JP7828458B2 - 生分解性エステル結合を含むイオン化可能な脂質およびこれを含む脂質ナノ粒子 - Google Patents

生分解性エステル結合を含むイオン化可能な脂質およびこれを含む脂質ナノ粒子

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Description

本発明は、生分解性エステル結合を含む新規なイオン化可能な脂質に関するものである。具体的に、本発明は、生分解性エステル結合を含むイオン化可能な脂質、これを用いて製造された脂質ナノ粒子およびその用途に関するものである。
薬物送達システム（ＤＤＳ；Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）は、薬物の副作用を減らし、効能および効果を極大化させて必要な量の薬物を効率的に送達できるように設計された技術である。特に、遺伝子治療における薬物送達体としては、従来のウィルス伝達体が効果的であることが立証されているが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、注入されたＤＮＡサイズの限界および大量生産の困難さなどのいくつかの短所により、遺伝子送達システムとしてウイルスの利用が制限されてきた。
そこで、ウィルス性システムの代替手段であって、核酸を細胞内に輸送する方法としては、これまでに正電荷脂質または重合体と混合して輸送する方法（それぞれ脂質－ＤＮＡコンジュゲート（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）およびポリマー－ＤＮＡコンジュゲート（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）と命名される）が主に用いられている（Ｈｉｒｋｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ．、１０、１１８５－１１９３、２００３；Ｍｅｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５４、７１５－７５８、２００２；Ｓｐａｇｎｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３、１３３４８－１３３８６、２００４）。特に、脂質－ＤＮＡコンジュゲートは、核酸と結合して細胞内に核酸をうまく伝達して細胞レベルで多く用いられているが、ｉｎ ｖｉｖｏでは局所的に注射したとき、多くの場合、体内で炎症を引き起こし（Ｆｉｌｏｎａｎｄ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ／Ａｃｔａ、１３２９、３４５－３５６、１９９７）、血管内注射の際、主に一次通過器官である肺、肝臓、脾臓などの組織に蓄積する短所がある（Ｒｅｎｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．７、７６４－７６８、２０００）。
このような背景の下、本発明者は、薬物の封入率に優れ、目的とする器官または細胞に核酸などのアニオン性薬物を効率的に送達できる新規物質を開発すべく鋭意努力した結果、本発明の生分解性エステル結合を含む新規イオン化可能な脂質の優れた薬物送達の効果を確認することによって本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、新規な構造の生分解性エステル結合を含むイオン化可能な脂質、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、前記イオン化可能な脂質、その立体異性体またはその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、前記脂質ナノ粒子およびアニオン性薬物を含む薬物送達用組成物を提供することである。
これを具体的に説明すると以下の通りである。なお、本発明にて開示された各々の説明および実施形態は、それぞれ他の説明および実施形態にも適用され得る。すなわち、本発明にて開示されたあらゆる要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、以下に述べる具体的な叙述によって本発明の範疇が制限されるとみることができない。
前記目的を達成するために、本発明者が研究努力した結果、次の式１で表されるエステル結合を含むイオン化可能な脂質が脂質ナノ粒子を製造するとき、薬物を安定的で効果的に送達し、肝毒性などの副作用が少ないことを確認し、本発明を完成した。
エステル結合を含むイオン化可能な脂質
前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、次の式１で表されるイオン化可能な脂質、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩である。

ここで、Ａは
または
であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ１－６アルキル－ＮＲ３Ｒ４、または－Ｃ２－１２アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－１２アルキルから選ばれるいずれかであり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、または－Ｃ２－１２アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－１２アルキルから選ばれるいずれかであり、
Ｒ５は、－Ｃ１－６アルキル－ＮＲ３Ｒ４または－Ｃ２－１２アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－１２アルキルであり、
Ｙは、－Ｏ－またはＮＲ６であり、
Ｒ６は、－ＨまたはＣ１－３アルキルであり、
ｍは、０～５の整数であり、
ｎは、１～１１の整数であり、
ｘは、１～５の整数であり、
ｌは、２～１０の整数であり、および
ｐは、０～２の整数である。
これらに制限されるものではないが、前記式１で表される化合物は、具体的に、前記式１中、
Ａは、
であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｃ１－３アルキル、－Ｃ１－４アルキル－ＮＲ３Ｒ４、または－Ｃ４－８アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－８アルキルから選ばれるいずれかであり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｃ１－３アルキル、または－Ｃ４－８アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－８アルキルから選ばれるいずれかであり、
Ｙは、－Ｏ－であり、
ｍは、０～３の整数であり、
ｎは、３～７の整数であり、
ｘは、１～３の整数であり、
ｌは、２～６の整数であり、および
ｐは、１であってもよい。
また、これらに制限されるものではないが、前記式１で表される化合物は、前記式１中、
Ａは、
であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｃ１－３アルキル、または－Ｃ４－８アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－８アルキルから選ばれるいずれかであり、
Ｒ５は、－Ｃ１－４アルキル－ＮＲ３Ｒ４または－Ｃ４－８アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ－Ｃ４－８アルキルであり、
Ｙは、－Ｏ－であり、
ｍは、０～３の整数であり、
ｎは、３～７の整数であり、
ｘは、１～３の整数であり、
ｌは、２～６の整数であり、および
ｐは、１であってもよい。
また、本発明の具体例によれば、前記式１で表される化合物は、次の表１に記載された化合物からなる群より選ばれるものであってもよい。

本発明において、用語「アルキル」とは、他の記載がない限り、直鎖または分岐鎖の非環状飽和炭化水素を意味する。例えば、「Ｃ１－６アルキル」は、炭素原子を１～６個含むアルキルを意味することができる。本発明におけるアルキル構造において、単純な置換基の付加等をした場合でも、本発明のイオン化可能な脂質と同等の効果を有する限り、いずれも均等な範囲で本発明の範疇に含まれる。
本発明において、用語「イオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）」とは、容易にプロトン化し得るアミン－含有脂質を意味し、脂質類似体（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）とも命名される。前記イオン化可能な脂質は、周囲のｐＨによって電荷状態が変化し得るため、アニオン性薬物と静電気的相互作用を通じて前記薬物が脂質ナノ粒子内に高い効率で封入されるようにする役割を行い、脂質ナノ粒子の構造を形成することに寄与する。本発明のイオン化可能な脂質は、少なくとも一つ以上の一次アミンを含むアミン頭部にエステル結合と二重結合を含むアルキル鎖が結合された形態を有することを特徴とし、核酸送達時、既知の他のイオン化可能な脂質に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでは組織特異性、遺伝子発現率のような効能に優れ、薬物送達後、ｉｎ ｖｉｖｏでは容易に分解され、肝毒性のような副作用が大きくない長所がある。
本発明において、用語「立体異性体」は、同一の化学式または分子式を有するが、立体的に他の本発明の化合物を意味する。このようなそれぞれの立体異性体およびそれの混合物も同様に本発明の範囲に含まれる。特に断りがない限り、不斉炭素原子に連結される実線結合（－）は、立体中心の絶対配置を示す実線くさび形結合
または破線くさび形結合
を含むことができる。
本発明における式１の化合物は、「薬学的に許容可能な塩」の形態で存在することができる。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用であることができるが、これに制限されない。本発明の用語「薬学的に許容可能な塩」とは、患者に比較的毒性がなく、無害な有効作用を有する濃度であって、この塩に起因する副作用が式１で表される化合物の有益な効能を低下させない前記化合物の任意の全ての有機酸または無機酸付加塩、または塩基付加塩を意味する。
酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過剰の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを用いて沈殿させて製造することができる。同モル量の化合物および水中の酸またはアルコールを加熱し、次いで前記混合物を蒸発させて乾燥させる、または析出された塩を吸引ろ過させることができる。
このとき、遊離酸としては、有機酸と無機酸を用いることができ、無機酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、または硝酸などを用いることができ、有機酸としては、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カーボン酸、バニリン酸、またはヨウ化水素酸などを用いることができるが、これらに制限されるものではない。
また、塩基を用いて薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属塩またはアルカリ土金属塩は、例えば、化合物を過剰のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土金属水酸化物の溶液中に溶解させ、非溶解化合物の塩をろ過した後、ろ液を蒸発、乾燥させて得ることができる。このとき、金属塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩を製造することができるが、これらに制限されるものではない。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得ることができる。
エステル結合を含むイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子
本発明のもう一つの態様は、上述した式１で表されるイオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、その立体異性体、またはその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子である。本発明の脂質ナノ粒子は、式１で表されるイオン化可能な脂質を１種含むか、または２種以上含むものであってもよい。また、目的に応じて本発明以外のイオン化可能な脂質を追加でさらに含むことができる。
前記脂質ナノ粒子は、リン脂質、構造的脂質、およびＰＥＧ－脂質からなる群より選ばれるいずれか一つ以上をさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。
前記リン脂質は、脂質ナノ粒子内でイオン化可能な脂質および薬物が相互作用して形成されたコアを取り囲んで保護する役割を行い、標的細胞のリン脂質二重層と結合し、薬物の細胞内送達時、細胞膜通過およびエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を容易にする。前記リン脂質は、脂質ナノ粒子の融合を促進させることができるリン脂質を制限なく使用することができ、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１８－ＰＡ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＭＥ１６：０ＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［ホスホ－Ｌ－セリン］（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］、ＤＯＰＳ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＭＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（１，２－ｄｉｕｎｄｅｃａｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＵＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ｄｉ－Ｏ－ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１－ｏｌｅｏｙｌ－２－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１－ｈｅｘａｄｅｃｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１，２－ｄｉｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、スフィンゴミエリン、またはこれらの混合物であってもよい。
前記構造的脂質は、脂質ナノ粒子内で脂質充填に形態的側面で剛性を与え、ナノ粒子のコアおよび表面に分散され、ナノ粒子の安定性を向上させる役割をする。前記構造的脂質は、例えば、コレステロール、コレステノール、スピナステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、エルゴステノール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロールまたはこれらの混合物であってもよいが、これらに制限されるものではない。
本発明におけるＰＥＧ－脂質は、脂質とＰＥＧがコンジュゲートされた形態を称するものであって、一方の側端部に親水性重合体であるポリエチレングリコール重合体が結合された脂質を意味する。前記ＰＥＧ－脂質は、脂質ナノ粒子内でナノ粒子の血清中での粒子安定性に寄与し、ナノ粒子間の凝集を防ぐ役割を行う。また、ＰＥＧ－脂質は、核酸をｉｎ ｖｉｖｏ送達時、分解酵素から核酸を保護し、核酸の体内安定性を強化させ、ナノ粒子内に封入された薬物の半減期を増加させることができる。前記ＰＥＧ－脂質は、例えば、ＰＥＧ－セラミド、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥまたはこれらの混合物であってもよいが、これらに制限されるものではない。
具体例として、本発明のイオン化可能な脂質とリン脂質、構造的脂質およびＰＥＧ脂質を混合し、脂質ナノ粒子を製造する場合、イオン化可能な脂質：リン脂質：構造的脂質：ＰＥＧ－脂質のモル比は、１０～４０：１０～３０：４０～７０：１～５であってもよい。また、前記モル比は、２０～３０：１５～２５：４５～５５：１～５であってもよいが、これらに制限されない。
本発明の脂質ナノ粒子は、６．０～７．０、具体的には、６．０～６．５のｐＫａを示すことによって、酸性ｐＨ条件で正電荷を帯び、負電荷を帯びる核酸およびアニオン性薬物などの治療剤と静電気的相互作用を通じて容易に薬物との複合体を形成し、高い効率でアニオン性薬物を封入することができ、薬物の細胞内またはｉｎ ｖｉｖｏ薬物送達組成物として用いられることができる。したがって、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸のみならずアニオンを帯びるあらゆる形態の薬物を送達するのに有用に用いられることができる。すなわち、本発明の脂質ナノ粒子は、最終的にアニオン性薬物を追加で含む形態（封入された形態）で製造され得る。
本発明において、「封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、送達物質を取り囲んで効率的にｉｎ ｖｉｖｏに取り込むためにカプセル化することを指し、薬物封入率（カプセル化効率、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）とは、調製に用いられた薬物全体の含有量に対して脂質ナノ粒子内に封入された薬物の含有量を意味する。
前記アニオン性薬物は、核酸、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、タンパク質－核酸構造体またはアニオン性生体高分子－薬物コンジュゲートなどであってもよいが、本発明のイオン化可能な脂質と共に脂質ナノ粒子を形成し、安定的で効率的に送達され得る限り、これに制限されるものではない。
本発明における前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、ＤＮＡｚｙｍｅ、またはこれらの混合物であってもよいが、これらに制限されるものではない。
前記脂質ナノ粒子において、イオン化可能な脂質／核酸の重量比は、１～２０であってもよく、例えば、５～１５、より具体的には８～１２であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明における前記脂質ナノ粒子は、例えば、５０～９０ｎｍの直径を有するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
脂質ナノ粒子を含む薬物送達用および薬学的組成物
本発明のもう一つの態様は、本発明によるアニオン性薬物含有脂質ナノ粒子を含む、薬物送達用組成物である。
本発明のもう一つの態様は、本発明によるアニオン性薬物含有脂質ナノ粒子を有効成分として含む、薬学的組成物である。
脂質ナノ粒子およびアニオン性薬物については、前述したとおりである。
本発明の脂質ナノ粒子は、核酸などのアニオン性薬物と安定した複合体を形成し、低い細胞毒性および効果的な細胞吸収性を示すため、アニオン性薬物を送達するのに効果的である。したがって、前記脂質ナノ粒子は、用いられるアニオン性薬物の種類、核酸の種類によって関連疾患に予防または治療効果を有し、薬物送達用組成物として無限の活用可能性がある。
本発明における「治療」という用語は、疾病を有する個々人または細胞の天然過程を変更するために介入することを指し、これは病理状態が進行する間またはそれを予防するために行われることができる。目的とする治療効果には、疾病の発生または再発を予防し、症状を緩和し、疾病に伴うすべての直接的または間接的な病理学的結果を低下させ、転移を予防し、疾病の進行速度を減少させ、疾病の状態を軽減または一時的に緩和させ、快方に向かわせるまたは予後を改善させることが含まれる。特に、本発明では、エステル結合含有イオン化可能な脂質、その立体異性体またはその薬学的に許容可能な塩、およびアニオン性薬物を有効成分として含む脂質ナノ粒子を投与することによって疾病の経過を好転させるあらゆる行為を含む。また、用語「予防」とは、前記脂質ナノ粒子の投与によって疾病の発病を抑制または遅延させるあらゆる行為を指す。本発明の脂質ナノ粒子が治療または予防の目的で使用される場合、個体に治療学的に有効な量で投与される。
本発明にて用いられる「治療学的に有効な量」という用語は、アニオン性薬物含有脂質ナノ粒子の有効な量を示す。具体的には、「治療学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類および重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野で周知の要因に応じて決定され得る。本発明の薬学的組成物は、単独の治療剤として投与するまたは他の治療剤と併用して投与され得、市販の治療剤とは順次または同時に投与され得る。また、単回または複数回投与することができる。上記の要素を全て考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定され得る。本発明の薬学的組成物の投与用量は、患者の状態、年齢、性別および合併症などの様々な要因に応じて専門家によって決定され得る。本発明の組成物の有効成分は、安全性に優れるので、決定された投与用量以上でも使用することができる。
前記脂質ナノ粒子を有効成分として含む組成物は、経口、筋肉、静脈、動脈、皮下、腹腔、肺、および経鼻注射などで投与することができるが、これらに制限されない。
本発明の組成物は、投与のために追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができる。薬学的に許容可能な塩としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、テキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤で製剤化することができる。したがって、本発明の組成物は、パッチ剤、液剤、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、坐剤などであってもよい。これら製剤は、当分野にて製剤化に用いられる通常の方法または文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ］に開示されている方法により製造され得、各疾患に応じてまたは成分に応じて多様な製剤に製剤化され得る。
本発明の実施形態は、多様な異なる形態に変形することができ、本発明の範囲が以下に説明する実施形態に限定されるものではない。また、本発明の実施形態は、当該技術分野で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。さらに、明細書全体において、ある構成要素を「含む」ということは、特に相反する記載がない限り、他の構成要素を除外するものでなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
本発明のエステル結合を含むイオン化可能な脂質は、脂質ナノ粒子を製造するとき、アニオン性薬物を安定的に送達し、特に核酸送達時、優れた効果を示し、脂質ナノ粒子媒介遺伝子治療などの関連技術分野に有用に使用することができる。
２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子のＴＮＳ実験によるｐＫａ測定の結果である。 ｉｎ ｖｉｖｏ効能実験により、本発明のイオン化可能な脂質を含むｓｉＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の肝細胞標的可能性を実験するために、ｓｉＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）ノックアウト効果を確認した結果を示す。 ｈＥＰＯ ｍＲＮＡ封入２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ送達を確認するために、マウスに静脈注射した後、採血し、ｈＥＰＯレベルを分析した結果である。 ｍＦＬｕｃ封入２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ送達を確認するために、マウスに筋肉注射した後、生体発光を確認した写真である。 ２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子の細胞毒性を確認するために、核酸薬物が封入されない脂質ナノ粒子を製造し、ＨｅｐＧ２、ＭＥＦ、Ｈｅｌａ、ＫＢ－ＧＦＰの４種類の細胞株に脂質ナノ粒子を濃度別に処理した後、細胞毒性を確認した結果である。 ２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子の肝毒性を確認するために、ｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を製造し、マウスに投与した後、ＡＳＴ、ＡＬＴのレベルを確認し、ＡＬＣ－０３１５脂質と比較した結果である。 ２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子の肝毒性を確認するために、ｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を製造し、投与した後、ＡＬＰ、ＡＬＢのレベルを確認し、ＡＬＣ－０３１５脂質と比較した結果である。 ２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子の肝毒性を確認するために、ｍＦＬｕｃが封入された脂質ナノ粒子を製造し、マウスに投与した後、２４時間後、ＡＬＣ－０３１５と肝毒性の状態を比較した肝組織写真である。
以下、本発明を製造例、実施例および実験例を通じて詳しく説明する。ただし、次の製造例、実施例および実験例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものではない。
実施例１．エステル結合含有イオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）の製造
実施例１－１．エステル結合含有イオン化可能な脂質の合成
多様な種類のアミン頭部基にエステル結合と二重結合を含むアルキル鎖を結合させ、本発明のエステル結合含有イオン化可能な脂質を製造した。
化合物１～化合物４は、具体的に、ＤＣＭ（ジクロロメタン）溶媒にｃｉｓ－２－ノネン－１－オール当たり９－ブロモノナン酸（９－Ｂｒｏｍｏ ｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド）（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｄｅ）をそれぞれ１．５当量、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）（４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を０．２当量入れ、２５℃で一晩反応させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムを用いて、ヘキサン／酢酸エチル（５：１ ｖ／ｖ ｒａｔｉｏ）で精製した。溶媒を全部飛ばした後、生成物をエタノールに溶かし、ＤＩＰＥＡ（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１当量、一次アミンを有する物質（アミン頭部）の場合、化合物１は、０．３当量、化合物２、化合物４は、０．２当量、化合物３は、０．１５当量を入れ、３日間反応させた。ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムを用いて、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１ ｖ／ｖ ｒａｔｉｏ）で精製を行い、イオン化可能な脂質を合成した。
化合物５～化合物９は、具体的に、ＤＣＭ（ジクロロメタン）（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）溶媒にｃｉｓ－２－ノネン－１－オール当たり化合物５の場合、９－ブロモノナン酸（９－Ｂｒｏｍｏ ｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、化合物６の場合、５－ブロモペンタン酸（５－Ｂｒｏｍｏ ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、化合物７の場合、６－ブロモヘキサン酸（６－Ｂｒｏｍｏ ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、化合物８の場合、７－ブロモヘプタン酸（７－Ｂｒｏｍｏ ｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、化合物９の場合、８－ブロモオクタン酸（８－Ｂｒｏｍｏ ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）とＤＩＣ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド）をそれぞれ１．５当量、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）を０．２当量入れ、２５℃で一晩反応させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムを用いて、ヘキサン／酢酸エチル（５：１ ｖ／ｖ ｒａｔｉｏ）で精製した。溶媒を全部飛ばした後、生成物をエタノールに溶かし、ＤＩＰＥＡ（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１当量、一次アミンを有する物質（アミン頭部）０．３当量を入れ、３日間反応させた。ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムを用いて、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１ ｖ／ｖ ｒａｔｉｏ）で精製を行い、イオン化可能な脂質を合成した。
一例として、２４４－９－ｃｉｓの具体的な反応式は、次の反応式１の通りである。

化合物１０および化合物１１は、具体的に、ＤＣＭ（ジクロロメタン）溶媒に化合物１０の場合、ｃｉｓ－３－ノネン－１－オール、化合物１１の場合、ｃｉｓ－４－デカン－１－オール当たり９－ブロモノナン酸（９－Ｂｒｏｍｏ ｎｏｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド）をそれぞれ１．５当量、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）を０．２当量入れ、２５℃で一晩反応させ、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムを用いて、ヘキサン／酢酸エチル（５：１ ｖ／ｖ ｒａｔｉｏ）で精製した。溶媒を全部飛ばした後、生成物をエタノールに溶かし、ＤＩＰＥＡ（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）１当量、一次アミンを有する物質（アミン頭部）０．３当量を入れ、３日間反応させた。ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈカラムを用いて、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１ ｖ／ｖ ｒａｔｉｏ）で精製を行い、イオン化可能な脂質を合成した。
本発明のエステル結合含有イオン化可能な脂質の具体的な実施例化合物を次の表２に示した。

実施例１－２．エステル結合含有イオン化可能な脂質の合成の確認
前記実施例１－１にて製造したイオン化可能な脂質の合成を確認するために、ＭＳ分析を行った。具体的に、イオン化可能な脂質は、０．５ｐｐｍ以下の濃度でエタノールに希釈し、ＭＳ分析を行い、分析に用いられた機器は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）の６２３０ ＬＣ／ＭＳであり、分離カラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８（１００ｍｍ×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．、３．５μｍ）を使用した。前記ＭＳ分析の内容を表３に示した。
前記結果から、実施例１－１にてエステル結合を含むイオン化可能な脂質が良好に作製されことを確認することができた。
実施例２．脂質ナノ粒子の製造
実施例２－１．製剤パラメータ
本発明のイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子は、次の表４および表５の重量比で製造された。
実施例２－２．ｓｉＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子の製造
前記実施例１－１にて製造したイオン化可能な脂質、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｐｏｗｄｅｒ、ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ、ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ、≧９９％、ｓｉｇｍａ、韓国）、リン脂質（ＤＳＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ、米国）、およびＣ１６－ＰＥＧ２０００セラミド（Ａｖａｎｔｉ、米国）をエタノールに２６．５：２０：５２：１．５のモル比で溶解させた。
それから、ｓｉＲＮＡを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｓｉｇｍａ、韓国）緩衝液に溶解させ、イオン化可能な脂質、コレステロール、リン脂質、および脂質－ＰＥＧが溶解されたエタノールおよびアセテート緩衝液をそれぞれ１：３の体積比で１２ｍｌ／分の流速でマイクロ流体混合装置（Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ；ＰＮＩ、Ｃａｎａｄａ）により混合し、脂質ナノ粒子を製造した。
実施例２－３．ｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子の製造
前記実施例１－１にて製造したイオン化可能な脂質、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｐｏｗｄｅｒ、ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ、ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ、≧９９％、ｓｉｇｍａ、韓国）、リン脂質（ＤＯＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ、米国）、およびＣ１６－ＰＥＧ２０００セラミド（Ａｖａｎｔｉ、米国）をエタノールに２６．５：２０：５２：１．５のモル比で溶解させた。
その後、ｍＲＮＡを１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｓｉｇｍａ、韓国）緩衝液に溶解し、イオン化可能な脂質、コレステロール、リン脂質、および脂質－ＰＥＧが溶解されたエタノールおよびクエン酸緩衝液をそれぞれ１：３の体積比で１２ｍｌ／分の流速でマイクロ流体混合装置（Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ；ＰＮＩ、Ｃａｎａｄａ）により混合し、脂質ナノ粒子を製造した。
実験例１：脂質ナノ粒子の物理化学的特性の確認
実験例１－１．粒子の大きさ、多分散指数（ＰＤＩ、ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）、ゼータ電荷（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）および薬物封入率の測定
本実験例では、前記実施例２－３にて製造されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）またはＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ（配列番号２および配列番号３）が封入された脂質ナノ粒子の物理化学的特性を確認することを試みた。具体的に、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが封入された２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子を製造した後、各脂質ナノ粒子に含まれたＲＮＡの濃度が１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳを用いて希釈した。その後、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）にて動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて脂質ナノ粒子の直径、多分散指数（ＰＤＩ；ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）、ゼータ電荷（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を測定した。
次に、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ分析（Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により前記ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子のカプセル化効率（薬物封入率、％）を測定した。ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を９６－ウェルプレートにてｍＲＮＡの最終濃度が４～７μｇ／ｍｌになるように１ｘＴＥ緩衝液５０μｌで希釈した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ無処理群（Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ ＬＮＰ（－））は、１ｘＴＥ緩衝液５０μｌを添加し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ処理群（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ＬＮＰ（＋））は、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ緩衝液５０μｌを添加した。３７℃で１０分間インキュベーションし、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで脂質ナノ粒子を分解し、カプセル化された核酸を放出させた。その後、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬１００μｌを各ウェルに添加した。Ｔｒｉｔｏｎ ＬＮＰ（－）とＴｒｉｔｏｎ ＬＮＰ（＋）の蛍光強度（ＦＬ）は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ）にて波長帯域幅（励起：４８５ｎｍ、蛍光：５２８ｎｍ）により測定し、薬物封入率（カプセル化効率、％）は、次の数式１のように計算した。
それぞれの結果値は、次の通りである（表６）。
実験例１－２．ｐＫａ測定
本実験例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＮＳ（２－（ｐ－トルイジノ）ナフタレン－６－スルホン酸）（２－（ｐ－ｔｏｌｕｉｄｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）分析により前記実施例２－３にて剤形化されたホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）脂質ナノ粒子のｐＫａを計算した。
具体的に、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸、２０ｍＭの酢酸アンモニウム、および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液のｐＨを０．１ Ｎ 水酸化ナトリウムおよび／または０．１ Ｎ 塩酸を用いて、ｐＨ３．５からｐＨ１１まで０．５の間隔で調整し、多様なｐＨ単位の溶液を製造した。それぞれのｐＨを有する溶液を１００μｌずつブラック９６－ウェルプレートに添加し、３００μＭのＴＮＳストック溶液を用いて、６μＭの最終濃度になるように前記溶液にそれぞれ添加した。剤形化された脂質ナノ粒子を最終濃度が２０μＭになるように混合溶液に添加し、Ｔｅｃａｎ機器により蛍光強度を測定（励起：３２５ｎｍ、蛍光：４３５ｎｍ）した。ここで、脂質ナノ粒子に対するｐＫａは、最大蛍光の折半に到達するｐＨ値として計算した。
その結果、本発明の脂質ナノ粒子は、ｐＫａ値が約６．２程度であり、グラフ上ｓ－字状曲線の形態を示すことが確認された（図１）。アニオン性ＴＮＳは、正に荷電したイオン化可能な脂質と相互作用して親油性になり、ｐＨ値がそれぞれのＬＮＰのｐＫａ値に近接することによってＴＮＳの親油性が低くなり、より多くの水分子がＴＮＳ蛍光をクエンチングさせるため、６．０～７．０のｐＫａを有する脂質ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏ薬物送達効率に優れている。また、ｐＨによる蛍光を示すグラフにて「ｓ－字状曲線」を示す脂質ナノ粒子は、エンドソーム膜と相互作用が容易であり、酸性化時に容易にエンドソーム脱出することができることを意味する。
実験例１－３．Ｃｒｙｏ－ＴＥＭによる測定
Ｃｒｙｏ－ＴＥＭにより脂質ナノ粒子の内部構造画像を測定した。
具体的に、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）を封入した脂質ナノ粒子を総脂質の最終濃度が１５～２５ｍｇ／ｍｌになるように濃縮し、２～４μｌのＬＮＰソリューションを銅グリッドに載せた後、ブロッティングさせた。その後、韓国科学技術院（ＫＩＳＴ）特性分析センターのｃｒｙｏ－ＴＥＭ（ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０ Ｇ２）装備により脂質ナノ粒子の内部画像を測定した。
実験例２：ｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能の確認
ｉｎ ｖｉｔｒｏにてｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の効能を確認するために、多様なアミン頭部基で合成した脂質ナノ粒子を用いてスクリーニングを行った。
試験は、多様なアミン頭部基を用いて合成したそれぞれの脂質ナノ粒子（実施例１、２、４および５）を用いて、Ｈｅｌａ細胞にｍＦＬｕｃ（配列番号１）が封入された脂質ナノ粒子を２０ｎｇ処理後、２４時間目に発光程度を測定した。
その結果、次の表７にて確認されるように、試験した殆どの脂質ナノ粒子において、発光強度が著しく増加したことが確認され、特に化合物５（２４４－９－ｃｉｓ）脂質ナノ粒子が最も高い発現効果を示すことが分かった。
実験例３：脂質ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ効果の確認
実験例３－１．ｓｉＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の送達効果
ＦＶＩＩは、肝細胞にて特異的に発現されるため、脂質ナノ粒子の肝細胞標的可能性をｓｉＦＶＩＩを用いたＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）ノックアウト効果を通じて確認することを試みた。
具体的に、ＦＶＩＩ標的ｓｉＲＮＡ（配列番号２および配列番号３）が封入された２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子を前記実施例２－２の方法により製造した。脂質ナノ粒子に含まれたｓｉＲＮＡの濃度を基準として、０．０３、０．１、または０．３ｍｇ／ｋｇの濃度で製造したｓｉＲＮＡが封入された２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子をＣ５７ＢＬ／６雌７週齢マウスに静脈注射した。３日後、血液を収集し、ｃｏａｓｅｔ ＦＶＩＩアッセイキットのプロトコルに従って血液を分析した。ＰＢＳが投与されたマウスの血液で標準曲線を示し、ＦＶＩＩ発現量を測定した。
その結果、図２に示すように、本発明のイオン化可能な脂質を用いて製造された脂質ナノ粒子は、封入されたｓｉＲＮＡ濃度に依存的にｉｎ ｖｉｖｏにてＦＶＩＩ発現を抑制したため、本発明の脂質ナノ粒子が肝細胞を標的として効果的に核酸を送達することができることを確認した。特に、本発明のイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子は、全ての用量にてＦＤＡ承認を受けたＡＬＣ－０３１５で製造された脂質ナノ粒子よりも優れたＦＶＩＩ発現抑制効果を示した。
実験例３－２．静脈注射によりｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の送達効能の確認
２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ送達を調べるために、ルシフェラーゼｍＲＮＡをマウスに送達した後、生体発光を確認し、遺伝子発現を確認した。
具体的に、前記実施例２－３の方法によりｍＦｌｕｃ（配列番号１）が封入された２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子を製造した。その後、製造された脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ基準２μｇ）を７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射し、３時間後、ルシフェリン０．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔投与し、ＩＶＩＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）装備を介して生体発光を確認した。その結果、殆どの脂質ナノ粒子が肝臓に送達されることが確認された（表８）。
次に、前記と同様の方式でｈＥＰＯ ｍＲＮＡ（配列番号４）が封入された脂質ナノ粒子を製造した。ｍＲＮＡ基準０．１ｍｇ／ｋｇ容量で製造した脂質ナノ粒子を７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した後、それぞれ３、６、９、２４、４８時間後に採血し、ｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを通じてｈＥＰＯ定量分析を行った。その結果、本発明のイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子は、核酸をｉｎ ｖｉｖｏに効果的に送達し、血液内でｈＥＰＯが相当レベルで検出され、このような効果は、対照群であるＡＬＣ－０３１５で製造された脂質ナノ粒子に比べて曲線下面積が実に約１．７倍高いことが確認された（表９および図３）。
実験例３－３．筋肉注射によりｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の送達効果
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）をマウスへの筋肉注射により送達した後、生体発光を確認し、遺伝子発現を確認した。
具体的に、上述したようにｍＦｌｕｃが封入された脂質ナノ粒子（２４４－９－ｃｉｓ）を製造した後、２μｇ（ｍＲＮＡ基準）を７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに筋肉注射した。３時間後、ルシフェリン０．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔投与し、ＩＶＩＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）装備により生体発光を確認した。
その結果、殆どの脂質ナノ粒子が注射局所に良好に送達されることを確認することができた（表１０および図４）。
実験例４：脂質ナノ粒子の細胞毒性の確認
ＣＣＫ－８（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ）物質は、生きている細胞のミトコンドリア内脱水素酵素による還元を通じてオレンジ色のホルマザンを形成するので、吸光度分析を通じて細胞生存能力の確認が可能である。
具体的に、多様な種類の細胞（ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＭＥＦ、ＫＢ－ＧＦＰ）を透明な９６－ウェルプレート（ＳＰＬ、３００９６）に播種（０．４ｘ１０５ 個）した。その後、ｍＲＮＡを除外した脂質ナノ粒子構成成分をマイクロ流体混合装置（Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ；ＰＮＩ、Ｃａｎａｄａ）により混合し、ｍＲＮＡを封入しない２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子を製造した。細胞播種２４時間後、１ウェル当たり０．５μｇ、５μｇ、５０μｇまたは１００μｇの量に該当する脂質ナノ粒子（イオン化可能な脂質基準）を処理した。脂質ナノ粒子処理２４時間後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ-８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９６９９２）を１ウェル当たり１０μｌずつ追加した。４時間インキュベーションした後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ）を介して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
その結果、各癌細胞株において５μｇまで細胞毒性を示さないことを確認した（図５）。
実験例５：脂質ナノ粒子の肝毒性の確認
ＡＳＴ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＡＬＴ（Ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）は、肝細胞性疾患や肝炎のような疾患の有無を測定することができる数値であり、通常は低い濃度で血液中に存在しているが、肝細胞が損傷すると流れ出て濃度が高くなる。ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）は、肝臓の胆管内を取り囲む細胞内の酵素であって、胆管の閉塞、肝臓内の胆汁分泌停止などの疾病と共に上昇する。ＡＬＢ（アルブミン）は、肝臓で生成され、アルブミン数値は肝硬変のような急性肝炎では減少する特徴がある。
肝毒性を確認するために、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（配列番号１）が封入された２４４－９－ｃｉｓ脂質ナノ粒子を製造した後、７週齢Ｃ５７ＢＬ／６ マウスにｍＲＮＡ基準２ｍｇ／ｋｇの容量で単回投与した。対照群としては、ＡＬＣ－０３１５を使用した。投与してから２４時間後、採血してＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＡＬＢのレベルを確認した（図６および図７）。また、各実験群の肝組織の分析写真を図８に示した。
その結果、全般的にＦＤＡ承認を受けたＡＬＣ－０３１５脂質に比べて肝毒性が示されないことが分かった。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施することができることを理解できるであろう。これに関連し、前記で述べた実施例は、あらゆる点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその等価概念から導出されるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (12)

  1. 次の式１で表されるイオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、その立体異性体またはその薬学的に許容可能な塩：

    ここで、Ａは、

    であり、
    Ｒ５は、－Ｃ １－4 アルキル－ＮＲ ３ Ｒ ４ または－Ｃ 4－8 アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ ２ ） ｘ ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ ４－8 アルキルであり、
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｃ １－3 アルキル、または－Ｃ 4－8 アルキル－（Ｃ＝Ｏ）－Ｙ－（ＣＨ ２ ） ｘ ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ ４－8 アルキルから選ばれるいずれかであり、
    Ｙは、－Ｏ－であり、
    ｍは、０～３の整数であり、
    ｎは、３～７の整数であり、
    ｘは、１～３の整数であり、
    ｌは、２～６の整数であり、および
    ｐは、１である。
  2. 前記イオン化可能な脂質は、次の表に記載された化合物４～化合物１１からなる群より選ばれる、請求項１に記載のイオン化可能な脂質、その立体異性体またはその薬学的に許容可能な塩：

    。
  3. 請求項１又は２に記載のイオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）、その立体異性体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、脂質ナノ粒子。
  4. 前記脂質ナノ粒子は、リン脂質、構造的脂質、およびＰＥＧ－脂質からなる群より選ばれるいずれか一つ以上をさらに含み、請求項３に記載の脂質ナノ粒子であって、ここで
    前記構造的脂質は、コレステロール、コレステノール、スピナステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、エルゴステノール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸およびアルファ－トコフェロールからなる群より選ばれるいずれか一つ以上である、
    脂質ナノ粒子。
  5. 前記リン脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＰＯＰＥ、ＤＯＰＳ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＵＰＣ、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、およびスフィンゴミエリンからなる群より選ばれるいずれか一つ以上である、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
  6. 前記ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－セラミド、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣおよびＰＥＧ－ＤＳＰＥからなる群より選ばれるいずれか一つ以上である、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
  7. 前記脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質：リン脂質：コレステロール：脂質－ＰＥＧコンジュゲートを１０～４０：１０～３０：４０～７０：１～５のモル比で含む、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
  8. 前記脂質ナノ粒子は、アニオン性薬物をさらに含む、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
  9. 前記アニオン性薬物は、核酸、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、タンパク質－核酸構造体、およびアニオン性生体高分子－薬物コンジュゲートからなる群より選ばれるいずれか一つ以上である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子。
  10. 前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、およびＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選ばれるいずれか一つ以上である、請求項９に記載の脂質ナノ粒子。
  11. 前記脂質ナノ粒子において、イオン化可能な脂質／核酸の重量比は１～２０である、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
  12. 請求項８に記載の脂質ナノ粒子を含む、薬物送達用組成物。
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