CN116829174A - Npc1单体及其单体偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明针对尼曼‑匹克病C1型(NPC1)结合多肽与包含这些结合多肽的NPC1结合肽偶联物。本发明还涉及包含这些NPC1结合多肽和结合肽偶联物的药物组合物，以及这些组合物用于治疗多种病症，包括癌症、传染病、神经退行性疾病、炎症病症和骨病症的用途。NPC1结合偶联物也可用于增强内体释放药物活性部分。

Description

NPC1单体及其单体偶联物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月10日提交的美国临时专利申请第63/112,031号的优先权，其特此通过参考在整体上并入本文中。
技术领域
本发明针对C1型尼曼-匹克病(NPC1)结合多肽与包含这些结合多肽的NPC1结合肽偶联物。本发明还涉及包含这些NPC1结合多肽和结合肽偶联物的药物组合物以及这些组合物在治疗各种病症中的应用。
背景技术
C1型尼曼-匹克病(NPC1)位于内体隔室的膜上，并且对于胆固醇从内体转运到质膜至关重要。中断胆固醇向质膜的转运会破坏质膜的完整性，阻止迁移和转移所必需的适当的Rac1定位，并可能破坏其他胆固醇依赖性蛋白质，诸如受体酪氨酸激酶(RTKs)。另一个观察结果是，某些癌细胞中的NPC1破坏阻断了自噬通量。这在临床上很有趣，因为自噬是结直肠癌和胰腺癌等癌症对化疗产生耐药性的治疗机制。
自噬是一种细胞过程，其协助晚期癌症增殖和存活。尽管大多数大型制药公司放弃了靶向自噬以治疗癌症的治疗策略，但随着越来越多的临床前证据表明抑制自噬可以提高目前使用的癌症疗法的疗效，对该领域的兴趣重新燃起。事实上，FDA批准的抗疟疾药物羟氯喹(HCQ)已被推向许多临床试验，与化疗联合治疗各种肿瘤类型，包括胰腺癌和结直肠癌。HCQ具有一些剂量敏感作用，至少部分是由于它在细胞中诱导的溶酶体贮积病表型，这可以限制给药量。
与HCQ类似，过去针对NPC1的研究在癌症治疗中显示出前景；然而，小分子方法容易受到不必要的脱靶效应和毒性的影响。本公开旨在克服本领域的这些和其他限制。
发明内容
本公开的第一方面涉及一种尼曼-匹克病C1型(NPC1)结合多肽。该NPC1结合多肽包括纤连蛋白III型(FN3)结构域，其具有修饰的FG环氨基酸序列、修饰的BC环氨基酸序列、修饰的CD环氨基酸序列、修饰的DE环氨基酸序列或其组合，其中所述一个或多个修饰的环序列能够与NPC1结合。
本公开的另一方面涉及NPC1结合肽偶联物。该NPC1结合肽偶联物包括第一部分和第二部分。NPC1结合肽偶联物的第一部分包括本文所述的NPC1结合多肽，并且偶联物的第二部分，其偶联至第一部分，并且选自药物活性部分、诊断部分、延长半衰期部分、递送载体、前药、第二结合分子、聚合物、和非结合蛋白。
本公开的其他方面涉及编码本文所述的NPC1结合多肽的分离的多核苷酸、编码本文所述NPC1结合肽偶联物的分离的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸中任一种的载体。本公开的另一方面涉及含有这些多核苷酸或载体的宿主细胞。
本公开的另一方面涉及一种药物组合物，包括本文所述的NPC1结合多肽、本文所述的NPC1结合肽偶联物、本文所述的分离的多核苷酸或本文所述的载体以及药物载体。
本公开的另一方面涉及组合治疗剂。这种组合治疗剂包括本文所述的NPC1结合多肽和癌症治疗剂。
本公开的另一方面涉及治疗对象癌症的方法。该方法涉及向患有癌症的对象施用有效量的本文所述的药物组合物以治疗癌症。
本公开的另一方面涉及治疗对象中传染病的方法。该方法涉及向患有传染病的对象施用有效量的本文所述的NCP1结合多肽或NPC1结合肽偶联物，以治疗传染病。
本公开的另一方面涉及在需要的对象中增强内体释放药物活性部分的方法。该方法包括向对象施用NPC1结合肽偶联物，其中所述肽偶联物包括本文所述的第一和第二部分，其中第二部分是药物活性部分。
本公开的另一方面涉及在需要的对象中增强内体释放药物活性部分的方法。该方法包括向对象施用组合治疗剂，其中组合治疗剂包括本文所述的NPC1结合多肽和药物活性部分。
如本文所公开的，NPC1抑制破坏癌细胞中的自噬。由于自噬是治疗耐药性的机制，NPC1抑制可用于增强细胞对治疗的再敏性并提高癌症治疗的疗效。目前的NPC1抑制剂对该目的没有用，因为它们不能选择性地靶向癌细胞。然而，本文所述的NPC1结合分子和NPC1结合肽偶联物通过大型胞饮作用特异性地内化到内体隔室中。大型胞饮作用是赋予细胞内化大量细胞外液和溶质以支持代谢需求的能力的过程，并且在由突变Ras、失调的生长因子信号传导、Src激活等驱动的癌症中被特别地增强。因此，大型胞饮作用介导的本文所述的NPC1结合分子和NPC1结合肽偶联物的摄取既提供了一种独立的癌症疗法，即，一种实现对癌细胞选择性递送癌症治疗剂的手段，也提供了一种利用癌症治疗剂使癌细胞对治疗再敏感的辅助疗法。
附图说明
图1A-1B示出了NPC1在癌症中的表达。图1A示出了相比于正常邻近组织胰腺癌组织中NPC1表达增加。图1B是Kaplan-Meier生存分析，示出NPC1是胰腺癌的不良预后指标。数据源自TCGA数据集。
图2示出了NPC1抑制对DLD-1癌细胞增殖的影响。治疗3天后通过Syto60测定分析增殖；n＝3。
图3A示出了DLD-1和HCT-116癌细胞系中NPC1基因沉默时游离胆固醇的内体积累。非律平菌素标记游离胆固醇。图3B示出了PC1基因沉默时自噬通量的抑制，如LC3B积累所示。图3C示出了使用抑制NPC1的工具化合物通过westem印迹分析验证LC3B积累。
图4是NPC1拓扑结构的示意图。筛选用于黄色NTD(胆固醇结合)结构域的粘合剂的单体库。
图5A-5B示出了NPC1的N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)结合单体。结合图5A中的NPC1 NTD和图5B中的CTD用于单体克隆的结合亲和力(任意单位)。FC是用于非特异性结合的对照。
图6示出了相比于非加载状态在胆固醇加载状态下NPC1 NTD和CTD结合单体。结合NPC1 NTD(左)和CTD(右)的用于单体克隆的结合亲和力(任意单位)。FC是用于非特异性结合的对照。
图7A-7C示出了筛选NPC1抑制性单体的结果。图7A是示出单体克隆对细胞内胆固醇运输的影响的图。图7B是图7A中的代表性细胞图像。图7C是图7B中胆固醇定位的热图表示。
图8A-8B示出了NPC1靶向单体的突变KRas依赖性效应。分析N23和N34克隆对大型胞饮作用阴性野生型KRas HeLa细胞(图8A)与大型胞饮作用阳性突变型KRas HeLa细胞(图8B)的影响。FN是一种非靶向单体对照。箭头表示LC3B积累。
图9示出了候选单体对HCT-116细胞增殖的影响。治疗3天后通过Syto60测定分析增殖。n＝3
图10A-10B示出了结直肠DLD-1和HCT-116癌细胞(CRC)中的单体选择性。候选单体N34在突变的KRas CRC细胞系中显示出选择性摄取(图10A)和生物学效应(图10B)。
图11示出了相比于非靶向对照(FN)的具有NPC1靶向单体(N34)的体内胆固醇改变。
图12示出了NPC1靶向单体的体内生物学效应。相比于N34阴性肿瘤，候选单体N34诱导N34阳性肿瘤中的胆固醇和LC3B积累。单体(1uM；50ul体积)在肿瘤提取前两小时瘤内注射。
图13A-13B示出了在体外和体内抑制NPC1后，ERK发生过度激活。图13A示出了DLD-1和HCT-116细胞系中的NPC1基因沉默导致ERK活化增加。如图13B所示，相比于N34阴性肿瘤，候选单体N34在N34阳性肿瘤中诱导ERK磷酸化。单体(1uM；50ul体积)在肿瘤提取前两小时瘤内注射。
图14示出了由EGFR信号驱动的ERK过度激活。NPC1基因沉默后的ERK过度激活可以在由达克替尼短期抑制EGFR后逆转。
图15示出了NPC1靶向单体治疗后的EGFR磷酸化。相比于N34阴性肿瘤，候选单体N34在N34阳性肿瘤中诱导EGFR磷酸化。单体(1uM；50ul体积)在肿瘤提取前两小时瘤内注射。从图13B中拍摄了连续切片的图像。
图16示出了使用分裂GFP测定的NCP1单体诱导的GFP11的内体释放。在有或没有1mM的N23或N34 NCP1单体处理24小时下，稳定表达细胞质GFP1-10的突变Ras PDAC MIAPaCa-2细胞用600mM GFP11处理。荧光依赖于GFP11的内体逃逸，其在用NCP1单体处理的细胞中观察到，但未观察到非结合的FN单体。
图17示出了NCP1单体诱导的钙黄绿素的内体释放。钙黄绿素是一种膜不可渗透的液相摄取标记物，当与囊泡隔室中的其他钙黄绿素分子紧密接近时，它被半淬灭，但随着细胞内释放和分子扩散，淬灭会导致细胞荧光增加。图17示出了随着N23和N34 NCP1单体治疗的钙黄绿素荧光增加，但未用非结合FN单体治疗。
图18A-18B示出了NCP1单体介导的内体钙黄绿素释放的增加，其在纳米颗粒递送载体存在下得到进一步改善。图18A是单独用钙黄绿素(PBS)处理或包装在聚乙二醇化纳米颗粒递送载体(90nm纳米颗粒)中的一组PDAC MIA PaCa3细胞的免疫细胞化学图像(第一行图像)。分别用N23或N34NCP1单体对细胞进行共处理，在这两种条件下钙黄绿素的内体释放增强。图18B是量化每种测试条件下钙黄绿素荧光的图。在用含有钙黄绿素和NPC1单体的纳米颗粒处理的细胞中观察到最高水平的钙黄绿素荧光。
具体实施方式
本发明一般涉及尼曼-匹克病C1型(NPC1)结合多肽和包含这些结合多肽的NPC1结合肽偶联物以及使用这些NPC1结合多肽和NPC1结合肽偶联物治疗癌症、传染病和其他病症的方法。
因此，本公开的第一方面涉及一种尼曼-匹克病C1型(NPC1)结合多肽。该NPCI结合多肽包括具有修饰的FG环氨基酸序列、修饰的BC环氨基酸序列、修饰的CD环氨基酸序列、修饰的DE环氨基酸序列或上述修饰环序列的任意组合的纤连蛋白III型(FN3)结构域。一个或多个修饰的循环序列能够结合到NPC1。
FN3结构域是进化保守的蛋白质结构域，其长度约为100个氨基酸并具有β夹心结构。人FN3的β夹心结构包括七条β链，称为链A、B、C、D、E、F、G，与六个连接环，称为环AB、BC、CD、DE、EF和FG，它们表现出与免疫球蛋白结合结构域的结构同源性。六个环中的三个，即，环DE、BC和FG，在拓扑上对应于抗体的互补性决定区域，即CDR1、CDR2和CDR3。其余三个环以类似于抗体CDR3的方式暴露表面。根据本公开，结合分子的每个FN3结构域的一个或多个环区域被修饰以能够与NPC1特异性结合。
本文所用的“特异性地结合”或“特异性结合”是指含有本公开的结合分子的FN3与预定抗原结合的能力，即具有约1×10-6M或更小的解离常数(KD)的NPC1，例如，约1×10-7M或更小，约1×10-8M或更小，约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小、约1×10-12M或更小、约1×10-13M或更小。通常，FN3结构域与NPC1结合，其KD至少比其非特异性抗原(例如BSA或酪蛋白)的KD小十倍，例如使用Proteon仪器(BioRad)通过表面等离子体共振测量。
本公开的结合分子的修饰的FN3结构域可以是衍生自含有这些结构域的多种动物、酵母、植物和细菌细胞外蛋白中的任何一种的FN3结构域。在一个实施方案中，FN3结构域衍生自哺乳动物的FN3结构域。示例性FN3结构域包括，例如，但不限于存在于人腱生蛋白C中的15个不同FN3结构域中的任何一个，或存在于人纤连蛋白(FN)中的15个不同的FN3结构域中的任何一个，例如，第10个纤连蛋白III型结构域。示例性FN3结构域还包括非天然合成FN3结构域，诸如Jacobs等人在美国专利第2010/0216708号中描述的那些结构域，其整体通过参考并入本文中。单个FN3结构域由结构域编号和蛋白质名称表示，例如，纤连蛋白的第10个FN3结构域(10FN3)。
在一些实施方案中，结合分子的FN3结构域衍生自连蛋白的第10个FN3结构域(10FN3)。人10FN3结构域具有如下文中所示的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。BC(残基24-30)、CD(残基40-45)、DE(残基51-55)和FG(残基75-86)环的位置在SEQ ID NO：1的野生型序列中以下划线表示。本公开中引用的其他氨基酸残基的位置也在SEQ ID NO：1中通过其位置进行标识。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDA24PAVTVR30 YYR33ITYGETG40GNSPV45 QE47FT49VP51GSK54S55
TATISGLKPGVDYTITVYA74 V75TGRGDSPASSK86 PISINYRT(SEQ ID NO:1)
根据本公开，一个或多个环区域或一个或多个这些环区域内的选定残基被修饰以使NPC1具有结合特异性和亲和力。合适的修饰包括氨基酸残基取代、插入和/或删除。在一个方面中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个环区域中的氨基酸残基被改变以用于NPC1结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，在或者约SEQ ID NO:1的残基24-30(BC环)、40-45(CD环)、51-55(DE环)和75-86(FG环)的环区域内的一个或多个氨基酸修饰形成NPC1结合区。在另一个实施方案中，这些环区域中的任何一个内的一个或多个氨基酸修饰使NPC1能够结合。
在一些实施方案中，本公开的NPC1结合分子包括修饰的BC环。在一些实施方案中，修饰的BC环选自SEQ ID NOs：15-21(见表1)中的任何一个修饰的BC环，或者包括与SEQ IDNOs：15-21的任何一个氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列的BC环。
在一些实施方案中，本公开的NPC1结合分子包括修饰的CD环。在一些实施方案中，修饰的CD环选自SEQ ID NOs：23-28(见表1)中的任何一个修饰的CD环，或者包括与SEQ IDNOs：23-28的任何一个氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列的CD环。
在一些实施方案中，本公开的NPC1结合分子包括修饰的DE环。在一些实施方案中，修饰的DE环包括SEQ ID NO：30的氨基酸序列(见表1)，或者包括与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列的DE环。
在一些实施方案中，本公开的NPC1结合分子包括修饰的FG环。在一些实施方案中，修饰的FG环选自SEQ ID Nos：2-13(见表1)中的任何一个修饰的FG环，或者包括与SEQ IDNos：2-13的任何一个氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列的FG环。
表1：NCP1结合分子的BC、CD、DE和FG环的氨基酸序列
如上所述，FN3结构域在分子的相对面上包含两组类似CDR的环。两组环由形成FN3结构中心的β链(环之间的结构域的区域)隔开。与环类似，这些β链可以被改变以增强靶分子结合特异性和亲和力。优选地，β链中的部分或全部表面暴露的残基是随机化的，而不影响(或最小地影响)FN3结构域的固有稳定性。在一些实施方案中，一个或多个β链中的一个或多个残基被修饰以使其能够与NPC1相互作用。合适的修饰包括氨基酸取代、插入和/或删除。例如，Aβ链、Bβ链、Cβ链、Dβ链、Eβ链、Fβ链或Gβ链的一个或多个氨基酸残基可以被修饰以使NPC1能够结合或增强NPC1结合的特异性或亲和力。在一个实施方案中，A、B、C、D、E和/或Fβ-链的一个或多个氨基酸残基被修饰以与NPC1结合。
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽在Aβ链或其上游的区域中包含一个或多个氨基酸残基取代、添加或删除。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包含与SEQ ID NO：1的残基D3、R6和D7对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1的3位(D3S)处的天冬氨酸对应的氨基酸残基处的天冬氨酸到丝氨酸的取代，
在与SEQ ID NO：1的6位(R6T)处的精氨酸对应的氨基酸残基处的精氨酸到苏氨酸的取代，和/或在与SEQ ID NO：1的7位(D7K)处的天冬氨酸对应的氨基酸残基处的天冬氨酸到赖氨酸的取代。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包括在与SEQ ID NO：1的D3S、R6T和D7K对应的氨基酸残基处的天冬氨酸到丝氨酸的氨基酸、精氨酸到苏氨酸、天冬氨酸到赖氨酸的取代。
在一些实施方案中，本文所述的NCP1结合多肽包括Cβ链中的一种或多种氨基酸残基取代、添加或删除。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包括Cβ链中在与SEQ ID NO：1的31位酪氨酸残基对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ IDNO：1的31位(Y31H)处的酪氨酸对应的氨基酸残基处的酪氨酸到组氨酸的取代。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包括Cβ链中在与SEQ ID NO：1的33位精氨酸残基对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1的33位(R33V)处的精氨酸对应的氨基酸残基处的精氨酸到缬氨酸的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQID NO：1的33位(R33D)处的精氨酸对应的氨基酸残基处的精氨酸到天冬氨酸的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1的33位(R33F)处的精氨酸对应的氨基酸残基处的精氨酸到苯丙氨酸的取代。
在一些实施方案中，本文所述的NCP1结合多肽包括Dβ链中的一种或多种氨基酸残基取代、添加或删除。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包括Dβ链中在与SEQ ID NO：1的47位处的谷氨酸残基对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQID NO：1的47位(E47T)处谷氨酸对应的氨基酸残基处的谷氨酸到苏氨酸取代。在一些实施方案中，基酸取代是在与SEQ ID NO：1的47位(E47K)处谷氨酸对应的氨基酸残基处的谷氨酸到赖氨酸取代。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包括Dβ链中在与SEQ ID NO：1的49位处的苏氨酸残基对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ IDNO：1的49位(T49K)处的苏氨酸对应的氨基酸残基处的苏氨基酸到赖氨酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1的49位(T49A)处的苏氨酸对应的氨基酸残基处的苏氨基酸到丙氨酸取代。
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包括Fβ链中的一种或多种氨基酸残基取代、添加或删除。在一些实施方案中，NCP1结合多肽包括Dβ链中在与SEQ ID NO：1的74位处的丙氨酸残基对应的氨基酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1的74位(A74T)处的丙氨酸对应的氨基酸残基处的丙氨酸到苏氨酸取代。
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包括A链、C链、D链、E链和Fβ链中的一种或多种氨基酸残基取代、添加或删除。在一些实施方案中，本文所述的NCP1结合多肽包括在与所有上述氨基酸残基对应的位置处的氨基酸取代，即，在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的残基处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包括FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：2的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：15的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30的修饰的DE环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包含在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6和D7对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：32(单体(Mb)NPC1N-N8)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N8)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAYVSYWKVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSSSSTATISGLKPGVDYTITVYAKMYSYPYWYYSPISINYRT(SEQ ID NO:32)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包括包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQ ID NO：3的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：16的修饰的BC环氨基酸序列和SEQID NO：30的修饰的DE环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包括在与残基D3、R6和D7对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：33(MbNPC1N-N16)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N16)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDARGVPIWWQVYYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSSSTATIS
GLKPGVDYTITVYAWGGWKWYSPISINYRT(SEQ ID NO:33)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：4的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：17的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30的修饰的DE环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包含在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6和D7对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：34(MbNPC1N-N18)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N18)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAQPMYRSVSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSSYTATISGLKPGVDYTITVYAYSYYKGWYWSPISINYRT(SEQ ID NO:34)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：5的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：23的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包含与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6、D7、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：35(MbNPC1N-N22)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N22)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVSYYVITYGETGGPFWHYQTFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAYSPYYPAPYRSSPISINYRT(SEQ ID NO:35)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包括包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQ ID NO：6的修饰的FN3环氨基酸序列、SEQ ID NO：19的修饰的BC环氨基酸序列和SEQID NO：23的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6、D7、E47和A74对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：36(MbNPC1N-N23)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N23)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDASSSSVSYYRITYGETGGPFWHYQTFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYTYSSSMHFSSSPISINYRT(SEQ ID NO:36)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：7的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：24的修饰CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包含在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6、D7、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：37(MbNPC1N-N24)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N24)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVSYYVITYGETGGSYWHYQTFKVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAYSPYYPAPYRSSPISINYRT(SEQ ID NO:37)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：8的修饰的FN3环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：25的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含与残基D3、R6、D7、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：38(MbNPC1N-N26)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N26)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVSYYVITYGETGSPYWHYQTFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAYSPYYPAPYRSSPISINYRT(SEQ ID NO:38)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：9的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：26的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：39(MbNPC1N-N31)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N31)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVSYYVITYGETGGHYWHWQTFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAKSYMYGPPSYKSSPISINYRT(SEQ ID NO:39)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含，FN3结构域包含SEQ ID NO：10的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：26的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包含在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6、D7、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：40(MbNPC1N-N34)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N34)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVSYYVITYGETGGHYWHWQTFKVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAYYGQMRYYSPISINYRT(SEQ ID NO:40)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：11的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：20的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：24的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包含在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包含在与残基D3、R6、D7、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：41(MbNPC1N-N35)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N35)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVVYYDITYGETGGSYWHYQTFKVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAYYSSYRYWSPISINYRT(SEQ ID NO:41)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包括FN3结构域，FN3结构域包括SEQID NO：12的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：21的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：27的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、Y31、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：42(MbNPC1N-N38)的氨基酸序列。
Mb(NPC1N-N38)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVDHYFITYGETGAPVWHVQKFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYASSSSSGSSSSSKPISINYRT(SEQ ID NO:42)
在一些实施方案中，本文描述的NCP1结合多肽包含FN3结构域，FN3结构域包含SEQID NO：13的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：20的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：28的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，FN结构域还包括与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN结构域包括与在与残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含SEQ ID NO：43(MbNPC1C-C45)的氨基酸序列。
Mb(NPC1C-C45)
VSSVPTKLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVVHYVITYGETGASPYYYQKFAVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAYDGFYYTNNDSPISINYRT(SEQ ID NO:43)
本公开的另一方面涉及包括第一部分和第二部分的NPC1结合肽偶联物。NPC1结合肽偶联物的第一部分包括如上所述的NPCI结合多肽。NPC1结合肽偶联物的第二部分，其偶联至偶联物的第一部分，选自药物活性部分、诊断部分、半衰期延长部分、前药、第二结合分子、递送载体、聚合物、非结合蛋白及其任意组合。
根据本公开的这一方面，NPC1结合肽偶联物的第一和第二部分直接或通过连接肽共价偶联到其他部分。第一部分和第二部分可以通过标准克隆和表达技术直接融合和生成。可选地，可以使用公知的化学偶联方法直接或通过肽或其他连接肽来附接该部分以产生本文所述的NPC1结合肽偶联物。例如，第一部分和第二部分的共价偶联可以通过使用活化酯或异硫氰酸酯的赖氨酸侧链，或通过半胱氨酸侧链与马来酰亚胺、卤代乙酰衍生物或活化的二硫化物来完成。第一部分和第二部分的位点特异性偶联也可以通过并入非天然氨基酸、自标记标签(例如，SNAP或DHFR)或由另一种酶(诸如，分选酶A、硫辛酸连接酶和甲酰甘氨酸生成酶)特异性识别和修饰的标签来完成。在一些实施方案中，第一和第二部分的位点特异性偶联是通过在NPC1结合分子的C末端或特定位点引入半胱氨酸残基来实现的，如Goldberg等人在“Engineering a Targeted Delivery Platform Using Centyrins,”Protein Engineering,Design&Selection29(12):563-572(2016)中所描述的那样，其在此通过参考整体并入本文中。
在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物的第一和第二部分通过连接肽偶联在一起。在一些实施方案中，连接肽是氨基酸连接肽。在一些实施方案中，氨基酸连接肽是可裂解的连接肽。在一些实施方案中，氨基酸连接肽是不可裂解的连接肽。合适的连接肽包括由一种或多种氨基酸的重复模块组成的肽，诸如甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸。示例性连接肽肽包括，例如，(Gly-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Gly3-Ser)n、(Ala-Pro)n，其中n是1-25的整数。连接肽的长度可以适当调整，只要它不影响非结合蛋白-药物偶联物的功能。标准15个氨基酸(Gly4-Ser)3的连接肽已得到充分表征，并已被证明采用非结构化、灵活的构象。此外，该连接肽不会干扰它所连接的结构域的组装和活性(Freund et al.,“Characterization of the Linker Peptide of the Single-Chain Fv Fragment of anAntibody by NMR Spectroscopy,”FEBS 320:97(1993),其公开内容通过参考整体并入本文中)。
在一些实施方案中，本公开的NPC1结合肽偶联物的第二部分包括半衰期延长部分。示例性半衰期延长部分包括但不限于白蛋白、白蛋白变体(参见例如，Andersen等人的第8,822,417号美国专利、Desai等人的第8,314,156号美国专利以及Plumridge等人的第8,748,380号美国专利，其在此通过参考整体并入本文中)、白蛋白结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白和片段及其类似物(参见例如，Prior等人的第7,176,278号美国专利，其在此通过参考整体并入本文中)、Fc区域和变体Fc区域(参见例如，Lazar等人的第8,546,543号美国专利、Tsui的公开号为20150125444的美国专利和Seehra等人的第8,722,615号美国专利，其在此通过参考整体并入本文中)。
NPC1结合肽偶联物的其他第二部分半衰期延长部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000、脂肪酸和不同链长度的脂肪酸酯，例如月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、硬脂酸酯、廿酸、山嵛酸酯、油酸盐、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(葡聚糖、纤维素、低聚糖或多糖)以用于所期望的性能。通过使用本领域公知的方法将半胱氨酸残基添加到分子的C末端并将聚乙二醇化基团连接到半胱氨酸，聚乙二醇化部分可以例如添加到第一部分，即NPC1结合分子。
在另一个实施方案中，NPC1结合肽偶联物的第二部分包括诊断部分。合适的诊断部分是那些有助于NPC1结合肽偶联物的检测、定量、分离和/或纯化的部分。合适的诊断部分包括但不限于纯化标签(例如，聚组氨酸(His6-)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-)或麦芽糖结合蛋白(MBP-))、荧光染料或标签(例如，螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰氯、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红)、酶标签、放射性同位素或放射性标记物(例如，4C、11C、14N、35S、3H、32P、99mTc、111In、62/64Cu、125I、18F、67/68Ga、90Y、177Lu和186/188Re)、具有含螯合剂的放射性核苷酸(e.g.,MAG3,DTPA,and DOTA,see also,Liu S.,“Bifunctional Coupling Agents for Radiolabeling of Biomolecules and TargetSpecific Delivery of Metallic Radionuclides,”Adv.Drug Deli.60(12):1347-1370(2008),其在此通过参考整体并入本文中)、适用于成像的造影剂或光敏剂。
适合与放射性核苷酸组合用作诊断部分的螯合剂，包括但不限于，ΝΟΤΑ(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N“-三乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-l,4,7,10-四乙酸)、DTPA(1,1,4,7,7-二乙烯三胺五乙酸)、TETA(对溴乙酰氨基苄基四乙胺四乙酸)和Df(去铁胺B)，其中每个都可以与各种放射性标记物，放射性核素、放射性同位素、金属和放射性金属一起使用。DOTA型螯合剂，其中配体包括硬碱螯合官能团，诸如羧酸盐或胺基团，对于螯合硬酸阳离子最有效。这种金属螯合物可以通过调整感兴趣的金属环尺寸而变得非常稳定。此外，可以将一种以上的螯合剂与可靶向构建体偶联以结合多种金属离子，例如，诊断性放射性核素和/或治疗性放射性核素。
螯合剂可以使用标准的生物偶联方法与偶联物(即，FN3结构域)的NPCI结合多肽共价结合。FN3结构域中含有胺的残基(例如，赖氨酸)与含有活化酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的螯合剂形成酰胺键。含硫残基(例如，半胱氨酸)与含有活化酯或马来酰亚胺部分的螯合剂发生偶联。可选地，当FN3结构域的活化羧酸盐残基分别与螯合剂上的胺或硫醇基团形成酰胺或硫醇时，形成生物偶联物。双功能连接肽，诸如，例如PEG-马来酰亚胺(PEG-Mal)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)或N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶硫基)丙酸酯(SPDP)可以替代使用。
适合用作NPC1结合肽偶联物中的诊断部分的成像剂包括但不限于单光子发射计算机断层扫描(SPECT)剂、正电子发射断层扫描(PET)剂、磁共振成像(MRI)剂、核磁共振成像(NMR)剂、X射线剂、光学试剂(例如，荧光团、生物发光探针、近红外染料、量子点)、超声试剂和中子捕获治疗剂，计算机辅助断层扫描剂、两个光子荧光显微镜成像剂和多光子显微镜成像剂。
可与螯合剂结合的特别有用的诊断性放射性标记物、放射性核素或放射性同位素包括但不限于110In、mIn、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、9V、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、158Gd、32P、nC、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他适用于MRI的γ，β或正电子发射器和超小的氧化铁超顺磁性颗粒(USPIO)。诊断性放射性标记物包括25至10,000keV范围内的衰变能量，更优选在25至4,000keV范围内，并且甚至更优选在20至1,000keV范围内，以及仍然更有选在70至700keV范围内。有用的正电子发射放射性核素的总衰变能量优选为<2,000keV，并且更优选在1,000keV以下，和最优选<700keV。
在另一个实施方案中，NPC1结合肽偶联物的第二部分包括药物活性部分。合适的药物活性部分包括但不限于小分子活性部分、核酸分子、抗体或其抗原结合片段、抗体衍生物、蛋白质或其多肽片段、以及蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)。
在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是癌症治疗剂。合适的癌症治疗剂包括但不限于抗代谢物、生物碱、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、DNA结合药物、毒素、抗增殖药物、DNA拮抗剂、放射性核素、热消融剂、蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)和核酸抑制剂以及免疫调节剂。
在一些实施方案中，癌症治疗是生物碱。合适的生物碱包括但不限于多卡霉素、多西他赛、依托泊甙、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是烷化剂。合适的烷化剂包括但不限于白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美乌替派、乌瑞替派、六甲蜜胺、三甘醇单甲基醚、三乙烯磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、novemebichin、perfosfamidephenesterine、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司丁、尼莫司汀、司莫司汀雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、替莫唑胺及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是抗肿瘤抗生素。合适的抗肿瘤抗生素包括但不限于阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡利奇霉素、卡柔比星、嗜癌素、色莫霉素(cromomycin)、更生霉素、道诺霉素、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、去甲氧基柔红霉素、美诺立尔、丝裂霉素、霉酚酸、诺卡形霉素、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂卓、链霉黑素、链脲佐菌素、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是抗代谢剂。合适的抗代谢剂包括但不限于SN-38、二甲叶酸、依达曲沙、巯嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、喷司他丁(2'-DCF)、雷替曲塞、三甲曲沙、cladridine、氟达拉滨、硫咪嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、喃氟啶、羟基脲、尿烷及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是抗增殖药物。合适的抗增殖药物包括但不限于醋葡醛内酯、安吖啶、比生群、喜树碱、地磷酰胺、秋水仙胺、亚丝醌、二氟替康、依洛尼塞、依利醋铵、乙环氧啶、足叶乙甙、维甲酰酚胺、硝酸镓、羟基脲、片螺素D、氯尼达明、米替福新、丙脒腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝基可润、喷司他丁、蛋氨氮芥、鬼臼酸2-乙基-酰肼、甲基苄肼、丙亚胺、索布佐生、锗螺胺、替尼泊苷、细格孢氮杂酸、三亚胺醌2,2',2"-三氯三乙胺及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是抗有丝分裂剂。合适的抗有丝分裂剂包括但不限于澳瑞他汀、美登木素生物碱、尾海兔素、微管菌素、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是免疫调节剂。合适的免疫调节剂包括但不限于巨噬细胞1型刺激剂、巨噬细胞2型刺激剂、树突状细胞刺激剂、中性粒细胞刺激剂、B细胞刺激剂、T细胞刺激剂。
在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是免疫调节剂，即，巨噬细胞1型刺激剂。合适的巨噬细胞1型刺激剂包括但不限于紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂和TLR-9激动剂及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，巨噬细胞1型刺激剂是CSF-1受体拮抗剂。合适的CSF-1受体拮抗剂包括但不限于ABT-869(Guo et al.,“Inhibition of Phosphorylation of theColony-Stimulating Factor-1 Receptor(c-Fms)Tyrosine Kinase in TransfectedCells by ABT-869 and Other Tyrosine Kinase Inhibitors,”Mol.Cancer.Ther.5(4):1007-1012(2006),其在此通过参考整体并入本文找中)、伊马替尼(Guo et al.,“Inhibition of Phosphorylation of the Colony-Stimulating Factor-1 Receptor(c-Fms)Tyrosine Kinase in Transfected Cells by ABT-869 and Other Tyrosine KinaseInhibitors,”Mol.Cancer.Ther.5(4):1007-1012(2006),其在此通过参考整体并入本文找中)、PLX3397(Mok et al.,“Inhibition of CSF1Receptor Improves the Anti-tumorEfficacy of Adoptive Cell Transfer Immunotherapy,”Cancer Res.74(1):153-161(2014),其在此通过参考整体并入本文找中)、PLX5622(Dagher et al.,“Colony-stimulating Factor 1Receptor Inhibition Prevents Microglial PlaqueAssociation and Improves Cognition in 3xTg-AD Mice,”J.Neuroinflamm.12:139(2015),其在此通过参考整体并入本文找中)、DCC-3014(Deciphera Pharmaceuticals),、BLZ945(Krauser et al.,“Phenotypic and Metabolic Investigation of a CSF-1RKinase Receptor Inhibitor(BLZ945)and its Pharmacologically ActiveMetabolite,”Xenobiotica 45(2):107-123(2015),其在此通过参考整体并入本文找中)以及GW2580(Olmos-Alonso et al.,“Pharmacological Targeting of CSF1R InhibitsMicroglial Proliferation and Prevents the Progression of Alzheimer’s-likePathology,”Brain139:891-907(2016)，其在此通过参考整体并入本文中。
在任何实施方案中，巨噬细胞1型刺激剂是IL-10受体拮抗剂。合适的IL-10受体拮抗剂包括但不限于Naiyer等人在“Identification and Characterization of a HumanIL-10 Receptor Antagonist,”Hum.Immunol.74(1):28-31(2013)中描述的肽拮抗剂，其在此通过参考整体并入本文找中以及Von Herrath等人在美国专利第7,553,932号中描述的IL-10受体拮抗抗体，其在此通过参考整体并入本文中。
在任何实施方案中，巨噬细胞1型刺激剂是TLR-2激动剂。用于本文所述方法的合适的TLR-2激动剂包括Pam3CSK4、合成的三酰化脂蛋白和脂磷壁酸(LTA)(Brandt et al.,“TLR2 Ligands Induce NF-κB Activation from Endosomal Compartments of HumanMonocytes”PLoS One 8(12):e80743，其在此通过参考整体并入本文中)合适的TLR-3激动剂包括但不限于聚肌苷：聚胞苷酸(polyI：C)(Smole et al.,“Delivery System for theEnhanced Efficiency of Immunostimulatory Nucleic Acids,”Innate Immun.19(1):53-65(2013)，其在此通过参考整体并入本文中)。合适的TLR-4激动剂包括但不限于MPL(Engel et al.,“The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and theImpact on the Immune System,”Expert Rev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011),其在此通过参考整体并入本文中)、吡喃葡萄糖基脂质-A(Matzner et al.,“Perioperativetreatment with the new synthetic TLR-4agonist GLA-SEreduces cancer metastasiswithout adverse effects,”Int.J.Cancer 138(7):1754-64(2016),其在此通过参考整体并入本文中)以及(Ghochikyan et al.,“Targeting TLR-4with a novelpharmaceutical grade plant derived agonist,/>as a therapeuticstrategy for metastatic breast cancer,”J.Trans.Med.12:322(2014),其在此通过参考整体并入本文中)。
在任何实施方案中，巨噬细胞1型刺激剂是TLR-7激动剂。合适的TLR-7激动剂包括但不限于富含尿苷/胍的单链RNA(Engel et al.,“The Pharmacokinetics of Toll-likeReceptor Agonists and the Impact on the Immune System,”ExpertRev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011),which is hereby incorporated byreference in its entirety)、852A(Dudek et al.,“First in Human Phase I Trial of852A,a Novel Systemic Toll-like Receptor 7Agonist,to Activate Innate ImmuneResponses in Patients With Advanced Cancer,”Clin.Cancer Res.13(23):7119-7125(2007),which is hereby incorporated by reference in its entirety)、瑞喹莫德(Chang et al.,“Topical resiquimod Promotes Priming of CTL to ParenteralAntigens,”Vaccine 27(42):5791-5799(2009),which is hereby incorporated byreference in its entirety)、咪唑喹啉(Itoh et al.,“The Clathrin-mediatedEndocytic Pathway Participates in dsRNA-induced IFN-beta Production,”J.Immunol.181:5522-9(2008),其在此通过参考整体并入本文中)、ANA975(Fletcher etal.,“Masked oral Prodrugs of Toll-like Receptor 7 Agonists:a New Approach forthe Treatment of Infectious Disease,”Curr.Opin.Investig.Drugs 7(8):702-708(2006),其在此通过参考整体并入本文中)以及咪喹莫特(Engel et al.,“ThePharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact on the ImmuneSystem,”Expert Rev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011),其在此通过参考整体并入本文中)。
在任何实施方案中，巨噬细胞1型刺激剂是TLR-8激动剂。合适的TLR-8激动剂包括但不限于瑞喹莫德(Chang et al.,“Topical resiquimod Promotes Priming of CTL toParenteral Antigens,”Vaccine 27(42):5791-5799(2009),其在此通过参考整体并入本文中)以及咪唑喹啉(Itoh et al.,“The Clathrin-mediated Endocytic PathwayParticipates in dsRNA-induced IFN-beta Production,”J.Immunol.181:5522-9(2008),其在此通过参考整体并入本文中)。
在任何实施方案中，巨噬细胞1型刺激剂是TLR-9激动剂。合适的TLR-9激动剂包括但不限于CpG-ODN(Yao et al.,“Late Endosome/Lysosome-localized Rab7b SuppressesTLR-9-initiated Proinflammatory Cytokine and Type I IFN Production inMacrophages,”J.Immunol.183:1751-8(2009),其在此通过参考整体并入本文中)。Engel等人在“The Pharmacokinetics of Toll-like Receptor Agonists and the Impact onthe Immune System,”Expert Rev.Clin.Pharmacol.4(2):275-289(2011)中描述了适合使用的特定CpG-ODNs，其在此通过参考整体并入本文中。
为了包含在本文所述的NPC1结合肽偶联物中的目的，本领域已知的将2型巨噬细胞重编程为1型巨噬细胞(即1型巨噬细胞刺激剂)的其他试剂包括，二氧化锰纳米颗粒(seee.g.,Song et al.,“Bioconjugated Manganese Dioxide Nanoparticles EnhanceChemotherapy Response by Priming Tumor-Associated Macrophages toward M1-likePhenotype and Attenuating Tumor Hypoxia”ACS Nano.10:633-647(2016),其在此通过参考整体并入本文中)、氧化铁纳米颗粒(Zanganeh,et al.“Iron oxide nanoparticlesinhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization intumour tissues,”Nat.Nanotechnol.11:986-994(2016),其在此通过参考整体并入本文中)、封装针对IκBα的siRNA的甘露糖基化纳米颗粒(Ortega et al.“Manipulating theNF-kappaB pathway in macrophages using mannosylated,siRNA-deliveringnanoparticles can induce immunostimulatory and tumor cytotoxic functions,”Int.J.Nanomed.2163-2177(2016),其在此通过参考整体并入本文中)。
在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是巨噬细胞2型刺激剂。合适的巨噬细胞2型刺激剂包括但不限于IL-33、IL-4受体激动剂、糖皮质激素、IL-10受体激动剂、IL-1受体激动剂以及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，巨噬细胞2型刺激剂是IL-4受体激动剂。合适的IL-4受体激动剂包括但不限于突变的IL-4蛋白。示例性突变IL-4蛋白包括但不限于Sebald在美国专利第5,723,118号中描述的那些，其在此通过参考整体并入本文中。
在任何实施方案中，巨噬细胞2型刺激剂是糖皮质激素。糖皮质激素是一类皮质类固醇，其是本领域公知的，适用于诱导巨噬细胞-2型表型。用于并入本公开的NPC1结合肽偶联物的示例性糖皮质激素包括但不限于皮质醇、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安奈德、倍氯米松、氟氢可的松、脱氧皮质酮和醛固酮。
在任何实施方案中，巨噬细胞2型刺激剂是IL-10受体激动剂。合适的IL-10受体激动剂包括但不限于Sommer等人在美国专利第7,749,490号中描述的突变的IL-10蛋白，其在此通过参考整体并入本文中。
在任何实施方案中，巨噬细胞2型刺激剂是IL-1受体激动剂。合适的IL-1受体激动剂包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ(Palomo et al.,“The Interleukin(IL)-1Cytokine Family-Balance Between Agonists andAntagonists in Inflammatory Diseases,”Cytokine 76(1):25-37(2015),其在此通过参考整体并入本文中)。
在任何实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是T细胞刺激剂。在任何实施方案中，T细胞刺激剂是干扰素基因(STING)激动剂的刺激剂。合适的STING激动剂包括但不限于环二核苷酸(CDN)，诸如单磷酸鸟苷环二聚体(c-di-GMP)、单磷酸腺苷环二聚体(c-di-AMP)、环GMP-AMP(cGAMP)和二硫代(RP,RP)-[环A(2',5')pA(3',5')p(ADU-S100,AduroBiotech)和小分子，诸如5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)和连接的酰胺基苯并咪唑。根据本公开，正在开发的其他STING激动剂也是合适的免疫调节剂，包括BMS-986301、E7766、GSK3745417、MK-1454、MK-2118和SB11285。
在任何实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是树突状细胞刺激剂。合适的树突状细胞刺激剂包括但不限于CpG寡核苷酸、咪喹莫特、拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱及其衍生物)、微管解聚药物(例如，秋水仙碱、鬼臼毒素及其衍生物)及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是中性粒细胞刺激剂。合适的中性粒细胞刺激剂包括重组粒细胞集落刺激因子蛋白(filgrastim)和聚乙二醇化的重组粒细胞集落刺激因子蛋白。
在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分是核酸分子。合适的核酸分子活性部分包括但不限于反义寡核苷酸、siRNA、适配体、miRNA、免疫刺激性寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、和向导RNA、及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，NPC1结合肽偶联物的药物活性部分偶联或包装在递送载体内。因此，在一些实施方案中，NPC1结合肽偶联物包括与递送载体偶联的NPC1结合多肽。在任何实施方案中，递送载体含有药物活性部分。
根据本公开的这一方面，本领域已知的任何合适的药物递送载体都可以与NPC1结合多肽偶联以形成本文所述的NPC1结合肽偶联物。在任何实施方案中，药物递送载体是本领域已知的纳米颗粒递送载体、基于聚合物的颗粒或基于脂质的颗粒递送载体(see,e.g.,Xiao et al.,“Engineering Nanoparticles for Targeted Delivery of Nucleic AcidTherapeutics in Tumor,”Mol.Ther.Meth.Clin.Dev.12:1-18(2019)and Ni et al.,“Synthetic Approaches for Nucleic Acid Delivery:Choosing the Right Carriers,”Life 9(3):59(2019),其在此通过参考整体并入本文中)，其可以在本文描述的方法中使用。
合适的纳米颗粒递送载体包括但不限于金纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、镉(量子点)纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒、以及衍生自本领域已知的任何其他固体无机材料的颗粒。
合适的聚合物基颗粒或聚复合载体(carrier)包括阳离子聚合物，诸如聚乙烯亚胺(PEI)，和/或与中性聚合物偶联的阳离子聚合物，如聚乙二醇(PEG)和环糊精。根据本文描述的方法促进核酸分子或表达载体(vector)递送的其他合适的PEI偶联物包括但不限于PEI-水杨酰胺偶联物和PEI-硬脂酸偶联物。其他适合用作递送载体(vehicle)材料的合成阳离子聚合物包括但不限于聚-L-赖氨酸(PLL)、聚丙烯酸(PAA)、聚酰胺-环氧氯丙烷(PAE)和聚[2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯](PDMAEMA)。适合用作递送载体材料的天然阳离子聚合物包括但不限于壳聚糖、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、明胶、葡聚糖、纤维素和环糊精。
合适的脂质载体(vehicle)包括基于阳离子脂质的脂质复合物(例如，1,2-二油酰基-3三甲基铵丙烷(DOTAP))、基于中性脂质的脂复合物(例如，胆固醇和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE))、基于阴离子脂质的脂质复合物(例如，胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS))和pH敏感的脂质复合物(例如，2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐(DOSPA))。其他合适的基于脂质的递送颗粒在脂质体和DLin-MC3-DMA((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯)中掺入可电离的DOSPA。
在一些实施方案中，癌症治疗剂是PROTAC。合适的PROTAC包括但不限于BET降解剂，诸如Pillow等人披露的“Antibody Conjugation of a Chimeric BET DegraderEnables In vivo Activity,”ChemMedChem 15(1):17-25(2020),其在此通过参考整体并入本文中。合适的PROTAC还包括Ras途径降解剂，参见例如Bond等人在“TargetedDegradation of Oncogenic KRAS(G12C)by VHL-recruiting PROTACs,”ACS Cent.Sci.6(8):1367-75(2020)中；Nabet等人在“The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation,”Nat Chem Biol.14(5):431-41(2018)中；Simpson等人在“Inducibledegradation of target proteins through a tractable affinity-directed protein missile system,”Cell Chem Biol.27(9):1164-80.e5(2020)中；Cheng等人在“Discovery of novel PDEδdegraders for the treatment of KRAS mutantcolorectal cancer,”J Med Chem.63(14):7892-905(2020)中；Crew等人在“Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-recruitingproteolysis targeting chimeras(PROTACs)of TANK-binding kinase 1,”J MedChem.61(2):583-98(2018)中；Vollmer等人在“Design,Synthesis,and BiologicalEvaluation of MEK PROTACs,”J Med Chem.63(1):157-62(2020)中；以及Yang等人在“Discovery of thalidomide-based PROTAC small molecules as the highlyefficient SHP2 degraders,”Eur J Med Chem.218:113341(2021)中描述的Ras途径降解剂，其在此通过参考整体并入本文中。
在另一个实施方案中，NPC1结合肽偶联物的第二部分包括第二多肽。在一些实施方案中，第二多肽是非结合分子。在一些实施方案中，多肽是第二结合分子。在一些实施方案中，第二结合分子是抗体或其抗体结合结构域。如本文所用的抗体包括任何含有蛋白质或肽的分子，其包含至少一部分免疫球蛋白分子，诸如但不限于重链或轻链的至少一个、至少两个或至少三个互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区、构架区或其任何部分。抗体包含完整的抗体、消化片段、其指定部分和变体，包括但不限于模仿抗体结构和/或功能的部分抗体或其特定片段或部分，包括但不限于单链抗体、单结构域抗体(即仅包含一个可变结构域的抗体片段，可能是独立于其他V区域或结构域的VHH、VH或VL、特异性结合抗原或表位)。功能片段包括与特定靶标结合的抗原结合片段。例如，能够与特定靶标或其部分结合的抗体片段包括但不限于Fab(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′(例如，通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab′)2(例如，通过胃蛋白酶消化)、Fd(例如，通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚合)、Fv或scFv(例如，通过分子生物学技术)片段。
本公开的另一方面涉及编码本文所述的NPC1结合分子或NPC1结合肽偶联物的多核苷酸。本公开的核酸分子包括分离的多核苷酸、部分表达载体或部分线性DNA序列，包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列，与原核、真核或丝状噬菌体表达、其组合物或定向诱变剂的分泌和/或显示相容的载体。
在本公开的一个实施方案中，分离的多核苷酸包括那些编码上文所述的结合分子的核苷酸。示例性分离的多核苷酸分子包括编码FN3结构域的那些分子，该FN3结构域包括SEQ ID NO：2的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：15的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ IDNO：30的修饰的DE环氨基酸序列。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6和D7对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：32(MbNPC1N-N8)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：3的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：16的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30的修饰的DE环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6和D7对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：33(MbNPC1N-N16)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：4的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：17的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30的修饰的DE环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域在与残基D3、R6和D7对应的残基处包括氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：34(MbNPC1N-N18)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：5的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：23的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ IDNO：35(MbNPC1N-N22)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：6的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：19的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：23的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、E47和A74对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ IDNO：36(MbNPC1N-N23)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：7的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：24的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQID NO：37(MbNPC1N-N24)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码的NCP1结合多肽具有FN3结构域，FN3结构域包括SEQ ID NO：8的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：25的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括与残基D3、R6、D7、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：38(MbNPC1N-N26)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：9的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：26的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ IDNO：39(MbNPC1N-N31)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：10的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：26的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQID NO：40(MbNPC1N-N34)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：11的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：20的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：24的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQID NO：41(MbNPC1N-N35)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：12的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：21的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：27的修饰CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、Y31、R33和E47对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQID NO：42(MbNPC1N-N38)的氨基酸序列的FN3结构域。
在一些实施方案中，本公开的分离的多核苷酸编码具有FN3结构域的NCP1结合多肽，FN3结构域包括SEQ ID NO：13的修饰的FG环氨基酸序列、SEQ ID NO：20的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：28的修饰的CD环氨基酸序列。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域还包括在与SEQ ID NO：1的残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47、T49和A74对应的一个或多个残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN结构域包括在与残基D3、R6、D7、Y31、R33、E47和T49对应的残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，由本公开的多核苷酸编码的FN3结构域包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FN3结构域包含与SEQ ID NO：43的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：43(MbNPC1C-C45)的氨基酸序列的FN3结构域。
本公开的多核苷酸可以通过化学合成，诸如固相多核苷酸在自动多核苷酸合成器上合成并组装成完整的单链或双链分子来生产。可选地，本公开的多核苷酸可以通过其它技术诸如PCR然后进行常规克隆来产生。用于生产或获得给定已知序列的多核苷酸的技术是本领域公知的。
本文中描述的多核苷酸可以包含至少一个非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、多聚腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可以包括编码附加氨基酸的附加序列，这些附加氨基酸编码例如标记物或标签序列诸如组氨酸标签或HA标签以促进蛋白质、信号序列、诸如RepA、Fc的融合蛋白伙伴或诸如pIX或pIII的噬菌体外壳蛋白的纯化或检测。
本公开的另一个实施方案是包含本文所述的至少一种或多种多核苷酸的载体。这种载体可以是质粒载体、病毒载体、杆状病毒表达载体、基于转座子的载体或适合于通过任何手段将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的任何其他载体。这种载体可以是包含核酸序列元件的表达载体，这些核酸序列元件可以控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达。这些元件可以包括转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及促进给定表达系统中编码多肽表达的其它位点。这种表达系统可以是本领域公知的基于细胞的或无细胞的系统。
本公开的另一个实施方案是包含上述载体的宿主细胞。本文公开的结合分子和/或NPC1结合肽偶联物可任选地由细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群产生，如本领域公知的(see e.g.,Ausubel et al.,ed.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Harlow and Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Colligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001)；Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,JohnWiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),其在此通过参考整体并入本文中)。
选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物来源的，或者也可以选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、He G2、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或其任何衍生、永生化或转化的细胞。可选地，宿主细胞可以选自不能糖基化多肽的物种或生物体，例如，原核细胞或生物体，诸如BL21、BL21(DE3)、BL21--GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)，以及任何天然或工程的大肠杆菌、克雷伯氏杆菌或假单胞菌菌株。
本公开的另一方面涉及如本文所述生产和分离结合分子和NPC1结合肽偶联物的方法。该方法涉及在使得结合分子或NPC1结合肽偶联物表达的条件下培养本公开的分离的宿主细胞，以及从宿主细胞培养物中纯化表达的结合分子或NPC1结合肽偶联物。
本文所述的结合分子和NPC1结合肽偶联物可以通过公知的方法从重组细胞培养物中纯化，例如通过蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱，或高效液相色谱(HPLC)。
如本文所述纯化或分离的结合分子和NPC1结合肽偶联物可以与多种非蛋白质聚合物之一连接，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。结合分子和/或NPC1结合肽偶联物也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的胶囊中(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳状液中。这些技术在雷明顿的PHARMACEUTICAL SCIENCES,16th edition,Oslo,A.,Ed.,(1980)中披露，其在此通过引用整体并入本文中。
对于治疗用途，本文所述的结合分子和NPC1结合肽偶联物可以制备为在药学上可接受的载体中含有有效量的结合分子或NPCI结合肽偶联物作为活性成分的药物组合物。术语“载体”是指和活性化合物一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体。这种载体可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些载体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物。它们可以通过传统的、众所周知的灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。所述组合物可含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本文所述的结合分子或结合肽偶联物的浓度在这种药物制剂中可以变化很大，即从小于约0.5％，通常或至少约1％至高达15或20重量％，并且将主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等，根据所选择的特定给药方式来选择。合适的载体和制剂，包括其他人类蛋白质，例如，人血清白蛋白，例如在REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing的第691-1092页，特别是第958-989页中所描述的，其在此通过引用整体并入本文中。
本文所述的结合分子和NPC1结合肽偶联物可以以非分离或分离形式使用。此外，本文的结合分子和NPC1结合肽偶联物可以单独使用，也可以在包含本文的至少一种其它结合分子或NPC1结合肽偶联物的混合物中使用。换言之，结合分子和NPC1结合肽偶联物可以组合使用，例如，作为包含两种或多种的本文的结合分子、两种或多种NPC1结合肽偶联物、结合分子和NPC1结合肽偶联物，以及它们的变体的药物组合物。例如，结合分子和/或具有不同但互补活性的NPC1结合肽偶联物可以在单一疗法中组合以达到所需的治疗效果，但是可选地，结合分子和具有相同活性的NPC1结合肽偶联物也可以在单一疗法中组合以达到所需的治疗或诊断效果。任选地，所述混合物还包含至少一种其它治疗剂。
本公开的另一方面涉及组合治疗剂。这种组合治疗剂包括本文所述的NPC1结合多肽和药物活性部分。
根据本方面公开的内容，所述组合治疗剂的药物活性部分可以是本领域已知的任何药物活性部分。合适的药物活性部分包括但不限于小分子活性部分、核酸分子、抗体、抗体结合片段、抗体衍生物、蛋白质或其多肽片段、蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)及其类似物和衍生物。
本文所用的术语“联合治疗”是指施用两种或多种治疗剂，即如本文所述的NPC1结合多肽或包括其的NPC1结合肽偶联物与活性药物部分组合。在一些实施方案中，联合治疗以基本上同时的方式共同施用，诸如以具有固定比例的活性成分的单个胶囊或其它递送载体。在一些实施方案中，联合治疗以多个胶囊或递送载体施用，每个胶囊或递送载体都含有活性成分。在一些实施方案中，联合治疗的治疗剂按顺序施用，要么在大约相同的时间，要么在不同的时间施用。例如，在一个实施方案中，如本文所述结合的NPC1多肽作为新佐剂施用，即在施用药物活性部分之前施用。在其它实施方案中，NPC1结合多肽作为标准辅助治疗施用，即在施用药物活性部分之后施用。在所有实施方案中，联合疗法提供了药物组合在治疗特定病症方面的有益效果，例如，用于治疗癌症，特别是在早期、侵袭性和难治性癌症中。
在任何实施方案中，组合治疗剂的药物活性部分是癌症治疗剂。在一些实施方案中，组合治疗剂的癌症治疗剂是化疗剂。合适的化疗剂包括但不限于烷化剂(例如，苯丁酸氮芥、环磷酰胺、CCNU、美法仑、甲基苄肼、噻替哌、BCNU和白消安)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤和5-氟尿嘧啶)、蒽环类药物(柔红霉素、多柔比星、伊达比星、表柔比星和米托蒽醌)、抗肿瘤抗生素(例如，博来霉素、单克隆抗体(例如，阿仑珠单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥单抗(Trastuxmab))、铂类(例如，顺铂和奥沙利铂)或植物生物碱(例如，拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类(例如紫杉醇)和表鬼臼毒素)。在一些实施方案中，癌症化疗剂选自环磷酰胺、吉西他滨、伏立诺他、替莫唑胺、硼替佐米、卡莫司汀和紫杉醇。
在一些实施方案中，组合治疗剂的癌症治疗剂是免疫检查点抑制剂。合适的免疫检查点抑制剂包括但不限于CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自帕博利珠单抗(Keytruda)、纳武利尤单抗(Opdivo)和西米普利单抗(Libtayo)的PD-1抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自阿替利珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Bavencio)和度伐利尤单抗(Imfinzi)的PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，诸如易普利姆玛(Yervoy)。
在一些实施方案中，组合治疗剂的癌症治疗剂是表皮生长因子(EGFR)抑制剂。合适的EGFR抑制剂包括但不限于吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、奥希替尼、帕尼单抗、来那替尼、凡德他尼、耐昔妥珠单抗和达克替尼。
在一些实施方案中，组合治疗剂的癌症治疗剂是mTOR抑制剂。合适的mTOR抑制剂包括但不限于西罗莫司、依维莫司、西罗莫司脂化物和依维莫司。
本公开的另一方面涉及治疗对象癌症的方法。该方法涉及选择患有癌症的对象并向对象施用有效量的本文所述的NPC1结合多肽，包括本文所述的NPC1结合多肽的NPC1结合肽偶联物，编码NPC1结合多肽或NPC1结合肽偶联物的多核苷酸，或含有任何前述试剂的药物组合物以治疗癌症。
根据本文描述的所有方法，“对象”是指具有将受益于NPC1抑制的条件的任何动物或人类。在一个实施方案中，对象是哺乳动物。示例性哺乳动物对象包括但不限于人类、非人类灵长类动物、狗、猫、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)、马、牛和奶牛、羊和猪。
在一些实施方案中，对象具有癌症类型，其中癌细胞相对于其相应的非癌细胞具有增强的大型胞饮作用。在一些实施方案中，癌症的特征在于癌细胞在H-ras、N-ras或K-ras中具有致癌突变。在一些实施方案中，对象具有选自胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、神经胶质瘤、实体瘤、黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤、白血病、肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌和骨髓瘤的癌症。
在一些实施方案中，对象的癌症类型，是或者变得对原发性癌症治疗剂治疗具有耐药性，例如，在施用NPC1结合分子或包含其的药物组合物之前对化疗治疗具有耐药性。施用有效量的NPC1结合分子或包含其的药物组合物以使癌细胞对原发性癌症治疗剂治疗再敏感。
在一些实施方案中，治疗患有癌症的对象的方法还包括共同施用癌症治疗剂，以及所述NPC1结合多肽、NPC1结合肽偶联物或者包含其的药物组合物。在前文中描述了可以与本文所述的NPC1组合物联合施用作为组合疗法的合适的癌症治疗剂。
根据本文描述的方法，通过全身或局部施用来单独地施用NPC1结合分子或包含其的药物组合物或者将其与一种或多种癌症治疗剂组合施用。本文公开的治疗剂和/或组合治疗剂的全身给药的合适方式包括但不限于口服、局部、透皮、肠道外、皮内、肺内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下或通过鼻内滴注、腔内或膀胱灌注、眼内、动脉内、病灶内或通过施加到粘膜。在某些实施方案中，本文中描述的方法的治疗剂是口服递送的。本文公开的治疗剂和/或组合的局部施用的合适模式包括但不限于导管插入、植入、直接注射、皮肤/透皮施用、或门静脉施用到相关组织，或通过本领域通常已知的任何其它局部施用技术、方法或程序。影响药物递送的方式将根据治疗剂的类型和待治疗的癌症类型而有所不同。
在本文公开的方法中，单独的NPC1结合分子或包含其的药物组合物或者NPC1结合分子或包含其的药物组合物与癌症治疗剂的组合的有效治疗量，是当在特定时间间隔内施用时，导致实现一个或多个治疗基准(例如，减缓或停止肿瘤生长、肿瘤消退、症状停止等)。用于目前公开的方法的单独的NPC1结合分子或包含其的药物组合物，或者NPC1结合分子或包含其的药物组合物与癌症治疗剂的组合可以施用于对象一次或多次。在治疗组合物多次施用的那些实施方案中，它们可以以设定的间隔施用，例如，每天、每隔一天、每周或每月。可选地，它们可以不定期施用，例如基于症状、患者健康状况等根据需要施用。例如，治疗有效量可以每天(q.d.)施用一次并持续一天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天或至少15天。任选地，在治疗期间或治疗后监测癌症的状态或癌症的消退，例如，通过对象的多参数超声(mpUS)，多参数磁共振成像(mpMRI)和核成像(正电子发射断层扫描[PET])。根据癌症的状态或检测到的癌症的消退，可以增加或减少给予对象的治疗剂或组合疗法的剂量。
本领域技术人员可以容易地确定这一量，无论是在个体对象的基础上(例如，在被治疗的对象中达到特定治疗基准所必需的化合物的量)还是基于群体(例如，在给定人群的平均对象中达到特定治疗基准所需的化合物的量)。理想情况下，治疗有效量不超过最大耐受剂量，其中50％或更多的治疗对象出现阻止进一步药物施用的副作用。
治疗有效量对于对象可以取决于多种因素而变化，包括症状的种类和程度、性别、年龄、体重、或对象的一般健康状况、给药方式和盐或溶剂化物类型、对药物易感性的变化、疾病的具体类型等。
本公开的另一方面涉及治疗对象中传染病的方法。该方法涉及选择具有传染病的对象并向对象施用有效量的本文所述的NCP1结合多肽或NPC1结合肽偶联物以治疗感染性疾病。
在一些实施方案中，具有感染性疾病的对象具有丝状病毒。在一些实施方案中，丝状病毒是埃博拉病毒或马尔堡病毒。埃博拉病毒和其他丝状病毒通过内吞作用附着并进入宿主细胞。内化病毒位于晚期内体/溶酶体中，并被半胱氨酸蛋白酶裂解。裂解的埃博拉糖蛋白可作为NPC1的配体。NPC1抑制剂抑制这种相互作用可阻断病毒感染。例如，参见Basu等人的“Novel Small Molecule Entry Inhibitors of Ebola Virus,”J.Infect.Dis.212(Suppl 2):S425-434(2015)，其在此通过参考整体并入本文中。因此，本文中描述的NPC1结合分子可以施用于具有或有丝状病毒感染风险的对象，作为抑制感染、抑制感染进展和/或减少对象感染的治疗手段。
在一些实施方案中，具有感染性疾病的对象具有冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)或中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。NPC1功能突变的丧失导致诱导胆固醇合成，这已被证明可以对抗冠状病毒介导的胆固醇合成抑制(Daniloski et al.,“Identification of Required Host Factorsfor SARS-CoV-2Infection in Human Cells,”Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.030(2020)，其在此通过参考整体并入本文中。因此，本文所述的NPC1结合分子可以施用于具有或处于冠状病毒感染风险的对象，作为抑制感染、抑制感染进展和/或减少对象感染的治疗手段。
在前文中描述了用于施用于具有传染病的对象的包含NPC1结合分子和/或其NPC1结合肽偶联物的合适药物组合物。
本公开的另一方面涉及在需要它的对象中增强内体释放药物活性部分的方法。在一个实施方案中，该方法涉及向对象施用本文所述的NPC1结合肽偶联物，即包括第一NPC1结合多肽部分和偶联到第一部分的第二部分，其中第二部分是药物活性部分。在另一个实施方案中，该方法涉及向对象施用本文所述的组合治疗剂，即，包含NPC1结合多肽和药物活性部分的组合治疗剂。
根据本方面公开的方面，所述药物活性部分可以是本领域已知的任何药物活性部分，包括但不限于小分子活性部分、核酸分子活性分子、抗体或其结合片段、抗体衍生物、蛋白质或其多肽片段、蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)，及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，对象具有神经退行性疾病并且该药物活性部分适于治疗所述神经退行性疾病。典型的神经退行性疾病包括但不限于肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病。
在任何实施方案中，对象患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，并且该方法涉及施用NPC1结合肽偶联物或包括ALS治疗剂的NPC1组合治疗剂以治疗对象中的ALS。合适的ALS治疗剂包括但不限于谷氨酸阻滞剂(例如，利鲁唑、力如太和其他衍生物)、依达拉奉、Radicava、肌肉松弛剂(例如，巴氯芬、替托尼定和其他衍生物)及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，对象患有帕金森病，并且该方法涉及施用NPC1结合肽偶联物或包括帕金森病治疗剂的NPC1组合治疗剂以治疗对象中的帕金森病。治疗帕金森病的合适治疗剂包括但不限于多巴胺促进剂(例如，卡比多巴、左旋多巴、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、卡麦角林、托卡朋、溴隐亭、金刚烷胺和其他衍生物)、多巴胺激动剂(例如，普拉克索、Mirapex、罗匹尼罗、罗平尼咯、罗替戈汀、纽普罗、阿朴吗啡、阿扑吗啡)、认知增强药物(卡巴拉汀和其他衍生物)、抗震颤药物(例如，苯扎托品和其他衍生物)、MAOB抑制剂(司来吉兰、Zelapar、雷沙吉兰、Azilect、沙芬酰胺、Xadago和其他衍生物)、邻苯二酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(例如，恩他卡朋、Comtan、奥匹卡朋、Ongentys、托卡朋、Tasmar、抗胆碱能药物(例如，苯扎托品、苯甲托品、苯海索和其他衍生物)及其类似物和组合。
在任何实施方案中，对象患有亨廷顿病，并且该方法涉及向对象施用NPC1结合肽偶联物或包括亨廷顿病治疗剂的NPC1组合治疗剂以治疗亨廷顿病。治疗亨廷顿病症状的合适的治疗剂包括但不限于运动控制药物(例如，四苯喹嗪、丁苯那嗪、替硝苯那嗪、Austedo和其他衍生物)抗精神病药物(例如，氟哌啶醇、氟哌丁苯、羟哌氟丙嗪、利培酮、维思通、奥氮平、再普乐、喹硫平、思瑞康和其他衍生物)、舞蹈病抑制剂(例如，金刚烷胺、Gocovri ER、Osmolex ER、左乙拉西坦、Keppra、Elepsia XR、左乙拉西坦、氯硝西泮、氯硝安定和其他衍生物)及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，对象患有阿尔茨海默病，并且该方法涉及向对象施用NPC1结合肽偶联物或包括阿尔茨海默病治疗剂的NPC1组合治疗剂来治疗阿尔茨海默病。治疗阿尔茨海默病的合适治疗剂包括但不限于认知增强药物(例如，美金刚、盐酸美金刚(Namenda)和其他衍生物)、胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、安理申、加兰他敏、Razadyne、卡巴拉汀、Exelon和其他衍生物)、阿杜卡奴抗体、Aduhelm及其类似物和衍生物。
在另一个实施方案中，增强内体释放药物活性部分的方法涉及向具有炎症病症的对象施用NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂以治疗该病症，其中NCP1结合肽偶联物或组合治疗剂的药物活性部分适合于治疗所述炎症病症。可以用该方法治疗的示例性炎症病症包括但不限于类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、黄斑变性、骨质疏松症、免疫炎症、非免疫炎症、肾脏炎症、结核病、多发性硬化症、关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和阿尔茨海默病。
掺入NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂的合适的抗炎治疗剂包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID)(例如，布洛芬、雅维、Motrin IB、萘普生钠、Aleve和其他衍生物)、皮质类固醇药物(例如，泼尼松和其他衍生物)、常规改善病情抗风湿药(DMARD)(例如，甲氨蝶呤、Trexall、Otrexup、来氟米特、Arava、羟化氯喹、硫酸羟氯喹片、柳氮磺胺吡啶和其他衍生物)、生物DMARD(阿巴西普、阿贝西普、阿达木单抗、修美乐、阿那白滞素、Kineret、赛妥珠单抗、Cimzia、依那西普、Enbrel、戈利木单抗、Simponi、英夫利昔、英利昔单抗、利妥昔单抗、美罗华、sarilumab、Kevzara、托珠单抗、托西珠单抗和其他衍生物)、靶向的合成DMARD(例如，巴瑞替尼、Olumiant、托法替尼、托法替布、乌帕替尼、Rinvoq和其他衍生物)及其类似物和衍生物。
掺入NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂的合适的抗炎治疗剂包括但不限于他汀类药物(例如，阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀和其它衍生物)和其它胆固醇药物(例如，依泽替米贝、Zetia、非诺贝特、吉非罗齐和其他衍生物)、抗凝剂(例如，阿司匹林和其它衍生物)、血液稀释剂及其类似物和衍生物。
在另一个实施方案中，增强内体释放药物活性部分的方法涉及向具有骨病症的对象施用NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂以该骨病症，其中NCP1结合肽偶联物或组合治疗剂的药物活性部分适用于治疗所述骨病症。在任何实施方案中，对象的骨病症选自骨质疏松症或佩吉特骨病。
在任何实施方案中，对象患有骨质疏松症，并且该方法涉及向对象施用NPC1结合肽偶联物或包括骨质疏松症治疗剂的NPC1组合治疗剂，以治疗骨质疏松症。合适的骨质疏松症治疗剂包括但不限于双膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐、阿仑膦酸钠、福善美、伊班膦酸盐、伊班膦酸钠、利塞膦酸盐、利塞膦酸钠、Atelvia、唑来膦酸、密固达、Zometa和其他衍生物)、地诺单抗(例如，狄诺塞麦、地诺塞麦和其他衍生物)、激素相关治疗(例如，雌性激素、雷洛昔芬、易维特、睾酮和其他衍生物)、骨骼构建药物(例如，特立帕肽、Bonsity、帕肽、阿巴洛肽、Tymlos、罗莫单抗、Evenity和其他衍生物)，及其类似物和衍生物。
在任何实施方案中，对象患有佩吉特骨病，并且该方法涉及向对象施用NPC1结合肽偶联物或包括佩吉特骨病治疗剂的NPC1组合治疗剂以治疗佩吉特骨病。适合治疗佩吉特骨病的治疗剂包括但不限于双膦酸盐(例如，唑来膦酸、密固达、Zometa、氨羟二磷酸二钠、帕米膦酸盐、伊班膦酸盐、伊拜膦酸钠和其他衍生物)和口服双膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐、阿仑膦酸钠、利塞膦酸盐、安妥良、Atelvia和其他衍生物)及其类似物和衍生物。
在另一个实施方案中，增强内体释放药物活性部分的方法涉及向患有癌症的对象施用NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂，其中NCP1结合肽偶联物或组合治疗剂的药物活性部分适合于治疗癌症。已知和可用于治疗癌症的药物活性部分详见前文所述。在任何实施方案中，对象具有与RAS途径激活或过度激活相关的癌症(例如，EGFR驱动的癌症和PTEN缺陷癌症)。
按照本文描述的方法，通过全身施用NPC1结合多肽、NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂以用于治疗本文所述的各种病症(例如，癌症、传染病、神经退行性疾病、炎症病症和骨病症)和/或增强在有需要的对象中进行内体释放。合适的全身给药方式如上所述公开，包括但不限于口服、局部、透皮、肠道外、皮内、肺内、肌内、腹腔内、静脉内、皮下或鼻内滴注、腔内或膀胱内灌注、眼内、动脉内、病灶内或应用于粘膜。
NPC1结合多肽、NPC1结合肽偶联物或NPC1组合治疗剂治疗本文所述病症(例如，癌症、传染病、神经退行性疾病、炎症病症和骨病症)和/或增强本文所述对象中内体释放药物活性部分的有效治疗量是，当在特定时间间隔内给药时，导致达到一个或多个治疗基准(例如，减缓或停止感染、抑制感染、症状停止等)。NPC1结合多肽、NPC1结合肽偶联物、或包括其的NPC1组合治疗剂可施用于对象一次或多次。在治疗组合物多次施用的那些实施方案中，可以以设定的间隔施用，例如，每天、每隔一天、每周或每月。可选地，可以不定期地给予，例如基于症状、患者健康状况等根据需要施用。例如，治疗有效量可以每天施用一次，并持续一天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天或至少15天。
对象的有效治疗量可以根据多种因素而变化，包括症状的种类和程度、性别、年龄、体重、或对象的一般健康状况、给药方式和盐或溶剂化物类型、对药物易感性的变化、丝状病毒感染的具体类型等。
实施例
提供以下实施例以示出本公开的实施例，但绝不旨在限制其范围
实施例1-NPC1在KRas肿瘤组织中上调
为了探索突变KRas肿瘤组织与NPC1表达之间的联系，分析了胰腺癌组织，因为这些样品主要是突变的KRas(～97％)。发现与正常相邻组织相比，肿瘤组织中NPC1表达升高(图1A)。此外，Kaplan-Meier分析显示，NPC1表达较高的患者的生存率较差(图1B)。为了测试NPC1的抑制是否在体外具有生长抑制作用，使用了NPC1靶向工具化合物伊曲康唑。观察到伊曲康唑在突变KRas CRC细胞中对细胞增殖的剂量依赖性抑制(图2)。
对于药物发现，建立了用于抑制NPC1的一组稳健生物标记物。如前所述，在成纤维细胞中，siRNA介导的NPC1基因沉默和NPC1的小分子抑制导致胆固醇的内体积累。经验证，NPC1在突变的KRas癌细胞系的胆固醇运输中具有必要的作用(图3A)。此外，自噬通量的抑制已被证明是NPC1抑制的结果。使用自噬标记物LC3B的免疫荧光和生化分析，验证了NPC1基因沉默和小分子抑制阻断自噬通量(图3B和3C)。
实施例2-用于治疗癌症的NPC1单体
不幸的是，可用的小分子NCP1工具化合物并非特异性靶向癌细胞，因为它们可以自由地穿过细胞的膜。因此，开发了新的分子实体来选择性靶向癌细胞中的NPC1。
有趣的是，发现单体，小的合成结合蛋白，通过大型胞饮作用被突变的Ras癌细胞系内化。因此，产生由表达突变-Ras的癌细胞内化的NPC1特异性单体，以促进内体隔室中NPC1的结合和抑制。
筛选产生本文所述的NPC1单体的两个专有的单体库，即，结合具有SEQ ID NOs：32-43中任意一种氨基酸序列的分子，其在2.5nM处显示出强的靶标结合。产生的单体在胆固醇消耗或胆固醇负载状态下结合NPC1的能力没有差异。此外，与更中性的环境(pH7.5)相比，NPC1单体在酸性pH下与NPC1的结合亲和力增强，类似于在内体(pH5-6)中遇到的亲和力(图4-6)。
单体相对于抗体的一个主要优点是制造成本较低。但是，如果在生产过程中需要重新折叠或聚集单体，则制造成本可能超过抗体的成本。然而，本文中描述的单体不需要重新折叠，并且在生产过程中几乎没有聚集。利用基于成像和生化的方法，证实了本文描述的单体抑制细胞培养物中的NPC1。靶向NPC1的单体克隆N23(SEQ ID NO：36)和N34(SEQ IDNO：40)通过胆固醇的内体积累显示出对NPC1的最大抑制(图7)。图7B DLD1细胞(Ras突变，结肠)用顶部单体击中处理，并通过filipin测量胆固醇。通过靶向NPC1的胆固醇结合结构域，我们的初步数据显示两种单体(N23和N34)导致胆固醇捕获改善并诱导囊泡破坏(图7A-7C)。
为了证明NPC1靶向单体对突变的Ras癌细胞具有特异性，观察每个单体在突变KRas可诱导的HeLa细胞系统中诱导LC3B积累的能力(图8)。NPC1靶向单体克隆N23和N34没有诱导HeLa细胞中的LC3B积累(图8A，大型胞饮作用阴性)，但在HeLa KRasV12细胞中显示出效果(图8B，大型胞饮作用阳性)。比较CRC细胞增殖测定中的候选单体，N34显示出生长抑制作用，而N23没有显著的抑制作用(图9)。
确认摄取依赖于大型胞饮作用在CRC细胞系中得到证实。野生型KRas CRC细胞(HCA7)为大型胞饮作用阴性，无法摄取N34单体(图10A；左列图像)。然而，突变的KRas CRC细胞(DLD-1和HCT-116)是大型胞饮作用阳性的，并且有效地内化了N34单体(图10A；图像的中间和右列)。根据，N34显示LC3B在HCT-116而不是HCA7细胞中的剂量依赖性积累(图10B)，表明了NPC1靶向单体对NPC1抑制的大型胞饮作用依赖性。最后，将N34单体瘤内注射到异种移植物中，显示CK8阳性肿瘤细胞中单体的摄取(图11)。与非靶向对照单体(FN)相比，N34阳性肿瘤细胞显示胆固醇积累。此外，在另一项研究中，与N34阴性区域相比，异种移植物的N34阳性区域在注射后2小时后显示出强大的胆固醇和LC3B积累(图12)。还观察到，在体外NPC1基因沉默时，存在ERK过度激活(图13A)。在体内使用N34单体证实了这一观察结果(图13B)。NPC1抑制时ERK的超激活可能是EGFR激活的结果，因为用达克替尼(一种选择性和不可逆的EGFR抑制剂)治疗NPC1基因沉默细胞阻断了ERK超激活(图14)。观察结果进一步支持了这一点，即在体内N34抑制NPC1时观察到EGFR活化(图15)。
实施例3-NPC1结合肽偶联物增强药物活性部分的内体逃逸
开发了一种split GFP测定法来测量蛋白质的内体逃逸。突变的Ras PDAC MIAPaCa-2细胞稳定地表达GFP1-10，GFP1-10缺少荧光所需的11β结构域，使得GFP11β的内体逃逸是阳性信号所必需的。NPC1靶向和对照单体与游离的GFP11β结构域共同递送。通过NPC1靶向单体的处理观察到荧光，但未观察到对照非结合单体(FN)(图16)。
在小分子测定中再次观察到内体逃逸(图17)。钙黄绿素是一种膜不可渗透的液相摄取标记物，当与囊泡隔室中的其他钙黄绿素分子紧密接近时，它被半淬灭，但随着细胞内释放和分子扩散，淬灭会导致细胞荧光增加。与GFP1-10split测定类似，随着细胞荧光的增加，随着NPC1靶向部分的共同递送观察到内体逃逸，但没有观察到对照单体。NPC1靶向单体在与纳米颗粒配对时显示出增加的逃逸，这可能有利于改善纳米颗粒运输逃逸(图18A-18B)。已经建立了NPC1靶向单体以诱导小分子、生物和纳米颗粒逃逸。
尽管优选实施方案已经在本文中详细示出和描述，但对于相关领域的技术人员来说，可以在不背离本公开的精神的情况下进行各种修改、添加、替换等将是显而易见的，并且因此这些被认为是在后附的权利要求中定义的公开范围内。

Claims (86)

1.一种尼曼-匹克病C1型(NPC1)结合多肽，所述结合多肽包括纤连蛋白III型(FN3)结构域，所述FN3结构域具有修饰的FG环氨基酸序列、修饰的BC环氨基酸序列、修饰的CD环氨基酸序列、修饰的DE环氨基酸序列或其组合，其中，所述一个或多个修饰的环序列能够与NPC1结合。
2.根据权利要求1所述的结合多肽，其中，所述修饰的FG环氨基酸序列选自SEQ IDNOs：2-13中的任一个。
3.根据权利要求1和2所述的结合多肽，其中，所述修饰的BC环氨基酸序列选自SEQ IDNOs：15-21中的任一个。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的结合多肽，其中，所述修饰的CD环氨基酸序列选自SEQ ID NOs：23-28中的任一个。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的结合多肽，其中，所述修饰的DE环氨基酸序列选自SEQ ID NOs：30-32中的任一个。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的结合多肽，其中，所述FN3结构域是包含至少一个修饰的环氨基酸序列的SEQ ID NO：1的人纤连蛋白III型第十结构域(10Fn3)。
7.根据权利要求6所述的结合多肽，其中，所述10Fn3结构域还包括在一条或多条C、D、E或F的β链中的氨基酸取代。
8.根据权利要求7所述的结合多肽，其中，所述氨基酸取代是选自SEQ ID NO：1的R33、E47、T49和A74中的一个或多个残基。
9.根据权利要求8所述的结合多肽，其中，R33处的氨基酸取代选自由R33V、R33D和R33F组成的组。
10.根据权利要求8所述的结合多肽，其中，E47处的氨基酸取代选自由E47T和E47K组成的组。
11.根据权利要求8所述的结合多肽，其中，T49处的氨基酸取代选自由T49K和T49A组成的组。
12.根据权利要求8所述的结合多肽，其中，A74处的氨基酸取代是A74T。
13.根据权利要求6所述的结合多肽，还包括选自SEQ ID NO：1的D3、R6和D7的一个或多个残基处的氨基酸取代。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的结合多肽，其中，所述FN3结构域包括：
(i)SEQ ID NO：2的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：15的修饰BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30(N8)的修饰DE环氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO：3的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：16的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30(N16)的修饰的DE环氨基酸序列；
(iii)SEQ ID NO：4的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：17的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：30(N18)的修饰的DE环氨基酸序列；
(iv)SEQ ID NO：5的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：23(N22)的修饰的CD环氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO：6的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：19的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：23(N23)的修饰的CD环氨基酸序列；
(vi)SEQ ID NO：7的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：24(N24)的修饰的CD环氨基酸序列；
(vii)SEQ ID NO：8的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：25(N26)的修饰的CD环氨基酸序列；
(viii)SEQ ID NO：9的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：26(N31)的修饰的CD环氨基酸序列；
(ix)SEQ ID NO：10的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：18的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：26(N34)的修饰的CD环氨基酸序列(x)SEQ ID NO：11的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：20的修饰的环氨基酸序列和SEQ ID NO：24(N35)的修饰的CD环氨基酸序列；
(xi)SEQ ID NO：12的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：21的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：27(N38)的修饰的CD环氨基酸序列；和
(xii)SEQ ID NO：13的修饰的FG环氨基酸序列，SEQ ID NO：20的修饰的BC环氨基酸序列和SEQ ID NO：28(C45)的修饰的CD环氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的结合多肽，其中，所述FN3结构域包含与选自由SEQ ID NOs：32-43组成的组中的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的结合多肽，其中，所述FN3结构域包含与选自由SEQ ID NOs：32-43组成的组中的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的结合多肽，其中，FN3结构域包含包含与选自由SEQ ID NOs：32-43组成的组中的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的结合多肽，其中，所述FN3结构域包含选自由SEQID NOs：32-43组成的组中的氨基酸序列。
19.一种尼曼-匹克病C1型(NPC1)结合肽偶联物，所述偶联物包括：
第一部分，所述第一部分包含权利要求1-18中任一项所述的结合多肽；以及
第二部分偶联于所述第一部分，所述第二部分选自药物活性部分、诊断部分、半衰期延长部分、递送载体、前药、第二结合分子、聚合物和非结合蛋白。
20.根据权利要求19所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述第二部分为药物活性部分。
21.根据权利要求20所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述药物活性部分选自由小分子、核酸分子、抗体或其抗原结合片段、抗体衍生物、蛋白质或其多肽片段以及蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。
22.根据权利要求20或21所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述药物活性部分是癌症治疗剂。
23.根据权利要求22所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述癌症治疗剂选自抗代谢剂、生物碱、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、DNA结合药物、毒素、抗增殖药物、DNA拮抗剂、放射性核素、热消融剂、蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)和核酸抑制剂。
24.根据权利要求23所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述生物碱选自由倍癌霉素、多西他赛、依托泊苷、伊立替康、紫杉醇、替尼泊苷、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春地辛及其类似物和衍生物组成的组。
25.根据权利要求23所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述烷化剂选自由以下组成的组：白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美乌替派、乌瑞替派、六甲蜜胺、三甘醇单甲基醚、三乙烯磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、novemebichin、perfosfamide phenesterine、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司丁、尼莫司汀、司莫司汀雷莫司汀、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、替莫唑胺及其类似物和衍生物。
26.根据权利要求23所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述抗肿瘤抗生素选自由以下组成的组：阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡利奇霉素、卡柔比星、嗜癌素、色莫霉素(cromomycin)、更生霉素、道诺霉素、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、去甲氧基柔红霉素、美诺立尔、丝裂霉素、霉酚酸、诺卡形霉素、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂卓、链霉黑素、链脲佐菌素、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星及其类似物和衍生物。
27.根据权利要求23所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述抗代谢剂选自由以下组成的组：SN-38、二甲叶酸、依达曲沙、巯嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶罗呤、喷司他丁(2'-DCF)、雷替曲塞、三甲曲沙、cladridine、氟达拉滨、硫咪嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、喃氟啶、羟基脲、尿烷及其类似物和衍生物。
28.根据权利要求23所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述抗增殖药物选自由以下组成的组：醋葡醛内酯、安吖啶、比生群、喜树碱、地磷酰胺、秋水仙胺、亚丝醌、二氟替康、依洛尼塞、依利醋铵、乙环氧啶、足叶乙甙、维甲酰酚胺、硝酸镓、羟基脲、片螺素D、氯尼达明、米替福新、丙脒腙、米托蒽醌、莫哌达醇、硝基可润、喷司他丁、蛋氨氮芥、鬼臼酸2-乙基-酰肼、甲基苄肼、丙亚胺、索布佐生、锗螺胺、替尼泊苷、细格孢氮杂酸、三亚胺醌2,2',2"-三氯三乙胺及其类似物和衍生物。
29.根据权利要求23所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述抗有丝分裂剂选自由澳瑞他汀、美登木素生物碱、尾海兔素、微管菌素、紫杉烷、埃博霉素、长春花生物碱及其类似物和衍生物组成的组。
30.根据权利要求20或21所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述药物活性部分是免疫调节剂。
31.根据权利要求30所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述免疫调节剂为巨噬细胞1型刺激剂。
32.根据权利要求31所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述巨噬细胞-1型刺激剂选自由紫杉醇、集落刺激因子-1(CSF-1)受体拮抗剂、IL-10受体拮抗剂、Toll样受体(TLR)-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂和TLR-9激动剂及其类似物和衍生物组成的组。
33.根据权利要求30所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述免疫调节剂为巨噬细胞2型刺激剂。
34.根据权利要求33所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述巨噬细胞2型刺激剂选自有IL-33、IL-4受体激动剂、糖皮质激素、IL-10受体激动剂和IL-1受体激动剂组成的组。
35.根据权利要求30所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述免疫调节剂为T细胞刺激剂。
36.根据权利要求35所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述T细胞刺激剂是干扰素基因(STING)激动剂的刺激剂。
37.根据权利要求30所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述免疫调节剂为树突状细胞刺激剂。
38.根据权利要求37所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述树突状细胞刺激剂选自由CpG寡核苷酸、咪喹莫特、喜树碱、秋水仙碱、鬼臼毒素及其衍生物组成的组。
39.根据权利要求30所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述免疫调节剂为中性粒细胞刺激剂。
40.根据权利要求39所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述中性粒细胞刺激剂为重组粒细胞集落刺激因子蛋白(filgrastim)或聚乙二醇化的重组粒细胞集落刺激因子蛋白。
41.根据权利要求21所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述药物活性部分是核酸分子。
42.根据权利要求41所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述核酸分子选自由siRNA、适配体、miRNA、免疫刺激性寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸和引导RNA组成的组。
43.根据权利要求20-42中任一项所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述药物活性部分偶联到递送载体上。
44.根据权利要求19所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述偶联物的第二部分是递送载体。
45.根据权利要求43或44所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述递送载体选自纳米颗粒、聚合物基颗粒和脂质颗粒。
46.根据权利要求19所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述第二部分为诊断部分。
47.根据权利要求46所述的NPC1结合肽偶联物，其中，所述诊断部分选自由荧光染料、放射性同位素、适于成像的造影剂、具有螯合剂的放射性核苷酸和光敏剂组成的组。
48.一种编码权利要求1-18任一项所述的NPC1结合多肽或权利要求19所述的NPC1结合肽偶联物的分离的多核苷酸。
49.一种包含权利要求48所述的分离的多核苷酸的载体。
50.一种包含权利要求49所述的载体的宿主细胞。
51.一种药物组合物，包括：
权利要求1-18中任一项所述的结合多肽、权利要求19-47中任一项所述的NPC1结合肽偶联物、权利要求48所述的分离的多核苷酸或权利要求49所述的载体；以及
药物载体。
52.一种组合治疗剂，包括：
权利要求1-18中任一项所述的结合多肽；以及
药物活性部分。
53.根据权利要求52所述的组合治疗剂，其中，所述药物活性部分选自由小分子、核酸分子、抗体或其抗原结合片段、抗体衍生物、蛋白质或其多肽片段以及蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。
54.根据权利要求52或53所述的组合治疗剂，其中，所述药物活性部分是癌症治疗剂。
55.根据权利要求54所述的组合治疗剂，其中，所述癌症治疗剂是化疗剂。
56.根据权利要求55所述的组合治疗剂，其中，所述化疗剂选自环磷酰胺、吉西他滨、伏立诺他、替莫唑胺、硼替佐米、卡莫司汀和紫杉醇。
57.根据权利要求54所述的组合治疗剂，其中，所述癌症治疗剂是免疫检查点抑制剂。
58.根据权利要求57所述的组合治疗剂，其中，所述免疫检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
59.根据权利要求54所述的组合治疗剂，其中，所述癌症治疗剂选自表皮生长因子(EGFR)抑制剂和mTOR抑制剂。
60.一种治疗对象癌症的方法，所述方法包括：
向患有癌症的对象施用权利要求51所述的有效量的药物组合物以治疗癌症。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，癌症的特征在于癌细胞相对于其相应的非癌细胞具有增强的大型胞饮作用。
62.根据权利要求60所述的方法，其中，癌症的特征在于癌细胞在H-ras、N-ras或K-ras处具有致癌突变。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中，所述癌症为胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、神经胶质瘤、实体瘤、黑色素瘤、多形性成胶质细胞瘤、白血病、肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌和骨髓瘤。
64.根据权利要求60所述的方法，其中，所述方法还包括：
与所述药物组合物联合施用癌症治疗剂。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述癌症治疗剂是化疗剂。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述化疗剂选自环磷酰胺、吉西他滨、伏立诺他、替莫唑胺、硼替佐米、卡莫司汀、紫杉醇、米托蒽醌和卡培他滨。
67.根据权利要求64所述的方法，其中，所述癌症治疗剂是免疫检查点抑制剂。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
69.根据权利要求64所述的方法，其中，所述癌症治疗剂选自表皮生长因子(EGFR)抑制剂和mTOR抑制剂。
70.根据权利要求60所述的方法，其中，所述方法还包括：
将所述药物组合物与放射治疗剂联合施用。
71.一种治疗对象传染病的方法，所述方法包括：
向患有传染病的对象施用有效量的权利要求1-18任一项所述的结合多肽或权利要求19所述的NPC1结合肽偶联物以治疗所述传染病。
72.根据权利要求71所述的方法，其中，所述传染病是由丝状病毒引起的。
73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述丝状病毒为埃博拉病毒或马尔堡病毒。
74.根据权利要求71所述的方法，其中，所述传染病是由冠状病毒引起的。
75.根据权利要求74所述的方法，其中，所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)或中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。
76.一种在需要的对象中增强内体释放药物活性部分的方法，所述方法包括：
向所述对象施用NPC1结合肽偶联物，其中，所述肽偶联物包括：
第一部分，所述第一部分包含权利要求1-18中任一项所述的结合多肽；和
第二部分，与所述第一部分偶联，所述第二部分包含所述药物活性部分。
77.一种增强有需要的对象中药物活性部分的内体释放的方法，所述方法包括：
向所述对象施用组合治疗剂，所述组合治疗剂包括：
权利要求1-18中任一项所述的NPC1结合多肽；以及
药物活性部分。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中，所述药物活性部分选自由小分子、核酸分子、抗体或其抗原结合片段、抗体衍生物、蛋白质或其多肽片段以及蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)组成的组。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中，所述对象具有神经退行性疾病并且所述药物活性部分适于治疗所述神经退行性疾病。
80.根据权利要求79所述的方法，其中，所述神经退行性疾病选自由肌萎缩性脊髓侧索硬化症、帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病组成的组。
81.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中，所述对象具有炎症病症并且所述药物活性部分适于治疗所述炎症病症。
82.根据权利要求81所述的方法，其中，所述炎症病症为类风湿性关节炎或动脉粥样硬化。
83.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中，对象具有骨病症并且所述药物活性部分适于治疗所述骨病症。
84.根据权利要求83所述的方法，其中，所述骨病症为骨质疏松症或佩吉特骨病。
85.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中，所述对象患有癌症并且所述药物活性部分适于治疗所述癌症。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述癌症与RAS途径激活有关。
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