CN114828896A - 病毒模拟纳米颗粒 - Google Patents

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S·马尔桑卡菲格罗
D·弗莱斯曼
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Abstract

本发明涉及一种纳米颗粒，其包含纳米材料和栓系于所述纳米颗粒的至少第一配体和第二配体。本发明还涉及用作药物或诊断剂的纳米颗粒。本发明还涉及用于预防或治疗选自糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾小球VEGF A失调、内皮VEGF A失调、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性和癌症(例如乳腺癌)的疾病的方法中的纳米颗粒。此外，本发明涉及一种制备纳米颗粒的方法。

Description

病毒模拟纳米颗粒
技术领域
本发明涉及包含纳米材料和至少第一配体和第二配体的纳米颗粒。本发明还涉及用作药物或诊断剂的纳米颗粒。本发明还涉及用于预防或治疗选自糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾小球VEGF A失调、内皮VEGF A失调、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性和癌症(例如乳腺癌)的疾病的方法中的纳米颗粒。此外，本发明涉及一种制备纳米颗粒的方法。
背景技术
近年来，已经开发出无数的纳米材料作为药物治疗或诊断的载体。为了使它们能够在体内以足够的特异性识别靶细胞，与细胞受体结合的配体已被束缚在它们的表面。然而，简单地遵循这种旧范式增加了纳米材料的亲和力，但结果证明不足以进行明确的细胞识别。目前，即使具有用于异多价结合的多个不同配体的纳米材料也不能区分不同的细胞类型。
相比之下，病毒是具有最终靶细胞特异性的纳米颗粒(NP)。与合成生物医学纳米材料相比，病毒利用连续的多步识别过程进行细胞识别。由于当前许多基于纳米颗粒的方法缺乏足够的特异性，因此利用病毒靶向策略可能是克服这一限制的可行选择。因此，用纳米材料模拟病毒(例如甲型流感病毒)的顺序识别策略可能允许特异性靶向细胞。特别是，病毒靶细胞识别在体内可能是有利的，其中颗粒由于蛋白质吸附而受到表面修饰。
尤其是病毒附着在细胞膜上的初始步骤(其不会导致颗粒吸收，但会增加细胞表面的病毒颗粒密度)在目前的纳米颗粒设计策略中是缺失的。发现这种对糖脂和糖蛋白或特定受体的初始粘附对于病毒感染性至关重要。更重要的是，如果颗粒一旦到达靶组织就被清除，它们就不足以用于药物递送目的。在系膜的情况下，早期报告显示直径为70±25nm或更小的小颗粒正在穿透直径约80-100nm的肾小球内皮窗孔(endothelialfenestration)。然而，这些颗粒已被系膜清除。如果纳米颗粒被靶组织中的靶细胞内化，则可以克服已知纳米颗粒常被从组织中快速清除的问题。
Maslanka Figueroa等[1]涉及包含为血管紧张素-I的配体的聚合物纳米颗粒。
Sah等[2]涉及包含嵌段共聚物和药物的纳米颗粒。
发明内容
本发明旨在提供配备用于在体外和体内寻址细胞的病毒模拟细胞识别机制的纳米材料。此外，本发明的一个目的是提供允许所述纳米颗粒在体内靶组织中有效积累的纳米颗粒。本发明的另一个目的是提供一种允许将药物或诊断剂递送至靶组织的药物递送系统。
下面将描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，然而，应该理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持和涵盖将两个或更多个明确描述的实施方案组合或将一个或多个明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选元素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的元素的任何排列和组合都应该被认为由本申请的描述所公开。
在第一方面，本发明涉及一种纳米颗粒，其包含纳米材料和至少第一配体和第二配体，
-其中所述第一配体能够介导所述纳米颗粒附着于靶细胞，并且
-其中所述第二配体能够介导所述纳米颗粒内化到所述靶细胞中，并且
-其中，优选地，所述纳米材料包含以下中的任意：聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、恶唑啉衍生聚合物、聚(氨基酸)、多糖、磷脂、鞘脂、胆固醇、PEG-脂质、嵌段共聚物如PEG-PLA或PEG-聚己内酯、无机物质如金或量子点材料，及其组合。
在一个实施方案中，所述第一配体是与GPCR(例如血管紧张素II受体1型(AT1r)、人神经肽Y1受体和C-X-C趋化因子受体4型结合的非激动剂，和/或与靶细胞表面上的糖蛋白和/或糖脂例如硫酸乙酰肝素、唾液酸糖蛋白、神经节苷脂和甘露糖受体结合的试剂，优选为EXP3174或替米沙坦。
在一个实施方案中，所述第二配体是以下中的任意：i)与整合素例如αVβ3整合素或αVβ5整合素结合的试剂，优选选自RGD、具有SEQ ID NO.1的序列的环状RGD肽及其衍生物，ii)与GPCR例如AT1r结合的激动剂，优选活化的血管紧张素-II，iii)与胞外酶例如天冬氨酸内肽酶(legumain)、膜型基质金属蛋白酶和血管紧张素转化酶(ACE)结合的试剂，优选血管紧张素-I，和/或iv)与转铁蛋白受体结合的试剂。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒还包含治疗剂，优选吡非尼酮(pirfenidone)和西那西呱(cinaciguat)中的任意。
在一个实施方案中，所述第一配体和所述第二配体各自与所述纳米材料偶联，优选各自与所述纳米材料的嵌段共聚物链偶联。
在一个实施方案中，所述纳米材料包含多于一个嵌段共聚物链，并且其中所述第一配体与所述纳米材料的第一嵌段共聚物链偶联并且所述第二配体与所述纳米材料的第二嵌段共聚物链偶联，并且其中所述第一嵌段共聚物链比所述第二嵌段共聚物链长，优选比所述第二嵌段共聚物链长至少1.5倍，更优选比所述第二嵌段共聚物链长至少3倍。
在一个实施方案中，所述第一嵌段共聚物链包含1k至20k、优选1k至10k范围内的PEG，和/或包含5k至40k、优选10k至20k范围内的PLA，任选地所述第一嵌段共聚物链是PEG5k-PLA10k并且所述第二嵌段共聚物链是PEG2k-PLA10k。
在一个实施方案中，所述第二配体在所述纳米颗粒内化到所述靶细胞中之前被酶促活化。
在一个实施方案中，所述靶细胞选自系膜细胞、内皮细胞如视网膜内皮细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞和肿瘤细胞。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒具有5nm至1000nm、优选10nm至150nm、更优选20nm至100nm的尺寸。
在一个实施方案中，所述第一配体与所述第二配体的比率在2:1至1:2的范围内，优选为1:1。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒对靶向受体的颗粒亲和力为1pM至100nM，优选50pM至1nM。
在一个实施方案中，所述纳米材料包含PEG，并且其中所述颗粒具有至少5％、优选至少15％、更优选至少25％的配体/PEG的配体密度。
在另一方面，本发明涉及如以上任何实施方案中所定义的纳米颗粒，其用作药物或诊断剂。
在另一方面，本发明涉及如以上任何实施方案中所定义的纳米颗粒，其用于预防或治疗选自糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾小球VEGF A失调、内皮VEGF A失调、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性和癌症如乳腺癌的疾病的方法。
在另一方面，本发明涉及一种制备纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
a)以任何顺序提供一种或多种纳米材料，其优选包含以下任意：聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、恶唑啉衍生聚合物、聚(氨基酸)、多糖、磷脂、鞘脂、胆固醇、PEG-脂质、嵌段共聚物如PEG-PLA或PEG-聚己内酯、无机物质如金或量子点材料，及其组合，以及任选的治疗剂；
b)任选地，由所述一种或多种纳米材料中的任意制备嵌段共聚物；
c)在一个或多个步骤中使第一配体和第二配体与其偶联，优选通过DCC/NHS-或EDC/NHS-偶联；
d)提供治疗剂，优选亲脂性治疗剂，如果在步骤a)中未提供的话；
e)使用与所述纳米材料偶联的配体和所述治疗剂制备和获得纳米颗粒，优选通过纳米沉淀。
在一个实施方案中，步骤e)中的所述获得包括获得多分散指数为0.01至0.5、优选0.01至0.3、更优选0.01至0.1的纳米颗粒。
在这方面，所述纳米颗粒、所述纳米材料、所述治疗剂、所述嵌段共聚物、所述第一配体和所述第二配体如上所定义。
在另一方面，本发明涉及包含如上定义的纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及预防或治疗疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的患者施用有效量的纳米颗粒和/或药物组合物。
在这方面，所述疾病、所述纳米颗粒、所述药物组合物如上所定义。
在另一方面，本发明涉及纳米颗粒在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在这方面，所述纳米颗粒和所述疾病如上文所定义。
在另一方面，本发明涉及纳米颗粒在制备用于疾病诊断和/或预后的诊断剂中的用途。
在这方面，所述纳米颗粒和所述疾病如上文所定义。
具体描述
由于不利的物理化学性质，在目标组织中利用度差是药物失败的常见原因。病毒通过将其核酸嵌入纳米级颗粒中并使它们对其靶细胞具有高度特异性来克服这一限制。虽然纳米技术已经提供了大量用于药物运输的纳米载体，但它们明确识别目标细胞的能力保持中等。本发明人在本文中表明，与常规纳米颗粒相比，具有通过三次连续检查细胞身份来识别细胞的病毒样能力的颗粒具有在体内识别系膜细胞的优越能力。在小鼠中，这导致肾系膜中的积累增加15倍，然后是大量细胞摄取。本发明提供了一种用于将药物输送到靶组织中的令人惊讶的有效工具，并且该工具适用于治疗多种疾病，例如目前尚无药物疗法的糖尿病肾病。
本发明人设计了在NP冠中携带例如EXP3174(血管紧张素-II 1型受体(AT1R)配体)以介导受体附着的颗粒(图1A)。作为G蛋白偶联受体(GPCR)拮抗剂，它的最大优势是结合不会触发细胞NP摄取，而只会触发膜结合，从而防止仅携带AT1R的脱靶细胞摄取颗粒。
对于第二个识别标准，本发明人为颗粒配备了探测细胞表面靶标例如血管紧张素转化酶(ACE)的存在的能力，该酶识别颗粒冠中的前配体血管紧张素-I(Ang-I)并将其转化为活性配体血管紧张素-II(Ang-II)。
作为第三个识别步骤，配体(例如Ang-II)与靶标(例如AT1R)结合，并且作为激动剂，在受体结合后触发颗粒的细胞摄取。靶细胞识别的整个过程可以最好用流程图(图1B)来说明。在体外检查颗粒的靶受体亲和力和靶细胞特异性。此外，还评估了同时呈递针对同一受体的两种配体(促进细胞膜结合的拮抗剂和支持细胞内化的激动剂)如何影响NP介导细胞摄取的能力。最后，本发明人表明，具有这种病毒模拟三重识别策略的颗粒在体内到达系膜细胞方面优于常规NP。
由于NP通常通过被动运输机制分布在生物体中，因此它们在特定组织中的出现取决于它们的物理化学性质。然而，如果它们能够主动与目标细胞相互作用，则可以增加在目标组织中积累的颗粒的比例。为NP配备与各自受体结合的配体以确认细胞的身份是不够的。本发明的颗粒清楚地表明，逐步识别细胞的策略，特别是包含用于介导附着至靶细胞的第一配体和用于介导纳米颗粒内化到靶细胞中的第二配体的策略是更有利的。
使用病毒作为模板，本发明人设计了能够执行一系列“如果-则-否则(if-then-else)”决策的NP，这些决策一个接一个地做出。在每个单独的步骤中，NP在配体或底物的帮助下分别探测细胞是否存在受体或胞外酶。如果成功，则进行下一个识别步骤，如果不成功(否则)，则颗粒“决定”该细胞不能成为靶细胞。像病毒一样，这有助于避免“错误”细胞类型摄取NP。
例如，属于GPCR家族的受体，例如AT1R，被用于决策颗粒。在用配体(例如GPCR拮抗剂，例如利用EXP3174或替米沙坦)检测细胞身份的情况下，这种相互作用的阳性结果(则)是颗粒与细胞表面结合并停留在那里。如果下一相互作用不是阳性的(否则)，很明显，颗粒有在脱靶细胞上搁浅的风险。然而，在这种情况下，由于游离颗粒和结合颗粒之间的热力学平衡，如可以预期的，体内游离颗粒的浓度随着时间的降低会改变这种平衡，使得颗粒会随着时间从“错误”的靶标上解离。相反，如果使用相同GPCR的激动剂检测细胞身份，例如使用Ang-II，则细胞的阳性答案(则)是颗粒内化。因此，通过仔细选择相互作用的靶标和配体的类型，可以为颗粒配备逻辑，该逻辑可以允许识别比本研究中研究的示例性靶标更多的隐藏靶细胞。一个实例是视网膜组织中的局部眼部应用，其中颗粒能够区分存在的超过60种细胞类型，例如通过特异性靶向内皮细胞。
如本文所用，术语“纳米颗粒”和“NP”涉及包含第一配体和第二配体的纳米材料结构。特别地，纳米颗粒是具有纳米级别的所有三个外部维度的纳米物体，例如脂质体、聚合物纳米颗粒、胶束、脂质纳米囊、脂质体、无机纳米颗粒如金纳米颗粒或量子点(Qdot)。在一个实施方案中，纳米颗粒提供了优异的生物相容性和高度可调的组合物。纳米颗粒可以由多种材料制成，例如聚合物、生物分子和金属。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒是一种病毒模拟纳米颗粒，其能够将药物运输到靶组织中，例如肾系膜中。在一个实施方案中，纳米颗粒包含吡非尼酮和/或西那西呱并且用于治疗糖尿病肾病。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒包含可生物降解的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含PEG和PLA。在一个实施方案中，第一和第二配体通过DCC/NHS或EDC/NHS共价偶联至纳米颗粒。在一个实施方案中，将所述嵌段共聚物溶解在乙腈中并与PLGA(70/30，m/m)混合以获得聚合物混合物。在一个实施方案中，通过将聚合物混合物逐滴注入水相中，使用纳米沉淀制备纳米颗粒。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒在施用所述纳米颗粒后非常短的时间内(即<1小时)积累在靶组织例如肾组织中。
在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒非常小，即<80nm，并且由于它们的小尺寸，能够通过有孔的内皮快速离开血流并在靶组织例如系膜组织中积累。在一个实施方案中，所述纳米颗粒还包含治疗剂，优选吡非尼酮和西那西呱中的任意。在一个实施方案中，所述颗粒的尺寸为5nm至1000nm，优选10nm至150nm，更优选20nm至100nm。在一种实施方案中，使用动态光散射、颗粒散射扩散法、纳米颗粒跟踪分析、原子力显微镜或透射电子显微镜，优选动态光散射或透射电子显微镜来测量粒度。颗粒的尺寸由其直径决定，直径与穿过球形颗粒中心且端点位于球形颗粒上的任何直线段有关。在非球形颗粒的情况下，直径涉及穿过所述非球形颗粒的中心并且端点位于颗粒上的最长线段。在一个实施方案中，平均直径涉及包含在一批纳米颗粒中的纳米颗粒的平均直径。在一个实施方案中，本发明的颗粒具有0.01至0.5、优选0.01至0.3、更优选0.01至0.1的多分散指数。在一个实施方案中，多分散指数使用动态光散射、颗粒散射扩散法、纳米颗粒跟踪分析、原子力显微镜或透射电子显微镜，优选动态光散射或透射电子显微镜来测量。在一个实施方案中，术语“纳米颗粒”和“颗粒”可互换使用。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒用于医学。在一个实施方案中，纳米颗粒具有正、负或中性的
Figure BDA0003680978190000051
-电势，例如-20mV至0mV，或-15mV至-5mV。在一个实施方案中，纳米颗粒包含至少一个含有纳米材料的核和任选地在其表面上的聚合物和/或接头，其中所述第一配体和第二配体与所述聚合物和/或接头偶联。在一个实施方案中，颗粒具有聚合物核。
如本文所用，术语“病毒模拟”涉及模拟病毒的细胞靶向方法的方法。本发明的病毒模拟颗粒通过具有至少两个连续步骤的识别过程被靶细胞内化。在这样的两步过程中，第一步是颗粒上的第一配体(例如EXP3174或替米沙坦)与靶细胞上表达的靶标(例如系膜细胞上的血管紧张素受体)结合。随后，颗粒被内化到靶细胞中，这由与靶细胞上的靶标结合的第二配体介导，例如活化的血管紧张素II或环状氨基酸序列(环Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys；SEQ ID No.1)，从而引发颗粒的内吞。在一个实施方案中，第一和第二配体的顺序呈递通过以下方式实现：i)与用于第二配体的较短的接头例如较短的PEG-PLA相比，通过用于第一配体的较长的接头例如较长的PEG-PLA链介导的空间控制，和/或通过ii)活化步骤，其中第二配体必须活化以能够介导内化，例如血管紧张素I向血管紧张素II的转化。在一个实施方案中，与没有配体修饰的常规颗粒相比，配体的顺序呈递允许纳米颗粒在靶细胞例如系膜细胞中的高15倍的积累。在一个实施方案中，所述颗粒对靶向受体的颗粒亲和力为1pM至100nM，优选50pM至1nM。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒用作药物或诊断剂。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒用于预防或治疗选自糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾小球VEGFA失调、内皮VEGF A失调、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性和癌症(例如乳腺癌)的疾病的方法。在一个实施方案中，术语“纳米颗粒”、“病毒模拟颗粒”和“决策纳米颗粒”可互换使用。
如本文所用，术语“纳米材料”涉及具有纳米级的任何外部尺寸或具有纳米级的内部结构或表面结构的材料。在一个实施方案中，所述纳米材料优选包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、恶唑啉衍生聚合物、聚(氨基酸)、多糖、磷脂、鞘脂、胆固醇、PEG-脂质如DPSE-PEG和酸性硬脂PEG、嵌段共聚物如PEG-PLA或PEG-聚己内酯、无机物如金或量子点材料，及其组合。在一个实施方案中，所述第一配体和所述第二配体各自与所述纳米材料偶联，优选各自与所述纳米材料的嵌段共聚物链偶联。在一个实施方案中，所述纳米材料包含多于一个嵌段共聚物链，并且所述第一配体与所述纳米材料的第一嵌段共聚物链偶联并且所述第二配体与所述纳米材料的第二嵌段共聚物链偶联，并且所述第一嵌段共聚物链比所述第二嵌段共聚物链长，优选比所述第二嵌段共聚物链长至少1.5倍，更优选比所述第二嵌段共聚物链长至少3倍。在一个实施方案中，所述第一嵌段共聚物链包含1k至20k、优选1k至10k范围内的PEG，和/或包含5k至40k、优选10k至20k范围内的PLA。在一个实施方案中，所述第一嵌段共聚物链的PEG链比所述第二嵌段共聚物链的PEG链长。在一个实施方案中，一种配体与一种PEG分子偶联。如本文在聚合物链(例如嵌段共聚物链、PEG和/或PLA)的上下文中使用的，术语“k”是指千道尔顿(kDa)。例如，1k至20k范围内的PEG涉及1kDa至20kDa范围内的PEG，例如PEG5kDa。在一个实施方案中，PEG5k-PLA10k和PEG2k-PLA10k分别涉及PEG5kDa-PLA10kDa和PEG2kDa-PLA10kDa。在一个实施方案中，所述第一嵌段共聚物链是PEG5k-PLA10k并且所述第二嵌段共聚物链是PEG2k-PLA10k。在一个实施方案中，所述纳米材料包含PEG的总量(PEG总)，并且所述颗粒具有至少5％、优选至少15％、更优选至少25％的配体/PEG总的配体密度，其中术语“配体”包括第一配体和第二配体二者。在一种实施方式中，配体/PEG的配体密度≤50％。
如本文所用，术语“第一配体”涉及能够介导纳米颗粒附着至靶细胞的配体。在一个实施方案中，第一配体仅引发颗粒与靶细胞的结合，而不引发颗粒内化到靶细胞中，并且需要第二配体随后与靶细胞结合以引发所述颗粒内化到所述靶细胞。在一个实施方案中，第一配体与纳米颗粒共价或非共价偶联。在一个实施方案中，第一配体是触发纳米颗粒与靶细胞结合的任何生物分子，例如抗体或其抗原结合片段、肽、适体、DNA纳米结构、受体配体和受体。在一个实施方案中，所述第一配体是与GPCR例如血管紧张素II受体1型(AT1r)、人神经肽Y1受体和C-X-C趋化因子受体4型结合的非激动剂，和/或与靶细胞表面上的糖蛋白和/或糖脂例如硫酸乙酰肝素、唾液酸糖蛋白、神经节苷脂和甘露糖受体结合的试剂，优选为EXP3174或替米沙坦。在一个实施方案中，与GPCR结合的非激动剂触发颗粒与靶细胞的结合，但不触发颗粒内化(例如内吞)到靶细胞中。在一个实施方案中，第一配体和/或第二配体与不普遍表达但主要在靶组织中的靶细胞上表达的靶标结合。在一个实施方案中，第一配体和/或第二配体以亲和力KD<100nM与靶细胞上的靶结构结合。在一个实施方案中，第一配体和/或第二配体具有≤1500Da的分子量。在一个实施方案中，术语“靶标”和“靶结构”可互换使用。在一个实施方案中，术语“靶结构”涉及存在于靶细胞表面上的蛋白质、肽、核酸、糖类、糖脂和/或糖蛋白。在一个实施方案中，第一配体是具有用于官能化的游离羧酸残基的任何AT1R拮抗剂。在一个实施方案中，第一配体是选择性AT1拮抗剂，例如EXP3174(氯沙坦羧酸)或替米沙坦，它们是有效且选择性的AT1拮抗剂，或任选地其生物活性衍生物。在一个实施方案中，“生物活性衍生物”分别具有与EXP3174或替米沙坦相同的生物学功能，例如相同的结合功能和/或治疗功能。
如本文所用，术语“非激动剂”涉及与靶结构结合的试剂，该试剂对所述靶结构不具有激动作用，优选其在所述靶结构上介导内化到靶细胞中不具有作用。
如本文所用，术语“第二配体”涉及能够介导纳米颗粒内化到靶细胞中的配体。在一个实施方案中，第二配体与靶细胞上的靶结构(例如受体)的结合引发纳米颗粒内化到靶细胞中。在一个实施方案中，靶细胞上的靶结构是通常在靶细胞表面上表达的任何结构，例如表面分子、受体和/或生物标志物。在一个实施方案中，靶细胞上的靶结构是与健康细胞相比通常在处于病理状态的细胞中过表达的分子。在一个实施方案中，第一配体和第二配体靶向靶细胞上的相同靶结构或靶向靶细胞上的不同靶结构。在一个实施方案中，第二配体与纳米颗粒共价或非共价偶联。在一个实施方案中，第二配体是触发纳米颗粒内化到靶细胞中的任何生物分子，例如抗体或其抗原结合片段、肽、适体、DNA纳米结构、受体配体和受体。在一个实施方案中，所述第二配体是以下中的任意：i)与整合素例如αVβ3整合素结合的试剂，优选选自RGD、具有SEQ ID NO.1的序列的环状RGD-肽及其衍生物，ii)与GPCR例如AT1r结合的激动剂，优选活化的血管紧张素-II，iii)与胞外酶例如天冬氨酸内肽酶、膜型基质金属蛋白酶和血管紧张素转化酶(ACE)结合的试剂，优选血管紧张素-I，和/或iv)与转铁蛋白受体结合的试剂。在一个实施方案中，所述第二配体在所述纳米颗粒的所述内化到所述靶细胞中之前被酶促活化，例如在所述第二配体与AT1r结合和所述颗粒内化到所述靶细胞中之前，血管紧张素-I被ACE活化为血管紧张素-II。在一个实施方案中，第二配体的酶促活化由靶细胞表面上的胞外酶进行，其中优选地，所述酶促活化包括所述第二配体的酶促切割，从而提供活化的第二配体。在另一个实施方案中，所述第二配体在介导内化之前没有被酶促活化。在一个实施方案中，所述第一配体与所述第二配体的比例在2:1至1:2的范围内，优选为1:1。在一个实施方案中，在所述第一配体与所述靶细胞结合之后，所述第二配体与所述靶细胞结合。在一个实施方案中，所述第一配体和所述第二配体与所述靶细胞的顺序结合增加了对所述靶细胞的特异性。
在一个实施方案中，如果第二配体靶向AT1r，则第二配体为血管紧张素-I优于第二配体为血管紧张素-II，因为将血管紧张素-I酶促活化为血管紧张素-II的中间步骤允许增加纳米颗粒的特异性。在一个实施方案中，如果第一配体是EXP3174并且第二配体是血管紧张素-II或待被活化为血管紧张素-II的血管紧张素-I，则第一配体和第二配体两者结合靶细胞上的相同靶结构，即AT1R。在该实施方案中，为EXP3174的第一配体作为拮抗剂与AT1R结合，并且为血管紧张素-II(任选地在酶促活化后)的第二配体作为激动剂与AT1R结合。在第一配体(例如EXP3174)结合后，仍有可用的AT1R结合位点用于第二配体。在一个实施方案中，靶标的由第一配体结合的靶的结合位点和第二配体结合的靶的结合位点是不同的结合位点或者是相同的结合位点但顺序地结合。
在一个实施方案中，第二配体被屏蔽而不与所述靶细胞结合：i)通过空间位阻，例如第二配体的嵌段共聚物链或接头比第一配体的嵌段共聚物链或接头短，和/或ii)通过在第二配体能够介导内化之前必须酶促活化第二配体。
如本文所用，术语“能够介导附着”涉及第一配体与靶细胞的结合能力。第一配体能够介导附着，即第一配体触发纳米颗粒与靶细胞的结合，优选通过靶向靶细胞上的靶结构。
在一个实施方案中，第一配体与靶细胞的所述结合不会触发纳米颗粒内化到靶细胞中。在一个实施方案中，为了将纳米颗粒内化到靶细胞中，需要进一步的相互作用，即第二配体与靶细胞的相互作用，优选地包括靶向靶细胞上的靶结构(与第一配体的靶结构相同或不同)的第二配体。在一个实施方案中，第一和第二配体可以结合相同的靶结构，但结合靶结构的不同位点，例如，激动剂结合位点和拮抗剂结合位点。
如本文所用，术语“能够介导内化”涉及第二配体触发纳米颗粒内化到靶细胞中的能力。在一个实施方案中，第二配体与靶细胞上的靶结构结合，从而引发纳米颗粒内化到靶细胞中。在一个实施方案中，所述触发内化的能力可以包括在触发内化之前被活化的能力，例如通过酶促活化。在一个实施方案中，所述内化涉及受体介导的内吞、网格蛋白有被小窝(clathrin-coated pits)和/或胞膜小窝(caveolae)中的任意。
如本文所用，术语“靶细胞”涉及参与病理状况(即疾病)的细胞。在一个实施方案中，疾病的治疗包括用本发明的纳米颗粒靶向所述疾病涉及的细胞。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒用作将药物运输至所述靶细胞的药物递送系统。在一个实施方案中，所述靶细胞选自系膜细胞、内皮细胞如视网膜内皮细胞和肿瘤细胞。
如本文所用，术语“治疗剂”涉及旨在用于医学治疗的任何物质。在一个实施方案中，治疗剂包含在纳米颗粒的颗粒主体(即核)中，例如在所述纳米颗粒的内部和/或整个颗粒纳米材料中，和/或使用接头与所述纳米颗粒偶联。在一个实施方案中，所述治疗剂是亲脂性治疗剂并且被颗粒主体包封和/或包含。在一个实施方案中，治疗剂与所述颗粒非共价或共价偶联，例如，通过可切割的接头。在一个实施方案中，所述治疗剂可以共价或非共价偶联至纳米颗粒的任何组分。在一个实施方案中，所述治疗剂是抗纤维化剂或化疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是吡非尼酮和西那西呱中的任意。如本文所用，术语“颗粒主体”涉及颗粒的主要支撑结构。例如，颗粒主体可以涉及脂质体的脂质双层或聚合物和/或实心脂质颗粒的核结构。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒装载有治疗剂，用于用治疗剂特异性治疗靶细胞，例如系膜细胞。在一个实施方案中，将待装载到颗粒中的治疗剂(例如吡非尼酮或西那西呱)溶解在聚合物相中，并在制备颗粒聚合物核的过程中掺入所述颗粒中，和/或溶解在颗粒包含的水相中，例如脂质体包含的水相中，和/或溶解在颗粒包含的脂质相中，例如脂质体包含的脂质相中。吡非尼酮是一种TGF-β拮抗剂，并且已被提议作为治疗系膜相关病理性纤维化的候选药物。西那西呱(BAY 58-2667)是一种可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)活化剂，并且已被提议用于治疗糖尿病肾病。在一个实施方案中，治疗剂吡非尼酮或西那西呱被有效地掺入纳米颗粒的聚合物核中，而不会显著改变颗粒的性质，由于治疗剂的亲脂性质，这是可能的。在一个实施方案中，所述纳米颗粒用于治疗糖尿病肾病并且所述治疗剂是抗纤维化剂。在一个实施方案中，所述纳米颗粒用于治疗癌症并且所述治疗剂是化疗剂。
本发明还涉及包含本发明的纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。本发明的纳米颗粒可以与合适的辅助物质和/或添加剂混合以获得药学上可接受的组合物。这样的物质包括增加纳米颗粒的稳定性、溶解度、生物相容性或生物半衰期的药理学上可接受的物质，或包括对于某些施用途径(例如静脉内溶液、喷雾剂、邦迪创可贴或丸剂)必须包括的物质。本发明还涉及包含本发明的纳米颗粒的组合物，其用于医学，例如用于预防或治疗选自糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾小球VEGF A失调、内皮VEGF A失调、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性和癌症如乳腺癌的疾病的方法。
本发明的纳米颗粒对诸如系膜细胞的靶细胞使用新的病毒模拟识别原理，这引起纳米颗粒在诸如系膜的靶组织中高效积累。在一个实施方案中，将纳米颗粒与合适的治疗剂组合，即治疗剂掺入纳米颗粒中和/或连接至纳米颗粒，这允许靶向治疗靶组织中的靶细胞，例如系膜中的系膜细胞。在一个实施方案中，包含治疗剂的纳米颗粒用于预防或治疗糖尿病肾病。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒允许使用具有至少两个步骤的识别过程靶向靶细胞。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒包含选择性AT1拮抗剂(例如EXP3174)作为第一配体，并且还包含治疗剂，优选吡非尼酮和/或西那西呱。在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒是EXPcRGD纳米颗粒，即包含EXP3174作为第一配体和cRGD(特别是cRGDfK)作为第二配体的纳米颗粒，或者纳米颗粒是EXPAng-I纳米颗粒，即包含EXP3174作为第一配体和Ang-I作为第二配体的纳米颗粒。在一个实施方案中，所述EXPcRGD纳米颗粒和/或EXPAng-I纳米颗粒还包含一种或多种治疗剂，优选吡非尼酮和/或西那西呱。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是包含选择性AT1拮抗剂(例如EXP3174)作为第一配体的纳米颗粒，优选EXPcRGD纳米颗粒，并且还包含治疗剂，其是西那西呱。在一个实施方案中，所述纳米颗粒包含纳米材料，该纳米材料包含PLGA和/或PEG-PLA或由其组成。
如本文所用，术语“施用”涉及药剂例如本发明的纳米颗粒和/或本发明的药物组合物的施用，其可以通过允许药剂到达靶细胞的任何方法来实现。这些方法包括，例如，注射、口服、吸入、鼻腔递送、局部施用、沉积、植入、栓剂，或其中获得通过纳米颗粒来接近靶细胞的任何其他施用方法。注射可涉及静脉内、皮内、皮下、肌肉内或腹膜内注射。植入可以包括插入包含本发明的纳米颗粒的可植入药物递送系统和/或可以涉及包含纳米颗粒的水凝胶，特别是皮下和/或腹膜内注射的原位凝胶化并且延迟释放纳米颗粒的水凝胶。栓剂包括甘油栓剂。吸入包括用吸入器中气溶胶施用纳米颗粒，单独或附着在可被吸收的载体上。纳米颗粒可以悬浮在液体中，例如以胶体形式。
“有效量”是减轻所发现的疾病和/或病症的症状的纳米颗粒或药物组合物的量。
如本文所用，术语“患者”涉及人或动物，优选哺乳动物。对患者的治疗意在包括例如预防、治疗、减轻疾病或病症的症状或治愈疾病或病症，例如癌症或糖尿病肾病。
如本文所用，术语“嵌段共聚物”涉及包含通过共价键连接的两个或更多个均聚物或共聚物亚单元的聚合物。可以包含中间非重复亚单元，其是连接嵌段。嵌段共聚物由不同聚合单体的嵌段组成。术语“嵌段共聚物链”涉及嵌段共聚物的链。
如本文所用，术语“DCC/NHS-偶联”和“EDC/NHS-偶联”涉及偶联反应。合成NHS活化分子的常用方法是将NHS与例如期望的羧酸和少量的有机碱在无水溶剂中混合。然后加入偶联剂如二环己基碳二亚胺(DCC)或乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)以形成高活性的活化中间体。在一个实施方案中，第一配体和第二配体在至少两个步骤中与所述纳米材料偶联。在一个实施方案中，第一配体和第二配体通过接头、通过融合蛋白和/或通过PEG与所述纳米材料偶联。
本发明人在本文中成功地表明，双重/三重检查细胞身份的病毒模拟NP允许体内靶向MC中增强的NP积累。通过将模拟病毒的初始细胞附着的拮抗配体与介导靶细胞识别过程的酶组合，这些颗粒具有非常高的体外靶亲和力以及出色的靶细胞特异性。本发明人还证明，相同GPCR的颗粒束缚的激动剂和拮抗剂的同时异多价结合出乎意料地导致颗粒摄取。总体而言，非特异性尺寸介导的被动靶向不足以在MC中实现令人满意的颗粒积累。即使是使用单个配体的传统颗粒官能化似乎也是不足的方法。然而，通过模拟复杂的多步骤病毒靶细胞结合和识别过程，本发明人获得了能够在MC中识别和积累的颗粒。这为治疗包括肾脏疾病在内的多种疾病的药物递送开辟了新的选择。
本发明人进一步制造了腺病毒模拟嵌段共聚物纳米颗粒，其由于空间控制的顺序配体-受体相互作用而有效靶向肾小球系膜细胞。因此，异多价NP不仅表现出精确可调的物理化学特性，而且对两种靶基序都表现出优异的亲和力，与未官能化的NP相比，导致在皮摩尔范围内的大量AT1r结合和显著增加的系膜细胞摄取。利用这些特征，病毒模拟NP可以选择性地靶向系膜细胞，即使在脱靶细胞的周围环境中也是如此。此外，异多价NP显示出必要的体内稳健性，导致体内系膜区域的有效积累，而肾脏内只有小的脱靶沉积。显然，与同官能的cRGD或EXP NP相比，异多价EXPcRGD NP因此显示出好得多的系膜靶向性。由于本发明人能够用两种不同的病毒启发概念在体内靶向相同的独特细胞类型，因此本发明人得出结论，病毒感染模式的模拟允许高效靶向概念。此外，成功的系膜细胞靶向允许对与系膜相关的肾脏疾病进行精细治疗，因为与所有其他目前可用的方法相比，它显著增加了药物递送。
附图说明
现在通过参考以下附图进一步描述本发明。
下文附图描述中提及的所有方法均如实施例中详细描述的那样进行。
图1显示了病毒模拟附着和靶细胞识别。
(A)在其冠上携带EXP3174和Ang-I的NP(NPEXPAng-I)通过EXP3174介导的AT1R结合附着在细胞膜上。通过酶促Ang-I加工和Ang-II介导的内化触发特异性识别。
(B)举例说明了决策NP的三重靶细胞识别的流程图。
图2显示了纳米颗粒的表征。
(A)配体修饰的NP的组装。
(B)相对于PEG含量归一化的不同NP物质的摩尔配体含量，
(C)尺寸和多分散指数(PDI)以及
(D)所得NP制剂的
Figure BDA0003680978190000111
-电位。
结果显示为至少n＝3次测量的平均值±SD。
图3显示了与AT1R和ACE的体外相互作用。
通过细胞内钙测量确定配体修饰的NP与其靶标AT1R(A-D)和ACE(E-F)的相互作用。针对AT1R的(A)配体亲和力和(B)颗粒亲和力。(C)游离的和颗粒结合的配体的IC50值。(D)通过配体修饰颗粒的AT1R抑制的动力学测量。(E)NPEXPAng-I和NAng-I的Michaelis-Menten动力学。(F)基于配体和NP浓度计算的游离的和颗粒结合的Ang-I的特异性常数(Kcat/km)。结果显示为至少n＝3次测量的平均值±SD。统计显著性水平表示为**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001和#p≤0.0001和x≤0.001，比较不同时间点NPEXP和NPEXPAng-I的AT1R抑制。n.s.：不显著。
图4显示了在不同孵育时间经YFP标记的AT1R(绿色)转染的靶大鼠系膜细胞(rMC)细胞(白色)(pAT1R-rMC)中NPEXPAng-I(红色)的细胞内化。比例尺20μm。
图5显示了病毒模拟NPEXPAng-I的摄取特异性。
(A)配体介导的rMC中NPEXPAng-I、NPAng-I和NPEXP的内化被游离EXP3174和卡托普利抑制(也参见图11和12)。(B)AT1R和ACE阳性rMC和HK-2细胞以及AT1R和ACE阴性HeLa细胞中NPEXPAng-I的摄取。通过流式细胞术分析的靶rMC与脱靶(C)NCI-H295-R细胞或(D)HeLa细胞共培养中颗粒摄取的特异性。(E)与深红色染色的(CTDR)脱靶HeLa或NCI-H295R细胞(白色)共培养的绿色染色的(CTG)rMC(绿色)中颗粒摄取(红色)的CLMS图像。比例尺20μm。(也参见图13)。结果显示为至少n＝3次测量的平均值±SD。统计显著性水平表示为**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001和#p≤0.0001，比较具有和没有卡托普利或EXP3174抑制的细胞中NP的摄取。n.s.：不显著。
图6显示了小鼠肾脏中的NP分布。(A)NPEXPAng-I荧光位于肾小球(白色箭头)中。(B)对照非靶向NPMeO未在肾小球中积累，肾小球缺乏颗粒相关荧光。蓝色：细胞核的DAPI染色；绿色：组织自发荧光；红色：NP相关荧光。从左到右的正方形区域显示为放大倍数。
图7显示了通过荧光显微镜分析在肾小球中检测到的NP相关荧光的评估。
(A)用不同颗粒制剂处理的小鼠肾小球(虚线圆圈)的图像。比例尺40μm。也参见图14B(B)完整肾小球NP-荧光的定量分析。(C)外皮层和内皮层的肾小球中颗粒相关荧光的比较。(D)通过MC的CLSM和整合素-α8染色确定的NPEXPAng-I的肾小球定位(比例尺20μm)。(C)和(D)中的结果表示为每个NP样品n＝6只小鼠的至少n＝120次荧光测量的平均值±SD。统计显著性水平表示为****p≤0.0001。n.s.：不显著。
图8显示了配体与PEG-PLA嵌段共聚物的偶联。
分别使用EDC/NHS或DCC/NHS化学使(A)Lys-Ang-I和(B)EXP3174与羧酸或胺封端的PEG5k-PLA10k连接。(C)摩尔配体和PEG含量的量化显示了完全的聚合物官能化。(D)使用荧光胺确定EXP3174修饰的聚合物不存在未反应的NH2聚合物端基。使用GraphPad Prism 6.0进行学生t检验以评估统计显著性。统计显著性水平表示为****p≤0.0001，比较具有NH2封端的PEG5k-PLA10k的MeO-和EXP3174-的荧光。详细方法见实施例1。
图9显示了NPEXP的最大钙信号和抑制。
同时用Ang-II和NPEXP刺激rMC，并立即测量产生的细胞内钙反应1分钟。在使用的NPEXP浓度下，EXP3174配体在测定期间不抑制激动剂触发的钙信号。因此，EXP3174对Ang-II测量的影响被认为可以忽略不计。结果显示为至少n＝3次测量的平均值±SD。详细方法见实施例1。
图10显示了通过CLSM分析的AT1R阳性pAT1R-rMC中不同颗粒制剂随时间的摄取。
(A)NPEXP没有在细胞系中内化，并且主要位于细胞膜上和随时间形成大簇的细胞之间的丝状伪足(filipodia)上。受体结合由NP和受体相关荧光的共定位显示。(B)NPAng-I被细胞内化，如通过其细胞质定位所示。(C)NPMeO不与细胞结合，因为它们缺乏能够实现特定靶向的栓系的配体。细胞：白色；AT1R-YFP：绿色；NP-制剂：红色。比例尺20μm。详细方法见实施例1。
图11显示了EXP3174抵消了由于NPEXPAng-I上的长聚合物链对Ang-I配体的空间位阻而导致的摄取减少。
制备具有不同聚合物密度的COOH-PEG5k-PLA10k的具有20％Ang-I密度的NPAng-I(灰色)，并使用流式细胞术分析它们的细胞摄取。同时，制备具有不同密度的EXP3174-PEG5k-PLA10k的NPEXPAng-I(黄色)，以比较第二配体对Ang-I的空间位阻的影响。在NPEXPAng-I上用EXP3174对长聚合物链进行官能化抵消了在添加非官能化长聚合物时由于Ang-I配体的空间位阻导致的摄取减少，并显著增加了颗粒内化。结果显示为至少n＝3次测量的平均值±SD。使用GraphPad Prism 6.0进行了2因素ANOVA和Sidak多重比较检验以评估统计显著性。统计显著性水平表示为****p≤0.0001。详细方法见实施例1。
图12显示了通过CLSM分析的NP摄取的特异性。
在添加不同的NP制剂(NPEXPAng-I、NPAng-I和NPEXP)之前，将细胞与游离的EXP3174预孵育30分钟。靶受体的抑制导致颗粒相关荧光的抑制。比例尺20μm。详细方法见实施例1。
图13显示了靶细胞和脱靶细胞共培养中(A)NPEXP和(B)NPAng-I的摄取。
NPEXP显示出在rMC和NCI-H205R细胞中积累，因为它们二者都携带AT1R。相反，rMC和HeLa细胞的共培养显示NPEXP在rMC中优先积累，因为HeLa细胞在细胞膜上仅表达少量受体(参见[3])。NPAng-I显示出更高的特异性，因为相对于缺少ACE的脱靶细胞(HeLa或NCI-H295R细胞)，它们优先在携带了它们内化所需的设备(ACE和AT1R)的靶rMC中积累。细胞核：蓝色；脱靶细胞(HeLa或NCI-H295R)：白色；靶细胞(rMC)：绿色；NP：红色。比例尺20μm。具体方法见实施例1。
图14显示了不同NP制剂的体内分布。
(A)在小鼠肾脏中NPAng-I和NPEXP的肾脏分布。NPAng-I在大多数肾小球中显示出小的NP相关荧光，相比之下NPEXP在该区域没有积累。为了可视化，肾小球用白色箭头标记。从左到右的正方形区域显示为放大倍数。细胞核的DAPI染色：蓝色；组织自发荧光：绿色；NP相关荧光：红色。(B)用于标记NP的游离染料的肾脏分布。将CF647作为对照注射到小鼠体内，以评估其在肾脏中的分布。在肾小管区域可以检测到强荧光，而在肾小球(用白色圆圈标记)中没有荧光。这表明从颗粒样品中看到的荧光来自颗粒本身，而不是来自泄漏的染料，其由于其低分子量而被自由过滤。(C)在NRMI小鼠中循环一小时后不同NP制剂的血浆停留。注射后1小时测量血浆中的NP荧光，并相对于注射后5分钟测量的荧光(初始颗粒血液荧光)进行归一化。非靶向NP(NPMeO)显示出最高的血液循环时间，这是由于其PEG壳赋予的隐身效应。尽管NPEXPAng-I表面的所有聚合物中有40％是配体偶联的，这降低了颗粒的隐身效应，但它们能够匹配非靶向颗粒的血液驻留。与仅用一种配体(NPAng-I和NPEXP)官能化的颗粒相比，它们描绘了1小时后血浆中显著更高的荧光。携带特异性两步病毒模拟识别机制的NPAng-I也显示出比NPEXP显著优越的血液驻留，后者代表通常靶向的NP。作为对照，将用于标记颗粒的游离染料(CF647)额外注射到小鼠体内，并在其自由过滤后迅速从血液循环中消失(1小时后为初始荧光的6％)。(C)中的结果表示为至少n＝6个样品的平均值±SD。使用GraphPad Prism 6.0进行学生t检验以评估统计显著性。统计显著性水平表示为*p≤0.05，***p≤0.001和****p≤0.0001。n.s.：不显著。详细方法见实施例1。
图15显示了本发明的决策纳米颗粒的示例性体内用途，其包含用于附着至靶细胞的第一配体和用于将纳米颗粒识别/内化到所述靶细胞中的第二配体。本发明的纳米颗粒可用于靶向多种靶组织，例如系膜。通过选择靶向靶细胞表面上的靶受体和/或分子的第一和第二配体，可以定制用于靶向特定靶组织的纳米颗粒。
图16显示了用颗粒处理的动物的横向肾切片。
A)病毒模拟颗粒在肾小体中显示出高积累(圆形标记)。
B)未携带第一配体和第二配体的未修饰纳米颗粒未显示显著吸收到肾小球组织中。
图17表明腺病毒模拟NP通过被动和主动靶向策略的协同组合进入肾小球系膜细胞。(a)施用后，NP通过传入小动脉到达肾滤过系统的肾小球区域，传入小动脉然后分流成肾小球毛细血管系统。(b)在肾小球毛细血管内，由于其网状结构，NP不能通过肾滤器，但能够通过内皮窗孔渗出，从而到达位于间质的系膜。(c)因此，病毒模拟NP可以通过初始结合血管紧张素II受体1型(AT1r)和随后的αVβ3整合素介导的内吞有效地浸润系膜细胞。(AA：传入小动脉；EA：传出小动脉；MC：系膜细胞；PO：足细胞；FP：足突；ET：内皮；BM：基底膜。)
图18显示了腺病毒模拟NP的表征。(a)异多价EXPcRGD NP以及同官能或非官能化NP物质的颗粒设计。(b)DLS分析。所有颗粒类型均在60nm的尺寸阈值以下制造，而没有明显的聚集。(PDI：多分散指数)。(c)ζ电位测量。将COOH-PEG2k-PLA10k添加到聚合物混合物中导致负表面电荷。(d)/(e)分别为NP制造后cRGDfK和EXP3174配体表面密度的量化。最终表面含量与先前添加的cRGDfK(R2＝0.9957)和EXP3174(R2＝0.9871)的配体官能化聚合物的量成正比。结果代表平均值±SD(n＝3)。
图19显示了腺病毒模拟NP的AT1r相互作用。(a)用游离的或颗粒结合的EXP3174处理的rMC的AT1r刺激后的细胞内钙水平。EXPcRGD NP(IC50＝276±31pM)和EXP NP(IC50＝552±73pM)均有效结合并抑制AT1r，导致AT1r用血管紧张素II(ATII)刺激时低的Ca2+流入。由于多价衍生的亲和力增益，游离EXP3174(IC50＝2.66±0.9nM)的这种作用甚至更强。(b)用无AT1r配体的NP处理的rMC的AT1r活性。未官能化的对照NP和cRGD NP都不能显著结合AT1r，导致ATII刺激时最大的钙水平并确认了测定的特异性。(M＝NP或EXP3174的摩尔浓度)。结果代表平均值±SD(n＝3)。
图20显示了体外靶系膜细胞对NP的内化。(a)与0.05mg mL-1AlexaFluorTM568标记的EXPcRGD纳米颗粒孵育后，CTDR染色的rMC的CLSM分析。可以在rMC胞质溶胶(灰色)内的囊泡结构中检测到NP相关荧光(紫色)。随着孵育时间的增加，内吞囊泡的尺寸、数量和强度都增加，表明囊泡融合成更大的内体。(比例尺20μm。)(b)NP摄取到rMC中的流式细胞术分析。与对照NP以及同官能NP相比，异多价EXPcRGD NP显示出显著增加的细胞摄取。(c)NP孵育60分钟后的流式细胞术结果。虽然与所有其他NP类型相比，EXPcRGD NP显示出最大的细胞结合，但添加过量的游离cRGDfK(c＝500μM)急剧降低到EXP NP水平的荧光信号，表明NP摄取的αVβ3依赖性。结果代表平均值±SD(n＝3)。◇P<0.0001，οP<0.001，****P<0.0001。(AFU，任意荧光单位)。
图21显示了NP与系膜细胞相互作用的TEM分析。(a)EXPcRGD NP在rMC内的许多囊泡结构(黑色箭头)中积累。不同尺寸的囊泡存在于细胞胞质溶胶的外部和内部二者中，表明细胞内加工并融合成更大的内体。此外，大量的NP仍然位于细胞膜上，这表明颗粒经历了初始细胞结合和随后的内吞作用的逐步过程。(右侧的图像显示左侧黑框的放大视图)。(b)相比之下，EXP NP仅在细胞边界积累，在那里它们与rMC细胞的不同表面结构结合，表明可能与膜结合AT1r相互作用。(左上角的图像显示了黑框的放大视图)。(c)对照NP仅显示与rMC的可忽略不计的相互作用，几乎没有任何金增强的NP可见。
图22显示了在体外共培养测定中EXPcRGD NP的系膜细胞选择性。(a)与充当脱靶细胞的CTDR标记的HeLa或NCI-H295R细胞(灰色)共培养的CTG染色的rMC(绿色)的CLSM分析。对于rMC/HeLa共培养(顶行)，仅能在rMC区域内检测到NP来源的荧光(紫色)，表明选择性EXPcRGD NP摄取到靶细胞中。rMC与表达AT1r的NCI-H295R细胞的共培养导致发散的NP分布(底行)。因此，EXPcRGD NP也结合到NCI-H295R细胞的表面，导致围绕细胞边界的扩散图案。然而，仅在系膜细胞中才能看到有效的颗粒摄取到圆形内吞囊泡中。(比例尺20μm)。rMC与HeLa(b)和NCI-H295R(c)二者的流式细胞术分析支持CLSM结果，因为EXPcRGD NP在这两种情况下都显示出与rMC的显著更高的细胞结合。有趣的是，在(c)中添加过量的游离EXP3174(c＝1mM)急剧减少了NP与NCI-H295R细胞的相互作用，表明EXPcRGD NP不能再通过AT1r与NCI-H295R细胞结合。结果代表平均值±SD(n＝3)。****P<0.0001。(n.s.：不显著。AFU，任意荧光单位)。
图23表明EXPcRGD NP在体内显示出强烈的肾小球内积累。使用荧光显微镜对横向肾冷冻切片进行成像。为了便于组织学评估，细胞核用DAPI(蓝色)染色并记录组织自发荧光(绿色)。发现EXPcRGD NP(红色)几乎仅在皮质的肾小球区域(白色圆圈)积累，而管状区域的荧光可忽略不计。(从左上角到右下角，图像显示了白框的放大视图)。
图24显示了EXPcRGD NP在系膜细胞中显示出显著增强的积累。(a)荧光显微镜分析显示，对于EXPcRGD NP主要可以检测到肾小球(白色圆圈)内的高荧光水平。虽然EXP NP在肾小球中显示出中等的积累，但对照NP和cRGD NP并没有产生任何相当程度的信号。(比例尺20μm。校准条：0–65535灰度值)。(b)通过评估足够数量的肾小球的每个肾小球区域的积分密度，实现了肾小球内荧光强度的精确量化。因此，与所有其他颗粒类型相比，EXPcRGDNP显示出每个肾小球的荧光强度要高得多。结果代表平均值±SD(n＝60)。****P<0.0001。(AFU，任意荧光单位)。(b)系膜表面标志物整合素α-8的抗体染色表明EXPcRGD NP相关荧光(红色)与系膜细胞覆盖的区域(黄色)共定位，表明EXPcRGD NP能够通过内吞选择性地浸润系膜细胞。比例尺20μm。
图25显示了配体官能化PEG-PLA嵌段共聚物的合成概念。(a)将不同链长(2kDa/5kDa)的异双官能PEG聚合物(①)与3,6-二甲基-1,4-二恶烷-2,5-二酮(②)混合以通过开环聚合产生NH2-PEG5k-PLA10k以及COOH-PEG2k-PLA10k(③)。(b)随后，NH2-PEG5k-PLA10k通过DCC/NHS化学与EXP3174(④)的羧基共价偶联，得到EXP3174-PEG5k-PLA10k(⑤)。(c)此外，COOH-PEG2k-PLA10k通过EDC/NHS化学连接到cRGDfK(⑥)的赖氨酸残基上，导致更短的cRGDfK-PEG2k-PLA10k(⑦)。(d)通过比较PEG和EXP3174二者的摩尔浓度来确定合成的EXP3174-PEG5k-PLA10k的偶联效率。因此，摩尔浓度没有显著变化，表明成功官能化。(e)cRGDfK-PEG2k-PLA10k的偶联效率也在合理范围内，PEG和cRGDfK的摩尔浓度仅有可忽略不计的差异。结果代表平均值±SD(n＝3)。
图26显示了金标记的NP，以便于TEM可视化。通过将超小金纳米颗粒(直径：2.2nm)共价连接到PLGA的羧基上，然后将其用于制造NP，来对NP进行金标记。在rMC与标记的NP孵育后，通过在NP核上沉积更多的金颗粒来对颗粒核进行金增强，从而增加样品的电子密度并在TEM显微镜下实现可视化，其中NP显示为暗黑点。
图27显示了通过(a)流式细胞术结果和(b)CLSM研究的不同细胞类型的αVβ3表达的量化。对于细胞计数分析，用2％BSA的DPBS溶液封闭非特异性结合位点，并将105个细胞与
Figure BDA0003680978190000151
抗CD51/61抗体在0.1％BSA的DPBS溶液中按照1:20稀释(
Figure BDA0003680978190000152
小鼠IgG1，κ同种型对照(FC)充当非特异性对照)孵育1小时。此后，细胞经历DPBS洗涤和离心的多个步骤。最后，将样品重悬在DPBS中并如先前所述使用流式细胞术进行分析(FACSCalibur，激发：633nm，发射：661/16nm带通滤波器)。因此，rMC的αVβ3来源荧光水平最高，而HeLa和NCI-H295R细胞二者均显示可忽略不计的信号，均显著低于rMC。结果代表平均值±SD(n＝3)。****P<0.0001，**P<0.01，*P<0.05。(AFU，任意荧光单位)。为了确认流式细胞术结果，将rMC接种到8孔Ibidi载玻片(15.000个细胞孔-1)中，并如上所述对αVβ3整合素进行染色。然后用DPBS洗涤细胞，用4％PFA的DPBS溶液固定并在Zeiss LSM 710上分析。CLSM图像显示与rMC细胞体共定位的强整合素信号，表明系膜细胞的大量αVβ3表达。比例尺20μm。
图28显示了荧光成像的结果。
A)NP注射后的相对血浆荧光。对照NP表现出最大的血液循环值，在注射60分钟后具有几乎50％的残留血浆荧光。与显示出可耐受的残留浓度的EXP NP和EXPcRGD NP相比，cRGD NP迅速从血液中清除。结果代表平均值±SD(n＝3)。****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01。(n.s.：不显著)。
B)注射游离CFTM 647荧光染料后肾冷冻切片的荧光成像。为了可视化细胞核，切片进行了DAPI染色(蓝色)。注射可比较摩尔浓度的游离染料后，可在肾小管区域检测到强荧光信号(红色到白色)，表明低分子染料的自由肾滤过。如预期的，没有检测到肾小球内积累(白色圆圈)。(校准条：0-65535灰度值)。
图29显示了NP辅助西那西呱递送的概念。异多价EXPcRGD NP通过先前描述的顺序识别序列进入靶肾系膜细胞。在成功的内吞后，NP经历内溶酶体降解，导致西那西呱(小点)的释放。然后CCG活化并稳定系膜GC，导致增强的、NO介导的cGMP产生。通过cGMP介导的蛋白调节激酶(PGK1-α)活化，抑制了多种促纤维化途径，导致系膜细胞促纤维化重塑的整体降低。
图30显示了示例性实验设置。对于所有实验，将游离西那西呱(c＝2μM)与携带浓度为0.2μM的CCG或不携带药物的EXPcRGD NP进行比较。根据在该浓度范围内显示出强效效果的先前的研究选择游离西那西呱的量。
图31显示了西那西呱对药物靶标的影响的蛋白质印迹分析。a)sGC刺激和稳定化。游离CCG和负载CCG的EXPcRGD NP二者均导致24小时孵育期间sGC水平显著增加，而缺少CCG的对照NP没有显著影响。b)PGK1-α的活化。为了评估PGK1-α活性，评估了其底物血管扩张刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化。因此，游离CCG和携带CCG的EXPcRGD NP二者均显示出P-VASP/VASP比率的显著增加，而对照NP没有导致可检测的变化。(n＝3；****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。
图32显示了负载西那西呱的NP的抗纤维化和抗增殖作用。系膜细胞与游离CCG或NP预孵育4小时，然后与10ng mL-1的TGF-β孵育48小时以诱导纤维化和过度增殖变化。a)MTT测定显示了抗增殖作用。虽然系膜细胞在TGF-β刺激下显示出显著的过度增殖，但与游离CCG或负载CCG的NP预孵育显著降低了这种效应。b)α-SMA和c)胶原蛋白I水平的蛋白质印迹分析显示，与TGF-β对照相比，CCG或负载CCG的NP的两种纤维化标志物均显著降低。(n＝3；****P<0.0001；***P<0.001；n.s.不显著)。d)LSM分析进一步支持了b)的结果，系膜细胞在与CCG或携带CCG的NP预孵育后显示出显著减少的α-SMA产生。比例尺＝2μm。
在下文中将参考实施例，给出这些实施例以用于说明而非限制本发明。
具体实施方式
实施例
实施例1：材料和方法
细胞培养
本研究中使用的细胞系在37℃和5％CO2条件下培养。rMC、NCI-H295R和HeLa细胞在补充有10％FBS和胰岛素-转铁蛋白-硒以及100nM氢化可的松的RPMI1640培养基(SigmaAldrich)中培养。HK-2细胞维持在补充有10％FBS的DMEM-F12(1:1)培养基(SigmaAldrich)中。pAT1R-rMC是通过使用市售的转染试剂Lipofectamine 2000按照制造商的说明用编码具有YFP标签的AT1R的质粒(CXN2-HA-AT1R-YFP)(参考[4])转染rMC获得的。pAT1R-rMC在补充有10％FBS和600μg/ml遗传霉素(G418)的RPMI1640培养基中培养。细胞系的特征在于它们的靶AT1R和ACE表达，如先前所示[1,3]。
小鼠
动物实验程序根据国家和机构指南进行，并得到地方当局的批准(Regierung vonUnterfranken，参考编号：55.2-2532-2-329)。关键资源表中指出的小鼠已在10周龄时用于本研究。在所有实验中仅使用雌性小鼠。它们保持在标准条件(50±5％相对湿度、21±1℃温度、空气交换>8AC/h和12h:12h(L:D)光周期)下的无特定病原体(SPF)饲养设施中。
聚合物制备：嵌段共聚物合成
PEG-PLA嵌段共聚物(COOH-PEG2k-PLA10k、COOH-PEG5k-PLA10k、NH2-PEG5k-PLA10k和MeO-PEG5k-PLA10k)通过环状3,6-二甲基-1,4-二恶烷-2,5-二酮(丙交酯)的开环聚合合成。简而言之，丙交酯在使用前从无水乙酸乙酯中重结晶，并在室温(r.t.)下在40℃下真空干燥12小时。COOH-PEG5k-OH、COOH-PEG2k-OH、Boc-NH-PEG5k-OH或MeO-PEG5k-OH用作开环聚合的大分子引发剂。将它们溶解(0.3mmol)在无水DCM中并与纯化的丙交酯(18mmol)混合。添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)(0.9mmol)作为催化剂。1小时后用苯甲酸(4.6mmol)淬灭聚合。将所得聚合物在乙醚中沉淀并在40℃(对于COOH-PEG2k-PLA10k、COOH-PEG5k-PLA10k和MeO-PEG5k-PLA10k)或35℃(对于Boc-NH-PEG5k-PLA10k)下真空干燥12小时。为了裂解保护性Boc基团，将Boc-NH-PEG-PLA溶解在50％(v/v)TFA/DCM中并在室温下搅拌30分钟。然后，将其用三倍体积的DCM稀释并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。所得NH2-PEG5k-PLA10k通过在乙醚中沉淀进行纯化，随后在35℃下真空干燥12小时。
聚合物制备：配体偶联
为了制备Ang-I修饰的聚合物(另请参见图8)，将14μmol的COOH-PEG5k-PLA10k用25摩尔过量的EDC和NHS的DMF溶液活化2小时。然后，添加863μmol的2-巯基乙醇淬灭反应20分钟，然后滴加66μmol DIPEA和17μmol Lys-Ang-I的DMF溶液。48小时后，将所得聚合物在超纯水(Millipore)中稀释至DMF浓度低于10％，并使用截留分子量为6-8kDa的再生纤维素透析膜透析24小时(30分钟、2和6小时后更换介质)以除去未反应的配体和试剂。为了制备EXP3174修饰的聚合物(另请参见图8)，将96.4μmol的EXP3174用等摩尔量的DCC和NHS的DMF溶液活化2小时。然后通过离心(5分钟，12,000x g)并且随后用0.2μm Rotilabo PTFE注射过滤器过滤除去产生的尿素副产物。将27.6μmol NH2-PEG5k-PLA10k的DMF溶液和17.5摩尔过量的DIPEA添加到活化配体中并反应20小时。如下对配体修饰的聚合物进行纯化：在冰冷的1:5(v/v)二乙醚:甲醇中沉淀，随后使用6-8kDa截留分子量的再生纤维素透析膜(SpectrumLaboratories)，用10mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)中的10％乙醇透析24小时以除去过量的游离配体(30分钟和6小时后更换介质)，然后用超纯水透析24小时以除去缓冲盐(30分钟、2和6小时后更换介质)。将配体修饰的嵌段共聚物冻干72小时，然后进行配体偶联确认。为此，聚合物以40mg/ml的浓度溶解在ACN中，并在搅拌的超纯水中沉淀以产生聚合物胶束(终浓度为1mg/ml)。PEG含量使用比色碘络合测定法定量，并且偶联的Ang-I使用Pierce BCA测定试剂盒按照制造商的说明使用FLUOstar Omega酶标仪进行量化。使用LS-5S荧光酶标仪在λex＝250nm和λem＝370nm下对EXP3174进行荧光定量。使用荧光胺确定了NH2-PEG5k-PLA10k上不存在未反应的NH2端基(也参见图8)。
聚合物制备：PLGA的荧光标记
对于体外和体内颗粒检测，在颗粒核中使用了荧光标记的PLGA。为此，使TAMRA-胺(用于CLSM)和CF6467-胺(用于流式细胞术和体内实验)共价偶联至羧酸封端的13.4kDaPLGA。简而言之，将5μmol酸封端的PLGA溶解在无水DMF中并在室温下用29μmol DMTMM(25倍过量)活化2小时。然后，将1μmol荧光染料溶解在DMF中，滴加到PLGA中并在室温下在黑暗中反应72小时。将反应产物稀释(DMF<10％)并使用3.5kDa截留分子量的再生纤维素透析膜(Spectrum Laboratories)用超纯水避光透析34小时(30分钟、2和6小时后更换介质)。然后将荧光标记的PLGA冻干3天。
NP制备和表征：颗粒制备
对于NP制备，将PEG-PLA嵌段共聚物和13.4kDa PLGA以70:30的质量比在ACN中混合至终浓度为10mg/mL。对于配体修饰的颗粒，将COOH-PEG2k-PLA10k和配体修饰的聚合物相应地混合，使得构成NP结构的聚合物中有20％被Ang-I(NPAng-I)或/和EXP3174(分别NPEXP和NPEXPAng-I)修饰。通过在剧烈搅拌的10％DPBS(v/v)(pH 7.4)中使聚合物混合物进行本体纳米沉淀至终浓度为1mg/ml来制备NP。将颗粒搅拌2小时以确保有机溶剂蒸发，并通过使用截留分子量为30-kDa的Microsep Advance离心装置(Pall Life Sciences)在756g下超速离心20分钟来浓缩。
NP制备和表征：动态光散射和ζ-电位
使用配备有173°反向散射角的633He-Ne激光和Malvern Zetasizer软件版本7.11的ZetaSizer Nano ZS(Malvern Instruments)，在25℃的恒温下10％PBS中分别使用1mg/mL或3.5mg/ml的浓度确定所得颗粒的尺寸和ζ电位。比色皿位置设置为4.65mm，衰减器由装置自动优化。一次性微型比色皿(Brand)和折叠毛细管池(Malvern Instruments)分别用于尺寸和ζ-电位测量。
NP制备和表征：颗粒量化
使用比色碘络合测定法对颗粒PEG浓度进行量化，并与通过冻干法测定的重量NP含量相关联。简而言之，将颗粒样品在超纯水中稀释至5-30μg/mL范围内的PEG浓度。MeO-PEG-OH(0-40μg/mL)在超纯水中的稀释液用作校准曲线的标准品。将140μL样品或标准品与60μL的5％(m/v)氯化钡的1N HCl溶液和0.1N碘水溶液的2:1(v/v)混合物混合。将样品和标准品转移到96孔板中，并使用FUOstar酶标仪(BMG Labtech)测量它们在535nm处的吸光度。在样品冻干后通过重量分析确定颗粒PEG含量与准确聚合物浓度的相关性。摩尔颗粒浓度由通过比色碘络合测定法确定的颗粒质量、颗粒密度(1.25g/cm3)和通过DLS测量获得的NP的流体动力学直径计算，假设为球形颗粒形状。如上所述，使用BCA测定法对颗粒冠上的配体浓度进行定量，并分别对Ang-I和EXP3174进行荧光定量。
细胞内钙测量
为了评估不同NP制剂的AT1R相互作用，如先前所述[1，3]使用比率Fura-2 Ca2+螯合剂方法，使用AT1R阳性rMC。为此，将rMC接种在T-150烧瓶(Corning)中并孵育直至汇合。随后，将它们胰蛋白酶化、离心(200g，5分钟)并重悬在补充有5μM Fura-2 AM(ThermoFisher)、0.05％Pluronic F-127和2.5mM丙磺舒的Leibovitz培养基中。将细胞在避光轻轻搅拌(50rpm)下孵育1小时。之后，将细胞悬液用DPBS通过离心(2x,200g,5min,RT)洗涤，并以200万个细胞/mL的计数重悬在补充有2.5mM丙磺舒的Leibovitz培养基中。为了确定AT1R的颗粒亲和力和配体亲和力(图3A-C)，将45μl的负载Fura-2的rMC悬浮液(90,000个细胞/孔)与10μL不同样品(1nM至300μM(配体浓度)的NP或游离配体)在96孔半面积微孔板中在室温下孵育30分钟。之后，用45μL的300nM Lys-Ang-II水溶液刺激细胞，并立即使用具有340/20nm和380/20nm激发和510/20nm发射带通滤波器的FLUOstar Omega酶标仪(BMG Labtech)记录所得钙信号1分钟/孔。为了确定AT1R相互作用的动力学(图3D)，使用了相同的程序，但样品与细胞孵育不同的时间段(5至320分钟)。分别通过用0.1％Triton-X 100或0.1％Triton-X 100和45mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)刺激细胞来确定最大和最小信号比。在Grynkiewicz假设Kd值为225nM后计算细胞内钙浓度。使用GraphPad Prism 6.0通过学生t检验(图3C)和使用Sidak的多重比较的2因素ANOVA(图3D)评估统计显著性。
酶动力学测量
使用兔肺ACE(Sigma Aldrich)作为细胞膜结合酶的可溶性替代物，如先前所述[1]测定NPAng-I和NPEXPAng-I的Michaelis-Menten动力学。简而言之，将不同浓度的NP(对应于10-120μM Ang-I)与18μM酶孵育不同的时间段(5、15、30、60、90和120分钟)以将颗粒冠上的Ang-I转化为AT1R活性配体Ang-II。所得Ang-II通过直接细胞内钙测量来量化。为此，如上所述，向rMC负载Fura-2染料。然后，将10μL样品移液到96孔半面积板上，并在其顶部注入90μL负载Fura-2的rMC悬液(90,000个细胞/孔)。如上所述，立即使用FLUOstar Omega酶标仪(BMG，Labtech)记录所得钙信号1分钟。为了排除使用的实验条件下EXP3174配体对NPEXPAng-I的干扰，使用NPEXP作为对照(见图9)。同时用不同的NPEXP浓度和Lys-Ang-II(400nM)刺激rMC(90,000个细胞/孔)，并立即记录所得钙信号1分钟。1nM至300μM范围的已知浓度的游离Lys-Ang-II用于将测量的钙浓度转换为水解产物的pmol。使用GraphPadPrism 6.0将15分钟孵育时间的反应速度(pmol/min)相对于测定中使用的底物浓度作图，以确定基于颗粒和基于配体的浓度(图3E)的Michaelis-Menten常数(Km)。使用相同的软件获得催化常数(Kcat)以计算用于比较相同酶的不同底物的特异性常数(Kcat/Km)(图3F)。使用GraphPad Prism 6.0通过带有Tukey多重比较检验的2因素ANOVA评估统计显著性(图3F)。
NP的细胞分布：共聚焦显微镜
为了确定不同颗粒制剂的细胞分布(图4)，将pAT1R-rMC以10,000个细胞/孔的密度接种到8孔μ-载玻片(Ibidi，Graefelfing，德国)中并孵育24小时(37℃)。然后将它们与在补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的Leibovitz培养基(LM)中预热的NP溶液(0.2mg/ml)一起孵育15、45或90分钟。之后，弃去NP，将细胞用DPBS彻底洗涤，然后用1x CellMaskTM DeepRed Plasma Membrane Stain染色细胞5分钟，然后用4％多聚甲醛(PFA)的DPBS溶液在室温下固定10分钟。使用Zen软件(Carl Zeiss Microscopy)，使用焦平面设置为1.4μm的ZeissLSM 700显微镜获得图像。对于颗粒摄取和结合抑制，在添加颗粒之前，将细胞与1mM游离EXP3174或卡托普利预孵育。使用Fiji软件分析图像。
NP的细胞分布：流式细胞术
如先前所述[1]通过流式细胞术分析颗粒摄取(图5A)。简而言之，将rMC以30,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并孵育48小时(37℃)。将预热的NP溶液(补充有0.1％BSA的LM中0.7mg/ml)移液到细胞顶部，用DPBS洗涤后，在37℃下孵育45分钟。为了确认摄取特异性，在添加颗粒之前，将细胞与1mM卡托普利和/或EXP3174孵育30分钟。之后，弃去颗粒溶液，并且将细胞用DPBS彻底洗涤、胰蛋白酶化并离心(2x,200g 5min,4℃)。使用FACSCalibur细胞仪(Becton Dickinson)在DPBS中分析NP相关细胞荧光。在633nm处激发荧光并使用661/16nm带通滤波器记录。使用Flowing软件2.5.1(Turku Centre forBiotechnology)对活细胞群进行设门并且分析NP相关荧光的几何平均值。使用GraphPadPrism 6.0通过学生t检验评估统计显著性(图5A)。
NP靶细胞特异性：流式细胞术
为了评估不同细胞系中的NP摄取(图5B)，将rMC、HK-2和HeLa细胞分别以30,000、50,000或100,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并孵育48小时(37℃)。然后将预热的NP溶液(补充有0.1％BSA的LM中0.7mg/ml)添加到细胞顶部并如上所述进行处理。使用GraphPad Prism 6.0通过具有Sidak多重比较检验的2因素ANOVA评估统计显著性(图5B)。
如先前所述[1]，通过流式细胞术研究了靶细胞和脱靶细胞共培养中的颗粒特异性(图5C-D)。简而言之，将CTG染色的rMC(在无血清培养基中10μM，30分钟，37℃)在与未染色的脱靶NCI-H295R或HeLa细胞的共培养中以密度分别为10,000和75,000细胞/孔接种到24孔板中，并且孵育48小时。随后将补充有0.1％BSA的LM中浓度为0.02mg/ml的温热NP溶液添加到细胞顶部，并在37℃下孵育45分钟。之后，弃去颗粒，并如上所述处理细胞用于流式细胞术分析。使用GraphPad Prism 6.0通过学生t检验评估统计显著性。
NP靶细胞特异性：共聚焦显微镜
为了确认流式细胞术实验，如先前所述[1]对共培养中的颗粒特异性进行了CLSM分析(图5E和图13)。简而言之，将靶CTG染色的rMC(10μM，30分钟，37℃)在与CTDR染色的脱靶HeLa或NCI-H295R细胞(25μM，30分钟，37℃)的共培养中以密度分别为2,000和10,000个细胞/孔接种，并孵育24小时。然后，将细胞核用Hoechst 33258(DPBS中5μg/ml)染色20分钟，将补充有0.1％BSA的LM中预热的0.02mg/mL NP溶液移液到细胞顶部并孵育45分钟。然后，弃去NP溶液，并且将细胞用DPBS彻底洗涤，并用4％PFA的DPBS溶液(r.t.)固定10分钟。如上所述，分别使用Zeiss LSM 700显微镜和Fiji软件获取和分析图像。
体内NP肾脏分布
为了评估不同NP制剂(NPEXPAng-I、NPAng-I、NPEXP和NPMeO)的肾脏分布，通过颈静脉将100μL的120nM NP溶液(相当于约10mg/ml NP)注射到用异氟醚吸入和丁丙诺啡(0.1mg/kg体重)麻醉的10周龄雌性NMRI小鼠(Charles River)(每个颗粒样品n＝6)中。此外，作为对照，将100μL用于荧光标记颗粒的游离染料(CF647)以与颗粒样品中包含的相同浓度(约50μM)注射。5分钟后，在小鼠仍处于麻醉状态的情况下通过i.v.穿刺收集血液样品。用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉颗粒循环小鼠1小时后，收集最终血液样品并通过用4％PFA灌注固定杀死它们。收获肾脏并横切。通过将它们置于补充有18％蔗糖和1％PFA的磷酸盐缓冲液(0.1M pH 7.4)中过夜进行冷冻保护。之后，将它们在液氮冷却的2-丙醇(-40℃)中冷冻，并包埋在Tissue
Figure BDA0003680978190000211
O.C.T.TM化合物中用于冷冻切片。使用CryoStar NX70低温恒温器(Thermo Fisher Scientific)将肾脏切成5μm切片并转移到SuperfrostTM plus载玻片上。为了更好地可视化细胞核，在使用Axiovert 200M(Zeiss)荧光显微镜和Zen软件(Zeiss)进行切片成像之前，用DAPI(DPBS中12.5μg/ml)对细胞核进行染色。使用10倍物镜获取全肾脏图像(图6)。对于肾小球，使用40倍物镜(每个样品平均120个肾小球)拍摄荧光定量图像并使用Fiji软件进行分析(Schneider等，2012)。为了更好地可视化，将查找表“Red Hot”应用于颗粒相关荧光。量化每个肾小球的区域，并对荧光区域进行设门。然后，对每个设门区域的积分荧光密度进行量化，并将其与整个肾小球区域相关联。使用GraphPad Prism 6.0通过学生t检验评估统计显著性。为了比较内皮层和外皮层的颗粒相关荧光，将皮层分成两个相等的部分，并如上所述分析肾小球荧光。为了评估统计显著性，使用GraphPad Prism 6.0进行了具有Sidak多重比较测试的2因素ANOVA。
使用激发和发射波长分别为640和680nm的FLUOstar Omega酶标仪(BMG Labtech)测量血浆中的NP相关荧光。将注射后1小时的荧光与注射后5分钟获得的样品的初始荧光相关联。
免疫组织化学
为了评估NP的肾小球定位，将新切的5μm肾冷冻切片用DPBS洗涤5分钟，用补充有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的DPBS洗涤5分钟，然后用DPBS洗涤5分钟，然后用补充有0.04％Triton-X(m/v)的DPBS中的5％BSA进行10分钟封闭。将切片再次用DPBS洗涤(5分钟)并在补充有0.5％BSA和0.004Triton-X(m/v)的DPBS中的多克隆山羊抗整合素-α8一抗的1:200溶液中在4℃下孵育过夜。然后，将它们在DPBS中洗涤5分钟，并与补充有0.5％BSA和0.04％Triton-X的DPBS中的Cy2-抗山羊二抗(1:400)和DAPI(12.5μg/ml)一起在室温下在黑暗中孵育1小时。冷冻切片使用DPBS和超纯水洗涤，然后使用Dako Faramount MountingMedium固定，并使用Zeiss LSM 700显微镜和Fiji软件进行分析，如上所述。
量化和统计分析
使用GraphPad Prism软件6.0进行统计分析。学生t检验或具有Sidak或Turkey多重比较检验的双因素ANOVA用于评估方法细节中所示的统计显著性。在文本和图形图例中指出了每个实验的统计显著性水平和“n”数字。
实施例2：嵌段共聚物允许病毒模拟颗粒设计
本实施例中提及的所有材料和方法均如先前实施例中所述。
为了开发病毒模拟NP，本发明人将配体EXP3174和Ang-I偶联到聚(乙二醇)5k-聚(乳酸)10k(PEG-PLA)嵌段共聚物(图8)，将其与聚(乳酸-共-乙醇酸)PLGA共混用于通过本体纳米沉淀制造NP，使颗粒在体内具有足够的稳定性。剩余的非官能化聚合物是具有较短的2k PEG和10k PLA嵌段的羧基封端的PEG-PLA(COOH-PEG2k-PLA10k)(图1A)。通过在制备NP之前用配体修饰聚合物，可以获得对配体密度的精确控制。制备颗粒，使得其20％的PEG链用Ang-I修饰，另外20％用EXP3174修饰(NPEXPAng-I)(图2B)。配体密度保持在40％最大值以避免配体之间的空间位阻和非特异性相互作用。作为对照，组装了无配体甲氧基-PEG封端颗粒(NPMeO)和携带20％Ang-I或EXP的颗粒(分别为NPAng-I和NPEXP)(图1A)。通过将携带长配体的聚合物与较短的非官能化聚合物组合用于颗粒制备，NP的尺寸可以保持在80nm以下，从而赋予颗粒通过系膜毛细血管内皮窗孔的能力(图2C)。选择羧酸封端的嵌段共聚物作为填充剂提供了理想的整体负颗粒电荷，以避免非特异性静电吸附到负细胞膜(图2D)。
实施例3：NP识别体外靶受体
本实施例中提及的所有材料和方法均如先前实施例中所述。
为了确认颗粒对细胞身份进行三重检查的能力，最初在体外进行了评估。使用钙动员测定法研究了介导初始附着和随后内化的靶受体的颗粒亲和力，因为用激动剂或拮抗剂刺激或沉默Gq偶联AT1R分别导致细胞溶质Ca2+流入或其抑制。为此，将AT1R阳性大鼠系膜细胞(rMC)与不同浓度的游离配体或NP制剂一起孵育30分钟，然后用Ang-II刺激并记录产生的钙信号。如图3A所示，使用游离EXP3174和Ang-II进行的对照实验显示，两种化合物对AT1R具有在纳摩尔范围内的高亲和力(IC50值分别为0.6±0.4和1.5±0.1nM)。Ang-I表现出低亲和力(IC50 0.9±0.6μM)，因为受体结合和活化仅在被细胞膜中存在的ACE酶促转化为Ang-II后发生。
与接头的偶联导致亲和力损失，这通过同时多种受体的高亲和力多价结合来补偿(图3B和3C)。仅携带Ang-I的颗粒(NPAng-I)对AT1R的亲和力(IC50为9.4±0.4nM)低于携带EXP3174的颗粒(IC50为0.4±0.1nM)，因为它们的主要相互作用是与ACE。然而，与游离配体相比，Ang-I的颗粒结合导致IC50值显著降低，这是由于促进了NP界面处的酶促切割和随后的多价结合。相比之下，EXP3174修饰的NP具有与游离配体相同数量级的亲和力。令人惊讶的是，携带两种配体的颗粒NPEXPAng-I在受体结合方面表现出协同效应，因为它们对AT1R的亲和力(IC50为0.2±0.09nM)显著高于仅携带一种配体的颗粒中的任何一种(图3C)。这证明配体不会阻碍彼此的相互作用，因为在Ang-I酶促活化成Ang-II后，两种配体以激动和拮抗的方式同时靶向相同受体。没有任何官能化的颗粒(NPMeO)证实该测定是配体特异性的，因为它们没有引起任何反应(图3B)。
为了评估细胞/颗粒相互作用的动力学，将浓度对应于10μM配体的NP与rMC一起孵育来在5.5小时内进行细胞内钙测量。它们可以沉默由存在游离激动剂触发的钙信号的程度用作各个颗粒在不同时间点通过其配体与细胞表面的AT1R结合的完整性的量度(图3D)。在其表面上仅携带Ang-I的颗粒表现出缓慢的受体结合，因为它们最初需要被细胞膜结合的ACE活化成携带Ang-II的颗粒才能与AT1R相互作用。孵育1小时后，受体结合达到最大值约40％，其在检测期间保持恒定。这表明一旦活化了一定数量的前配体，颗粒就会快速内化，并且可能并非所有的Ang-I都转化为Ang-II。一旦颗粒表面上的Ang-II与受体结合，颗粒就会迅速内化(因为它们具有皮摩尔AT1R亲和力[1])，这意味着NP内化的发生可能并不需要所有前配体都被活化。当在颗粒表面添加EXP3174作为附着因子时，可以避免这种现象。在颗粒孵育仅5分钟后，就会发生非常快速和完全的受体阻断(对于NPEXPAng-I和NPEXP类似)。AT1R抑制几乎在整个测量过程中都保持，并在最后时间点下降到约80％，可能是由于受体上调和再循环。通过EXP3174附着至细胞膜减慢了识别过程，使Ang-I向Ang-II的活化更高，从而可以更有效地与AT1R结合。比较NPEXPAng-I和NPEXP，NPEXPAng-I的初始AT1R抑制显著更高，其在颗粒孵育45分钟后变平。这可能是由于两种配体的组合作用导致对于AT1R的更高亲和力(图3C)。
颗粒内化的先决条件是ACE能够将Ang-I活化为Ang-II。因此，本发明人研究了NPEXPAng-I的酶动力学，以确定颗粒表面上拮抗剂的存在是否会阻碍酶促反应。将可溶形式的ACE用不同的颗粒浓度孵育不同的时间段，并通过钙动员测定对NP冠上产生的Ang-II进行量化。通过测量NPEXP表现出的信号抑制来评估测定中EXP3174配体的干扰(图9)。为NPAng-I和NPEXPAng-I(图3E)二者确定的Michaelis Menten常数(Km)导致两种颗粒制剂的值与游离配体(参见[1])相同数量级。此外，本发明人确定了催化常数(Kcat)以计算特异性常数(Kcat/Km)，这是比较不同底物对相同酶的亲和力的有用指标(图3F)。NPEXPAng-I冠上Ang-I的酶促活化与NPAng-I上的没有显著差异，表明ACE不受额外配体EXP3174的空间位阻。此外，基于配体浓度计算的Kcat/Km值对于游离和颗粒结合的Ang-I是相等的。更重要的是，当基于NP浓度计算Kcat/Km时，结合的配体是酶的明显更好的底物，这是颗粒表面上的多种配体分子与多种酶分子结合的结果(图3F)。
实施例4：决策NP是靶细胞特异性的
本实施例中提及的所有材料和方法均如先前实施例中所述。
在成功建立颗粒与其个体靶标的相互作用后，下一步是确定在其冠上携带拮抗剂和激动剂的NP是否仍会触发其靶细胞的内化，并且如果是，摄取是否因为特异性配体-受体相互作用。由于拮抗剂不引起AT1R介导的内吞作用而激动剂引起，本发明人通过共焦激光扫描显微镜(CLSM)研究了NPEXPAng-I在表达YFP标记的AT1R的rMC(pAT1R-rMC)中的细胞定位。如图4所示，在细胞内发现了NPEXPAng-I相关荧光。它随着孵育时间的增加而增加，并与AT1R荧光强烈共定位。
因此，存在由AT1R介导的特异性颗粒摄取。然而，仅携带拮抗剂(NPEXP)的颗粒不会被细胞内化，并且主要位于细胞表面上(图10A)。颗粒荧光也与受体荧光共定位，表明受体介导的附着。由于NPAng-I也被细胞内化(图10B)，所以酶促产生的Ang-II介导了NPEXPAng-I的细胞摄取。出乎意料的是，随着孵育时间的增加，细胞膜上的受体发生了重排(图4)，从更分散和均匀的细胞膜分布(15分钟后)到更集中的聚簇(90分钟)，这与NP荧光强烈地共定位。这是摄取是由AT1R介导的另一个证据，因为通过网格蛋白有被小窝内化的受体(例如GPCR，如AT1R)的活化会促进受体聚簇。
对于NPEXP，也发生了细胞膜上的受体重排，这是由细胞表面上的受体运动促进的多价受体结合的结果。一旦NPEXP附着在细胞膜上的受体上，它们缺乏内化会导致细胞膜上的受体-颗粒移动和进一步受体结合。没有配体的颗粒(NPMeO)不被细胞摄取(图10C)，证实了特异性靶向机制对于介导高细胞内化至关重要。
总体而言，本发明人证明与颗粒冠连接的介导附着的拮抗配体的存在不会阻碍随后的颗粒内化。更重要的是，在颗粒表面包含额外的配体通过添加更多的长聚合物链补偿了由于Ang-I配体的空间位阻导致的靶向损失(图11)。为了进一步确认颗粒特异性和配体介导的内化，在添加颗粒前将细胞与游离EXP3174或卡托普利(一种ACE抑制剂)预孵育30分钟，从而通过流式细胞术(图5A)和CLSM(图12)分析颗粒相关荧光的抑制。
此外，本发明人通过流式细胞术检查了不同细胞系中的颗粒内化(图5B)。不表达ACE并且仅表达少量AT1R水平的HeLa细胞显示出低颗粒摄取，这是非特异性的，因为它不能被卡托普利或EXP3174抑制。相反，表达这两种靶标的rMC和HK-2细胞能够摄取这些颗粒，如通过高得多的颗粒相关细胞荧光所示。内化也由与AT1R结合的活化的前配体介导，因为细胞与卡托普利或EXP3174的预孵育显著抑制了细胞荧光。因此，颗粒对其靶细胞显示出高特异性。然而，当NP进入体内时，它们与靶细胞和脱靶细胞同时存在。因此，本发明人研究了NPEXPAng-I是否能够区分它们。
将靶细胞(rMC)与过量的都缺少ACE并分别表达高和低AT1R水平的脱靶NCI-H295R或HeLa细胞一起接种。将它们与不同的NP制剂一起孵育，并通过流式细胞术研究每个细胞系的颗粒相关荧光(图5C-D)。NPEXPAng-I表现出出色的靶细胞特异性，因为它们在靶rMC中积累显著更多。特异性由Ang-I赋予，因为NPAng-I在两种脱靶细胞中也显示出低积累。相反，NPEXP在rMC中与细胞表面的结合程度与在表达高AT1R水平的NCI-H295R细胞中的结合程度相同，这表明简单的一步识别过程不足以赋予颗粒选择性。CLSM图像证实了流式细胞术的结果(图5E和13)，其中NPEXPAng-I和NPAng-I荧光(红色)主要与靶rMC(绿色)相关，而与脱靶HeLa或NCI-H295R细胞(白色)无关，而在rMC和表达AT1R的NCI-H295R细胞两者中都发现了NPEXP荧光。总之，这些结果表明NPEXPAng-I摄取是受体介导的，并且通过EXP3174配体的初始细胞附着不会降低病毒模拟识别过程赋予的靶细胞的颗粒特异性。
实施例5：NP靶向体内MC
本实施例中提及的所有材料和方法均如先前实施例中所述。
由于在体外证实了NPEXPAng-I上两种配体的互补靶向能力和颗粒特异性，下一步是确定病毒识别原理是否会导致更高的体内MC积累。为此，将靶向(NPEXPAng-I、NPAng-I和NPEXP)(图1A)和非靶向(NPMeO)颗粒制剂注射到NRMI小鼠中，并检查肾脏冷冻切片的颗粒相关荧光(图6和14A)。如图6A所示，可以在肾脏切片的所有肾小球上均匀地发现NPEXPAng-I荧光，而在其他肾脏结构(例如小管)中没有荧光。相反，对于非靶向NPMeO，在肾脏切片中几乎没能检测到NP荧光(图6B)。这表明简单的尺寸依赖性靶向不足以实现MC中的颗粒积累，因为NPMeO可能由于缺乏特异性细胞相互作用而从系膜中清除。更重要的是，作为靶向NP但不能介导细胞内化的NPEXP也显示出非常小的肾小球荧光(图14A)，这表明颗粒摄取是实现高MC积累的基础。此外，与缺少附着因子的NPAng-I相比，NPEXPAng-I实现了更强和均匀的肾小球分布(图14A)，表明在体内增强的靶细胞识别原理是非常有利的。
为了定量评估NP相关荧光并更好地区分不同颗粒制剂之间的差异，在更高的放大倍率下拍摄了肾小球的图像(图7A)。与在一些肾小球中仅显示出小的荧光点的非靶向对照颗粒(NPMeO)相比，具有增强识别机制的病毒模拟颗粒(NPEXPAng-I)的肾小球荧光定量分析产生了高15倍的荧光。
此外，NPEXPAng-I的积累显著高于单配体靶向颗粒(分别比NPEXP和NPAng-I高7倍和5倍)(图7B)。检测到的荧光与颗粒相关，这通过用于颗粒标记的游离染料(CF647)的肾脏分布证实，该染料显示出强的肾小管荧光但没有肾小球荧光(图14B)，因为它的尺寸小，因此可以自由过滤。为了评估NP肾小球分布，比较了外皮层和内皮层肾小球的荧光(图7C)。对于所有颗粒制剂，两个群体之间没有显著差异。这表明颗粒均匀分布在整个肾皮质的肾小球中，这是治疗肾小球相关疾病不可缺少的先决条件。最后，由于除了MC外，肾小球中还有其他可能内化NP的细胞，因此使用整合素-α8作为标志物对MC进行特异性抗体染色，以确定颗粒在MC中积累。如图7D所示，NPEXPAng-I荧光定位在抗体染色的MC内，证实颗粒不仅能够到达肾小球系膜，而且能够被MC摄取。
综上所述，这些结果清楚地表明，尺寸介导的靶向是到达系膜的必要先决条件，但不足以实现MC中的颗粒积累。NP内化似乎是避免系膜清除的必要条件，这解释了缺少这种特性的颗粒(NPMeO和NPEXP)导致最低的肾小球荧光。实施病毒模拟识别原理(NPAng-I)增加了NP特异性并导致颗粒摄取，进而导致更高的MC积累。然而，如体外研究所示，通过初始病毒样细胞附着(NPEXPAng-I)促进靶细胞识别显著增强了NP的靶向潜力，这是两种配体共同作用的结果。
此外，NPEXPAng-I的增强的官能化不会导致颗粒血液停留的减少。通常，纳米颗粒涂有聚合物如PEG，这增加了其循环时间并减少血浆蛋白吸附。一种积极作用，通常被配体官能化抵消，因为表达靶向受体的脱靶细胞可以结合并干扰NP。然而，在注射后一小时对血浆NP荧光的定量表明，NPEXPAng-I保持在循环中的程度与非靶向NPMeO相同，并且明显长于其他靶向制剂(图14C)。这可能是由于更复杂的细胞识别过程导致更高的颗粒特异性。总体而言，结果表明，通过密切模拟病毒结合和内化并将其与最佳NP尺寸相结合，可以开发靶向MC并在MC中大量积累的NP。
实施例6：材料和方法
材料
分子量为2000和5000g mol-1的异双官能羟基聚(乙二醇)羧酸(COOH-PEG2k/5k-OH)和分子量为2000g mol-1的羟基聚(乙二醇)Boc-胺(Boc-NH-PEG2k-OH)购自JenkemTechnology USA Inc.(艾伦,得克萨斯州,美国)，而分子量为5000g mol-1的甲氧基聚(乙二醇)(MeO-PEG5k-OH)和Resomer RG 502(PLGA)购自Sigma-Aldrich(陶夫基兴,德国)。EXP3174(也称为氯沙坦羧酸)购自Santa Cruz(海德堡,德国)，而Cyclic RGDfK(cRGDfK)购自Synpeptide Co.Ltd.(上海，中国)。AlexaFluorTM 568酰肼(Alexa568)、CellTrackerTMGreen Dye(CTG)和CellTrackerTM Deep Red Dye(CTDR)购自Thermo Fisher Scientific(施韦特,德国)。平均直径为2.2nm的胺官能化球形金纳米颗粒(Au2.2-NH2)获自NanopartzInc.(洛弗兰德,科罗拉多州,美国)。GoldEnhanceTM EM Plus试剂盒购自Nanoprobes(亚普汉克,纽约,美国)。山羊来源的整合素α-8抗体获自R&D Systems(明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。如果没有特别说明，所有其他化学品均为购自Sigma-Aldrich的分析级。超纯水获自Milli-Q水净化系统(Millipore，比勒利卡，马萨诸塞州，美国)。NCI-H295R(CRL-2128)和HeLa(CCL-2)细胞购自ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。所有细胞系均在含有10％胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)(1x)和100nM氢化可的松的RPMI 1640培养基中培养。
聚合物合成
COOH-PEG2k-PLA10k、Boc-NH-PEG5k-PLA10k和MeO-PEG5k-PLA10k嵌段共聚物通过如前所述的开环聚合合成。简而言之，将异双官能PEG聚合物(1当量＝equiv)与3,6-二甲基-1,4-二恶烷-2,5-二酮(70当量)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(3当量)混合。将聚合物混合物在室温(RT)搅拌1小时(h)，直到用苯甲酸(14当量)淬灭聚合。所得嵌段共聚物在乙醚中沉淀，通过过滤分离并在真空下干燥。使用Bruker Avance 300光谱仪(BrukerBioSpin GmbH，莱茵施泰滕，德国)在295K的氘代氯仿中测定合成聚合物的分子量。
为了制备cRGDfK-PEG2k-PLA聚合物，如前所示，将先前合成的COOH-PEG2k-PLA10k与cRGDfK的赖氨酸残基共价偶联。简而言之，将COOH-PEG2k-PLA10k(1当量)使用3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)-N,N-二甲基丙-1-胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(25当量)在室温下活化2小时，然后用β-巯基乙醇(BME)(30当量)淬灭。活化的聚合物与cRGDfK(3当量)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(10当量)在室温下反应24小时。在所得cRGDfK偶联聚合物在乙醚/甲醇(15:1 V/V))中沉淀后，使用millipore水(mpH2O)透析除去游离cRGDfK和过量反应物。
对于EXP3174-PEG5k-PLA10k，最初切割Boc-NH-PEG5k-PLA10k的Boc保护基团。简而言之，将Boc保护的聚合物溶解在二氯甲烷(DCM)/三氟乙酸(TFA)(1:1V/V)中。搅拌30分钟(min)后，使用饱和碳酸氢钠溶液中和过量的TFA。有机相用mpH2O洗涤，然后如上所述进行聚合物分离。
所得NH2-PEG5k-PLA10k通过咪唑组分的羰基残基与EXP3174偶联。将EXP3174(3.5当量)在室温下用N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)/NHS(3.3当量)活化2小时。通过离心除去所得二环己基脲后，添加NH2-PEG5k-PLA10k(1当量)和DIPEA(17.5当量)并在室温下反应24小时。将所得EXP3174-PEG5k-PLA10k在甲醇/乙醚(1:5V/V)中沉淀，然后将产物用乙醇/100mM硼酸盐缓冲液pH 8.5/水(1/1/8V/V)透析24小时，然后用mpH2O透析12小时，以除去未反应的EXP3174和过量的反应物。
用荧光染料标记的PLGA
对于颗粒可视化，在NP制备之前，将形成核的PLGA与荧光染料共价连接。为此，使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)作为催化剂将羧酸封端的PLGA活化2小时。然后将活化的PLGA与AlexaFluorTM568酰肼或CFTM 647胺在室温下反应24小时。将标记的PLGA用mpH2O透析24小时以除去未反应的荧光染料。
用纳米金标记的PLGA
对于电子显微镜分析，将PLGA与纳米金缀合。最初将PLGA在DCM中用EDC和NHS活化2小时。在减压下除去DCM后，将活化的PLGA溶解在DMSO中并与DIPEA和平均直径为2.2nm的冻干单氨基金纳米颗粒(Au2.2-NH2)混合。在室温下搅拌24小时后，将金缀合的PLGA在mpH2O中沉淀，通过在2500g下离心10分钟分离并冻干。
NP制备
使用常见的溶剂蒸发技术制造嵌段共聚物纳米颗粒。将相应量的PEG-PLA聚合物和PLGA以70/30(m/m)的比率混合，并在乙腈(ACN)中稀释至终浓度为10mg mL-1。为了达到异官能/同官能NP物质所需的配体表面密度，根据图18d/e中描绘的校准，将cRGDfK-PEG2k-PLA和/或EXP3174-PEG5k-PLA10k与COOH-PEG2k-PLA10k混合。然后将有机相逐滴加入到剧烈搅拌的10％Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(7.5mM，pH 7.4)中并在室温下搅拌3小时以除去有机溶剂。
使用Pall Microsep过滤器(截留分子量30kDa；Pall Corporation，纽约，美国)通过在1250g下离心25分钟来浓缩得到的NP分散体。为了获得制造的NP的质量浓度，使用比色碘络合测定法评估PEG含量。然后将NP冻干并进行重量分析以获得PEG含量和NP重量的比率。在以下实验中，该比率用于根据评估的每种NP物质的PEG含量计算质量浓度。
NP表征
使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern,黑伦贝格,德国)评估NP尺寸和ζ电位。使用PMAA半微量比色皿(DLS；Brand，韦特海姆，德国)或折叠毛细管池(ζ-电位；Malvern,黑伦贝格,德国)，在7.5mM DPBS中使用633nm He-Ne激光以173°(25℃，RT)的角度测量样品。
cRGDfK量化
基于精氨酸的测量评估NP表面上的cRGDfK水平。简而言之，将50μL NP样品(1mgmL-1)与175μL由9,10-菲醌(150μM乙醇溶液)和2N NaOH(6:1V/V)组成的工作溶液混合。在60℃下孵育3小时后，将1当量的样品与1当量的1N HCl混合，并在室温下再孵育1小时。最后，在激发波长为312/7nm和发射波长为395/7nm的SynergyTM Neo2多模式酶标仪(BioTekInstrument Inc.，威努斯基，佛蒙特州，美国)上测量荧光。cRGDfK(0-40μg mL-1)的稀释液用作校准品。确定cRGDfK摩尔浓度以及摩尔cRGDfK含量与摩尔PEG含量的比率，并相对于理论值作图(图18d)。
EXP3174量化
为了确定制造的颗粒上EXP3174的表面水平，将1当量的NP样品(1mg mL-1)与10当量的0.2M乙酸混合。EXP3174在0.2M乙酸中的稀释液(0-30μM)用作校准品。在SynergyTMNeo2多模式酶标仪(见上文)(激发250/10nm，发射370/5nm)上测量样品和标准品的荧光。测定EXP3174摩尔浓度以及EXP3174摩尔含量与PEG摩尔含量的比率，并相对于理论值作图(图18e)。
钙动员测定
为了研究NP的AT1r结合，使用fura-2作为Ca2+螯合剂测量细胞内钙水平。简而言之，将rMC与5μM fura-2AM、2.5mM丙磺舒和0.05％Pluronics F-127在Leibovitz的L-15培养基中在室温下孵育1小时。然后将细胞离心(5分钟，200g，RT)并重悬在Leibovitz的培养基中。将45μL的不同浓度的NP或游离EXP3174移入96孔板(Greiner Bio One，弗里肯豪森，德国)，然后加入45μL rMC悬浮液(2x106mL-1)。接下来，将细胞与样品在室温下孵育45分钟。孵育后，将10μL的30nM AT II添加到每个孔中以活化未抑制的AT1r，从而诱导Ca2+流入细胞胞质溶胶。使用FluoStar Omega荧光酶标仪(BMG Labtech，奥尔滕贝格，德国)测量注射之后前30秒内的荧光信号，分别为激发滤波器340/20nm和380/20nm，发射滤波器510/20nm。通过将负载细胞与0.1％Triton-X 100一起孵育并如上所述测量荧光水平来评估Ca2+-结合与Ca2+-未结合Fura-2的最大比率。类似地，通过与0.1％Triton-X 100和45mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)一起孵育来实现最小比率。使用Grynkiewicz等的方程计算每个样品的细胞内钙水平。使用GraphPad Prism(圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)并应用S型剂量反应方程(可变斜率)计算半数最大抑制浓度(IC50)。
CLSM分析
为了详细分析NP细胞相互作用，将rMC以15.000个细胞/孔的密度接种到8孔载玻片(Ibidi，格雷弗尔芬，德国)中，并在37℃下孵育24小时。为了便于细胞胞质溶胶的可视化，在接种前，将rMC在无血清RPMI 1640培养基中用CTDR(25μM，45分钟，37℃)染色。使用AlexaFluorTM 568标记的PLGA制造NP，并在补充有0.1％BSA的Leibovitz缓冲液中调整为0.05mg mL-1。将系膜细胞与250μL NP在37℃下孵育15、45和90分钟，用预热的DPBS洗涤，并用4％多聚甲醛(PFA)的DPBS溶液固定10分钟。在最后的洗涤步骤之后，使用Zeiss LSM 710(Carl Zeiss Microscopy GmbH，耶拿，德国)分析固定的样品。
流式细胞术
为了评估NP样品的系膜细胞结合，将rMC以40.000个细胞/孔的密度接种到24孔板(Greiner Bio One，弗里肯豪森，德国)中，并在37℃下孵育48小时。使用CFTM 647标记的PLGA制造NP，并在补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的Leibovitz缓冲液中调整为0.05mg NPmL-1。为了确认NP细胞进入的αVβ3依赖性，在NP孵育前，将300μL游离cRGDfK(c＝500μM)添加到相关细胞样品中15分钟。用DPBS洗涤细胞，并在37℃下添加300μL预热的NP溶液60分钟。对于时间依赖性摄取的相应分析，将细胞孵育120分钟，在0、15、30、45、60、90和120分钟后去除NP。将细胞用DPBS洗涤、胰蛋白酶消化并在200g和4℃下离心5分钟，然后再进行两次洗涤和离心步骤(DPBS，200g，5分钟，4℃)。最终样品在DPBS中重悬，并使用FACS Calibur细胞仪(Becton Dickinson，富兰克林湖，新泽西州，美国)进行分析。NP相关荧光在633nm处激发，并记录了相应的发射(661/16带通滤波器)。使用Flowing软件2.5.1(Turku Center forBiotechnology，图尔库，芬兰)分析流式细胞术数据。在活细胞群中，评估了细胞相关荧光的几何平均值。
透射电子显微镜
为了评估NP的细胞定位，将rMC以12.000个细胞/孔的密度接种到24孔板中并孵育72小时。将包含纳米金缀合的PLGA的NP制剂在包含0.1％BSA的Leibovitz缓冲液中稀释，并以0.05mg mL-1的浓度(V＝300μL)添加45分钟。孵育后，样品用DPBS洗涤并制备用于电子显微镜分析。简而言之，将细胞用0.1M二甲胂酸钠溶液(Caco缓冲液)中的2.5％PFA和2.5％戊二醛在室温下固定60分钟，用Caco缓冲液洗涤并用DPBS中的0.1％Triton-X透化10分钟。在使用mpH2O的洗涤步骤后，根据制造商的说明，使用GoldEnhanceTM EM Plus试剂盒(Nanoprobes Inc.，亚普汉克，纽约，美国)对样品进行金增强，然后在2.5％硫代硫酸钠的mpH2O溶液中进一步洗涤和后固定。将细胞用0.5％四氧化锇染色，并在浓度升高的乙醇(50–99.5％)中脱水。对于复染，在70％乙醇浓度下使用2％醋酸铀酰5分钟。包埋在Epon中后，使用100kV Zeiss Libra 120电子显微镜(Carl Zeiss NTS GmbH，上科亨，德国)以6300x和12500x的放大倍数对150nm的超薄切片进行成像。
共培养实验
为了评估制造的NP的细胞选择性，本发明人使用了本发明人先前实施的共培养设计。对于流式细胞术分析，将rMC与HeLa或NCI-H295R细胞一起接种在24孔板中，密度分别为10.000和75.000个细胞/孔，并在37℃下孵育48小时。为了区分细胞类型，在接种前用无血清RPMI 1640培养基中的CTG(15μM，45分钟，37℃)对rMC进行染色。然后将共培养的细胞与浓度为0.05mg mL-1(V＝300μL)CFTM647标记的NP一起孵育45分钟。如上所述进行样品制备和流式细胞术分析。此外，rMC相关荧光在488nm处激发，并使用530/30带通滤波器记录。在数据分析期间，对染色的rMC细胞的活细胞群进一步进行设门，并就细胞特异性分析NP相关荧光。
对于CLSM分析，如上所述在接种前对rMC细胞进行CTG染色。为了可视化所有细胞类型，HeLa或NCI-H295R细胞也使用CTDR(25μM，45分钟，37℃)染色。在CellTrackerTM孵育后，将rMC与HeLa/NCI-H295R细胞一起以2.000和10.000/20.000个细胞/孔的密度接种到8孔Ibidi载玻片中。在37℃下孵育48小时后，细胞核用Hoechst 33258(DPBS中5μg mL-1)染色20分钟。用预热的DPBS洗涤细胞两次，并在37℃下以0.05mg mL-1的浓度(V＝250μL)添加AlexaFluorTM568标记的NP 45分钟。在NP孵育后，如上所述处理样品并使用Zeiss LSM 710显微镜进行分析。
体内细胞靶向
动物实验根据国家和机构指南进行，并得到地方当局的批准(Regierung vonUnterfranken，参考号：55.2-2532-2-329)。雌性10周龄的NMRI小鼠(Charles River，苏尔茨费尔德，德国)用作模型动物。用丁丙诺啡(0.1mg kg体重-1)镇痛后，将小鼠用2.5％异氟醚麻醉，并通过颈静脉注射100μL CFTM 647标记的NP(c＝120nM)。将小鼠保持麻醉并且5分钟后，通过i.v.穿刺采集初始血液样品。60分钟后，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠，采集最终血液样品，并通过灌注固定杀死动物。取出两个肾脏并立即转移到18％蔗糖和14％PFA的磷酸盐缓冲液(0.1M pH 7.4)的溶液中。6小时后，将肾脏用DPBS洗涤并在-80℃冷冻保护直至进一步处理。对于冷冻切片，将器官包埋在Tissue
Figure BDA0003680978190000302
O.C.T.TM化合物(Sakura Finetek，托伦斯，加利福尼亚州，美国)中，使用CryStar NX70冷冻切片机(Thermo FisherScientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)切成5μm切片并固定在SuperfrostTM plus载玻片(Thermo Fisher Scientific，施韦特，德国)上。为了分析NP肾脏沉积和肾小球荧光定量，将切片在DPBS中冲洗，并在室温下用补充有0.04％Triton-X的5％BSA的DPBS溶液封闭10分钟。在DPBS中进一步冲洗后，用4',6-二脒-2'-苯吲哚二盐酸盐(DAPI)在0.5％BSA和0.04％Triton-X的DPBS溶液中的1:400稀释液对样品进行细胞核染色。分别在DPBS和mpH2O中进行最后一次洗涤后，将冷冻切片用Mowiol封固剂封固，并在Zeiss Axiovert 200M上进行分析。对于图像分析，使用了Fiji软件(Madison，威斯康星州，美国)。通过测量超过一定荧光阈值的区域的积分密度并除以肾小球区域来评估肾小球荧光强度。为了评估NP的确切细胞位置，如上所述制备肾冷冻切片。洗涤和封闭切片后，将样品在4℃下用山羊来源的整合素α-8抗体(在0.5％BSA/0.04％Triton-X的DPBS溶液中1:200稀释)染色过夜。随后用DPBS洗涤样品，并用
Figure BDA0003680978190000301
驴抗山羊和DAPI的0.5％BSA/0.04％Triton-X的DPBS溶液的1:400稀释液在室温下染色1小时。在最后的洗涤步骤之后，样品在Zeiss LSM 710上封固和分析。
实施例7：使用模块化概念制备异多价EXPcRGD NP
本实施例中提及的所有材料和方法均如实施例6中所述。
为了产生具有期望腺病毒模拟特性的NP，本发明人实施了一种模块化设计，该设计基于将不同生物相容性聚合物组分协同组合成异多价颗粒物质(图18a)。NP的总体聚合物组成旨在类似于本发明人先前的甲型流感模拟NP设计，以便能够充分比较两种靶向概念。因此，广泛建立的聚(乳酸-共乙醇酸)(PLGA)形成疏水的NP核，不仅保证了水介质中增强的结构完整性，而且还允许通过荧光染料或纳米金的偶联来实现NP可视化。聚(乙二醇)-聚(乳酸)(PEG-PLA)嵌段共聚物作为第二组分提供了实现所追求的病毒模拟NP设计所需的结构柔性。在第一步中，通过先前描述的开环聚合合成具有较长(PEG5k-PLA10k)或较短(PEG2k-PLA10k)PEG链的PEG-PLA聚合物(图25a)。由于EXP3174最初旨在作为自由移动的配体结合系膜AT1r，因此它与更长且因此更柔性的PEG5k-PLA10k链共价偶联(图25b)。相比之下，第二配体(cRGDfK)不应与表面结合的整合素相互作用，除非发生第一AT1r结合和随后的NP空间接近。在这方面，其连接到较短的PEG2k-PLA10k(图25c)。cRGDfK和EXP3174二者的表面密度可以通过在通过纳米沉淀制造NP之前将不同量的配体官能化或非官能化PEG-PLA聚合物与PLGA混合来精确调节(图18d/e)。
本发明人决定制备在其表面上携带25％EXP3174和15％cRGDfK的异官能纳米颗粒(EXPcRGD NP)，从而充分利用配体的受体结合能力，但保持制造的颗粒的结构完整性。颗粒应该能够通过空间柔性EXP3174与AT1r结合来定位靶细胞，然后降低到细胞表面的空间距离，随后通过先前隐藏的cRGDfK活化αVβ3整合素，最终启动NP内吞作用(图17c)。异官能EXPcRGD NP以及同官能(EXP NP/cRGD NP)和非官能化的甲氧基封端颗粒(对照NP)在60nm的尺寸阈值以下制造并显示负ζ电位值(图18b/C)。这些特征不仅应有助于通过内皮窗孔成功外渗(图17a/b)，而且还应防止NP吞噬作用或延长血清蛋白吸附。
实施例8：异多价EXPcRGD NP对靶基序表现出优异的配体亲和力
本实施例中提及的所有材料和方法均如实施例6和7中所述。
本发明人测试了EXP3174介导的NP与大鼠系膜细胞(rMC)表达的AT1r的结合。由于Gq偶联AT1r与其主要配体血管紧张素II(AT II)的活化导致钙流入细胞胞质溶胶，因此ATII刺激后的细胞内Ca2+水平可用作NP孵育后AT1r活性的标志物。因此，低受体活性表明高比率的结合的EXP3174，因为配体本身充当有效的拮抗剂。图19显示已与NP或游离EXP3174预孵育45分钟的AT II刺激的rMC的细胞内的Ca2+水平。EXPcRGD NP(IC50＝276±31pM)和EXPNP(IC50＝552±73pM)均显示出优异的AT1r亲和力，导致在皮摩尔范围内对受体的高效抑制和因此最低的胞内Ca2+水平(图19a)。此外，携带EXP3174的NP类型的抑制效力甚至高于游离配体(IC50＝2.66±0.9nM)。这有力地表明EXP3174官能化颗粒能够以多价方式与靶受体相互作用，从而获得整体亲和力。由于发现EXPcRGD和EXP NP二者的IC50水平在相同范围内，本发明人得出结论，EXP3174和cRGDfK在一种颗粒类型中的组合不会显著干扰EXP3174本身的结合能力。此外，对照NP和cRGD NP没有显示出与AT1r的任何相互作用，从而在受体刺激后产生最大的Ca2+信号，并证实了测定对AT1r的特异性(图19b)。
验证了腺病毒模拟EXPcRGD NP的AT1r结合能力后，下一步是研究颗粒通过cRGDfK-αVβ3相互作用摄取到rMC中。因此，本发明人用荧光标记的NP孵育系膜细胞并通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析细胞分布。为了使细胞体可视化，用CellTrackerTM DeepRed(CTDR)预处理rMC。图20a显示了AlexaFluorTM568标记的EXPcRGD NP在代表内吞囊泡的球形结构中的强烈细胞内积累。随着时间的推移，可见积累的数量和强度都增加了。此外，随着孵育时间的延长，囊泡似乎变大。这些发现支持cRGDfK官能化的NP能够结合靶细胞并通过整合素介导的内吞被摄取到细胞内囊泡中。随着时间的推移，这些内吞囊泡与更大的内体融合，因此尺寸和强度都会增加。
在CLSM结果的基础上，本发明人对NP处理的rMC进行了流式细胞术分析，并在120分钟的孵育期内确定了细胞相关荧光。如图20b所示，在整个孵育期间，与所有其他NP物质相比，EXPcRGD NP的NP来源荧光水平最大。虽然EXP NP和对照NP仅显示出中等荧光信号，但对于cRGD NP可以检测到大量的细胞结合。值得注意的是，各自的荧光水平在约60分钟后达到一个平台，而EXPcRGD NP的细胞结合进一步增加。这有力地支持了EXPcRGD NP与其靶细胞之间的顺序相互作用的假设，与同官能的cRGD NP相比，这导致荧光水平的增加延长。
为了研究αVβ3整合素对EXPcRGD NP细胞摄取的影响，在将rMC与EXPcRGD NP孵育60分钟之前，加入过量的游离cRGDfK(c＝500μM)。结果，细胞相关荧光水平急剧下降至与EXP NP或对照NP相当的水平(图20c)。异多价颗粒显然不再能够寻址必要的αVβ3整合素，因此在AT1r结合后基本上不能启动内吞。
为了进一步验证整合素介导的NP内吞的概念，本发明人决定利用透射电子显微镜(TEM)，这使得能够在高得多的放大率水平下评估NP-细胞相互作用。为了增加所施用的NP的电子密度和相应的TEM可见性，将平均直径为2.2nm的超小金纳米颗粒与PLGA共价偶联，然后用于进一步的NP制造(图26)。然后可以对与这些金标记的NP孵育的系膜细胞进行金增强，以增强并因此可视化颗粒的金核并评估它们的确切位置。这种回顾性的金增强提供了巨大的优势，即纳米金标记的NP的物理化学特性与未标记的NP没有显著差异，而通常使用的金NP不会出现这种情况。
图21a显示了已与金标记的EXPcRGD NP一起孵育的两个系膜细胞的细胞体。在细胞胞质溶胶中，可以检测到许多充满金增强NP的圆形囊泡。分布模式显示出与先前描述的CLSM结果显著相似(图20a)，从而强烈支持配体介导的NP内吞。此外，观察到颗粒在细胞边界积累，表明这些NP仍然与定位于膜的表面结构结合。这些发现进一步表明，施用的EXPcRGD NP在先与AT1r结合和随后的整合素介导的内吞的逐步过程中与靶细胞相互作用。根据该评估，没有表面结合的cRGDfK的EXP NP只能在rMC膜上检测到，而在内吞囊泡中没有发现颗粒积累(图21b)。此外，对照NP的细胞-颗粒结合只是微不足道的(图21c)。应用金增强的特异性表现在无颗粒的细胞中没有金积累。
实施例9：配体协同作用导致体外系膜细胞选择性增强
本实施例中提及的所有材料和方法均如实施例6至8中所述。
已经证明异多价EXPcRGD NP协同结合其表面配体的两种关键特征并以空间控制的方式呈现它们，本发明人打算证明这种设计实际上可以用于增加系膜细胞选择性。因此，本发明人实施了基于体外的测定，其中靶rMC与大量(5-10倍)不携带或仅携带两种靶受体中的一种的脱靶细胞共培养。HeLa细胞不在显著程度上表达AT1r或αVβ3-整合素，选择了NCI-H295R细胞，因为它们显示出高AT1r但低αVβ3表达(图27)。
为了在CLSM分析中区分共培养的细胞，使用CellTrackerTM Green(CTG)对rMC进行染色，同时用CTDR标记脱靶细胞。在与荧光标记的EXPcRGD NP孵育45分钟后，评估了NP的细胞分布。在rMC/HeLa共培养模型中，几乎仅可以在系膜细胞区域内检测到颗粒来源的荧光。相比之下，HeLa细胞仅显示出与NP的弱相互作用，导致边缘荧光水平(图22a)。本发明人据此得出结论，由于细胞表面受体表达的差异，EXPcRGD NP可以从HeLa细胞中选择性地定位系膜细胞。这些发现得到流式细胞术分析的支持，其显示rMC中EXPcRGD NP的细胞相关荧光显著高于脱靶HeLa细胞，而对照NP的细胞相互作用对于两种细胞类型来说仅是微不足道(图22b)。相比之下，rMC/NCI-H295R共培养提供了不同的颗粒分布。NP相关荧光不仅可以在rMC中发现，而且可以在NCI-H295R细胞覆盖的区域中发现。然而，分布模式显著不同。虽然在如前所见的圆形、囊泡样结构中发现了rMC中的荧光，但与NCI-H295R相关的荧光更加扩散并且主要在细胞膜处增强(图22a)。因此，本发明人得出结论，虽然EXPcRGD NP在rMC的内吞囊泡中积累，但仅能够结合存在于NCI-H295R细胞的细胞膜中的AT1r，但由于缺乏αVβ3整合素而不能被摄取到细胞质中。此外，流式细胞术分析表明，尽管NCI-H295R细胞的NP相关荧光比HeLa细胞更高，但EXPcRGD NP在系膜细胞中仍显示出显著增强的信号(图22c)。值得注意的是，在NP孵育之前添加过量的游离EXP3174(c＝1mM)导致NCI-H295R细胞的荧光水平急剧下降，而rMC的细胞相关荧光仍然显著较高。这一观察进一步支持了EXPcRGD NP实际上能够利用两种表面配体靶向系膜细胞，从而从异官能设计中获益的观点。
总之，本发明人的共培养模型证明，异多价EXPcRGD NP具有在存在脱靶细胞(这些脱靶细胞不仅在数量上占优势，而且甚至表达两种靶受体中的一种)的情况下有效识别受体阳性系膜细胞的能力。
实施例10:腺病毒模拟EXPcRGD NP在系膜细胞中的体内积累
本实施例中提及的所有材料和方法均如实施例6至9中所述。
rMC结合和摄取研究二者成功地表明，本发明人关于顺序配体-受体相互作用的病毒模拟概念使异多价EXPcRGD NP能够在体外选择性地靶向系膜细胞。然而，将体外结果转移到具有足够体内效率的稳健系统已被证明是纳米颗粒设计的主要障碍，因为许多策略无法提供期望的靶标特异性。因此，本发明人决定评估NP在体内实际到达系膜区域的能力，这不仅需要主动细胞摄取的促进，还需要在靶区域中足够的被动积累。在这方面，将荧光标记的NP注射到10周龄的雌性NMRI小鼠中。NP循环1小时后，处死小鼠，取出肾脏。制备的冷冻切片的荧光分析表明，EXPcRGD NP有效地积累在肾小球区域，而肾小管部分的荧光可忽略不计(图23)。相反，对照NP以及同官能EXP或cRGD NP在肾脏冷冻切片中显示出相当低的沉积。
为了量化观察到的差异，通过评估所有NP类型的每个区域的肾小球荧光强度来确定肾小球相关的荧光水平(图24a/b)。因此，与对照NP相比，EXPcRGD NP的荧光强度增加了10倍以上。此外，异多价NP的肾小球积累明显大于两种同官能NP类型。值得注意的是，cRGDNP荧光甚至低于非官能化对照NP。本发明人假设cRGD NP不能到达肾小球区域，因为在注射后不久，大量的颗粒结合表达αVβ3的内皮细胞并因此在到达肾脏更深区域之前离开血流。这一假设得到以下发现的进一步支持：在所有颗粒类型中，孵育1小时后cRGD NP的相对血浆水平最低(图28a)。相反，在EXPcRGD NP中，较短的cRGDfK官能化PEG-PLA链通过添加较长的EXP3174官能化PEG-PLA链来防止过早暴露于αVβ3整合素。因此，异多价颗粒避免了脱靶沉积，因此成功到达肾脏内的肾小球区域。系膜细胞标志物整合素-α8的抗体染色进一步揭示了肾小球中的EXPcRGD NP相关荧光几乎可以完全在系膜细胞内发现(图24c)，证明了外渗到系膜间质和随后内吞的假设(图17a/b)。为了验证系膜区域中检测到的荧光来源于结构完整的NP，本发明人另外将相当剂量的游离荧光染料注入小鼠并分析荧光沉积。虽然这些样品的肾小球内信号可以忽略不计，但肾小管细胞表现出非常强的荧光水平(图28b)。这表明，与注射的NP物质相比，低分子染料是肾过滤的。因此，本发明人得出结论，所有NP类型的肾小球内荧光源自完整颗粒，因为否则降解将导致管状信号增加。
因此，本文讨论的体内研究成功地证明了本发明的新型腺病毒模拟NP设计的潜力。异多价EXPcRGD NP有效地积累在肾小球的系膜区域，而同官能或未官能化的NP物质则没能如此。这有力地表明，为了达到足够的生物利用度水平，NP不仅必须携带适当的表面配体，而且还必须以适合各自靶向策略的协调方式呈现它们。此外，NP在系膜中的积累也证明了空间控制的颗粒-细胞相互作用的腺病毒模拟系统是非常有效的。
实施例11：负载西那西呱的EXPcRGD NP显示出高效率
检测到使用甲型流感模拟或腺病毒模拟靶细胞识别概念的纳米颗粒(NP)在体内环境中有效地积累在系膜细胞内。在下一步中，将实验药物西那西呱(BAY 58-2667)封装在腺病毒模拟EXPcRGD NP中。西那西呱(CCG)是可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的有效活化剂，在糖尿病动物模型中已被证明可显著减少系膜纤维化并减少肾小球损伤。通过将CCG封装在发明人有前途的NP物质中，CCG向病理性系膜部位的细胞选择性递送可以显著增加，从而提高治疗效果，同时最大限度地减少脱靶效应(图29)。
在发明人的实验装置中，CCG最初被封装在异多价EXPcRGD NP中。所得NP每个NP携带约500-700个CCG分子(数据未显示)。在以下所有实验中，将2μM浓度的游离西那西呱的施用与浓度为约0.5nM的负载CCG的EXPcRGD NP(相当于0.2μM CCG)和不含药物的EXPcRGD对照NP进行比较(图30)。游离西那西呱的该浓度根据先前的出版物选择，该出版物显示CCG在该浓度范围内具有抗纤维化作用。然而，携带CCG的NP仅携带各自CCG量的10％以测试可能的药物递送效果。
为了评估负载CCG的EXPcRGD NP对靶sGC的影响，最初将系膜细胞孵育24小时，并使用蛋白质印迹分析评估蛋白质量。有趣的是，在与游离药物和负载CCG的NP二者孵育后，sGC的总量因此逐渐增加，这不仅表明了先前显示的活化，而且表明了西那西呱对sGC的稳定作用(图31)。相反，缺少西那西呱的NP对sGC水平没有任何显著影响。
最后，分析了NP辅助CCG递送的抗纤维化和抗增殖潜力。在这方面，系膜细胞最初与游离CCG、负载CCG的EXPcRGD NP或没有封装药物的对照NP一起孵育4小时。4小时后，加入10ng mL-1转化生长因子β(TGF-β)48小时以诱导纤维化和过度增殖性重塑。虽然TGF-β的施用导致系膜细胞增殖显著增加，但与游离CCG和负载CCG的NP预孵育可以显著逆转这种效应(图32)。此外，纤维化标志物α-SMA和胶原蛋白I的蛋白质印迹和荧光显微镜分析揭示了CCG(负载的NP)对抑制系膜细胞促纤维化重塑的类似作用。
总之，这些结果揭示了两个主要结果：
1.游离和NP封装的西那西呱都显示出对其靶酶sGC的显著影响，导致所述抗纤维化途径的显著活化(图29)。这些结果与先前关于CCG的发现一致，并显示了治疗剂在抗纤维化治疗中的显著潜力。
2.在所有实验中，即使封装的CCG的总量仅为游离药物剂量的10％(0.2μM对比于2μM)，负载西那西呱的EXPcRGD NP的效果与施用游离CCG的效果相当。这表明所描述的NP在更有效地将药剂递送至其预期的细胞内靶标方面具有相当大的潜力。
参考文献
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在说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地或以其任意组合成为以各种形式实现本发明的材料。
序列表
<110> 雷根斯堡大学
<120> 病毒模拟纳米颗粒
<130> FSP1V223205JW
<150> EP19 219 424.9
<151> 2019-12-23
<160> 1
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 环肽
<400> 1
Arg Gly Asp Phe Lys
1 5

Claims (17)

1.一种纳米颗粒，包含纳米材料和至少第一配体和第二配体，
-其中所述第一配体能够介导所述纳米颗粒附着于靶细胞，并且
-其中所述第二配体能够介导所述纳米颗粒内化到所述靶细胞中，并且
-其中，优选地，所述纳米材料包含以下中的任意：聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、恶唑啉衍生聚合物、聚(氨基酸)、多糖、磷脂、鞘脂、胆固醇、PEG-脂质、嵌段共聚物如PEG-PLA或PEG-聚己内酯、无机物质如金或量子点材料，及其组合。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述第一配体是与GPCR例如血管紧张素II受体1型(AT1r)、人神经肽Y1受体和C-X-C趋化因子受体4型结合的非激动剂，和/或与靶细胞表面上的糖蛋白和/或糖脂例如硫酸乙酰肝素、唾液酸糖蛋白、神经节苷脂和甘露糖受体结合的试剂，优选为EXP3174或替米沙坦。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述第二配体是以下中的任意：i)与整合素例如αVβ3整合素或αVβ5整合素结合的试剂，优选选自RGD、具有SEQ ID NO.1的序列的环状RGD肽及其衍生物，ii)与GPCR例如AT1r结合的激动剂，优选活化的血管紧张素-II，iii)与胞外酶例如天冬氨酸内肽酶、膜型基质金属蛋白酶和血管紧张素转化酶(ACE)结合的试剂，优选血管紧张素-I，和/或iv)与转铁蛋白受体结合的试剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，还包含治疗剂，优选吡非尼酮和西那西呱中的任意。
5.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一配体和所述第二配体各自与所述纳米材料偶联，优选各自与所述纳米材料的嵌段共聚物链偶联。
6.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米材料包含多于一个嵌段共聚物链，并且其中所述第一配体与所述纳米材料的第一嵌段共聚物链偶联并且所述第二配体与所述纳米材料的第二嵌段共聚物链偶联，并且其中所述第一嵌段共聚物链比所述第二嵌段共聚物链长，优选比所述第二嵌段共聚物链长至少1.5倍，更优选比所述第二嵌段共聚物链长至少3倍。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其中所述第一嵌段共聚物链包含1k至20k、优选1k至10k范围内的PEG，和/或包含5k至40k、优选10k至20k范围内的PLA，任选地其中所述第一嵌段共聚物链是PEG5k-PLA10k并且所述第二嵌段共聚物链是PEG2k-PLA10k。
8.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第二配体在所述纳米颗粒内化到所述靶细胞中之前被酶促活化。
9.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述靶细胞选自系膜细胞、内皮细胞如视网膜内皮细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞和肿瘤细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有5nm至1000nm、优选10nm至150nm、更优选20nm至100nm的尺寸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述第一配体与所述第二配体的比率在2:1至1:2的范围内，优选为1:1。
12.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒对靶向受体的颗粒亲和力为1pM至100nM，优选50pM至1nM。
13.根据前述权利要求中任一项所述的纳米颗粒，其中所述纳米材料包含PEG，并且其中所述纳米颗粒具有至少5％、优选至少15％、更优选至少25％的配体/PEG的配体密度。
14.如前述权利要求中任一项所定义的纳米颗粒，其用作药物或诊断剂。
15.如前述权利要求中任一项所定义的纳米颗粒，其用于预防或治疗选自糖尿病肾病、肾小球肾炎、肾小球VEGF A失调、内皮VEGF A失调、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性和癌症如乳腺癌的疾病的方法。
16.制备如权利要求1至13中任一项所定义的纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
a)以任何顺序提供一种或多种纳米材料，其优选包含以下任意：聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、恶唑啉衍生聚合物、聚(氨基酸)、多糖、磷脂、鞘脂、胆固醇、PEG-脂质，嵌段共聚物如PEG-PLA或PEG-聚己内酯，无机物质如金或量子点材料，及其组合，以及任选的治疗剂；
b)任选地，由所述一种或多种纳米材料中的任意制备嵌段共聚物；
c)在一个或多个步骤中使第一配体和第二配体与其偶联，优选通过DCC/NHS-或EDC/NHS-偶联；
d)提供治疗剂，优选亲脂性治疗剂，如果在步骤a)中未提供的话；
e)使用与所述纳米材料偶联的配体和所述治疗剂制备和获得纳米颗粒，优选通过纳米沉淀。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤e)中的所述获得包括获得多分散指数为0.01至0.5，优选0.01至0.3，更优选0.01至0.1的纳米颗粒。
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