１００μｇ／マウスのｈＴＳＬＰ－ｈＦｃ抗原を生理食塩水で７５μｌに希釈してから、等体積のフロイント完全アジュバントと混合し、超音波で完全に乳化してから、４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢生物科技有限会社より購入、動物生産許可番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１３－００１８）に皮下多点注射した。３週間後、５０μｇ／マウスのタンパク質を同様に７５μｌに希釈してから、等体積のフロイント不完全アジュバントと混合し、超音波で完全に乳化してから、マウスに皮下多点注射し、２週間後に再度この免疫を繰り返した。全てのマウスは、３回目の免疫の１週間後に尾を切って血液を採取して血清を分離し、ｈＴＳＬＰ－ｈＦｃ抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡにより血清力価を測定した。血清抗体力価が＞１０，０００のマウスについて、採血の１週間後に衝撃免疫（ｉｃｔｕｓ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｏｒｉｕｓ）を行った：１０μｇ抗原／１００μｌ生理食塩水／マウスを尾静脈より注射した。
力価の測定はＥＬＩＳＡ法で行った：ＥＬＩＳＡプレートは、１μｇ／ｍｌのコーティング濃度のｈＴＳＬＰ－ｈＦｃ抗原を用いて、１ウェルあたり１００μｌで、４℃で一晩コーティングされた。ＰＢＳＴ（０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレートを２回洗浄してから、叩いて乾燥させた。各ウェルに１％ＢＳＡ含有コーティング液を２００μｌずつ加え、常温で４時間ブロッキングした後、叩いて乾燥させ、使用するまで－２０℃の冷蔵庫で保管した。測定の際に、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに異なる濃度のマウス血清を１００μｌずつ加え、２つの重複ウェルを設定し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄してから、叩いて乾燥させた。ＰＢＳＴで１：１０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社から購入）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄してから、叩いて乾燥させた。各ウェルに発色液（使用直前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液と発色Ｂ液を１：１の体積比で均一に混合したもの）を１００μｌずつ加え、その後に２ＭのＨ２ＳＯ４終了液を１００μｌずつ加えて反応を終了させた。直ちにマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
＜実施例３ ハイブリドーマ融合とスクリーニング＞
ハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型的培養物保存委員会細胞バンク、保存番号ＴＣＭ－１８）は、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで培養し、融合前日に液交換をした。マウスの衝撃免疫の３日後に、マウスから脾臓細胞を採取して融合させた。融合とスクリーニングの方法は以下の通りであった：マウスの脾臓を採取し、研磨して洗浄した後、脾臓細胞をカウントした。脾臓細胞とｓｐ２／０細胞を１０：１の割合で混合し、１５００ｒｐｍで７分間遠心した。上清液を洗い流した。１分間以内にＰＥＧ（１４５０）を１ｍｌ加え、９０秒間軽く振とうし、２．５分間以内に一括に無血清ＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ社より購入）を５ｍｌ加え、反応を終了させるようにさらに無血清培地を５ｍｌ加え、５分間放置し、１２８０ｒｐｍで８分間遠心した。９６ウェルプレート１枚あたり２００万個のｓｐ２／０細胞の量で、１ウェルあたり２００μｌで細胞を９６ウェルプレートに均一に接種した。まずヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）とチミジン（Ｔ）を含むＨＡＴ培地でスクリーニングし、３～４日ごとに半量で液交換し、１０日目にＨＴ培地に切り替えた。１０日後、９６ウェルプレートの底部の１０％超えがハイブリドーマ細胞で満ちた時点で、上清を採取し、ｈＴＳＬＰ－ｈＦｃ抗原でコーティングされたマイクロプレートでＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡによる測定法は、実施例２に記載の方法と同様であった。陽性ハイブリドーマクローンを選択し、２４ウェルプレートで増幅培養し、限界希釈法でサブクローニングし、標的抗体を安定に発現するハイブリドーマ株を得て、保存してバンクを建築した。
＜実施例４ マウス由来抗ヒトｈＴＳＬＰモノクローナル抗体とヒトＴＳＬＰの結合＞
好ましいマウス由来抗ヒトｈＴＳＬＰモノクローナル抗体をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムでアフィニティー精製した後、ＢＣＡ法により定量を完了した。ｈＴＳＬＰに結合した抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体のＥＣ５０をＥＬＩＳＡで測定した。測定方法は、組換えヒトＴＳＬＰ ｆｌａｇをコーティング液で０．２μｇ／ｍｌに希釈し、マルチチャンネルピペットで９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで加え、室温で１．５時間インキュベートした。コーティング液を捨て、ＰＢＳＴで１回洗浄し、１％ＢＳＡ含有コーティング液で２００μｌ／ウェルでブロッキングし、室温で２時間インキュベートした。ブロッキング液を捨て、叩いて乾燥させ、使用に備えた。抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体を、１００μｇ／ｍｌの開始濃度から、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで３倍に１２勾配分で希釈した。マルチチャンネルピペットで上記勾配希釈された抗体を１００μｌ吸引してＥＬＩＳＡプレートに加え、１つの重複ウェルを設定し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で叩いて乾燥させた。
各ウェルにヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ抗体（使用直前に１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１０００倍に希釈したもの）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で叩いて乾燥させた。各ウェルに発色液（使用直前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液と発色Ｂ液を１：１の体積比で均一に混合したもの）を１００μｌずつ加え、発色後５分間に各ウェルに終了液を８０μｌずつ加えて反応を終了させた。直ちにマイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いてデータを解析した。実験結果は表１に示す。
＜実施例５ マウス由来抗ヒトｈＴＳＬＰモノクローナル抗体の、ＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの結合に対する阻害＞
組換えヒトＴＳＬＰＲ－ＥＣＤ－ｈＦｃを２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングバッファーでコーティングし、マルチチャンネルピペットで９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで加え、室温で１．５時間インキュベートした。コーティング液を捨て、ＰＢＳＴで１回洗浄した。
１％ＢＳＡ含有コーティング液で２００μｌ／ウェルでブロッキングし、室温で２時間インキュベートした後、叩いて乾燥させ、使用に備えた。マウス由来ＴＳＬＰ抗体を、１００μｇ／ｍｌの開始濃度から、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで３倍に１１勾配分で希釈し、等体積のＴＳＬＰ－ｆｌａｇ－ビオチンを２ｎｇ／ｍｌの濃度で勾配希釈された抗体に加え、室温で１時間インキュベートした。マルチチャンネルピペットで上記抗体とＴＳＬＰ－ｆｌａｇ－ビオチンの混合液を１００μｌ吸引してＥＬＩＳＡプレートに加え、１つの重複ウェルを設定し、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで２回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で叩いて乾燥させた。各ウェルにストレプトアビジン－ＨＲＰ抗体（使用直前に1％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１０００倍に希釈したもの）を１００μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＥＬＩＳＡプレートを吸水紙で叩いて乾燥させた。各ウェルに発色液（使用直前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液と発色Ｂ液を１：１の体積比で均一に混合したもの）を１００μｌずつ加え、発色後５分間に各ウェルに終了液を８０μｌずつ加えて反応を終了させた。直ちにマイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いてデータを解析した。実験結果は表２に示す。
＜実施例６ マウス由来抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体配列の測定＞
実施例４と５の実験結果に基づき、３０個のハイブリドーマ細胞株を選択して抗体配列を抽出した。各ハイブリドーマ細胞株からＴｒｉｚｏｌ（上海生工生物より購入）を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（ＡＢＩ社より購入）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。文献に報告されたプライマーで、ＰＣＲによりマウス由来抗ヒトｈＴＳＬＰモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域の遺伝子を増幅した後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングし、配列を決定し、可変領域遺伝子の配列を解析した。得られた配列をＧｅｎＢａｎｋでアライニングして解析したところ、全ての配列はマウスＩｇＧ可変領域遺伝子の特徴に合致した。好ましい抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は表３と表４に挙げられた。
＜実施例７ 抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体のヒト化＞
配列解析の結果により、２７、１０１、１１１、１６３番の抗体をキメラ抗体とヒト化抗体の構築に選んだ。キメラ抗体は、マウス由来抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を切り出し、それぞれオーバーラップＰＣＲでヒトＩｇＧ１の軽鎖と重鎖の定常領域に接続することにより構築した。
Ｋａｂａｔスキームにより、マウス由来抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、３つのＣＤＲと４つのＦＲを決定した。１６３番の抗体を一例として、ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔでヒトＩｇＧ生殖細胞系列配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）との相同性を比較することで、ＩＧＨＶ３－２３＊０４を重鎖ＣＤＲ移植テンプレートに選択し、マウス由来抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体１６３の重鎖ＣＤＲ領域をＩＧＨＶ３－２３＊０４のフレームワーク領域に移植し、重鎖ＣＤＲ移植抗体を構築した。同様に、ヒトＩｇＧ生殖細胞系列配列との相同性を比較することで、ＩＧＫＶ３－１１＊０１を軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートに選択し、マウス由来抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体１６３の軽鎖ＣＤＲ領域をＩＧＫＶ３－１１＊０１のフレームワーク領域に移植し、軽鎖ＣＤＲ移植抗体を構築した。同時に、それに基づき、一部のフレームワーク領域のアミノ酸部位を復帰突然変異させた。復帰突然変異の際に、アミノ酸配列をｋａｂａｔナンバリングし、部位の位置をｋａｂａｔ番号で指示した。好ましくは、軽鎖可変領域配列について、Ｋａｂａｔ番号第４３位のＡをマウス由来のＳに復帰突然変異させたと共に、第５８位のＩをＶに突然変異させた。重鎖可変領域第４９位のＡをＳに復帰突然変異させた。上記可変領域の遺伝子配列を、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用嗜好性に従って、生工生物社でコドン最適化して合成した。合成したヒト化可変領域配列をヒトＩｇＧ１定常領域に接続した抗体を、１６番の抗体のヒト化抗体（１６３－Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ、１６３Ｈ）と定義した。
上記と同様な原理により、残りの３つの抗体も同様にヒト化した。ヒト化抗体の配列は表５と表６に示す。ｐＴＴ５ベクターを用いてヒト化重鎖と軽鎖の一過性発現ベクターをそれぞれ構築し、ＨＥＫ２９３Ｅ系を用いて上記軽鎖と重鎖の組み合わせを一過性にトランスフェクトし、抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ社より購入）で培養し、ＰＥＩトランスフェクション法を用いて細胞にプラスミドをトランスフェクトした５日後に細胞上清を収穫し、プロテインＡで精製したことで、個々のヒト化モノクローナル抗体を取得した。
最終的に、２７番の抗体のヒト化された重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２５に示され、アミノ酸配列は配列番号２６に示される；ヒト化された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号２８に示され、アミノ酸配列は配列番号２９に示される。ヒトＩｇＧ１定常領域に接続することで、最終的に２７Ｈヒト化重鎖（配列は配列番号２７に示される）と２７Ｈヒト化軽鎖（配列は配列番号３０に示される）が得られた。
１０１番の抗体のヒト化された重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３１に示され、アミノ酸配列は配列番号３２に示される；ヒト化された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号３４に示され、アミノ酸配列は配列番号３５に示される。ヒトＩｇＧ１定常領域に接続することで、最終的に１０１Ｈヒト化重鎖（配列は配列番号３３に示される）と１０１Ｈヒト化軽鎖（配列は配列番号３６に示される）が得られた。
１１１番の抗体のヒト化された重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３７に示され、アミノ酸配列は配列番号３８に示される；ヒト化された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号４０に示され、アミノ酸配列は配列番号４１に示される。ヒトＩｇＧ１定常領域に接続することで、最終的に１１１Ｈヒト化重鎖（配列は配列番号３９に示される）と１０１Ｈヒト化軽鎖（配列は配列番号４２に示される）が得られた。
１６３番の抗体のヒト化された重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号４３に示され、アミノ酸配列は配列番号４４に示される；ヒト化された軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号４６に示され、アミノ酸配列は配列番号４７に示される。ヒトＩｇＧ１定常領域に接続することで、最終的に１６３Ｈヒト化重鎖（配列は配列番号４５に示される）と１０１Ｈヒト化軽鎖（配列は配列番号４８に示される）が得られた。
＜実施例８ ヒト化抗ヒトＴＳＬＰ抗体の、ＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの結合に対する阻害＞
ヒト化ＴＳＬＰ抗体について、実施例５の方法により、ＴＳＬＰとＴＳＬＰＲの結合に対する阻害作用を測定した。実験結果の詳細は表７に示す。
＜実施例９ ヒト化抗ヒトＴＳＬＰ抗体の、ＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化に対する阻害＞
まず、ｈＩＬ－７ＲとｈＴＳＬＰＲの２つの受容体を共発現する安定したＢａＦ３細胞株を構築した。これに基づいて、ｐＧＬ４．５２（Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入）に安定にトランスフェクすることで、ＩＬ－７Ｒ／ＴＳＬＰＲ－ＢａＦ３－Ｌｕｃ（ＳＴＡＴ５）の安定な細胞株を得た。
対数増殖期にあるＩＬ－７Ｒ／ＴＳＬＰＲ－ＢａＦ３－Ｌｕｃ（ＳＴＡＴ５）細胞を無血清ＩＭＤＭ培地で液交換し、３７℃インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、抗体を１００μｇ／ｍｌの開始濃度から、１ウェルあたり１００μｌで、３倍に１１勾配分で希釈した。その後、各ウェルに４ｎｇ／ｍｌのＴＳＬＰ－ｆｌａｇを５０μｌずつ加え、３０分間インキュベートした。無血清で一晩培養されたＩＬ－７Ｒ／ＴＳＬＰＲ－ＢａＦ３－Ｌｕｃ（ＳＴＡＴ５）細胞を無血清ＩＭＤＭ培地で遠心して液交換し、細胞濃度を１×１０6の最終濃度に調整し、十分に混合してから、１ウェルあたり５０μｌの細胞懸濁液を上記抗体溶液に加え、３７℃で４時間インキュベートした。ピペットチップで３回フリックすることで均一に混合してから、アッセイホワイトプレートの１ウェルあたりに混合液を７５μｌ取り、１つの重複ウェルを設定した。各ウェルにホタルフルオレセインのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ用基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入）を７５μｌ加え、２０分間放置した後、５６０ｎｍで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いてデータを解析した。実験結果は図１に示し、ＴＥＺ－１、１１１Ｈ、１６３Ｈ及びＴＥＺ－２のＩＣ５０は順次に、９５７．９ｎｇ／ｍｌ、１８４．４ｎｇ／ｍｌ、３７７．９ｎｇ／ｍｌと８５３．８ｎｇ／ｍｌであった。実験結果から分かるように、好ましい抗体のＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化を阻害する効果は、参照抗体よりも顕著に優れた。
＜実施例１０ ヒト化抗ヒトＴＳＬＰ抗体の、ＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌に対する阻害＞
ヒト化抗ヒトＴＳＬＰ抗体を、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で８０μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに５０μｌ／ウェルで添加した。ＴＳＬＰ－ｆｌａｇタンパク質を５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で１０ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、上記のＴＳＬＰ抗体を有する９６ウェル細胞培養プレートのウェルに５０μｌ／ウェルで加えた。培養プレートを３７℃インキュベーターに置いて１時間インキュベートした。新鮮なＰＢＭＣ（ＴＰＣＳ社より購入）を５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０培地で２×１０6細胞／ｍｌに調整し、上記の抗体が加えられた９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１００μｌで接種し、３つの重複ウェルを設定した。９６ウェルプレートを３７℃インキュベーターで２日間インキュベートした後、培養液上清を収穫し、Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて上清中のＴＡＲＣ含有量を測定した。実験結果は図２に示す。実験結果から分かるように、好ましい抗体のＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌を阻害する活性は、参照抗体よりも顕著に優れた。
＜実施例１１ ヒト化抗ヒトＴＳＬＰモノクローナル抗体のＴＳＬＰに対する親和性＞
発現して精製されたヒト化抗体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定し、参照抗体Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂはコントロールとした。具体的な実験方法は、プロテインＡ ＣＭ５センシングチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＦＣ１（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ １）をリファレンスチャネルとして、ＦＣ２（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ２）をサンプルチャネルとした。ヒト抗体又はコントロール抗体をそれぞれＦＣ２チャネルに捕捉し、その後、異なる濃度のｈＴＳＬＰ－Ｆｌａｇを注入した。サイクル条件は、ＦＣの全チャンネルにおいて、５０μｌ／ｍｉｎで分析物を４分間注入し、解離時間を２０分間とし、１０μｌ／ｍｉｎで６Ｍ塩酸グアニジン（シノファームグループ化学試薬有限会社）を３０秒間注入して表面再生を行い、その後、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアＶｅｒ１．０を用いて、捕捉された抗体のシグナルと捕捉されていない抗体のシグナルとの差及び相互作用の親和性を算出した。表８に示すように、ヒト化された抗体１６３ＨのｈＴＳＬＰに対する親和性は、参照抗体Ｔｅｚｅｐｅｌｕｍａｂと同等であった。
結論：本発明の抗体は、親和性や複数のインビトロ機能活性アッセイにおいて、対照抗体であるＴｅｚｅｐｅｌｕｍａｂよりも一貫して強い生物活性を示す。
本願は何らかの形で説明されたが、本願は本明細書に示されて説明されている内容に限定されるものではないことは、理解すべきである。本願の範囲から逸脱することなく、前記実施形態及び／又はある特徴やパラメータに様々な変更を加えることもできることは、当業者にとって自明である。これらの変更は全て、本願で主張する保護の範囲内に入っている。

Claims (17)

  1. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ｈＴＳＬＰ）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分であって、
    前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、
    前記ＨＣＤＲ１は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ３は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、
    前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
    前記ＬＣＤＲ１は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ３は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合部分。
  2. 前記重鎖可変領域は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  3. 前記重鎖は、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  4. 前記抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、及びｓｃＦｖフラグメントからなる群から選ばれる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  5. ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子又はカニクイザル胸腺間質性リンパ球新生因子と特異的に結合でき、前記抗原結合部分がヒト胸腺間質性リンパ球新生因子と６０ｐＭ未満のＫＤで結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  6. ＴＳＬＰ依存性ＳＴＡＴ５活性化を阻害することができ、ＰＢＭＣによるＴＡＲＣ分泌を良好に阻害できる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  8. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子。
  9. 請求項８に記載のヌクレオチド分子を含む発現ベクター。
  10. 請求項８に記載のヌクレオチド分子又は請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  11. ａ）請求項１０に記載の宿主細胞に前記抗体又はその抗原結合部分を産生させることができる発現条件下で、前記宿主細胞を培養することで、前記抗体又はその抗原結合部分を発現させる工程；及び
    ｂ）工程ａ）で発現された前記抗体又はその抗原結合部分を分離して精製する工程、
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分を調製する方法。
  12. ＴＳＬＰ関連疾患の予防又は治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  13. 前記ＴＳＬＰ関連疾患は免疫介在性炎症性疾患である、請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  14. 前記免疫介在性炎症性疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫から選ばれるものである、請求項１３に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  15. ＴＳＬＰ関連疾患の予防又は治療に使用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
  16. 前記ＴＳＬＰ関連疾患は免疫介在性炎症性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記免疫介在性炎症性疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患及びホジキンリンパ腫から選ばれるものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
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