JP7842689B2 - ウイルス模倣性ナノ粒子 - Google Patents

ウイルス模倣性ナノ粒子

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Description

発明の分野
本発明は、ナノ材料ならびに少なくとも第１のリガンドおよび第２のリガンドを含むナノ粒子に関する。本発明は、医薬または診断剤としての使用のためのナノ粒子にさらに関する。本発明は、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体ＶＥＧＦ Ａ調節不全、内皮ＶＥＧＦ Ａ調節不全、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、および乳がんなどのがんから選択される疾患を予防または処置する方法における使用のためのナノ粒子にも関する。さらに、本発明は、ナノ粒子を調製する方法に関する。
発明の背景
無数のナノ材料が、薬物治療または診断法のための担体として、ここ数年にわたって開発されてきた。標的細胞をｉｎ ｖｉｖｏで十分な特異性で同定する能力をそれらに持たせるために、細胞受容体に結合するリガンドが、その表面に係留されてきた。しかし、この古い枠組みに単純に従うことは、ナノ材料のアビディティを増加させるが、疑いの余地のない細胞同定のためには不十分であることが分かった。現時点では、ヘテロ－多価結合のためのいくつかの異なるリガンドを提示するナノ材料であっても、異なる細胞型間を識別することができない。
対照的に、ウイルスは、究極の標的細胞特異性を有するナノ粒子（ＮＰ）である。合成の生物医学的ナノ材料とは対照的に、ウイルスは、細胞同定のために連続的なマルチステップ認識プロセスを使用する。多くの現行のナノ粒子ベースのアプローチは、十分な特異性を欠如するので、ウイルス標的化戦略の活用は、この制限を克服するための実行可能な選択肢であり得る。したがって、ナノ材料を用いてインフルエンザＡウイルスなどのウイルスの逐次的な認識戦略を模倣することによって、細胞を特異的に標的化することが可能になり得る。特に、ウイルスの標的細胞認識は、粒子がタンパク質吸着に起因する表面改変を受ける場合、ｉｎ ｖｉｖｏで有利である可能性が高い。
特に、粒子取り込みを生じないが、細胞表面上のウイルス粒子密度を増加させる、細胞膜へのウイルス付着の初期ステップは、現在のナノ粒子設計戦略では欠けている。糖脂質および糖タンパク質または特異的受容体へのこの初期の接着は、ウイルス感染性にとって必須であることが見出されている。さらに、粒子が標的組織に到達した後にクリアランスに供される場合、それらの粒子は、薬物送達目的にとって不適切なものになる。メサンギウムの場合、初期の報告は、７０±２５ｎｍまたはそれ未満の直径を有する小さい粒子が、約８０～１００ｎｍの直径を有する糸球体内皮開窓を貫通していたことを示している。しかし、これらの粒子は、メサンギウムクリアランスを受けてきた。組織から迅速にクリアランスされる場合が多い既知のナノ粒子のこの問題は、ナノ粒子が標的組織中の標的細胞によって内在化される場合、克服され得る。
Ｍａｓｌａｎｋａ Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．［１］は、アンジオテンシン－Ｉであるリガンドを含むポリマーナノ粒子に関する。
Ｓａｈ ｅｔ ａｌ．［２］は、ブロックコポリマーおよび薬物を含むナノ粒子に関する。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細胞に向かう（ａｄｄｒｅｓｓ）ために、ウイルス模倣性細胞同定機構を持たせたナノ材料を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は、標的組織におけるｉｎ ｖｉｖｏでの前記ナノ粒子の有効な蓄積を可能にするナノ粒子を提供することである。本発明のさらなる目的は、薬物または診断剤を標的組織に送達することを可能にする薬物送達系を提供することである。
Ｍａｓｌａｎｋａ Ｆｉｇｕｅｒｏａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１９）２０１９０２５６３ Ｓａｈ Ｅ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ２０１５， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ７９４６０１
発明の概要
以下では、本発明の要素が記載される。これらの要素は、具体的な実施形態に列挙されるが、さらなる実施形態を創出するために、任意の様式で任意の数でこれらの要素が組み合わされ得ることを理解すべきである。種々に記載された例および好ましい実施形態は、明確に記載された実施形態のみに本発明を限定すると解釈すべきではない。この記載は、明確に記載された実施形態のうち２つもしくはそれよりも多くを組み合わせる、または明確に記載された実施形態のうち１つもしくは複数を任意の数の開示されたおよび／もしくは好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持および包含すると理解すべきである。さらに、本出願中の全ての記載された要素の任意の順列および組合せは、文脈が他を示さない限り、本出願の記載によって開示されたとみなすべきである。
第１の態様では、本発明は、ナノ材料ならびに少なくとも第１のリガンドおよび第２のリガンドを含むナノ粒子であって、
－ 前記第１のリガンドが、標的細胞への前記ナノ粒子の付着を媒介することが可能であり、
－ 前記第２のリガンドが、前記標的細胞中への前記ナノ粒子の内在化を媒介することが可能であり、
－ 好ましくは、前記ナノ材料が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、オキサゾリン由来ポリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ＰＥＧ－脂質、ブロックコポリマー、例えば、ＰＥＧ－ＰＬＡまたはＰＥＧ－ポリ－カプロラクトン、無機物質、例えば、金またはｑｄｏｔ材料、およびそれらの組合せのいずれかを含む
ナノ粒子に関する。
一実施形態では、前記第１のリガンドは、ＧＰＣＲ、例えば、アンジオテンシンＩＩ受容体１型（ＡＴ１ｒ）、ヒト神経ペプチドＹ１受容体およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型に結合する非アゴニスト性薬剤、ならびに／または標的細胞表面上の糖タンパク質および／もしくは糖脂質、例えば、ヘパラン硫酸、シアロ糖タンパク質、ガングリオシドおよびマンノース受容体に結合する薬剤であり、好ましくは、ＥＸＰ３１７４またはテルミサルタンである。
一実施形態では、前記第２のリガンドは、ｉ）好ましくは、ＲＧＤ、配列番号１の配列を有する環状ＲＧＤ－ペプチド、およびそれらの誘導体から選択される、インテグリン、例えば、αＶβ３インテグリンまたはαＶβ５インテグリンに結合する薬剤、ｉｉ）ＧＰＣＲ、例えば、ＡＴ１ｒに結合するアゴニスト性薬剤、好ましくは、活性化されたアンジオテンシン－ＩＩ、ｉｉｉ）エクト酵素、例えば、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼおよびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に結合する薬剤、好ましくは、アンジオテンシン－Ｉ、ならびに／またはｉｖ）トランスフェリン受容体に結合する薬剤、のいずれかである。
一実施形態では、前記ナノ粒子は、治療剤、好ましくは、ピルフェニドンおよびシナシグアトのいずれかをさらに含む。
一実施形態では、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドは各々、前記ナノ材料にカップリングされ、好ましくは、各々が前記ナノ材料のブロックコポリマー鎖にカップリングされる。
一実施形態では、前記ナノ材料は、１つよりも多くのブロックコポリマー鎖を含み、前記第１のリガンドは、前記ナノ材料の第１のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第２のリガンドは、前記ナノ材料の第２のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第１のブロックコポリマー鎖は、前記第２のブロックコポリマー鎖よりも長く、好ましくは、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも１．５倍の長さであり、より好ましくは、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも３倍の長さである。
一実施形態では、前記第１のブロックコポリマー鎖は、１ｋ～２０ｋ、好ましくは１ｋ～１０ｋの範囲のＰＥＧを含み、および／または５ｋ～４０ｋ、好ましくは１０ｋ～２０ｋの範囲のＰＬＡを含み、必要に応じて、前記第１のブロックコポリマー鎖は、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋであり、前記第２のブロックコポリマー鎖は、ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋである。
一実施形態では、前記第２のリガンドは、前記標的細胞中への前記ナノ粒子の前記内在化の前に酵素的に活性化される。
一実施形態では、前記標的細胞は、メサンギウム細胞、内皮細胞、例えば網膜内皮細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞および腫瘍細胞から選択される。
一実施形態では、前記粒子は、５ｎｍ～１０００ｎｍの、好ましくは、１０ｎｍ～１５０ｎｍの、より好ましくは、２０ｎｍ～１００ｎｍのサイズを有する。
一実施形態では、前記第１のリガンドの前記第２のリガンドに対する比は、２：１～１：２の範囲であり、好ましくは１：１である。
一実施形態では、前記粒子は、１ｐＭ～１００ｎＭ、好ましくは５０ｐＭ～１ｎＭの、標的化された受容体に対する粒子アビディティを有する。
一実施形態では、前記ナノ材料は、ＰＥＧを含み、前記粒子は、少なくとも５％の、好ましくは、少なくとも１５％の、より好ましくは、少なくとも２５％のリガンド／ＰＥＧのリガンド密度を有する。
さらなる態様では、本発明は、医薬または診断剤としての使用のための、上記実施形態のいずれかにおいて定義されたナノ粒子に関する。
さらなる態様では、本発明は、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体ＶＥＧＦ Ａ調節不全、内皮ＶＥＧＦ Ａ調節不全、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、および乳がんなどのがんから選択される疾患を予防または処置する方法における使用のための、上記実施形態のいずれかにおいて定義されたナノ粒子に関する。
さらなる態様では、本発明は、ナノ粒子を調製する方法であって、
ａ）好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、オキサゾリン由来ポリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ＰＥＧ－脂質、ブロックコポリマー、例えば、ＰＥＧ－ＰＬＡまたはＰＥＧ－ポリ－カプロラクトン、無機物質、例えば、金またはｑｄｏｔ材料、およびそれらの組合せのいずれかを含む１種または数種のナノ材料、ならびに必要に応じて治療剤を、任意の順序で提供するステップ；
ｂ）必要に応じて、前記１種または数種のナノ材料のいずれかから、ブロックコポリマーを調製するステップ；
ｃ）好ましくは、ＤＣＣ／ＮＨＳカップリングまたはＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによって、１つまたは複数のステップにおいて、第１のリガンドおよび第２のリガンドをそれにカップリングさせるステップ；
ｄ）ステップａ）において既に提供されていない場合に、治療剤、好ましくは親油性治療剤を提供するステップ；
ｅ）好ましくはナノ沈殿によって、前記ナノ材料にカップリングされたリガンドと前記治療剤とを使用して、ナノ粒子を調製するおよび得るステップ
を含む、方法に関する。
一実施形態では、ステップｅ）における前記得るステップは、０．０１～０．５の、好ましくは、０．０１～０．３の、より好ましくは、０．０１～０．１の多分散性指数を有するナノ粒子を得ることを含む。
この態様では、前記ナノ粒子、前記ナノ材料、前記治療剤、前記ブロックコポリマー、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドは、上で定義した通りである。
さらなる態様では、本発明は、上で定義したナノ粒子および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、疾患を予防または処置する方法であって、有効量のナノ粒子および／または医薬組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
この態様では、前記疾患、前記ナノ粒子、前記医薬組成物は、上で定義した通りである。
さらなる態様では、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造におけるナノ粒子の使用に関する。
この態様では、前記ナノ粒子および前記疾患は、上で定義した通りである。
さらなる態様では、本発明は、疾患の診断および／または予後判定のための診断剤の製造におけるナノ粒子の使用に関する。
この態様では、前記ナノ粒子および前記疾患は、上で定義した通りである。
詳細な説明
有害な物理化学的特性に起因する目的の組織における不十分なアベイラビリティは、薬物の失敗のよくある原因である。ウイルスは、それらの核酸をナノスケール粒子中に埋め込み、それらの標的細胞に高い特異性で向かうことによって、この制約を克服している。ナノテクノロジーは、薬物輸送のための多量のナノ担体を提供しているが、目的の細胞を疑いの余地なく同定するそれらの能力は、平凡なままであった。本発明者らは、本明細書で、細胞正体についての３回の連続的なチェックによって細胞を同定するウイルス様の能力を備えた粒子が、従来のナノ粒子と比較して、メサンギウム細胞をｉｎ ｖｉｖｏで同定する優れた能力を有することを示している。マウスでは、これは、腎臓メサンギウムにおける１５倍高い蓄積と、その後の大量の細胞取り込みとをもたらした。本発明は、薬物を標的組織中に輸送するための驚くほど有効なツールを提供し、このツールは、種々の疾患、例えば、それに対する薬物療法が現在存在しない糖尿病性腎症の処置における使用に適切である。
本発明者らは、受容体付着を媒介するために、ＮＰコロナ中にアンジオテンシン－ＩＩ １型受容体（ＡＴ１Ｒ）リガンドであるＥＸＰ３１７４を例えば有する粒子を設計した（図１Ａ）。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アンタゴニストとして、これは、結合が細胞ＮＰ取り込みを誘発できず、膜結合のみを誘発し、したがって、ＡＴ１Ｒのみを有するオフターゲット細胞による粒子取り込みを防止するという、最重要の利点を有する。
第２の認識基準として、本発明者らは、標的、例えば、粒子コロナ中のプロリガンドであるアンジオテンシン－Ｉ（Ａｎｇ－Ｉ）を認識し、それを活性なリガンドのアンジオテンシン－ＩＩ（Ａｎｇ－ＩＩ）に変換するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の存在について細胞表面を探索する能力を、粒子に持たせた。
第３の認識ステップとして、Ａｎｇ－ＩＩなどのリガンドが、ＡＴ１Ｒなどの標的に結合し、アゴニストとして、受容体結合の際に粒子の細胞取り込みを誘発する。標的細胞認識のプロセス全体は、フローチャートを用いて最良に例示され得る（図１Ｂ）。粒子を、それらの標的受容体アビディティおよび標的細胞特異性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。さらに、同じ受容体に向かう２つのリガンドである、細胞膜結合を促進するアンタゴニストおよび細胞内在化を支持するアゴニストの同時の提示が、細胞取り込みを媒介するＮＰの能力にどのように影響を与えるかを評価した。最後に、本発明者らは、かかるウイルス模倣性三重認識戦略を有する粒子が、メサンギウム細胞にｉｎ ｖｉｖｏで到達することに関して、従来のＮＰよりも優れていたことを示した。
ＮＰは、典型的には受動輸送機構によって生物中に分布されるので、特定の組織におけるそれらの出現は、それらの物理化学的特性の問題である。しかし、目的の組織において蓄積する粒子の割合は、それらが目的の細胞と能動的に相互作用することができる場合に増加され得る。細胞の正体を確認するためには、それぞれの受容体に結合するリガンドをＮＰに持たせることでは十分ではない。本発明の粒子は、細胞の段階的同定の戦略、特に、標的細胞への付着を媒介するための第１のリガンドおよび標的細胞中へのナノ粒子の内在化を媒介するための第２のリガンドを含む戦略がより有利であることを、明らかに実証している。
ウイルスを鋳型として使用して、本発明者らは、次々に行われる「ｉｆ－ｔｈｅｎ－ｅｌｓｅ」決定のシーケンスを実施することができるＮＰを設計した。各単一のステップにおいて、ＮＰは、それぞれ、受容体またはエクト酵素の存在について、リガンドまたは基質の助けにより細胞を探索する。それが成功である場合、次の同定ステップが続き、そうではない場合（ｅｌｓｅ）、細胞が標的細胞ではあり得ないことを粒子が「決定する」。ウイルスと同様、これは、「間違った」細胞型によるＮＰ取り込みの回避を助ける。
例として、ＧＰＣＲのファミリーに属する受容体、例えば、ＡＴ１Ｒを、決定実行粒子（ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｍａｋｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ）のために使用した。リガンド、例えば、ＧＰＣＲ－アンタゴニストを用いて、例えば、ＥＸＰ３１７４またはテルミサルタンを用いて細胞正体が検出される場合、（ｔｈｅｎ）この相互作用のポジティブな成果は、粒子が細胞表面に結合し、その場に留まることである。次の相互作用がポジティブになれない場合（ｅｌｓｅ）、粒子がオフターゲット細胞上に残るリスクがあることは明らかである。しかし、この場合、遊離粒子と結合粒子との間の熱力学的な平衡に起因して、予想され得るように、ｉｎ ｖｉｖｏでの遊離粒子の濃度の経時的な低下は、粒子が、「間違った」標的から時間と共に解離するように、平衡をシフトさせる。対照的に、細胞正体が、同じＧＰＣＲについてのアゴニスト、例えば、Ａｎｇ－ＩＩを用いて検出される場合、（ｔｈｅｎ）細胞のポジティブな応答（ａｎｓｗｅｒ）は、粒子内在化である。したがって、相互作用のための標的およびリガンドの型を注意深く選択することによって、粒子に、この研究において調査した例示的な標的よりもさらにより隠れた標的細胞の同定を可能にし得るロジックを持たせることができる。例は、例えば、内皮細胞を特異的に標的化することによって、存在する６０種よりも多くの細胞型間を粒子が識別することができる、網膜組織における局所的眼適用である。
用語「ナノ粒子」および「ＮＰ」は、本明細書で使用される場合、第１のリガンドおよび第２のリガンドを含むナノ材料構造に関する。特に、ナノ粒子は、３つ全ての外形寸法がナノスケールであるナノ物体、例えば、リポソーム、ポリマーナノ粒子、ミセル、脂質ナノカプセル、リポソーム、無機ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子またはＱｄｏｔである。一実施形態では、ナノ粒子は、優れた生体適合性および高度に調節可能な組成を提供する。ナノ粒子は、広範な種々の材料、例えば、ポリマー、生体分子および金属から産生され得る。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、例えば、腎臓のメサンギウム中の標的組織中に薬物を輸送することが可能なウイルス模倣性ナノ粒子である。一実施形態では、ナノ粒子は、ピルフェニドンおよび／またはシナシグアトを含み、糖尿病性腎症の処置における使用のためである。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＰＥＧおよびＰＬＡを含む生分解性ブロックコポリマーを含む。一実施形態では、第１および第２のリガンドは、ＤＣＣ／ＮＨＳまたはＥＤＣ／ＮＨＳを介してナノ粒子に共有結合的にカップリングされる。一実施形態では、前記ブロックコポリマーは、アセトニトリル中に溶解され、ポリマー混合物を得るためにＰＬＧＡと混合される（７０／３０、ｍ／ｍ）。一実施形態では、ナノ粒子は、ポリマー混合物を水相中に液滴で注入することによって、ナノ沈殿を使用して調製される。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、前記ナノ粒子の投与後非常に短い時間内に、即ち、＜１時間で、腎臓組織などの標的組織中に蓄積する。
一実施形態では、本発明のナノ粒子は、非常に小さく、即ち、＜８０ｎｍであり、それらの小さいサイズに起因して、開窓された内皮を介して血流から迅速に抜け出し、メサンギウム組織などの標的組織中に蓄積することができる。一実施形態では、前記ナノ粒子は、治療剤、好ましくは、ピルフェニドンおよびシナシグアトのいずれかをさらに含む。一実施形態では、前記粒子は、５ｎｍ～１０００ｎｍの、好ましくは、１０ｎｍ～１５０ｎｍの、より好ましくは、２０ｎｍ～１００ｎｍのサイズを有する。一実施形態では、粒子サイズは、動的光散乱、粒子散乱拡散測定（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｉｆｆｕｓｏｍｅｔｒｙ）、ナノ粒子追跡解析、原子間力顕微鏡または透過電子顕微鏡、好ましくは、動的光散乱または透過電子顕微鏡を使用して測定される。粒子のサイズは、球状粒子の中心を通り、その終点が球状粒子上にある任意の直線セグメントに関するその直径によって決定される。非球状粒子の場合、直径は、前記非球状粒子の中心を通り、その終点が粒子上にある最長の線セグメントに関する。一実施形態では、平均直径は、ナノ粒子のバッチ中に含まれるナノ粒子の直径の平均に関する。一実施形態では、本発明の粒子は、０．０１～０．５の、好ましくは、０．０１～０．３の、より好ましくは、０．０１～０．１の多分散性指数を有する。一実施形態では、多分散性指数は、動的光散乱、粒子散乱拡散測定、ナノ粒子追跡解析、原子間力顕微鏡または透過電子顕微鏡、好ましくは、動的光散乱または透過電子顕微鏡を使用して測定される。一実施形態では、用語「ナノ粒子」および「粒子」は、互換的に使用される。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、医薬における使用のためである。一実施形態では、ナノ粒子は、例えば、－２０ｍＶ～０ｍＶの、または－１５ｍＶ～－５ｍＶの、正の、負のまたは中性であるζ電位を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、ナノ材料を含む少なくとも１つのコアならびに必要に応じてその表面上のポリマーおよび／またはリンカーを含み、前記第１のリガンドおよび第２のリガンドは、前記ポリマーおよび／またはリンカーにカップリングされる。一実施形態では、粒子は、ポリマーコアを有する。
用語「ウイルス模倣性」は、本明細書で使用される場合、ウイルスの細胞標的化アプローチが模倣されるアプローチに関する。本発明のウイルス模倣性粒子は、少なくとも２つの逐次的なステップを有する認識プロセスによって、標的細胞によって内在化されている。かかる２ステッププロセスでは、第１のステップは、粒子上の第１のリガンド、例えば、ＥＸＰ３１７４またはテルミサルタンが、標的細胞上で発現されている標的、例えば、メサンギウム細胞上のアンジオテンシン受容体に結合することである。引き続いて、粒子は、標的細胞中に内在化され、これは、標的細胞上の標的に結合する第２のリガンド、例えば、活性化されたアンジオテンシンＩＩまたは環状アミノ酸配列（シクロＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ；配列番号１）によって媒介され、それにより、粒子のエンドサイトーシスを開始させる。一実施形態では、第１および第２のリガンドの逐次的な提示は、ｉ）第２のリガンドのために使用されるより短いリンカー、例えばより短いＰＥＧ－ＰＬＡ鎖と比較して、第１のリガンドのためにより長いリンカー、例えばより長いＰＥＧ－ＰＬＡ鎖を使用することによって媒介される立体制御によって、および／またはｉｉ）内在化を媒介することが可能になるように第２のリガンドが活性化される必要がある活性化ステップ、例えば、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換によって、達成される。一実施形態では、リガンドの逐次的な提示は、リガンド改変なしの従来の粒子と比較して、メサンギウム細胞などの標的細胞におけるナノ粒子の１５倍高い蓄積を可能にする。一実施形態では、前記粒子は、１ｐＭ～１００ｎＭ、好ましくは５０ｐＭ～１ｎＭの、標的化された受容体に対する粒子アビディティを有する。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、医薬または診断剤としての使用のためである。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体ＶＥＧＦ Ａ調節不全、内皮ＶＥＧＦ Ａ調節不全、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、および乳がんなどのがんから選択される疾患を予防または処置する方法における使用のためである。一実施形態では、用語「ナノ粒子」、「ウイルス模倣性粒子」および「決定実行ナノ粒子」は、互換的に使用される。
用語「ナノ材料」は、本明細書で使用される場合、ナノスケールの任意の外形寸法を有する、またはナノスケールの内部構造もしくは表面構造を有する材料に関する。一実施形態では、前記ナノ材料は、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、オキサゾリン由来ポリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ＰＥＧ－脂質、例えば、ＤＰＳＥ－ＰＥＧおよびステアリン酸（ａｃｉｄ ｓｔｅａｒｉｃ）ＰＥＧ、ブロックコポリマー、例えば、ＰＥＧ－ＰＬＡまたはＰＥＧ－ポリ－カプロラクトン、無機物質、例えば、金またはｑｄｏｔ材料、およびそれらの組合せのいずれかを含む。一実施形態では、前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドは各々、前記ナノ材料にカップリングされ、好ましくは、各々が前記ナノ材料のブロックコポリマー鎖にカップリングされる。一実施形態では、前記ナノ材料は、１つよりも多くのブロックコポリマー鎖を含み、前記第１のリガンドは、前記ナノ材料の第１のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第２のリガンドは、前記ナノ材料の第２のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第１のブロックコポリマー鎖は、前記第２のブロックコポリマー鎖よりも長く、好ましくは、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも１．５倍の長さであり、より好ましくは、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも３倍の長さである。一実施形態では、前記第１のブロックコポリマー鎖は、１ｋ～２０ｋ、好ましくは１ｋ～１０ｋの範囲のＰＥＧを含み、および／または、５ｋ～４０ｋ、好ましくは１０ｋ～２０ｋの範囲のＰＬＡを含む。一実施形態では、前記第１のブロックコポリマー鎖のＰＥＧ鎖は、前記第２のブロックコポリマー鎖のＰＥＧ鎖よりも長い。一実施形態では、１つのリガンドは、１つのＰＥＧ分子にカップリングされる。用語「ｋ」は、本明細書で使用される場合、ポリマー鎖、例えば、ブロックコポリマー鎖、ＰＥＧおよび／またはＰＬＡに関して、キロダルトン（ｋＤａ）を指す。例えば、１ｋ～２０ｋの範囲のＰＥＧは、１ｋＤａ～２０ｋＤａの範囲のＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ５ｋＤａに関する。一実施形態では、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋおよびＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋは、それぞれ、ＰＥＧ５ｋＤａ－ＰＬＡ１０ｋＤａおよびＰＥＧ２ｋＤａ－ＰＬＡ１０ｋＤａに関する。一実施形態では、前記第１のブロックコポリマー鎖は、ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋであり、前記第２のブロックコポリマー鎖は、ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋである。一実施形態では、前記ナノ材料は、ＰＥＧ（ＰＥＧ総）の総量を含み、前記粒子は、少なくとも５％の、好ましくは、少なくとも１５％の、より好ましくは、少なくとも２５％のリガンド／ＰＥＧ総のリガンド密度を有し、用語「リガンド」は、第１のリガンドおよび第２のリガンドの両方を含む。一実施形態では、リガンド／ＰＥＧのリガンド密度は、≦５０％である。
用語「第１のリガンド」は、本明細書で使用される場合、標的細胞へのナノ粒子の付着を媒介することが可能なリガンドに関する。一実施形態では、第１のリガンドは、標的細胞への粒子の結合を開始させるにすぎず、標的細胞中への粒子の内在化は開始させず、標的細胞への第２のリガンドの引き続く結合が、前記標的細胞中への前記粒子の内在化を開始させるために必要とされる。一実施形態では、第１のリガンドは、ナノ粒子に共有結合的または非共有結合的にカップリングされる。一実施形態では、第１のリガンドは、標的細胞へのナノ粒子の結合を誘発する任意の生体分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片、ペプチド、アプタマー、ＤＮＡナノ構造、受容体リガンドおよび受容体である。一実施形態では、前記第１のリガンドは、ＧＰＣＲ、例えば、アンジオテンシンＩＩ受容体１型（ＡＴ１ｒ）、ヒト神経ペプチドＹ１受容体およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型に結合する非アゴニスト性薬剤、ならびに／または標的細胞表面上の糖タンパク質および／もしくは糖脂質、例えば、ヘパラン硫酸、シアロ糖タンパク質、ガングリオシドおよびマンノース受容体に結合する薬剤であり、好ましくは、ＥＸＰ３１７４またはテルミサルタンである。一実施形態では、ＧＰＣＲに結合する非アゴニスト性薬剤は、標的細胞への粒子の結合を誘発するが、標的細胞中への粒子の内在化、例えばエンドサイトーシスは誘発しない。一実施形態では、第１のリガンドおよび／または第２のリガンドは、遍在的には発現されないが、標的組織中の標的細胞上で優勢に発現される標的に結合する。一実施形態では、第１のリガンドおよび／または第２のリガンドは、ＫＤ＜１００ｎＭの親和性で、標的細胞上の標的構造に結合する。一実施形態では、第１のリガンドおよび／または第２のリガンドは、＜１５００Ｄａの分子量を有する。一実施形態では、用語「標的」および「標的構造」は、互換的に使用される。一実施形態では、用語「標的構造」は、標的細胞の表面上に提示されるタンパク質、ペプチド、核酸、サッカライド、糖脂質および／または糖タンパク質に関する。一実施形態では、第１のリガンドは、機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）のための遊離カルボン酸残基を有する任意のＡＴ１Ｒアンタゴニストである。一実施形態では、第１のリガンドは、選択的ＡＴ１アンタゴニスト、例えば、ＥＸＰ３１７４（ロサルタンカルボン酸）またはテルミサルタンであり、これらは、強力かつ選択的なＡＴ１アンタゴニスト、または必要に応じて、その生物学的に活性な誘導体である。一実施形態では、「生物学的に活性な誘導体」は、それぞれＥＸＰ３１７４またはテルミサルタンと同じ生物学的機能、例えば、同じ結合機能および／または治療的機能を有する。
用語「非アゴニスト性薬剤」は、本明細書で使用される場合、標的構造に対するアゴニスト性効果を有さない、好ましくは、標的細胞中への内在化を媒介する前記標的構造に対して効果を有さない、前記標的構造に結合する薬剤に関する。
用語「第２のリガンド」は、本明細書で使用される場合、標的細胞中へのナノ粒子の内在化を媒介することが可能なリガンドに関する。一実施形態では、標的構造、例えば、標的細胞上の受容体への第２のリガンドの結合は、標的細胞中へのナノ粒子の内在化を開始させる。一実施形態では、標的細胞上の標的構造は、標的細胞の表面上で典型的には発現される任意の構造、例えば、表面分子、受容体および／またはバイオマーカーである。一実施形態では、標的細胞上の標的構造は、健康な細胞と比較して、病理学的状態にある細胞において、典型的には過剰発現される分子である。一実施形態では、第１のリガンドおよび第２のリガンドは、標的細胞上の同じ標的構造を標的化し、または標的細胞上の異なる標的構造を標的化する。一実施形態では、第２のリガンドは、ナノ粒子に共有結合的または非共有結合的にカップリングされる。一実施形態では、第２のリガンドは、標的細胞中へのナノ粒子の内在化を誘発する任意の生体分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片、ペプチド、アプタマー、ＤＮＡナノ構造、受容体リガンドおよび受容体である。一実施形態では、前記第２のリガンドは、ｉ）好ましくは、ＲＧＤ、配列番号１の配列を有する環状ＲＧＤ－ペプチド、およびそれらの誘導体から選択される、インテグリン、例えば、αＶβ３インテグリンに結合する薬剤、ｉｉ）ＧＰＣＲ、例えば、ＡＴ１ｒに結合するアゴニスト性薬剤、好ましくは、活性化されたアンジオテンシン－ＩＩ、ｉｉｉ）エクト酵素、例えば、レグマイン、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼおよびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に結合する薬剤、好ましくは、アンジオテンシン－Ｉ、ならびに／またはｉｖ）トランスフェリン受容体に結合する薬剤、のいずれかである。一実施形態では、前記第２のリガンドは、前記標的細胞中への前記ナノ粒子の前記内在化の前に酵素的に活性化される、例えば、アンジオテンシン－Ｉは、ＡＴ１ｒへの前記第２のリガンドの結合および前記標的細胞中への前記粒子の内在化の前に、ＡＣＥによってアンジオテンシン－ＩＩへと活性化される。一実施形態では、第２のリガンドの酵素的活性化は、標的細胞の表面上のエクト酵素によって実施され、好ましくは、前記酵素的活性化は、前記第２のリガンドの酵素的切断を含み、それにより、活性化された第２のリガンドを提供する。代替的な実施形態では、前記第２のリガンドは、内在化を媒介する前に酵素的に活性化されない。一実施形態では、前記第１のリガンドの前記第２のリガンドに対する比は、２：１～１：２の範囲であり、好ましくは１：１である。一実施形態では、第２のリガンドは、前記第１のリガンドが前記標的細胞に結合した後に、前記標的細胞に結合する。一実施形態では、前記標的細胞への前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドの逐次的な結合は、前記標的細胞に対する特異性を増加させる。
一実施形態では、第２のリガンドがＡＴ１ｒを標的化する場合、アンジオテンシン－Ｉである第２のリガンドが、アンジオテンシン－ＩＩである第２のリガンドよりも好ましいが、それは、アンジオテンシン－Ｉのアンジオテンシン－ＩＩへの酵素的活性化の中間のステップが、ナノ粒子の増加した特異性を可能にするからである。一実施形態では、第１のリガンドがＥＸＰ３１７４であり、第２のリガンドがアンジオテンシン－ＩＩ、またはアンジオテンシン－ＩＩへと活性化されるアンジオテンシン－Ｉである場合、第１のリガンドおよび第２のリガンドは共に、標的細胞上の同じ標的構造、即ちＡＴ１Ｒに結合する。この実施形態では、ＥＸＰ３１７４である第１のリガンドは、アンタゴニストとしてＡＴ１Ｒに結合し、必要に応じて酵素的活性化後にアンジオテンシン－ＩＩである第２のリガンドは、アゴニストとしてＡＴ１Ｒに結合する。第１のリガンド、例えばＥＸＰ３１７４の結合の後、第２のリガンドのために利用可能なＡＴ１Ｒ結合部位がなおも存在する。一実施形態では、第１のリガンドによって結合される標的の結合部位および第２のリガンドによって結合される標的の結合部位は、異なる結合部位であり、または同じ結合部位であるが逐次的に結合される。
一実施形態では、第２のリガンドは、ｉ）立体障害、例えば、第１のリガンドのブロックコポリマー鎖もしくはリンカーよりも短い、第２のリガンドのブロックコポリマー鎖もしくはリンカーによって、および／またはｉｉ）第２のリガンドが内在化を媒介することが可能になる前の、第２のリガンドの酵素的活性化の必要性によって、前記標的細胞への結合から遮蔽される。
用語「付着を媒介することが可能な」は、本明細書で使用される場合、標的細胞への第１のリガンドの結合能力に関する。第１のリガンドは、付着を媒介することが可能である、即ち、第１のリガンドは、好ましくは、標的細胞上の標的構造を標的化することによって、標的細胞へのナノ粒子の結合を誘発する。一実施形態では、標的細胞への第１のリガンドの前記結合は、標的細胞中へのナノ粒子の内在化を誘発しない。一実施形態では、標的細胞中へのナノ粒子の内在化のために、さらなる相互作用、即ち、好ましくは、第１のリガンドの標的構造と同じまたは異なる標的細胞上の標的構造を標的化する第２のリガンドを含む、第２のリガンドと標的細胞との相互作用が必要とされる。一実施形態では、第１および第２のリガンドは、同じ標的構造に結合し得るが、標的構造の異なる部位、例えば、アゴニスト結合部位およびアンタゴニスト結合部位に結合し得る。
用語「内在化を媒介することが可能な」は、本明細書で使用される場合、第２のリガンドが標的細胞中へのナノ粒子の内在化を誘発する能力に関する。一実施形態では、第２のリガンドは、標的細胞上の標的構造に結合し、それにより、標的細胞中へのナノ粒子の内在化を開始させる。一実施形態では、内在化を誘発する前記能力は、内在化を誘発する前に、例えば酵素的活性化によって活性化される能力を含み得る。一実施形態では、前記内在化には、受容体媒介性エンドサイトーシス、クラスリン被覆されたピットおよび／またはカベオラのいずれかが関与する。
用語「標的細胞」は、本明細書で使用される場合、病理学的状態、即ち疾患に関与する細胞に関する。一実施形態では、疾患の処置は、前記疾患に関与する細胞を、本発明のナノ粒子を用いて標的化することを含む。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、薬物を前記標的細胞に輸送する薬物送達系として機能する。一実施形態では、前記標的細胞は、メサンギウム細胞、内皮細胞、例えば網膜内皮細胞、および腫瘍細胞から選択される。
用語「治療剤」は、本明細書で使用される場合、医学的処置のために意図された任意の物質に関する。一実施形態では、治療剤は、ナノ粒子の粒子本体、即ちコア中に、例えば、前記ナノ粒子の内側に、および／もしくは粒子ナノ材料の至る所に含まれ、ならびに／またはリンカーを使用して前記ナノ粒子にカップリングされる。一実施形態では、前記治療剤は、親油性治療剤であり、粒子本体によって被包されるおよび／または含まれる。一実施形態では、治療剤は、例えば、切断可能なリンカーによって、前記粒子に非共有結合的または共有結合的にカップリングされる。一実施形態では、前記治療剤は、ナノ粒子の任意の構成成分に共有結合的または非共有結合的にカップリングされ得る。一実施形態では、前記治療剤は、抗線維化剤または化学療法剤である。一実施形態では、前記治療剤は、ピルフェニドンおよびシナシグアトのいずれかである。用語「粒子本体」は、本明細書で使用される場合、粒子の主要な支持構造に関する。例えば、粒子本体は、リポソームの脂質二重層に、またはポリマーおよび／もしくは固体脂質粒子のコア構造に関し得る。一実施形態では、本発明のナノ粒子には、メサンギウム細胞などの標的細胞を治療剤を用いて特異的に処置するための治療剤が負荷される。一実施形態では、粒子中に負荷される治療剤、例えば、ピルフェニドンまたはシナシグアトは、ポリマー相中に溶解され、粒子ポリマーコアの調製の間に前記粒子中に取り込まれ、および／または粒子によって含まれる水相、例えば、リポソームによって含まれる水相中に溶解され、および／または粒子によって含まれる脂質相、例えば、リポソームによって含まれる脂質相中に溶解される。ピルフェニドンは、ＴＧＦ－ベータアンタゴニストであり、メサンギウム関連の病理学的線維症を処置するための候補として提唱されている。シナシグアト（ＢＡＹ ５８－２６６７）は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）活性化因子であり、糖尿病性腎症を処置するために提唱されている。一実施形態では、治療剤ピルフェニドンまたはシナシグアトは、粒子の特性を顕著に変化させることなしに、ナノ粒子のポリマー性コア中に効率的に取り込まれ、これは、治療剤の親油性特性に起因して可能である。一実施形態では、前記ナノ粒子は、糖尿病性腎症の処置における使用のためであり、前記治療剤は、抗線維化剤である。一実施形態では、前記ナノ粒子は、がんの処置における使用のためであり、前記治療剤は、化学療法剤である。
本発明は、本発明のナノ粒子および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物にさらに関する。本発明のナノ粒子は、薬学的に許容される組成物を得るために、適切な補助物質および／または添加剤と混合され得る。かかる物質は、ナノ粒子の安定性、溶解度、生体適合性もしくは生物学的半減期を増加させる、薬理学的に許容される物質を含み、またはある特定の経路の適用など、例えば、静脈内溶液、スプレー、バンドエイド（登録商標）もしくは丸剤のために含められる必要がある物質を含む。本発明は、医薬における使用のため、例えば、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体ＶＥＧＦ Ａ調節不全、内皮ＶＥＧＦ Ａ調節不全、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、および乳がんなどのがんから選択される疾患を予防または処置する方法における使用のための、本発明のナノ粒子を含む組成物にも関する。
本発明のナノ粒子は、メサンギウム細胞などの標的細胞のための新規ウイルス模倣性認識原理を使用し、これは、メサンギウムなどの標的組織におけるナノ粒子の高度に効率的な蓄積を生じる。一実施形態では、ナノ粒子は、適切な治療剤と組み合わされる、即ち、治療剤は、ナノ粒子中に取り込まれおよび／またはナノ粒子に連結され、標的組織中の標的細胞、例えば、メサンギウム中のメサンギウム細胞の標的化された治療を可能にする。一実施形態では、治療剤を含むナノ粒子は、糖尿病性腎症を予防または処置するために使用される。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、少なくとも２つのステップを有する認識プロセスを使用して標的細胞を標的化することを可能にする。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、第１のリガンドとしての選択的ＡＴ１アンタゴニスト、例えばＥＸＰ３１７４を含み、治療剤、好ましくは、ピルフェニドンおよび／またはシナシグアトをさらに含む。一実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＥＸＰｃＲＧＤナノ粒子、即ち、第１のリガンドとしてのＥＸＰ３１７４および第２のリガンドとしてのｃＲＧＤ、特にｃＲＧＤｆＫを含むナノ粒子であり、またはナノ粒子は、ＥＸＰＡｎｇ－Ｉナノ粒子、即ち、第１のリガンドとしてのＥＸＰ３１７４および第２のリガンドとしてのＡｎｇ－Ｉを含むナノ粒子である。一実施形態では、前記ＥＸＰｃＲＧＤナノ粒子および／またはＥＸＰＡｎｇ－Ｉナノ粒子は、治療剤、好ましくは、ピルフェニドンおよび／またはシナシグアトをさらに含む。一実施形態では、前記ナノ粒子は、第１のリガンドとしての選択的ＡＴ１アンタゴニスト、例えばＥＸＰ３１７４を含むナノ粒子、好ましくは、ＥＸＰｃＲＧＤナノ粒子であり、シナシグアトである治療剤をさらに含む。一実施形態では、前記ナノ粒子は、ＰＬＧＡおよび／またはＰＥＧ－ＰＬＡを含むまたはそれからなるナノ材料を含む。
用語「投与する」は、本明細書で使用される場合、薬剤、例えば、本発明のナノ粒子および／または本発明の医薬組成物の投与に関し、これは、薬剤が標的細胞に到達するのを可能にする任意の方法によって達成され得る。これらの方法には、例えば、注射、経口摂取、吸入、経鼻送達、外用投与、沈着、移植、坐剤、またはナノ粒子による標的細胞へのアクセスが得られる、投与の任意の他の方法が含まれる。注射は、静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内注射に関し得る。移植は、本発明のナノ粒子を含む移植可能な薬物送達系を挿入することを含み得、ならびに／またはナノ粒子を含むヒドロゲル、特に、ｉｎ ｓｉｔｕでゲル化し、ナノ粒子を遅れて放出する皮下および／もしくは腹腔内注射されるヒドロゲルに関し得る。坐剤には、グリセリン坐剤が含まれる。吸入は、単独の、または吸収され得る担体に付着してのいずれかの、吸入器中のエアロゾルを用いてナノ粒子を投与することを含む。ナノ粒子は、液体中に、例えば、コロイド形態で懸濁され得る。
「有効量」は、疾患および／または状態について見出された症状を軽減する、ナノ粒子または医薬組成物の量である。
用語「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物、好ましくは、哺乳動物に関する。患者の処置は、例えば、疾患もしくは状態、例えば、がんもしくは糖尿病性腎症を予防すること、処置すること、その症状を低減させること、またはかかる疾患もしくは状態を治癒させることを含む意味である。
用語「ブロックコポリマー」は、本明細書で使用される場合、共有結合的結合によって連結された２つまたはそれよりも多くのホモ－またはコポリマーサブユニットを含むポリマーに関する。接合ブロック（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋ）である中間の非反復サブユニットが含まれ得る。ブロックコポリマーは、異なる重合したモノマーのブロックで構成される。用語「ブロックコポリマー鎖」は、ブロックコポリマーの鎖に関する。
用語「ＤＣＣ／ＮＨＳカップリング」および「ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング」は、本明細書で使用される場合、カップリング反応に関する。ＮＨＳで活性化された分子を合成するための一般的な方法は、ＮＨＳを、例えば、所望のカルボン酸、および少量の有機塩基と無水溶媒中で混合することである。次いで、カップリング試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が、高度に反応性の活性化された中間体を形成するために添加される。一実施形態では、第１のリガンドおよび第２のリガンドは、少なくとも２つのステップで、前記ナノ材料にカップリングされる。一実施形態では、第１のリガンドおよび第２のリガンドは、リンカーを介して、融合タンパク質を介しておよび／またはＰＥＧを介して、前記ナノ材料にカップリングされる。
本発明者らは、本明細書で、細胞正体を二重／三重チェックするウイルス模倣性ＮＰが、標的化されたＭＣにおける増強されたＮＰ蓄積をｉｎ ｖｉｖｏで可能にすることを首尾よく示している。ウイルスの初期細胞付着を模倣するアンタゴニスト性リガンドを、酵素媒介性の標的細胞認識プロセスと組み合わせることによって、粒子は、例外的な標的細胞特異性と共に、並外れて高いｉｎ ｖｉｔｒｏ標的アビディティを有した。本発明者らは、同じＧＰＣＲへの、粒子に係留されたアゴニストおよびアンタゴニストの同時のヘテロ－多価結合が、粒子取り込みを驚くべきことにもたらすこともまた実証している。全体として、非特異的なサイズ媒介性の受動的標的化は、ＭＣにおける満足できる粒子蓄積を達成するには十分ではない。単一のリガンドを用いた伝統的な粒子機能化であっても、不十分なアプローチのようである。しかし、複雑なマルチステップウイルス標的細胞結合および認識プロセスを模倣することによって、本発明者らは、ＭＣを同定し、ＭＣ中に蓄積することができる粒子を得た。これは、腎疾患を含む種々の疾患の処置のための薬物の送達のための新たな選択肢を広げる。
本発明者らは、立体的に制御された逐次的なリガンド－受容体相互作用に起因して糸球体メサンギウム細胞を効果的に標的化したアデノウイルス模倣性ブロックコポリマーナノ粒子をさらに製造した。ヘテロ－多価ＮＰは、それにより、正確に調節可能な物理化学的特徴を示しただけでなく、両方の標的モチーフに対する優れたアビディティもまた示し、ピコモル濃度範囲での実質的なＡＴ１ｒ結合、および機能化されていないＮＰと比較して有意に増加したメサンギウム細胞取り込みをもたらした。これらの特色から利益を得て、ウイルス模倣性ＮＰは、オフターゲット細胞の周辺環境においてさえ、メサンギウム細胞を選択的に標的化することができた。さらに、ヘテロ－多価ＮＰは、必要なｉｎ ｖｉｖｏでの堅牢性を示し、腎臓内のわずかなオフターゲット沈着のみを伴って、メサンギウム領域におけるｉｎ ｖｉｖｏでの効率的な蓄積をもたらした。際立って、ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、それにより、ホモ－機能的ｃＲＧＤまたはＥＸＰ ＮＰと比較して、はるかに良好なメサンギウム標的化を示した。本発明者らは、２つの異なるウイルスにインスピレーションを受けた概念を用いて、同じ明確な細胞型をｉｎ ｖｉｖｏで標的化することができたので、本発明者らは、ウイルス感染パターンの模倣が、高度に有効な標的化概念を可能にすると結論付けている。さらに、首尾よいメサンギウム細胞標的化は、メサンギウム関連腎臓病理の洗練された治療を可能にするが、それは、現在利用可能な全ての他のアプローチと比較して、薬物送達をこれが劇的に増加させるからである。
本発明は、以下の図面を参照してここでさらに記載される。
以下の図面の説明中で言及される全ての方法は、実施例において詳細に記載されるように実施した。
図１は、ウイルス模倣性の付着および標的細胞認識を示す。（Ａ）それらのコロナ上にＥＸＰ３１７４およびＡｎｇ－Ｉを有するＮＰ（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ）は、ＥＸＰ３１７４媒介性のＡＴ１Ｒ結合を介して細胞膜に付着する。特異的認識は、酵素的Ａｎｇ－ＩプロセシングおよびＡｎｇ－ＩＩ媒介性の内在化を介して誘発される。（Ｂ）決定実行ＮＰの三重標的細胞認識を例示するフローチャート。
図２は、ナノ粒子特徴付けを示す。（Ａ）リガンドで修飾されたＮＰのアセンブリ。（Ｂ）ＰＥＧ含量に対して正規化した異なるＮＰ種のモル濃度リガンド含量、（Ｃ）サイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）ならびに（Ｄ）得られたＮＰ製剤のζ電位。結果は、少なくともｎ＝３回の測定の平均±ＳＤとして示される。
図３は、ＡＴ１ＲおよびＡＣＥとのｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用を示す。細胞内カルシウム測定によって決定した、リガンドで修飾されたＮＰの、それらの標的ＡＴ１Ｒ（Ａ～Ｄ）およびＡＣＥ（Ｅ～Ｆ）との相互作用。ＡＴ１Ｒについての（Ａ）リガンド親和性および（Ｂ）粒子アビディティ。（Ｃ）遊離リガンドおよび粒子結合リガンドについてのＩＣ５０値。（Ｄ）リガンドで修飾された粒子によるＡＴ１Ｒ阻害の動力学的測定。（Ｅ）ＮＰＥＸＰＡｎｇ－ＩおよびＮＡｎｇ－Ｉのミカエリス・メンテン動力学。（Ｆ）リガンドおよびＮＰ濃度に基づいて計算した、遊離Ａｎｇ－Ｉおよび粒子結合Ａｎｇ－Ｉについての特異性定数（Ｋｃａｔ／ｋｍ）。結果は、少なくともｎ＝３回の測定の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性のレベルは、異なる時点におけるＮＰＥＸＰおよびＮＰＥＸＰＡｎｇ－ＩのＡＴ１Ｒ阻害を比較して、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１ならびに＃ｐ≦０．０００１およびｘ≦０．００１として示される。ｎ．ｓ．：有意ではない。
図４は、異なるインキュベーション時間におけるＹＦＰタグ付きＡＴ１Ｒ（緑色）でトランスフェクトした標的ラットメサンギウム細胞（ｒＭＣ）細胞（白色）（ｐＡＴ１Ｒ－ｒＭＣ）中のＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ（赤色）の細胞内在化を示す。スケールバー２０μｍ。
図５は、ウイルス模倣性ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの取り込み特異性を示す。（Ａ）遊離ＥＸＰ３１７４およびカプトプリルによって阻害された、ｒＭＣにおけるＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ、ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰのリガンド媒介性の内在化（図１１および１２もまた参照のこと）。（Ｂ）ＡＴ１ＲおよびＡＣＥ陽性のｒＭＣおよびＨＫ－２細胞ならびにＡＴ１ＲおよびＡＣＥ陰性のＨｅＬａ細胞におけるＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの取り込み。フローサイトメトリーを介して解析した、標的ｒＭＣとオフターゲット（Ｃ）ＮＣＩ－Ｈ２９５－Ｒ細胞または（Ｄ）ＨｅＬａ細胞との共培養における粒子取り込みの特異性。（Ｅ）深い赤色で染色した（ＣＴＤＲ）オフターゲットＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞（白色）との共培養における、緑色で染色された（ＣＴＧ）ｒＭＣ（緑色）における粒子取り込み（赤色）のＣＬＭＳイメージ。スケールバー２０μｍ。（図１３もまた参照のこと）。結果は、少なくともｎ＝３回の測定の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性のレベルは、カプトプリルまたはＥＸＰ３１７４阻害ありおよびなしの、細胞におけるＮＰの取り込みを比較して、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１および＃ｐ≦０．０００１として示される。ｎ．ｓ．：有意ではない。
図６は、マウス腎臓におけるＮＰ分布を示す。（Ａ）腎臓糸球体中に位置するＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ蛍光（白色矢印）。（Ｂ）対照の標的化されていないＮＰＭｅＯは、腎臓糸球体中に蓄積せず、粒子関連蛍光を欠如する。青色：細胞核のＤＡＰＩ染色；緑色：組織自己蛍光；赤色：ＮＰ関連蛍光。左から右に、四角く切り取られた領域は、拡大図として示される。
図７は、蛍光顕微鏡を介して解析した、腎臓糸球体において検出されたＮＰ関連蛍光の評価を示す。（Ａ）異なる粒子製剤で処置したマウスの腎臓糸球体（点線の丸）のイメージ。スケールバー４０μｍ。図１４Ｂもまた参照のこと。（Ｂ）完全糸球体ＮＰ－蛍光の定量的解析。（Ｃ）外および内皮質の糸球体中の粒子関連蛍光の比較。（Ｄ）ＭＣのＣＬＳＭおよびインテグリン－α８染色を介して決定した、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの糸球体局在化（スケールバー２０μｍ）。（Ｃ）および（Ｄ）中の結果は、ＮＰ試料１つ当たりｎ＝６マウスの少なくともｎ＝１２０の蛍光測定の平均±ＳＤとして示される。統計的有意性のレベルは、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１として示される。ｎ．ｓ．：有意ではない。
図８は、ＰＥＧ－ＰＬＡブロックコポリマーへのリガンドカップリングを示す。（Ａ）Ｌｙｓ－Ａｎｇ－Ｉおよび（Ｂ）ＥＸＰ３１７４を、それぞれ、ＥＤＣ／ＮＨＳまたはＤＣＣ／ＮＨＳ化学を使用して、カルボン酸で終わるまたはアミンで終わるＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋに連結させた。（Ｃ）モル濃度リガンドおよびＰＥＧ含量の定量化によって示された完全なポリマー機能化。（Ｄ）ＥＸＰ３１７４改変ポリマー上の未反応のＮＨ２ポリマー末端基の非存在を、フルオレスカミン（ｆｌｕｒｅｓｃａｍｉｎｅ）を使用して決定した。スチューデントｔ検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して実施して、統計的有意性を評価した。統計的有意性のレベルは、ＭｅＯ－およびＥＸＰ３１７４－の蛍光を、ＮＨ２で終端したＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋと比較して、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１として示される。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図９は、最大カルシウムシグナルおよびＮＰＥＸＰによる阻害を示す。ｒＭＣを、Ａｎｇ－ＩＩおよびＮＰＥＸＰで同時に刺激し、得られた細胞内カルシウム応答を、１分間即座に測定した。使用したＮＰＥＸＰ濃度において、ＥＸＰ３１７４リガンドは、アッセイ持続時間の間、アゴニストで誘発されたカルシウムシグナルを阻害しなかった。したがって、Ａｎｇ－ＩＩ測定値に対するＥＸＰ３１７４の影響は、無視できるとみなした。結果は、少なくともｎ＝３回の測定の平均±ＳＤとして示される。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図１０は、ＣＬＳＭを介して解析したＡＴ１Ｒ陽性ｐＡＴ１Ｒ－ｒＭＣにおける経時的な異なる粒子製剤の取り込みを示す。（Ａ）ＮＰＥＸＰは、細胞系において内在化されず、大部分は、細胞膜、および経時的に大きいクラスターを形成する細胞間の糸状仮足（ｆｉｌｉｐｏｄｉａ）に位置する。受容体結合は、ＮＰ関連蛍光および受容体関連蛍光の共局在化によって示される。（Ｂ）ＮＰＡｎｇ－Ｉは、それらの細胞質局在化によって示されるように、細胞によって内在化される。（Ｃ）ＮＰＭｅＯは、特異的標的化を可能にする係留されたリガンドの欠如に起因して、細胞に関連しない。細胞：白色；ＡＴ１Ｒ－ＹＦＰ：緑色；ＮＰ製剤：赤色。スケールバー２０μｍ。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図１１は、ＥＸＰ３１７４が、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ上の長いポリマー鎖によるＡｎｇ－Ｉリガンドの立体障害に起因する取り込み減少を相殺することを示している。２０％のＡｎｇ－Ｉ密度を有するＮＰＡｎｇ－Ｉ（灰色）を、変動するポリマー密度のＣＯＯＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを用いて調製し、フローサイトメトリーを使用してそれらの細胞取り込みについて解析した。付随して、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ（黄色）を、変動する密度のＥＸＰ３１７４－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを用いて調製して、Ａｎｇ－Ｉの立体障害に対する第２のリガンドの効果を比較した。ＥＸＰ３１７４によるＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ上の長いポリマー鎖の機能化は、機能化されていない長いポリマーを添加した場合のＡｎｇ－Ｉリガンドの立体障害に起因して減少した取り込みを相殺し、粒子内在化を有意に増加させた。結果は、少なくともｎ＝３回の測定の平均±ＳＤとして示される。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して実施して、統計的有意性を評価した。統計的有意性のレベルは、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１として示される。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図１２は、ＣＬＳＭを介して解析したＮＰ取り込みの特異性を示す。細胞を、異なるＮＰ製剤（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ、ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰ）の添加前に、遊離ＥＸＰ３１７４と共に３０分間事前インキュベートした。標的受容体の阻害は、粒子関連蛍光の抑制を生じた。スケールバー２０μｍ。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図１３は、標的細胞およびオフターゲット細胞の共培養における（Ａ）ＮＰＥＸＰおよび（Ｂ）ＮＰＡｎｇ－Ｉの取り込みを示す。ＮＰＥＸＰは、ｒＭＣおよびＮＣＩ－Ｈ２０５Ｒ細胞における蓄積を示すが、それは、これらの細胞が共にＡＴ１Ｒを有するからである。対照的に、ｒＭＣおよびＨｅＬａ細胞の共培養は、ｒＭＣにおけるＮＰＥＸＰの優先的な蓄積を示すが、それは、ＨｅＬａ細胞が、細胞膜上に少量の受容体のみを発現するからである（［３］を参照のこと）。ＮＰＡｎｇ－Ｉは、より高い特異性を示すが、それは、これらが、ＡＣＥを欠如するオフターゲット細胞（ＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞）よりも、標的ｒＭＣ中に優先的に蓄積するからであり、標的ｒＭＣは、それらの内在化のために必要な装置（ＡＣＥおよびＡＴ１Ｒ）を有する。細胞核：青色；オフターゲット細胞（ＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ）：白色；標的細胞（ｒＭＣ）：緑色；ＮＰ：赤色。スケールバー２０μｍ。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図１４は、異なるＮＰ製剤のｉｎ ｖｉｖｏ分布を示す。（Ａ）マウス腎臓におけるＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰの腎臓分布。ＮＰＡｎｇ－Ｉは、この領域には蓄積しなかったＮＰＥＸＰとは対照的に、糸球体の大多数において小さいＮＰ関連蛍光を示す。糸球体には、より良い可視化のために、白色矢印でマークを付ける。左から右に、四角く切り取られた領域は、拡大図として示される。細胞核のＤＡＰＩ染色：青色；組織自己蛍光：緑色；ＮＰ関連蛍光：赤色。（Ｂ）ＮＰを標識するために使用した遊離色素の腎臓分布。ＣＦ６４７を、対照としてマウス中に注射して、腎臓におけるその分布を評価した。糸球体（白色の丸でマークを付けた）における蛍光を伴わずに、強い蛍光が尿細管領域において検出できた。これは、粒子－試料について見られた蛍光が、粒子自体に由来し、その低い分子量に起因して自由に濾過される漏出した色素由来ではないことを実証している。（Ｃ）ＮＲＭＩマウスにおける１時間の循環後の異なるＮＰ製剤の血漿滞留。注射の１時間後の血漿中のＮＰ蛍光を測定し、注射の５分後に測定した蛍光（初期粒子血液蛍光）に対して正規化した。標的化されていないＮＰ（ＮＰＭｅＯ）は、それらのＰＥＧ－シェルによって付与されたステルス効果に起因する最も高い血液循環時間を示す。粒子ステルス効果を減少させる、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ表面上の全てのポリマーの４０％がリガンドにカップリングされても、それらは、標的化されていない粒子の血液滞留と一致することができる。これらは、１つのリガンドのみによって機能化した粒子（ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰ）と比較して、１時間後に血漿中で有意なより高い蛍光を示す。特異的２ステップウイルス模倣性認識機構を有するＮＰＡｎｇ－Ｉはまた、ＮＰＥＸＰよりも有意な優れた血液滞留を示し、これは、共通して標的化されたＮＰを示す。対照として、粒子を標識するために使用した遊離色素（ＣＦ６４７）を、マウス中にさらに注射したが、これは、その後に血液循環からその自由濾過へと迅速に消失する（１時間後に初期蛍光の６％）。（Ｃ）の結果は、少なくともｎ＝６の試料の平均±ＳＤとして示される。スチューデントｔ検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して実施して、統計的有意性を評価した。統計的有意性のレベルは、＊ｐ≦０．０５、＊＊＊ｐ≦０．００１および＊＊＊＊ｐ≦０．０００１として示される。ｎ．ｓ．：有意ではない。詳細な方法については、実施例１を参照のこと。
図１５は、標的細胞への付着のための第１のリガンドおよびナノ粒子の認識／前記標的細胞中へのその内在化のための第２のリガンドを含む、本発明の決定実行ナノ粒子の例示的なｉｎ ｖｉｖｏ使用を示す。本発明のナノ粒子は、種々の標的組織、例えばメサンギウムを標的化するために使用され得る。ナノ粒子は、標的細胞の表面上の標的受容体および／または分子を標的化する第１および第２のリガンドを選択することによって、特異的標的組織を標的化するためにカスタマイズされ得る。
図１６は、粒子で処置した動物の横断腎臓切片を示す。Ａ）ウイルス模倣性粒子は、腎小体における高い蓄積を示す（丸い標識）。Ｂ）第１のリガンドおよび第２のリガンドを有さない未改変のナノ粒子は、糸球体組織中への顕著な取り込みを示さない。
図１７は、アデノウイルス模倣性ＮＰが、受動的および能動的標的化戦略の相乗的な組合せを介して糸球体メサンギウム細胞に進入することを示す。（ａ）投与の際に、ＮＰは、糸球体毛細血管系へと次いで分岐する輸入細動脈を介して、腎濾過システムの糸球体領域に到達する。（ｂ）糸球体毛細血管内で、ＮＰは、その網状構造に起因して、腎フィルターを通過できないが、内皮開窓を介して血管外遊出することができ、それにより、隙間に位置するメサンギウムに到達する。（ｃ）その後、ウイルス模倣性ＮＰは、アンジオテンシンＩＩ受容体１型（ＡＴ１ｒ）への初期結合および引き続くαＶβ３インテグリン媒介性のエンドサイトーシスを介して、メサンギウム細胞に効果的に浸潤することができる。（ＡＡ：輸入細動脈；ＥＡ：輸出細動脈；ＭＣ：メサンギウム細胞；ＰＯ：有足突起；ＦＰ：小足；ＥＴ：内皮；ＢＭ：基底膜）。
図１８は、アデノウイルス模倣性ＮＰの特徴付けを示す。（ａ）ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰならびにホモ－機能的または機能化されていないＮＰ種の粒子設計。（ｂ）ＤＬＳ解析。全ての粒子型を、顕著な凝集なしに、６０ｎｍのサイズ閾値を下回って製造した（ＰＤＩ：多分散性指数）。（ｃ）ゼータ電位測定値。ポリマーミックスへのＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋの添加は、負の表面電荷を生じる。（ｄ）／（ｅ）ＮＰ製造後の、それぞれｃＲＧＤｆＫおよびＥＸＰ３１７４リガンド表面密度の定量化。最終表面含量は、ｃＲＧＤｆＫ（Ｒ２＝０．９９５７）およびＥＸＰ３１７４（Ｒ２＝０．９８７１）の両方について、リガンド機能化ポリマーの前もって添加された量と正比例した。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。
図１９は、アデノウイルス模倣性ＮＰのＡＴ１ｒ相互作用を示す。（ａ）遊離ＥＸＰ３１７４または粒子結合ＥＸＰ３１７４で処置したｒＭＣのＡＴ１ｒ刺激後の細胞内カルシウムレベル。ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ（ＩＣ５０＝２７６±３１ｐＭ）およびＥＸＰ ＮＰ（ＩＣ５０＝５５２±７３ｐＭ）は共に、ＡＴ１ｒに効果的に結合し、それにより、ＡＴ１ｒを阻害し、アンジオテンシンＩＩ（ＡＴＩＩ）によるＡＴ１ｒ刺激の際の低いＣａ２＋流入を生じた。この効果は、多価性由来のアビディティ増大に起因して、遊離ＥＸＰ３１７４（ＩＣ５０＝２．６６±０．９ｎＭ）についてよりも、さらに強かった。（ｂ）ＡＴ１ｒリガンドなしのＮＰで処置したｒＭＣについてのＡＴ１ｒ活性。機能化されていない対照ＮＰもｃＲＧＤ ＮＰも、ＡＴ１ｒに有意には結合できず、ＡＴＩＩ刺激の際に最大カルシウムレベルを生じ、アッセイの特異性を確認した（Ｍ＝ＮＰまたはＥＸＰ３１７４のいずれかの、モル濃度）。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。
図２０は、標的メサンギウム細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＰの内在化を示す。（ａ）０．０５ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）５６８で標識したＥＸＰｃＲＧＤナノ粒子とのインキュベーション後の、ＣＴＤＲで染色されたｒＭＣのＣＬＳＭ解析。ＮＰ関連蛍光（紫色）が、ｒＭＣサイトゾル内の小胞構造（灰色）において検出できた。インキュベーション時間の増加と共に、エンドサイトーシス小胞は、サイズ、数および強度において共に成長し、より大きいエンドソームへの小胞の融合を示す（スケールバー２０μｍ）。（ｂ）ｒＭＣ中へのＮＰ取り込みのフローサイトメトリー解析。ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、対照ＮＰならびにホモ－機能的ＮＰと比較して、実質的に増加した細胞取り込みを示した。（ｃ）６０分間のＮＰインキュベーション後のフローサイトメトリー結果。ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、全ての他のＮＰ型と比較して、最大細胞会合を示したが、過剰量の遊離ｃＲＧＤｆＫ（ｃ＝５００μＭ）の添加は、蛍光シグナルを、ＥＸＰ ＮＰのレベルまで鋭く減少させ、これは、ＮＰ取り込みのαＶβ３依存性を示す。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。◇Ｐ＜０．０００１、○Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ＡＦＵ、任意の蛍光単位）。
図２１は、メサンギウム細胞とのＮＰ相互作用のＴＥＭ解析を示す。（ａ）ｒＭＣ内の多数の小胞構造（黒色矢印）中に蓄積したＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ。異なるサイズの小胞が、細胞サイトゾルの外側部分および内側部分の両方中に存在し、これは、細胞内プロセシングおよびより大きいエンドソームへの融合を示している。さらに、かなりの数のＮＰが、細胞膜になおも位置し、これは、粒子が初期細胞結合および引き続くエンドサイトーシスの段階的プロセスを受けたことを示唆している（右側のイメージは、左側の黒色の四角のズームインした図を示す）。（ｂ）対照的に、ＥＸＰ ＮＰは、それらがｒＭＣ細胞の明確な表面構造に結合した場所である細胞境界においてのみ蓄積し、これは、膜に結合したＡＴ１ｒとの可能な相互作用を示している（左上角のイメージは、黒色の四角のズームインした図を示す）。（ｃ）対照ＮＰは、ｒＭＣとの無視できるほどの相互作用のみを示し、金で増強されたＮＰはほとんど眼に見えなかった。
図２２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養アッセイにおけるＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰのメサンギウム細胞選択性を示す。（ａ）オフターゲット細胞として作用したＣＴＤＲで標識したＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞（灰色）と共に共培養した、ＣＴＧで染色されたｒＭＣ（緑色）のＣＬＳＭ解析。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で染色した（青色）。ｒＭＣ／ＨｅＬａ共培養（上の横列）について、ＮＰ由来蛍光（紫色）は、ｒＭＣの領域内でのみ検出することができ、これは、標的細胞中への選択的ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ取り込みを示している。ｒＭＣとＡＴ１ｒ発現ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞との共培養は、多様なＮＰ分布をもたらす（下の横列）。ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、それにより、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞の表面にも結合し、細胞境界周囲の拡散したパターンをもたらした。しかし、丸形のエンドサイトーシス小胞中への効率的な粒子取り込みは、メサンギウム細胞においてのみ見ることができた（スケールバー２０μｍ）。ＨｅＬａ（ｂ）およびＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ（ｃ）の両方とのｒＭＣのフローサイトメトリー解析は、ＣＬＳＭ結果を支持したが、それは、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、両方の場合に、ｒＭＣとの有意により高い細胞会合を示したからである。興味深いことに、（ｃ）における過剰量の遊離ＥＸＰ３１７４（ｃ＝１ｍＭ）の添加は、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞とのＮＰ相互作用を鋭く低減させ、これは、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、ＡＴ１ｒを介してＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞にもはや結合できなかったことを示している。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｎ．ｓ．：有意でない．ＡＦＵ、任意の蛍光単位）。
図２３は、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが強い糸球体内蓄積をｉｎ ｖｉｖｏで示すことを示している。横断腎臓凍結切片を、蛍光顕微鏡を使用してイメージングした。組織学的評価を促進するために、細胞核をＤＡＰＩで染色し（青色）、組織自己蛍光を記録した（緑色）。ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ（赤色）は、皮質の糸球体領域（白色の丸）中にほぼ排他的に蓄積したことが見出されたが、尿細管領域中の蛍光は無視できた（左上から右下に、イメージは、白色の四角のズームインした図を示す）。
図２４は、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、メサンギウム細胞における有意に増強された蓄積を示すことを示している。（ａ）蛍光顕微鏡解析により、糸球体（白色の丸）内の高い蛍光レベルが、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰについて主に検出することができたことが明らかになった。ＥＸＰ ＮＰは、糸球体における中等度の蓄積を示したが、対照ＮＰおよびｃＲＧＤ ＮＰは、顕著な程度まで一切シグナルを生じなかった（スケールバー２０μｍ。較正バー：０～６５５３５グレイの値）。（ｂ）糸球体内蛍光強度の正確な定量化を、十分な数の糸球体について、糸球体の面積当たりの積分した密度を評価することによって達成した。それにより、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、全ての他の粒子型と比較して、糸球体１つ当たり、はるかにより高い蛍光強度を示した。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝６０）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ＡＦＵ、任意の蛍光単位）。（ｂ）メサンギウム表面マーカーインテグリンα－８についての抗体染色は、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ関連蛍光（赤色）が、メサンギウム細胞によって覆われた領域と共に共局在化したことを示し（黄色）、これは、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、エンドサイトーシスを介してメサンギウム細胞に選択的に浸潤することができたことを示している。スケールバー２０μｍ。
図２５は、リガンド機能化ＰＥＧ－ＰＬＡブロックコポリマーのための合成概念を示す。（ａ）変動する鎖長さ（２ｋＤａ／５ｋＤａ）のヘテロ－二機能的ＰＥＧポリマー（（１））を、３，６－ジメチル－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（（２））と混合して、開環重合を介してＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋならびにＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ（（３））を創出した。（ｂ）引き続いて、ＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、ＤＣＣ／ＮＨＳ化学を介して、ＥＸＰ３１７４（（４））のカルボキシル基に共有結合的にカップリングさせ、ＥＸＰ３１７４－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ（（５））を得た。（ｃ）さらに、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を介して、ｃＲＧＤｆＫ（（６））のリシン残基に結合させて、より短いｃＲＧＤｆＫ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ（（７））をもたらした。（ｄ）合成されたＥＸＰ３１７４－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋについてのカップリング効率を、ＰＥＧおよびＥＸＰ３１７４の両方のモル濃度を比較することによって決定した。それにより、モル濃度は、有意には変動せず、これは、首尾よい機能化を示している。（ｅ）ｃＲＧＤｆＫ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋについてのカップリング効率もまた、ＰＥＧおよびｃＲＧＤｆＫのモル濃度における無視できるほどの差異のみを伴って、合理的な範囲内であった。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。
図２６は、ＴＥＭ可視化の促進を可能にする金タグ付きＮＰを示す。ＮＰを、極小の金ナノ粒子（直径：２．２ｎｍ）を、ＮＰを製造するために次いで使用したＰＬＧＡのカルボキシル基に共有結合的に結合させることによって金で標識した。ｒＭＣと標識されたＮＰとのインキュベーション後、粒子コアを、ＮＰコア上にさらなる金粒子を沈着させることによって金で増強し、それにより、試料の電子密度を増加させ、ＴＥＭ顕微鏡における可視化を可能にし、このとき、ＮＰは、暗黒色のスポットとして出現した。
図２７は、（ａ）フローサイトメトリー結果および（ｂ）ＣＬＳＭによって調査した、異なる細胞型によるαＶβ３発現の定量化を示す。サイトメトリー解析のために、非特異的結合部位を、ＤＰＢＳ中２％のＢＳＡでブロッキングし、１０５個の細胞を、ＤＰＢＳ中０．１％のＢＳＡ中１：２０希釈のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）抗ＣＤ５１／６１抗体（非特異的対照として機能するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）マウスＩｇＧ１、κアイソタイプ対照（ＦＣ））と共に１時間インキュベートした。その後、細胞は、ＤＰＢＳ洗浄および遠心分離の複数のステップを受けた。最後に、試料を、ＤＰＢＳ中に再懸濁し、以前に記載されたようにフローサイトメトリーを使用して解析した（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、励起：６３３ｎｍ、発光：６６１／１６ｎｍバンドパスフィルター）。αＶβ３由来の蛍光レベルは、それにより、ｒＭＣについて最大であったが、ＨｅＬａおよびＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞は共に、無視できるほどのシグナルを示し、これらは共に、ｒＭＣについてよりも有意に低かった。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５（ＡＦＵ、任意の蛍光単位）。フローサイトメトリー結果を確認するために、ｒＭＣを、８ウェルＩｂｉｄｉスライド中に播種し（１５，０００細胞／ウェル）、上記のように、αＶβ３インテグリンについて染色した。次いで、細胞を、ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中４％のＰＦＡで固定し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０で解析した。ＣＬＳＭイメージは、ｒＭＣ細胞体と共に共局在化した強いインテグリンシグナルを示し、これは、メサンギウム細胞による実質的なαＶβ３発現を示している。スケールバー２０μｍ。
図２８は、蛍光イメージングの結果を示す。Ａ）ＮＰ注射後の相対的血漿蛍光。対照ＮＰは、注射の６０分後に、ほぼ５０％の残留血漿蛍光を伴って、最大血液循環値を示した。両方が許容できる残留濃度を示したＥＸＰ ＮＰならびにＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰとは対照的に、ｃＲＧＤ ＮＰは、血液から迅速にクリアランスされた。結果は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１．（ｎ．ｓ．：有意でない）。Ｂ）遊離ＣＦ（商標）６４７蛍光色素の注射後の腎臓凍結切片の蛍光イメージング。細胞核を可視化するために、切片をＤＡＰＩ染色した（青色）。匹敵するモル濃度の遊離色素の注射の後、強い蛍光シグナル（赤色から白色）が、腎臓の尿細管領域において検出され得、これは、低分子色素の自由な腎濾過を示している。予想したように、糸球体内蓄積は検出できなかった（白色の丸）（較正バー：０～６５５３５グレイの値）。
図２９は、ＮＰで補助されたシナシグアト送達の概念を示す。ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、以前に記載された逐次的な認識シーケンスを介して、標的腎メサンギウム細胞に進入する。首尾良いエンドサイトーシスの後、ＮＰは、エンドリソソーム分解を受け、シナシグアトの放出をもたらす（小さいドット）。次いで、ＣＣＧは、メサンギウムｓＧＣを活性化および安定化し、増強されたＮＯ媒介性のｃＧＭＰ産生をもたらす。タンパク質調節型キナーゼ（ＰＧＫ１－α）のｃＧＭＰ媒介性の活性化を介して、いくつかの線維化促進性経路が阻害され、メサンギウム細胞の線維化促進性リモデリングにおける全体的低減をもたらす。
図３０は、例示的な実験的セットアップを示す。全ての実験について、遊離シナシグアト（ｃ＝２μＭ）を、０．２μＭの濃度のＣＣＧを有するまたは薬物を有さないＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰと比較した。遊離シナシグアトの量は、この濃度範囲において強力な効果を示した以前の研究に従って選択した。
図３１は、薬物標的に対するシナシグアトの効果のウエスタンブロット解析を示す。ａ）ｓＧＣ刺激および安定化。遊離ＣＣＧおよびＣＣＧで負荷されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの両方が、２４時間のインキュベーションの間に、ｓＧＣレベルにおける実質的な増加をもたらすが、ＣＣＧを欠如する対照ＮＰは、顕著な効果を示さなかった。ｂ）ＰＧＫ１－αの活性化。ＰＧＫ１－α活性を評価するために、その基質である血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）のリン酸化を評価した。遊離ＣＣＧおよびＣＣＧ保有ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの両方が、それにより、Ｐ－ＶＡＳＰ／ＶＡＳＰ比における顕著な増加を示したが、対照ＮＰは、検出可能な変化をもたらさない（ｎ＝３；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５）。
図３２は、シナシグアトで負荷されたＮＰの抗線維化効果および抗増殖効果を示す。メサンギウム細胞を、線維化変化および過剰増殖的変化を誘導するための１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βとの４８時間のインキュベーションの前に４時間にわたって、遊離ＣＣＧまたはＮＰと共に事前インキュベートした。ａ）ＭＴＴアッセイは、抗増殖効果を示す。メサンギウム細胞は、ＴＧＦ－β刺激の際に有意な過剰増殖を示したが、遊離ＣＣＧまたはＣＣＧで負荷されたＮＰとの事前インキュベーションは、この効果をかなり減少させた。ｂ）α－ＳＭＡおよびｃ）コラーゲンＩレベルの両方のウエスタンブロット解析は、ＴＧＦ－β対照と比較して、ＣＣＧまたはＣＣＧで負荷されたＮＰについて、両方の線維症マーカーの劇的な低減を示した（ｎ＝３；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．有意でない）。ｄ）ＬＳＭ解析は、ｂ）からの結果をさらに支持し、メサンギウム細胞は、ＣＣＧまたはＣＣＧ保有ＮＰとの事前インキュベーションにより、α－ＳＭＡのかなり低減された産生を示した。スケールバー＝２μｍ。 同上。
以下では、本発明を限定するためではなく例示するために与えられた実施例に対して参照がなされる。
（実施例１）
材料および方法
細胞培養
この研究で使用した細胞系を、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ｒＭＣ、ＮＣＩ－Ｈ２９５ＲおよびＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳおよびインスリン－トランスフェリン－セレンおよび１００ｎＭヒドロコルチゾンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養した。ＨＫ－２細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２（１：１）培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で維持した。ｐＡＴ１Ｒ－ｒＭＣを、製造業者の指示に従って市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ＹＦＰ－タグを有するＡＴ１Ｒをコードするプラスミド（ＣＸＮ２－ＨＡ－ＡＴ１Ｒ－ＹＦＰ）（［４］を参照のこと）でｒＭＣをトランスフェクトすることによって得た。ｐＡＴ１Ｒ－ｒＭＣを、１０％ＦＢＳおよび６００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇ４１８）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞系を、以前に示されたように［１、３］、それらの標的ＡＴ１ＲおよびＡＣＥ発現について特徴付けた。
マウス
動物に対する実験的手順は、国のおよび施設のガイドラインに従って実施し、現地の当局によって承認された（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎ、参照番号：５５．２－２５３２－２－３２９）。Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｔａｂｌｅ中に示したマウスを、１０週齢で、この研究において使用した。雌性マウスだけを、全ての実験で使用した。これらのマウスを、標準条件（５０±５％の相対湿度、２１±１℃の温度、空気交換＞８ＡＣ／時間、および１２時間：１２時間（Ｌ：Ｄ）の明期間）の下で、特定病原体除去（ＳＰＦ）収容施設下で維持した。
ポリマー調製：ブロックコポリマー合成
ＰＥＧ－ＰＬＡブロックコポリマー（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ、ＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋおよびＭｅＯ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ）を、環状３，６－ジメチル－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ラクチド）の開環重合を介して合成した。手短に言えば、ラクチドを、使用前に無水酢酸エチルから再結晶化し、室温（ｒ．ｔ．）で１２時間にわたって４０℃で真空下で乾燥させた。ＣＯＯＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＯＨ、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＯＨ、Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＯＨまたはＭｅＯ－ＰＥＧ５ｋ－ＯＨを、開環重合のためのマクロ開始剤として使用した。これらを、無水ＤＣＭ中に溶解させ（０．３ｍｍｏｌ）、精製されたラクチド（１８ｍｍｏｌ）と混合した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）（０．９ｍｍｏｌ）を、触媒として添加した。重合を、１時間後に安息香酸（４．６ｍｍｏｌ）でクエンチした。得られたポリマーを、ジエチルエーテル中で沈殿させ、１２時間にわたって４０℃（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋおよびＭｅＯ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋについて）または３５℃（Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋについて）で真空下で乾燥させた。Ｂｏｃ保護基の切断のために、Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ－ＰＬＡを、５０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／ＤＣＭ中に溶解させ、ｒ．ｔ．で３０分間撹拌した。その後、これを、３倍体積のＤＣＭで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で３回洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られたＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、ジエチルエーテル中での沈殿を介して精製し、引き続いて、１２時間にわたって３５℃で真空下で乾燥させた。
ポリマー調製：リガンドカップリング
Ａｎｇ－Ｉで改変されたポリマーの調製（図８もまた参照のこと）のために、１４μｍｏｌのＣＯＯＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、ＤＭＦ中の２５モル過剰なＥＤＣおよびＮＨＳを用いて２時間活性化した。その後、８６３μｍｏｌの２－メルカプトエタノール（２－ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈａｎｏｌ）を添加して反応を２０分間クエンチし、その後、ＤＭＦ中６６μｍｏｌのＤＩＰＥＡおよび１７μｍｏｌのＬｙｓ－Ａｎｇ－Ｉを滴下添加した。４８時間後、得られたポリマーを、超純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に希釈して、１０％を下回るＤＭＦ濃度にし、２４時間（３０分、２時間および６時間後の媒体交換を伴う）にわたって６～８ｋＤａ分子量カットオフ再生セルロース透析メンブレンを使用して透析して、未反応のリガンドおよび試薬を除去した。ＥＸＰ３１７４で改変されたポリマーの調製（図８もまた参照のこと）のために、９６．４μｍｏｌのＥＸＰ３１７４を、ＤＭＦ中の等モル量のＤＣＣおよびＮＨＳを用いて２時間活性化した。その後、得られた尿素副産物を、遠心分離（５分、１２，０００×ｇ）および０．２μｍ Ｒｏｔｉｌａｂｏ ＰＴＦＥシリンジフィルターを用いた引き続く濾過によって除去した。ＤＭＦ中の２７．６μｍｏｌのＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋおよび１７．５モル過剰なＤＩＰＥＡを、活性化されたリガンドに添加し、２０時間反応させた。リガンドで改変されたポリマーを、氷冷１：５（ｖ／ｖ）ジエチルエーテル：メタノール中での沈殿、および１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１０％のエタノールに対する２４時間の引き続く透析によって精製して、過剰な遊離リガンドを除去し（３０分および６時間後の媒体交換を伴う）、その後、超純水に対して透析して、２４時間（３０分、２時間および６時間後の媒体交換を伴う）にわたって６～８ｋＤａ分子量カットオフ再生セルロース透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して緩衝塩を除去した。リガンドで改変されたブロックコポリマーを、リガンドカップリング確認の前に、７２時間凍結乾燥させた。そのために、ポリマーを、４０ｍｇ／ｍｌの濃度でＡＣＮ中に可溶化し、撹拌超純水中で沈殿させて、ポリマーミセルを創出した（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）。ＰＥＧ含量を、比色ヨウ素錯体形成アッセイを使用して定量化し、カップリングされたＡｎｇ－Ｉを、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダーを使用して、製造業者の指示に従ってＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイキットを使用して定量化した。ＥＸＰ３１７４を、ＬＳ－５Ｓ蛍光プレートリーダーを使用して、λｅｘ＝２５０ｎｍおよびλｅｍ＝３７０ｎｍにおいて蛍光的に定量化した。ＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ上の未反応のＮＨ２末端基の非存在を、フルオレスカミンを使用して決定した（図８もまた参照のこと）。
ポリマー調製：ＰＬＧＡの蛍光標識
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの粒子検出のために、蛍光標識したＰＬＧＡを粒子コアにおいて使用した。その目的のために、ＴＡＭＲＡ－アミン（ＣＬＳＭのため）およびＣＦ６４６７－アミン（フローサイトメトリーおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験のため）を、カルボン酸で終端した１３．４ｋＤａのＰＬＧＡに共有結合的にカップリングさせた。簡潔に述べると、５μｍｏｌの酸で終端したＰＬＧＡを、無水ＤＭＦ中に溶解させ、１２９μｍｏｌのＤＭＴＭＭ（２５倍過剰）を用いてｒ．ｔ．で２時間活性化した。その後、１μｍｏｌの蛍光色素をＤＭＦ中に溶解させ、ＰＬＧＡに滴下添加し、暗所でｒ．ｔ．で７２時間反応させた。反応産物を希釈し（ＤＭＦ＜１０％）、遮光下で３４時間（３０分、２時間および６時間後の媒体交換を伴う）にわたって３．５ｋＤａ分子量カットオフ再生セルロース透析メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、超純水に対して透析した。次いで、蛍光標識したＰＬＧＡを、３日間凍結乾燥させた。
ＮＰの調製および特徴付け：粒子調製
ＮＰ調製のために、ＰＥＧ－ＰＬＡブロックコポリマーおよび１３．４ｋＤａのＰＬＧＡを、ＡＣＮ中１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように、７０：３０の質量比で混合した。リガンドで改変された粒子のために、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋおよびリガンドで改変されたポリマーを、ＮＰ構造を構成するポリマーの２０％がＡｎｇ－Ｉ（ＮＰＡｎｇ－Ｉ）または／およびＥＸＰ３１７４（それぞれ、ＮＰＥＸＰおよびＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ）で改変されるように、しかるべく混合した。ＮＰを、激しく撹拌する１０％ＤＰＢＳ（ｖ／ｖ）（ｐＨ７．４）中でのポリマー混合物のバルクナノ沈殿を介して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように調製した。粒子を２時間撹拌して、有機溶媒の蒸発を確実にし、３０ｋＤａ分子量カットオフＭｉｃｒｏｓｅｐアドバンス遠心分離デバイス（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する７５６ｇで２０分間の超遠心分離によって濃縮した。
ＮＰの調製および特徴付け：動的光散乱およびζ電位
得られた粒子のサイズおよびζ電位を、１７３°の後方散乱角で６３３ Ｈｅ－Ｎｅレーザーを備えたＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアバージョン７．１１を用いて、それぞれ１ｍｇ／ｍＬまたは３．５ｍｇ／ｍｌの濃度を使用して、２５℃の一定温度で１０％ＰＢＳ中で決定した。キュベット位置を、４．６５ｍｍに設定し、減衰器を、デバイスによって自動的に最適化した。使い捨てのマイクロキュベット（Ｂｒａｎｄ）および折りたたみキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、それぞれ、サイズおよびζ電位の測定に使用した。
ＮＰの調製および特徴付け：粒子定量化
粒子ＰＥＧ濃度の定量化を、比色ヨウ素錯体形成アッセイを使用して実施し、凍結乾燥を介して決定した重量測定的ＮＰ含量と相関させた。手短に言えば、粒子試料を、超純水中に希釈して、５～３０μｇ／ｍＬの範囲のＰＥＧ濃度にした。ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＯＨの超純水中での希釈（０～４０μｇ／ｍＬ）を、較正曲線のための標準として使用した。１４０μＬの試料または標準を、１Ｎ ＨＣｌ中５％（ｍ／ｖ）の塩化バリウム溶液および０．１Ｎヨウ素水溶液の２：１（ｖ／ｖ）混合物６０μＬと混合した。試料および標準を、９６ウェルプレート中に移し、５３５ｎｍにおけるそれらの吸光度を、ＦＵＯｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。粒子ＰＥＧ含量と正確なポリマー濃度との相関を、試料凍結乾燥後に重量測定的に決定した。モル濃度での粒子濃度を、比色ヨウ素錯体形成アッセイを介して決定した粒子質量、粒子密度（１．２５ｇ／ｃｍ３）、および球状の粒子形状を仮定するＤＬＳ測定を介して得たＮＰの流体力学直径から計算した。粒子コロナ上のリガンド濃度を、上記のように、ＢＣＡアッセイを使用して、それぞれ、Ａｎｇ－ＩおよびＥＸＰ３１７４について蛍光定量的に定量化した。
細胞内カルシウム測定
異なるＮＰ製剤のＡＴ１Ｒ相互作用を評価するために、比率計測的Ｆｕｒａ－２ Ｃａ２＋キレーター法を、ＡＴ１Ｒ陽性ｒＭＣを使用して、以前に記載されたように［１、３］使用した。その目的のために、ｒＭＣを、Ｔ－１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種し、コンフルエントになるまでインキュベートした。引き続いて、それらをトリプシン処理し、遠心分離し（２００ｇ、５分間）、５μＭ Ｆｕｒａ－２、ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７および２．５ｍＭプロベネシドを補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地中に再懸濁した。穏やかにかき混ぜながら（５０ｒｐｍ）、細胞を１時間インキュベートし、光保護した。その後、細胞懸濁物を、遠心分離（２×、２００ｇ、５分間、ＲＴ）によってＤＰＢＳで洗浄し、２．５ｍＭプロベネシドを補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地中に、２百万細胞／ｍＬのカウントで再懸濁した。ＡＴ１Ｒに対する粒子アビディティおよびリガンド親和性を決定するために（図３Ａ～Ｃ）、懸濁物中のＦｕｒａ－２で負荷されたｒＭＣ（９０，０００細胞／ウェル）４５μｌを、９６ウェルハーフエリアマイクロプレート中で１０μＬの異なる試料（ＮＰ、または１ｎｍ～３００μＭ（リガンド濃度）の範囲の遊離リガンド）と共にｒ．ｔ．で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、４５μＬの３００ｎＭ Ｌｙｓ－Ａｎｇ－ＩＩ水溶液で刺激し、得られたカルシウムシグナルを、３４０／２０ｎｍおよび３８０／２０ｎｍの励起ならびに５１０／２０ｎｍの発光バンドパスフィルターを用いてＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、１分／ウェルにわたって即座に記録した。ＡＴ１Ｒ相互作用の動力学を決定するために（図３Ｄ）、同じ手順を使用したが、試料は、異なる期間（５～３２０分間）にわたって細胞と共にインキュベートした。最大および最小シグナル比を、それぞれ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、または４５ｍＭエチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）と合わせた０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００で細胞を刺激することによって決定した。細胞内カルシウム濃度を、２２５ｎＭのＫｄ値を仮定するＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ後に計算した。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して、スチューデントｔ検定（図３Ｃ）、およびシダックの多重比較を使用する二元配置ＡＮＯＶＡ（図３Ｄ）を介して評価した。
酵素の動力学的測定
ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉについてのミカエリス・メンテン動力学を、細胞膜結合酵素の可溶性代替物としてウサギ肺ＡＣＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、以前に記載されたように［１］決定した。手短に言えば、異なる濃度のＮＰ（１０～１２０μＭのＡｎｇ－Ｉに対応する）を、異なる期間（５、１５、３０、６０、９０および１２０分間）にわたって１８μＭの酵素と共にインキュベートして、粒子コロナ上のＡｎｇ－ＩをＡＴ１Ｒ活性のリガンドＡｎｇ－ＩＩに変換した。得られたＡｎｇ－ＩＩを、直接的細胞内カルシウム測定によって定量化した。その目的のために、ｒＭＣに、上記のようにＦｕｒａ－２色素を負荷した。次いで、１０μＬの試料を、９６ウェルハーフエリアプレート上にピペッティングし、９０μＬのＦｕｒａ－２で負荷されたｒＭＣ懸濁物（９０，０００細胞／ウェル）を、それらの上に注入した。得られたカルシウムシグナルを、上記のように、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ、Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して１分間即座に記録した。使用した実験条件下でのＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉに対するＥＸＰ３１７４リガンドの干渉を排除するために、ＮＰＥＸＰを対照として使用した（図９を参照のこと）。ｒＭＣ（９０，０００細胞／ウェル）を、異なるＮＰＥＸＰ濃度およびＬｙｓ－Ａｎｇ－ＩＩ（４００ｎＭ）で同時に刺激し、得られたカルシウムシグナルを、１分間即座に記録した。１ｎｍ～３００μＭの範囲の既知の濃度の遊離Ｌｙｓ－Ａｎｇ－ＩＩを使用して、測定したカルシウム濃度を、加水分解された産物のｐｍｏｌに変換した。１５分間のインキュベーション時間における反応の速度（ｐｍｏｌ／分）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して、アッセイにおいて使用した基質濃度に対してプロットして、粒子ベースのおよびリガンドベースの濃度についてのミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）を決定した（図３Ｅ）。同じ酵素について異なる基質を比較するために使用した特異性定数（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を計算するために、触媒定数（Ｋｃａｔ）を、同じソフトウェアを使用して得た（図３Ｆ）。統計的有意性（図３Ｆ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して、チューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを介して評価した。
ＮＰの細胞分布：共焦点顕微鏡
異なる粒子製剤の細胞分布を決定するために（図４）、ｐＡＴ１Ｒ－ｒＭＣを、８ウェルμ－スライド（Ｉｂｉｄｉ、Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に１０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間インキュベートした（３７℃）。次いで、これらを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地（ＬＭ）中の事前に温めたＮＰ溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）と共に、１５、４５または９０分間インキュベートした。その後、ＮＰを廃棄し、細胞をＤＰＢＳで徹底的に洗浄し、その後、１×ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎで５分間細胞染色し、ＤＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）でｒ．ｔ．で１０分間固定した。イメージを、Ｚｅｎソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して、１．４μｍに設定した焦点面を用いてＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００顕微鏡を使用して獲得した。粒子の取り込みおよび結合の阻害のために、細胞を、粒子添加前に、１ｍＭの遊離ＥＸＰ３１７４またはカプトプリルと共に事前インキュベートした。イメージを、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して解析した。
ＮＰの細胞分布：フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを介した粒子取り込みの解析（図５Ａ）を、以前に記載されたように実施した［１］。手短に言えば、ｒＭＣを、２４ウェルプレート中に３０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、４８時間インキュベートした（３７℃）。事前に温めたＮＰ溶液（０．１％ＢＳＡを補充したＬＭ中０．７ｍｇ／ｍｌ）を、細胞の上にピペッティングし、それらをＤＰＢＳで洗浄した後、３７℃で４５分間インキュベートした。取り込み特異性を確認するために、細胞を、粒子添加の前に３０分間にわたって、１ｍＭのカプトプリルおよび／またはＥＸＰ３１７４と共にインキュベートした。その後、粒子溶液を廃棄し、細胞をＤＰＢＳで徹底的に洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離した（２×、２００ｇ ５分間、４℃）。ＮＰ関連細胞蛍光を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＤＰＢＳ中で解析した。蛍光を、６３３ｎｍで励起し、６６１／１６ｎｍバンドパスフィルターを使用して記録した。生存細胞の集団を、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．１．（Ｔｕｒｋｕ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してゲート処理し、ＮＰ関連蛍光の幾何平均を解析した。統計的有意性（図５Ａ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してスチューデントｔ検定を介して評価した。
ＮＰ標的細胞特異性：フローサイトメトリー
異なる細胞系におけるＮＰ取り込みを評価するために（図５Ｂ）、ｒＭＣ、ＨＫ－２およびＨｅＬａ細胞を、２４ウェルプレート中にそれぞれ３０，０００、５０，０００または１００，０００細胞／ウェルの密度で播種し、４８時間インキュベートした（３７℃）。その後、事前に温めたＮＰ溶液（０．１％ＢＳＡを補充したＬＭ中０．７ｍｇ／ｍｌ）を、上記のように細胞の上に添加し、処理した。統計的有意性（図５Ｂ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して、シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを介して評価した。
標的細胞およびオフターゲット細胞の共培養における粒子特異性を、以前に記載されたように［１］、フローサイトメトリーを介して調査した（図５Ｃ～Ｄ）。簡潔に述べると、ＣＴＧで染色されたｒＭＣ（無血清培地中１０μＭ、３０分間、３７℃）を、２４ウェルプレート中にそれぞれ１０，０００および７５，０００細胞／ウェルの密度の未染色のオフターゲットＮＣＩ－Ｈ２９５ＲまたはＨｅＬａ細胞との共培養で播種し、４８時間インキュベートした。０．１％ＢＳＡを補充したＬＭ中０．０２ｍｇ／ｍｌの濃度の温かいＮＰ溶液を、細胞の上に引き続いて添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。その後、上記のように、粒子を廃棄し、細胞をフローサイトメトリー解析のために処理した。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してスチューデントｔ検定を介して評価した。
ＮＰ標的細胞特異性：共焦点顕微鏡
フローサイトメトリー実験を確認するために、共培養における粒子特異性のＣＬＳＭ解析（図５Ｅおよび図１３）を、以前に記載されたように実施した［１］。手短に言えば、標的であるＣＴＧで染色されたｒＭＣ（１０μＭ、３０分間、３７℃）を、それぞれ２，０００および１０，０００細胞／ウェルの密度の、ＣＴＤＲで染色されたオフターゲットＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞（２５μＭ、３０分間、３７℃）との共培養で播種し、２４時間インキュベートした。その後、細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（ＤＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）で２０分間染色し、０．１％ＢＳＡを補充したＬＭ中の事前に温めた０．０２ｍｇ／ｍＬのＮＰ溶液を、細胞の上にピペッティングし、４５分間インキュベートした。次いで、ＮＰ溶液を廃棄し、細胞をＤＰＢＳで徹底的に洗浄し、ＤＰＢＳ中４％のＰＦＡで１０分間固定した（ｒ．ｔ．）。上記のように、イメージを獲得し、それぞれ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００顕微鏡およびＦｉｊｉソフトウェアを使用して解析した。
ｉｎ ｖｉｖｏのＮＰ腎臓分布
異なるＮＰ製剤（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ、ＮＰＡｎｇ－Ｉ、ＮＰＥＸＰおよびＮＰＭｅＯ）の腎臓分布を評価するために、１２０ｎＭのＮＰ溶液（およそ１０ｍｇ／ｍｌのＮＰと等価）１００μＬを、イソフルラン吸入およびブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した１０週齢雌性ＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）において、頸静脈を介して注射した（各粒子試料についてｎ＝６）。さらに、対照として、粒子を蛍光標識するために使用した遊離色素（ＣＦ６４７）１００μＬを、粒子試料中に含めたのと同じ濃度（およそ５０μＭ）で注射した。５分間後、血液試料を、ｉ．ｖ．穿刺を介して収集したが、マウスはなおも麻酔下にあった。１時間の粒子循環の後、マウスを、ケタミン／キシラジンで麻酔し、最終血液試料を収集し、４％ＰＦＡによる潅流固定を介して屠殺した。腎臓を回収し、横断して切断した。これらを、１８％スクロースおよび１％ＰＦＡを補充したリン酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ７．４）中に一晩置くことによって、凍結保護した。その後、これらを、液体窒素で冷却した２－プロパノール中で凍結させ（－４０℃）、凍結切片のためにＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．（商標）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ中に包埋した。腎臓を、ＣｒｙｏＳｔａｒ ＮＸ７０クライオスタット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して５μｍの切片へと切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）プラスガラススライド上に移した。より良い可視化のために、細胞核を、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡およびＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用する切片イメージングの前に、ＤＡＰＩ（ＤＰＢＳ中１２．５μｇ／ｍｌ）で染色した。腎臓全体のイメージを、１０×対物レンズを使用して獲得した（図６）。糸球体蛍光定量化のために、イメージを、４０×対物レンズを使用して取得し（試料１つ当たり１２０個の糸球体の平均）、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して解析した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。より良い可視化のために、ルックアップテーブル「Ｒｅｄ Ｈｏｔ」を、粒子関連蛍光に適用した。各糸球体の面積を定量化し、蛍光面積をゲート処理した。次いで、各ゲート処理した面積の積分した蛍光密度を定量化し、全糸球体面積と相関付けた。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用してスチューデントｔ検定を介して評価した。内および外皮質の粒子関連蛍光を比較するために、皮質を、２つの等しい切片に分割し、糸球体蛍光を、上記のように解析した。統計的有意性を評価するために、シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０を使用して実施した。
血漿中のＮＰ関連蛍光を、それぞれ６４０ｎｍおよび６８０ｎｍの励起および発光波長を用いてＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。注射の１時間後の蛍光を、注射の５分後に得た試料の初期蛍光と相関付けた。
免疫組織化学
ＮＰの糸球体局在化を評価するために、新たに切断した５μｍの腎臓凍結切片を、ＤＰＢＳで５分間洗浄し、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を補充したＤＰＢＳで５分間洗浄し、ＤＰＢＳで５分間洗浄し、その後、０．０４％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ｍ／ｖ）を補充したＤＰＢＳ中５％のＢＳＡで１０分間ブロッキングした。切片を、ＤＰＢＳで再度洗浄し（５分間）、０．５％ＢＳＡおよび０．００４％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（ｍ／ｖ）を補充したＤＰＢＳ中の一次ポリクローナルヤギ抗インテグリン－α８抗体の１：２００溶液中で４℃で一晩インキュベートした。次いで、これらを、ＤＰＢＳ中で５分間洗浄し、０．５％ＢＳＡおよび０．０４％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを補充したＤＰＢＳ中のＣｙ２－抗ヤギ二次抗体（１：４００）およびＤＡＰＩ（１２．５μｇ／ｍｌ）と共に、暗所、ｒ．ｔ．で１時間インキュベートした。凍結切片を、ＤＰＢＳおよび超純水で洗浄し、その後、これらを、Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ封入媒体を使用してマウントし、上記のように、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００顕微鏡およびＦｉｊｉソフトウェアを使用して解析した。
定量化および統計解析
統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０を使用して実施した。スチューデントｔ検定、またはシダックもしくはチューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、方法の詳細に示されるように、統計的有意性を評価した。各実験についての統計的有意性のレベルおよび「ｎ」数は、テキストおよび図の説明文中に示される。
（実施例２）
ブロックコポリマーは、ウイルス模倣性粒子設計を可能にする
この実施例で言及される全ての材料および方法は、先の実施例に記載した通りであった。
ウイルス模倣性ＮＰの開発のために、本発明者らは、リガンドＥＸＰ３１７４およびＡｎｇ－Ｉを、ポリ（エチレングリコール）５ｋ－ポリ（乳酸）１０ｋ（ＰＥＧ－ＰＬＡ）ブロックコポリマーにカップリングさせ（図８）、これを、粒子にｉｎ ｖｉｖｏでの十分な安定性を与えるバルクナノ沈殿を介したＮＰ製造のために、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）ＰＬＧＡとブレンドした。残りの機能化されていないポリマーは、より短い２ｋのＰＥＧおよび１０ｋのＰＬＡブロックを有するカルボン酸で終わるＰＥＧ－ＰＬＡ（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ）であった（図１Ａ）。ＮＰ調製の前にポリマーをリガンドで改変することによって、リガンド密度の正確な制御を得ることができる。それらのＰＥＧ鎖の２０％がＡｎｇ－Ｉで修飾され、さらなる２０％がＥＸＰ３１７４で修飾されるように、粒子を調製した（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ）（図２Ｂ）。リガンド密度を、４０％の最大で維持して、リガンド間での立体障害および非特異的相互作用を回避した。対照として、リガンドなしのメトキシ－ＰＥＧで終端した粒子（ＮＰＭｅＯ）および２０％のＡｎｇ－ＩまたはＥＸＰのいずれかを有する粒子（それぞれ、ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰ）を組み立てた（図１Ａ）。長いリガンドを保有するポリマーを粒子調製のためにより短い機能化されていないポリマーと組み合わせることによって、ＮＰのサイズを、８０ｎｍ下で維持して、メサンギウム毛細血管の内皮開窓を通って通過する能力を粒子に提供できた（図２Ｃ）。カルボン酸で終端したブロックコポリマーを、負の細胞膜への非特異的静電気的吸着を回避するのに理想的な全体的な負の粒子電荷を提供するフィラーとして選択した（図２Ｄ）。
（実施例３）
ＮＰは、標的受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで認識する
この実施例で言及される全ての材料および方法は、先の実施例に記載した通りであった。
三重チェックする粒子の能力を確認するために、細胞の正体を最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。一次付着および引き続く内在化を媒介する、標的受容体に対する粒子アビディティを、カルシウム動員アッセイを使用して調査したが、それは、アゴニストまたはアンタゴニストによる、Ｇｑ共役型ＡＴ１Ｒの刺激またはサイレンシングが、それぞれ、サイトゾルＣａ２＋流入またはその抑制を生じるからである。その目的のために、ＡＴ１Ｒ陽性ラットメサンギウム細胞（ｒＭＣ）を、Ａｎｇ－ＩＩによる刺激の前に、変動する濃度の遊離リガンドまたはＮＰ製剤のいずれかと共に３０分間の期間にわたってインキュベートし、得られたカルシウムシグナルを記録した。図３Ａに示されるように、遊離ＥＸＰ３１７４およびＡｎｇ－ＩＩを用いた対照実験により、ナノモル濃度範囲内の、ＡＴ１Ｒに対する両方の化合物の高い親和性が明らかになった（それぞれ、０．６±０．４および１．５±０．１ｎＭのＩＣ５０値）。受容体の結合および活性化は、細胞膜中に存在するＡＣＥによるＡｎｇ－ＩＩへの酵素的変換後にのみ生じるので、Ａｎｇ－Ｉは、より低い親和性（ＩＣ５０ ０．９±０．６μＭ）を示す。
リンカーへのカップリングは、数種の受容体の、同時の高いアビディティの多価結合によって補償される親和性喪失をもたらす（図３Ｂおよび３Ｃ）。それらの主な相互作用は、ＡＣＥとの相互作用であるので、Ａｎｇ－Ｉのみを有する粒子（ＮＰＡｎｇ－Ｉ）は、ＥＸＰ３１７４を有する粒子（０．４±０．１ｎＭのＩＣ５０）よりも、ＡＴ１Ｒに対するより低いアビディティ（９．４±０．４ｎＭのＩＣ５０）を示す。それにもかかわらず、Ａｎｇ－Ｉの粒子結合は、ＮＰ界面における酵素的切断の促進および引き続く多価結合に起因して、遊離リガンドと比較して、ＩＣ５０値における有意な減少をもたらす。ＥＸＰ３１７４で改変されたＮＰは、対照的に、遊離リガンドについてと同じオーダーの大きさのアビディティを有した。驚くべきことに、両方のリガンドを有する粒子ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉは、受容体結合に関して共同的効果を示したが、それは、これらが、１つの型のリガンドのみを有する粒子のいずれよりも、ＡＴ１Ｒに対する有意に高いアビディティ（０．２±０．０９ｎＭのＩＣ５０）を有したからである（図３Ｃ）。Ａｎｇ－ＩＩへのＡｎｇ－Ｉの酵素的活性化の後、両方のリガンドが、同時のアゴニスト性およびアンタゴニスト性様式で同じ受容体を標的化するので、これは、これらのリガンドが互いの相互作用を妨害しないことを証明している。いかなる機能化も含まない粒子（ＮＰＭｅＯ）は、一切応答を惹起しなかったので、アッセイがリガンド特異的であったことが確認された（図３Ｂ）。
細胞／粒子相互作用の動力学を評価するために、細胞内カルシウム測定を、１０μＭのリガンドに対応する濃度のＮＰをｒＭＣと共にインキュベートすることによって、５．５時間の期間にわたって実施した。本遊離アゴニストによって誘発されるカルシウムシグナル伝達をそれらがサイレンシングすることができる程度は、それぞれの粒子が異なる時点においてそれらのリガンドを介して細胞表面中のＡＴ１Ｒに結合する完全性についての尺度として機能した（図３Ｄ）。それらの表面上にＡｎｇ－Ｉのみを有する粒子は、緩徐な受容体結合を示したが、それは、これらが、ＡＴ１Ｒと相互作用できる前に、細胞膜結合ＡＣＥによってＡｎｇ－ＩＩ保有粒子へと最初に活性化される必要があるからである。受容体結合は、１時間のインキュベーション後に約４０％で最大に達し、アッセイの持続時間にわたって一定のままであった。これは、ある特定の数のプロリガンドが活性化されたときの粒子の素早い内在化を指し、おそらく、全てのＡｎｇ－ＩがＡｎｇ－ＩＩに変換されるわけではない。粒子表面上のＡｎｇ－ＩＩが受容体に結合すると、粒子は、迅速に内在化され（それらがピコモル濃度のＡＴ１Ｒアビディティを有するので［１］）、これは、ＮＰ内在化が起こるために全てのプロリガンドが活性化される必要がない可能性があることを意味している。この現象は、粒子表面上の付着因子としてＥＸＰ３１７４を添加した場合には回避される。非常に素早く完全な受容体遮断が、たった５分間の粒子インキュベーション後に生じる（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰについて同様）。ＡＴ１Ｒ阻害は、測定のほぼ全体にわたって維持され、受容体の上方調節およびリサイクルにおそらくは起因して、最後の時点において約８０％まで下降する。ＥＸＰ３１７４による細胞膜への付着は、認識プロセスを緩徐化し、Ａｎｇ－Ｉから、ＡＴ１Ｒにより効率的に結合することができるＡｎｇ－ＩＩへの、より高い活性化を可能にする。ＮＰＥＸＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰを比較すると、４５分間の粒子インキュベーション後に一定になる、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの有意に高い初期ＡＴ１Ｒ阻害が存在する。これは、ＡＴ１Ｒに対するより高いアビディティをもたらす、２つのリガンドの組み合わせ効果に起因する可能性が高い（図３Ｃ）。
粒子内在化のための必要条件は、Ａｎｇ－ＩをＡｎｇ－ＩＩへと活性化するＡＣＥの能力である。したがって、本発明者らは、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉについての酵素動力学を調査して、粒子表面上のアンタゴニストの存在が酵素反応を妨害するかどうかを決定した。ＡＣＥの可溶性形態を、異なる粒子濃度と共に変動する期間にわたってインキュベートし、ＮＰコロナ上の得られたＡｎｇ－ＩＩを、カルシウム動員アッセイを実行して定量化した。アッセイにおけるＥＸＰ３１７４リガンドの干渉を、ＮＰＥＸＰによって示されるシグナル阻害を測定することによって評価した（図９）。ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの両方について決定されたミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）（図３Ｅ）は、両方の粒子製剤について、遊離リガンドについてと同じオーダーの大きさの値を生じた（［１］を参照のこと）。さらに、本発明者らは、触媒定数（Ｋｃａｔ）を決定して、同じ酵素に対する異なる基質の親和性を比較するための有用な指標である特異性定数（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を計算した（図３Ｆ）。ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉコロナ上のＡｎｇ－Ｉの酵素的活性化は、ＮＰＡｎｇ－Ｉ上のものと有意には異ならず、これは、ＡＣＥがさらなるリガンドＥＸＰ３１７４によって立体的に妨害されていないことを示している。さらに、リガンド濃度に基づいて計算したＫｃａｔ／Ｋｍ値は、遊離Ａｎｇ－Ｉおよび粒子結合Ａｎｇ－Ｉについて等しかった。さらに、Ｋｃａｔ／ＫｍがＮＰ濃度に基づいて計算される場合、結合したリガンドは、酵素に対する有意に良い基質であり、これは、いくつかの酵素分子への粒子表面上のいくつかのリガンド分子の結合の結果である（図３Ｆ）。
（実施例４）
決定実行ＮＰは、標的細胞特異的である
この実施例で言及される全ての材料および方法は、先の実施例に記載した通りであった。
それらの個々の標的との粒子相互作用が首尾よく確立された後、次のステップは、それらのコロナ上にアンタゴニストならびにアゴニストを有するＮＰが、それらの標的細胞による内在化をなおも誘発するかどうか、およびそうである場合に、取り込みが特異的リガンド－受容体相互作用から続いて起こるかどうかを決定することであった。アンタゴニストは、ＡＴ１Ｒ媒介性のエンドサイトーシスを引き起こさず、アゴニストは引き起こすので、本発明者らは、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を介して、ＹＦＰタグ付きＡＴ１Ｒを発現するｒＭＣ（ｐＡＴ１Ｒ－ｒＭＣ）におけるＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの細胞局在化を調査した。図４に示されるように、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ関連蛍光は、細胞の内側で見出された。これは、より長いインキュベーション時間と共に増加し、ＡＴ１Ｒ蛍光と共に強く共局在化した。
したがって、ＡＴ１Ｒによって媒介される特異的粒子取り込みが存在する。しかし、アンタゴニストのみを有する粒子（ＮＰＥＸＰ）は、細胞によって内在化されず、大部分は細胞表面上に位置する（図１０Ａ）。粒子蛍光は、受容体蛍光とも共に共局在化し、これは、受容体媒介性の付着を実証している。ＮＰＡｎｇ－Ｉもまた、細胞によって内在化されたので（図１０Ｂ）、酵素的に創出されたＡｎｇ－ＩＩは、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの細胞取り込みを媒介する。予想外に、インキュベーション時間の増加と共に、より拡散した均一な細胞膜分布（１５分後）から、より濃縮されたクラスター化（９０分の時点）まで、細胞膜上の受容体の再編成が存在し（図４）、これは、ＮＰ蛍光と強く共局在化した。これは、取り込みがＡＴ１Ｒによって媒介されることのさらなる証拠であるが、それは、クラスリン被覆されたピットを介して内在化される受容体、例えば、ＡＴ１ＲなどのＧＰＣＲの活性化が、受容体のクラスター化を促進するからである。
ＮＰＥＸＰについても、細胞膜上での受容体再編成が生じ、これは、細胞表面上での受容体の移動によって促進される多価受容体結合の結果である。細胞膜上の受容体にＮＰＥＸＰが付着すると、それらの内在化の欠如は、細胞膜上での受容体－粒子移動性、およびさらには受容体結合をもたらし得る。リガンドなしの粒子（ＮＰＭｅＯ）は、細胞によって取り込まれず（図１０Ｃ）、これにより、特異的標的化機構が高い細胞内在化を媒介するために必須であることが確認された。
全体として、本発明者らは、粒子コロナに連結された付着媒介アンタゴニスト性リガンドの存在が、引き続く粒子内在化を妨害しないことを実証している。さらに、粒子表面上にさらなるリガンドを含めることは、より多数の長いポリマー鎖の添加によるＡｎｇ－Ｉリガンドの立体障害に起因する標的化喪失を補償した（図１１）。粒子特異性およびリガンド媒介性の内在化をさらに確認するために、細胞を、遊離ＥＸＰ３１７４、または粒子関連蛍光の抑制を生じるＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルと、粒子添加の前に３０分間事前インキュベートし、フローサイトメトリー（図５Ａ）およびＣＬＳＭ（図１２）によって解析した。
さらに、本発明者らは、フローサイトメトリーによって、異なる細胞系における粒子内在化を試験した（図５Ｂ）。ＡＣＥを発現しないが微量のＡＴ１Ｒレベルのみを発現するＨｅＬａ細胞は、低い粒子取り込みを示したが、これは、カプトプリルによってもＥＸＰ３１７４によっても抑制できなかったので、非特異的であった。対照的に、両方の標的を発現するｒＭＣおよびＨＫ－２細胞は、はるかに高い粒子関連細胞蛍光によって示されるように、粒子を取り込むことができた。カプトプリルまたはＥＸＰ３１７４との細胞の事前インキュベーションは、細胞蛍光を有意に抑制したので、内在化もまた、ＡＴ１Ｒへの活性化されたプロリガンド結合によって媒介された。したがって、粒子は、それらの標的細胞に対する高い特異性を示す。それにもかかわらず、ＮＰが身体に進入する場合、これらには、標的細胞およびオフターゲット細胞が同時に提示される。したがって、本発明者らは、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉがそれらの間を区別することができたかどうかを調査した。
標的細胞（ｒＭＣ）を、過剰量のオフターゲットＮＣＩ－Ｈ２９５ＲまたはＨｅＬａ細胞と一緒に播種したが、これらの細胞は共にＡＣＥを欠如し、それぞれ高いおよび低いＡＴ１Ｒレベルを発現する。これらを異なるＮＰ製剤と共にインキュベートし、各細胞系を、フローサイトメトリーを介して粒子関連蛍光について調査した（図５Ｃ～Ｄ）。ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉは、標的ｒＭＣ中で有意により多く蓄積したので、ずばぬけた標的細胞特異性を示した。ＮＰＡｎｇ－Ｉもまた、両方のオフターゲット細胞において低い蓄積を示したので、特異性は、Ａｎｇ－Ｉによって付与される。対照的に、ＮＰＥＸＰは、高いＡＴ１Ｒレベルを発現するＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞と同じ程度までｒＭＣにおいて細胞表面に結合し、これは、単純な１ステップ認識プロセスが、粒子選択性を付与するために十分ではないことを実証している。ＣＬＳＭイメージにより、フローサイトメトリーの知見が確認され（図５Ｅおよび１３）、ここで、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ－およびＮＰＡｎｇ－Ｉ蛍光（赤色）は、標的ｒＭＣ（緑色）に大部分は関連したが、オフターゲットＨｅＬａでもＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞でも関連せず（白色）、一方で、ＮＰＥＸＰ蛍光は、ｒＭＣおよびＡＴ１Ｒ発現ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞の両方において見出された。全てを合わせると、これらの結果は、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ取り込みが受容体媒介性であること、およびＥＸＰ３１７４リガンドを介した初期細胞付着が、ウイルス模倣性認識プロセスによって付与される標的細胞に対する粒子特異性を低減させないことを実証している。
（実施例５）
ＮＰは、ＭＣをｉｎ ｖｉｖｏで標的化する
この実施例で言及される全ての材料および方法は、先の実施例に記載した通りであった。
ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ上の両方のリガンドの相補的標的化能力および粒子特異性がｉｎ ｖｉｔｒｏで実証されたので、次のステップは、ウイルス認識原理がより高いｉｎ ｖｉｖｏ ＭＣ蓄積をもたらすかどうかを決定することであった。その目的のために、標的化された粒子製剤（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ、ＮＰＡｎｇ－ＩおよびＮＰＥＸＰ）（図１Ａ）ならびに標的化されていない粒子製剤（ＮＰＭｅＯ）を、ＮＲＭＩマウス中に注射し、腎臓の凍結切片を、粒子関連蛍光について試験した（図６および１４Ａ）。図６Ａに示されるように、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ蛍光は、腎臓切片中の全ての糸球体にわたって均一に見出され得、尿細管などの他の腎臓構造には蛍光は見出されなかった。対照的に、標的化されていないＮＰＭｅＯについて、腎臓切片においてＮＰ蛍光はほとんど検出できなかった（図６Ｂ）。これは、単純なサイズ依存的な標的化が、ＭＣにおいて粒子蓄積を達成するには十分でないことを実証しているが、それは、ＮＰＭｅＯが、特異的細胞相互作用の欠如に起因して、メサンギウムからおそらくはクリアランスされるからである。さらに、標的化されたＮＰであるが細胞内在化を媒介することができないＮＰＥＸＰもまた、ごくわずかな糸球体蛍光を示し（図１４Ａ）、これは、粒子取り込みが、高いＭＣ蓄積を達成するために重要であることを実証している。さらに、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉは、付着因子を欠如するＮＰＡｎｇ－Ｉよりもはるかに強く均一な糸球体分布を達成し（図１４Ａ）、これは、ｉｎ ｖｉｖｏの増強された標的細胞認識原理が高度に有利であることを示している。
ＮＰ関連蛍光を定量的に評価し、異なる粒子製剤間での差異をより良く識別するために、糸球体のイメージを、より高い倍率で取得した（図７Ａ）。糸球体蛍光の定量的解析は、一部の糸球体において小さい蛍光スポットのみを示した標的化されていない対照粒子（ＮＰＭｅＯ）と比較して、増強された認識機構を有するウイルス模倣性粒子（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ）について、１５倍高い蛍光を生じた。
さらに、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉは、１リガンドの標的化された粒子よりも有意に高い蓄積を示した（それぞれ、ＮＰＥＸＰおよびＮＰＡｎｇ－Ｉよりも７倍および５倍高い）（図７Ｂ）。検出された蛍光が粒子関連であることは、自由に濾過され得るその小さいサイズに起因して強い尿細管蛍光を示したが糸球体蛍光は示さなかった（図１４Ｂ）、粒子標識化に使用した遊離色素（ＣＦ６４７）の腎臓分布によって確認された。ＮＰ糸球体分布を評価するために、外および内皮質中の糸球体の蛍光を比較した（図７Ｃ）。全ての粒子製剤について、２つの集団間に有意な差異は存在しなかった。これは、腎臓皮質全体の糸球体中に均一に粒子が分布されることを示しており、これは、糸球体関連疾患の処置のために不可欠な必要条件である。最後に、ＭＣとは別に、糸球体中には、ＮＰを内在化できた他の細胞が存在したので、マーカーとしてインテグリン－α８を使用するＭＣの特異的抗体染色を実施して、ＭＣ中に粒子が蓄積したことを解明した。図７Ｄに示されるように、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ蛍光は、抗体染色されたＭＣの内側に局在化し、これにより、粒子が、糸球体メサンギウムに到達することができるだけでなく、ＭＣによって取り込まれることもできることが確認された。
これらを合わせると、結果は、サイズ媒介性の標的化が、メサンギウムに到達するための必要条件であるが、ＭＣにおける粒子蓄積を達成するには不十分であることを明らかに示している。ＮＰ内在化は、メサンギウムクリアランスを回避するために必要不可欠のようであり、これは、この特質を欠如する粒子（ＮＰＭｅＯおよびＮＰＥＸＰ）が最も低い糸球体蛍光をもたらすことを説明する。ウイルス模倣性認識原理（ＮＰＡｎｇ－Ｉ）の実装は、ＮＰ特異性を増加させ、より高いＭＣ蓄積を次いでもたらす粒子取り込みを生じる。しかし、初期ウイルス様細胞付着を介して標的細胞認識を促進すること（ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉ）は、ＮＰの標的化潜在力を有意に増強し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって示されるように、２つのリガンドの組み合わせ効果の結果である。
さらに、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉの増強された機能化は、粒子血液滞留における減少をもたらさない。一般に、ＮＰは、ＰＥＧなどのポリマーでコーティングされ、これは、それらの循環時間を増加させ、血漿タンパク質吸着を減少させる。標的化された受容体を発現するオフターゲット細胞は、ＮＰに結合でき、ＮＰを妨害することができるので、リガンド機能化によって通常は対抗されるポジティブな効果。それにもかかわらず、注射の１時間後の血漿ＮＰ蛍光の定量化は、ＮＰＥＸＰＡｎｇ－Ｉが、標的化されていないＮＰＭｅＯと同じ程度まで、かつ他の標的化された製剤よりも有意に長く、循環中に残存したことを示した（図１４Ｃ）。これは、より複雑な細胞認識プロセスから生じるより高い粒子特異性におそらくは起因する。全体として、これらの結果は、ウイルスの結合および内在化を密接に模倣し、それを最適なＮＰサイズと組み合わせることによって、ＭＣを標的化し、ＭＣ中に大量に蓄積するＮＰを開発することが可能であることを実証している。
（実施例６）
材料および方法
材料
２０００および５０００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するヘテロ二機能的ヒドロキシルポリ（エチレングリコール）カルボン酸（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ／５ｋ－ＯＨ）ならびに２０００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するヒドロキシルポリ（エチレングリコール）Ｂｏｃ－アミン（Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＯＨ）は、Ｊｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ Ｉｎｃ．（Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入したが、５０００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）（ＭｅＯ－ＰＥＧ５ｋ－ＯＨ）およびＲｅｓｏｍｅｒ ＲＧ ５０２（ＰＬＧＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＥＸＰ３１７４（ロサルタンカルボン酸としても公知）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したが、環状ＲＧＤｆＫ（ｃＲＧＤｆＫ）は、Ｓｙｎｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ．Ｃｈｉｎａ）から得た。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）５６８ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（Ａｌｅｘａ５６８）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ（ＣＴＧ）およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｄｙｅ（ＣＴＤＲ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。２．２ｎｍの平均直径を有するアミン機能化球状金ＮＰ（Ａｕ２．２－ＮＨ２）は、Ｎａｎｏｐａｒｔｚ Ｉｎｃ．（Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ、ＵＳＡ）から得た。ＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅ（商標）ＥＭ Ｐｌｕｓキットは、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ（Ｙａｐｈａｎｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。ヤギ由来インテグリンα－８抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から得た。全ての他の化学物質は、異なって述べられない場合、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから解析グレードで購入した。超純水は、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ（ＣＲＬ－２１２８）およびＨｅＬａ（ＣＣＬ－２）細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。全ての細胞系は、１０％胎仔ウシ血清、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）（１×）および１００ｎＭヒドロコルチゾンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
ポリマー合成
ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ、Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋおよびＭｅＯ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋブロックコポリマーを、以前に記載されたように開環重合を介して合成した。簡潔に述べると、ヘテロ二機能的ＰＥＧポリマー（１当量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）＝当量（ｅｑｕｉｖ））を、３，６－ジメチル－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（７０当量）および１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（１，８－ｄｉａｚａｂｉｃｙｌｏ［５．４．０］ ｕｎｄｅｃ－７－ｅｎｅ）（３当量）と混合した。重合を安息香酸（１４当量）でクエンチするまで、ポリマー混合物を室温（ＲＴ）で１時間撹拌した。得られたブロックコポリマーを、ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過を介して単離し、真空下で乾燥させた。合成されたポリマーの分子量を、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ＧｍｂＨ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２９５Ｋで重水素化クロロホルム中で決定した。
ｃＲＧＤｆＫ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡポリマーの調製のために、以前に合成されたＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、以前に示されたように、ｃＲＧＤｆＫのリシン残基に共有結合的にカップリングした。手短に言えば、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ（１当量）を、３－（エチルイミノメチレンアミノ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＥＤＣ）／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２５当量）を使用してＲＴで２時間活性化し、その後、β－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）（３０当量）でクエンチした。活性化されたポリマーを、ｃＲＧＤｆＫ（３当量）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１０当量）とＲＴで２４時間反応させた。ジエチルエーテル／メタノール（１５：１ Ｖ／Ｖ））中での、得られたｃＲＧＤｆＫカップリングされたポリマーの沈殿の後、遊離ｃＲＧＤｆＫおよび過剰の反応物を、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水（ｍｐＨ２Ｏ）に対する透析を使用して除去した。
ＥＸＰ３１７４－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋのために、Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋのＢｏｃ保護基を最初に切断した。簡潔に述べると、Ｂｏｃ保護されたポリマーを、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：１ Ｖ／Ｖ）中に溶解させた。３０分間撹拌した後、過剰のＴＦＡを、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を使用して中和した。有機相を、ｍｐＨ２Ｏで洗浄し、その後、上記のようにポリマーを単離した。
得られたＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、イミダゾール構成成分のカルボニル残基を介してＥＸＰ３１７４にカップリングした。ＥＸＰ３１７４（３．５当量）を、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／ＮＨＳ（３．３当量）でＲＴで２時間活性化した。遠心分離を介した得られたジシクロヘキシル尿素の除去後に、ＮＨ２－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ（１当量）およびＤＩＰＥＡ（１７．５当量）を添加し、ＲＴで２４時間反応させた。得られたＥＸＰ３１７４－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、メタノール／ジエチルエーテル（１：５ Ｖ／Ｖ）中で沈殿させ、産物を、エタノール／１００ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．５／水（１／１／８ Ｖ／Ｖ）に対して２４時間透析し、その後、ｍｐＨ２Ｏに対して１２時間透析して、未反応のＥＸＰ３１７４および過剰の反応物を除去した。
蛍光色素を用いたＰＬＧＡ標識化
粒子可視化のために、コア形成性ＰＬＧＡを、ＮＰ調製前に蛍光色素に共有結合的に連結させた。その目的のために、カルボン酸で終端したＰＬＧＡを、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）を触媒剤として使用して２時間活性化した。次いで、活性化されたＰＬＧＡを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）５６８ ＨｙｄｒａｚｉｄｅまたはＣＦ（商標）６４７アミンのいずれかとＲＴで２４時間反応させた。標識したＰＬＧＡを、ｍｐＨ２Ｏに対して２４時間透析して、未反応の蛍光色素を除去した。
ナノ金を用いたＰＬＧＡ標識化
電子顕微鏡解析のために、ＰＬＧＡをナノ金にコンジュゲートした。ＰＬＧＡを、ＤＣＭ中のＥＤＣおよびＮＨＳで２時間最初に活性化した。減圧下でのＤＣＭ除去の後、活性化されたＰＬＧＡを、ＤＭＳＯ中に溶解させ、ＤＩＰＥＡおよび２．２ｎｍの平均直径を有する凍結乾燥させたモノアミノ金ナノ粒子（Ａｕ２．２－ＮＨ２）と混合した。ＲＴで２４時間撹拌した後、金コンジュゲートしたＰＬＧＡを、ｍｐＨ２Ｏ中で沈殿させ、２５００ｇで１０分間の遠心分離を介して単離し、凍結乾燥させた。
ＮＰ調製
ブロックコポリマーナノ粒子を、一般的な溶媒蒸発技法を使用して製造した。ＰＥＧ－ＰＬＡポリマーおよびＰＬＧＡの対応する量を、７０／３０（ｍ／ｍ）の比で混合し、アセトニトリル（ＡＣＮ）中に希釈して、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。ヘテロ－／ホモ－機能的ＮＰ種について所望のリガンド表面密度に到達するために、ｃＲＧＤｆＫ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡおよび／またはＥＸＰ３１７４－ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋを、図１８ｄ／ｅに示される較正に従って、ＣＯＯＨ－ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋと混合した。次いで、有機相を、激しく撹拌する１０％ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（７．５ｍＭ、ｐＨ７．４）に滴下添加し、ＲＴで３時間撹拌して、有機溶媒を除去した。
得られたＮＰ分散物を、Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｓｅｐフィルター（分子量カットオフ３０ｋＤａ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して、１２５０ｇで２５分間の遠心分離を介して濃縮した。製造したＮＰの質量濃度を得るために、ＰＥＧ含量を、比色ヨウ素錯体形成アッセイを使用して評価した。次いで、ＮＰを凍結乾燥させ、重量測定的に解析して、ＰＥＧ含量およびＮＰ重量の比を得た。以下の実験では、この比を使用して、各ＮＰ種について、評価したＰＥＧ含量から質量濃度を計算した。
ＮＰ特徴付け
ＮＰサイズおよびζ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して評価した。試料を、ＰＭＡＡセミマイクロキュベット（ＤＬＳ；Ｂｒａｎｄ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または折りたたみキャピラリーセル（ζ電位；Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｈｅｒｒｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかを使用して、７．５ｍＭ ＤＰＢＳ中で、１７３°の角度で６３３ｎｍ Ｈｅ－Ｎｅレーザーを用いて測定した（２５℃、ＲＴ）。
ｃＲＧＤｆＫ定量化
ＮＰ表面上のｃＲＧＤｆＫのレベルを、アルギニンの測定値に基づいて評価した。簡潔に述べると、５０μＬのＮＰ試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、９，１０－フェナントレンキノン（エタノール中１５０μＭ）および２Ｎ ＮａＯＨ（６：１ Ｖ／Ｖ）からなる作業溶液１７５μＬと混合した。６０℃での３時間のインキュベーション後、１当量の試料を、１当量の１Ｎ ＨＣｌと混合し、ＲＴでもう１時間インキュベートした。最後に、蛍光を、３１２／７ｎｍの励起波長および３９５／７ｎｍの発光波長を用いてＳｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で測定した。ｃＲＧＤｆＫの希釈（０～４０μｇ／ｍＬ）は、較正として機能した。ｃＲＧＤｆＫモル濃度およびモル濃度ｃＲＧＤｆＫ含量とモル濃度ＰＥＧ含量との比を決定し、理論値に対してプロットした（図１８ｄ）。
ＥＸＰ３１７４定量化
製造した粒子上のＥＸＰ３１７４の表面レベルを決定するために、１当量のＮＰ試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、１０当量の０．２Ｍ酢酸と混合した。０．２Ｍ酢酸中でのＥＸＰ３１７４の希釈（０～３０μＭ）は、較正として機能した。試料および標準の蛍光を、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（上記を参照のこと）（励起２５０／１０ｎｍ、発光３７０／５ｎｍ）で測定した。ＥＸＰ３１７４モル濃度およびモル濃度ＥＸＰ３１７４含量とモル濃度ＰＥＧ含量との比を決定し、理論値に対してプロットした（図１８ｅ）。
カルシウム動員アッセイ
ＮＰのＡＴ１ｒ結合を調査するために、細胞内カルシウムレベルを、ｆｕｒａ－２をＣａ２＋キレーターとして使用して測定した。簡潔に述べると、ｒＭＣを、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ－１５培地中の５μＭ ｆｕｒａ－２ＡＭ、２．５ｍＭプロベネシドおよび０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ Ｆ－１２７と共にＲＴで１時間インキュベートした。細胞をその後遠心分離し（５分間、２００ｇ、ＲＴ）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚの培地中に再懸濁した。異なる濃度の４５μＬのＮＰまたは遊離ＥＸＰ３１７４を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中にピペッティングし、その後、４５μＬのｒＭＣ懸濁物（２×１０６／ｍＬ）をピペッティングした。以下では、細胞を、試料と共にＲＴで４５分間インキュベートした。インキュベーション後、１０μＬの３０ｎＭ ＡＴ ＩＩを各ウェルに添加して、未阻害のＡＴ１ｒを活性化し、細胞サイトゾル中へのＣａ２＋流入を結果として誘導した。注射後最初の３０秒間の間の蛍光シグナルを、３４０／２０ｎｍおよび３８０／２０ｎｍの励起フィルターならびに５１０／２０ｎｍの発光フィルターをそれぞれ用いてＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｍｅｇａ蛍光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。Ｃａ２＋が結合したＦｕｒａ－２の、Ｃａ２＋が結合していないＦｕｒａ－２に対する最大比を、負荷された細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００と共にインキュベートし、上記のように蛍光レベルを測定することによって評価した。同様に、最小比は、４５ｍＭエチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）と合わせた０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００とのインキュベーションによって達成された。試料１つ当たりの細胞内カルシウムのレベルを、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌの方程式を使用して計算した。半数阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、シグモイド用量応答方程式（可変勾配）を適用して計算した。
ＣＬＳＭ解析
ＮＰ－細胞相互作用の詳細な解析のために、ｒＭＣを、１５，０００細胞／ウェルの密度で８ウェルスライド（Ｉｂｉｄｉ、Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞サイトゾルの可視化を促進するために、ｒＭＣを、播種の前に、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中でＣＴＤＲ（２５μＭ、４５分間、３７℃）で染色した。ＮＰを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）５６８で標識したＰＬＧＡを使用して製造し、０．１％ＢＳＡを補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚの緩衝液中で０．０５ｍｇ／ｍＬに調整した。メサンギウム細胞を、２５０μＬのＮＰと共に３７℃で１５、４５および９０分間インキュベートし、事前に温めたＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定した。最終洗浄ステップの後、固定された試料を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して解析した。
フローサイトメトリー
ＮＰ試料のメサンギウム細胞会合を評価するために、ｒＭＣを、４０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。ＮＰを、ＣＦ（商標）６４７で標識したＰＬＧＡを使用して製造し、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚの緩衝液中で０．０５ｍｇ ＮＰ／ｍＬに調整した。ＮＰの細胞進入のαＶβ３依存性を確認するために、３００μＬの遊離ｃＲＧＤｆＫ（ｃ＝５００μＭ）を、ＮＰインキュベーションの前に、関連する細胞試料に１５分間添加した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、３００μＬの事前に温めたＮＰ溶液を３７℃で６０分間添加した。時間依存的取り込みのそれぞれの解析のために、細胞を、１２０分間の期間にわたってインキュベートし、ＮＰを、０、１５、３０、４５、６０、９０および１２０分後に除去した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、２００ｇおよび４℃で５分間遠心分離し、その後、２回のさらなる洗浄および遠心分離のステップが続いた（ＤＰＢＳ、２００ｇ、５分間、４℃）。最終試料を、ＤＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して解析した。ＮＰ関連蛍光を、６３３ｎｍで励起させ、対応する発光を記録した（６６１／１６バンドパスフィルター）。フローサイトメトリーデータを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．１（Ｔｕｒｋｕ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して解析した。生存細胞の集団内で、細胞関連蛍光の幾何平均を評価した。
透過電子顕微鏡
ＮＰの細胞局在化を評価するために、ｒＭＣを、１２．０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート中に播種し、７２時間インキュベートした。ナノ金にコンジュゲートしたＰＬＧＡを含むＮＰ製剤を、０．１％ＢＳＡを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚの緩衝液中に希釈し、０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ｖ＝３００μＬ）の濃度で４５分間添加した。インキュベーション後、試料をＤＰＢＳで洗浄し、電子顕微鏡解析のために調製した。簡潔に述べると、細胞を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（Ｃａｃｏ緩衝液）中の２．５％ＰＦＡおよび２．５％グルタルアルデヒドでＲＴで６０分間固定し、Ｃａｃｏ緩衝液で洗浄し、ＤＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘで１０分間透過処理した。ｍｐＨ２Ｏによる洗浄ステップの後、試料を、ＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅ（商標）ＥＭ Ｐｌｕｓキット（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、Ｙａｐｈａｎｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を製造業者の仕様書に従って使用して金で増強し、その後、さらに洗浄し、ｍｐＨ２Ｏ中２．５％のチオ硫酸ナトリウム溶液中で後固定した。細胞を、０．５％四酸化オスミウムで染色し、リンス濃度のエタノール（５０～９９．５％）中で脱水した。対比染色のために、２％酢酸ウラニルを、７０％のエタノール濃度で５分間適用した。Ｅｐｏｎ中に包埋した後、１５０ｎｍの極薄切片を、６３００×ならびに１２５００×の倍率で１００ｋＶ Ｚｅｉｓｓ Ｌｉｂｒａ １２０電子顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＮＴＳ ＧｍｂＨ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してイメージングした。
共培養実験
製造したＮＰの細胞選択性を評価するために、本発明者らは、本発明者らが以前に実装した共培養設計を使用した。フローサイトメトリー解析のために、ｒＭＣを、２４ウェルプレート中にそれぞれ１０，０００および７５，０００細胞／ウェルの密度のＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞と一緒に播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。細胞型間を区別するために、ｒＭＣを、播種の前に、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中でＣＴＧ（１５μＭ、４５分間、３７℃）で染色した。次いで、共培養した細胞を、０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ｖ＝３００μＬ）の濃度のＣＦ（商標）６４７で標識したＮＰと共に４５分間インキュベートした。試料の調製およびフローサイトメトリー解析を、上記のように実施した。さらに、ｒＭＣ関連蛍光を、４８８ｎｍで励起し、５３０／３０バンドパスフィルターを使用して記録した。データ解析の間に、生存細胞の集団を、染色されたｒＭＣ細胞についてさらにゲート処理し、ＮＰ関連蛍光を細胞特異性に関して解析した。
ＣＬＳＭ解析のために、ｒＭＣ細胞を、上記のように播種の前にＣＴＧ染色した。全ての細胞型を可視化するために、ＨｅＬａまたはＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞もまた、ＣＴＤＲを使用して染色した（２５μＭ、４５分間、３７℃）。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）インキュベーションの後、ｒＭＣを、２，０００および１０，０００／２０，０００細胞／ウェルの密度のＨｅＬａ／ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞と一緒に８ウェルＩｂｉｄｉスライド中に播種した。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（ＤＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）で２０分間染色した。細胞を、事前に温めたＤＰＢＳで２回洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）５６８で標識したＮＰを、０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ｖ＝２５０μＬ）の濃度で３７℃で４５分間添加した。ＮＰインキュベーションの後、試料を上記のように処置し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０顕微鏡を使用して解析した。
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞標的化
動物実験は、国のおよび施設のガイドラインに従って実施し、現地の当局によって承認された（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎ、参照番号：５５．２－２５３２－２－３２９）。雌性１０週齢ＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、モデル動物として作用した。ブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）による鎮痛の後、マウスを２．５％イソフルランで麻酔し、１００μＬのＣＦ（商標）６４７で標識したＮＰ（ｃ＝１２０ｎＭ）を頸静脈を介して注射した。マウスを麻酔下で維持し、５分後、初期血液試料を、ｉ．ｖ．穿刺を介して採取した。６０分後、マウスを、ケタミン／キシラジンで麻酔し、最終血液試料を採取し、動物を、潅流固定を介して屠殺した。両方の腎臓を取り出し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ ｐＨ７．４）中１８％のスクロースおよび１４％のＰＦＡの溶液に、即座に移した。６時間後、腎臓をＤＰＢＳで洗浄し、さらなる処理まで－８０℃で凍結保護した。凍結切片のために、臓器を、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．（商標）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に包埋し、ＣｒｙＳｔａｒ ＮＸ７０クライオトーム（ｃｒｙｏｔｏｍｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して５μｍの切片へと切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）プラスガラススライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｒｔｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で固定した。ＮＰ腎臓沈着の解析および糸球体蛍光定量化のために、切片を、ＤＰＢＳ中でリンスし、ＤＰＢＳ中の０．０４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを補充した５％のＢＳＡでＲＴで１０分間ブロッキングした。ＤＰＢＳ中でさらにリンスした後、試料を、ＤＰＢＳ中０．５％のＢＳＡおよび０．０４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ中１：４００希釈の４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で、細胞核について染色した。それぞれＤＰＢＳおよびｍｐＨ２Ｏ中での最終洗浄ステップの後に、凍結切片を、Ｍｏｗｉｏｌ封入媒体を用いてマウントし、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍで解析した。イメージ解析のために、Ｆｉｊｉソフトウェア（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用した。糸球体蛍光強度を、ある特定の蛍光閾値を超える面積の積分した密度を測定し、糸球体面積によって除算することによって評価した。ＮＰの正確な細胞位置を評価するために、腎臓凍結切片を上記のように調製した。切片の洗浄およびブロッキングの後に、試料を、ヤギ由来インテグリンα－８抗体（ＤＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ／０．０４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ中１：２００希釈）で４℃で一晩染色した。その後、試料をＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ／０．０４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ中１：４００希釈のＣｙ２（登録商標）ロバ抗ヤギおよびＤＡＰＩでＲＴで１時間染色した。最終洗浄ステップの後、試料をマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０で解析した。
（実施例７）
モジュラー概念を使用するヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの調製
この実施例で言及される全ての材料および方法は、実施例６で記載した通りであった。
所望のアデノウイルス模倣特性を有するＮＰを創出するために、本発明者らは、異なる生体適合性ポリマー構成成分の、ヘテロ－多価粒子種への相乗的な組合せに基づくモジュラー設計を実装した（図１８ａ）。ＮＰの全体的ポリマー組成は、両方の標的化概念を適切に比較することができるように、本発明者らの以前のインフルエンザＡ模倣性ＮＰ設計と類似させることを意図した。それにより、広く確立されたポリ（乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）は、水性媒体中で増強された構造的完全性を保証するだけでなく、蛍光色素またはナノ金のカップリングを介したＮＰ可視化もまた可能にする、疎水性ＮＰコアを形成する。第２の構成成分としてのポリ（エチレングリコール）－ポリ（乳酸）（ＰＥＧ－ＰＬＡ）ブロックコポリマーは、追及されるウイルス模倣性ＮＰ設計を実装するために必要とされる構造的柔軟性を提供する。第１のステップでは、より長い（ＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ）またはより短い（ＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋ）ＰＥＧ鎖のいずれかを有するＰＥＧ－ＰＬＡポリマーを、以前に記載された開環重合を介して合成した（図２５ａ）。ＥＸＰ３１７４は、自由に移動するリガンドとしてメサンギウムＡＴ１ｒに最初に結合するように意図したので、より長い、したがってより柔軟性のあるＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋ鎖に共有結合的にカップリングさせた（図２５ｂ）。対照的に、第２のリガンド（ｃＲＧＤｆＫ）は、最初のＡＴ１ｒ結合およびＮＰの引き続く空間的接近が起こっていない限り、表面に結合したインテグリンと相互作用することができないはずである。それに関して、第２のリガンド（ｃＲＧＤｆＫ）を、より短いＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋに結合させた（図２５ｃ）。ｃＲＧＤｆＫおよびＥＸＰ３１７４の両方の表面密度は、ナノ沈殿を介したＮＰ製造の前に、リガンド機能化または機能化されていないＰＥＧ－ＰＬＡポリマーのいずれかの明確な量をＰＬＧＡと混合することによって、正確に調整され得る（図１８ｄ／ｅ）。
本発明者らは、それらの表面上に２５％のＥＸＰ３１７４および１５％のｃＲＧＤｆＫを有するヘテロ－機能的ナノ粒子（ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ）を調製することを決定し、それにより、リガンドの受容体結合能を十分に活用したが、製造した粒子の構造的完全性は保存した。粒子は、立体的に柔軟性のあるＥＸＰ３１７４を介したＡＴ１ｒへの結合によって標的細胞に位置し、次いで、細胞表面までの空間的距離を低下させ、引き続いて、以前には隠れていたｃＲＧＤｆＫを介してαＶβ３インテグリンを活性化し、最終的に、ＮＰエンドサイトーシスを開始させることができるはずである（図１７ｃ）。６０ｎｍのサイズ閾値を下回るヘテロ－機能的ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰならびにホモ－機能的（ＥＸＰ ＮＰ／ｃＲＧＤ ＮＰ）および機能化されておらず、メトキシで終端した粒子（対照ＮＰ）を製造したところ、負のゼータ電位値が示された（図１８ｂ／ｃ）。これらの特徴は、内皮開窓を介した首尾よい溢出を促進するだけでなく（図１７ａ／ｂ）、ＮＰファゴサイトーシスまたは広範な血清タンパク質吸着もまた防止するはずである。
（実施例８）
ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、標的モチーフに対する優れたリガンド親和性を示す
この実施例で言及される全ての材料および方法は、実施例６および７で記載した通りであった。
本発明者らは、ラットメサンギウム細胞（ｒＭＣ）によって発現されるＡＴ１ｒへの、ＥＸＰ３１７４媒介性のＮＰ結合を試験した。Ｇｑ共役型ＡＴ１ｒの、その一次リガンドであるアンジオテンシンＩＩ（ＡＴ ＩＩ）による活性化は、細胞サイトゾル中へのカルシウム流入を生じるので、ＡＴ ＩＩ刺激後の細胞内Ｃａ２＋レベルは、ＮＰインキュベーション後のＡＴ１ｒ活性のマーカーとして使用することができる。それにより、リガンド自体が強力なアンタゴニストとして作用するので、低い受容体活性は、結合したＥＸＰ３１７４の高い比を示す。図１９は、ＮＰまたは遊離ＥＸＰ３１７４と共に４５分間事前インキュベートしたＡＴ ＩＩで刺激したｒＭＣの細胞内Ｃａ２＋レベルを示す。ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ（ＩＣ５０＝２７６±３１ｐＭ）およびＥＸＰ ＮＰ（ＩＣ５０＝５５２±７３ｐＭ）は共に、優れたＡＴ１ｒアビディティを示し、これは、ピコモル濃度範囲での受容体の高度に有効な阻害と、結果として生じる最小のサイトゾル内Ｃａ２＋レベルとを生じる（図１９ａ）。さらに、ＥＸＰ３１７４保有ＮＰ型の阻害有効性は、遊離リガンドについてよりも、さらに高かった（ＩＣ５０＝２．６６±０．９ｎＭ）。これは、ＥＸＰ３１７４機能化粒子が、標的受容体と多価形式で相互作用することができ、全体的アビディティの増大をもたらしたことを強く示唆している。ＥＸＰｃＲＧＤおよびＥＸＰ ＮＰの両方のＩＣ５０レベルは、同じ範囲内であることが見出されたので、本発明者らは、１つの粒子型におけるＥＸＰ３１７４およびｃＲＧＤｆＫの両方の組合せが、ＥＸＰ３１７４自体の結合能を有意には妨害しなかったと結論付けた。さらに、対照ＮＰおよびｃＲＧＤ ＮＰは、ＡＴ１ｒとの相互作用を示さず、受容体刺激の際に最大Ｃａ２＋シグナルを生じ、ＡＴ１ｒに対するアッセイの特異性が確認された（図１９ｂ）。
アデノウイルス模倣性ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰのＡＴ１ｒ結合能を検証した後、次のステップは、ｃＲＧＤｆＫ－αＶβ３相互作用を介したｒＭＣ中への粒子取り込みを調査することであった。したがって、本発明者らは、メサンギウム細胞を、蛍光標識したＮＰと共にインキュベートし、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を介して細胞分布を解析した。細胞体を可視化するために、ｒＭＣを、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（ＣＴＤＲ）で事前処置した。図２０ａは、エンドサイトーシス小胞を示す球状構造におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）５６８で標識したＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの強い細胞内蓄積を示している。経時的に、眼に見える蓄積の数および強度の両方が増加した。さらに、小胞は、より長いインキュベーション時間でサイズが増大するようであった。これらの知見は、ｃＲＧＤｆＫ機能化ＮＰが標的細胞に結合することができ、インテグリン媒介性のエンドサイトーシスを介して細胞内小胞中に取り込まれることができることを支持している。経時的に、これらのエンドサイトーシス小胞は、より大きいエンドソームへと融合し、サイズならびに強度がさらに増大する。
ＣＬＳＭ結果に基づいて、本発明者らは、ＮＰで処置したｒＭＣのフローサイトメトリー解析を実施し、１２０分間のインキュベーション期間にわたって細胞関連蛍光を決定した。図２０ｂに示されるように、ＮＰ由来蛍光のレベルは、全インキュベーション期間にわたって、全ての他のＮＰ種と比較して、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰについて最大であった。ＥＸＰ ＮＰならびに対照ＮＰは、中等度の蛍光シグナルを示したに過ぎないが、かなりのレベルの細胞会合が、ｃＲＧＤ ＮＰについて検出できた。際立って、それぞれの蛍光レベルは、およそ６０分後にプラトーに達したが、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの細胞会合はさらに増加した。これは、ホモ－機能的ｃＲＧＤ ＮＰと比較して長期の、蛍光レベルの増加を生じる、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰとそれらの標的細胞との間での逐次的な相互作用の仮説を強く支持する。
ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ細胞取り込みに対するαＶβ３インテグリンの影響を調査するために、過剰量の遊離ｃＲＧＤｆＫ（ｃ＝５００μＭ）を添加し、その後、ｒＭＣをＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰと共に６０分間インキュベートした。結果として、細胞関連蛍光のレベルは、ＥＸＰ ＮＰまたは対照ＮＰのものと匹敵するレベルまで鋭く減少した（図２０ｃ）。ヘテロ－多価粒子は、見かけ上、必要なαＶβ３インテグリンにもはや向かうことができず、したがって、ＡＴ１ｒ結合後にエンドサイトーシスを実質的に開始させることができなかった。
インテグリン媒介性のＮＰエンドサイトーシスの概念をさらに検証するために、本発明者らは、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を利用することを決定し、これは、はるかにより高い倍率レベルでのＮＰ－細胞相互作用の評価を可能にした。電子密度を増加させ、適用されたＮＰの結果として生じるＴＥＭ可視性を増加させるために、２．２ｎｍの平均直径を有する超小型金ナノ粒子を、さらなるＮＰ製造のために次いで使用したＰＬＧＡに共有結合的にカップリングさせた（図２６）。粒子の金コアを増感させ、したがってそれを可視化し、それらの正確な位置を評価するために、これらの金タグ付きＮＰと共にインキュベートしたメサンギウム細胞を次いで金で増強させることができた。このレトロスペクティブな金増強は、ナノ金で標識したＮＰの物理化学的特徴が未標識のＮＰと有意に異ならないという実質的な利点を提供するが、これは、通常利用される金ＮＰについては当てはまらない。
図２１ａは、金タグ付きＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰと共にインキュベートした２つのメサンギウム細胞の細胞体を示している。細胞サイトゾル内で、金で増強されたＮＰで満たされた多数の丸形の小胞が検出できた。分布パターンは、以前に記載されたＣＬＳＭ結果（図２０ａ）との顕著な類似性を示し、それにより、リガンド媒介性のＮＰエンドサイトーシスを強く支持している。さらに、粒子は、細胞境界において蓄積したことが観察され、これは、これらのＮＰが膜に位置する表面構造になおも結合していたことを示している。これらの知見は、適用されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、ＡＴ１ｒへの事前の結合および引き続くインテグリン媒介性のエンドサイトーシスの段階的プロセスにおいて、標的細胞と相互作用したことをさらに示している。この評価に従って、表面に結合したｃＲＧＤｆＫなしのＥＸＰ ＮＰは、ｒＭＣ膜においてのみ検出でき、エンドサイトーシス小胞中には粒子蓄積は見出されなかった（図２１ｂ）。さらに、対照ＮＰについての細胞－粒子会合はわずかのみであった（図２１ｃ）。適用された金増強の特異性は、粒子なし細胞における金蓄積の欠如によって示された。
（実施例９）
リガンド相乗作用は、増強されたメサンギウム細胞選択性をｉｎ ｖｉｔｒｏでもたらす
この実施例で言及される全ての材料および方法は、実施例６～８で記載した通りであった。
ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰがその表面リガンドの両方の重要な特色を相乗的に組み合わせ、立体的に制御された様式でそれらを提示することが実証されたので、本発明者らは、この設計がメサンギウム細胞選択性を増加させるために実際に利用することができることを実証することを意図した。したがって、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏベースのアッセイを実装し、標的ｒＭＣを、標的受容体を有さないまたは２つの標的受容体のうち一方のみを有する優勢な数（５～１０倍）のオフターゲット細胞と共に共培養した。ＨｅＬａ細胞は、ＡＴ１ｒもαＶβ３－インテグリンも顕著な程度まで発現しなかったが、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞は、高いＡＴ１ｒ発現を示したが、低いαＶβ３発現を示したので、これを選択した（図２７）。
ＣＬＳＭ解析において共培養した細胞間を区別するために、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ（ＣＴＧ）を使用してｒＭＣを染色したが、オフターゲット細胞はＣＴＤＲでマークした。蛍光標識したＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰとの４５分間のインキュベーションの後に、ＮＰの細胞分布を評価した。ｒＭＣ／ＨｅＬａ共培養モデルでは、粒子由来の蛍光は、メサンギウム細胞の領域内でほぼ排他的に検出することができた。ＨｅＬａ細胞は、対照的に、ＮＰとの弱い相互作用を示したに過ぎず、わずかな蛍光レベルを生じた（図２２ａ）。したがって、本発明者らは、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、細胞表面上での受容体発現における差異に起因して、ＨｅＬａ細胞の間のメサンギウム細胞に選択的に位置できたと結論付けた。これらの知見は、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの細胞関連蛍光がオフターゲットＨｅＬａ細胞においてよりもｒＭＣにおいて有意に高かったが、対照ＮＰについての細胞相互作用は、両方の細胞型についてわずかだけであったことを示すフローサイトメトリー解析によって支持された（図２２ｂ）。対照的に、ｒＭＣ／ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ共培養は、多様な粒子分布を提供した。ＮＰ関連蛍光は、ｒＭＣにおいて見出すことができただけでなく、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞によってカバーされる領域内でも見出すことができた。しかし、分布パターンは、有意に異なった。ｒＭＣの間での蛍光は、以前に見られたように、丸形の小胞様構造において見出されたが、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ関連蛍光は、より拡散しており、細胞膜において主に増大された（図２２ａ）。したがって、本発明者らは、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、ｒＭＣのエンドサイトーシス小胞中に蓄積するが、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞の細胞膜中に存在するＡＴ１ｒに結合することができただけであり、αＶβ３インテグリンの非存在に起因してサイトゾル中に取り込まれることができなかったと結論付けた。さらに、フローサイトメトリー解析により、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞についてのＮＰ関連蛍光がＨｅＬａ細胞と比較してより高かったが、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰがメサンギウム細胞において有意に増強されたシグナルをなおも示したことが示された（図２２ｃ）。際立って、ＮＰインキュベーションの前の過剰量の遊離ＥＸＰ３１７４（ｃ＝１ｍＭ）の添加は、ＮＣＩ－Ｈ２９５Ｒ細胞についての蛍光レベルの鋭い減少をもたらしたが、ｒＭＣについての細胞関連蛍光は、なおも有意に高かった。この観察は、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰがメサンギウム細胞を標的化するために両方の表面リガンドを利用することが実際にでき、それにより、ヘテロ－機能的設計から利益を得るという見解をさらに支持する。
まとめると、本発明者らの共培養モデルは、ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが、数において主流であるだけでなく、さらには２つの標的受容体のうち一方を発現するオフターゲット細胞の存在下で、受容体陽性メサンギウム細胞を効果的に同定する能力を有することを実証した。
（実施例１０）
メサンギウム細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏでのアデノウイルス模倣性ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの蓄積
この実施例で言及される全ての材料および方法は、実施例６～９で記載した通りであった。
ｒＭＣ結合および取り込み研究の両方が、逐次的なリガンド－受容体相互作用の、本発明者らのウイルス模倣概念により、ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰがメサンギウム細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に標的化することができるようになることを、首尾よく示した。しかし、多くの戦略が所望の標的特異性を送達することに失敗しているので、十分なｉｎ ｖｉｖｏ効率を有する堅牢な系へとｉｎ ｖｉｔｒｏ結果を移行させることは、ナノ粒子設計における主要な障害であることが示されている。したがって、本発明者らは、能動的な細胞取り込み促進を要求するだけでなく、標的領域における適切な受動的蓄積もまた要求する、メサンギウム領域にｉｎ ｖｉｖｏで実際に到達するＮＰの能力を評価することを決定した。それに関して、蛍光標識したＮＰを、１０週齢の雌性ＮＭＲＩマウス中に注射した。１時間のＮＰ循環後、マウスを屠殺し、腎臓を抽出した。調製された凍結切片の蛍光解析により、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰが糸球体領域中に効果的に蓄積したが、腎臓の尿細管部分における蛍光は無視できたことが明らかになった（図２３）。対照的に、対照ＮＰならびにホモ－機能的ＥＸＰまたはｃＲＧＤ ＮＰは、腎臓凍結切片においてかなり低い沈着を示した。
観察された差異を定量化するために、糸球体関連蛍光レベルを、全てのＮＰ型について、面積当たりの糸球体蛍光強度を評価することによって決定した（図２４ａ／ｂ）。それにより、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、対照ＮＰと比較して、蛍光強度における１０倍を超える増加を示した。さらに、ヘテロ－多価ＮＰの糸球体蓄積は、両方のホモ－機能的ＮＰ型についてよりも有意に大きかった。際立って、ｃＲＧＤ ＮＰ蛍光は、機能化されていない対照ＮＰについてよりもさらに低かった。優勢な数の粒子が、注射の直後にαＶβ３発現内皮細胞に結合し、結果として、腎臓のより深い領域に到達する前に血流から離れるので、本発明者らは、ｃＲＧＤ ＮＰが、糸球体領域に到達することができなかったと仮説を立てている。この仮説は、１時間のインキュベーション後のｃＲＧＤ ＮＰの相対的血漿レベルが全ての粒子型の間で最小であったという知見によってさらに支持された（図２８ａ）。対照的に、ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰでは、より短いｃＲＧＤｆＫ機能化ＰＥＧ－ＰＬＡ鎖は、より長いＥＸＰ３１７４機能化ＰＥＧ－ＰＬＡ鎖の添加によって、αＶβ３インテグリンへの早すぎる提示から遮蔽された。結果として、ヘテロ－多価粒子は、オフターゲット沈着を回避し、したがって、腎臓内の糸球体領域に首尾よく到達した。メサンギウム細胞マーカーインテグリン－α８についての抗体染色により、糸球体におけるＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ関連蛍光が、メサンギウム細胞内でほぼ完全に見出され得ることがさらに明らかになり（図２４ｃ）、これは、メサンギウム間質中への溢出および引き続くエンドサイトーシスの仮説を証明した（図１７ａ／ｂ）。メサンギウム領域中の検出された蛍光が、構造的にインタクトなＮＰに由来したことを検証するために、本発明者らは、さらに、匹敵する用量の遊離蛍光色素をマウス中に注射し、蛍光沈着を解析した。これらの試料についての糸球体内シグナルは無視できるほどであったが、尿細管細胞は、非常に強い蛍光レベルを示した（図２８ｂ）。これは、注射したＮＰ種とは対照的に、低分子色素が腎濾過されたことを示した。したがって、本発明者らは、全てのＮＰ型についての糸球体内蛍光がインタクトな粒子に由来したと結論付けたが、それは、そうでなければ、分解は、尿細管シグナルにおける増加をもたらしたからである。
したがって、本明細書で記述されるｉｎ ｖｉｖｏ研究は、本発明の新たなアデノウイルス模倣性ＮＰ設計の可能性を首尾よく実証した。ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、糸球体のメサンギウム領域に効果的に蓄積したが、ホモ－機能的または機能化されていないＮＰ種は、そのように蓄積できなかった。これは、十分なレベルのバイオアベイラビリティに到達するために、ＮＰが、適切な表面リガンドを有する必要があるだけでなく、それぞれの標的化戦略に適切な組織化された形式でそれらを提示しなければならないことを強く示唆している。さらに、メサンギウムにおけるＮＰ蓄積は、立体的に制御された粒子－細胞相互作用のアデノウイルス模倣性システムが高度に有効であることも証明した。
（実施例１１）
シナシグアトで負荷されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、高い効率を示す
インフルエンザＡ模倣性またはアデノウイルス模倣性の標的細胞認識概念のいずれかを使用するナノ粒子（ＮＰ）は、ｉｎ ｖｉｖｏ状況においてメサンギウム細胞内に効率的に蓄積することが検出された。次のステップでは、実験的薬物シナシグアト（ＢＡＹ ５８－２６６７）を、アデノウイルス模倣性ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ中に被包した。シナシグアト（ＣＣＧ）は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の強力な活性化因子であり、メサンギウム線維症を有意に減少させ、糖尿病動物モデルにおいて糸球体損傷を低減させることが示されている。本発明者らの有望なＮＰ種中にＣＣＧを被包することによって、病理学的メサンギウム部位へのＣＣＧの細胞選択的送達がかなり増加され得、最小化されたオフターゲット効果と共に、増強された治療効果がもたらされる（図２９）。
本発明者らの実験的セットアップでは、ＣＣＧを、ヘテロ－多価ＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ中に最初に被包した。得られたＮＰは、ＮＰ１つ当たりおよそ５００～７００個のＣＣＧ分子を有した（データ示さず）。全ての以下の実験では、２μＭの濃度での遊離シナシグアトの投与を、およそ０．５ｎＭ（０．２μＭのＣＣＧと等しい）の濃度のＣＣＧで負荷されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ、および薬物なしのＥＸＰｃＲＧＤ対照ＮＰと比較した（図３０）。遊離シナシグアトの濃度は、この濃度範囲においてＣＣＧの抗線維化効果を示した以前の刊行物に従って選択した。しかし、ＣＣＧ保有ＮＰは、可能な薬物送達効果を試験するために、それぞれのＣＣＧ量の１０％のみを有した。
標的ｓＧＣに対するＣＣＧで負荷されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰの効果を評価するために、メサンギウム細胞を２４時間最初にインキュベートし、タンパク質量を、ウエスタンブロット解析を使用して評価した。興味深いことに、ｓＧＣの全体量は、それにより、遊離薬物およびＣＣＧで負荷されたＮＰとのインキュベーション両方の後に徐々に増加しており、これは、ｓＧＣに対するシナシグアトの、以前に示された活性化効果だけでなく、安定化効果もまた示している（図３１）。対照的に、シナシグアトを欠如するＮＰは、ｓＧＣレベルに対する有意な効果を全く示さなかった。
最後に、ＮＰで補助されたＣＣＧ送達の抗線維化潜在力および抗増殖潜在力を解析した。それに関して、メサンギウム細胞を、遊離ＣＣＧ、ＣＣＧで負荷されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰ、または被包された薬物なしの対照ＮＰのいずれかと共に最初に４時間インキュベートした。４時間後、１０ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）を４８時間にわたって添加して、線維化および過剰増殖的リモデリングを誘導した。ＴＧＦ－βの投与は、メサンギウム細胞増殖における顕著な増加をもたらすが、遊離ＣＣＧおよびＣＣＧで負荷されたＮＰとの事前インキュベーションは共に、この効果を有意に逆転させることができた（図３２）。また、線維症マーカーα－ＳＭＡおよびコラーゲンＩのウエスタンブロットおよび蛍光顕微鏡解析により、メサンギウム細胞の線維化促進性リモデリングの阻害に対する、ＣＣＧ（負荷されたＮＰ）の類似の効果が明らかになった。
合わせると、これらの結果により、２つの主要な成果が明らかになった：
１．遊離シナシグアトおよびＮＰで被包されたシナシグアトの両方が、その標的酵素ｓＧＣに対する有意な効果を示し、これは、記載された抗線維化経路の顕著な活性化をもたらす（図２９）。これらの結果は、ＣＣＧについての以前の知見と一致しており、抗線維化治療における治療剤の際立った可能性を示している。
２．全ての実験を通じて、シナシグアトで負荷されたＥＸＰｃＲＧＤ ＮＰは、被包されたＣＣＧの全体的な量が遊離薬物用量のたった１０％であっても（０．２μＭ 対 ２μＭ）、遊離ＣＣＧの投与と匹敵する効果を示した。これは、その意図した細胞内標的へと医薬剤をより効率的に送達する、記載されたＮＰの顕著な可能性を示している。
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本明細書、特許請求の範囲および／または添付の図面に開示された本発明の特色は、別々におよびそれらの任意の組合せでの両方で、その種々の形態で本発明を実現するための材料であり得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ナノ材料ならびに少なくとも第１のリガンドおよび第２のリガンドを含むナノ粒子であって、
－ 前記第１のリガンドが、標的細胞への前記ナノ粒子の付着を媒介することが可能であり、
－ 前記第２のリガンドが、前記標的細胞中への前記ナノ粒子の内在化を媒介することが可能であり、
－ 好ましくは、前記ナノ材料が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、オキサゾリン由来ポリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ＰＥＧ－脂質、ブロックコポリマー、例えば、ＰＥＧ－ＰＬＡまたはＰＥＧ－ポリ－カプロラクトン、無機物質、例えば、金またはｑｄｏｔ材料、およびそれらの組合せのいずれかを含む、
ナノ粒子。
（項目２）
前記第１のリガンドが、ＧＰＣＲ、例えば、アンジオテンシンＩＩ受容体１型（ＡＴ１ｒ）、ヒト神経ペプチドＹ１受容体およびＣ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型に結合する非アゴニスト性薬剤、ならびに／または標的細胞表面上の糖タンパク質および／もしくは糖脂質、例えば、ヘパラン硫酸、シアロ糖タンパク質、ガングリオシドおよびマンノース受容体に結合する薬剤であり、好ましくは、ＥＸＰ３１７４またはテルミサルタンである、項目１に記載のナノ粒子。
（項目３）
前記第２のリガンドが、ｉ）好ましくは、ＲＧＤ、配列番号１の配列を有する環状ＲＧＤ－ペプチド、およびそれらの誘導体から選択される、インテグリン、例えば、αＶβ３インテグリンまたはαＶβ５インテグリンに結合する薬剤、ｉｉ）ＧＰＣＲ、例えば、ＡＴ１ｒに結合するアゴニスト性薬剤、好ましくは、活性化されたアンジオテンシン－ＩＩ、ｉｉｉ）エクト酵素、例えば、レグマイン、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼおよびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に結合する薬剤、好ましくは、アンジオテンシン－Ｉ、ならびに／またはｉｖ）トランスフェリン受容体に結合する薬剤、のいずれかである、項目１または２に記載のナノ粒子。
（項目４）
治療剤、好ましくは、ピルフェニドンおよびシナシグアトのいずれかをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目５）
前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドが各々、前記ナノ材料にカップリングされ、好ましくは、各々が前記ナノ材料のブロックコポリマー鎖にカップリングされる、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目６）
前記ナノ材料が、１つよりも多くのブロックコポリマー鎖を含み、前記第１のリガンドが、前記ナノ材料の第１のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第２のリガンドが、前記ナノ材料の第２のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第１のブロックコポリマー鎖が、前記第２のブロックコポリマー鎖よりも長く、好ましくは、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも１．５倍の長さであり、より好ましくは、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも３倍の長さである、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目７）
前記第１のブロックコポリマー鎖が、１ｋ～２０ｋ、好ましくは１ｋ～１０ｋの範囲のＰＥＧを含み、および／または５ｋ～４０ｋ、好ましくは１０ｋ～２０ｋの範囲のＰＬＡを含み、必要に応じて、前記第１のブロックコポリマー鎖がＰＥＧ ５ｋ －ＰＬＡ １０ｋ であり、前記第２のブロックコポリマー鎖がＰＥＧ ２ｋ －ＰＬＡ １０ｋ である、項目６に
記載のナノ粒子。
（項目８）
前記第２のリガンドが、前記標的細胞中への前記ナノ粒子の前記内在化の前に酵素的に活性化される、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目９）
前記標的細胞が、メサンギウム細胞、内皮細胞、例えば網膜内皮細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞および腫瘍細胞から選択される、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１０）
５ｎｍ～１０００ｎｍの、好ましくは、１０ｎｍ～１５０ｎｍの、より好ましくは、２０ｎｍ～１００ｎｍのサイズを有する、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１１）
前記第１のリガンドの前記第２のリガンドに対する比が、２：１～１：２の範囲であり、好ましくは１：１である、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１２）
１ｐＭ～１００ｎＭ、好ましくは５０ｐＭ～１ｎＭの、標的化された受容体に対する粒子アビディティを有する、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１３）
前記ナノ材料が、ＰＥＧを含み、前記ナノ粒子が、少なくとも５％の、好ましくは、少なくとも１５％の、より好ましくは、少なくとも２５％のリガンド／ＰＥＧのリガンド密度を有する、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１４）
医薬または診断剤としての使用のための、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１５）
糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体ＶＥＧＦ Ａ調節不全、内皮ＶＥＧＦ Ａ調節不全、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、および乳がんなどのがんから選択される疾患を予防または処置する方法における使用のための、前述の項目のいずれかに記載のナノ粒子。
（項目１６）
項目１から１３のいずれかに記載のナノ粒子を調製する方法であって、
ａ）好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、オキサゾリン由来ポリマー、ポリ（アミノ酸）、多糖、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ＰＥＧ－脂質、ブロックコポリマー、例えば、ＰＥＧ－ＰＬＡまたはＰＥＧ－ポリ－カプロラクトン、無機物質、例えば、金またはｑｄｏｔ材料、およびそれらの組合せのいずれかを含む１種または数種のナノ材料、ならびに必要に応じて治療剤を、任意の順序で提供するステップ；
ｂ）必要に応じて、前記１種または数種のナノ材料のいずれかから、ブロックコポリマーを調製するステップ；
ｃ）好ましくは、ＤＣＣ／ＮＨＳカップリングまたはＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによって、１つまたは複数のステップにおいて、第１のリガンドおよび第２のリガンドを前記ナノ材料にカップリングさせるステップ；
ｄ）ステップａ）において既に提供されていない場合に、治療剤、好ましくは親油性治療剤を提供するステップ；
ｅ）好ましくはナノ沈殿によって、前記ナノ材料にカップリングされた前記リガンドと前記治療剤とを使用して、ナノ粒子を調製するおよび得るステップ
を含む、方法。
（項目１７）
ステップｅ）における前記得るステップが、０．０１～０．５の、好ましくは、０．０１～０．３の、より好ましくは、０．０１～０．１の多分散性指数を有するナノ粒子を得ることを含む、項目１６に記載の方法。

Claims (28)

  1. ナノ材料ならびに少なくとも第１のリガンドおよび第２のリガンドを含むナノ粒子であって、
    － 前記第１のリガンドが、メサンギウム細胞への前記ナノ粒子の付着を媒介することが可能であり、前記第1のリガンドがＥＸＰ３１７４であり、
    － 前記第２のリガンドが、前記メサンギウム細胞中への前記ナノ粒子の内在化を媒介することが可能であり、前記第２のリガンドが、配列番号１の配列を有する環状ＲＧＤ－ペプチドまたはアンジオテンシン－Ｉであり、
    前記ナノ材料が、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびブロックコポリマーを含み、前記ブロックコポリマーが、ＰＥＧ－ＰＬＡであり、
    前記ナノ材料が、１つよりも多くのブロックコポリマー鎖を含み、前記第１のリガンドが、前記ナノ材料の第１のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第２のリガンドが、前記ナノ材料の第２のブロックコポリマー鎖にカップリングされ、前記第２のリガンドが、配列番号１の配列を有する前記環状ＲＧＤ－ペプチドである場合、前記第１のブロックコポリマー鎖が、前記第２のブロックコポリマー鎖よりも長い、
    ナノ粒子。
  2. 前記第２のリガンドが、アンジオテンシン－Ｉであり、前記アンジオテンシン－Ｉが、前記メサンギウム細胞中への前記ナノ粒子の前記内在化の前に酵素的に活性化され、前記酵素的な活性化が、アンジオテンシン－Ｉのアンジオテンシン－ＩＩへの変換を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. 治療剤をさらに含む、請求項１～２のいずれかに記載のナノ粒子。
  4. 前記治療剤が、ピルフェニドンおよびシナシグアトのいずれかである、請求項３に記載のナノ粒子。
  5. 前記第１のブロックコポリマー鎖が、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも１．５倍の長さである、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  6. 前記第１のブロックコポリマー鎖が、前記第２のブロックコポリマー鎖の少なくとも３倍の長さである、請求項１～５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  7. 前記第１のブロックコポリマー鎖が、１ｋ～２０ｋの範囲のＰＥＧを含み、および／または５ｋ～４０ｋの範囲のＰＬＡを含む、請求項１～６のいずれかに記載のナノ粒子。
  8. 前記第１のブロックコポリマー鎖が、１ｋ～１０ｋの範囲のＰＥＧを含む、および／または１０ｋ～２０ｋの範囲のＰＬＡを含む、請求項７に記載のナノ粒子。
  9. 前記第１のブロックコポリマー鎖がＰＥＧ５ｋ－ＰＬＡ１０ｋであり、前記第２のブロックコポリマー鎖がＰＥＧ２ｋ－ＰＬＡ１０ｋである、請求項７または８に記載のナノ粒子。
  10. ５ｎｍ～１０００ｎｍのサイズを有する、請求項１～９のいずれかに記載のナノ粒子。
  11. １０ｎｍ～１５０ｎｍのサイズを有する、請求項１０に記載のナノ粒子。
  12. ２０ｎｍ～１００ｎｍのサイズを有する、請求項１１に記載のナノ粒子。
  13. 前記第１のリガンドの前記第２のリガンドに対する比が、２：１～１：２の範囲である、請求項１～１２のいずれかに記載のナノ粒子。
  14. 前記第１のリガンドの前記第２のリガンドに対する比が、１：１である、請求項１３に記載のナノ粒子。
  15. １ｐＭ～１００ｎＭの標的化された受容体に対する粒子アビディティを有する、請求項１～１４のいずれかに記載のナノ粒子。
  16. ５０ｐＭ～１ｎＭの標的化された受容体に対する粒子アビディティを有する、請求項１５に記載のナノ粒子。
  17. 前記ナノ粒子が、少なくとも５％のリガンド／ＰＥＧのリガンド密度を有する、請求項１～１６のいずれかに記載のナノ粒子。
  18. 前記ナノ粒子が、少なくとも１５％のリガンド／ＰＥＧのリガンド密度を有する、請求項１７に記載のナノ粒子。
  19. 前記ナノ粒子が、少なくとも２５％のリガンド／ＰＥＧのリガンド密度を有する、請求項１８に記載のナノ粒子。
  20. 医薬または診断剤としての使用のための、請求項１～１９のいずれかに記載のナノ粒子。
  21. 糖尿病性腎症、糸球体腎炎、糸球体ＶＥＧＦ Ａ調節不全、内皮ＶＥＧＦ Ａ調節不全、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、およびがんから選択される疾患を予防または処置する方法における使用のための、請求項１～１９のいずれかに記載のナノ粒子。
  22. 前記がんが乳がんである、請求項２１に記載のナノ粒子。
  23. 請求項１から１９のいずれかに記載のナノ粒子を調製する方法であって、
    ａ）１種または数種のナノ材料を任意の順序で提供するステップ；
    ｃ）１つまたは複数のステップにおいて、第１のリガンドおよび第２のリガンドを前記ナノ材料にカップリングさせるステップ；
    ｄ）ステップａ）において既に提供されていない場合に、治療剤を提供するステップ；
    ｅ）前記ナノ材料にカップリングされた前記リガンドと前記治療剤とを使用して、ナノ粒子を調製するおよび得るステップ
    を含み、
    前記第１のリガンドが、ＥＸＰ３１７４であり、
    前記第２のリガンドが、配列番号１の配列を有する環状ＲＧＤ－ペプチドまたはアンジオテンシン－Ｉであり、
    ステップａ）の前記ナノ材料が、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびブロックコポリマーを含み、前記ブロックコポリマーが、ＰＥＧ－ＰＬＡである、方法。
  24. ステップａ）において、前記１種または数種のナノ材料に加えて、治療剤が提供される、請求項２３に記載の方法。
  25. ステップｃ）のカップリングが、ＤＣＣ／ＮＨＳカップリングまたはＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによるものであり、ならびに／あるいはステップａ）またはステップｄ）において提供される前記治療剤が、親油性治療剤である、ならびに／あるいはステップｅ）における調製するおよび得るステップが、ナノ沈殿による、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. ステップｅ）における前記得るステップが、０．０１～０．５の多分散性指数を有するナノ粒子を得ることを含む、請求項２３～２５のいずれかに記載の方法。
  27. ステップｅ）における前記得るステップが、０．０１～０．３の多分散性指数を有するナノ粒子を得ることを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. ステップｅ）における前記得るステップが、０．０１～０．１の多分散性指数を有するナノ粒子を得ることを含む、請求項２７に記載の方法。
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