JP7841771B2 - 高腫大循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃａｍｌ）を有する対象における多臓器転移性疾患及び全生存期間及び無増悪生存期間を予測する方法 - Google Patents
高腫大循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃａｍｌ）を有する対象における多臓器転移性疾患及び全生存期間及び無増悪生存期間を予測する方法Info
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Description
本発明は、包括的には、癌に関する診断、並びに多巣転移性疾患（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）等の癌に罹患している対象における全生存期間及び無増悪生存期間に関する予測を行うための、血液及び他の体液中のバイオマーカーの使用に関する。
腫瘍細胞は、原発性固形腫瘍から離脱すると、血液やリンパ液循環に浸透し、最終的には、血流を離れて臓器や組織に入り、転移する。癌に関連する死亡の９０％は、転移プロセスによるものである。最も一般的な転移部位は、肺、肝臓、骨、脳である。循環中に発見される腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）と呼ばれる。多くの研究発表や臨床試験は、（ｉ）血流中のＣＴＣを列挙（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）することにより、予後の生存や癌の再発に関する情報が提供され、及び（ｉｉ）タンパク質の発現レベル、ＣＴＣ中の遺伝子変異や転座の発生を調べることにより、治療に関する情報が提供されるとい点において、ＣＴＣが臨床的に有用であることを示している。しかしながら、ステージＩＶの癌患者であっても、ＣＴＣと、対象の癌の発症及び／又は存在との関連性に一貫性があるわけではない。ＣＴＣは、小細胞肺癌や乳癌、前立腺癌、大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）のステージＩＶで最も頻繁に発見されるが、これらの癌の早期ステージでは、稀である。また、ＣＴＣは、他の癌でも稀である。
循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ：ＣＡＭＬ）は、癌に罹患している対象の血液中に認められる他の癌関連細胞である。ＣＡＭＬは、検査された全ての固形腫瘍及び全ての病期の癌と関連している。ＣＡＭＬは、倍数体であり、サイズは約２５μｍから３００μｍ以上と非常に大きい。これらの倍数体細胞は、ＣＤ４５（－）又はＣＤ４５（＋）であり、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ３１を発現することがあり、骨髄系であることが確認されている。これらの細胞は、ＣＴＣや細胞残屑を飲み込む過程で発見されることが多い［１，７］。
精密腫瘍学の分野では、進行性転移と非進行性転移を区別できる予測バイオマーカーを同定することは、依然として困難である［１１］。多臓器転移に伴って生存期間が著しく短くなるため、これらの患者集団を予測できるバイオマーカーが必要とされている［１０，１１］。ＣＡＭＬに関する先行研究は、複数の固形悪性腫瘍における普遍的で侵襲の少ない血液ベースの予後予測バイオマーカーとして、これらの細胞を使用できることを示唆している［１，９］。
血液及び他の体液中のＣＡＭＬ等のバイオマーカーの同定及び特性判定に関連するアッセイは、予後情報を提供するために使用できる。本発明は、このようなツールを臨床医および他の重要な目的に対して提供することに係るものである。
本発明は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫等の固形腫瘍を有する対象の血液中に見出される、特異的な特徴を有する細胞の一種を使用する方法に係る。これらの循環細胞は「癌関連マクロファージ様細胞」（Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ：ＣＡＭＬ）と呼ばれ、癌に罹患している対象の固形腫瘍の存在と関連することが判明している。これまで、ＣＡＭＬに関連する５つの形態が特徴付けられ、記述されている［１，２］。ＣＡＭＬは、循環間質細胞のサブタイプであり、孔径が精密なマイクロフィルターを用いたサイズ排除に基づく精密濾過によって、ステージＩからステージＩＶの固形腫瘍を有する対象の末梢血から一貫して検出されている［１］。
ＣＡＭＬに関連する医療用途としては、以下に限定されるものではないが、癌の早期発見や診断、特に癌の再発や再燃の早期発見や診断、癌変異の判定を行うためのバイオマーカーとしての細胞の使用が挙げられる。また、ＣＡＭＬは、病気の進行や患者の生存を予測するバイオマーカーとしても臨床的に有用であることが明らかになっている。
多臓器転移を有する患者は、単臓器転移を有する患者よりも予後が悪く、腫瘍の負担が大きい［１］。５０μｍ以上のサイズのＣＡＭＬは、予後不良を予測することが多くの研究で示されているが、これらの研究のメタアナリシスは、高腫大（又は極度に肥大した）ＣＡＭＬ（ｈｙｐｅｒ－ｅｎｇｏｒｇｅｄ ＣＡＭＬ：ｈｅＣＡＭＬ）、すなわち、１００μｍ以上のサイズの細胞が、多巣転移性疾患及び非転移性疾患、並びに更に悪い予後に関連することを示唆している［９］。ここに提示する実験的証拠に示されるように、癌患者におけるｈｅＣＡＭＬの存在は、多臓器転移、並びに無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）の短縮と相関する。
第１の実施形態において、本発明は、対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を診断する方法に係る。この方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を有すると診断される。
第２の実施形態において、本発明は、対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患の発症を予測する方法に係る。この方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を発症すると予測する。
第３の実施形態において、本発明は、ＣＡＭＬ細胞サイズに基づいて、癌に罹患している対象の全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法を提供する。この方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象は、同じ癌又は類似の癌に罹患しているが対応するサンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上でない対象よりも、ＯＳが短く及び／又はＰＦＳが短いと予測する。すなわち、より大きなサイズのＣＡＭＬを有する対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、より小さなサイズのＣＡＭＬを有する対象のＯＳ及び／又はＰＦＳよりも少ない又は短いと予測する。いくつかの局面において、癌は、多臓器転移又は多巣転移性疾患である。
一局面において、本方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、癌に罹患しているがサイズが約１００μｍ以上のＣＡＭＬがない対象よりも、少ない又は短いと予測する。
本発明の実施形態のいくつかの局面において、ＯＳ若しくはＰＦＳ又はその両方は、少なくとも１２箇月である。本発明の実施形態の他の態様において、ＯＳ若しくはＰＦＳ又はその両方は、少なくとも２４箇月である。
本発明の実施形態のいくつかの局面において、生体サンプルのサイズは、５～１５ｍＬである。
本発明の実施形態及び局面のそれぞれにおいて、ＣＡＭＬは、以下の特徴のそれぞれを有するものとして定義できる。
（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核（ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｎｕｃｌｅｕｓ）又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核（ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｎｕｃｌｅｕｓ）又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
本発明の実施形態のいくつかの局面において、ＣＡＭＬは、更に、以下の付加的な特徴の１つ又は複数を有するものとして定義できる。
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
本発明の各局面及び実施形態において、約１００μｍより大きいＣＡＭＬを「高腫大（又は極度に肥大した）癌関連マクロファージ様細胞（ｈｙｐｅｒ－ｅｎｇｏｒｇｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）」又はｈｅＣＡＭＬと称する。
本発明の実施形態において、生体サンプルの供給源は、以下に限定されるものではないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿のうちの１つ又は複数であってもよい。生体サンプルが血液である場合、血液は、例えば、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血であってもよい。サンプルは、新鮮なサンプルであってもよく、適切に調製された凍結保存サンプルを解凍したものであってもよい。
本発明の実施形態のいくつかの局面において、癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又は他の固形腫瘍癌である。
本発明の実施形態のいくつかの局面において、循環細胞は、サイズ排除法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び様々なマイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせから選択される１つ又は複数の手段を用いて、判定ステップのために生体サンプルから単離される。
本発明の１つの局面において、循環細胞は、マイクロフィルターを使用することからなるサイズ排除法を用いて生体サンプルから単離される。マイクロフィルターは、約５μｍから約２０μｍの範囲の孔径を有していてもよい。マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、正方形及び／又は長方形の孔形状を有していてもよい。マイクロフィルターは、精密な孔形状及び／又は均一な孔分布を有していてもよい。
本発明の他の局面において、循環細胞は、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介するマイクロ流体チップを使用して生体サンプルから単離される。
本発明の更なる態様ではＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、生体サンプルから循環細胞を単離する。
詳細な説明
本明細書で定義される詳細な構成及び要素等の事項は、本発明の包括的な理解を補助するために提示しているに過ぎない。したがって、本発明の範囲及び思想から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態を様々に変更及び修正できることは、当業者にとって明らかである。
本明細書で定義される詳細な構成及び要素等の事項は、本発明の包括的な理解を補助するために提示しているに過ぎない。したがって、本発明の範囲及び思想から逸脱することなく、本明細書に記載された実施形態を様々に変更及び修正できることは、当業者にとって明らかである。
癌は、世界で最も恐れられている病気の１つであり、あらゆる国のあらゆる人口及び民族構成に影響を及ぼしている。男女ともに約４０％が一生のうちに癌を発症する。米国のみでも、常時１，２００万人以上の癌患者がおり、２０１８年には、新たに１７０万人の癌患者が発生し、６０万人以上が死亡すると推定されている。世界の癌死亡者数は、年間約８００万人と推定され、そのうち３００万人は、患者が治療を受けられる先進国で発生している。
癌が存在するかどうか及び／又は癌が転移しているかどうかを迅速に判定でき、治療タイプの選択及び選択した治療が効いているかどうかの判定に使用でき、生存の予後診断に使用できる診断法が存在することが理想的である。
本開示では、ステージＩ～ＩＶの固形腫瘍患者の血液中に、他のどの癌関連細胞よりも一貫して見出される細胞型を提示する。これらの循環細胞は、原発腫瘍と同じ腫瘍マーカーを含むマクロファージ様細胞であり、ここでは、循環癌関連マクロファージ様細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ：ＣＡＭＬ）と称する。
癌に罹患している患者からの生体サンプル中に存在するＣＡＭＬは、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）とともに、例えば、精密濾過法を含むサイズ排除法の使用によって単離し、特徴付けることができる。マイクロフィルターは、ＣＴＣやＣＡＭＬ等の大きな細胞を保持しながら、赤血球や大部分の白血球を通過させるのに十分なサイズの孔を持つように形成できる。採取された細胞は、フィルター上で直接、あるいは、他の手段によって、特性解析できる。
ＣＡＭＬは、単独で使用される場合、多くの臨床的有用性を有する。更に、生体サンプル中のＣＡＭＬの特性解析は、ＣＴＣ、無細胞ＤＮＡ、血液中の遊離タンパク質等の他のマーカーのアッセイと組み合わせることで、診断技術の感度と特異性を更に向上させることができる。ＣＡＭＬ及びＣＴＣは、同じ手段で同時に単離及び同定できるため、上記の特徴は、特に、ＣＡＭＬ及びＣＴＣに当てはまる。
循環腫瘍細胞
本明細書で定義するように、癌腫に関連するＣＴＣは、多くのサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９は、ＣＴＣによって最も一般的に発現され、診断において使用されるサイトケラチンであるが、調査は、これらのマーカーのみに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、通常、上皮細胞接着分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）を発現する。しかしながら、この発現は、一様ではなく、一貫しているわけでもない。ＣＴＣは、ＣＤ４５を発現しないが、これは、ＣＤ４５が白血球マーカーであるためである。ＣＴＣやＣＡＭＬ等の腫瘍関連細胞を同定するアッセイでは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９等の固形腫瘍に関連するマーカーに対する抗体、あるいは、ＣＤ４５やＤＡＰＩに対する抗体を用いれば十分である。染色技術を形態学と組み合わせることによって、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎａｂｌｅ ＣＴＣ：ＰＤＣＴＣ）、アポトーシスＣＴＣ、ＣＡＭＬを同定できる［３］。
本明細書で定義するように、癌腫に関連するＣＴＣは、多くのサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：ＣＫ）を発現する。ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９は、ＣＴＣによって最も一般的に発現され、診断において使用されるサイトケラチンであるが、調査は、これらのマーカーのみに限定する必要はない。固形腫瘍ＣＴＣの表面は、通常、上皮細胞接着分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＥｐＣＡＭ）を発現する。しかしながら、この発現は、一様ではなく、一貫しているわけでもない。ＣＴＣは、ＣＤ４５を発現しないが、これは、ＣＤ４５が白血球マーカーであるためである。ＣＴＣやＣＡＭＬ等の腫瘍関連細胞を同定するアッセイでは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９等の固形腫瘍に関連するマーカーに対する抗体、あるいは、ＣＤ４５やＤＡＰＩに対する抗体を用いれば十分である。染色技術を形態学と組み合わせることによって、病理学的に定義可能なＣＴＣ（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎａｂｌｅ ＣＴＣ：ＰＤＣＴＣ）、アポトーシスＣＴＣ、ＣＡＭＬを同定できる［３］。
癌腫に関連するＰＤＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９を発現し、以下の特徴によって同定及び定義される。
・ＤＡＰＩで染色された「癌様」核。核は、通常大きく、ドットパターンを有する。ただし、細胞分裂中は、例外である。核が凝縮していることもある。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の１つ又は複数の発現。上皮癌からのＣＴＣは、通常、少なくともＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９を発現する。サイトケラチンは、糸状パターンを有する。
・ＣＤ４５の発現の欠如。
・ＤＡＰＩで染色された「癌様」核。核は、通常大きく、ドットパターンを有する。ただし、細胞分裂中は、例外である。核が凝縮していることもある。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の１つ又は複数の発現。上皮癌からのＣＴＣは、通常、少なくともＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９を発現する。サイトケラチンは、糸状パターンを有する。
・ＣＤ４５の発現の欠如。
肉腫に関連するＰＤＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の代わりに、ビメンチンを発現する。
黒色腫に関連するＰＤＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の代わりに、ＣＤ１４６、ＣＤ３１、及び／又はＣＤ３４を発現する。
神経芽腫に関連するＰＤＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、及びＣＫ１９の代わりに、ＧＤ２及び／又はビメンチンを発現する。
癌腫に関連するアポトーシスＣＴＣは、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９を発現し、以下の特徴により同定及び定義される：
・劣化した核。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９の１つ又は複数の発現。全てのサイトケラチンのパターンが糸状ではなく、一部又は全体が斑点状に断片化されている。
・ＣＤ４５発現の欠如。
・劣化した核。
・ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９の１つ又は複数の発現。全てのサイトケラチンのパターンが糸状ではなく、一部又は全体が斑点状に断片化されている。
・ＣＤ４５発現の欠如。
循環癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）
本明細書で定義するように、本発明の方法で使用される循環細胞は「ＣＡＭＬ」と称することができる。「循環細胞」への各言及は、ＣＡＭＬと同義であり、「ＣＡＭＬ」への各言及は、循環細胞と同義である。ＣＡＭＬと呼ぶ場合も「循環細胞」と称する場合も、これらの細胞は、以下の特徴の１つ又は複数を有する。
・ＣＡＭＬは、大きな非定型倍数体核又は複数の個別核を有し、多くの場合、細胞内に散在しているが、拡大した融合核小体（ｅｎｌａｒｇｅｄ ｆｕｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｌｉ）が共通している。ＣＡＭＬの核のサイズは、一般的に直径約１０μｍ～約７０μｍ、より一般的には、直径約１４μｍ～約６４μｍである。
・多くの癌において、ＣＡＭＬはその疾患の癌マーカーを発現する。例えば、上皮性癌に関連するＣＡＭＬは、ＣＫ８、ＣＫ１８又はＣＫ１９、ビメンチン等を発現する。マーカーは、通常、拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連している。どのマーカーの染色パターンも細胞全体に略均一に拡散している。肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫の場合、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９の代わりに、癌に関連する他のマーカーを使用できる。
・ＣＡＭＬは、ＣＤ４５陽性又はＣＤ４５陰性でありえ、本発明は、両方のタイプのＣＡＭＬの使用を包含する。
・ＣＡＭＬは、大きく、長径が約２０μｍから約３００μｍである。
・ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、または無定形等、多数の異なる形態学的形状で見出される。
・癌腫由来のＣＡＭＬは、通常、拡散したサイトケラチンを有する。
・ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現している場合、ＥｐＣＡＭは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に亘って略均一であるが、腫瘍によっては、ＥｐＣＡＭの発現が非常に低いか全くないため、全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するわけではない。
・ＣＡＭＬがマーカーを発現している場合、そのマーカーは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に略均一であるが、全てのＣＡＭＬが同じマーカーを同じ強度で発現するわけではない。
・ＣＡＭＬは、しばしば腫瘍由来のマーカーと関連するマーカーを発現し、例えば、腫瘍が前立腺癌由来でＰＳＭＡを発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓由来でＰＤＸ－１を発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＤＸ－１を発現する。更なる例として、癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣがＣＸＣＲ－４を発現している場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＣＸＣＲ－４を発現する。
・癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現している場合、そのような患者からのＣＡＭＬも薬物標的のバイオマーカーを発現する。このような免疫療法のバイオマーカーの例は、ＰＤ－Ｌ１である。
・ＣＡＭＬは、単球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）や内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。
・ＣＡＭＬは、Ｆｃ断片を結合する能力を有する。
本明細書で定義するように、本発明の方法で使用される循環細胞は「ＣＡＭＬ」と称することができる。「循環細胞」への各言及は、ＣＡＭＬと同義であり、「ＣＡＭＬ」への各言及は、循環細胞と同義である。ＣＡＭＬと呼ぶ場合も「循環細胞」と称する場合も、これらの細胞は、以下の特徴の１つ又は複数を有する。
・ＣＡＭＬは、大きな非定型倍数体核又は複数の個別核を有し、多くの場合、細胞内に散在しているが、拡大した融合核小体（ｅｎｌａｒｇｅｄ ｆｕｓｅｄ ｎｕｃｌｅｏｌｉ）が共通している。ＣＡＭＬの核のサイズは、一般的に直径約１０μｍ～約７０μｍ、より一般的には、直径約１４μｍ～約６４μｍである。
・多くの癌において、ＣＡＭＬはその疾患の癌マーカーを発現する。例えば、上皮性癌に関連するＣＡＭＬは、ＣＫ８、ＣＫ１８又はＣＫ１９、ビメンチン等を発現する。マーカーは、通常、拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連している。どのマーカーの染色パターンも細胞全体に略均一に拡散している。肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫の場合、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９の代わりに、癌に関連する他のマーカーを使用できる。
・ＣＡＭＬは、ＣＤ４５陽性又はＣＤ４５陰性でありえ、本発明は、両方のタイプのＣＡＭＬの使用を包含する。
・ＣＡＭＬは、大きく、長径が約２０μｍから約３００μｍである。
・ＣＡＭＬは、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、または無定形等、多数の異なる形態学的形状で見出される。
・癌腫由来のＣＡＭＬは、通常、拡散したサイトケラチンを有する。
・ＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現している場合、ＥｐＣＡＭは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に亘って略均一であるが、腫瘍によっては、ＥｐＣＡＭの発現が非常に低いか全くないため、全てのＣＡＭＬがＥｐＣＡＭを発現するわけではない。
・ＣＡＭＬがマーカーを発現している場合、そのマーカーは、通常、細胞全体に拡散しているか、液胞及び／又は摂取物質と関連しており、細胞全体に略均一であるが、全てのＣＡＭＬが同じマーカーを同じ強度で発現するわけではない。
・ＣＡＭＬは、しばしば腫瘍由来のマーカーと関連するマーカーを発現し、例えば、腫瘍が前立腺癌由来でＰＳＭＡを発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＳＭＡを発現する。別の例として、原発腫瘍が膵臓由来でＰＤＸ－１を発現する場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＰＤＸ－１を発現する。更なる例として、癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣがＣＸＣＲ－４を発現している場合、そのような患者からのＣＡＭＬもＣＸＣＲ－４を発現する。
・癌由来の原発腫瘍又はＣＴＣが薬物標的のバイオマーカーを発現している場合、そのような患者からのＣＡＭＬも薬物標的のバイオマーカーを発現する。このような免疫療法のバイオマーカーの例は、ＰＤ－Ｌ１である。
・ＣＡＭＬは、単球マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４）や内皮マーカー（例えば、ＣＤ１４６、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ３１）を発現する。
・ＣＡＭＬは、Ｆｃ断片を結合する能力を有する。
約１００μｍ以上のＣＡＭＬを「高腫大（又は極度に肥大した）循環癌関連マクロファージ様細胞（ｈｙｐｅｒ－ｅｎｇｏｒｇｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ）」又はｈｅＣＡＭＬと称する。
ＣＡＭＬでの発現について広範なマーカーを評価した。その結果を図１に示す。本発明の１つの局面において、本発明のＣＡＭＬは、図１に示したマーカーの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１個全てを発現する。これらのマーカーは、異なる癌に罹患する９３人の患者から得られた１１１８個のＣＡＭＬに対するスクリーニングによって得られたものである。最初にＣＡＭＬを単離し、ＤＡＰＩ、サイトケラチン、及びＣＤ４５で同定し、その後、骨髄性／マクロファージ、白血球、巨核球、上皮、内皮、前駆／幹細胞、運動性マーカーを含む合計２７のマーカーで順次再染色した。図１からわかるように、マーカーの発現は、０％から９６％の範囲である。略全てのＣＡＭＬが何らかのレベルのＣＤ３１を発現すると共に、サイトケラチン、ＣＤ１４、ＣＸＣＲ４、ビメンチン、及びその他のマーカーを共通して発現していることがわかった。しかし、ＣＡＭＬは、明らかな骨髄系統マーカー（ＣＤ１４）を含む一方で、ＣＤ３１マーカーの発現が９６％とより多かった。
また、ＣＡＭＬは、従来の細胞分化の理解とは一致しないと思われる多くの表現型（ＣＤ４５［白血球］とサイトケラチン［上皮］、ＣＤ１１ｃ［マクロファージ］とＣＤ４１［巨核球］、ＣＤ１４６［内皮］とＣＤ４１／ＣＤ６１［巨核球］、ＣＤ４１／ＣＤ６１［巨核球］とＣＤ６８／ＣＤ１６３［スカベンジャーマクロファージ］の共発現等）を示している。マーカーの多くは、複数の細胞型に現れる。これらのデータを総合すると、ＣＡＭＬは、分化の初期段階にある骨髄由来細胞であり、幹細胞や血管新生能に関連する多くの表現型的属性を有していることがわかる。
ＣＡＭＬは、図１に示すように、Ｈ＆Ｅ等の比色染色、あるいは、特定のマーカーの蛍光染色によって可視化できる。細胞質については、ＣＤ３１が最も陽性の表現型である。ＣＤ３１単独、又は図１の他の陽性マーカー、あるいは、腫瘍に関連する癌マーカーとの併用が推奨される。
本発明の様々な実施形態及び局面において、ＣＡＭＬは、以下の各特徴を有する細胞として定義できる。（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核、又は単一細胞内に複数の核を有する。（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ。（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状。更なる実施形態において、ＣＡＭＬは、以下の付加的な特性の１つ又は複数をも有するものとして定義できる。（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型。（ｅ）ＣＤ４５発現。（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現。（ｇ）ビメンチン発現。（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現。（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現。（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現。（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現。（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現。
上記に示唆したように、本明細書に開示するＣＡＭＬ及びＣＴＣのユニークな特徴は、癌等の疾患のスクリーニング及び診断、治療のモニタリング、疾患の進行及び再発のモニタリングの方法を含む臨床用途での使用に適している。
多臓器転移の予測及び診断
発明の概要において示唆したように、本発明は、対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患の発症を予測又は診断する方法に係る。当該方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を発症すると予測する。
発明の概要において示唆したように、本発明は、対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患の発症を予測又は診断する方法に係る。当該方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を発症すると予測する。
細胞サイズを用いたＯＳ及びＰＦＳの予測
また、本発明は、ＣＡＭＬ細胞サイズに基づいて、癌に罹患している対象の全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法に係る。この方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象は、同じ癌又は類似の癌に罹患しているが対応するサンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上でない対象よりも、ＯＳが短く及び／又はＰＦＳが短いと予測する。このように、より大きなサイズのＣＡＭＬを有する対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、より小さなサイズのＣＡＭＬを有する対象のＯＳ及び／又はＰＦＳよりも少ない又は短いと予測する。いくつかの局面において、癌は、多臓器転移又は多巣転移性疾患である。
また、本発明は、ＣＡＭＬ細胞サイズに基づいて、癌に罹患している対象の全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法に係る。この方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象は、同じ癌又は類似の癌に罹患しているが対応するサンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上でない対象よりも、ＯＳが短く及び／又はＰＦＳが短いと予測する。このように、より大きなサイズのＣＡＭＬを有する対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、より小さなサイズのＣＡＭＬを有する対象のＯＳ及び／又はＰＦＳよりも少ない又は短いと予測する。いくつかの局面において、癌は、多臓器転移又は多巣転移性疾患である。
本発明の好ましい局面において、方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象のＯＳ及びＰＦＳは、癌に罹患しているが約１００μｍ以上のサイズのＣＡＭＬがない対象よりも少ない又は短いと予測する。
１００μｍの値は、本方法のカットオフ値とみなすことができる。本方法の関わる局面において、カットオフ値は、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１１０μｍ以上のいずれか１つであってもよい。
本発明の１つの局面において、本発明の方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、サンプル中の少なくとも１つの細胞のサイズが約１００μｍ以上である場合、当該対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、癌に罹患しているが細胞のサイズが約１００μｍ以上でない対象よりも少ない又は短いと予測する。
この方法に関して、特定のＣＡＭＬのサイズは、細胞の状態や形態、サイズが判定される状況、サイズを判定する方法によって変化し得ることを認識することが重要である。循環細胞が採用する形態の種類には、紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚等（本書で更に定義されている）が含まれるため、測定用に選択された細胞上の２点によってサイズも変化し得る。なお、細胞のサイズは、通常、細胞体上の最も離れた２点間で測定される。したがって、形状が丸い場合は、細胞の直径が測定される。形状が紡錘形であれば、セルの軸方向の長さに沿った両端間の距離を測定できる。
本発明の各方法において、全生存期間（ＯＳ）若しくは無増悪生存期間（ＰＦＳ）、又はその両方は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０箇月、又はこれ以上の期間である。本発明の１つの局面において、ＯＳ若しくはＰＦＳ、又はその両方は、少なくとも約１２箇月、又は少なくとも約２４箇月である。
ここで用いられる、全生存期間（ＯＳ）とは、診断日、治療開始日、及び癌の進行を評価するために血液を採取した日等の選択された日から、癌に罹患している対象が生存している期間の長さを意味する。
ここで用いられる、無増悪生存期間（ＰＦＳ）とは、治療を開始した日又は癌の進行を評価するために採血した日等の選択された日から、癌に罹患している対象が生存し、癌が悪化又は進行していない期間の長さを意味する。
本発明の各方法において、循環細胞（ＣＡＭＬ）がアッセイされる生体サンプルの量は、様々であり得ることは明らかである。しかしながら、細胞のサイズを判定することに基づく方法の場合、関連する細胞数を得るためには、生体サンプルは、少なくとも約２．５ｍＬであるべきである。また、生体サンプルの量は、少なくとも約３、４、５、６、７、７．５、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１７．５、１８、１９、２０、２１、２２、２２．５、２３、２４、２５、２６、２７、２７．５、２８、２９、３０ｍＬ、又はこれ以上であってもよい。また、生体サンプルの量は、約２．５～２０ｍＬ、約５～１５ｍＬ、又は約５～１０ｍＬであってもよい。本発明の１つの局面では、生体サンプルは、約７．５ｍＬである。
本発明の実施形態及び局面のそれぞれにおいて、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、以下の特徴のそれぞれを有するものとして定義できる。
（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
本発明の実施形態のいくつかの局面において、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、以下の付加的な特徴の１つ又は複数を有するものとして更に定義できる。
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
本発明の実施形態および局面のそれぞれにおいて、生体サンプルの供給源は、以下に限定されるものではないが、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿のうちの１つ又は複数であってもよい。生体サンプルが血液である場合、血液は、例えば、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血であってもよい。サンプルは、新鮮なサンプルであってもよく、凍結保存したものを解凍したものでもよい［８］。
癌に罹患する２人の対象の間で循環細胞（ＣＡＭＬ）サイズを比較する場合、対象が同じ種類の癌に罹患していることが望ましい。しかしながら、癌の種類、癌の病期、癌の進行速度、治療歴、癌の寛解歴及び／又は再発歴等、他の要因の観点から、２人の対象を完全に一致させることが困難な場合がある。したがって、本発明の方法において比較される２つの対象の癌における特性には、多少のばらつきがあり得ることが理解されるべきである。
本発明の実施形態及び局面のそれぞれにおいて、癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又は他の固形腫瘍癌である。本発明の方法は、特定の形態又は種類の癌に限定されず、多種多様な癌に関連して実施されうることは当業者にとって明らかである。
本発明の実施形態及び局面のそれぞれにおいて、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、サイズ排除法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮上、及び様々なマイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせから選択される１つ又は複数の手段を用いて、判定ステップのために生体サンプルから単離される。特定の態様において、サイズ排除法は、マイクロフィルターの使用を含む。
本発明の１つの局面において、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、マイクロフィルターを使用することを含むサイズ排除法を用いて生体サンプルから単離される。適切なマイクロフィルターは、様々な孔径及び形状を有することができる。マイクロフィルターは、約５μｍから約２０μｍの範囲の孔径を有していてもよい。本発明のいくつかの局面では、孔径は、約５μｍから約１０μｍであり、他の局面では、孔径は、約７μｍから８μｍである。孔径が大きいと、フィルター上のＷＢＣ汚染のほとんどが除去される。マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形状、楕円形、正方形及び／又は長方形の孔形状を有していてもよい。マイクロフィルターは、精密な孔形状及び／又は均一な孔分布を有していてもよい。
本発明の他の局面において、循環細胞（ＣＡＭＬ）は、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介する、マイクロ流体チップを使用して生体サンプルから単離される。循環細胞（ＣＡＭＬ）の捕捉効率は、採取方法によって異なり得る。また、異なるプラットフォームで捕捉できる循環細胞（ＣＡＭＬ）サイズも異なり得る。循環細胞サイズを予後や生存の判定に用いる原理は同じであっても、統計が異なることもある。ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターを用いた循環細胞の採取は、１００％の捕捉効率と高品質の細胞を提供する。
本発明の他の局面は、採血管である。ＣｅｌｌＳａｖｅ採血管（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｍｅｎａｒｉｎｉ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）は、安定した細胞の形態とサイズを提供する。他の採血管では、細胞の安定性が得られない。他のほとんどの採血管では、細胞が増大し、破裂して採取されることさえある。
本発明の他の局面は、細胞自体をＣＡＭＬ細胞として特異的に同定することに代えて、シンプルに細胞質と核のサイズに基づいて細胞を同定し、サンプル中の大きな細胞を同定することである。この局面で使用されうる技術の例としては、Ｈ＆Ｅ染色等のカラー計量染色を使用すること又は単にＣＫ（＋）細胞を見ること等が含まれる。
本発明の更なる局面では、Ｃｒｅａｔｖ ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、生体サンプルから循環細胞（ＣＡＭＬ）を単離する。サイズ排除法は、血流からＣＡＭＬを単離するのに理想的である。Ｃｒｅａｔｖ ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ社のＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターは、丈夫で低自己蛍光性を有する厚さ１０μｍのポリマーの直径９ｍｍの領域内に１８万個の直径７．５μｍの細孔が均一に分布するサイズ排除デバイスである。サイズによる濾過は、ＣＴＣとＣＡＭＬの両方を含む血液中の複数種類の腫瘍関連細胞を一貫して捕捉するのに適した方法である。濾過は、シリンジポンプや真空ポンプを用いて低圧下で行うことができる。
例えば、全血をＣｅｌｌＳａｖｅ保存チューブに採取する。７．５ｍＬの全血を７．５ｍＬの前置緩衝液に前置する。３分をかけて、１５ｍＬのサンプルをＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）マイクロフィルターで濾過する。マイクロフィルターにより、全ての赤血球と９９．９％の白血球が除去される。アッセイ後、フィルターに捕捉された細胞を固定、透過、蛍光染色する。その後、マイクロフィルターをスライドグラスにマウントし、蛍光顕微鏡で画像化する。
実験
実験＃１
方法． 転移性（ｍ）の、ｍ乳癌（ｎ＝５８）、ｍ肺癌（ｎ＝３４）、ｍ前立腺癌（ｎ＝３９）、ｍ腎癌（ｎ＝２０）の患者１５１人をプロスペクティブに集めた。末梢血は、転移性癌に対する新たな治療を開始する前に採取した。７．５ｍＬの血液から標準的なＣｅｌｌＳｉｅｖｅ技術に従ってＣＡＭＬを単離した後、ＺｅｎＢｌｕｅを用いて画像化／測定した。多臓器転移は、２つ以上の遠隔臓器への転移又は脳への転移と定義した。単因子分散解析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：ＡＮＯＶＡ）を用いて、多臓器転移患者と単臓器転移患者におけるｈｅＣＡＭＬの存在を比較した。単変量解析及び多変量解析を行い、ｈｅＣＡＭＬに対するＰＦＳ及びＯＳ、並びに既知の全ての臨床パラメータを評価した。
実験＃１
方法． 転移性（ｍ）の、ｍ乳癌（ｎ＝５８）、ｍ肺癌（ｎ＝３４）、ｍ前立腺癌（ｎ＝３９）、ｍ腎癌（ｎ＝２０）の患者１５１人をプロスペクティブに集めた。末梢血は、転移性癌に対する新たな治療を開始する前に採取した。７．５ｍＬの血液から標準的なＣｅｌｌＳｉｅｖｅ技術に従ってＣＡＭＬを単離した後、ＺｅｎＢｌｕｅを用いて画像化／測定した。多臓器転移は、２つ以上の遠隔臓器への転移又は脳への転移と定義した。単因子分散解析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ：ＡＮＯＶＡ）を用いて、多臓器転移患者と単臓器転移患者におけるｈｅＣＡＭＬの存在を比較した。単変量解析及び多変量解析を行い、ｈｅＣＡＭＬに対するＰＦＳ及びＯＳ、並びに既知の全ての臨床パラメータを評価した。
結果． 多臓器転移は、患者の５５％（ｎ＝８３／１５０）に認めらた（表１）。ｈｅＣＡＭＬは、多臓器転移患者の５９％（ｎ＝４９／８３）に認められたが（図２Ｂ）、ｈｅＣＡＭＬは、単臓器転移患者の１６％（ｎ＝１１／６７）にしか認められなかった（図２Ａ）。ｈｅＣＡＭＬの存在は、ｍ乳癌（８２％対５２％、ｐ＝０．００６）、ｍ肺癌（７１％対２６％、ｐ＝０．０２５）、ｍ前立腺癌（７５％対３７％、ｐ＝０．０２９）、ｍ腎癌（８８％対３６％、ｐ＝０．０２５）の患者における多臓器転移を示唆すると考えられる（図２Ｂ）。更に、全患者ｎ＝１５０において、２４箇月ＰＦＳのＰＦＳ中央値が４．５箇月対７．２箇月（ＨＲ＝１．６７、９５％ ＣＩ＝１．１３～２．４５、ｐ＝０．０１３）と有意に短く、２４箇月OAのＯＳ中央値が１３．１箇月対２０．４箇月（ＨＲ＝２．０５、９５％ ＣＩ＝１．２４～３．３９、ｐ＝０．００８）と有意に短いことを予測した（図３）。
結論． 一回の採血から、少なくとも１つのｈｅＣＡＭＬを有する患者は多臓器転移を有する可能性が高いことが識別された。ｈｅＣＡＭＬの存在は、ＰＦＳ（ＨＲ＝１．６７）とＯＳ（ＨＲ＝２．０５）の有意な短縮を予測した。新たな治療を開始する前にｈｅＣＡＭＬが存在すると、多臓器転移が予測され、したがって、より積極的な治療レジームが必要となる可能性がある。
実験＃２
方法． ステージＩ（ｎ＝１９）、ステージＩＩ（ｎ＝３１）、ステージＩＩＩ（ｎ＝６５）、ステージＩＶ（ｎ＝１６０）を含む乳癌（ｎ＝５８）、肺癌（ｎ＝４７）、前立腺癌（ｎ＝４７）、膵癌（ｎ＝２９）、食道癌（ｎ＝２８）、腎癌（ｎ＝２０）、大腸癌（ｎ＝１５）、肝臓癌（ｎ＝９）、肉腫（ｎ＝２２）の患者２７５人をプロスペクティブに集めた。末梢血は、新規治療開始前に採取した。７．５ｍＬの血液から標準的なＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）技術に従って細胞を単離した後、ＺｅｎＢｌｕｅを用いて画像化及び測定した。多臓器転移は、２つ以上の遠隔臓器への転移又は脳への転移と定義した。単因子ＡＮＯＶＡを行って、多臓器転移患者と単臓器転移患者におけるｈｅＣＡＭＬの存在を比較した。単変量解析及び多変量解析を行い、ｈｅＣＡＭＬに対するＰＦＳ及びＯＳ、並びに既知の全ての臨床パラメータを評価した。
方法． ステージＩ（ｎ＝１９）、ステージＩＩ（ｎ＝３１）、ステージＩＩＩ（ｎ＝６５）、ステージＩＶ（ｎ＝１６０）を含む乳癌（ｎ＝５８）、肺癌（ｎ＝４７）、前立腺癌（ｎ＝４７）、膵癌（ｎ＝２９）、食道癌（ｎ＝２８）、腎癌（ｎ＝２０）、大腸癌（ｎ＝１５）、肝臓癌（ｎ＝９）、肉腫（ｎ＝２２）の患者２７５人をプロスペクティブに集めた。末梢血は、新規治療開始前に採取した。７．５ｍＬの血液から標準的なＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）技術に従って細胞を単離した後、ＺｅｎＢｌｕｅを用いて画像化及び測定した。多臓器転移は、２つ以上の遠隔臓器への転移又は脳への転移と定義した。単因子ＡＮＯＶＡを行って、多臓器転移患者と単臓器転移患者におけるｈｅＣＡＭＬの存在を比較した。単変量解析及び多変量解析を行い、ｈｅＣＡＭＬに対するＰＦＳ及びＯＳ、並びに既知の全ての臨床パラメータを評価した。
結果． ２７５の生存サンプルが得られた。多臓器転移は、初回採血時に転移病変を有する患者の５７％（ｎ＝９１／１６０）に認められた（表２）。ｈｅＣＡＭＬは、初期の多臓器転移患者の７３％（ｎ＝６６／９１）に認められたが、非転移コホートでは、１９％（ｎ＝２２／１１５）にしか認められず（ｐ＜０．００１）（図４）、したがって、ＨｅＣＡＭＬは、多臓器転移及び単臓器転移に共通し、臨床的に診断された非転移病変では稀である。
初回採血時にＨｅＣＡＭＬを認めた非転移性患者ｎ＝２２／１１５のうち、７３％（ｎ＝１６／２２）が採血後２年以内に多臓器転移に進行した（図５）。ｈｅＣＡＭＬは、肉腫を含む様々な固形癌の全ての病期で同定され、標準的な臨床的又は病理学的方法によって病期分類された。２年以内に、最初の病期分類でｈｅＣＡＭＬであった患者は、多臓器転移で進行する可能性が高く、その内訳は、Ｉ期患者の８０％、ＩＩ期患者の６０％、ＩＩＩ期患者の８３％、ステージＩＶ患者の９４％であった。これとは対照的に、最初の病期分類でＨｅＣＡＭＬを認めなかった患者では、２年以内に多臓器転移が進行する可能性は低く、その内訳は、Ｉ期患者の０％、ＩＩ期患者の４％、ＩＩＩ期患者の９％、ステージＩＶ患者の２３％であった。
ｎ＝２７５の全患者において、ｈｅＣＡＭＬの存在は、２４箇月ＰＦＳの有意な短縮（ＨＲ＝２．７１、９５％ＣＩ＝１．９２－３．８１、ｐ＜０．０００１）を予測し、２４箇月ＯＳの有意な短縮（ＨＲ＝２．０２、９５％ＣＩ＝１．３２－３．０８、ｐ＝０．００１５）を予測した（図６Ａ）。図６Ｂは、表２のｎ＝２７５の固形癌患者の概要である。５０μｍ未満のＣＡＭＬは、侵攻性が低く、進行又は死亡する可能性が低いようである。５０μｍ以上１００μｍ未満のＣＡＭＬを有する患者は、進行のリスクが１４０％増加し、２年以内の死亡のリスクが１７０％増加し、ほとんどの患者は、単臓器転移のみを有する。１００μｍ以上のＣＡＭＬを有する患者では、２年以内の進行リスクは、２０５％、死亡リスクは、１１００％増加し、ほとんどの患者は、多臓器転移を有する。
結論． 非侵襲的な血液ベースの予後判定法を開発し、多臓器転移との関係及び幾つかの固形癌における予後判定能を検討した。これらの結果から、ｈｅＣＡＭＬを有する患者では、多臓器転移率が高く、ＰＦＳとＯＳの短縮が予測されることが判明した。
引用
1. Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. PNAS 2014, 111(9):3514-3519.
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11. Valastyan, S. et al. Tumor Metastasis: Molecular Insights and Evolving Paradigms. Cell 147 (2011).
＜付記事項＞
［付記事項１］
対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を診断する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を有すると診断する、前記方法。
［付記事項２］
対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患の発症を予測する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を発症すると予測する、前記方法。
［付記事項３］
癌に罹患している対象の全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象は、同じ癌又は類似の癌に罹患しているが対応するサンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上であるということを充足しない対象よりも、ＯＳが短く及び／又はＰＦＳが短いと予測する、前記方法。
［付記事項４］
癌に罹患している対象のＯＳ及び／又はＰＦＳを予測する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、癌に罹患しているがサイズが約１００μｍ以上のＣＡＭＬがない対象よりも、少ない又は短いと予測する、前記方法。
［付記事項５］
前記ＯＳ及び／又はＰＦＳは、少なくとも１２箇月である、付記事項３又は付記事項４に記載の方法。
［付記事項６］
前記ＯＳ及び／又はＰＦＳは、少なくとも２４箇月である、付記事項３又は付記事項４に記載の方法。
［付記事項７］
前記生体サンプルのサイズが５～１５ｍＬである、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項８］
前記ＣＡＭＬは、
（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
の特徴を有する、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項９］
前記ＣＡＭＬは、
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
のうちの一つ以上の特徴を有する、付記事項８に記載の方法。
［付記事項１０］
前記生体サンプルの供給源は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿のうちの１つ又は複数である、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項１１］
前記生体サンプルは、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血である、［付記事項１０］に記載の方法。
［付記事項１２］
前記癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又は他の固形腫瘍癌である、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項１３］
前記ＣＡＭＬは、サイズ排除法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮遊、及び各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の手段を用いて、前記判定ステップのために前記生体サンプルから単離される、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項１４］
前記ＣＡＭＬは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いて生体サンプルから単離される、付記事項１３に記載の方法。
［付記事項１５］
前記マイクロフィルターは、約５μｍから約２０μｍの範囲の孔径を有する、付記事項１４に記載の方法。
［付記事項１６］
前記マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形、楕円形、正方形、及び長方形の孔形状を有する、付記事項１５に記載の方法。
［付記事項１７］
前記マイクロフィルターは、精密な孔形状と均一な孔分布を有する、付記事項１５に記載の方法。
［付記事項１８］
前記ＣＡＭＬは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介するマイクロ流体チップを使用して単離される、［付記事項１３］に記載の方法。
［付記事項１９］
前記ＣＡＭＬは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、前記判定ステップのために前記生体サンプルから単離される、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
1. Adams, D., et al., Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. PNAS 2014, 111(9):3514-3519.
2. International Patent Application Publication No. WO 2013/181532, dated December 5, 2013.
3. Adams, D. L., et al., Cytometric characterization of Circulating Tumor Cells captured by microfiltration and their correlation to the CellSearchR CTC test. Cytometry Part A 2015; 87A:137-144.
4. Adams DL, et al. The systematic study of circulating tumor cell isolation using lithographic microfilters. RSC Adv 2014, 4:4334-4342.
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10. Steeg, P. et al. Tumor Metastasis: Mechanistic Insights and Clinical Challenges. Nature Medicine. 12 (2006).
11. Valastyan, S. et al. Tumor Metastasis: Molecular Insights and Evolving Paradigms. Cell 147 (2011).
＜付記事項＞
［付記事項１］
対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を診断する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を有すると診断する、前記方法。
［付記事項２］
対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患の発症を予測する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象等の対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を発症すると予測する、前記方法。
［付記事項３］
癌に罹患している対象の全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象は、同じ癌又は類似の癌に罹患しているが対応するサンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上であるということを充足しない対象よりも、ＯＳが短く及び／又はＰＦＳが短いと予測する、前記方法。
［付記事項４］
癌に罹患している対象のＯＳ及び／又はＰＦＳを予測する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが約１００μｍ以上である場合、前記対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、癌に罹患しているがサイズが約１００μｍ以上のＣＡＭＬがない対象よりも、少ない又は短いと予測する、前記方法。
［付記事項５］
前記ＯＳ及び／又はＰＦＳは、少なくとも１２箇月である、付記事項３又は付記事項４に記載の方法。
［付記事項６］
前記ＯＳ及び／又はＰＦＳは、少なくとも２４箇月である、付記事項３又は付記事項４に記載の方法。
［付記事項７］
前記生体サンプルのサイズが５～１５ｍＬである、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項８］
前記ＣＡＭＬは、
（ａ）約１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）約２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
の特徴を有する、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項９］
前記ＣＡＭＬは、
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
のうちの一つ以上の特徴を有する、付記事項８に記載の方法。
［付記事項１０］
前記生体サンプルの供給源は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿のうちの１つ又は複数である、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項１１］
前記生体サンプルは、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血である、［付記事項１０］に記載の方法。
［付記事項１２］
前記癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又は他の固形腫瘍癌である、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項１３］
前記ＣＡＭＬは、サイズ排除法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮遊、及び各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の手段を用いて、前記判定ステップのために前記生体サンプルから単離される、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
［付記事項１４］
前記ＣＡＭＬは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いて生体サンプルから単離される、付記事項１３に記載の方法。
［付記事項１５］
前記マイクロフィルターは、約５μｍから約２０μｍの範囲の孔径を有する、付記事項１４に記載の方法。
［付記事項１６］
前記マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形、楕円形、正方形、及び長方形の孔形状を有する、付記事項１５に記載の方法。
［付記事項１７］
前記マイクロフィルターは、精密な孔形状と均一な孔分布を有する、付記事項１５に記載の方法。
［付記事項１８］
前記ＣＡＭＬは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介するマイクロ流体チップを使用して単離される、［付記事項１３］に記載の方法。
［付記事項１９］
前記ＣＡＭＬは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、前記判定ステップのために前記生体サンプルから単離される、付記事項１から付記事項４のいずれか一項に記載の方法。
Claims (19)
- 生体サンプルをアッセイする方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記生体サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが１００μｍ以上である場合、前記対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を有する可能性が高いと示す、前記方法。
- 対象における多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患の発症を予測するための情報を提供する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記生体サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが１００μｍ以上である場合、前記対象は、多臓器転移及び／又は多巣転移性疾患を発症すると予測する情報を提供する、前記方法。
- 癌に罹患している対象の全生存期間（ＯＳ）及び／又は無増悪生存期間（ＰＦＳ）を予測するための情報を提供する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記生体サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが１００μｍ以上である場合、前記対象は、同じ癌又は類似の癌に罹患しているが対応するサンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが１００μｍ以上であるということを充足しない対象よりも、ＯＳが短く及び／又はＰＦＳが短いと予測する情報を提供する、前記方法。
- 癌に罹患している対象のＯＳ及び／又はＰＦＳを予測するための情報を提供する方法であって、前記方法は、癌に罹患している対象からの生体サンプル中のＣＡＭＬのサイズを判定することを含み、前記生体サンプル中の少なくとも１つのＣＡＭＬのサイズが１００μｍ以上である場合、前記対象のＯＳ及び／又はＰＦＳは、癌に罹患しているがサイズが１００μｍ以上のＣＡＭＬがない対象よりも、少ない又は短いと予測する情報を提供する、前記方法。
- 前記ＯＳ及び／又はＰＦＳは、少なくとも１２箇月である、請求項３又は請求項４に記載の方法。
- 前記ＯＳ及び／又はＰＦＳは、少なくとも２４箇月である、請求項３又は請求項４に記載の方法。
- 前記生体サンプルのサイズが５～１５ｍＬである、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＣＡＭＬは、
（ａ）１４～６４μｍの大きな非定型倍数体核又は単一細胞内の複数の核
（ｂ）２０～３００μｍの細胞サイズ
（ｃ）紡錘形、オタマジャクシ形、円形、長円形、２本脚、２本脚以上、細い脚、及び無定形からなる群から選択される形態学的形状
の特徴を有する、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ＣＡＭＬは、
（ｄ）ＣＤ１４陽性表現型
（ｅ）ＣＤ４５発現
（ｆ）ＥｐＣＡＭ発現
（ｇ）ビメンチン発現
（ｈ）ＰＤ－Ｌ１発現
（ｉ）単球性ＣＤ１１Ｃマーカー発現
（ｊ）内皮ＣＤ１４６マーカー発現
（ｋ）内皮ＣＤ２０２ｂマーカー発現
（ｌ）内皮ＣＤ３１マーカー発現
のうちの一つ以上の特徴を有する、請求項８に記載の方法。 - 前記生体サンプルの供給源は、末梢血、血液、リンパ節、骨髄、脳脊髄液、組織、及び尿のうちの１つ又は複数である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体サンプルは、肘正中静脈血、下大静脈血、大腿静脈血、門脈血、又は頸静脈血である、請求項１０に記載の方法。
- 前記癌は、固形腫瘍、ステージＩ癌、ステージＩＩ癌、ステージＩＩＩ癌、ステージＩＶ癌、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、黒色腫、上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、食道癌、又は他の固形腫瘍癌である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＣＡＭＬは、サイズ排除法、免疫捕捉、赤血球溶解、白血球枯渇、ＦＩＣＯＬＬ、電気泳動、誘電泳動、フローサイトメトリー、磁気浮遊、及び各種マイクロ流体チップ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の手段を用いて、前記ＣＡＭＬのサイズを判定するために前記生体サンプルから単離される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＣＡＭＬは、マイクロフィルターを用いるサイズ排除法を用いて生体サンプルから単離される、請求項１３に記載の方法。
- 前記マイクロフィルターは、５μｍから２０μｍの範囲の孔径を有する、請求項１４に記載の方法。
- 前記マイクロフィルターの孔は、円形、レーストラック形、楕円形、正方形、及び長方形の孔形状を有する、請求項１５に記載の方法。
- 前記マイクロフィルターは、精密な孔形状と均一な孔分布を有する、請求項１５に記載の方法。
- 前記ＣＡＭＬは、物理的サイズに基づく選別、流体力学的サイズに基づく選別、グループ化、トラッピング、免疫捕捉、大きな細胞の濃縮、又はサイズに基づく小さな細胞の排除を介するマイクロ流体チップを使用して単離される、請求項１３に記載の方法。
- 前記ＣＡＭＬは、ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ（登録商標）低圧精密濾過アッセイを用いて、前記ＣＡＭＬのサイズを判定するために前記生体サンプルから単離される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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