JP7841758B2 - Ｎｐｃ１モノボディおよびそのモノボディコンジュゲート - Google Patents

Ｎｐｃ１モノボディおよびそのモノボディコンジュゲート

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Description

本願は、2020年11月10日に出願された米国仮特許出願第63/112,031号の優先権の恩典を主張する。米国仮特許出願第63/112,031号は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる。
分野
本発明は、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチド、およびこれらの結合ポリペプチドを含むNPC1結合ペプチドコンジュゲートに関する。さらに、本発明は、これらのNPC1結合ポリペプチドおよび結合ペプチドコンジュゲートを含む薬学的組成物、ならびに様々な病態の処置における、これらの組成物の使用に関する。
背景
ニーマン・ピック病C1型(NPC1)は、エンドソーム区画の膜に位置し、コレステロールをエンドソームから原形質膜に輸送するのに必要不可欠である。原形質膜へのコレステロール輸送が妨害されると原形質膜の完全性が破壊され、遊走と転移に必要な正しいRac1局在化が阻止され、受容体型チロシンキナーゼ(RTK)などの他のコレステロール依存性タンパク質が破壊される可能性がある。さらなる知見は、ある特定のがん細胞ではNPC1が破壊されるとオートファジーフラックスが遮断されるということである。オートファジーは結腸直腸がんおよび膵臓がんなどのがんにおける化学療法に対する治療抵抗性機構であるので、このことは臨床的に興味深い。
オートファジーは進行がんの増殖と生存を助ける細胞プロセスである。多くの製薬大企業はがん治療のためにオートファジーを標的とする治療戦略を断念したが、オートファジーを阻害することで、現在用いられているがん療法の効力を強化できるという前臨床証拠が増えてきているので、この分野の関心が再燃している。実際に、FDAにより承認された抗マラリア薬であるヒドロキシクロロキン(HCQ)は、膵臓がんおよび結腸直腸がんを含む様々な腫瘍タイプに対する化学療法と併用されて多くの臨床試験が進められてきた。HCQが細胞内で誘導するリソソーム蓄積症表現型に少なくとも部分的に起因して、HCQは、ある程度の用量感受性効果を有し、このために、与えられる薬物の量が制限され得る。
HCQと同様に、NPC1を標的とする過去の研究はがん治療において見込みがあることを示している。しかしながら、低分子アプローチは、望ましくないオフターゲット効果と毒性に対して脆弱である。本開示は、当技術分野における、これらの制約および他の製薬を克服することに関する。
概要
本開示の第1の局面は、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチドに関する。このNPC1結合ポリペプチドは、改変されたFGループアミノ酸配列、改変されたBCループアミノ酸配列、改変されたCDループアミノ酸配列、改変されたDEループアミノ酸配列、またはその組み合わせを有する、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含み、前記1つまたは複数の改変されたループ配列は、NPC1との結合を可能にする。
本開示の別の局面はNPC1結合ペプチドコンジュゲートに関する。このNPC1結合ペプチドコンジュゲートは第1の部分と第2の部分とを含む。NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第1の部分は、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドを含み、コンジュゲートの第2の部分は第1の部分に接続されており、薬学的に活性な部分、診断部分、半減期延長部分、送達ビヒクル、プロドラッグ、第2の結合分子、ポリマー、および非結合タンパク質より選択される。
本開示の他の局面は、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、本明細書に記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチド、および記載されたポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクターに関する。本開示の別の局面は、これらのポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞に関する。
本開示の別の局面は、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチド、本明細書に記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチド、または本明細書に記載のベクターと、薬学的担体とを含む、薬学的組成物に関する。
本開示の別の局面は組み合わせ治療剤に関する。この組み合わせ治療剤は、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドとがん治療剤とを含む。
本開示の別の局面は、対象においてがんを処置する方法に関する。この方法は、がんを有する対象に、がんを処置するのに有効な量の本明細書に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、対象において感染症を処置する方法に関する。この方法は、感染症を有する対象に、感染症を処置するのに有効な量の本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドまたはNPC1結合ペプチドコンジュゲートを投与する工程を含む。
本開示の別の局面は、その必要のある対象において薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法に関する。この方法は、NPC1結合ペプチドコンジュゲートを対象に投与する工程を含み、前記ペプチドコンジュゲートは、本明細書に記載の第1の部分と第2の部分とを含み、第2の部分は薬学的に活性な部分である。
本開示の別の局面は、その必要のある対象において薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法に関する。この方法は、組み合わせ治療剤を対象に投与する工程を含み、組み合わせ治療剤は、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドと薬学的に活性な部分とを含む。
本明細書において開示されるように、NPC1阻害によってがん細胞におけるオートファジーが破壊される。オートファジーは治療抵抗性機構であるので、NPC1阻害は、治療に対する細胞の再感作を強化し、がん治療剤の効力を改善するのに使用することができる。現在のNPC1阻害剤は、がん細胞を選択的に標的としないので、この目的に有用でない。しかしながら、本明細書に記載のNCP1結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートはマクロピノサイトーシスによってエンドソーム区画に特異的に内部移行される。マクロピノサイトーシスは、代謝需要を支援するために、多量の細胞外液体と溶質とを内部移行する能力を細胞に付与するプロセスであり、変異Ras、調節解除された増殖因子シグナル伝達、Src活性化などによって引き起こされるがんにおいて特異的に強化されるプロセスである。従って、マクロピノサイトーシスによって媒介される、本明細書に記載のNCP1結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートの取り込みによって、独立型のがん療法、すなわち、がん治療剤をがん細胞に選択的に送達する手段と、がん治療剤を用いた処置に対してがん細胞を再感作するアジュバント療法との両方が提供される。
[本発明1001]
フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含む、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチドであって、
該FN3ドメインが、改変されたFGループアミノ酸配列、改変されたBCループアミノ酸配列、改変されたCDループアミノ酸配列、改変されたDEループアミノ酸配列、またはその組み合わせを有し、
該1つまたは複数の改変されたループ配列が、NPC1との結合を可能にする、
ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチド。
[本発明1002]
改変されたFGループアミノ酸配列が、SEQ ID NO:2～13のいずれか一つより選択される、本発明1001の結合ポリペプチド。
[本発明1003]
改変されたBCループアミノ酸配列が、SEQ ID NO:15～21のいずれか一つより選択される、本発明1001または本発明1002の結合ポリペプチド。
[本発明1004]
改変されたCDループアミノ酸配列が、SEQ ID NO:23～28のいずれか一つより選択される、本発明1001～1003のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1005]
改変されたDEループアミノ酸配列が、SEQ ID NO:30～32のいずれか一つより選択される、本発明1001～1004のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1006]
FN3ドメインが、
少なくとも1つの改変されたループアミノ酸配列を含む、SEQ ID NO:1のヒトフィブロネクチンIII型の第10ドメイン( 10 Fn3)
である、本発明1001～1005のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1007]
10 Fn3ドメインが、C、D、E、またはFβ鎖の1つまたは複数においてアミノ酸置換をさらに含む、本発明1006の結合ポリペプチド。
[本発明1008]
前記アミノ酸置換が、SEQ ID NO:1のR33、E47、T49、およびA74より選択される1つまたは複数の残基にある、本発明1007の結合ポリペプチド。
[本発明1009]
R33におけるアミノ酸置換が、R33V、R33D、およびR33Fからなる群より選択される、本発明1008の結合ポリペプチド。
[本発明1010]
E47におけるアミノ酸置換が、E47TおよびE47Kからなる群より選択される、本発明1008の結合ポリペプチド。
[本発明1011]
T49におけるアミノ酸置換が、T49KおよびT49Aからなる群より選択される、本発明1008の結合ポリペプチド。
[本発明1012]
A74におけるアミノ酸置換が、A74Tである、本発明1008の結合ポリペプチド。
[本発明1013]
SEQ ID NO:1のD3、R6、およびD7より選択される1つまたは複数の残基におけるアミノ酸置換をさらに含む、本発明1006の結合ポリペプチド。
[本発明1014]
FN3ドメインが、
(i)SEQ ID NO:2の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:15の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:30の改変されたDEループアミノ酸配列(N8);
(ii)SEQ ID NO:3の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:16の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:30の改変されたDEループアミノ酸配列(N16);
(iii)SEQ ID NO:4の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:17の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:30の改変されたDEループアミノ酸配列(N18);
(iv)SEQ ID NO:5の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23の改変されたCDループアミノ酸配列(N22);
(v)SEQ ID NO:6の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:19の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23の改変されたCDループアミノ酸配列(N23);
(vi)SEQ ID NO:7の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24の改変されたCDループアミノ酸配列(N24);
(vii)SEQ ID NO:8の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:25の改変されたCDループアミノ酸配列(N26);
(viii)SEQ ID NO:9の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26の改変されたCDループアミノ酸配列(N31);
(ix)SEQ ID NO:10の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26の改変されたCDループアミノ酸配列(N34);
(x)SEQ ID NO:11の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24の改変されたCDループアミノ酸配列(N35);
(xi)SEQ ID NO:12の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:21の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:27の改変されたCDループアミノ酸配列(N38);ならびに
(xii)SEQ ID NO:13の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:28の改変されたCDループアミノ酸配列(C45)
を含む、本発明1001～1013のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1015]
FN3ドメインが、SEQ ID NO:32～43からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1001～1014のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1016]
FN3ドメインが、SEQ ID NO:32～43からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1001～1014のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1017]
FN3ドメインが、SEQ ID NO:32～43からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む、本発明1001～1014のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1018]
FN3ドメインが、SEQ ID NO:32～43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001～1014のいずれかの結合ポリペプチド。
[本発明1019]
本発明1001～1018のいずれかの結合ポリペプチドを含む、第1の部分と、
該第1の部分に接続され、薬学的に活性な部分、診断部分、半減期延長部分、送達ビヒクル、プロドラッグ、第2の結合分子、ポリマー、および非結合タンパク質より選択される、第2の部分と
を含む、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1020]
第2の部分が、薬学的に活性な部分である、本発明1019のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1021]
薬学的に活性な部分が、低分子、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)からなる群より選択される、本発明1020のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1022]
薬学的に活性な部分が、がん治療剤である、本発明1020または本発明1021のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1023]
がん治療剤が、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、および核酸阻害剤より選択される、本発明1022のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1024]
アルカロイドが、デュオカルマイシン、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、本発明1023のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1025]
アルキル化剤が、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロランブシル、クロラナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドHCl、メルファラン、ノベメビキン、ペルホスファミド フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチン ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、本発明1023のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1026]
抗腫瘍性抗生物質が、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-l-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピラビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、本発明1023のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1027]
代謝拮抗物質が、SN-38、デノプテリン、エダトレキセート、メルカプトプリン(6-MP)、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン(2'-DCF)、トムデックス、トリメトレキセート、クラドリジン、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ヒドロキシウレア、ウレタン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、本発明1023のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1028]
抗増殖薬が、アセグラトン、アムサクリン、ビサントレン、カンプトテシン、デホスファミド、デメコルシン、ジアジクオン、ジフロモテカン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、エトプシド、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、ラメラリンD、ロニダミン、ミルテホシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ポドフィリン酸2-エチル-ヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジクオン2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、本発明1023のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1029]
有糸分裂阻害剤が、アウリスタチン、マイタンシノイド、ドラスタチン、ツブリシン、タキサン、エポシロン、ビンカアルカロイド、ならびにその類似体および誘導体からなる群より選択される、本発明1023のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1030]
薬学的に活性な部分が、免疫調節剤である、本発明1020または本発明1021のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1031]
免疫調節剤が、マクロファージ1型刺激剤である、本発明1030のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1032]
マクロファージ1型刺激剤が、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストからなる群より選択される、本発明1031のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1033]
免疫調節剤が、マクロファージ2型刺激剤である、本発明1030のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1034]
マクロファージ2型刺激剤が、IL-33、IL-4受容体アゴニスト、グルココルチコイド、IL-10受容体アゴニスト、およびIL-1受容体アゴニストからなる群より選択される、本発明1033のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1035]
免疫調節剤が、T細胞刺激剤である、本発明1030のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1036]
T細胞刺激剤が、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストである、本発明1035のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1037]
免疫調節剤が、樹状細胞刺激剤である、本発明1030のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1038]
樹状細胞刺激剤が、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、カンプトテシン、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびその誘導体からなる群より選択される、本発明1037のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1039]
免疫調節剤が、好中球刺激剤である、本発明1030のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1040]
好中球刺激剤が、組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)またはペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質である、本発明1039のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1041]
薬学的に活性な部分が、核酸分子である、本発明1021のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1042]
核酸分子が、siRNA、アプタマー、miRNA、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、およびガイドRNAからなる群より選択される、本発明1041のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1043]
薬学的に活性な部分が、送達ビヒクルに接続されている、本発明1020～1042のいずれかのNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1044]
コンジュゲートの第2の部分が、送達ビヒクルである、本発明1019のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1045]
送達ビヒクルが、ナノ粒子、ポリマーベースの粒子、および脂質ベースの粒子より選択される、本発明1043または1044のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1046]
第2の部分が、診断部分である、本発明1019のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1047]
診断部分が、蛍光色素、放射性同位体、画像化に適した造影剤、キレート剤を有する放射性核種、および光増感剤からなる群より選択される、本発明1046のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
[本発明1048]
本発明1001～1018のいずれかのNPC1結合ポリペプチドまたは本発明1019のNPC1結合ペプチドコンジュゲートをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1049]
本発明1048の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1050]
本発明1049のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1051]
本発明1001～1018のいずれかの結合ポリペプチド、本発明1019～1047のいずれかのNPC1結合ペプチドコンジュゲート、本発明1048の単離されたポリヌクレオチド、または本発明1049のベクターと、
薬学的担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1052]
本発明1001～1018のいずれかの結合ポリペプチドと、
薬学的に活性な部分と
を含む、組み合わせ治療剤。
[本発明1053]
薬学的に活性な部分が、低分子、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)からなる群より選択される、本発明1052の組み合わせ治療剤。
[本発明1054]
薬学的に活性な部分が、がん治療剤である、本発明1052または本発明1053の組み合わせ治療剤。
[本発明1055]
がん治療剤が、化学療法剤である、本発明1054の組み合わせ治療剤。
[本発明1056]
化学療法剤が、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ボリノスタット、テモゾロミド、ボルテゾミブ、カルムスチン、およびパクリタキセルより選択される、本発明1055の組み合わせ治療剤。
[本発明1057]
がん治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、本発明1054の組み合わせ治療剤。
[本発明1058]
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤より選択される、本発明1057の組み合わせ治療剤。
[本発明1059]
がん治療剤が、上皮細胞増殖因子(EGFR)阻害剤およびmTOR阻害剤より選択される、本発明1054の組み合わせ治療剤。
[本発明1060]
対象においてがんを処置するための方法であって、以下の工程:
がんを有する対象に、がんを処置するのに有効な量の本発明1051の薬学的組成物を投与する工程
を含む、方法。
[本発明1061]
がんが、対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とする、本発明1060の方法。
[本発明1062]
がんが、H-ras、N-ras、またはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする、本発明1060の方法。
[本発明1063]
がんが、膵臓がん、肺がん、乳がん、結腸がん、神経膠腫、固形腫瘍、メラノーマ、多形性神経膠芽腫、白血病、腎細胞がん、肝細胞がん、前立腺がん、およびミエローマである、本発明1060～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記薬学的組成物と一緒にがん治療剤を投与する工程
をさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1065]
がん治療剤が、化学療法剤である、本発明1064の方法。
[本発明1066]
化学療法剤が、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ボリノスタット、テモゾロミド、ボルテゾミブ、カルムスチン、パクリタキセル、ミトキサントロン、およびカペシタビンより選択される、本発明1065の方法。
[本発明1067]
がん治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、本発明1064の方法。
[本発明1068]
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤より選択される、本発明1067の方法。
[本発明1069]
がん治療剤が、上皮細胞増殖因子(EGFR)阻害剤およびmTOR阻害剤より選択される、本発明1064の方法。
[本発明1070]
放射線療法と一緒に前記薬学的組成物を投与する工程
をさらに含む、本発明1060の方法。
[本発明1071]
対象において感染症を処置するための方法であって、以下の工程:
感染症を有する対象に、感染症を処置するのに有効な量の本発明1001～1018のいずれかの結合ポリペプチドまたは本発明1019のNPC1結合ペプチドコンジュゲートを投与する工程
を含む、方法。
[本発明1072]
感染症が、フィロウイルスによって引き起こされる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
フィロウイルスが、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスである、本発明1072の方法。
[本発明1074]
感染症が、コロナウイルスによって引き起こされる、本発明1071の方法。
[本発明1075]
コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)または中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)である、本発明1074の方法。
[本発明1076]
その必要のある対象において、薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法であって、以下の工程:
該対象にNPC1結合ペプチドコンジュゲートを投与する工程であって、該ペプチドコンジュゲートが、
本発明1001～1018のいずれかの結合ポリペプチドを含む、第1の部分と、
該第1の部分に接続され、薬学的に活性な部分を含む、第2の部分と
を含む、工程
を含む、方法。
[本発明1077]
その必要のある対象において、薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法であって、以下の工程:
該対象に組み合わせ治療剤を投与する工程であって、該組み合わせ治療剤が、
本発明1001～1018のいずれかのNPC1結合ポリペプチドと、
薬学的に活性な部分と
を含む、工程
を含む、方法。
[本発明1078]
薬学的に活性な部分が、低分子、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)からなる群より選択される、本発明1076または本発明1077の方法。
[本発明1079]
対象が神経変性疾患を有し、薬学的に活性な部分が、該神経変性疾患を処置するのに適している、本発明1076～1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病からなる群より選択される、本発明1079の方法。
[本発明1081]
対象が炎症状態を有し、薬学的に活性な部分が、該炎症状態を処置するのに適している、本発明1076～1078のいずれかの方法。
[本発明1082]
炎症状態が、関節リウマチまたはアテローム性動脈硬化症である、本発明1081の方法。
[本発明1083]
対象が骨病態を有し、薬学的に活性な部分が、該骨病態を処置するのに適している、本発明1076～1078のいずれかの方法。
[本発明1084]
骨病態が、骨粗鬆症または骨パジェット病である、本発明1083の方法。
[本発明1085]
対象ががんを有し、薬学的に活性な部分が、該がんを処置するのに適している、本発明1076～1078のいずれかの方法。
[本発明1086]
がんが、RAS経路活性化と関連する、本発明1085の方法。

図1A～1BはがんにおけるNPC1発現を示す。図1Aは、正常隣接組織と比べて膵臓がん組織ではNPC1発現が増加していることを示す。図1Bは、NPC1が膵臓がんにおける予後不良指標であることを示したカプラン・マイヤー生存分析である。データはTCGAデータセットに由来した。 図1Aの説明を参照のこと。 DLD-1がん細胞増殖に対するNPC1阻害の効果を示す。処理して3日後に増殖をSyto60アッセイによって分析した。n=3。 図3Aは、DLD-1およびHCT-116がん細胞株におけるNPC1ノックダウン時の遊離コレステロールのエンドソーム蓄積を示す。フィリピンは遊離コレステロールを標識する。図3Bは、LC3B蓄積によって示されるようなNPC1ノックダウン時のオートファジーフラックス阻害を示す。図3Cは、NPC1を阻害するためにツール化合物を用いたウエスタンブロット分析によるLC3B蓄積の検証を示す。 図3-1の説明を参照のこと。 NPC1トポロジーを示した模式図である。黄色のNTD(コレステロール結合)ドメインの結合剤についてモノボディライブラリーをスクリーニングした。 図5A～5Bは、NPC1 N末端ドメイン(NTD)結合モノボディおよびC末端ドメイン(CTD)結合モノボディを示す。図5Aには、NPC1 NTDに対するモノボディクローンの結合親和性(任意単位)、図5BにはNPC1 CTDに結合するモノボディクローンの結合親和性(任意単位)。FCは非特異的結合対照である。 コレステロールがロードされた状態対コレステロールがロードされていない状態におけるNPC1 NTD結合およびNPC1 CTD結合モノボディを示す。NPC1 NTD(左)およびCTD(右)に結合するモノボディクローンの結合親和性(任意単位)。FCは非特異的結合対照である。 図7A～7Cは、NPC1阻害性モノボディのスクリーニングの結果を示す。図7Aは、細胞内コレステロール輸送に対するモノボディクローンの効果を示したグラフである。図7Bは、図7Aからの代表的な細胞画像である。図7Cは、図7Bからのコレステロール局在化のヒートマップ図である。 図7-1の説明を参照のこと。 図8A～8Bは、NPC1標的モノボディの変異KRas依存的効果を示す。N23およびN34クローンを、マクロピノサイトーシス陰性野生型KRas HeLa細胞(図8A)対マクロピノサイトーシス陽性変異KRas HeLa細胞(図8B)に対する効果について分析した。FNは非標的モノボディ対照である。矢印はLC3B蓄積を示す。 HCT-116細胞増殖に対するモノボディ候補の効果を示す。処理して3日後にSyto60アッセイによって増殖を分析した。n=3。 図10A～10Bは、結腸直腸DLD-1およびHCT-116がん細胞(CRC)におけるモノボディ選択性を示す。候補モノボディN34は、変異KRas CRC細胞株における選択的取り込み(図10A)および生物学的効果(図10B)を示す。 図10Aの説明を参照のこと。 NPC1標的モノボディ(N34)対非標的対照(FN)を用いたインビボコレステロール変化を示す。 NPC1標的モノボディのインビボ生物学的効果を示す。候補モノボディN34は、N34陽性腫瘍対N34陰性腫瘍においてコレステロールおよびLC3Bの蓄積を誘導する。腫瘍抽出の2時間前にモノボディ(1uM; 50ul体積)を腫瘍内注射した。 図13A～13Bは、インビトロおよびインビボでNPC1阻害後にERK過剰活性化が起こることを示す。図13Aは、DLD-1およびHCT-116細胞株においてNPC1ノックダウンするとERK活性化が増加することを示す。図13Bに示したように、候補モノボディN34はN34陽性腫瘍対N34陰性腫瘍においてERKリン酸化を誘導する。腫瘍抽出の2時間前にモノボディ(1uM;50ul体積)を腫瘍内注射した。 図13Aの説明を参照のこと。 EGFRシグナル伝達によってERK過剰活性化が引き起こされることを示す。NPC1ノックダウン後のERK過剰活性化は、ダコミチニブによる短期EGFR阻害時に逆転することができる。 NPC1標的モノボディ処理後のEGFRリン酸化を示す。候補モノボディN34は、N34陽性腫瘍対N34陰性腫瘍においてEGFRリン酸化を誘導する。腫瘍抽出の2時間前にモノボディ(1uM;50ul体積)を腫瘍内注射した。図13Bからの連続切片の画像を撮影した。 スプリットGFPを用いて、NCP1モノボディがGFP11のエンドソーム放出を誘導したことを示す。細胞質GFP1-10を安定発現する変異Ras PDAC MIA PaCa-2細胞を1mMのN23もしくはN34 NCP1モノボディと共に、または1mMのN23もしくはN34 NCP1モノボディなしで600mM GFP11で24時間処理した。蛍光はGFP11のエンドソーム脱出に依存し、NCP1モノボディで処理された細胞において観察されたが、非結合FNモノボディで処理された細胞では観察されなかった。 NCP1モノボディによって誘導されるエンドソームカルセイン放出を示す。カルセインは、小胞区画内で他のカルセイン分子のすぐ近くにある時にセミクエンチされるが、細胞内放出および分子拡散されるとデクエンチによって細胞蛍光が増加する、膜不透過性の液相取り込みマーカーである。N23およびN34 NCP1モノボディ処理によってカルセイン蛍光が増加するが、非結合FNモノボディ処理では増加しないことを示す。 図18A～18Bは、ナノ粒子送達ビヒクルの存在下でさらに改善された、NCP1モノボディを介したエンドソームカルセイン放出の増加を示す。図18Aは、カルセイン単独(PBS)で処理した、またはペグ化ナノ粒子送達ビヒクル(90nm ナノ)の中に入れて処理したPDAC MIA PaCa3細胞の免疫細胞化学的画像のパネルである(上部の横列の画像)。N23またはN34 NCP1モノボディそれぞれで細胞を同時処理すると、両条件下でのエンドソームカルセイン放出が強化された。図18Bは、処理された条件それぞれのカルセイン蛍光を定量したグラフである。カルセインとNPC1モノボディとを含有するナノ粒子で処理した細胞において最も高いレベルのカルセイン蛍光が観察された。 図18Aの説明を参照のこと。
詳細な説明
本発明は、概して、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチド、およびこれらの結合ポリペプチドを含むNPC1結合ペプチドコンジュゲート、ならびにがん、感染症、および他の病態を処置するための、これらのNPC1結合ポリペプチドおよびNPC1結合ペプチドコンジュゲートを使用する方法に関する。
従って、本開示の第1の局面は、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチドに関する。このNPCI結合ポリペプチドは、改変されたFGループアミノ酸配列、改変されたBCループアミノ酸配列、改変されたCDループアミノ酸配列、改変されたDEループアミノ酸配列、または上記の改変されたループ配列の任意の組み合わせを有する、フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含む。1つまたは複数の改変されたループ配列は、NPC1との結合を可能にする。
FN3ドメインは、約100アミノ酸長の、βサンドイッチ構造を有する進化的に保存されたタンパク質ドメインである。ヒトFN3のβサンドイッチ構造は、鎖A、B、C、D、E、F、Gと呼ばれる7つのβ鎖と、免疫グロブリン結合ドメインに対して構造相同性を示すループAB、BC、CD、DE、EF、およびFGと呼ばれる6つの接続ループを含む。6つのループのうち3つ、すなわち、ループDE、BC、およびFGは、位相幾何学的に抗体の相補性決定領域、すなわち、CDR1、CDR2、およびCDR3に対応する。残りの3つのループは、抗体CDR3と同様に表面に露出している。本開示によれば、NPC1と特異的結合できるように、結合分子の各FN3ドメインのループ領域の1つまたは複数が改変される。
本明細書で使用する「特異的に結合する」または「特異的結合」は、本開示のFN3含有結合分子が、予め決められた抗原、すなわち、NPC1に、約1×10-6M以下、例えば、約1×10-7M以下、約1×10-8M以下、約1×10-9M以下、約1×10-10M以下、約1×10-11M以下、約1×10-12M以下、または約1×10-13M以下の解離定数(KD)で結合する能力を指す。典型的に、FN3ドメインは、例えば、ProteonInstrument(BioRad)を用いて表面プラズモン共鳴によって測定された時に、非特異的抗原(例えばBSAまたはカゼイン)に対するKDよりも少なくとも1/10のKDでNPC1に結合する。
本開示の結合分子の改変されたFN3ドメインは、これらのドメインを含有する、多種多様な動物、酵母、植物、および細菌の細胞外タンパク質のいずれかに由来するFN3ドメインでもよい。一態様では、FN3ドメインは哺乳動物FN3ドメインに由来する。例示的なFN3ドメインは、例えば、ヒトテネイシンCに存在する15の異なるFN3ドメイン、またはヒトフィブロネクチン(FN)に存在する15の異なるFN3ドメインのいずれか一つ、例えば、第10フィブロネクチンIII型ドメインを含むが、それに限定されるわけではない。例示的なFN3ドメインには、非天然合成FN3ドメイン、例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Jacobsらへの米国特許出願公開第2010/0216708号に記載の非天然合成FN3ドメインも含まれる。個々のFN3ドメインはドメイン番号とタンパク質名、例えば、フィブロネクチンの第10 FN3ドメイン(10FN3)によって言及される。
一部の態様では、結合分子のFN3ドメインはフィブロネクチンの第10 FNドメイン(10FN3)に由来する。一部の態様では、結合分子のFN3ドメインはヒト10FN3ドメインに由来する。ヒト10FN3ドメインは、以下に示したようにSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する。SEQ ID NO:1の野生型配列中にある、BC(残基24～30)、CD(残基40～45)、DE(残基51～55)、およびFG(残基75～86)ループの場所に下線を引いた。この開示において言及される他のアミノ酸残基の場所もSEQ ID NO:1の中の位置によって特定される。
本開示によれば、NPC1の結合特異性および親和性が可能になるように、ループ領域の1つもしくは複数、またはこれらのループ領域の1つもしくは複数の中にある選択された残基が改変される。適切な改変には、アミノ酸置換、挿入、および/または欠失が含まれる。一局面では、NPC1の結合特異性および親和性のために、ループ領域の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または6つ全てにあるアミノ酸残基が変えられる。一態様では、ループ領域内にある、SEQ ID NO:1の残基24～30(BCループ)、40～45(CDループ)、51～55(DEループ)、および75～86(FGループ)、または約残基24～30(BCループ)、40～45(CDループ)、51～55(DEループ)、および75～86(FGループ)での1つまたは複数のアミノ酸改変がNPC1結合領域を形成する。別の態様では、これらのループ領域のいずれか一つにある1つまたは複数のアミノ酸改変がNPC1結合を可能にする。
一部の態様では、本開示のNCP1結合分子は、改変されたBCループを含む。一部の態様では、改変されたBCループは、SEQ ID NO:15～21(表1を参照されたい)の改変されたBCループのいずれか一つ、またはSEQ ID NO:15～21のアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するBCループより選択される。
一部の態様では、本開示のNCP1結合分子は、改変されたCDループを含む。一部の態様では、改変されたCDループは、SEQ ID NO:23～28(表1を参照されたい)の改変されたCDループのいずれか一つ、またはSEQ ID NO:23～28のアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCDループより選択される。
一部の態様では、本開示のNCP1結合分子は、改変されたDEループを含む。一部の態様では、改変されたDEループは、SEQ ID NO:14、22、および30(表1を参照されたい)のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:14、22、および30のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するDEループを含む。
一部の態様では、本開示のNCP1結合分子は、改変されたFGループを含む。一部の態様では、改変されたFGループは、SEQ ID NO:2～13(表1を参照されたい)の改変されたFGループのいずれか一つ、またはSEQ ID NO:2～13のアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するFGループより選択される。
(表１)NCP1結合分子のBC、CD、DE、およびFGループのアミノ酸配列
前記で考察したように、FN3ドメインは、分子の反対の面に2組のCDR様ループを含有する。2組のループは、FN3構造の中央を形成するβ鎖(ループ間にあるドメイン領域)によって隔てられている。ループと同様に、これらのβ鎖は、標的分子の結合特異性および親和性を強化するように変えることができる。好ましくは、β鎖にある表面に露出している残基の一部または全てが、FN3ドメインの固有の安定性に影響を及ぼすことなく(または最小限にしか影響を及ぼさずに)無作為化される。一部の態様では、NPC1と相互作用できるように、1つまたは複数のβ鎖にある残基の1つまたは複数が改変される。適切な改変にはアミノ酸置換、挿入、および/または欠失が含まれる。例えば、NPC1に結合できるように、またはNPC1結合の特異性もしくは親和性を強化するようにするために、Aβ鎖、Bβ鎖、Cβ鎖、Dβ鎖、Eβ鎖、Fβ鎖、またはGβ鎖の1つまたは複数のアミノ酸残基が改変され得る。一態様では、NPC1に結合するために、A、B、C、D、E、および/またはFβ鎖の1つまたは複数のアミノ酸残基が改変される。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、Aβ鎖またはその上流の領域において1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を含む。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、およびD7に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置3のアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン酸からセリンへの置換(D3S)、SEQ ID NO:1の位置6のアルギニンに対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからスレオニンへの置換(R6T)、および/またはSEQ ID NO:1の位置7のアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン酸からリジンへの置換(D7K)である。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のD3S、R6T、およびD7Kに対応するアミノ酸残基におけるアスパラギン酸からセリン、アルギニンからスレオニン、およびアスパラギン酸からリジンのアミノ酸置換を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、Cβ鎖中に1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を含む。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、Cβ鎖中の、SEQ ID NO:1の位置31にあるチロシン残基に対応する残基にアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置31にあるチロシンに対応するアミノ酸残基におけるチロシンからヒスチジンへの置換(Y31H)である。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、Cβ鎖の中の、SEQ ID NO:1の位置33にあるアルギニン残基に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置33のアルギニンに対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからバリンへの置換(R33V)である。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置33のアルギニンに対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからアスパラギン酸への置換(R33D)である。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置33のアルギニンに対応するアミノ酸残基におけるアルギニンからフェニルアラニンへの置換(R33F)である。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、Dβ鎖における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を含む。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、Dβ鎖の中の、SEQ ID NO:1の位置47にあるグルタミン酸残基に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置47のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基におけるグルタミン酸からスレオニンへの置換(E47T)である。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置47のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基におけるグルタミン酸からリジンへの置換(E47K)である。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、Dβ鎖の中の、SEQ ID NO:1の位置49のスレオニン残基に対応する残基におけるアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置49のスレオニンに対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからリジンへの置換(T49K)である。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置49のスレオニンに対応するアミノ酸残基におけるスレオニンからアラニンへの置換(T49A)である。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、Fβ鎖における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を含む。一部の態様では、NCP1結合ポリペプチドは、Dβ鎖の中の、SEQ ID NO:1の位置74にあるアラニン残基に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、SEQ ID NO:1の位置74にあるアラニンに対応するアミノ酸残基でのアラニンからスレオニンへの置換(A74T)である。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、A鎖、C鎖、D鎖、E鎖、およびFβ鎖における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を含む。一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、上記のアミノ酸残基の全てに対応する位置、すなわち、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:2の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:15の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:14の改変されたDEループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、およびD7に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列(モノボディ(Mb)NPC1N-N8)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:3の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:16の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:22の改変されたDEループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、およびD7に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、 SEQ ID NO:33のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列(MbNPC1N-N16)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、 SEQ ID NO:4の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:17の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:30の改変されたDEループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、およびD7に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列(MbNPC1N-N18)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:5の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列(MbNPC1N-N22)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:6の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:19の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、E47、およびA74に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列(MbNPC1N-N23)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:7の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列(MbNPC1N-N24)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:8の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:25の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列(MbNPC1N-N26)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:9の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列(MbNPC1N-N31)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:10の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列(MbNPC1N-N34)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:11の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列(MbNPC1N-N35)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:12の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:21の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:27の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、Y31、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列(MbNPC1N-N38)を含む。
一部の態様では、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドは、SEQ ID NO:13の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:28の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを含む。一部の態様では、FNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、FNドメインは、残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:43のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:43のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:43のアミノ酸配列(MbNPC1C-C45)を含む。
本開示の別の局面は、第1の部分と第2の部分とを含むNPC1結合ペプチドコンジュゲートに関する。NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第1の部分は、前記のようなNPCI結合ポリペプチドを含む。NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第2の部分はコンジュゲートの第1の部分と接続されており、薬学的に活性な部分、診断部分、半減期延長部分、プロドラッグ、第2の結合分子、送達ビヒクル、ポリマー、非結合タンパク質、およびその任意の組み合わせより選択される。
本開示のこの局面によれば、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第1の部分と第2の部分とは、直接、またはリンカーを介して共有結合により接続されている。第1の部分と第2の部分とは、標準的なクローニングと発現法によって直接、融合および生成され得る。または、部分を直接、またはペプチドもしくは他のリンカーを介して取り付けて本明細書に記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲートを生成するために、周知の化学カップリング法が使用され得る。例えば、共有結合による第1の部分と第2の部分とのコンジュゲーションは、活性化エステルまたはイソチオシアネートを用いてリジン側鎖を介して成し遂げられてもよく、マレイミド、ハロアセチル誘導体、または活性化ジスルフィドを用いてシステイン側鎖を介して成し遂げられてもよい。第1の部分と第2の部分との部位特異的コンジュゲーションはまた、非天然アミノ酸、自己標識タグ(例えば、SNAPもしくはDHFR)、またはソルターゼA、リポ酸リガーゼ、およびホルミルグリシン生成酵素などの別の酵素によって特異的に認識および修飾されるタグを組み込むことでも成し遂げることができる。一部の態様では、第1の部分と第2の部分との部位特異的コンジュゲーションは、NCP1結合分子のC末端に、またはその全体が本明細書において参照により組み入れられる、Goldberg et al.,「Engineering a Targeted Delivery Platform Using Centyrins」, Protein Engineering, Design & Selection 29(12):563-572 (2016)に記載のような特定の部位にシステイン残基を導入することによって成し遂げられる。
一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第1の部分と第2の部分はリンカーを介して一緒に接続される。一部の態様では、前記リンカーはアミノ酸リンカーである。一部の態様では、アミノ酸リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の態様では、アミノ酸リンカーは、切断不可能なリンカーである。適切なリンカーには、グリシンおよびセリンまたはアラニンおよびプロリンなどのアミノ酸の1つまたは複数の反復モジュールで構成されるペプチドが含まれる。例示的なリンカーペプチドには、例えば、(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Gly3-Ser)n、(Ala-Pro)nが含まれ、式中、nは1～25の整数である。リンカーの長さは、非結合タンパク質-薬物コンジュゲートの機能に影響を及ぼさない限り、適切に調節され得る。標準的な15アミノ酸(Gly4-Ser)3リンカーペプチドは十分に特徴付けられており、構造不定の柔軟なコンホメーションをとることが示されている。さらに、このリンカーペプチドは、リンカーペプチドが接続するドメインの集合および活性を妨害しない(Freund et al., 「Characterization of the Linker Peptide of the Single-Chain Fv Fragment of an Antibody by NMR Spectroscopy」, FEBS 320:97 (1993)。この開示は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる)。
一部の態様では、本開示のNPC1結合ペプチドコンジュゲートの第2の部分は半減期延長部分を含む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変種(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Andersenらへの米国特許第8,822,417号、Desaiらへの米国特許第8,314,156号、およびPlumridgeらへの米国特許第8,748,380号を参照されたい)、アルブミン結合タンパク質および/またはドメイン、トランスフェリンならびにその断片および類似体(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Priorらへの米国特許第7,176,278号を参照されたい)、Fc領域および変種Fc領域(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Lazarらへの米国特許第8,546,543号、Tsuiへの米国特許出願公開第20150125444号、ならびにSeehraらへの米国特許第8,722,615号を参照されたい)を含むが、それに限定されるわけではない。
NPC1結合ペプチドコンジュゲートの他の第2の部分の半減期延長部分は、望ましい特性のために、ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えば、PEG5000またはPEG20,000、様々な鎖長の脂肪酸および脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖、または多糖類)を含むが、それに限定されるわけではない。ペギル(pegyl)部分が、例えば、当技術分野において周知の方法を用いてシステイン残基を分子のC末端に付加し、ペギル基をシステインに取り付けることによって、第1の部分、すなわち、NCP1結合分子に付加されてもよい。
別の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第2の部分は診断部分を含む。適切な診断部分は、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの検出、定量、分離、および/または精製を容易にする部分である。適切な診断部分は、精製タグ(例えば、ポリ-ヒスチジン(His6-)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST-)、またはマルトース結合タンパク質(MBP-))、蛍光色素またはタグ(例えば、キレート(ユーロピウムキレート)、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッド)、酵素タグ、放射性同位体または放射性標識(例えば、4C、11C、14N、35S、3H、32P、99mTc、111In、62/64Cu、125I、18F、67/68Ga、90Y、177Lu、および186/188Re)、キレート剤を有する放射性核種(例えば、MAG3、DTPA、およびDOTA。その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Liu S., 「Bifunctional Coupling Agents for Radiolabeling of Biomolecules and Target Specific Delivery of Metallic Radionuclides」, Adv. Drug Deli. 60(12):1347-1370 (2008)も参照されたい)、画像化に適した造影剤、または光増感剤を含むが、それに限定されるわけではない。
診断部分として放射性核種と組み合わせて使用される適切なキレート剤は、NOTA(1,4,7-トリアザ-シクロノナン-N,N',N''-三酢酸)、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-l,4,7,10-四酢酸)、DTPA(1,1,4,7,7-ジエチレントリアミンペンタ酢酸)、TETA(p-ブロモアセトアミド-ベンジル-テトラエチルアミン四酢酸)、およびDf(デスフェリオキサミンB)を含むが、それに限定されるわけではない。これらのそれぞれが、様々な放射標識、放射性核種、放射性同位体、金属、および放射性金属と共に使用することができる。リガンドが、カルボキシレートまたはアミン基などのハード塩基キレート化官能基を含むDOTA型キレート剤が、ハード酸カチオンをキレート化するのに最も有効である。このような金属キレート錯体は環のサイズを関心対象の金属に合わせることで非常に安定にすることができる。同様に、複数のタイプのキレート剤が、複数の金属イオン、例えば、診断用放射性核種および/または治療用放射性核種に結合するように、標的可能な構築物とコンジュゲーションされ得る。
キレート剤は標準的なバイオコンジュゲーション法を用いてコンジュゲートのNPCI結合ポリペプチド(すなわち、FN3ドメイン)に共有結合することができる。FN3ドメイン中のアミン含有残基(例えば、リジン)は、活性化エステル(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)を含有するキレート剤とアミド結合を形成する。硫黄含有残基(例えば、システイン)は、活性化エステルまたはマレイミド部分を含有するキレート剤とコンジュゲーションされる。または、FN3ドメインの活性化カルボキシレート残基が、キレート剤上にあるアミン基とアミド形成するか、またはチオール基とチオイエステル(thoiester)形成する時にバイオコンジュゲートは形成される。例えば、PEG-マレイミド(PEG-Mal)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート(SMCC)またはN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)などの二官能性リンカーを代わりに使用することができる。
NPC1結合ペプチドコンジュゲート中の診断部分として使用するのに適した画像化剤は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)剤、ポジトロン放出断層撮影法(PET)剤、磁気共鳴画像(MRI)剤、核磁気共鳴画像(NMR)剤、X線剤、光学的薬剤(例えば、フルオロフォア、生物発光プローブ、近赤外線色素、量子ドット)、超音波剤および中性子捕獲療法剤、コンピュータ支援断層撮影剤、2光子蛍光顕微鏡画像化剤、ならびに多光子顕微鏡画像化剤を含むが、それに限定されるわけではない。キレート剤に結合することができる特に有用な診断用放射標識、放射性核種、または放射性同位体は、110In、mIn、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、9V、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、158Gd、32P、nC、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、または他のγ、β、もしくはポジトロン放射体、およびMRIに適した酸化鉄の極小超常磁性粒子(ultra-small superparamagnetic particle)(USPIO)を含むが、それに限定されるわけではない。診断用放射標識は、25～10,000keV、より好ましくは、25～4,000keV、さらにより好ましくは20～1,000keV、さらにより好ましくは70～700keVの崩壊エネルギーを含む。有用なポジトロン放射放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは<2,000keV、より好ましくは1,000keV未満、および最も好ましくは<700keVである。
別の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第2の部分は、薬学的に活性な部分を含む。適切な薬学的に活性な部分は、低分子活性部分、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分はがん治療剤である。適切ながん治療剤は、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、および核酸阻害剤、および免疫調節剤を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤はアルカロイドである。適切なアルカロイドは、デュオカルマイシン、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤はアルキル化剤である。適切なアルキル化剤は、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロランブシル、クロラナファジン(chloranaphazine)、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドHCl、メルファラン、ノベメビキン(novemebichin)、ペルホスファミド フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチン ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は抗腫瘍性抗生物質である。適切な抗腫瘍性抗生物質は、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン(cromomycin)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-l-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピラビシン(epirabicin)、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン(nogalamycine)、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は代謝拮抗剤である。適切な代謝拮抗剤は、SN-38、デノプテリン、エダトレキセート、メルカプトプリン(6-MP)、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン(2'-DCF)、トムデックス、トリメトレキセート、クラドリジン(cladridine)、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ヒドロキシウレア、ウレタン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は抗増殖薬である。適切な抗増殖薬は、アセグラトン、アムサクリン、ビサントレン、カンプトテシン、デホスファミド、デメコルシン、ジアジクオン、ジフロモテカン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、エトプシド(etopside)、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、ラメラリンD、ロニダミン、ミルテホシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ポドフィリン酸(podophillinic acid)2-エチル-ヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジクオン2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、がん治療剤は有糸分裂阻害剤である。適切な有糸分裂阻害剤は、アウリスタチン、マイタンシノイド、ドラスタチン、ツブリシン、タキサン、エポシロン、ビンカアルカロイド、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分は免疫調節剤である。適切な免疫調節剤は、マクロファージ1型刺激剤、マクロファージ2型刺激剤、樹状細胞刺激剤、好中球刺激剤、B細胞刺激剤、T細胞刺激剤を含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分は、マクロファージ1型刺激剤である免疫調節剤である。適切なマクロファージ1型刺激剤は、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニスト、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ1型刺激剤はCSF-1受容体アンタゴニストである。適切なCSF-1受容体アンタゴニストは、ABT-869(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、ABT-869(Guo et al., 「Inhibition of Phosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor (c-Fms) Tyrosine Kinase in Transfected Cells by ABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors」, Mol. Cancer. Ther. 5(4):1007-1012 (2006))、イマチニブ(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Guo et al., 「Inhibition of Phosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor (c-Fms) Tyrosine Kinase in Transfected Cells by ABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors」, Mol. Cancer. Ther. 5(4):1007-1012 (2006))、PLX3397(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Mok et al., 「Inhibition of CSF1 Receptor Improves the Anti-tumor Efficacy of Adoptive Cell Transfer Immunotherapy」, Cancer Res. 74(1):153-161 (2014))、PLX5622(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Dagher et al., 「Colony-stimulating Factor 1 Receptor Inhibition Prevents Microglial Plaque Association and Improves Cognition in 3xTg-AD Mice」, J. Neuroinflamm. 12:139 (2015))、DCC-3014(Deciphera Pharmaceuticals)、BLZ945(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Krauser et al., 「Phenotypic and Metabolic Investigation of a CSF-1R Kinase Receptor Inhibitor (BLZ945) and its Pharmacologically Active Metabolite」, Xenobiotica 45(2):107-123 (2015))、およびGW2580(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Olmos-Alonso et al., 「Pharmacological Targeting of CSF1R Inhibits Microglial Proliferation and Prevents the Progression of Alzheimer’s-like Pathology」, Brain 139:891-907 (2016)を含むが、それに限定されるわけではない)を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ1型刺激剤はIL-10受容体アンタゴニストである。適切なIL-10受容体アンタゴニストは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Naiyer et al., 「Identification and Characterization of a Human IL-10 Receptor Antagonist」, Hum. Immunol. 74(1):28-31 (2013)に記載のペプチドアンタゴニスト、およびその全体が本明細書において参照により組み入れられる、Von Herrathらへの米国特許第7,553,932号に記載のIL-10受容体アンタゴニスト抗体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ1型刺激剤はTLR-2アゴニストである。本明細書に記載の方法において使用するための適切なTLR-2アゴニストは、合成トリアシル化リポタンパク質であるPam3CSK4、およびリポテイコ酸(LTA)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Brandt et al., 「TLR2 Ligands Induce NF-κB Activation from Endosomal Compartments of Human Monocytes」 PLoS One 8(12):e80743)を含む。適切なTLR-3アゴニストは、ポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Smole et al., 「Delivery System for the Enhanced Efficiency of Immunostimulatory Nucleic Acids」, Innate Immun. 19(1):53-65 (2013))を含むが、それに限定されるわけではない。適切なTLR-4アゴニストは、MPL(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011))、グルコピラノシルリピド-A(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Matzner et al., 「Perioperative treatment with the new synthetic TLR-4 agonist GLA-SE reduces cancer metastasis without adverse effects」, Int. J. Cancer 138(7):1754-64 (2016))、およびImmunomax(登録商標)(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ghochikyan et al., 「Targeting TLR-4 with a novel pharmaceutical grade plant derived agonist, Immunomax(登録商標), as a therapeutic strategy for metastatic breast cancer」, J. Trans. Med. 12:322 (2014))を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ1型刺激剤はTLR-7アゴニストである。適切なTLR-7アゴニストは、ウリジン/グアニジンリッチ一本鎖RNA(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011))、852A (その全体が本明細書において参照により組み入れられ、Dudek et al., 「First in Human Phase I Trial of 852A, a Novel Systemic Toll-like Receptor 7 Agonist, to Activate Innate Immune Responses in Patients With Advanced Cancer」, Clin. Cancer Res. 13(23):7119-7125 (2007))、レシキモド(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Chang et al., 「Topical resiquimod Promotes Priming of CTL to Parenteral Antigens」, Vaccine 27(42):5791-5799 (2009))、イミダゾキノリン(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Itoh et al., 「The Clathrin-mediated Endocytic Pathway Participates in dsRNA-induced IFN-beta Production」, J. Immunol. 181:5522-9 (2008))、ANA975(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Fletcher et al., 「Masked oral Prodrugs of Toll-like Receptor 7 Agonists: a New Approach for the Treatment of Infectious Disease」, Curr. Opin. Investig. Drugs 7(8):702-708 (2006))、およびイミキモド(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011))を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ1型刺激剤はTLR-8アゴニストである。適切なTLR-8アゴニストは、レシキモド(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Chang et al., 「Topical resiquimod Promotes Priming of CTL to Parenteral Antigens」, Vaccine 27(42):5791-5799 (2009))、およびイミダゾキノリン(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Itoh et al., 「The Clathrin-mediated Endocytic Pathway Participates in dsRNA-induced IFN-beta Production」, J. Immunol. 181:5522-9 (2008))を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ1型刺激剤はTLR-9アゴニストである。適切なTLR-9アゴニストは、CpG-ODN(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Yao et al., 「Late Endosome/Lysosome-localized Rab7b Suppresses TLR-9-initiated Proinflammatory Cytokine and Type I IFN Production in Macrophages」, J. Immunol. 183:1751-8 (2009))を含むが、それに限定されるわけではない。使用に適した特定のCpG-ODNは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Engel et al., 「The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the Immune System」, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 4(2):275-289 (2011)に記載されている。
本明細書に記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲートに含める目的で、2型マクロファージを1型マクロファージにリプログラミングするための当技術分野において公知の他の薬剤(すなわち、マクロファージ1型刺激剤)は、二酸化マンガンナノ粒子(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Song et al.,「Bioconjugated Manganese Dioxide Nanoparticles Enhance Chemotherapy Response by Priming Tumor-Associated Macrophages toward M1-like Phenotype and Attenuating Tumor Hypoxia」 ACS Nano. 10:633-647 (2016)を参照されたい)、フェルモキシタール(ferumoxytal)ナノ粒子(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Zanganeh, et al. 「Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues」, Nat. Nanotechnol. 11:986-994 (2016))、IκBαに対するマンノシル化ナノ粒子カプセル化siRNA(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ortega et al. 「Manipulating the NF-kappaB pathway in macrophages using mannosylated, siRNA-delivering nanoparticles can induce immunostimulatory and tumor cytotoxic functions」, Int. J. Nanomed. 2163-2177 (2016))を含む。
一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分はマクロファージ2型刺激剤である。適切なマクロファージ2型刺激剤は、IL-33、IL-4受容体アゴニスト、グルココルチコイド、IL-10受容体アゴニスト、IL-1受容体アゴニスト、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ2型刺激剤はIL-4受容体アゴニストである。適切なIL-4受容体アゴニストは変異IL-4タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。例示的な変異IL-4タンパク質は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Sebaldへの米国特許第5,723,118号に記載の変異IL-4タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ2型刺激剤はグルココルチコイドである。グルココルチコイドは、当技術分野において周知であり、かつマクロファージ2型表現型を誘導するのに適したコルチコステロイドの一種である。本開示のNPC1結合ペプチドコンジュゲートに組み込むための例示的なグルココルチコイドは、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、およびアルドステロンを含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ2型刺激剤はIL-10受容体アゴニストである。適切なIL-10受容体アゴニストは、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Sommerへの米国特許第7,749,490号に記載の変異IL-10タンパク質を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、マクロファージ2型刺激剤はIL-1受容体アゴニストである。適切なIL-1受容体アゴニストは、IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、およびIL-36γ(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Palomo et al., 「The Interleukin (IL)-1 Cytokine Family- Balance Between Agonists and Antagonists in Inflammatory Diseases」, Cytokine 76(1):25-37 (2015))を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分はT細胞刺激剤である。任意の態様において、T細胞刺激剤は、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストである。適切なSTINGアゴニストは、環状ジヌクレオチド(CDN)、例えば、環状二量体グアノシン一リン酸(c-di-GMP)、環状二量体アデノシン一リン酸(c-di-AMP)、環状GMP-AMP(cGAMP)、およびジチオ-(RP,RP)-[環状[A(2',5')pA(3',5')p(ADU-S100, Aduro Biotech)、ならびに低分子、例えば、5,6-ジメチルキサテンテノン-4-酢酸(DMXAA)および連結されたアミドベンズイミダゾールを含むが、それに限定されるわけではない。本開示に従う適切な免疫調節剤でもある開発中の他のSTINGアゴニストは、BMS-986301、E7766、GSK3745417、MK-1454、MK-2118、およびSB11285を含む。
任意の態様において、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分は樹状細胞刺激剤である。適切な樹状細胞刺激剤は、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、トポイソメラーゼI阻害剤(例えば、カンプトテシンおよびその誘導体)、微小管脱重合薬(例えば、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびその誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分は好中球刺激剤である。適切な好中球刺激剤は、組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)およびペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質を含む。
一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分は核酸分子である。適切な核酸分子活性部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、アプタマー、miRNA、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、およびガイドRNA、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの薬学的に活性な部分は送達ビヒクルに接続されるか、または送達ビヒクルの中に入れられる。従って、一部の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートは、送達ビヒクルに接続されたNPC1結合ポリペプチドを含む。任意の態様において、送達ビヒクルは、薬学的に活性な部分を含有する。
本開示のこの局面によれば、当技術分野において公知の任意の適切な薬物送達ビヒクルをNPC1結合ポリペプチドに接続して、本明細書に記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲートを形成することができる。任意の態様において、薬物送達ビヒクルは、当技術分野において公知のナノ粒子送達ビヒクル、ポリマーベースの粒子、または脂質ベースの粒子送達ビヒクルであり(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Xiao et al., 「Engineering Nanoparticles for Targeted Delivery of Nucleic Acid Therapeutics in Tumor」, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 12: 1-18 (2019)、およびNi et al., 「Synthetic Approaches for Nucleic Acid Delivery: Choosing the Right Carriers」, Life 9(3): 59 (2019)を参照されたい)、本明細書に記載の方法において使用することができる。
適切なナノ粒子送達ビヒクルは、金ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、カジナム(cadinum)(量子ドット)ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ならびに当技術分野において公知の他の任意の固体無機材料に由来する粒子を含むが、それに限定されるわけではない。
適切なポリマーベースの粒子またはポリプレックス担体は、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン(PEI)、ならびに/またはポリエチレングリコール(PEG)およびシクロデキストリンのような中性ポリマーとコンジュゲーションされたカチオン性ポリマーを含む。本明細書に記載の方法に従う核酸分子または発現ベクター送達を容易にするための他の適切なPEIコンジュゲートはPEI-サリチルアミドコンジュゲートおよびPEI-立体酸(steric acid)コンジュゲートを含むが、それに限定されるわけではない。送達ビヒクル材料として使用するのに適した他の合成カチオン性ポリマーは、ポリ-L-リジン(PLL)、ポリアクリル酸(PAA)、ポリアミドアミン-エピクロロヒドリン(PAE)およびポリ[2-(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート](PDMAEMA)を含むが、それに限定されるわけではない。送達ビヒクル材料として使用するのに適した天然カチオン性ポリマーは、キトサン、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、ゼラチン、デキストラン、セルロース、およびシクロデキストリンを含むが、それに限定されるわけではない。
適切な脂質ベースのビヒクルは、カチオン性脂質ベースのリポプレックス(例えば、1,2-ジオレオイル-3トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP))、中性脂質ベースのリポプレックス(例えば、コレステロールおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE))、アニオン性脂質ベースのリポプレックス(例えば、コレステリルヘミスクシネート(CHEMS))、およびpH感受性脂質リポプレックス(例えば、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA))を含む。他の適切な脂質ベースの送達粒子は、リポフェクタミンおよびDLin-MC3-DMA((6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル-4-(ジメチルアミノ)ブタノエート)の中に、イオン化可能なDOSPAを組み込んでいる。
一部の態様では、がん治療剤はPROTACである。適切なPROTACには、BETデグレーダー(BET degrader)、例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Pillow et al., 「Antibody Conjugation of a Chimeric BET Degrader Enables In vivo Activity」, ChemMedChem 15(1): 17-25 (2020)に開示されるBETデグレーダーを含むが、それに限定されるわけではない。適切なPROTACはRas経路デグレーダーも含む。例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Bond et al., 「Targeted Degradation of Oncogenic KRAS (G12C) by VHL-recruiting PROTAC」, ACS Cent. Sci. 6(8):1367-75 (2020); Nabet et al., 「The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation」, Nat Chem Biol. 14(5):431-41 (2018); Simpson et al., 「Inducible degradation of target proteins through a tractable affinity-directed protein missile system」, Cell Chem Biol. 27(9):1164-80.e5 (2020); Cheng et al., 「Discovery of novel PDEδ degraders for the treatment of KRAS mutant colorectal cancer」, J Med Chem. 63(14):7892-905 (2020); Crew et al., 「Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-recruiting proteolysis targeting chimeras (PROTAC) of TANK-binding kinase 1」, J Med Chem. 61(2):583-98 (2018); Vollmer et al., 「Design, Synthesis, and Biological Evaluation of MEK PROTAC」, J Med Chem. 63(1):157-62 (2020);およびYang et al., 「Discovery of thalidomide-based PROTAC small molecules as the highly efficient SHP2 degraders」, Eur J Med Chem. 218:113341 (2021)に記載のRas経路デグレーダーを参照されたい。
別の態様では、NPC1結合ペプチドコンジュゲートの第2の部分は第2のポリペプチドを含む。一部の態様では、第2のポリペプチドは非結合分子である。一部の態様では、前記ポリペプチドは第2の結合分子である。一部の態様では、第2の結合分子は抗体またはその抗体結合ドメインである。本明細書で使用する抗体は、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも1つ、少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つの相補性決定領域(CDR)、重鎖もしくは軽鎖の可変領域、重鎖もしくは軽鎖の定常領域、フレームワーク領域、またはその任意の部分などがあるが、これに限定されない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチドを含有する分子を含む。抗体は、単鎖抗体、シングルドメイン抗体(すなわち、独立して、他のV領域またはドメインの抗原、またはエピトープに特異的に結合する、VHH、VH、またはVLでもよい、唯一の可変ドメインを含む抗体断片)を含むが、それに限定されるわけではない、抗体またはその指定された断片もしくは部分の構造および/または機能を模倣する抗体の一部を含むが、それに限定されるわけではない、完全抗体、消化断片、その指定された部分および変種を含む。機能的断片は、特定の標的に結合する抗原結合断片を含む。例えば、特定の標的またはその部分に結合することができる抗体断片は、Fab(例えば、パパイン消化による)、Fab'(例えば、ペプシン消化および部分的還元による)、およびF(ab')2(例えば、ペプシン消化による)、Fd(例えば、ペプシン消化、部分的還元、および再凝集による)、FvまたはscFv(例えば、分子生物学技法による)断片を含むが、これに限定されない。
本開示の別の局面は、本明細書に記載のNPC1結合分子またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示の核酸分子は、単離されたポリヌクレオチド、発現ベクターの一部、またはインビトロ転写/翻訳に用いられる直鎖DNA配列を含む直鎖DNA配列の一部、前記組成物もしくはその定方向変異原(directed mutagen)の原核生物、真核生物、もしくは繊維状ファージ発現、分泌、および/もしくはディスプレイと適合するベクターを含む。
一態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、前記の結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。例示的な単離されたポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO:2の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:15の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:14の改変されたDEループアミノ酸配列を含むFN3ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含む。一部の態様では、前記ポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、およびD7に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列(MbNPC1N-N8)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:16の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:22の改変されたDEループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、およびD7に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列(MbNPC1N-N16)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:17の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:30の改変されたDEループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、およびD7に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列(MbNPC1N-N18)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:5の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列(MbNPC1N-N22)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:6の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:19の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、E47、およびA74に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列(MbNPC1N-N23)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列(MbNPC1N-N24)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:8の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:25の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列(MbNPC1N-N26)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:9の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列(MbNPC1N-N31)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:10の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、 SEQ ID NO:40のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列(MbNPC1N-N34)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:11の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列(MbNPC1N-N35)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:12の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:21の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:27の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、Y31、R33、およびE47に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列(MbNPC1N-N38)を含むFN3ドメインをコードする。
一部の態様では、本開示の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:13の改変されたFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20の改変されたBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:28の改変されたCDループアミノ酸配列を含むFN3ドメインを有するNCP1結合ポリペプチドをコードする。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、SEQ ID NO:1の残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49、およびA74に対応する1つまたは複数の残基においてアミノ酸置換をさらに含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFNドメインは、残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、およびT49に対応する残基においてアミノ酸置換を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるFN3ドメインは、SEQ ID NO:43のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、FN3ドメインは、 SEQ ID NO:43のアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:43のアミノ酸配列(MbNPC1C-C45)を含むFN3ドメインをコードする。
本開示のポリヌクレオチドは自動ポリヌクレオチド合成機による固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成によって生成され、完全な一本鎖分子または二本鎖分子に組み立てられてもよい。または、本開示のポリヌクレオチドは、PCRなどの他の技法と、それに続く日常的なクローニングによって生成されてもよい。ある特定の公知の配列のポリヌクレオチドを生成または入手するための技法は当技術分野において周知である。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの非コード配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、RepA結合を容易にするcis配列などを含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、マーカーまたはタグ配列、例えば、タンパク質の精製もしくは検出を容易にするヒスチジンタグまたはHAタグ、シグナル配列、融合タンパク質パートナー、例えば、RepA、Fcまたはバクテリオファージコートタンパク質、例えば、pIXまたはpIIIをコードする、さらなるアミノ酸をコードする、さらなる配列も含んでもよい。
本開示の別の態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの少なくとも1つまたは複数を含むベクターである。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、または任意の手段によって本発明のポリヌクレオチドを、ある特定の生物もしくは遺伝的背景に導入するのに適した他の任意のベクターでもよい。このようなベクターは、このようなベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御することができる、調節することができる、引き起こすことができる、または可能にする核酸配列エレメントを含む発現ベクターでもよい。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、RNAポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、およびある特定の発現系において、コードされるポリペプチドの発現を容易にする他の部位を含んでもよい。このような発現系は細胞ベースでもよく、当技術分野において周知の無細胞系でもよい。
本開示の別の態様は、上記のベクターを含む宿主細胞である。本明細書において開示される結合分子および/またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、任意で、当技術分野において周知のように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって産生することができる(例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)を参照されたい)。
発現のために選択される宿主細胞は哺乳動物に由来してもよく、COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HeG2、SP2/0、HeLa、ミエローマ細胞、リンパ腫細胞、酵母細胞、昆虫細胞、もしくは植物細胞、またはその任意の誘導細胞、不死化細胞、もしくは形質転換細胞より選択されてもよい。または、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種または生物、例えば、原核細胞または原核生物、例えば、BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)、および天然の、または操作された大腸菌(E. coli)の種、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、またはシュードモナス属(Pseudomonas)の種の株のいずれかより選択されてもよい。
本開示の別の局面は、本明細書に記載の結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートを生成および単離する方法に関する。この方法は、前記の結合分子またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートが発現されるような条件下で、本開示の単離された宿主細胞を培養する工程、および発現された結合分子またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートを宿主細胞培養物から精製する工程を含む。
本明細書に記載の結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、周知の方法によって、例えば、プロテインA精製、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって組換え細胞培養物から精製することができる。
本明細書に記載の精製または単離された結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーのうちの1つに連結されてもよい。前記結合分子および/またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、例えば、コアセルベーション法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル(例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)、またはマクロエマルジョンに封入されてもよい。このような技法は、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示される。
治療的使用のために、本明細書に記載の結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、薬学的に許容される担体中に、活性成分として有効量の結合分子またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートを含有する薬学的組成物として調製されてもよい。「担体」という用語は、活性化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなビヒクルは、液体、例えば、水、および石油、動物、植物、または合成由来の油を含む油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などでもよい。例えば、0.4％食塩水と0.3％グリシンを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらの溶液は従来の周知の滅菌法(例えば、濾過)によって滅菌され得る。前記組成物は、生理学的条件に近づくように、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、ならびに着色剤などを含有してもよい。このような薬学的製剤の中の本明細書に記載の結合分子またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートの濃度は大きく異なることがある、すなわち、約0.5重量％未満、通常、約1重量％または少なくとも約1重量％から15重量％または20重量％と大きな濃度になることがあり、主として、選択された特定の投与方法に応じて、必要とされる用量、流体の体積、粘性などに基づいて選択される。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む適切なビヒクルおよび製剤は、例えば、REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092に記載されている。特に、その全体が本明細書において参照により組み入れられる958～989頁を参照されたい。
本明細書に記載の結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、単離されていない形で、または単離された形で使用することができる。さらに、前記結合分子およびそのNPC1結合ペプチドコンジュゲートは単独で、または少なくとも1種類の他の結合分子もしくはそのNPC1結合ペプチドコンジュゲートを含む混合物中で使用することができる。言い換えると、前記結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートは、組み合わされて、例えば、2種類以上のその結合分子、2種類以上のNPC1結合ペプチドコンジュゲート、1種類の結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲート、ならびにその変種を含む薬学的組成物として使用することができる。例えば、望ましい治療効果を実現するように、異なるが、補完的な活性を有する結合分子および/またはNPC1結合ペプチドコンジュゲートを単一療法において組み合わせることができる。だが、代わりに、望ましい治療効果または診断効果を実現するように、同一の活性を有する結合分子およびNPC1結合ペプチドコンジュゲートも単一療法において組み合わせることができる。任意で、混合物は少なくとも1種類の他の治療剤をさらに含む。
本開示の別の局面は組み合わせ治療剤に関する。この組み合わせ治療剤は、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドと薬学的に活性な部分を含む。
本開示のこの局面によれば、組み合わせ治療剤の薬学的に活性な部分は、当技術分野において公知の任意の薬学的に活性な部分でよい。適切な薬学的に活性な部分は、低分子活性部分、核酸分子、抗体、抗体結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
本明細書で使用する「併用療法」という用語は、2種類以上の治療剤、すなわち、本明細書に記載のようなNPC1結合ポリペプチドまたはこれを含むNPC1結合ペプチドコンジュゲートを活性な薬学的部分と組み合わせて投与することを指す。一部の態様では、併用療法は、実質的に同時に、例えば、一定の比の活性成分を有する1個のカプセルまたはある他の送達ビヒクルに入れて同時投与される。一部の態様では、併用療法は、複数のカプセルまたは送達ビヒクルに入れて投与され、それぞれが活性成分を含有する。一部の態様では、併用療法の治療剤は、連続して、ほぼ同時に、または異なる時間で投与される。例えば、一態様では、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドはネオアジュバントとして投与される、すなわち、薬学的に活性な部分の投与前に投与される。他の態様では、NPC1結合ポリペプチドは標準的なアジュバント療法として投与される、すなわち、薬学的に活性な部分の投与後に投与される。態様の全てにおいて、併用療法は、特定の病態の処置において、例えば、がんを処置するための、特に、初期の、高悪性度の、および治療抵抗性のがんを処置するための薬物組み合わせの有益な効果を提供する。
任意の態様において、組み合わせ治療剤の薬学的に活性な部分はがん治療剤である。一部の態様では、組み合わせ治療剤のがん治療剤は化学療法剤である。適切な化学療法剤は、アルキル化剤(例えば、クロランブシル、シクロホファミド(cyclophophamide)、CCNU、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、BCNU、およびブスルファン)、代謝拮抗物質(例えば、メトトラキサート(methotraxate)、6-メルカプトプリン、および5-フルオロウラシル)、アントラサイクリン(ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、およびミトキサントロン)、抗腫瘍性抗生物質(例えば、ブレオマイシン、モノクローナル抗体(例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツキサマブ(Trastuxmab))、プラチニウム(platinium)(例えば、シスプラチンおよびオキサリプラチン)、または植物アルカロイド(例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサン(例えば、パクリタキセル)、ならびにエピポドフィロトキシン)を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、がん治療剤は、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ボリノスタット、テモゾロミド、ボルテゾミブ、カルムスチン、およびパクリタキセルより選択される。
一部の態様では、組み合わせ治療剤のがん治療剤は免疫チェックポイント阻害剤である。適切な免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤を含むが、それに限定されるわけではない。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ(キイトルーダ)、ニボルマブ(オプジーボ)、およびセミプリマブ(リブタヨ)より選択されるPD-1阻害剤である。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ(テセントリク)、アベルマブ(バベンチオ)、およびデュルバルマブ(イミフィンジ)より選択されるPD-L1阻害剤である。一部の態様では、免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ(ヤーボイ)などのCTLA-4阻害剤である。
一部の態様では、組み合わせ治療剤のがん治療剤は上皮細胞増殖因子(EGFR)阻害剤である。適切なEGFR阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、オシメルチニブ、パニツムマブ、ネラチニブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、およびダコミチニブを含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、組み合わせ治療剤のがん治療剤はmTOR阻害剤である。適切なmTOR阻害剤は、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、およびエベロリムスを含むが、それに限定されるわけではない。
本開示の別の局面は、対象においてがんを処置する方法に関する。この方法は、がんを有する対象を選択する工程、およびがんを処置するのに有効な量の、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチド、本明細書に記載のNPC1結合ポリペプチドを含むNPC1結合ペプチドコンジュゲート、NPC1結合ポリペプチドもしくはNPC1結合ペプチドコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、または上記の薬剤のいずれかを含有する薬学的組成物を対象に投与する工程を含む。
本明細書に記載の方法の全てによれば、「対象」は、NPC1阻害から利益を得る病態を有する任意の動物またはヒトを指す。一態様では、対象は哺乳動物である。例示的な哺乳動物対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット)、ウマ、畜牛および乳牛、ヒツジ、ならびにブタを含むが、それに限定されるわけではない。
一部の態様では、対象は、対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とするがんの一種を有する。一部の態様では、がんは、H-ras、N-ras、またはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする。一部の態様では、対象は、膵臓がん、肺がん、乳がん、結腸がん、神経膠腫、固形腫瘍、メラノーマ、多形性神経膠芽腫、白血病、腎細胞がん、肝細胞がん、前立腺がん、およびミエローマより選択されるがんを有する。
一部の態様では、対象は、NPC1結合分子またはNPC1結合分子を含む薬学的組成物を投与する前に、原発がんの治療的処置に対して抵抗性であるか、または抵抗性になっている、例えば、化学療法処置に対して抵抗性であるか、または抵抗性になっているがんの一種を有する。NCP1結合分子またはNCP1結合分子を含む薬学的組成物を投与する工程は、がん細胞を原発がんの治療的処置に対して再感作するのに有効な量で行われる。
一部の態様では、がんを有する対象を処置する方法は、がん治療剤を、前記NPC1結合ポリペプチド、NPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはこれを含む薬学的組成物と一緒に投与する工程をさらに含む。併用療法として本明細書に記載のNPC1組成物と組み合わせて投与することができる適切ながん治療剤は前記で説明されている。
本明細書に記載の方法によれば、NPC1結合分子またはNPC1結合分子を含む薬学的組成物は単独で、または1種類もしくは複数種のがん治療剤と組み合わせて全身投与または局所投与によって投与される。本明細書において開示される治療剤および/または組み合わせ治療剤の適切な全身投与方法は、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、皮内投与、肺内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、または鼻腔内注入、腔内注入もしくは膀胱内注入による投与、眼内投与、動脈内投与、病巣内投与、あるいは粘膜への適用を含むが、それに限定されるわけではない。ある特定の態様では、本明細書に記載の方法の治療剤は経口送達される。本明細書において開示される治療剤および/または組み合わせの適切な局所投与方法は、カテーテル法、移植、直接注射、皮膚/経皮適用、または関連組織への門脈投与、または当技術分野において一般的に知られている他の任意の局所投与の技法、方法、もしくは手順を含むが、それに限定されるわけではない。薬剤の送達に影響を及ぼす方法は、治療剤のタイプおよび処置しようとするがんのタイプに応じて異なる。
本明細書において開示される方法において単独の、またはがん治療剤と組み合わされる、NPC1結合分子またはNPC1結合分子を含む薬学的組成物の治療的有効量とは、特定の間隔にわたって投与された時に、1つまたは複数の治療ベンチマーク(例えば、腫瘍成長の減速または停止、腫瘍の退縮、症状の停止など)を実現する量である。本発明で開示される方法において使用するための、単独の、またはがん治療剤と組み合わされたNPC1結合分子またはNPC1結合分子を含む薬学的組成物は対象に一回または複数回投与されてもよい。治療用組成物が複数回投与される態様では、所定の間隔で、毎日、隔日、毎週、または毎月投与されてもよい。または、治療用組成物は、不規則な間隔で、例えば、症状、患者の健康状態などに基づいて必要に応じて投与することができる。例えば、治療的有効量は、1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも15日にわたって1日1回(q.d.)投与されてもよい。任意で、処置の間または後に、がんの状態またはがんの退縮が、例えば、対象のマルチパラメトリック超音波(mpUS)、マルチパラメトリック磁気共鳴画像法(mpMRI)、および核イメージング(ポジトロン放出断層撮影法[PET])によってモニタリングされる。対象に投与される治療剤または併用療法の投与量は、がんの状態または検出されたがんの退縮に応じて増加または減少することができる。
当業者は、一人一人の対象に基づいて(例えば、処置されている対象において特定の治療ベンチマークを実現するのに必要な化合物の量)、または集団に基づいて(例えば、ある特定の集団からの平均的な対象において特定の治療ベンチマークを実現するのに必要な化合物の量)、この量を容易に決定することができる。理想的には、治療的有効量は、処置されている対象の50％以上が、さらなる薬物投与を妨げる副作用を経験する最大許容量を超えない。
対象の治療的有効量は、症状の種類および程度、対象の性別、年齢、体重、または身体全体の健康、投与方法、ならびに塩または溶媒和化合物のタイプ、薬物に対する感受性のバリエーション、疾患の特定のタイプなどを含む様々な要因に応じて変化することがある。
本開示の別の局面は、対象において感染症を処置する方法に関する。この方法は、感染症を有する対象を選択する工程、および感染症を処置するのに有効な量の、本明細書に記載のNCP1結合ポリペプチドまたはNPC1結合ペプチドコンジュゲートを対象に投与する工程を含む。
一部の態様では、感染症を有する対象はフィロウイルスを有する。一部の態様では、フィロウイルスはエボラウイルスまたはマールブルグウイルスである。エボラおよび他のフィロウイルスはエンドサイトーシスを介して宿主細胞に取り付き、侵入する。内部移行したウイルスは後期エンドソーム/リソソームに局在し、システインプロテアーゼによって切断される。切断されたエボラ糖タンパク質はNPC1に対するリガンドとして働く。NPC1阻害剤によって、この相互作用を阻害するとウイルス感染症が阻止される。例えば、その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Basu et al., 「Novel Small Molecule Entry Inhibitors of Ebola Virus」, J. Infect. Dis. 212(Suppl 2): S425-434 (2015)を参照されたい。従って、対象において感染症を阻害する、感染症の進行を阻害する、および/または感染症を軽減する治療的手段として、本明細書に記載のNPC1結合分子を、フィロウイルス感染症を有するか、またはそのリスクのある対象に投与することができる。
一部の態様では、感染症を有する対象はコロナウイルスを有する。一部の態様では、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)または中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)である。NPC1に機能喪失型変異があると、コロナウイルスによって媒介されるコレステロール合成抑制と戦うことが示されているコレステロール合成誘導が引き起こされる(その全体が本明細書において参照により組み入れられる、Daniloski et al.,「Identification of Required Host Factors for SARS-CoV-2 Infection in Human Cells」, Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.030 (2020))。従って、対象において感染症を阻害する、感染症の進行を阻害する、および/または感染症を軽減する治療的手段として、本明細書に記載のNPC1結合分子を、コロナウイルス感染症を有するか、またはそのリスクのある対象に投与することができる。
感染症を有する対象に投与するための、NPC1結合分子および/またはそのNPC1結合ペプチドコンジュゲートを含む適切な薬学的組成物は上述されている。
本開示の別の局面は、その必要のある対象において薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法に関する。一態様では、この方法は、本明細書に記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート、すなわち、第1のNPC1結合ポリペプチド部分と、第1の部分に接続され、薬学的に活性な部分である第2の部分とを含む、NPC1結合ペプチドコンジュゲートを、対象に投与する工程を含む。別の態様では、前記方法は、本明細書に記載の組み合わせ治療剤、すなわち、NPC1結合ポリペプチドと薬学的に活性な部分を含む組み合わせ治療剤を対象に投与する工程を含む。
本開示のこの局面によれば、薬学的に活性な部分は、低分子活性部分、核酸分子活性分子、抗体またはその結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない当技術分野において公知の任意の薬学的に活性な部分でもよい。
任意の態様において、対象は神経変性疾患を有し、薬学的に活性な部分は前記神経変性疾患を処置するのに適している。例示的な神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、対象は筋萎縮性側索硬化症(ALS)を有し、前記方法は、対象においてALSを処置するためにNPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはALS治療剤を含むNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含む。適切なALS治療剤は、グルタミン酸遮断薬(例えば、リルゾール、リルテック、および他の誘導体)、エンダラボン(Endaravone)、ラジカヴァ、筋弛緩剤(例えば、バクロフェン、チザニジン、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、対象はパーキンソン病を有し、前記方法は、対象においてパーキンソン病を処置するためにNPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはパーキンソン病治療剤を含むNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含む。パーキンソン病を処置するための適切な治療剤は、ドーパミン促進剤(例えば、カルビドパ、レボドパ、カルビドパ・レボドパ、エンタカポン、カベルゴリン、トルカポン、ブロモクリプチン、アマンタジン、および他の誘導体)、ドーパミンアゴニスト(例えば、プラミペキソール、ミラペックス、ロピニロール、レキップ、ロチゴチン、ニュープロ、アポモルフィン、アポカイン)、認知向上薬(リバスチグミン、および他の誘導体)、抗振戦薬(例えば、ベンゾトロピン、および他の誘導体)、MAOB阻害剤(セレギリン、ゼラパー(Zelapar)、ラサギリン、アジレクト、サフィナミド、ザダーゴ、および他の誘導体)、カテコールO-メチルトランスフェラーゼ(COMT)阻害剤(例えば、エンタカポン、コムタン、オピカポン、オンジェンティス、トルカポン、タスマール、抗コリン作用薬(例えば、ベンゾトロピン、コジェンティン、トリヘキシフェニジル、および他の誘導体)、ならびにその類似体および組み合わせを含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、対象はハンチントン病を有し、前記方法は、対象においてハンチントン病を処置するためにNPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはハンチントン病治療剤を含むNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含む。ハンチントン病の症状を処置するのに適した治療剤は、運動制御薬(例えば、テトラベナジン、キセナジン、デューテトラベナジン、アウステド(Austedo)、および他の誘導体)、抗精神薬(例えば、ハロペリドール、ハルドール、フルフェナジン、リスペリドン、リスパダール、オランザピン、ジプレキサ、クエチアピン、セロクエル、および他の誘導体)、舞踏病抑制薬(例えば、アマンタジン、ゴコブリ(Gocovri)ER、オスモレックス(Osmolex)ER、レベチラセタム、ケプラ、エレプシア(Elepsia)XR、スプリタム(Spritam)、クロナゼパム、クロノピン(Klonopin)、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、対象はアルツハイマー病を有し、前記方法は、対象においてアルツハイマー病を処置するためにNPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはアルツハイマー病治療剤を含むNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含む。アルツハイマー病を処置するための適切な治療剤は、認知向上薬(例えば、メマンチン、ナメンダ、および他の誘導体)、コリンエステラーゼ阻害剤(例えば、ドネペジル、アリセプト、ガランタミン、ラザダイン、リバスチグミン、イクセロン、および他の誘導体)、アデュカヌマブ、アデュヘルム(Aduhelm)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
別の態様では、薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法は、炎症状態を処置するために、NPC1結合ペプチドコンジュゲートまたはNPC1組み合わせ治療剤を、炎症状態を有する対象に投与する工程を含み、NCP1結合ペプチドコンジュゲートまたは組み合わせ治療剤の薬学的に活性な部分は前記炎症状態を処置するのに適している。この方法に従って処置することができる例示的な炎症状態は、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、黄斑変性、骨粗鬆症、免疫炎症、非免疫炎症、腎臓炎症、結核、多発性硬化症、関節炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、およびアルツハイマー病を含むが、それに限定されるわけではない。
NPC1結合ペプチドコンジュゲートまたはNPC1組み合わせ治療剤に組み入れるための適切な抗炎症性治療剤は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)(例えば、イブプロフェン、アドビル、モトリンIB、ナプロキセンナトリウム、アリーブ、および他の誘導体)、コルチコステロイド薬(例えば、プレドニゾンおよび他の誘導体)、従来の疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)(例えば、メトトレキセート、トレキサル(Trexall)、オトレキアプ(Otrexup)、レフルノミド、アラバ、ヒドロキシクロロキン、プラケニル、スルファサラジンアザルフィジン、および他の誘導体)、生物DMARD(アバタセプト、オレンシア、アダリムマブ、ヒュミラ、アナキンラ、キネレット、セルトリズマブ、シムジア、エタネルセプト、エンブレル、ゴリムマブ、シンポニー、インフリキシマブ、レミケード、リツキシマブ、リツキサン、サリルマブ、ケブザラ、トシリズマブ、アクテムラ、および他の誘導体)、標的合成DMARD(例えば、バリシチニブ、オルミエント、トファシチニブ、ゼルヤンツ、ウパダシチニブ、リンヴォック、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
NPC1結合ペプチドコンジュゲートまたはNPC1組み合わせ治療剤に組み入れるためのさらなる抗炎症性治療剤は、スタチン(例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、および他の誘導体)、ならびに他のコレステロール薬(例えば、エキセチミベ(exetimibe)、ゼチーア、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、および他の誘導体)、抗凝固剤、(例えば、アスピリンおよび他の誘導体)、抗血栓薬、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
別の態様では、薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法は、骨病態を処置するためにNPC1結合ペプチドコンジュゲートまたはNPC1組み合わせ治療剤を、骨病態を有する対象投与する工程を含み、NCP1結合ペプチドコンジュゲートまたは組み合わせ治療剤の薬学的に活性な部分は前記骨病態を処置するのに適している。任意の態様において、対象は、骨粗鬆症または骨パジェット病より選択される骨病態を有する。
任意の態様において、対象は骨粗鬆症を有し、前記方法は、対象において骨粗鬆症を処置するために、NPC1結合ペプチドコンジュゲート、または骨粗鬆症治療剤を含むNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含む。適切な骨粗鬆症治療剤は、ビスホスホネート(例えば、アレンドロネート、ビノスト(Binosto)、フォサマックス、イバンドロネート、ボニバ、リセドロネート、アクトネル、アテルビア(Atelvia)、ゾレドロン酸、リクラスト、ゾメタ、および他の誘導体)、デノスマブ(例えば、プロリア、ザイゲバ(Xgeva)、および他の誘導体)、ホルモン関連療法(例えば、エストロゲン、ラロキシフェン、エビスタ、テストステロン、および他の誘導体)、骨を作る薬(例えば、テリパラチド、ボンシティ(Bonsity)、フォルテオ(Forteo)、アバロパラチド、チムロス(Tymlos)、ロモソズマブ、イベニティ、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
任意の態様において、対象は骨パジェット病を有し、前記方法は、対象において骨パジェット病を処置するために、NPC1結合ペプチドコンジュゲート、または骨パジェット病治療剤を含むNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含む。適切な骨パジェット病治療剤は、ビスホスホネート(例えば、ゾレドロン酸、リクラスト、ゾメタ、パミドロネート、アレディア、イバンドロネート、ボニバ、および他の誘導体)、ならびに経口ビスホスホネート(例えば、アレンドロネート、ビノスト、リセドロネート、アクトネル、アテルビア、および他の誘導体)、ならびにその類似体および誘導体を含むが、それに限定されるわけではない。
別の態様では、薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法は、がんを有する対象に、NPC1結合ペプチドコンジュゲートまたはNPC1組み合わせ治療剤を投与する工程を含み、NCP1結合ペプチドコンジュゲートまたは組み合わせ治療剤の薬学的に活性な部分はがんを処置するのに適している。がんを処置することが知られている、またはがんを処置するのに利用可能な薬学的に活性な部分は前記で詳述されている。任意の態様において、対象は、RAS経路活性化または過剰活性化に関連するがん(例えば、EGFRによって引き起こされるがんおよびPTEN欠損がん)を有する。
本明細書に記載の方法によれば、その必要のある対象において、本明細書に記載の様々な病態(例えば、がん、感染症、神経変性疾患、炎症状態、および骨病態)を処置するために、ならびに/またはエンドソーム放出を強化するために、NPC1結合ポリペプチド、NPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはNPC1組み合わせ治療剤の投与が全身投与によって行われる。適切な全身投与方法は前記で開示され、経口投与、局所投与、経皮投与、非経口投与、皮内投与、肺内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、または鼻腔内注入、腔内注入もしくは膀胱内注入による投与、眼内投与、動脈内投与、病巣内投与、あるいは粘膜への適用を含むが、それに限定されるわけではない。
本明細書に記載のように対象において、本明細書に記載の病態(例えば、がん、感染症、神経変性疾患、炎症状態、および骨病態)を処置するための、ならびに/または薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化するための、NPC1結合ポリペプチド、NPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはNPC1組み合わせ治療剤の治療的有効量とは、特定の間隔にわたって投与された時に1つまたは複数の治療ベンチマーク(例えば、感染の減速または停止、感染の阻害、症状の停止など)を実現する量である。NPC1結合ポリペプチド、NPC1結合ペプチドコンジュゲート、またはこれを含むNPC1組み合わせ治療剤は対象に一回投与されてもよく、複数回投与されてもよい。治療用組成物が複数回投与される態様では、所定の間隔で、例えば、毎日、隔日、毎週、または毎月投与されてもよい。または、治療用組成物は、不規則な間隔で、例えば、症状、患者の健康状態などに基づいて必要に応じて投与することができる。例えば、治療的有効量は、1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも10日、または少なくとも15日にわたって1日1回投与されてもよい。
対象の治療的有効量は、症状の種類および程度、対象の性別、年齢、体重、または身体全体の健康、投与方法、ならびに塩または溶媒和化合物のタイプ、薬物に対する感受性のバリエーション、フィロウイルス感染症の特定のタイプなどを含む様々な要因に応じて変化し得る。
以下の実施例は本開示の態様を例示するために提供されるが、決して、本開示の範囲を限定することを目的としない。
実施例1-NPC1はKRas腫瘍組織においてアップレギュレートされる
変異KRas腫瘍組織とNPC1発現との関連を探索するために、膵臓がん組織を分析した。なぜなら、これらの試料は大部分が変異KRas(約97％)であるからである。腫瘍組織におけるNPC1発現は正常隣接組織と比較して高いことが見出された(図1A)。さらに、カプラン・マイヤー分析からNPC1発現が高い患者は生存率が悪いことが分かった(図1B)。NPC1阻害はインビトロで増殖阻害効果があるかどうか試験するために、NPC1標的ツール化合物であるイトラコナゾールを利用した。変異KRas CRC細胞においてイトラコナゾールによる用量依存的な細胞増殖阻害が観察された(図2)。
創薬のために、NPC1阻害用のロバストなバイオマーカーセットを確立した。線維芽細胞において以前に示されたように、siRNAを介したNPC1ノックダウンと低分子によるNPC1阻害によって、コレステロールがエンドソームに蓄積した。NPC1は変異KRasがん細胞株におけるコレステロール輸送において必要な役割を有することが確認された(図3A)。さらに、オートファジーフラックス阻害はNPC1阻害の結果であることが示されている。オートファジーマーカーであるLC3Bの免疫蛍光法および生化学的分析を用いて、オートファジーフラックスはNPC1ノックダウンと低分子阻害によって遮断されることが確認された(図3Bおよび3C)。
実施例2-がんを処置するためのNPC1モノボディ
残念なことに、利用可能な低分子NCP1ツール化合物は細胞膜を自由に通り抜けてしまうので、がん細胞を標的とするのに特異的でない。従って、がん細胞内のNPC1を選択的に標的化するために新たな分子実体を開発した。
興味深いことに、小さな合成結合タンパク質であるモノボディは変異Rasがん細胞株によってマクロピノサイトーシスを介して内部移行されることが発見された。この理由で、エンドソーム区画内にあるNPC1との結合およびNPC1の阻害を容易にするために、変異Ras発現がん細胞によって内部移行されるNPC1特異的モノボディを作製した。
知的所有権下にある2つのモノボディライブラリーのスクリーニングによって、2.5nMで強力な標的結合を示した本明細書に記載のNPC1モノボディ、すなわち、SEQ ID NO:32～43いずれか一つのアミノ酸配列を有する結合分子が生成された。生成されたモノボディは、コレステロール枯渇状態でもコレステロールがロードされた状態でも、NPC1結合能力において差を示さなかった。さらに、NPC1モノボディは、エンドソームにおいて遭遇するpH(pH5～6)と同様の酸性pHでは、より中性の環境(pH7.5)と比較して、NPC1に対する強い結合親和性を示した(図4～6)。
抗体と比べたモノボディの大きな利点は製造費が安いことである。しかしながら、生産中にモノボディをリフォールディングまたは凝集する必要があれば、製造費は抗体の製造費を上回ることがある。しかしながら、本明細書に記載のモノボディはリフォールディングする必要はなく、生産中にほとんど凝集しないか、全く凝集しない。画像化ベースのアプローチと生化学的アプローチとを両方とも利用して、本明細書に記載のモノボディは細胞培養中にNPC1を阻害することが確認された。NPC1標的モノボディクローンN23(SEQ ID NO:36)およびN34(SEQ ID NO:40)はコレステロールのエンドソーム蓄積によって最大のNPC1阻害を示した(図7)。図7B DLD1細胞(Ras変異、結腸)を上位のモノボディヒットで処理し、コレステロールをフィリピンで測定した。NPC1のコレステロール結合ドメインを標的とすることで、本発明者らの予備データは、2種類のモノボディ(N23およびN34)がコレステロール捕捉を改善し、小胞破壊を誘導することを示す(図7A～7C)。
NPC1標的モノボディが変異Rasがん細胞に対して特異性を有することを示すために、それぞれのモノボディは変異KRas誘導性HeLa細胞系においてLC3B蓄積を誘導できることが観察された(図8)。NPC1標的モノボディクローンN23およびN34は、HeLa細胞(図8A、マクロピノサイトーシス陰性)ではLC3B蓄積を誘導しなかったが、HeLa KRasV12細胞(図8B、マクロピノサイトーシス陽性)では効果を示した。CRC細胞増殖アッセイにおいて候補モノボディを比較すると、N34は増殖阻害効果を示したが、N23は有意な阻害を示さなかった(図9)。
取り込みがマクロピノサイトーシスに依存するという確証がCRC細胞株において確かめられた。野生型KRas CRC細胞(HCA7)はマクロピノサイトーシス陰性であり、N34モノボディを取り込まない(図10A;画像の左の縦列)。しかしながら、変異KRas CRC細胞(DLD-1およびHCT-116)はマクロピノサイトーシス陽性であり、N34モノボディを効率的に内部移行する(図10A;画像の中央および右の縦列)。従って、N34は、HCT-116において用量依存的なLC3B蓄積を示すが、HCA7細胞では示さない(図10B)。このことから、NPC1標的モノボディによるNPC1阻害のマクロピノサイトーシス依存性が示唆される。最後に、異種移植片にN34モノボディが腫瘍内注射されるとCK8陽性腫瘍細胞にモノボディが取り込まれることが示された(図11)。非標的対照モノボディ(FN)と比較してN34陽性腫瘍細胞はコレステロール蓄積を示した。さらに、別の試験において、注射して2時間後に、N34陰性領域と比較して異種移植片のN34陽性領域は活発なコレステロールおよびLC3Bの蓄積を示した(図12)。インビトロでNPC1ノックダウンするとERKが過剰活性化されることも観察された(図13A)。この観察はインビボでN34モノボディを用いて確認された(図13B)。選択的かつ不可逆的なEGFR阻害剤であるダコミチニブでNPC1ノックダウン細胞を処理するとERK過剰活性化が遮断されたので、NPC1阻害時のERK過剰活性化はEGFR活性化の結果かもしれない(図14)。このことは、インビボでのN34によるNPC1阻害時にEGFR活性化が認められたという観察によってさらに裏付けられる(図15)。
実施例3-NPC1結合ペプチドコンジュゲートは薬学的に活性な部分のエンドソーム脱出を強化する
タンパク質のエンドソーム脱出を測定するためにスプリットGFPアッセイを開発した。変異Ras PDAC MIA PaCa-2細胞において、蛍光に必要な11βドメインを欠くGFP1-10を安定発現させた。陽性シグナルにはGFP11βのエンドソーム脱出が必要である。NPC1標的モノボディおよび対照モノボディを遊離GFP11βドメインと共に同時送達した。NPC1標的モノボディで処理すると蛍光は観察されたが、対照非結合モノボディ(FN)では観察されなかった(図16)。
エンドソーム脱出は低分子アッセイでも観察された(図17)。カルセインは、小胞区画内で他のカルセイン分子のすぐ近くにある時にセミクエンチされるが、細胞内放出および分子拡散されるとデクエンチによって細胞蛍光が増加する、膜不透過性の液相取り込みマーカーである。GFP1-10スプリットアッセイと同様にNPC1標的部分の同時送達ではエンドソーム脱出が認められたが、対照モノボディでは認められず、細胞蛍光が増加した。NPC1標的モノボディはナノ粒子と対になった時に脱出の増加を示し、このことはナノ粒子カーゴ脱出の改善に有利であるかもしれない(図18A～18B)。NPC1標的モノボディは、低分子、生物製剤、およびナノ粒子脱出を誘導することが証明された。
好ましい態様が本明細書において詳細に描写および説明されたが、本開示の精神から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを加えることができ、従って、これらが、添付の特許請求の範囲に定義されるように本開示の範囲内だとみなされることは、関連する分野の当業者に明らかである。

Claims (38)

  1. フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインを含む、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチドであって、
    該FN3ドメインが、対応するループAB、BC、CD、DE、EF、およびFGによって隣接するβ鎖がそれぞれ隔てられた、β鎖A～Gを含み、
    該結合ポリペプチドが、
    (1)SEQ ID NO:10のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26のCDループアミノ酸配列(N34);または
    (2)SEQ ID NO:6のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:19のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23のCDループアミノ酸配列(N23);または
    (3)SEQ ID NO:5のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:23のCDループアミノ酸配列(N22);または
    (4)SEQ ID NO:7のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24のCDループアミノ酸配列(N24);または
    (5)SEQ ID NO:8のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:25のCDループアミノ酸配列(N26);または
    (6)SEQ ID NO:9のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26のCDループアミノ酸配列(N31);または
    (7)SEQ ID NO:11のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:24のCDループアミノ酸配列(N35);または
    (8)SEQ ID NO:12のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:21のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:27のCDループアミノ酸配列(N38);または
    (9)SEQ ID NO:13のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:20のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:28のCDループアミノ酸配列(C45) ;または
    (10)SEQ ID NO:2のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:15のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:14のDEループアミノ酸配列(N8);または
    (11)SEQ ID NO:3のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:16のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:22のDEループアミノ酸配列(N16);または
    (12)SEQ ID NO:4のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:17のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:30のDEループアミノ酸配列(N18)
    を含む、
    ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ポリペプチド。
  2. β鎖A～Gが、SEQ ID NO: 1のVSDVPRD (A)、SLLISWD (B)、YYRITYGET (C)、QEFTV (D)、TATIS (E)、GVDYTITVYA (F)、およびPISINYRT (G)のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の結合ポリペプチド。
  3. β鎖Aが、VSDVPRDであるアミノ酸配列（SEQ ID NO: 1のaa1～7）、またはその変種アミノ酸配列であって、D3S、R6T、およびD7Kから選択される1つもしくは複数の置換を含む変種アミノ酸配列を含む、請求項1記載の結合ポリペプチド。
  4. 以下の1または複数を含む、請求項1記載の結合ポリペプチド：
    YYRITYGETであるアミノ酸配列（SEQ ID NO: 1のaa31～39）、またはその変種アミノ酸配列であって、Y31H、ならびに/またはR33V、R33D、もしくはR33Fの1つから選択されるアミノ酸置換を含む変種アミノ酸配列を含む、β鎖B；
    QEFTVであるアミノ酸配列（SEQ ID NO: 1のaa46～50）、またはその変種アミノ酸配列であって、E47TおよびE47Kの1つ、ならびに/またはT49KおよびT49Aの1つから選択されるアミノ酸置換を含む変種アミノ酸配列を含む、β鎖D；ならびに
    GVDYTITVYAであるアミノ酸配列（SEQ ID NO: 1のaa65～74）、またはA74Tアミノ酸置換を含むその変種アミノ酸配列を含む、β鎖F。
  5. FN3ドメインが、SEQ ID NO:10のFGループアミノ酸配列、SEQ ID NO:18のBCループアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:26のCDループアミノ酸配列(N34)を含む、請求項1～4のいずれか一項記載の結合ポリペプチド。
  6. FN3ドメインが、SEQ ID NO:40、36、32～35、37～39、および41～43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の結合ポリペプチド。
  7. SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含む、請求項6記載の結合ポリペプチド。
  8. 請求項1～7のいずれか一項記載の結合ポリペプチドを含む、第1の部分と、
    該第1の部分に接続され、薬学的に活性な部分、診断部分、半減期延長部分、送達ビヒクル、プロドラッグ、第2の結合分子、ポリマー、および非結合タンパク質より選択される、第2の部分と
    を含む、ニーマン・ピック病C1型(NPC1)結合ペプチドコンジュゲート。
  9. 第2の部分が、薬学的に活性な部分である、請求項8記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  10. 前記薬学的に活性な部分が、低分子、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)の1つである、請求項9記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  11. 前記核酸分子が、siRNA、アプタマー、miRNA、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、またはガイドRNAである、請求項10記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  12. 前記薬学的に活性な部分が、がん治療剤または免疫調節剤である、請求項9記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  13. 前記がん治療剤が、代謝拮抗物質、アルカロイド、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、DNA結合薬、毒素、抗増殖薬、DNAアンタゴニスト、放射性核種、サーモアブレーティブ剤、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、および核酸阻害剤より選択され、
    該アルカロイドが、デュオカルマイシン、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、パクリタキセル、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択され、
    該アルキル化剤が、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、ウレデパ、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホルアミド、クロランブシル、クロラナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドHCl、メルファラン、ノベメビキン、ペルホスファミド、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、セムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、テモゾロミド、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択され、
    該抗腫瘍性抗生物質が、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-l-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピラビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択され、
    該代謝拮抗物質が、SN-38、デノプテリン、エダトレキセート、メルカプトプリン(6-MP)、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、ペントスタチン(2'-DCF)、トムデックス、トリメトレキセート、クラドリジン、フルダラビン、チアミプリン、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール、ヒドロキシウレア、ウレタン、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される、
    該抗増殖薬が、アセグラトン、アムサクリン、ビサントレン、カンプトテシン、デホスファミド、デメコルシン、ジアジクオン、ジフロモテカン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エトグルシド、エトプシド、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、ラメラリンD、ロニダミン、ミルテホシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ポドフィリン酸2-エチル-ヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン、ソブゾキサン、スピロゲルマニウム、テニポシド、テヌアゾン酸、トリアジクオン2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される、
    該有糸分裂阻害剤が、アウリスタチン、マイタンシノイド、ドラスタチン、ツブリシン、タキサン、エポシロン、ビンカアルカロイド、ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される、
    該免疫調節剤が、マクロファージ1型刺激剤である、
    該免疫調節剤が、マクロファージ2型刺激剤である、
    該免疫調節剤が、T細胞刺激剤である、
    該免疫調節剤が、樹状細胞刺激剤である、または
    該免疫調節剤が、好中球刺激剤である、
    請求項12記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  14. (i)前記マクロファージ1型刺激剤が、パクリタキセル、コロニー刺激因子-1(CSF-1)受容体アンタゴニスト、IL-10受容体アンタゴニスト、Toll様受容体(TLR)-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、およびTLR-9アゴニストからなる群より選択され、
    (ii)前記マクロファージ2型刺激剤が、IL-33、IL-4受容体アゴニスト、グルココルチコイド、IL-10受容体アゴニスト、およびIL-1受容体アゴニストからなる群より選択され、
    (iii)前記T細胞刺激剤が、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストであり、
    (iv)前記樹状細胞刺激剤が、CpGオリゴヌクレオチド、イミキモド、カンプトテシン、コルヒチン、ポドフィロトキシン、およびそれらの誘導体からなる群より選択され、かつ/または
    (v)前記好中球刺激剤が、組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質(フィルグラスチム)もしくはペグ化組換え顆粒球コロニー刺激因子タンパク質である、
    請求項13記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  15. コンジュゲートの第2の部分が、送達ビヒクルもしくは診断部分である、請求項8記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート、または
    前記薬学的に活性な部分が、送達ビヒクルに接続されている、請求項9記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート。
  16. (i)前記送達ビヒクルが、ナノ粒子、ポリマーベースの粒子、および脂質ベースの粒子からなる群より選択される、ならびに/または
    (ii)前記診断部分が、蛍光色素、放射性同位体、画像化に適した造影剤、キレート剤を有する放射性核種、および光増感剤からなる群より選択される、
    請求項15記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート
  17. 請求項1～7のいずれか一項記載のNPC1結合ポリペプチドまたは請求項8記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲートをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  18. 請求項17記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  19. 請求項18記載のベクターを含む、宿主細胞。
  20. 請求項1～7のいずれか一項記載の結合ポリペプチド、請求項8～16のいずれか一項記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲート、請求項17記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項18記載のベクターと、
    薬学的担体と
    を含む、薬学的組成物。
  21. 請求項1～7のいずれか一項記載の結合ポリペプチドと、
    薬学的に活性な部分と
    を含む、組み合わせ治療剤。
  22. 前記薬学的に活性な部分が、低分子、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、タンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)、およびがん治療剤からなる群より選択される、請求項21記載の組み合わせ治療剤。
  23. 前記がん治療剤が、化学療法剤、
    免疫チェックポイント阻害剤、または上皮細胞増殖因子(EGFR)阻害剤もしくはmTOR阻害剤である、請求項22記載の組み合わせ治療剤。
  24. (i)前記化学療法剤が、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ボリノスタット、テモゾロミド、ボルテゾミブ、カルムスチン、およびパクリタキセルからなる群より選択される、ならびに/または
    (ii)前記免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤からなる群より選択される、
    請求項23記載の組み合わせ治療剤。
  25. 対象においてがんを処置するための方法に使用するための、請求項20記載の薬学的組成物であって、該方法が、以下の工程:
    がんを有する対象に、がんを処置するのに有効な量の該薬学的組成物を投与する工程
    を含む、薬学的組成物。
  26. 前記がんが、対応する非がん細胞と比べて増大したマクロピノサイトーシスを有するがん細胞を特徴とするか、または
    前記がんが、H-ras、N-ras、もしくはK-rasに発がん変異を有するがん細胞を特徴とする、
    請求項25記載の薬学的組成物。
  27. 前記がんが、膵臓がん、肺がん、乳がん、結腸がん、神経膠腫、固形腫瘍、メラノーマ、多形性神経膠芽腫、白血病、腎細胞がん、肝細胞がん、前立腺がん、またはミエローマである、請求項25または26記載の薬学的組成物。
  28. 前記方法が、前記薬学的組成物と一緒にがん治療剤を投与する工程
    をさらに含む、請求項25～27のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  29. 前記がん治療剤が、化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤、または上皮細胞増殖因子(EGFR)阻害剤もしくはmTOR阻害剤である、請求項28記載の薬学的組成物。
  30. (i)前記化学療法剤が、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ボリノスタット、テモゾロミド、ボルテゾミブ、カルムスチン、パクリタキセル、ミトキサントロン、およびカペシタビンからなる群より選択される、または
    (ii)前記免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤からなる群より選択される、
    請求項29記載の薬学的組成物。
  31. 前記方法が、放射線療法と一緒に前記薬学的組成物を投与する工程
    をさらに含む、請求項25～30のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  32. 対象において感染症を処置するための方法において使用するための、請求項1～7のいずれか一項記載の結合ポリペプチドまたは請求項8～16のいずれか一項記載のNPC1結合ペプチドコンジュゲートを含む薬学的組成物であって、該方法が、以下の工程:
    感染症を有する対象に、感染症を処置するのに有効な量の該薬学的組成物を投与する工程
    を含む、薬学的組成物。
  33. 前記感染症が、フィロウイルスまたはコロナウイルスによって引き起こされる、請求項32記載の薬学的組成物。
  34. (i)フィロウイルスが、エボラウイルスもしくはマールブルグウイルスである、ならびに/または、
    (ii)コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)もしくは中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)である、
    請求項33記載の薬学的組成物。
  35. その必要のある対象において、薬学的に活性な部分のエンドソーム放出を強化する方法において使用するための、
    請求項1～7のいずれか一項記載の結合ポリペプチドを含む、第1の部分と、
    該第1の部分に接続され、薬学的に活性な部分を含む、第2の部分と
    を含むNPC1結合ペプチドコンジュゲートを含む薬学的組成物、または
    請求項1～7のいずれか一項記載のNPC1結合ポリペプチドと、
    薬学的に活性な部分と
    を含む、組み合わせ治療剤であって、該方法が、以下の工程:
    該対象に該薬学的組成物または該組み合わせ治療剤を投与する工程
    を含む、薬学的組成物または組み合わせ治療剤。
  36. 前記薬学的に活性な部分が、低分子、核酸分子、抗体またはその抗原結合断片、抗体誘導体、タンパク質またはそのポリペプチド断片、およびタンパク質分解誘導キメラ(PROTAC)からなる群より選択される、請求項35記載の薬学的組成物または組み合わせ治療剤。
  37. 前記対象が神経変性疾患を有し、前記薬学的に活性な部分が、該神経変性疾患を処置するのに適しているか、
    前記対象が炎症状態を有し、前記薬学的に活性な部分が、該炎症状態を処置するのに適しているか、
    前記対象が骨病態を有し、前記薬学的に活性な部分が、該骨病態を処置するのに適しているか、または
    前記対象ががんを有し、前記薬学的に活性な部分が、該がんを処置するのに適している、
    請求項35または36記載の薬学的組成物または組み合わせ治療剤。
  38. 前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病からなる群より選択される、
    前記炎症状態が、関節リウマチもしくはアテローム性動脈硬化症である、
    前記骨病態が、骨粗鬆症もしくは骨パジェット病である、ならびに/または
    前記がんが、RAS経路活性化と関連する、
    請求項37記載の薬学的組成物または組み合わせ治療剤。
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CHANDLER G. Peter et al.，Development and Differentiation in Monobodies Based on the Fibronectin Type 3 Domain，Cells，2020年03月04日，Vol.9, No.610，p.1-19

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