JP7707147B2 - アルドステロン検出用抗体及びアルドステロンの免疫測定方法 - Google Patents

Description

NPMD NITE BP-03018

本発明は、アルドステロン検出用抗体、アルドステロンの免疫測定方法及びアルドステロンの免疫測定試薬に関する。

アルドステロンは、副腎皮質外層から分泌される、分子量約３６０の鉱質ステロイドホルモンである。アルドステロンの分泌は、主にレニン－アンジオテンシン－アルドステロン系に依存している。アルドステロンは、電解質の恒常性、循環血液量及び血圧の維持に重要な役割を有するホルモンである。アルドステロンは、腎臓遠位尿細管のミネラルコルチコイド受容体に作用して、ナトリウムと水の再吸収を促進することで血圧を上昇させる機能を有する。

生体試料中のアルドステロン濃度の測定は、原発性アルドステロン症、バーター症候群、リドル症候群、水酸化酵素欠損症、及び選択的低アルドステロン症等の鑑別診断のために実施されている。日本内分泌学会ガイドラインおよび日本高血圧学会ガイドラインにおいては、原発性アルドステロン症のスクリーニング方法として、アルドステロン濃度（Ｐｌａｓｍａ Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＰＡＣ）の、レニン活性（Ｐｌａｓｍａ Ｒｅｎｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：ＰＲＡ）又はレニン濃度（Ａｃｔｉｖｅ Ｒｅｎｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＡＲＣ）に対する比率であるアルドステロン／レニン比（Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ ｔｏ Ｒｅｎｉｎ Ｒａｔｉｏ：ＡＲＲ）の測定が推奨されている。

アルドステロンの測定方法としては、ＬＣ－ＭＳ法及び免疫測定法等が知られている。免疫測定法としては、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）がある（特許文献１参照）。

一方、特許文献２には、ステロイドを免疫学的に定量する方法において、抗ステロイド抗体として、ステロイドと抗体との複合体に特異的に結合する抗体を用いることが記載されている。なお、特許文献２には、前記複合体に特異的に結合する抗体として使用可能な具体的な抗体は開示されていない。

特開平２－５７９７６号公報 国際公開第２０１９／０９８３１４号

本発明は、試料中のアルドステロンを正確に検出するための技術を提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］－［３５］を提供する。
［１］ アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する抗体。
［２］ 配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む、［１］の抗体。
［３］ 配列番号５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む、［１］又は［２］の抗体。
［４］ モノクローナル抗体である、［１］－［３］のいずれかの抗体。
［５］ マウスモノクローナル抗体である、［１］－［４］のいずれかの抗体。
［６］ 前記抗アルドステロン抗体が、ウサギ抗アルドステロン抗体又はその断片である、［１］－［５］のいずれかの抗体。
［７］ 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生される、［１］－［６］のいずれかの抗体。
［８］ ［１］－［６］のいずれかの抗体を産生するハイブリドーマ。
［９］ 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託された、［８］のハイブリドーマ。
［１０］ ［１］－［７］のいずれかの抗体をコードするＤＮＡ。
［１１］ ［１０］のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
［１２］ ［１１］の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
［１３］ ［１２］の形質転換体を培地に培養し、培養物中に［１］－［６］のいずれかの抗体を生成蓄積させること；及び
該培養物から該抗体を採取すること；
を含む、［１］－［６］のいずれかの抗体の製造方法。

［１４］ 試料中のアルドステロンと、
アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を接触させて、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること；及び
前記多重複合体を測定すること；
を含む、アルドステロンの免疫測定方法。
［１５］ 試料中のアルドステロンと、
アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
を接触させて、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を形成させること；
前記複合体と、
アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を接触させて、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること；及び
前記多重複合体を測定すること；
を含む、アルドステロンの免疫測定方法。
［１６］ さらに、多重複合体を測定することで得られる検出シグナル強度と、既知量のアルドステロンを用いて予め作成されたアルドステロン量と検出シグナル強度との相関を規定する検量線と、に基づいて試料中のアルドステロン量を決定すること、
を含む、［１４］又は［１５］の方法。
［１７］ 前記複合体認識型抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む、［１４］－［１６］のいずれかの方法。
［１８］ 前記複合体認識型抗体が、配列番号５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む、［１４］－［１７］のいずれかの方法。
［１９］ 前記複合体認識型抗体がモノクローナル抗体である、［１４］－［１８］のいずれかの方法。
［２０］ 前記複合体認識型抗体がマウスモノクローナル抗体である、［１４］－［１９］のいずれかの方法。
［２１］ 前記抗アルドステロン抗体が、ウサギ抗アルドステロン抗体又はその断片である、［１４］－［２０］の方法。
［２２］ 前記複合体認識型抗体が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生される抗体である、［１４］－［２１］のいずれかの方法。
［２３］ 前記複合体認識型抗体又は前記抗アルドステロン抗体のいずれか一方、好ましくは前記抗アルドステロン抗体が、不溶性担体に固定化される、［１４］－［２２］のいずれかの方法。
［２４］ 試料が、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗及び膵液からなる群から選択されるいずれか一以上である、［１４］－［２３］のいずれかの方法。
［２５］ サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、ラテックス凝集法又はイムノクロマト法である、［１４］－［２４］のいずれかの方法。

［２６］ アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定試薬。
［２７］ 前記複合体認識型抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む、［２６］の試薬。
［２８］ 前記複合体認識型抗体が、配列番号５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む、［２６］又は［２７］の試薬。
［２９］ 前記複合体認識型抗体がモノクローナル抗体である、［２６］－［２８］のいずれかの試薬。
［３０］ 前記複合体認識型抗体がマウスモノクローナル抗体である、［２６］－［２９］のいずれかの試薬。
［３１］ 前記抗アルドステロン抗体が、ウサギ抗アルドステロン抗体又はその断片である、［２６］－［３０］の試薬。
［３２］ 前記複合体認識型抗体が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生される、［２６］－［３１］のいずれかの試薬。
［３３］ 前記複合体認識型抗体又は前記抗アルドステロン抗体のいずれか一方、好ましくは前記抗アルドステロン抗体が、不溶性担体に固定化されている、［２６］－［３２］のいずれかの試薬。
［３４］ ［２６］－［３３］の試薬を含む、アルドステロンの免疫測定キット。
［３５］ サンドイッチＥＬＩＳＡ、ラテックス凝集法又はイムノクロマト法による、［３４］のキット。

本発明において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片又は抗体修飾物であってよい。抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であってよく、または他の種由来抗体であってもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。なお、「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われる。

「抗体断片」とは、抗体の一部であって、抗体の可変ドメインを含むか、少なくとも抗原結合領域を含むものを言う。抗体断片には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）₂、Ｆａｂ₃、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、及びこれらの抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれ得る。「Ｆｖ断片」は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識領域と抗原結合領域を含む。

「抗体修飾物」とは、抗体又は抗体断片に化学的な修飾を施すことによって得られるものであり、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子を結合した抗体が挙げられる。抗体に結合される分子は限定されない。

「アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する」とは、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に対して、遊離のアルドステロンに対するよりも高い親和性で結合することを意味し、好ましくは、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体にのみに結合し、遊離のアルドステロンには結合しないことを意味する。遊離のアルドステロンに対する親和性、又はアルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に対する親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法又は表面プラズモン共鳴の原理を用いる方法等によって測定することができる。本発明に係るアルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する抗体の、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に対する親和性は、遊離のアルドステロンに対する親和性の１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍であり、好ましくは２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍であり、場合によって２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１００００倍あるいはそれ以上である。

本発明により、試料中のアルドステロンを正確に検出するための技術が提供される。

アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体対する抗体（ＫＴＭ－６１１抗体）及び抗アルドステロン抗体（ＫＴＭ－２０１２抗体）の、アルドステロンへの反応性を評価した結果である。横軸はＫＴＭ－６１１抗体又はＫＴＭ－２０１２抗体の濃度を示し、縦軸は吸光（主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍ）を示す。四角はＫＴＭ－６１１抗体の結果を、丸はＫＴＭ－２０１２抗体の結果を示す。 実施例５のアルドステロン測定における最小測定濃度を示すグラフであり、試料中のアルドステロン濃度と発光量（平均値±２ＳＤ）との関係を表すグラフである。 実施例４の測定キットを用いる測定により得られたアルドステロン濃度（Ｙ軸）と、「デタミナーＣＬ アルドステロン」（日立化成ダイアグノスティックス・システムズ社製）を用いる測定により得られたアルドステロン濃度（Ｘ軸）との相関を示すグラフである。直線は相関式（Ｙ＝０．９１Ｘ＋８．４０）を示し、相関係数は０．９９８である。

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

１．アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する抗体
本発明に係る抗体は、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に特異的に結合する。
本発明に係る抗体は、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に特異的に結合する抗体であれば、その構造は特に制限されず、例えば、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなるヘテロテトラマーからなる構造を有し、重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）、重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記する）、軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記する）からなる抗体等が挙げられる。
本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体、特にマウスモノクローナル抗体であってよい。
本発明において、モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、及び、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを含む組換え体ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体等を挙げることができる。
本発明に係る抗体は、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を免疫した動物（例えばマウス）の脾臓Ｂ細胞とミエローマ細胞（例えばＰ３－Ｕ１細胞）とを融合してハイブリドーマのライブラリを作製し、ライブラリから目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択されたハイブリドーマから産生される抗体を精製することより得ることができる。
抗アルドステロン抗体には、市販の抗体を用いてよい。また、アルドステロンあるいはその誘導体（例えばキーホールリンペットヘモシアニン結合アルドステロン ３－カルボキシメチルオキシム）を免疫した動物（例えばウサギ）の脾臓Ｂ細胞とミエローマ細胞（例えば２４０Ｅ細胞）とを融合して得たハイブリドーマから産生される抗アルドステロン抗体を用いてもよい。

本発明に係る抗体は、一実施形態として、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で、原寄託日２０１９年９月１１日に国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生されるものであってよい。ハイブリドーマＫＴＭ－６１１は、特許法施行規則第２７条の２及び３の規定に基づく寄託機関であり、微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく国際寄託当局である、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に国際寄託されている。

本発明に係る抗体は、一実施形態として、以下の（１）－（６）のいずれかの抗体であってよい。
（１）配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含む抗体、
（２）配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む抗体、
（３）配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む抗体、
（４）配列番号５のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含む抗体、
（５）配列番号６のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む抗体、
（６）配列番号５のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる可変領域を軽鎖に含む抗体。

本発明に係る抗体は、一実施形態として、上記（１）～（６）のいずれかの抗体をコードするＤＮＡを含む組換え体ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体であってよい。
遺伝子組換え抗体は、本発明に係る抗体をコードするＤＮＡを、発明に係る抗体を発現することができる発現ベクターに挿入して組換え体ベクターを調製し、当該組換え体ベクターにより形質転換された形質転換体を培養することにより製造することができる。
配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号７のＤＮＡが挙げられ、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号８のＤＮＡが挙げられ、配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号９のＤＮＡが挙げられる。
配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１３のＤＮＡが挙げられ、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１４のＤＮＡが挙げられ、配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１５のＤＮＡが挙げられる。
配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３のＤＮＡが挙げられ、配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号４のＤＮＡが挙げられる。

遺伝子組換え法により本発明に係る抗体を生産する方法を以下に具体的に説明する。なお、ハイブリドーマにより産生される抗体を前述の方法で取得した後に、以下の（Ｉ）～（Ｖ）を行う。

（Ｉ）ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の決定
（抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析）
前述の方法で得られたモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
前述の方法で得られたハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製し、当該全ＲＮＡからｍＲＮＡを抽出した後、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。前述の方法で得られたモノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡを特異的に増幅することができるプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡからＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる。前述の方法で得られたモノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。

ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４， ３ （１９８７））、又はＲＮＡ ｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社製）のキット等を用いることができる。
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））、又はＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等のキットを用いて行うことができる。また、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）等のキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ｔｍ） ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等のキットを用いて行うことができる。
モノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬをコードするＤＮＡを特異的に増幅する方法には、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等のキット用いて行うことができる。
増幅した当該ＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（アジレント・テクノロジー社製）等のプラスミドに挿入し、通常用いられる塩基配列解析方法等により該ＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４， ５４６３ （１９７７））等で処理されたＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等の塩基配列自動分析装置で解析する方法等が挙げられる。

決定した塩基配列から、モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認することができる。全アミノ酸配列のデータベースとしては、例えばＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ｖｏｌ．１８（１１）， ｐｐ．５０９ （１９９７）等が挙げられる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１））と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１））と比較することによって見出すことができる。
また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ又はＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎ等の任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ４０３ （１９９０））やＢＬＡＳＴＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２５（１７）， ｐｐ．３３８９－３４０２ （１９９７））等により相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規であるか否かを確認できる。

（ＩＩ）ＣＤＲのアミノ酸配列の決定
（Ｉ）で得られたＶＨ及びＶＬの各アミノ酸配列を、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１））と比較することによって、（Ｉ）で得られたＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列を決定することができる。

（ＩＩＩ）遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築
ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、抗体のＶＨ又はＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植した可変領域をコードするｃＤＮＡを取得する。抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲは、ＶＨ及びＶＬが由来する動物種と同一のものであっても異なっていてもよい。
ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲに移植した可変領域をコードするｃＤＮＡを、定常領域含有発現ベクターに挿入して遺伝子組換え抗体発現ベクターを構築することができる。定常領域含有発現ベクターとは、抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターに抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれ挿入することにより構築することができる。
本発明において、ＣＨ及びＣＬは任意の動物の抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、動物がマウスの場合、マウス抗体のＩｇＧ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬ等を用いることができる。抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターには、ＣＨ及びＣＬが由来する動物の抗体の定常領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３， １３３ （１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０１， １３０７ （１９８７））、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７， ２２３ （１９８４））、ｐＣＩ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ． Ｕ４７１１９）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８， １５２７ （１９８１））、ｐＳＧ１ｂｄ２－４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４， １７３ （１９９０））、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １３， ７９ （１９９３））等が挙げられる。動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０１， １３０７ （１９８７））、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４９， ９６０ （１９８７））、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ， ４１， ４７９ （１９８５））とエンハンサー（Ｃｅｌｌ， ３３， ７１７ （１９８３））等を用いることができる。動物細胞用発現ベクターに組み込む抗体の定常領域は、前記重鎖及び軽鎖の由来する動物と同種の抗体の定常領域であっても、異なる動物種のものであってもよい。

定常領域含有発現ベクターには、定常領域含有発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体重鎖及び軽鎖の発現量のバランスが均衡する等の点から、抗体重鎖をコードするＤＮＡと抗体軽鎖をコードするＤＮＡとが同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の定常領域含有発現ベクター（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １６７， ２７１ （１９９４））を用いる。抗体重鎖をコードするＤＮＡと抗体軽鎖をコードするＤＮＡとがそれぞれ、別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の定常領域含有発現ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， Ｖｏｌ．１７， ｐ．５５９（１９９８））等を用いることができきる。

遺伝子組換え抗体発現ベクターにより形質転換される宿主細胞としては、本発明のモノクローナル抗体を発現できる宿主細胞であれば特に制限はなく、例えばＣＯＳ－７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｔ ＃ １１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７，４２１６ （１９８０））等が挙げられる。
宿主細胞への遺伝子組換え抗体発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ （１９９１））、エレクトロポレーション法（特開平２－２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３， １３３ （１９９０））、又はリポフェクション法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７））等を用いることができる。

ＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列には、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されている抗体のＦＲのアミノ酸配列、又は抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１））等を用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、ＣＤＲが由来する抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
次に、選択した抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、ＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列、及びＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸をそれぞれ移植し、遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１））を考慮してＤＮＡ配列に変換し、遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくは重鎖、軽鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、前記の定常領域含有発現ベクターに容易に遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを挿入することができる。
あるいは、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各重鎖、軽鎖全長合成ＤＮＡを用いることもできる。

ＰＣＲ反応後、増幅したＶＨをコードするＤＮＡ及びＶＬをコードするＤＮＡをそれぞれ別々のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）（アジレント・テクノロジー社製）等のプラスミドにそれぞれ挿入し、ＶＨをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド及びＶＬをコードするＤＮＡが挿入されたプラスミドを調製する。当該調製されたプラスミドを用いて、通常用いられる塩基配列解析方法等により該ＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法は、例えば、前述の方法等が挙げられる。

抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをＣＤＲが由来する動物と異なる動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性はＣＤＲの基となる動物の抗体に比べて低下する。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ９， ２６６ （１９９１））。そこで、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。

抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １１２， ５３５ （１９７７））又はコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７， １５０１ （１９９４））等を用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変遺伝子組換え抗体を取得できる。

ＣＤＲが由来する抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて前述のＰＣＲ反応を行うことにより改変できる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について前記と同様にして、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認できる。
前記の定常領域含有発現ベクターの抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、上記で構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれ挿入し、遺伝子組換え抗体発現ベクターを構築できる。
例えば、遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、前記の定常領域含有発現ベクターに挿入されたＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬが適切な形で発現するようにそれぞれ挿入することができる。

（ＩＶ）形質転換体の製造
形質転換体としては、例えば遺伝子組換え抗体を一過性に発現し得る形質転換体や、安定に発現し得る形質転換体等が挙げられる。

（遺伝子組換え抗体を一過性に発現する形質転換体の製造方法）
前記（ＩＩＩ）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを、適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を一過性に発現する形質転換体を得ることができる。
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば特に制限はなく、例えばＣＯＳ－７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｔ ＃ １１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７，４２１６ （１９８０））等が挙げられる。
宿主細胞への遺伝子組換え抗体発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ （１９９１））、エレクトロポレーション法（特開平２－２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３， １３３ （１９９０））、又はリポフェクション法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７））等を用いる。
遺伝子組換え抗体発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル， 講談社サイエンティフィック （１９８７））等を用いて測定することができる。

（遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体の製造方法）
前記（ＩＩＩ）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを、適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞への遺伝子組換え抗体発現ベクターの導入には、例えば前述の方法等を用いることができる。
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を安定に発現させることができる宿主細胞であれば特に制限はなく、例えば、ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｔ ＃ １１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７，４２１６ （１９８０））等が挙げられる。
遺伝子組換え抗体発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択することができる（特開平２－２５７８９１）。

動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＧＩＴ培地（コージンバイオ社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、又はこれら培地にＦＢＳ等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。
得られた形質転換体を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換体は、ＤＨＦＲ増幅系（特開平２－２５７８９１）等を利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。

（Ｖ）遺伝子組換え抗体の製造
遺伝子組換え抗体は、形質転換体の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８））。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等の蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わせることもできる。
精製した遺伝子組換え抗体の重鎖、軽鎖、又は抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｎａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０ （１９７０））、又はウェスタンブロッティング法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））等を用いて測定することができる。
精製した本発明に係る抗体の、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に対する親和性は、前述方法を用いて測定することができる。また、蛍光抗体法（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ３６， ３７３ （１９９３））等を用いて測定することもできる。

２．抗体を産生するハイブリドーマ
本発明に係る抗体を産生するハイブリドーマとしては、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１等が挙げられ、前述の方法により製造することができる。

３．抗体をコードするＤＮＡ
本発明に係る抗体をコードするＤＮＡとしては、以下の（１）～（６）のいずれかの抗体をコードするＤＮＡを挙げることができる。
（１）配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含む抗体、
（２）配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む抗体、
（３）配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む抗体、
（４）配列番号５のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含む抗体、
（５）配列番号６のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む抗体、
（６）配列番号５のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１又は数個（２－２０個、好ましくは２－１０個、より好ましくは２－５個、特に好ましく２又は３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む抗体。
本発明に係る抗体をコードするＤＮＡは、前記（Ｉ）又は（ＩＩ）に記載の方法により決定された塩基配列に基づき、ＤＮＡ合成装置を用いた方法等の公知のＤＮＡの製造方法により製造することができる。

４．組換え体ベクター
本発明に係る組換え体ベクターとしては、本発明に係る抗体をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに導入した前記遺伝子組換え抗体発現ベクターが挙げられる。遺伝子組換え抗体発現ベクターは、前述の（ＩＩＩ）記載の方法により製造することができる。

５．形質転換体
本発明に係る形質転換体としては、本発明に係る抗体をコードするＤＮＡを含む前記組換え体ベクターを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体を挙げることができる。本発明における形質転換体は前記（ＩＶ）記載の方法により製造することができる。

６．アルドステロンの免疫測定方法
本発明に係るアルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する抗体は、アルドステロンの免疫測定試薬として利用でき、アルドステロンの免疫測定方法に好適に用いられ得る。

一実施形態に係るアルドステロンの免疫測定方法は、
試料中のアルドステロンと、
アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること（以下、「多重複合体形成工程」という）；及び
前記多重複合体を測定すること（以下、「多重複合体測定工程」という）；
を含む。

さらに、多重複合体測定工程の後に以下の工程を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度を決定できる。
試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、多重複合体形成工程及び多重複合体測定工程を行い、アルドステロン濃度と測定値との関係を表す検量線を作成すること（以下、「検量線作成工程」という）；及び
検量線作成工程で作成された検量線と、多重複合体測定工程の測定により得られた測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

本発明における「試料中のアルドステロン」とは、試料中に存在するアルドステロンを意味する。アルドステロンは、抗体との結合が可能な形態であれば特に制限はなく、例えば、アルドステロン単体による遊離状態であってもよく、他の物質、例えばタンパク質等との複合形態であってもよい。

本発明における抗アルドステロン抗体は、アルドステロンに特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、遊離のアルドステロンに結合する抗体、複合形態のアルドステロンに結合する抗体等であってよい。
また、本発明における抗アルドステロン抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体断片を用いることもできる。抗体断片としては、例えば、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）₂、ペプシン処理－還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体断片等が挙げられる。

本発明における「複合体認識型抗体」とは、いわゆる抗メタタイプ抗体と同義であり、抗原と抗体との複合体に結合する抗体を意味する。本測定方法における複合体認識型抗体は、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に結合する抗体を意味し、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体のいずれの部位に結合する抗体であってよい。本発明における「複合体認識型抗体」は、複数のタイプの、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に結合することができる。

本発明における複合体認識型抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体断片を用いることもできる。抗体断片としては、例えば、前述の抗体断片等が挙げられる。

本発明のアルドステロンの免疫測定方法における試料は、アルドステロンを含有する可能性がある試料であれば特に制限はなく、例えば、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等の生体試料等が挙げられ、好ましくは全血、血漿、血清及び尿が挙げられる。

本発明に係るアルドステロンの免疫測定方法は、一般に抗体による免疫反応を利用した測定方法であれば特に制限はなく、例えば、ＥＬＩＳＡ法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス凝集法、イムノクロマト法等が挙げられる。

（多重複合体形成工程）
多重複合体形成工程は、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体と、を接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させる方法であれば特に制限はない。
多重複合体形成工程は、水性媒体中で行っても、不溶性メンブレン中で展開させること（イムノクロマト法）によりで行ってもよく、水性媒体中で行うことが好ましい。

前記多重複合体を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。抗アルドステロン抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。また、複合体認識型抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。

多重複合体形成工程では、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを、試料中のアルドステロンに同時に接触させてもよいが、抗アルドステロン抗体とアルドステロンとを反応させた後に複合体認識型抗体を反応させることがより好ましい。すなわち、多重複合体形成工程は、試料中のアルドステロンと抗アルドステロン抗体とを接触させて、抗アルドステロン抗体とアルドステロンとの第１の複合体（以下「複合体１」と称する）を形成させる工程（１－１）と、複合体１と複合体認識型抗体とを反応させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との第２の複合体（以下「複合体２」と称する）を形成させる工程（１－２）と、を含むことが好ましい。
ここで、「抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを、試料中のアルドステロンに同時に接触させ」とは、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを１つの反応容器内で共存させて、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とが互いに接触可能となっている状態を含む。この場合において、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体と、アルドステロンとは、どの順番で添加して接触させても良い。

［工程（１－１）］
工程（１－１）は、試料中のアルドステロンと抗アルドステロン抗体とを接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体１を形成させる方法であれば特に制限はない。
工程（１－１）は、水性媒体中で行っても、不溶性メンブレン中で展開させることによりで行ってもよく、水性媒体中で行うことが好ましい。

工程（１－１）において、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体とを接触させ、前記複合体１を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。抗アルドステロン抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。

［工程（１－２）］
工程（１－２）は、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体１と、複合体認識型抗体とを接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との複合体２を形成させる方法であれば特に制限はない。ここで、工程（１－２）で形成される「複合体２」は、多重複合体形成工程で形成される「多重複合体」と同じである。
工程（１－２）は、水性媒体中で行っても、不溶性メンブレン中で展開させることによりで行ってもよく、水性媒体中で行うことが好ましい。

工程（１－２）において、前記複合体１と、複合体認識型抗体とを接触させて、前記複合体２を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。複合体認識型抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。

抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。
不溶性担体は、抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体を固定化し、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする不溶性担体であれば特に制限はなく、例えば、スライドグラス、ＥＬＩＳＡプレート（マイクロタイタープレート）、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、フィルター、フィルム及びメンブレン等が挙げられる。不溶性担体の材料には、ガラス、シリコン、セラミック、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート又はポリウレタン等が挙げられる。

抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体を不溶性担体に固定化させる方法は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする固定化方法であれば特に制限はなく、例えば、化学的結合法（共有結合により固定化する方法）あるいは物理的に吸着させる方法などの公知の方法を適用できる。アビジン－ビオチン反応のような非常に強固な結合反応を利用して抗体を不溶性担体に固定化することも可能である。この場合、抗体にビオチンを結合したビオチン化抗体を、ストレプトアビジンをコーティングしたストレプトアビジンプレートに固定化すればよい。また、リンカーを介して、抗体を不溶性担体に固定化させてもよい。

リンカーとしては、不溶性担体表面の官能基と、抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体とが有する官能基の両者を共有結合できる分子等が挙げられ、例えば、抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であって、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が好ましく用いられる。抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体が有する官能基及び不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ－ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えばアリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。

多重複合体形成工程の後に、洗浄液を用いて、多重複合体形成工程の反応後の不溶性担体を洗浄する洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離工程）を任意で追加することが好ましい。洗浄工程によって、不溶性担体表面からサンプル中の夾雑物や未反応の抗体を除去し、当該担体表面上に形成された前記多重複合体のみを分離できる。洗浄工程において使用する洗浄液としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えばＰＢＳ溶液や界面活性剤を含有するＰＢＳ溶液等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ ２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

また、工程（１－１）と工程（１－２）の間に、必要に応じて、工程（１－１）の反応後の不溶性担体を洗浄する洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離工程）を追加してもよい。洗浄工程によって、不溶性担体表面からサンプル中の夾雑物や未反応の抗体を除去し、当該担体表面上に形成された複合体１のみを分離できる。洗浄工程において使用する洗浄液としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。

洗浄工程を行わない方法では、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との複合体を分離するための方法として、例えばクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、例えばＬｉＢＡＳｙｓ（島津製作所株式会社製）等の自動免疫分析装置を用いた方法等を適用できる。

（多重複合体測定工程）
多重複合体測定工程は、多重複合体形成工程で形成された前記多重複合体を以下の方法を用いて測定する方法であれば特に制限はない。

［抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体に標識物質が結合していない場合］
抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体に結合する抗体（以下、「第３抗体」と記す）に標識物質が結合した標識化第３抗体を用いて、前記多重複合体を測定することができる。すなわち、前記標識化第３抗体と前記多重複合体とを接触させ、抗アルドステロン抗体と、アルドステロンと、複合体認識型抗体と、標識化第３抗体との複合体３を形成させ、当該複合体３の標識物質を後述の方法により測定することにより、多重複合体測定工程で形成した多重複合体の量を測定することができる。第３抗体としては、例えば抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体のＦｃ領域に結合する抗体等が挙げられる。

また、多重複合体形成工程の後に、洗浄工程を行わずに、多重複合体測定工程を行う方法（ホモジニアス法）により多重複合体を測定することも可能である。ホモジニアス法としては、後述するラテックス凝集法や、前記表面プラズモン共鳴等が挙げられる。ラテックス凝集法においては、免疫反応によって生成する凝集を測定することで、当該多重複合体を測定することができる。凝集を測定する方法としては、例えば吸光度を測定する方法、散乱光を測定する方法等が挙げられる。

標識化第３抗体と、前記多重複合体とを接触させて、前記複合体３を形成させる際の反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。標識化第３抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。

［抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体に標識物質が結合している場合］
多重複合体測定工程は、標識物質を用いて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を測定することにより行うことができる。標識物質は、抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体のいずれか一方に結合されていればよい。

標識物質を抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体に結合させる方法は、免疫測定の技術分野において公知である。例えば、１個若しくは数個のアミノ酸を介して、又は、１個又は数個のアミノ酸とリンカーを介して、抗体に標識物質を結合させることができる。また、標識物質をタンパク質に結合させるキットも各種市販されている。
標識物質としては、例えば、通常の免疫測定方法において用いられる、酵素類、放射性同位元素、蛍光性物質、発光性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、補酵素又は補酵素と特異的に結合するもの（ビオチン、アビジン）、タグ、紫外部～赤外部に吸収を有する物質、発色性微粒子、蛍光性微粒子、金属性微粒子、磁性物質、スピンラベル化剤としての性質を有する物質などが挙げられる。
酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ、³²Ｐ、¹²⁵Ｐ及び₁₃₁Ｉ等が挙げられる。蛍光性物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ－イソチオシアナート）等が挙げられる。発光性物質としては、例えばアクリジニウム及びその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。

これらの標識物質から生じるシグナルを検出することにより、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を検出することができる。
前記標識物質から生じるシグナルの測定方法は、用いる標識物質により適宜選択すればよい。
標識物質が発色物質、すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いて吸光度を測定することにより、標識物質を測定することができる。
標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いて蛍光強度を測定することにより、標識物質を測定することができる。
標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いて、発光強度を測定することにより、標識物質を測定することができる。
標識物質が放射性同位元素である場合、放射活性をシンチレーションカウンター、γ－ウェルカウンター等により、放射活性を測定することにより、標識物質を測定することができる。
標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定することにより、標識物質を測定することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識物質を測定することができる。

本発明に係るアルドステロンの免疫測定方法は、用手法に限らず、自動分析装置による実施に適用され得る。用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせなどについては、特に制限はなく、適用する自動分析装置の環境や機種に合わせて、あるいは他の要因を考慮に入れて適当な試薬類等の組み合わせを選択して用いればよい。さらに、本発明に係るアルドステロンの免疫測定方法は、Ｍｉｃｒｏ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ：μ－ＴＡＳ、μ総合分析システム）への応用も可能である。

本発明における水性媒体としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
水性媒体には、塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。塩類としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Ｐｒｏｘｅｌ）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す）等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、ダコサイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社製）等が挙げられる。

以下、本発明に係るアルドステロンの免疫測定方法の好適な実施形態を例示する。

［測定方法１：サンドイッチＥＬＩＳＡ１］
本実施形態に係るサンドイッチＥＬＩＳＡは以下を含む。
〔１〕試料中のアルドステロンと、
アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
を接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を形成させること（前記「工程（１－１）」に相当）；
〔２〕前記複合体と、
アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること（前記「工程（１－２）」に相当）；及び
〔３〕前記多重複合体を測定すること（前記「多重複合体測定工程」に相当）。

さらに、前記工程〔３〕の後に、以下を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度を決定できる。
〔４〕試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、前記工程〔１〕－工程〔３〕を行い、アルドステロン濃度と前記多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕検量線作成工程で作成された検量線と、前記工程〔３〕の測定により得られた測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

ここで、工程〔１〕及び工程〔２〕は順次行っても、同時に行ってもよい。
工程〔１〕と工程〔２〕とを同時に行うとは、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを１つの反応容器内で共存させて、アルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とが互いに接触可能となっている状態にすることも含まれる。

測定方法１の工程〔１〕は、試料中のアルドステロンと抗アルドステロン抗体とを接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体１を形成させる方法であれば特に制限はない。当該工程〔１〕は、水性媒体中で行うことが好ましい。
測定方法１の工程〔１〕において、アルドステロンと、抗アルドステロン抗体とを接触させ、前記複合体１を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、前述の時間が挙げられる。抗アルドステロン抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、前述の濃度が挙げられる。

測定方法１の工程〔２〕は、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体１と、複合体認識型抗体とを接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との複合体２を形成させる方法であれば特に制限はない。工程〔２〕は、水性媒体中で行うことが好ましい。
測定方法１の工程〔２〕において、前記複合体１と、複合体認識型抗体とを接触させて、前記複合体２を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば前述の時間が挙げられる。複合体認識型抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度が挙げられる。

工程〔１〕と工程〔２〕の間に洗浄工程を追加してもよい。また、工程〔２〕と工程〔３〕の間に洗浄工程を追加してもよい。前記洗浄工程における洗浄方法及び洗浄液は、例えば前述の方法及び洗浄液が挙げられる。

測定方法１の工程〔１〕において、抗アルドステロン抗体は、不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。抗アルドステロン抗体を不溶性担体に固定化させる方法は、例えば前述の方法等が挙げられる。測定方法１の工程〔２〕において、複合体認識型抗体は、標識物質で標識化されていても標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された複合体認識型抗体を用いる場合には、工程〔３〕において、前記多重複合体中の標識物質を測定すればよい。
標識物質を複合体認識型抗体に結合させる方法としては、例えば前述の方法が挙げられる。標識物質としては、例えば前述の標識物質等が挙げられる。

測定方法１の工程〔３〕は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする工程であれば特に制限はなく、例えば、前述の多重複合体測定工程の方法が挙げられる。

抗アルドステロン抗体が不溶性担体に固定化されている場合、抗アルドステロン抗体が固定化された不溶性担体は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗アルドステロン抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗アルドステロン抗体が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ａ－ａの組み合わせとしては、例えば、ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）の組み合わせ、アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチンの組み合わせ、及び抗アルドステロン抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体の組み合わせが挙げられる。

［測定方法２：サンドイッチＥＬＩＳＡ２］
本実施形態に係るサンドイッチＥＬＩＳＡは以下を含む。
〔１〕 試料中のアルドステロンと、
アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること（前記「多重複合体形成工程」に相当）；及び
〔２〕 前記多重複合体を測定すること（前記「多重複合体測定工程」に相当）。

さらに、前記工程〔２〕の後に、以下を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度を決定できる。
〔３〕試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、工程〔１〕及び工程〔２〕を行い、アルドステロン濃度と前記多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔４〕検量線作成工程で作成された検量線と、工程〔２〕の測定により得られた測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

測定方法２の工程〔１〕において、「試料中のアルドステロンと、アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、を接触させて」とは、アルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、を同時に接触させることを意味し、又は、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを１つの容器内で反応共存させて、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とが互いに接触可能となっている状態にすることを意味する。「試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを１つの容器内で共存させて、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とが互いに接触可能となっている」場合において、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とは、どの順番で添加して接触させてもよい。

測定方法２の工程〔１〕は、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体と、を互いに接触させて、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させる方法であれば特に制限はない。当該工程〔１〕は、水性媒体中で行うことが好ましい。

測定方法２の工程〔１〕において、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを互いに接触させ、前記多重複合体を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば前述の時間が挙げられる。抗アルドステロン抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度が挙げられる。また、複合体認識型抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度等が挙げられる。

ここで、測定方法２の工程〔１〕と工程〔２〕との間に洗浄工程を追加してもよい。前記洗浄工程における洗浄方法及び洗浄液は、例えば前述の方法及び洗浄液が挙げられる。

測定方法２の工程〔１〕において、複合体認識型抗体は、不溶性担体に固定化されていても固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。複合体認識型抗体を不溶性担体に固定化させる方法は、例えば前述の方法等が挙げられる。また、抗アルドステロン抗体は、標識物質で標識化されていても標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された抗アルドステロン抗体を用いる場合には、工程〔２〕において、前記多重複合体中の標識物質を測定すればよい。
標識物質を抗アルドステロン抗体に結合させる方法としては、例えば前述の方法が挙げられる。標識物質としては、例えば前述の標識物質等が挙げられる。

測定方法２の工程〔２〕は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする工程であれば特に制限はなく、例えば、前述の多重複合体測定工程の方法が挙げられる。

複合体認識型抗体が不溶性担体に固定化されている場合、複合体認識型抗体が固定化された不溶性担体は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した複合体認識型抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、複合体認識型抗体が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。
Ｂ－ｂの組み合わせとしては、例えば、前述のＡ－ａと同じ組み合わせが挙げられる。

［測定方法３：ラテックス凝集法１］
本実施形態に係るラテックス凝集法は以下を含む。
〔１〕 試料中のアルドステロンと不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを水性媒体中で接触させ、アルドステロンと、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体との複合体を形成させること（前記「工程（１－１）」に相当）；
〔２〕 工程〔１〕後の溶液に、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体を添加し、前記複合体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体とを接触させ、凝集を生成させること（前記「工程（１－２）」に相当）；及び
〔３〕 当該凝集を測定すること（前記「多重複合体測定工程」に相当）。

前記工程〔１〕において、試料を予め前述の水性媒体で希釈して保持した後に前記工程〔１〕を行うこともできる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。試料を予め水性媒体で希釈して保持する温度は、本発明のアルドステロンの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃等が挙げられる。試料を予め水性媒体で希釈して保持する時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分間等が挙げられる。

さらに、前記工程〔３〕の後に、以下を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度を決定できる。
〔４〕試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、工程〔１〕－〔３〕を行い、アルドステロン濃度と当該凝集の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕工程〔４〕で作成された検量線と、工程〔３〕の測定により得られた当該凝集の測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

測定方法３の工程〔１〕及び工程〔２〕は順次行っても、同時に行ってもよい。
測定方法３の工程〔１〕は、試料中のアルドステロンと、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを接触させて、アルドステロンと、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体との複合体を形成させる方法であれば特に制限はない。当該工程〔１〕は、水性媒体中で行うことが好ましい。
測定方法３の工程〔１〕において、試料中のアルドステロンと、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを互いに接触させ、前記複合体を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、前述の時間が挙げられる。抗アルドステロン抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、前述の濃度が挙げられる。抗アルドステロン抗体が結合した不溶性担体粒子の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．００００５、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０重量％等が挙げられる。

測定方法３の工程〔２〕は、アルドステロンと不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体との複合体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、を接触させて、凝集を形成させる方法であれば特に制限はない。工程〔２〕は、水性媒体中で行うことが好ましい。
測定方法３の工程〔２〕において、前記複合体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体とを接触させて、当該凝集を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば前述の時間が挙げられる。複合体認識型抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度が挙げられる。複合体認識型抗体が結合する不溶性担体粒子の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．００００５、０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０重量％等が挙げられる。

測定方法３の工程〔３〕は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする工程であれば特に制限はなく、例えば、前述の多重複合体測定工程の方法が挙げられる。

［測定方法４：ラテックス凝集法２］
本実施形態に係るラテックス凝集法は以下を含む。
〔１〕 水性媒体中で、試料中のアルドステロンと、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを接触させ、凝集を生成させること（前記「多重複合体形成工程」に相当）；
〔２〕 当該凝集を測定すること（前記「多重複合体測定工程」に相当）。

前記工程〔１〕において、試料を予め前述の水性媒体で希釈して保持した後に前記工程〔１〕を行うこともできる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。試料を予め水性媒体で希釈して保持する温度は、本発明のアルドステロンの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度等が挙げられる。試料を予め水性媒体で希釈して保持する時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば前述の時間等が挙げられる。

さらに、前記工程〔２〕の後に、以下を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度を決定できる。
〔３〕試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、前記工程〔１〕及び工程〔２〕を行い、アルドステロン濃度と当該凝集の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔４〕工程〔３〕で作成された検量線と、工程〔２〕の測定により得られた当該凝集の測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

測定方法４の工程〔１〕において、「試料中のアルドステロンと、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを接触させ」とは、試料中のアルドステロンと、前記抗不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、前記不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを同時に接触させることを意味し、又は、試料中のアルドステロンと、前記抗不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、前記不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを１つの反応容器内で共存させて、試料中のアルドステロンと、前記抗不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、前記不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とが互いに接触可能となっている状態にすることも意味する。「試料中のアルドステロンと、前記抗不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、前記不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを１つの反応容器内で共存させて、試料中のアルドステロンと、前記抗不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、前記不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とが互いに接触可能となっている」場合において、試料中のアルドステロンと、前記抗不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、前記不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とは、どの順番で添加して接触させてもよい。

測定方法４の工程〔１〕は、アルドステロンと、不不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを互いに接触させ、凝集を形成させる方法であれば特に制限はない。工程〔１〕は、水性媒体中で行うことが好ましい。
測定方法４の工程〔１〕において、アルドステロンと、不不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体と、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体とを互いに接触させ、当該凝集を形成させる反応の反応温度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば前述の温度が挙げられる。当該反応の反応時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば前述の時間が挙げられる。複合体認識型抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度が挙げられる。抗アルドステロン抗体の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度が挙げられる。複合体認識型抗体が結合する不溶性担体粒子の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度等が挙げられる。抗アルドステロン抗体が結合する不溶性担体粒子の反応溶液中の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば前述の濃度等が挙げられる。反応液中の、複合体認識型抗体が結合する不溶性担体粒子と、抗アルドステロン抗体が結合する不溶性担体粒子との総濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０重量％等が挙げられる。

測定方法３及び測定方法４において、抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体を不溶性担体に固定化させる方法は、例えば前述の方法等が挙げられる。また、測定方法３及び測定方法４において、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗アルドステロン抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体粒子とを反応させることにより、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体を生成することができる。同様に、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合した複合体認識型抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体粒子とを反応させることにより、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体を生成することができる。
ここで、不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体と、不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体とが同一の反応液中で生成する場合には、Ｃ及びｃからなる一組の親和性物質は、Ｄ及びｄからなる一組の親和性物質とは異なっていることが好ましい。一組の親和性物質としては、例えばアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）とビオチンとの組み合わせ、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ領域と結合する抗体との組み合わせ等が挙げられる。Ｃ－ｃの組み合わせとＤ－ｄの組み合わせとが異なる場合における、Ｃ－ｃの組み合わせ、及び、Ｄ－ｄの組み合わせとしては、例えば、前述のＡ－ａと同じ組み合わせが挙げられる。

測定方法４の工程〔２〕は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする工程であれば特に制限はなく、例えば、前述の多重複合体測定工程の方法が挙げられる。

測定方法３及び測定方法４の不溶性担体粒子としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする不溶性担体粒子であれば特に制限はなく、例えば、ラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられ、ラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の素材としては、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等が挙げられる。
測定方法３及び測定方法４の不溶性担体粒子の粒径としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする粒径であれば特に制限はなく、平均粒径で、３０～８００ｎｍであり、平均粒径１００～５００ｎｍが好ましく、平均粒径１５０～４５０ｎｍがより好ましい。
測定方法３及び測定方法４において、抗アルドステロン抗体が結合する不溶性担体粒子と、複合体認識型抗体が結合する不溶性担体粒子とは同じであっても異なっていてもよいが、同じである方が好ましい。また、測定方法３及び測定方法４において、抗アルドステロン抗体が結合する不溶性担体粒の平均粒径と、複合体認識型抗体が結合する不溶性担体粒子の平均粒径とは同じであっても異なっていてもよい。

測定方法３の工程〔１〕又は測定方法４の工程〔１〕の前に、試料を、水性媒体を含む試料希釈液と混合する工程を含んでいてもよい。前記水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。前記水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。

測定方法１～４における水性媒体は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
測定方法１～４おいて、水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。
測定方法１～４における試料は、アルドステロンを含有する可能性がある試料であれば特に制限はなく、例えば、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等の生体試料等が挙げられ、好ましくは全血、血漿、血清及び尿が挙げられる。

［測定方法５：イムノクロマト法１］
本実施形態に係るイムノクロマト法は以下を含む。
〔１〕 テストストリップのサンプル供給部に、試料を供給すること；
〔２〕 試料中のアルドステロンをテストストリップの展開部に溶出可能に保持された抗アルドステロン抗体と接触させ、アルドステロンを抗アルドステロン抗体との複合体を形成させること；
〔３〕 検出部において、当該複合体に複合体認識型抗体を接触させ、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること；及び
〔４〕 当該多重複合体を測定すること。

さらに、前記工程〔４〕の後に、以下を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度を決定できる。
〔５〕試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、前記工程〔１〕－〔４〕を行い、アルドステロン濃度と前記多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；
〔６〕検量線作成工程で作成された検量線と、前記工程〔５〕の測定により得られた測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

ここで用いられるテストストリップは、サンプル供給部、展開部及び検出部を備えた多孔質体からなるメンブレンを有する。展開部の一部には、標識物質が結合した抗アルドステロン抗体（標識化抗アルドステロン抗体という）が溶出可能に保持されている。さらに展開部の下流側に複合体認識型抗体が固定化されている検出部を有する。標識物質を抗アルドステロン抗体に結合させる方法としては、例えば前述の方法が挙げられる。
サンプル供給部は、液体の試料が供給される場所であり、当該試料を吸収し、液体とアルドステロンとが通り抜けることができる物質及び形態であればよい。展開部とは、アルドステロンを含む当該試料が毛細管現象によって展開される場所であり、前記サンプル供給部の下流に位置する。

測定方法５における工程〔１〕は、サンプル供給部に、試料を供給する工程である。試料を、予め試料希釈液で希釈した後に、当該サンプル供給部に供給してもよい。また、試料を試料希釈液で希釈し保持した後に、当該希釈試料を当該サンプル供給部に供給してもよい。希釈液には、前述の水性媒体等が含まれる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。当該希釈試料の保持時間は、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分間等が挙げられる。

測定方法５の工程〔２〕は、試料中のアルドステロンと標識化抗アルドステロン抗体とを接触させて、アルドステロンと標識化抗アルドステロン抗体の複合体を形成させる工程である。当該工程〔２〕において、水性媒体を含んだメンブレン中で展開させるにより、アルドステロンと抗アルドステロン抗体とが接触する。

測定方法５の工程〔３〕は、検出部において、アルドステロンと標識化抗アルドステロン抗体との複合体と、検出部に固定化された複合体認識型抗体との多重複合体が形成される工程である。当該多重複合体は、メンブレン上で形成される。

測定方法５の工程〔４〕は、検出部において、当該多重複合体を測定する工程である。多重複合体中の標識物質を測定することで、当該多重複合体を測定することができる。

測定方法５において、サンプル供給部に試料が添加されてから、検出部において多重複合体が測定されるまでの時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分間等が挙げられる。

［測定方法６：イムノクロマト法２］
本実施形態に係るイムノクロマト法は以下を含む。
〔１〕 テストストリップのサンプル供給部に、試料を供給すること；
〔２〕 検出部において、試料中のアルドステロンと、抗アルドステロン抗体と、複合体認識型抗体とを接触させ、アルドステロンと抗アルドステロン抗体と複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること；
〔３〕 当該多重複合体を測定すること。

さらに、前記工程〔３〕の後に、以下を含むことにより、試料中のアルドステロンの濃度の決定できる。
〔４〕試料として既知濃度のアルドステロンを用いて、前記工程〔１〕－工程〔３〕を行い、アルドステロン濃度と前記多重複合体の測定値との関係を表す検量線を作成すること；及び
〔５〕検量線作成工程で作成された検量線と、前記工程〔３〕の測定により得られた測定値とから、試料中のアルドステロンの濃度を決定すること。

ここで用いられるテストストリップは、サンプル供給部、展開部及び検出部を備えた多孔質体からなるメンブレンを有する。展開部の一部には、標識物質が結合した複合体認識型抗体（標識化複合体認識型抗体という）が溶出可能に保持されている。さらに展開部の下流側に抗アルドステロン抗体が固定化されている検出部を有する。標識物質を複合体認識型抗体に結合させる方法としては、例えば前述の方法が挙げられる。
サンプル供給部は、液体の試料が供給される場所であり、当該試料を吸収し、液体とアルドステロンとが通り抜けることができる物質及び形態であればよい。展開部とは、アルドステロンを含む当該試料や、標識化複合体認識型抗体が、毛細管現象によって展開される場所であり、前記サンプル供給部の下流に位置する。

測定方法６における工程〔１〕は、サンプル供給部に、試料を供給する工程である。試料を、予め試料希釈液で希釈した後に、当該サンプル供給部に供給してもよい。また、試料を試料希釈液で希釈し保持した後に、当該希釈試料を当該サンプル供給部に供給してもよい。希釈液には、前述の水性媒体等が含まれる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。当該希釈試料の保持時間は、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分間等が挙げられる。

測定方法６の工程〔２〕は、検出部において、アルドステロンと、標識化複合体認識型抗体と、検出部に固定化された抗アルドステロン抗体との多重複合体が形成される工程である。工程〔２〕は、まず、アルドステロンを含む試料と、標識化複合体認識型抗体とが混合され、アルドステロンを含む試料と標識化複合体認識型抗体とがメンブレン中で展開される。その後、検出部において、アルドステロンと、標識化複合体認識型抗体と、検出部に固定化された抗アルドステロン抗体との多重複合体が形成される。

測定方法６の工程〔３〕は、検出部において、当該多重複合体を測定する工程である。多重複合体中の標識物質を測定することで、当該多重複合体を測定することができる。

測定方法６において、サンプル供給部に試料が添加されてから、検出部において多重複合体が測定されるまでの時間は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分間等が挙げられる。

測定方法５及び測定方法６に用いられるメンブレンとしては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とするメンブレンであれば特に制限はなく、例えば、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート又はポリウレタン等からなるメンブレンが挙げられる。

測定方法５及び測定方法６において、複合体認識型抗体又は抗アルドステロン抗体に標識物質を結合させる方法としては、例えば前述の方法が挙げられる。測定方法５及び測定方法６に用いられる標識物質としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする標識物質であれば特に制限はなく、例えば前述の標識物質が挙げられる。

測定方法５及び測定方法６において、水性媒体としては、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。測定方法５及び測定方法６において、水性媒体には前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。
測定方法５及び測定方法６における試料は、アルドステロンを含有する可能性がある試料であれば特に制限はなく、例えば、全血、血漿、血清、尿、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等の生体試料等が挙げられ、好ましくは全血、血漿、血清及び尿が挙げられる。

７．アルドステロンの免疫測定試薬
本発明のアルドステロンの免疫測定試薬は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法に用いられる試薬であり、アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体とを含む、アルドステロンの免疫測定試薬である。

本発明における抗アルドステロン抗体は、アルドステロンに特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、例えば前述の抗体等が挙げられる。
また、本発明における抗アルドステロン抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体断片を用いることもできる。抗体断片としては、例えば、前述の抗体断片等が挙げられる。

アルドステロンの免疫測定試薬における複合体認識型抗体とは、６．アルドステロンの免疫測定方法における「複合体認識型抗体」と同じであり、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、例えば前述の、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する抗体等が挙げられる。

アルドステロンの免疫測定試薬における試料は、アルドステロンを含有する可能性がある試料であれば特に制限はなく、例えば、前述の試料等挙げられる。

アルドステロンの免疫測定試薬における抗アルドステロン抗体の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。また、アルドステロンの免疫測定試薬における複合体認識型抗体の濃度は、本発明のアルドステロンの免疫測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ等であり、０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲が好ましい。

抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体は不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。不溶性担体としては、例えば、前述の不溶性担体等が挙げられる。抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体を不溶性担体に固定化させる方法は、例えば、前述の方法等が挙げられる。アビジン－ビオチン反応のような非常に強固な結合反応を利用して抗体を不溶性担体に固定化することも可能である。
また、アルドステロンの免疫測定試薬において、不溶性担体が固定化された抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体は、前述の多重複合体形成工程の反応液中で生成されてもよい。
この場合、当該免疫測定試薬には、不溶性担体が固定化された抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体の代わりに、一組の親和性物質の一方（Ｅ）が結合した抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体と、一組の親和性物質の他方（ｅ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＡ－ａと同じ組み合わせ等が挙げられる。

アルドステロンの免疫測定試薬に洗浄液が含まれていてもよい。洗浄液としては、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。また、アルドステロンの免疫測定試薬に、試料を希釈するための試料希釈液が含まれていてもよい。試料希釈液には前述の水性媒体が含まれている。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。

抗アルドステロン抗体又は複合体認識型抗体は標識物質が結合されていても、結合されていなくてもよいが、結合されていることが好ましい。標識物質としては、例えば前述の標識物質等が挙げられる。

アルドステロンの免疫測定試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の測定試薬を使用する場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。
液状の測定試薬においては、抗アルドステロン抗体及び複合体認識型抗体は、水性媒体で溶解された状態となっている。
水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等が含有されてもよい。

以下、本発明に係るアルドステロンの免疫測定試薬の好適な実施形態を例示する。

［測定試薬１：サンドイッチＥＬＩＳＡ用測定試薬１］
不溶性担体に固定化された抗アルドステロン抗体と、
アルドステロンと抗アルドステロンとの複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定試薬。
測定試薬１は、前述の測定方法１に用いられる測定試薬である。

［測定試薬２：サンドイッチＥＬＩＳＡ用測定試薬２］
抗アルドステロン抗体と、
不溶性担体に固定化された、アルドステロンと抗アルドステロンとの複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定試薬。
測定試薬２は、前述の測定方法２に用いられる測定試薬である。

［測定試薬３：ラテックス凝集法用の測定試薬］
不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体と、
不溶性担体粒子が結合した、アルドステロンと抗アルドステロンとの複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定試薬。
測定試薬３は、前述の測定方法３又は測定方法４に用いられる測定試薬である。

［測定試薬４：イムノクロマト法用の測定試薬１］
サンプル供給部、展開部及び検出部を備えた多孔質体からなるメンブレンを有するテストストリップと、
展開部の一部に溶出可能に保持された抗アルドステロン抗体と、
前記検出部に結合した、アルドステロンと抗アルドステロンとの複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定試薬。
測定試薬４は、前述の測定方法５に用いられる測定試薬である。

［測定試薬５：イムノクロマト法用の測定試薬２］
サンプル供給部、展開部及び検出部を備えた多孔質体からなるメンブレンを有するテストストリップと、
展開部の一部に溶出可能に保持された複合体認識型抗体と、
前記検出部に結合した抗アルドステロン抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定試薬。
測定試薬５は、前述の測定方法６に用いられる測定試薬である。

８．アルドステロンの免疫測定キット
本発明のアルドステロンの免疫測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。アルドステロンの免疫測定キットは、本発明のアルドステロンの免疫測定方法に用いられる。
以下、本発明に係るアルドステロンの免疫測定キットの好適な実施形態を例示する。なお、下記の実施形態において、抗アルドステロン抗体、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体、不溶性担体、不溶性担体粒子及び標識物質としては、例えば前述の抗アルドステロン抗体、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体、不溶性担体、不溶性担体粒子及び標識物質が用いられる。

［測定キット１：サンドイッチＥＬＩＳＡ用測定キット１］
抗アルドステロン抗体を含む第１試薬と、
アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体を含む第２試薬と、
を含む、アルドステロンの免疫測定キット。

［測定キット２：サンドイッチＥＬＩＳＡ用測定キット２］
不溶性担体に固定化された、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体を含む第１試薬と、
抗アルドステロン抗体を含む第２試薬と、
を含む、アルドステロンの免疫測定キット。

測定キット１と測定キット２には、洗浄液が含まれていてもよい。洗浄液としては、例えば前述の洗浄液等が挙げられる。加えて、試料を希釈するための試料希釈液が含まれていてもよい。

［測定キット３：ラテックス凝集法用測定キット１］
不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体を含む第１試薬と、
不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体を含む第２試薬と、
を含む、アルドステロンの免疫測定キット。

測定キット３には、試料を希釈するための試料希釈液が含まれていてもよい。

［測定キット４：ラテックス凝集法用測定キット２］
水性媒体を含む第１試薬と、
不溶性担体粒子が結合した抗アルドステロン抗体、及び不溶性担体粒子が結合した複合体認識型抗体を含む第２試薬と、
を含む、アルドステロンの免疫測定キット。

［測定キット５：イムノクロマト法用の測定キット１］
サンプル供給部、展開部及び検出部を備えた多孔質体からなるメンブレンを有するテストストリップと、
前記展開部に溶出可能に保持された抗アルドステロン抗体と、
前記検出部に結合した複合体認識型抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定キット。

［測定キット６：イムノクロマト法用の測定キット２］
サンプル供給部、展開部及び検出部を備えた多孔質体からなるメンブレンを有するテストストリップと、
前記展開部に溶出可能に保持された複合体認識型抗体と、
前記検出部に結合した抗アルドステロン抗体と、
を含む、アルドステロンの免疫測定キット。

また、測定キット５及び測定キット６には、試料を希釈するための試料希釈液が含まれていてもよい。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。

［参考例１］抗アルドステロンモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の作製
ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯ（アルドステロン ３－カルボキシメチルオキシム；ＳＴＥＲＡＬＯＩＤＳ社製）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（シグマアルドリッチ社製）で溶解して１００ｍｇ／ｍＬ ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯのＤＭＳＯ溶液を調製した。１００ｍｇ／ｍＬ ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯのＤＭＳＯ溶液（２５μＬ）に、１０ｍｇ／ｍＬ ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＰＢＳ溶液（２ｍＬ）、１００ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液（５０μＬ）、及び１００ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液（１０μＬ）を添加して混合し、４℃で１６時間反応させて、ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯとＫＬＨとを結合させ、ＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯ溶液を調製した。ＰＢＳ溶液で平衡化したＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いてＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯ溶液の溶媒の置換を行い、ＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯのＰＢＳ溶液を調製した。

（２）ハイブリドーマ細胞の作製
（１）で調製したＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯを０．５ｍｇ含む免疫原をアジュバントと混合してエマルジョン化し、得られたＫＬＨ結合ＡＬＤＯＳＴＥＲＯＮＥ ３－ＣＭＯのエマルジョンを計４回、ウサギ（ＮＺＷ種）へ皮下注射した。１回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用し、２～４回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用した。２週間間隔で計４回免疫を行った後に採血し、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡにて評価した。血清中の抗体価が上昇していることを確認した。さらに、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用し、２週間間隔で２回免疫を行ったウサギから、脾臓を摘出した。Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９９５ Ｓｅｐ ２６； ９２（２０）： ９３４８－９３５２に記載の方法に従い脾臓細胞を調製し、２４０Ｅ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。
上記で作製したハイブリドーマ細胞を１０％ＦＣＳとＨＡＴを含むＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に懸濁後、マイクロウェルプレートに播種し培養した。生育したハイブリドーマ細胞の培養上清を取得した。

（３）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
マイクロウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、５μｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）ＰＢＳ溶液５０μＬを固定化した後、当該ウェルをブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）にてブロッキングし、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を固定化したプレートを作製した。上記（２）で得られた各ハイブリドーマの培養上清５０μＬを添加し２５℃で反応させ、培養上清中のモノクローナル抗体を捕捉した。洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．４、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した後、ＨＲＰ標識アルドステロン溶液（コスモバイオ社製）５０μＬを各ウェルに添加し、２５℃で反応させた。洗浄液で各ウェルを３回洗浄した後、基質である１－Ｓｔｅｐ^TM Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）５０μＬを添加して反応させた。２ｍｏｌ／Ｌ 硫酸（関東化学社製）５０μＬを添加した後に、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定し、吸光度が高いウェル（結合能の高いモノクローナル抗体が存在するウェル）を選択した。選択したウェル中のハイブリドーマ細胞のクローニングを限界希釈法により行うことにより、抗アルドステロンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株（ＫＴＭ－２０１２）を樹立した。

（４）抗アルドステロンモノクローナル抗体の作製
樹立したハイブリドーマ細胞ＫＴＭ－２０１２をＨｙＣｌｏｎｅ ＳＦＭ４ＭＡｂ－Ｕｔｉｌｉｔｙ培地（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）にて培養した。細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した。Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： １９８８に記載の方法に従い、得られた培養上清からプロテインＡセファロース（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）を用いて抗アルドステロンモノクローナル抗体ＫＴＭ－２０１２を精製した。

［実施例１］アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体の作製
（１）マウスへの免疫
参考例１（４）で取得したＫＴＭ－２０１２抗体をペプシン（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で消化した後、移動相として０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてＧ３０００ＳＷカラム（東ソー社製；口径：２１．５ｍｍ；長さ：６０ｃｍ）を用いたＨＰＬＣシステム（日立製作所社製）でＦ（ａｂ'）₂を分離した。当該Ｆ（ａｂ'）₂と、アルドステロン（シグマアルドリッチ社製）とをモル比で１：５４０になるようにＰＢＳ溶液中で混合し、２５℃で１時間放置し、抗原溶液を調製した。当該抗原溶液とアジュバンドとを等量混合したエマルジョンを調製し、当該エマルジョンを計３回、Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー社製）へ皮下注射した。１回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用し、２～３回目の免疫に際しては、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ'ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマアルドリッチ社製）を使用した。２週間間隔で計３回免疫を行った後に採血し、血清中の抗体価を、後述の（２）の手順に従いＥＬＩＳＡにて評価した。血清中の抗体価が上昇していることを確認した後、更に、ＰＢＳ溶液と前記抗原溶液とを等量混合した溶液を前記マウスの皮下に注射し、３日後に当該マウスから脾臓を摘出した。

（２）ＥＬＩＳＡによる抗体価の評価
９６穴マイクロウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の各ウェルに、参考例１（４）で取得したＫＴＭ－２０１２抗体のＰＢＳ溶液（５μg/mL）（５０μＬ）を固定化した。当該ウェルをブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）１００μＬにてブロッキングし、ＫＴＭ－２０１２抗体固定化プレートを作製した。
試料希釈液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））を用いて１ｎｇ／ｍＬに調製したアルドステロン溶液を、ＫＴＭ－２０１２抗体固定化プレートの各ウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させ、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体を形成させた。陰性コントロールとして前記試料希釈液のみを添加したウェルを用意し、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体が存在しない（すなわち、ＫＴＭ－２０１２抗体のみが存在する）ウェルも用意した。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、免疫中のマウスから採取した血清を前記試料希釈液で１００００倍に希釈した血清希釈液を、各ウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、前記試料希釈液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製）を各ウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、ＴＭＢ－ＯＮＥ（Ｋｅｍ―Ｅｎ-Ｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）（５０μＬ）を分注し、２５℃で３０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を各ウェルに添加し（５０μＬ）攪拌混合した後、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。
この評価により、陰性コントロールには反応せず、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体に特異的に反応する血清が確認でき、免疫されたマウスに、所望の抗体が産生されていると判断した。

（３）細胞融合によるハイブリドーマの作製
抗体価の上昇が確認されたマウスから脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を調製した。調製した脾臓細胞をスーパー細胞融合装置 ＥＧＦＧ２１（ネッパジーン社製）を用い、エレクトロフュージョン法にて同社提供プロトコルに従い、マウスミエローマ細胞（Ｐ３－Ｕ１）と融合させ、ハイブリドーマを作製した。
上記で作製したハイブリドーマ細胞を１０％ ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１０×）（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）とＨＡＴを含むＧＩＴ培地（コージンバイオ社製）に懸濁後、マイクロウェルプレートに播種し培養した。生育したハイブリドーマ細胞の培養上清を取得した。

（４）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
（２）で作製したＫＴＭ－２０１２抗体固定化プレートの各ウェルに、前記試料希釈液を用いて１ｎｇ／ｍＬに調製したアルドステロン溶液を添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させ、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体を形成させた。陰性コントロールとして前記試料希釈液のみを添加したウェルを用意し、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体が存在しない（ＫＴＭ－２０１２抗体のみが存在する）ウェルも用意した。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、（３）で得られた培養上清を前記試料希釈液で２倍に希釈した希釈液を、各ウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、前記試料希釈液で１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ミリポア社製）を各ウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、ＴＭＢ－ＯＮＥ（５０μＬ）を分注し、２５℃で３０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を各ウェルに添加し（５０μＬ）攪拌混合した後、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。
陰性コントロールには反応性せず、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体に特異的に反応する培養上清を選択した。選択した培養上清中のハイブリドーマ細胞のクローニングを限界希釈法にて行うことにより、アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株（ＫＴＭ－６１１）を樹立した。

（５）アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体の作製
樹立したハイブリドーマ細胞ＫＴＭ－６１１をＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて培養した。細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した。Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： １９８８に記載の方法に従い、得られた培養上清からプロテインＡセファロース（グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン社製）を用いてアルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体ＫＴＭ－６１１を精製した。

［実施例２］ＫＴＭ－６１１抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
取得したハイブリドーマＫＴＭ－６１１ ２×１０⁶～２×１０⁷個の細胞より、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するマウスモノクローナル抗体のｍＲＮＡを調製した。

（２）ＫＴＭ－６１１抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）可変領域の遺伝子クローニングと遺伝子配列の決定
上記（１）で取得したマウスモノクローナル抗体のｍＲＮＡ １μｇから、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ５'／３'Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってｃＤＮＡを取得した。ｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーｍｉｘと、マウスＩｇＧ１に特異的なプライマー（配列番号１）を用いてＰＣＲ反応を行い、各抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）のｃＤＮＡ断片を増幅した。またユニバーサルプライマーｍｉｘと、マウスＩｇＧ（κ）特異的プライマー（配列番号２）を用いてＰＣＲ反応を行い、各抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ領域）のｃＤＮＡ断片を増幅した。
次に、クローニングして塩基配列を決定するため、取得したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、ＶＨ遺伝子断片及びＶＬ遺伝子断片をキット付属のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔを用いて、それぞれ抽出した。キット付属のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてｐＲＡＣＥベクターに各抗体のＶＨ遺伝子又はＶＬ遺伝子を組み込み、得られたベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｉｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出した。
クローニングしたＰＣＲ産物の塩基配列を、プラスミド分離用試薬キット（ＫＵＲＡＢＯ社製）、核酸自動分離装置 ＰＩ－５０（ＫＵＲＡＢＯ社製）及びシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて解析した。ＶＨ領域の遺伝子配列を配列番号３に、ＶＬ領域の遺伝配列を配列番号４に示した。遺伝子解析の結果、ｃＤＮＡの５'末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＶＨ領域のｃＤＮＡを含むプラスミド及びＶＬ領域のｃＤＮＡを含むプラスミドが取得された。

（３）アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体ＫＴＭ－６１１の可変領域の遺伝子配列の解析
上記（２）で得られたＫＴＭ－６１１抗体のＶＨ領域の全塩基配列から推定されるＶＨ領域の全アミノ酸配列を配列番号５に、またＶＬの全塩基配列から推定されるＶＬ領域の全アミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示した。
既知のマウス抗体の配列データ（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９１））との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む、ＫＴＭ－６１１抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）をコードする完全長ｃＤＮＡであることが明らかとなった。
同定されたＫＴＭ－６１１抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮのデータベースをＢＬＡＳＴＰ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２５（１７）， ｐｐ．３３８９－３４０２ （１９９７））により検索した。完全に一致するアミノ酸配列は認められず、ＫＴＭ－６１１抗体のＶＨ及びＶＬは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
また、各モノクローナル抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。ＫＴＭ－６１１抗体のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１０、１１及び１２に、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１６、１７及び１８にそれぞれ示した。

［実施例３］アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対するモノクローナル抗体の反応性試験
（１）ペルオキシダーゼ標識抗体溶液の調製
実施例１（５）で得られたＫＴＭ－６１１抗体（２００μｇ）を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ₂（同仁化学研究所社製）を用いて、添付マニュアルに従いペルオキシダーゼで標識した。当該キットに付属のＳｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒでペルオキシダーゼ標識ＫＴＭ－６１１抗体を懸濁し、当該懸濁液を前記試料希釈液で希釈して２０ｎｇ／ｍＬに調製した溶液をペルオキシダーゼ標識抗体溶液とした。

（２）アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体に対する反応性
実施例１（２）で作製したＫＴＭ－２０１２抗体固定化プレートの各ウェルに、前記試料希釈液を用いて５，２５，５０，７５，１００，２００，３００，４００，５００ｐｇ／ｍＬ）に調製したアルドステロン溶液をそれぞれ添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させ、ＫＴＭ－２０１２抗体（抗アルドステロン抗体）とアルドステロンとの複合体を形成させた。陰性コントロールとして前記試料希釈液のみを添加したウェルを用意し、ＫＴＭ－２０１２抗体とアルドステロンとの複合体が存在しない（抗アルドステロン抗体のみが存在する）ウェルも用意した。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、（１）で調製したペルオキシダーゼ標識抗体溶液を、各ウェルに添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、ＴＭＢ－ＯＮＥ（５０μＬ）を分注し、２５℃で３０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を各ウェルに添加し（５０μＬ）攪拌混合した後、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。その結果を表１に示す。
表１より、ＫＴＭ－６１１抗体は、抗アルドステロン抗体には反応せず、アルドステロン－抗アルドステロン抗体の複合体にのみ反応することが判明した。

（３）アルドステロンに対する反応性
マイクロウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）ＰＢＳ溶液５０μＬを固定化した後、当該ウェルをブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）にてブロッキングし、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を固定化したプレートを作製した。各ウェルに、前記試料希釈液を用いて１．０，３．９，１５．６，６２．５，２５０，１０００ｎｇ／ｍＬに調製したＫＴＭ－６１１抗体溶液をそれぞれ添加し（５０μＬ）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、前記試料希釈液を用いて１２５０倍希釈したＡｌｄｓｔｅｒｏｎｅ－３－ＣＭＯ－ＨＲＰ（コスモバイオ社製）を各ウェルに添加し（５０μL）、２５℃で１時間反応させた。前記洗浄液でウェルを３回洗浄（Ｂ／Ｆ分離）した後、ＴＭＢ－ＯＮＥ（５０μＬ）を分注し、２５℃で３０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を各ウェルに添加し（５０μＬ）攪拌混合した後、反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。対照として、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を固定化したプレートを上記方法と同様に作製し、ＫＴＭ－６１１抗体溶液に替えてＫＴＭ－２０１２抗体（抗アルドステロン抗体）溶液を用いて同様の測定を行った。

結果を図１に示す。ＫＴＭ－２０１２抗体（抗アルドステロン抗体）は、濃度依存的にアルドステロンに結合したことがわかる。一方、ＫＴＭ－６１１抗体は、吸光度の増加が見られず、アルドステロンに結合しないことが確認された。

［実施例４］アルドステロン測定キットの作製
以下の磁性粒子懸濁液、ビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体溶液、及びアルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液を含む、アルドステロン測定キットを作製した。なお、以下の実施例４－７においては、次のメーカーの試薬類を使用した。

Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（２－スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）（株式会社同仁化学研究所製）、Ｔｗｅｅｎ ２０（関東化学株式会社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｖｏｇｅｎ社製）、「デタミナーＣＬ アルドステロン」（日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社製）、「デタミナーコントロールＣＬ アルドステロン用」（日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社製）、「ＣＬ アナライザー洗浄液」（日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社製）を使用した。

＜磁性粒子懸濁液＞
磁性粒子として、ストレプトアビジンが結合した市販の磁性粒子［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）］を用いて、以下の組成の磁性粒子懸濁液を調製した。

ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １２５ ｍｍｏｌ／Ｌ
ストレプトアビジン結合磁性粒子 １．１ ｍｇ／ｍＬ
ＢＳＡ ０．１ ％（ｗ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ２０ １ ％（ｗ／ｖ）

＜ビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体溶液＞
Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ－ＮＨ２（株式会社同仁化学研究所製）を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、ＫＴＭ－６１１抗体にビオチンが結合した、ビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体を作製した。得られたビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体を用いて、以下の組成のビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体溶液を調製した。

ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １２５ ｍｍｏｌ／Ｌ
ビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体 ０．３ μｇ／ｍＬ
ＢＳＡ １ ％（ｗ／ｖ）

＜アルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液＞
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ－ＳＨ（株式会社同仁化学研究所製）を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、ＫＴＭ－２０１２抗体にアルカリホスファターゼが結合した、アルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体を作製した。得られたアルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体を用いて、以下の組成のアルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液を調製した。

ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
アルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体 ０．１ μｇ／ｍＬ
ＢＳＡ ０．６ ％（ｗ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ２０ １ ％（ｗ／ｖ）
塩化マグネシウム・６水和物 ３０ ｍｍｏｌ／Ｌ

［実施例５］最小検出感度
（１）アルドステロン試料の調製
「デタミナーＣＬ アルドステロン」キットに含まれる「標準アルドステロン試薬Ｂ」を「標準アルドステロン試薬Ａ」で希釈し、０．２５ｐｇ／ｍＬ、０．５ｐｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、２ｐｇ／ｍＬ、４．１ｐｇ／ｍＬ、８．２ｐｇ／ｍＬのアルドステロン溶液を調製し、測定用試料とした。なお、標準アルドステロン試薬Ａを０ｐｇ／ｍＬの測定用試料とした。

（２）アルドステロンの測定
測定用試料１０μＬに、実施例４で調製した磁性粒子懸濁液、ビオチン結合ＫＴＭ－６１１抗体溶液、及びアルカリホスファターゼ標識ＫＴＭ－２０１２抗体溶液を各３０μＬ加えて攪拌し、３７℃で９分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、「ＣＬ アナライザー洗浄液」で磁性粒子を５回洗浄した。その後、９－（４－クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）－１０－メチルアクリダン・二ナトリウム塩を主成分とする発光基質液を１００μＬ加えて攪拌し、生じた発光量を測定した。その後、各試料を５重測定した際の発光量の平均値及び標準偏差（ＳＤ）を算出し、その結果を図２に示した。

測定系として測定可能な最小濃度（最小検出感度）を規定する方法として、平均値と標準偏差（ＳＤ）を用いて統計学的に評価する方法がある。具体的には、０ｐｇ／ｍＬ試料を５重測定した際の平均値＋２倍の標準偏差（＋２ＳＤ）よりも、（１）で調製した試料を５重測定した際の平均値－２倍の標準偏差（－２ＳＤ）が高い場合、その試料を検出できる濃度として規定できる。最小検出感度が小さいほど、測定感度が高いことを意味する。
アルドステロン濃度が０ｐｇ／ｍＬの試料を測定した際の発光量の平均＋２ＳＤは１４１６ＲＬＵであった。一方、アルドステロン濃度が０．２５ｐｇ／ｍＬである試料を測定した際の発光量の平均－２ＳＤは１５８４ＲＬＵであり、０ｐｇ／ｍＬ試料を測定した際の発光量の平均＋２ＳＤよりも高い値であったことから、０．２５ｐｇ／ｍＬのアルドステロンを測定できることを確認した。よって、この測定法において、最小検出感度は０．２５ｐｇ／ｍＬであると規定できる。また、図２に示したように、アルドステロンが０．２５ｐｇ／ｍＬ以上の濃度では濃度依存的な発光量の増加が見られた。

比較として、競合法の「デタミナーＣＬ アルドステロン」を用いて、同キットに添付された添付文書に従い、同一の試料を５重測定した。
競合法における最小検出感度は、０ｐｇ／ｍＬ試料を５重測定した際の発光量の平均－２ＳＤよりも、（１）で調製した試料を５重測定した際の発光量の平均＋２ＳＤが低い場合、その試料を検出できる濃度として規定できる。

アルドステロン濃度が０ｐｇ／ｍＬの試料を測定した際の発光量の平均－２ＳＤは４８７２２ＲＬＵであった。アルドステロン濃度が４．１ｐｇ／ｍＬ試料を測定した際の発光量の平均＋２ＳＤは４９６２２であり、０ｐｇ／ｍＬ試料を測定した際の発光量の平均－２ＳＤよりも高い値であったことから、４．１ｐｇ／ｍＬのアルドステロン濃度は測定できないことを確認した。一方、アルドステロン濃度が８．２ｐｇ／ｍＬである試料を測定した際の発光量の平均＋２ＳＤは４７８４６ＲＬＵであり、０ｐｇ／ｍＬ試料を測定した際の発光量の平均＋２ＳＤよりも低い値であったことから、８．２ｐｇ／ｍＬのアルドステロンを測定できることを確認した。よって、競合における最小検出感度は８．２ｐｇ／ｍＬと規定できる。
この結果より、実施例４の測定キット用いるアルドステロンの測定方法は、測定感度が高いことが判明した。

［実施例６］同時再現性試験
同時再現性試験とは、同一試料を複数回、連続測定し、測定値のばらつきを評価することで、測定法の正確性を判断する方法である。
「デタミナーコントロールＣＬ アルドステロン用」のコントロールＬを測定用試料として、実施例５（２）に記載の方法に従い、実施例４の測定キットを用いて、当該試料を２０重測定した。なお、「デタミナーＣＬ アルドステロン」キットに含まれる標準アルドステロン試薬Ａ～Ｄを用いて検量線を作成し、得られた発光量からアルドステロン濃度を決定した。比較例として、「デタミナーＣＬ アルドステロン」を用いて、同一試料を２０重測定しアルドステロン濃度を決定した。
実施例４の測定キット及び「デタミナーＣＬ アルドステロン」の測定結果より、アルドステロン濃度の平均、変動係数（ＣＶ％）を算出したところ、実施例４の測定キットのＣＶは１．７％、「デタミナーＣＬ アルドステロン」のＣＶは３．５％であった。

［実施例７］交差反応性試験
実施例４のキットを用いて、アルドステロンの測定における、コルチコステロン（東京化成工業社製）、コルチゾール（東京化成工業社製）、コルチゾン（東京化成工業社製）、プロゲステロン（東京化成工業社製）、テトラヒドロコルチコステロン（ＳＴＥＲＡＬＯＩＤＳ社製）、デキサメサゾン（東京化成工業社製）、プレドニゾロン（東京化成工業社製）、及びスピロノラクトン（東京化成工業社製）の各交差反応性物質に対する交差反応性を評価した。コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾン、プロゲステロン、テトラヒドロコルチコステロン、デキサメサゾン、プレドニゾロン、及びスピロノラクトンはいずれも、アルドステロンと構造が類似したステロイドホルモンである。
本試験において、各交差反応性物質を、脱脂処理された血漿［Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ， Ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ， Ｄｅｌｉｐｉｄｉｚｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ（Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）］で希釈し、表２に記載された濃度の各交差反応性物質溶液を調製した。

実施例５（２）に記載の方法に従い、各交差反応性物質溶液の測定を行った後、実施例６に記載の方法に従い、各溶液中の交差反応性物質の濃度を決定した。以下の式により、各交差反応性物質に対する交差率を決定した。その結果を表２に示す。また、比較例として、「デタミナーＣＬ アルドステロン」を用いて、同一試料を測定し、以下の式により、各交差反応性物質に対する交差率を決定した。その結果を表２に示す。

交差率は、本来測定すべきではない交差反応性物質を測定してしまう割合を示す指標であるので、交差率が低いほど、アルドステロンを特異的に検出することができ、正確な測定ができていることを示している。
表２に示すとおり、実施例４のキット用いた測定方法は、「デタミナーＣＬ アルドステロン」を用いる測定方法と同程度に交差率が低く、正確にアルドステロンを測定できる方法であることが判明した。

［実施例８］相関性試験
正確な測定ができているか否かを判断する方法の１つとして、相関性試験がある。当該試験は、既存の体外診断用医薬品と、当該体外診断用医薬品と比較したい評価試薬とを用いて、複数の同一の検体を測定し、それぞれの試薬を用いた測定により得られた測定値から、統計学的に相関式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ）及び相関係数（ｒ）を算出し、その結果を評価する試験である。前記相関式における傾き「ａ」が１．０に近く、かつ、相関係数（ｒ）が１．０に近い程、既存の体外診断用医薬品における測定値と、評価試薬における測定値とが同じであり、正確な測定ができていることを示していることとなる。

原発性アルドステロン症患者、及び健常人から採取された２０の血清及び血漿検体を用いて、実施例４の測定キットと、体外診断用医薬品「デタミナーＣＬ アルドステロン」との相関性試験を実施した。実施例４の測定キットを用いるアルドステロンの測定値（ｙ軸）と、「デタミナーＣＬ アルドステロン」を用いるアルドステロンの測定値（ｘ軸）との間の相関式を図３に示す。
図３に係る相関式の傾きは０．９１であり、ほぼ１．０に近く、また、相関係数も０．９９８であり、ほぼ１．０に近かったことから、正確なアルドステロンの測定方法であることが判明した。

配列番号１：マウスＩｇＧ１特異的プライマーの塩基配列
配列番号２：マウスＩｇＧ（κ）特異的プライマーの塩基配列
配列番号３：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 遺伝子配列
配列番号４：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 遺伝子配列
配列番号５：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 アミノ酸配列
配列番号６：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 アミノ酸配列
配列番号７：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 ＣＤＲ１ 遺伝子配列
配列番号８：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 ＣＤＲ２ 遺伝子配列
配列番号９：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 ＣＤＲ３ 遺伝子配列
配列番号１０：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 ＣＤＲ１ アミノ酸配列
配列番号１１：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 ＣＤＲ２ アミノ酸配列
配列番号１２：ＫＴＭ－６１１ ＶＨ領域 ＣＤＲ３ アミノ酸配列
配列番号１３：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 ＣＤＲ１ 遺伝子配列
配列番号１４：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 ＣＤＲ２ 遺伝子配列
配列番号１５：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 ＣＤＲ３ 遺伝子配列
配列番号１６：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 ＣＤＲ１ アミノ酸配列
配列番号１７：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 ＣＤＲ２ アミノ酸配列
配列番号１８：ＫＴＭ－６１１ ＶＬ領域 ＣＤＲ３ アミノ酸配列

Claims (12)

1. 配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、
   配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む、アルドステロンと抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する抗体。
2. 配列番号５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む、請求項１に記載の抗体。
3. 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生される、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 試料中のアルドステロンと、
   アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
   アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する前記抗体（複合体認識型抗体）と、
   を接触させて、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること、及び
   前記多重複合体を測定すること、
   を含む、アルドステロンの免疫測定方法に用いられ、
   アルドステロンの最小検出濃度0.25 pg/mlを示し得る、請求項１－３のいずれ一項に記載の抗体。
5. 試料中のアルドステロンと、
   アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
   アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
   を接触させて、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること、及び
   前記多重複合体を測定すること、
   を含む、アルドステロンの免疫測定方法であって、
   前記複合体認識型抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、
   配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む抗体である、方法。
6. 前記複合体認識型抗体が、配列番号５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む、抗体である、請求項５に記載の方法。
7. 前記複合体認識型抗体が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生される抗体である、請求項５又は６に記載の方法。
8. アルドステロンの最小検出濃度が0.25 pg/mlであり得る、請求項５－７のいずれか一項に記載の方法。
9. アルドステロンを認識する抗アルドステロン抗体と、
   アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する複合体認識型抗体と、
   を含む、アルドステロンの免疫測定試薬であって、
   前記複合体認識型抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を重鎖に含み、
   配列番号１６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなるＣＤＲ３を軽鎖に含む抗体である、試薬。
10. 前記複合体認識型抗体が、配列番号５のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を重鎖に含み、配列番号６のアミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる可変領域を軽鎖に含む、抗体である、請求項９に記載の試薬。
11. 前記複合体認識型抗体が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０１８で国際寄託されたハイブリドーマＫＴＭ－６１１から産生される抗体である、請求項９又は１０に記載の試薬。
12. 試料中のアルドステロンと、
    アルドステロンを認識する前記抗アルドステロン抗体と、
    アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体との複合体を特異的に認識する前記複合体認識型抗体と、
    を接触させて、アルドステロンと前記抗アルドステロン抗体と前記複合体認識型抗体との多重複合体を形成させること、及び
    前記多重複合体を測定すること、
    を含む、アルドステロンの免疫測定方法に用いられ、
    アルドステロンの最小検出濃度0.25 pg/mlを示し得る、請求項９－１１のいずれか一項に記載の試薬。

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