JP7651497B2 - 核酸の正確な並行定量のための高感度な方法 - Google Patents

Description

本発明の開示は、１以上の核酸標的を正確に、かつ大規模に並行して定量するための改良された次世代ＤＮＡシーケンシング方法に関する。より詳細には、本開示は、主に遺伝子標的および変異体の検出に使用される、複雑なＤＮＡプール中の遺伝子標的を検出および定量するためのプローブを含む方法およびキットに関する。本発明は、遺伝子標的毎に１以上の標的特異性核酸プローブ（左プローブおよび右プローブ）、および架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を使用する。

ある植物および動物における遺伝的変異の検出は、遺伝子変異の研究技術の進歩によって、面倒なものではない。しかしながら、特に弱いシグナルを有する試料における突然変異などの遺伝子変異の検出および正確な定量は、シーケンシングコストの低下にもかかわらず、現在依然として面倒で、労力を要し、高価である。コンセンサスバックグラウンドに対する遺伝子シグナルを検出するための特異性、弱い遺伝子シグナルを検出するための感度、検出されたシグナルを正確に定量するための精度、アッセイあたりの標的化遺伝子標的のスループット数、アッセイあたりのコスト、複数の試料を並行してアッセイする場合のアッセイコスト規模を決定するための評価、および試料採取から結果までの時間の長さを決定するためのターンオーバーなど、様々な問題はより正確に示されうる。

現在、液体生検の典型的な定量方法および概念的に類似したアッセイ（抗生物質耐性遺伝子検出など）には、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、アレイｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、または次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの定量が含まれる。定量方法は確固とした、かつ良好に確立された方法であるが、各方法は、以下により詳細に説明する特定の問題に関連している。

定量ＰＣＲ：定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ中の、すなわちリアルタイムでの標的ＤＮＡ分子の増幅を含む技術である。リアルタイムＰＣＲは、定量的（定量的リアルタイムＰＣＲ）、および半定量的、すなわち一定量のＤＮＡ分子より多い／少ない（半定量的リアルタイムＰＣＲ）、に使用され得る。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、遺伝子標的定量の絶対的な基準である。現在、ｑＰＣＲ反応の実験室コストは約２ドルである。しかしながら、反応を準備するための相当な実践時間（労働コスト）、標準曲線の必要性、および各定量化標的についての反復を考慮に入れると、事実、実際のコストははるかに高い。各遺伝子標的について別個の定量実験が必要とされるため、実践時間の量は、試料数の増加に伴って急激に変化する。

アレイＰＣＲ：ＰＣＲアレイは、関連する経路または疾患に焦点を当てた遺伝子のパネルの発現を分析するための最も信頼性の高いツールである。９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１００ウェルディスクのＰＣＲアレイは、それぞれ、焦点を当てた遺伝子パネルの徹底的に研究されたパネルのためのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ最適化プライマーアッセイを含む。ｑＰＣＲ技術のより新しい反復法は、個々のｑＰＣＲ反応を小型化するアレイｑＰＣＲである。アレイＰＣＲは、個々のｑＰＣＲ反応のコストを下げ、複数の標的および試料に対する方法のスケーラビリティを改善する。しかしながら、この方法は、現在、チップあたり数千ドルのコストに、さらに読み出し基礎設備の大きな資本を加えたコストで、１２個の試料からの３８４個の標的（または逆に３８４個の試料からの１２個の標的）に限定されている。従って、前記機構を使用した数千の試料のプロファイリングは、依然として極端に費用が高い。

デジタルＰＣＲ：デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲ、またはｄｅＰＣＲ）は、液滴マイクロ流体および蛍光検出によって標的の絶対定量を提供する方法である。この方法論は比較的費用対効果が高い（試料あたり１つの標的のコストは約３ドル）が、各試料の各標的についてそれぞれ実験を準備し、設定し、実行するための実践時間は、数千の試料規模には不十分である。

多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）は、個々の試料中の複数の遺伝子標的の検出を単純化するためのアプローチを提供する。しかしながら、ＭＬＰＡは、標的の相対的な定量しか提供せず、各試料について別個の検出実験を必要とする。さらに最近では、ＭＬＰＡの変形は、ＤＮＡのバーコード化からコンセプトを導入する。このコンセプトは、従来のＭＬＰＡワークフローよりも良好な定量的分離および試料多重化を可能にする。

次世代シーケンシングベースのアプローチ：次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、配列ベースの遺伝子発現分析をアナログ技術の「デジタル」代替物にするハイスループットシーケンシングとしても知られる。次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの標的計数は、ＤＮＡシーケンシングのコストが低下し続けるにつれてますます魅力的になってきており、現在、例えばＮＩＰＴスクリーニングで使用されている。しかしながら、現在のアプローチは、高いシーケンシングライブラリー調製コスト、および関連性のない遺伝子標的のシーケンシングに浪費されるシーケンシング労力に悩まされている。例えば、癌関連液体生検では、非標的化アプローチは、腫瘍学的に関連性のない遺伝子座に対するシーケンシング労力の浪費をもたらす。胎児診断において、遺伝子座の非標的化試料採取は、データを解釈するための統計的選択肢をかなり制限する。Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｃは、より標的化されたシーケンシングアプローチを提供し、ＲＮＡ捕捉プローブのアレイが次世代ＤＮＡシーケンシングの標的を濃縮する。

Ａｋｈｒａｓら（２００７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（２）：ｅ２２３は、バーコード化標的特異性プローブ、標的環状化およびシーケンシングを含む多重病原体検出アッセイを開示している。標的特異性プローブをライゲーションするための架橋オリゴヌクレオチドの使用も開示される。
国際公開第２０１８／１０９２０６号は、パッドロックプローブとローリングサークル増幅を使用して試料中の分析物を検出する方法を示している。架橋オリゴの使用は記載されていない。
国際公開第２０１９／０３８３７２号はＴ７ポリメラーゼのプロモーターを含むライゲーション複合体からのインビトロ転写とそれに続くｃＤＮＡ合成および配列決定によって、目的の標的配列が選択的に増幅される次世代配列決定アプローチを記載している。この方法は、試料中の多くの標的配列の正確かつ並行した検出および定量を可能にするが、より複雑で大量かつ／または不純な試料は、依然として困難である。
したがって、前記議論に照らして、前記の欠点、例えば、これらに限定されないが、核酸標的の正確かつ大規模に並行した定量を通じた特異性、感度、精度、スループット、コスト、評価およびターンオーバーを克服する必要がある。

国際公開第２０１８／１０９２０６号公報

国際公開第２０１９／０３８３７２号公報

Ａｋｈｒａｓ ｅｔ ａｌ．（２００７） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（２）：ｅ２２３

本発明は、大量の試料（最大数十ミリリットル）、ならびに／または希釈かつ／もしくは非精製試料材料からの高度にスケーラブルで正確な標的定量のために次世代シーケンシングを使用する方法を提供する。
さらに、ＷＯ２０１９／０３８３７２に記載されているようなＲＮＡ増幅工程が回避され、方法がより単純になる。

第１の主要な態様では、本発明は、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出するための方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み、
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み、および、
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および、選択的に第３のバーコードを含み、および、
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し、および、
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼの認識配列を含み、および、
選択的に、前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、第１の捕捉部分を含む、
工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、互いにアニーリングして前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして前記架橋オリゴ複合体を形成できる複数のヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする、工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる、工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程と、
（ｖ）選択的に、前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させ、および、固体支持体に結合していないサンプルの成分から固体支持体に結合したハイブリダイゼーション複合体を分離する、工程と、
（ｖｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する、工程と、
（ｖｉｉ）選択的に、前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする、工程と、
（ｖｉｉｉ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して、増幅する、工程と、
（ｉｘ）選択的に、工程（ｖｉｉｉ）で得られた増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、エンドヌクレアーゼの認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドでアニーリングに供し、前記オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼに対する認識部位が得られるように、工程（ｉ）で指定された認識配列とアニーリングする、工程と、
（ｘ）選択的に、工程（ｖｉｉｉ）で得られた前記一本鎖コンカテマー配列または工程（ｉｘ）で前記エンドヌクレアーゼで得られたアニーリングされた複合体を切断する、工程と、
（ｘｉ）工程（ｘ）で得られた前記核酸断片、または工程（ｖｉｉｉ）で得られたコンカテマー配列を、ハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程、および
（ｘｉｉ）前記第１の標的特異性部分および／もしくは前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程、を含み、
前記工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法である。

本明細書の一実施形態による多重ライゲーションアッセイ（ＭＬＡ）のフロー図を示す。 本明細書の一実施形態による、複数のプローブエンティティを有するプローブトリプレットの原理構造を示す。 本明細書の一実施形態による、第１のプローブと第２のプローブとの間の間隙充填を示す。 本明細書の一実施形態による、第１のプローブと第２のプローブと架橋複合体との間の間隙充填を示す。 制限エンドヌクレアーゼによる分解前（レーン2）および分解後（レーン1）のワークフローからのＲＣＡ生成物を示す。 分子バーコードを列挙することによって次世代ＤＮＡシーケンスデータから推測される、４つの複製反応中に対数的に減少する遺伝子標的の数に対する実験ワークフローの線形反応を示す。各行は、標的配列の３つの濃度を示す。反応は３桁にわたって線形である。

（定義）
標的ヌクレオチド配列：標的ヌクレオチド配列という用語は、その検出が必要とされる目的の任意のヌクレオチド配列であり得る。所定の用語は、連続するヌクレオチドの配列ならびに相補的配列を有する核酸分子を指すことが理解されうる。いくつかの態様における標的配列は、多型を表すかまたは多型に関連するヌクレオチド配列である。

多型：多型という用語は、集団中の２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または対立遺伝子の発生を指す。多型マーカーまたは部位は、配列の相違が生じる遺伝子座である。多型遺伝子座は、１つの塩基対ほど小さくてもよい。

試料：試料という用語は、本明細書では、２つ以上の標的配列を含む２以上の試料に使用される。本発明による方法で提供される試料は、少なくとも標的核酸を抽出し、それらが本発明で使用されるプローブにアクセスできるようにするために調製されていてもよい。特に、いくつかの実施形態では、試料はそれぞれ、少なくとも２つの異なる標的配列、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２５０、より好ましくは少なくとも５００、最も好ましくは少なくとも２０００またはそれ以上の異なる標的配列を含む。試料という用語は、限定されるものではないが、尿、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検）を含むヒト／動物の体から得られた２つ以上の試料、または水、廃水、土壌、植物、ウイルスもしくは細菌等を含む試料などを含む環境から得られた２つ以上の試料を指すことができる。一実施形態では、複数の試料は、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料、他の体液の試料または、例えば毛髪または皮屑からの抽出物等の身体物質を含む。

プローブ：プローブは、可変長（通常５０～１０００塩基長、好ましくは５０～２００塩基長）のＤＮＡまたはＲＮＡの断片であり、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料中で使用され、プローブ中の配列に相補的なヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）の存在を検出することができる。標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブのセクションは、試料中の各標的配列に対して、左右のプローブの対が提供されるように設計され、それにより、プローブはそれぞれ、それらの末端に標的配列の一部に相補的なセクションを含む。さらに、本開示には、左プローブおよび右プローブの接合に用いられる架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体が記載されている。

ユニバーサル：増幅手順を説明するために使用される場合、ユニバーサルという用語は、単一のプライマーまたはプライマーセットを複数の増幅反応のために使用できるようにする配列を指す。そのようなプライマーの使用は、選択された複数の核酸配列を増幅するために必要なプライマーが２つのみであるという点で、多重化を大幅に単純化する。ユニバーサルという用語は、プライミング部位を説明するために使用される場合、ユニバーサルプライマーがハイブリダイズする部位である。ユニバーサルプライミング配列／プライマーの「セット」が使用され得ることにも留意すべきである。

ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎまたはｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子の、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡにアニーリングするプロセスを表す。ＤＮＡまたはＲＮＡの複製およびＲＮＡへのＤＮＡの転写は両方とも、ヌクレオチドハイブリダイゼーションに依存する。

ライゲーション：ライゲーションという用語は、酵素の作用による２つの核酸断片の連結である。ＤＮＡリガーゼは、相補鎖上の隣接部位に結合した２本のポリヌクレオチド鎖（の末端）間のホスホジエステル結合の形成を触媒することができる酵素である。一実施形態では、ライゲーションは、特に化学的ライゲーションができるようにポリヌクレオチドの隣接する末端の両方が修飾されている場合、化学的に行われうる。

増幅：本明細書で使用される増幅という用語は、ヌクレオチド配列の混合物内の特定のヌクレオチド配列の濃度を増加させるための、ポリメラーゼベース反応の使用を意味する。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡ／ＲＮＡのインビトロ酵素増幅のための急速な手順である。増幅されるＤＮＡ／ＲＮＡは、試料を加熱することによって変性され得る。プライマーという用語は、ＤＮＡ合成の出発点として役立つＲＮＡまたはＤＮＡの短鎖（一般に約１８～２２塩基）である。ＤＮＡ複製にそれが必要であるのは、このプロセスを触媒する酵素、すなわちＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの既存の鎖に新しいヌクレオチドを付加することしかできないからである。

ポリメラーゼ：ポリメラーゼは、核酸の長鎖またはポリマーを合成する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを使用して、塩基対合相互作用を用いてＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型鎖をコピーすることによって、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡ分子を組み立てる。

ハイスループット：ハイスループットという用語は、多数のＤＮＡ試料を同時に処理する、およびスクリーニングする能力、ならびに単一のＤＮＡ試料内の多数の異なる遺伝子座を同時にスクリーニングする能力を意味する。しばしばＨＴＳと略されるハイスループットシーケンシングまたはスクリーニングは、大量の試料を同時に効果的にスクリーニングするのに特に関連する科学的実験のための方法である。

エンドヌクレアーゼ：エンドヌクレアーゼは、ランダムに、または指定された位置でＤＮＡの二本鎖または一本鎖を切断する酵素である。

上述のように、本開示は、ライゲーション依存性アッセイを活用することによる、非常に多数の試料における標的ヌクレオチド配列検出のハイスループット検出のための方法に関する。本開示は、次世代シーケンシングによって許容される技術を使用して、複合核酸プール中の遺伝子標的の配列を決定する方法を提供する。本開示はまた、ライゲーション依存性アッセイを活用することによって、多数の試料、好ましくは非常に多数の試料中の複数の遺伝子標的をプロファイルする方法を提供する。
本開示はさらに、複数の試料中の異なる標的核酸の照会を可能にする多重ライゲーション依存性プローブ増幅のための方法を提供する。本発明の方法は、異なる標的核酸のための複数の異なるプローブセットを提供して、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列のシーケンシングを可能にする。シーケンシングデータを処理する際に、試料プールから、遺伝子標的を同定すること、および、個々の試料を絶対的に定量するために、固有の配列識別子が使用される。

第１の主要な態様では、本発明は、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出するための方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み、
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み、および、
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および、選択的に第３のバーコードを含み、および、
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し、および、
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼの認識配列を含み、および、
選択的に、前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、第１の捕捉部分を含む、
工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、互いにアニーリングして前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして前記架橋オリゴ複合体を形成できる複数のヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする、工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる、工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程と、
（ｖ）選択的に、前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させ、および、固体支持体に結合していないサンプルの成分から固体支持体に結合したハイブリダイゼーション複合体を分離する、工程と、
（ｖｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する、工程と、
（ｖｉｉ）前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする、工程と、
（ｖｉｉｉ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して、増幅する、工程と、
（ｉｘ）選択的に、工程（ｖｉｉｉ）で得られた増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、エンドヌクレアーゼの認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドでアニーリングに供し、前記オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼに対する認識部位が得られるように、工程（ｉ）で指定された認識配列とアニーリングする、工程と、
（ｘ）選択的に、工程（ｖｉｉ）で得られた前記一本鎖コンカテマー配列または工程（ｉｘ）で前記エンドヌクレアーゼで得られたアニーリングされた複合体を切断する、工程と、
（ｘｉ）工程（ｘ）で得られた前記核酸断片、または、工程（ｖｉｉｉ）で得られたコンカテマー配列を、ハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉｉ）前記第１の標的特異性部分および／もしくは前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法である。

図１は、本発明の方法の一実施形態の非限定的な例示を提供する。

本発明の方法は、３つの核酸プローブを利用し、そのうちの２つの標的特異性核酸プローブ（左プローブおよび右プローブ）は遺伝子標的に特異であり、１つの核酸プローブは典型的にはユニバーサルである（架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体）。左右のプローブは、架橋プローブまたは架橋オリゴ複合体にハイブリダイズし、ライゲーション複合体を形成する。試料ＤＮＡまたはＲＮＡ上に標的識別部位を有するライゲーション複合体（１以上のバーコード配列を含む）は、照会試料の相補的標的配列に対してハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーション後、左右のプローブを化学的またはＤＮＡリガーゼにより酵素的にライゲーションして、ライゲートされたライゲーション複合体を形成する。本発明では、そのようなライゲーションされたライゲーション複合体の複数が、分析される複数の試料における試料分析中に形成されるであろう。

一実施形態では、「複数の試料」は、これらに限定されないが、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検）を含むヒトもしくは動物の体から得られた２つ以上の試料、水、廃水、土壌、植物、ウイルスもしくは細菌を含む試料などを含む環境から得られた２つ以上の試料等を指していてもよい。
好ましい実施形態では、試料は、事前に核酸を精製または濃縮せずに使用される。別の実施形態では、例えば、細胞を溶解して核酸を露出させる等の試料の前処理をしてもよい。
一実施形態では、サンプルは、核酸の事前の精製または濃縮なしで使用される。別の実施形態では、サンプルを前処理することができ、例えば、細胞を溶解して核酸を露出させることができる。

標的配列は、検出が必要とされる目的の任意のヌクレオチド配列を含み得る。本開示の標的ヌクレオチド配列は、患者の血液中のＤＮＡの画分または母体血液中のＤＮＡの画分から得ることができるが、これらに限定されない。患者の血液中のＤＮＡの画分は、アポトーシス／壊死癌細胞から、または胎児および／または母体由来の母体血液中のＤＮＡの画分から得ることができる。さらに、分析の結果を使用して、例えば、所定のタイプの癌に対する個体のリスク、所定の癌に対する所定の治療の有効性の判定、腫瘍における薬物耐性関連変異の発生、または一般的なトリソミーダウン症候群、パトウ症候群およびエドワーズ症候群などの遺伝性障害を有する胎児のリスク等を評価する。特定の実施形態では、方法は、各標的ヌクレオチド配列に対して、複数の異なるプローブセットを提供することを含む。

本明細書で使用される場合、プローブセットという用語は、第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を含む。

特定の実施形態では、第１のプローブは、分子の５’末端から出発して、選択的に５’リン酸、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１のユニバーサル配列、選択的に第１の配列バーコード、およびその３’末端における第１の標的特異性部分を含む。特定の実施形態では、第２のプローブは、分子の５’末端から出発して、選択的に５’リン酸、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、選択的に第２のユニバーサル配列、およびその３’末端における第２の架橋オリゴ特異性配列を含む。

好ましい実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブのいずれかは、第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコードのうちの少なくとも１つを含む。第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコード、またはその両方は、ランダム配列であってもよく、または標的ヌクレオチド配列識別子配列、試料識別子配列および／または標的列挙のための分子バーコードを含んでもよい。

好ましい実施形態では、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、第１および第２のプローブ中の第１および第２の架橋オリゴ特異性配列にそれぞれ相補的な配列、選択的にユニバーサル配列を含有し、および／またはランダム配列であり得るか、または試料もしくは配列識別子配列を含有し得る第３のバーコードを含有し得る。この点において、第３のバーコードは、必ずしも第１および第２のバーコードが既に存在することを意味するものではない。上述のように、少なくとも１つのバーコードがライゲーションされたライゲーション複合体中に存在すべきであり、これにより、試験されたすべての試料中のすべてのライゲーション複合体内で複合体を一意的に定義することが可能になる。

さらに、第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、エンドヌクレアーゼのための認識配列を含む。
認識配列は、工程（ｘ）におけるコンカテマー配列切断のために必要とされる。一つの実施形態では、ＥｃｏＲＩなどの制限エンドヌクレアーゼの認識配列である。別の実施形態では、認識配列は、Ｉ－ＣｅｕＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列である。別の実施形態では、認識配列は、誘導されたＤＮＡａｓｅＩまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓのような切断システムの認識配列である。

選択的に、第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは、第１の捕捉部分を含む。第１の捕捉部分は、本明細書で使用される場合、化学基などの部分を指し、これによって、固体支持体に連結された第２の捕捉部分がプローブ、ライゲーション複合体またはハイブリダイゼーション複合体を捕捉、すなわち結合することができる。この目的のために、当技術分野で公知の任意の適切な捕捉部分を使用することができる。周知の好適な例は、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを用いたビオチン化分子の捕捉である。したがって、一実施形態では、第１の捕捉部分はビオチン部分であり、磁気ビーズなどの固体支持体に連結されたストレプトアビジンまたはアビジン部分（第２の捕捉部分）と相互作用することができる。他の選択肢には、ストレプトアビジン／アビジンとのコンジュゲーションに使用することができる、二重ビオチン、デスチオビオチンまたは光切断性ビオチンなどのビオチン誘導体が含まれる。さらなる選択肢としては、アクリルダイト／アクリルアミドコンジュゲーションのためのチオール基およびアクリルダイト基、クリックケミストリーのためのアルキン基およびアジド基、ならびに抗ジゴキシゲニン抗体コンジュゲーションのためのジゴキシゲニンの使用を含む。コンジュゲーションパートナーは、ビーズ（磁性またはその他）など任意の固体表面、または固体支持体上に提供されうる。

第１の標的特異性部分、第２の標的特異性部分、第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または第２の架橋オリゴ特異性配列は、好ましくは、プローブ結合を増加させるために互いに独立して少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドを含有する。プローブ結合を増加させる化学修飾には、リボ核酸、ペプチド核酸、およびロックド核酸（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９/０３８３７２号の図３に示される）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブ、またはその両方の架橋部分が、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む。
別の実施形態では、第１の標的特異性部分、第２の標的特異性部分、第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、化学修飾は、隣接するプローブを化学的にライゲーションさせる。いくつかの実施形態では、前述のプローブは、完全に隣接する遺伝子座に、または最大５００塩基対離れて、例えば最大２００塩基対離れて、例えば最大５０塩基対離れて、好ましくは最大４０塩基対離れて、より好ましくは最大３０塩基対離れて、より好ましくは最大２０塩基対離れて、より好ましくは最大１０塩基対離れて、最も好ましくは最大５塩基対離れて結合する。

いくつかの実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋プローブまたは架橋オリゴ複合体は、Ｉｌｌｕｍｉｎａなどの（但し、これに限定されない）ＤＮＡシーケンシングプラットフォーム用のアダプター配列を含んでいてもよい。これらのアダプター配列により、結果として得られるシーケンシングライブラリをイルミナフローセルなどのシーケンスデバイスの検出部分に結合することができる。

さらに、いくつかの実施形態では、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、
（ｉ）１～５個の３’突出塩基（すなわち、第２のプローブと二重らせんを形成しない追加の塩基）、および／または
（ｉｉ）３’リン酸、および／または
（ｉｉｉ）３’末端から３番目の位置以内の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾、
を含む。

プローブを、標的配列を含む試料と接触させる前に、第１のプローブおよび第２のプローブを、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドと、好ましくは別個のチューブ内の試料の各々について、接触させ、ライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする（工程（ｉｉ））。架橋が１つのオリゴではなく、互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、例えば３つまたは５つのオリゴヌクレオチドである実施形態（本明細書では図２Ｃに示す）では、複数のオリゴヌクレオチドが第１および第２のプローブとアニーリングする前にプレアニーリングされても、またはすべてのアニーリング工程が一度に行われてもよい。

好ましくは、各ライゲーション複合体は、第１の標的特異性配列、第２の標的特異性配列および１以上のバーコード配列の組み合わせに対して固有である。これにより、増幅後の標的配列の列挙および結果の分析が可能になる。

その後、複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列を複数のライゲーション複合体と接触させる（工程（ｉｉｉ））。第１のプローブおよび第２のプローブそれぞれの第１の標的特異性部分および第２の標的特異性部分を、標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズして、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する（工程（ｉｖ））。いくつかの実施形態では、試料は、１００マイクロリットル超、例えば１ｍｌ超の体積を有する。さらなる実施形態では、試料は、５ｐｍｏｌ未満、例えば１ｐｍｏｌ未満、例えば２００ｆｍｏｌ未満の核酸濃度を有する。一実施形態では、複数の試料が、１以上の血液試料、１以上の唾液試料、１以上の尿試料、または、１以上の糞便試料を含む。

続いて、いくつかの実施形態では、第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが第１の捕捉部分を含む場合、ハイブリダイゼーション複合体は、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させられ、そして、第１の補足部分および第２の捕捉部分とを、ハイブリダイゼーション複合体が固体支持体に連結されるように相互作用させることができる（選択的な工程（ｖ））。その後、固体支持体に連結されていない試料の成分から、固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する（工程（ｖｉ））。固体支持体が磁性ビーズである場合、磁石を用いてビーズを固定化し、残った液体試料を除去してもよい。選択的に、洗浄工程は、進行する前に行われる。

工程（ｖ）によって、核酸が精製および濃縮され、特に非常に純度の低い試料について結果の改善を可能にする。一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｖ）の前に核酸を濃縮する工程を含まない。
したがって、一実施形態では、方法は、工程（ｖｉ）の前に、元の試料中の核酸を２倍超、１０倍超、または１００倍超に濃縮する工程を含まない。
別の実施形態では、本発明の方法は、工程（ｖｉ）のライゲーションの後に精製工程を含まない。

続いて、形成されたハイブリダイズ複合体中のプローブのライゲーションを酵素的または化学的に行い、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する（工程（ｖｉ））。工程（ｖｉ）の一部として任意に、第１のプローブと第２のプローブとの間に間隙が存在する場合、ポリメラーゼおよび１以上のヌクレオチドを導入することによって塞ぐことができる。ポリメラーゼは、（ａ）ユニバーサル架橋オリゴ配列に相補的、および／または（ｂ）バーコード配列に相補的、であるヌクレオチドを付加し、それによって第１のプローブと第２のプローブとの間の２つの間隙を埋め、その結果、左右のプローブがライゲーションし、ユニバーサル配列および／または第３のバーコード配列が架橋相補鎖に含まれる。架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、第１のプローブまたは第２のプローブに存在する標的配列識別子配列が架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体に組み込まれるように、ライゲーションされたプローブに相補的な５’部位または３’部位から伸長される。好ましくは、第１のプローブの第２のプローブへのライゲーションを、両方が標的配列にアニーリングされている場合に、妨害しないために、二本鎖ＤＮＡを分解しないポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼなどが使用される。

ライゲーションされたライゲーション複合体は、そして、１以上の標的試料からプールされる（工程（ｖｉｉ））。工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）は、指定された順序で、または逆の順序で実行されてもよい。

次に、核酸は、１以上の複数のライゲーションされたライゲーション複合体から増幅される（工程（ｖｉｉｉ））。
増幅は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３６８０、 ＤＰＯＬ＿ＢＰＰＨ２）またはＢｓｔポリメラーゼ（Ｐ５２０２６、 ＤＰＯ１＿ＧＥＯＳＥ）などの鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して実行される。次の工程（ｉｘ）では、工程（ｖｉｉｉ）で得られた増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、エンドヌクレアーゼの認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドで、選択的にアニーリングに供し、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼの認識部位が得られるように、ステップ（ｉ）で指定された前記認識配列とアニーリングする。認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドは、典型的には、切断のための安定した二重らせんの形成を可能にするために、認識配列の周りにいくつかの追加の特定の配列を含みうる。

続いて、工程（ｖｉｉｉ）で得られた一本鎖コンカテマー配列または工程（ｉｘ）で得られたアニーリングされた複合体は、選択的に前記エンドヌクレアーゼで切断され（工程（ｘ））、その結果、ＮＧＳライブラリーが得られる。

選択的に、増幅後、固体支持体が存在する場合には、その固体支持体は除去され、上清はその後の処理に使用される。例えば、固体支持体が磁性粒子である場合、これらは磁石を使用して除去することができる。本発明の方法の他のいくつかの実施形態では、第１の捕捉部分と第２の捕捉部分との間の相互作用は、工程（ｖｉ）の直後、工程（ｖｉ）の後で、または工程（ｖｉｉｉ）の後に中断される。例えば、第１の捕捉部分がビオチンであり、第２の捕捉部分がストレプトアビジンである場合、過剰の可溶性ビオチンを添加することによって相互作用を中断することができる。ストレプトアビジンが磁性粒子に結合している場合、その後磁石を用いて除去することができる。

さらに、選択的に、ＰＣＲ増幅は、第１および第２のプローブのユニバーサル部分に結合するプライマーを使用して、ステップ（ｘ）とステップ（ｘｉ）との間で行われ、前記プライマーは、選択的に、ステップ（ｘｉ）におけるその後の配列決定のためのアダプターを含む。

複数の試料中の標的ヌクレオチド配列の存在および／または数の特定は、第１および／または第２の標的特異性部分の少なくとも一部分、第１および／または第２のバーコードの少なくとも一部分、および／または第３のバーコードの少なくとも一部分を、ハイスループット次世代シーケンシング技術、例えば、これに限定するものではないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑまたはＮｏｖａＳｅｑを含む次世代シーケンシングプラットフォームを使用して決定すること（工程（ｘｉ）および（ｘｉｉ））によって行われ得る。好ましくは、遺伝子標的列挙は、標的あたりの、および試料あたりの分子バーコードの数を数えることによって可能になる。試料を配列データから分離（逆畳み込み）し、ＤＮＡシーケンシング後にイン シリコで配列標的を定量する。

好ましい実施形態では、分子は、第１のプライマーおよび第２のプライマーでさらに増幅されて、増幅産物を提供する。好ましくは、ユニバーサル第１プライマーおよびユニバーサル第２プライマーが使用され、ライゲーションされた複合体中に存在する第１または第２のユニバーサル配列に対して相補的である。

本発明の利点には、従来の核酸シーケンシング技術と比較して、低コスト、高単純性、高特異性、高感度、高精度、ハイスループット、高スケーラビリティおよび高ターンオーバーでの定量アッセイが含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の態様は、本発明の方法が、ヒトおよび動物の集団を含み、大量の未精製試料材料を含む複数の試料中の複数の核酸標的の正確かつ大規模に並行して定量を可能にすることである。上述したように、好ましい実施形態では、尿試料などの試料は、事前に核酸を精製または濃縮せずに使用される。別の実施形態では、試料を前処理してもよく、例えば、細胞を溶解して核酸を露出させる。本発明の１つの特定の利点は、独自のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを使用して、目的の標的配列の検出および増幅を可能にすることである。プローブは、アニーリングおよび結合効率を改善する特別に配置された修飾ヌクレオチドを用いて設計される。結合特性の改善は、アッセイの特異性、感度および精度を向上させる。本発明の方法は、遺伝変異体の研究にも適用可能であり、これらに限定されないが、ＳＮＰおよび／またはインデルなど、１以上の配列および／または多型についての試料の遺伝子型同定、癌診断、または母体血液からの胎児染色体障害等を含む診断および予後への適用が見出される。好ましい実施形態では、２つ以上の試料または２つ以上の遺伝子座／対立遺伝子組み合わせについて、バーコード配列は、ＳＮＰおよび／またはインデルなどの１以上の配列および／または多型について試料の遺伝子型を同定するために使用される。

別の態様では、本発明は、以下のようなパーツのキットを提供する。
パーツのキットは複数の容器を含み、少なくとも１つの容器は、第１のプローブおよび第２のプローブの１以上のセットを含み、および少なくとも１つの容器が、１以上の架橋オリゴ、または架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含み、、
第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列と、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端の第１の標的特異性部分とを含み、
第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分と、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端の第２の架橋オリゴ特異性配列とを含み、
架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体が、第１および第２のプローブそれぞれの第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、ならびに選択的に第３のバーコードを含み、
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、各前記第１および第２のプローブ中の各第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および選択的に第３のバーコードを含み
第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコードまたは第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し、
第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコードまたは第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中にそれぞれ存在し、および、
第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼのための認識配列を含み、および、
パーツのキットが、エンドヌクレアーゼに対する認識部分が得られるように、認識配列とアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドをさらに含む。

好ましくは、複数の第１のプローブの３’末端または複数の第２のプローブの５’末端、またはその両方は、複数の第１のプローブが複数の第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される。

好ましくは、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、第１のプローブの配列に相補的な配列または第２のプローブの配列に相補的な配列またはその両方において、１以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。

好ましくは、第１のプローブの３’末端または第２のプローブの５’末端、またはその両方は、第１のプローブが第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される。

好ましくは、第１のプローブまたは第２のプローブ、またはその両方の架橋部分は、架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む。

１つの特定の実施形態では、第１および第２のプローブのセットを含む少なくとも１つの容器と、架橋オリゴまたは、互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１つの容器とは１つの同じ容器である。そのような場合、３つのプローブは、予めアニーリングされ、ライゲーションされた複合体を形成していてもよい。

本発明の１つの特定の利点は、独自のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを使用して、目的の標的配列の検出および増幅を可能にすることである。プローブは、アッセイ特異性、感度および精度の向上につながる改善された結合特性で設計される。本発明は、分子生物学、進化生物学、メタゲノミクス、遺伝子型同定、より具体的には、ＳＮＰおよび／またはインデルなど、１以上の配列および／または多型についての試料の遺伝子型同定を含むがこれらに限定されない、癌診断または胎児染色体障害を含むがこれらに限定されない分野における用途を見出す。

さらに、本発明は、以下に関する：
実施形態１
複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出のための方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴを提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み、および
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み、および、
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および、選択的に第３のバーコードを含み、および、
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し、および、
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼの認識配列を含み、および、
選択的に、前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴの少なくとも１つは、第１の捕捉部分を含む、
工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴ複合体と接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする、工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる、工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程と、
（ｖ）選択的に、前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させ、および、固体支持体に結合していないサンプルの成分から固体支持体に結合したハイブリダイゼーション複合体を分離する、工程と、
（ｖｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する、工程と、
（ｖｉｉ）前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする、工程と、
（ｖｉｉｉ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して、増幅する、工程と、
（ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得られた増幅された１以上の一本鎖コンカテマー配列を、エンドヌクレアーゼの認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドでアニーリングに供し、前記オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼに対する認識部位が得られるように、工程（ｉ）で指定された認識配列とアニーリングする、工程と、
（ｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得られた前記一本鎖コンカテマー配列または工程（ｉｘ）で前記エンドヌクレアーゼで得られたアニーリングされた複合体を切断する、工程と、
（ｘｉ）工程（ｘ）で得られた前記核酸断片を、ハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程、および
（ｘｉｉ）前記第１の標的特異性部分および／もしくは前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程、を含み、
前記工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法。

実施形態２
前記複数の試料が、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料を含む、実施形態１に記載の方法。

実施形態３
前記第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴの少なくとも１つは第１の捕捉部分を含み、
前記工程（ｖ）を含み、前記工程（ｖ）の前に核酸を濃縮するステップを含まない、実施形態１または２に記載の方法。

実施形態４
前記第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴの少なくとも１つは第１の捕捉部分を含み、
工程（ｖ）を含み、前記第１の捕捉部分はビオチン部分であり、前記第２の捕捉部分はストレプトアビジン部分またはアビジン部分である、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。

実施形態５
前記第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴの少なくとも１つは第１の捕捉部分を含み、
前記工程（ｖ）を含み、前記工程（ｖ）と（ｖｉ）の間に洗浄工程が行われる、実施形態１～４のいずれかに記載の方法。

実施形態６
前記架橋オリゴは、
（ｉ）１～５個の３’突出塩基、および／または
（ｉｉ）３’リン酸、および／または
（ｉｉｉ）３’末端から３番目の位置以内の１または複数のホスホロチオエート修飾
を含む、実施形態１～５のいずれか記載の方法

実施形態７
前記第１のプローブの３’末端または前記第２のプローブの５’末端、またはその両方が、前記第１のプローブが前記第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される、実施形態１～６のいずれかに記載の方法

実施形態８
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブ、またはその両方の架橋部分が、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。

実施形態９
前記第１の標的特異性部分、前記第２の標的特異性部分、前記第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または前記第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを含有する、実施形態１～８のいずれかに記載の方法。

実施形態１０
前記工程（ｖｉｉｉ）は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔポリメラーゼを用いて実施される、実施形態１～９のいずれかに記載の方法。

実施形態１１
ＰＣＲ増幅は、第１および第２のプローブのユニバーサル部分に結合するプライマーを使用して、ステップ（ｘ）とステップ（ｘｉ）との間で行われ、前記プライマーは、選択的に、ステップ（ｘｉ）におけるその後の配列決定のためのアダプターを含む、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法。

実施形態１２
遺伝子標的列挙が、標的あたりの、および試料あたりの分子バーコードの数を数えることによって可能になる、実施形態１～１１のいずれかに記載の方法。

実施形態１３
２つ以上のサンプルまたは２以上の遺伝子座／対立遺伝子の組み合わせに対して、バーコード配列が使用されて、ＳＮＰおよび／またはインデルなどの１以上の配列および／または多型のサンプルの遺伝子型を決定する、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。

実施形態１４
複数の容器を含むパーツのキットであって、
少なくとも１つの容器は、第１のプローブおよび第２のプローブの１以上のセットを含み、および少なくとも１つの容器が、１以上の架橋オリゴを含み、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列と、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端の第１の標的特異性部分とを含み、
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分と、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端の第２の架橋オリゴ特異性配列とを含み、
前記架橋オリゴは、各前記第１および第２のプローブ中の各前記第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、ならびに選択的に第３のバーコードを含み、
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴ中にそれぞれ存在し、および、
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴ少なくとも１つはエンドヌクレアーゼに対する認識配列を含み、および、
前記パーツのキットは、前記エンドヌクレアーゼに対する認識部分が得られるように、前記認識配列とアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドをさらに含む。

（方法）
１．プローブ複合体の形成
プローブ複合体には、遺伝的標的、サンプルインデックス、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンスライブラリの構築に必要な配列が含まれる。以下を含む３部分構成のプローブ複合体が形成された（図２に示す。）
（ａ）分子の５’末端から出発して、第１の架橋オリゴ特異性配列、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を有する第１のプローブ、
（ｂ）分子の５’末端から出発して、第２の標的特異性部分、第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を有する第２のプローブ、および、
（ｃ）第１のプローブおよび第２のプローブのそれぞれにおける第１の架橋オリゴ特異性配列および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、を有する架橋オリゴ。

プローブ複合体は、アニーリング反応で３部分（架橋、右アーム、左アーム）すべてを等モル量で組み合わせることによって構築される。
反応は、サーモサイクラー内で実施される（表１に示すアニーリングプログラム）。

２．標的捕捉
目的の変異を含む特定のゲノム領域が標的とされる。精製されたＤＮＡ（たとえば、組織、血漿、尿、唾液からのもの）を試料として使用することも、試料を精製せずに、たとえば煮沸および／または遠心分離等によってのみ前処理することもできる。

プローブ複合体は、塩基配列の相補的相互作用を介して標的領域にハイブリダイズする。標的捕捉の開始には、反応プローブと標的ＤＮＡを混合し、サーマルサイクラー内でインキュベートする（表２に示す標的捕捉と間隙充填のプログラム）。

３．間隙充填
標的捕捉の後、プローブ複合体は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ ＤＮＡリガーゼの組み合わせを追加し、＋４５°Ｃで４５分間インキュベートすることで、伸長され、ライゲートされる。

４．ローリングサークル増幅
伸長およびライゲーションの後、環状プローブ分子は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に付される。ＲＣＡ反応のための、標的捕捉反応は、ＥｑｕｉｐＰｈｉ２９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ポリメラーゼを含むＲＣＡ反応ミックスと混合される。
反応は＋４２℃、３０分から２時間、インキュベートされる。ＲＣＡ反応後、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の濃度を測定することにより、反応効率を分析する。

５．酵素的設計
ＲＣＡ反応により、ターゲットライブラリの複数のコピーを持つ長いコンカテマーｓｓＤＮＡ分子が生成される。各完全なターゲットライブラリは、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列によって分離されている。
この配列は、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドとのアニーリングと、および準備ができた標的ライブラリーの放出とを介して、長いコンカテマーの配列特異的切断を可能にする。
これらのライブラリは、簡単な精製ステップの後、さらに分析する準備ができている。ＲＣＡ生産物をＥｃｏＲＩで＋３７℃で１時間、分解する。

６．ライブラリの精製
ＥｃｏＲＩ分解後、ライブラリー分子は、電気泳動後またはサイズ選択ビーズ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＭａｇなど）を使用してアガロースゲルから抽出することにより精製される。

７．スクリーニング
精製されたＭｉＳｅｑまたはｉＳｅｑ１００互換のライブラリーは、最先端のシーケンス機器を使用してシーケンス分析に供される。
重要なことは、ライブラリーは、単純なオリゴヌクレオチド修飾によって、利用可能な任意のシーケンスプラットフォームに適合するように変換されうる。シーケンスデータは、ＵｎｉｘコマンドラインツールとＰｙｔｈｏｎおよびＲプログラミング言語の組み合わせを使用して処理される。
簡潔に述べると、シーケンシング処理の理論的根拠は、各リード内のプローブ配列を同定し、それらの間のゲノム領域をシーケンシングし、各遺伝子標的に関連する分子バーコードの数を数えることである。

（実験１）
第１の実験では、プローブミックスは、４つの複製反応をもたらす４つの異なるインデックスのプローブの集合体であった。それらは、EML-ALK融合を標的にした。標的オリゴヌクレオチドは、各標的の同定を可能にする固有の認識配列をっていた。

試料として、３つの合成標的オリゴヌクレオチドを対数的に増加する濃度で混合した。標的の捕捉、伸長およびライゲーション反応、ローリングサークル増幅およびその後のＥｃｏＲＩによる分解は、上記のように実施された。典型的な結果の例を図３に示す。

レディライブラリはＭｉＳｅｑおよびｉＳｅｑ１００機器でシーケンスされ、各リード内のプローブ配列をマッチングし、プローブ配列間のゲノム配列領域を同定し、分子バーコードを計数することによって、配列データ内で標的遺伝子を検出した。計数データはスパイクイン鋳型分子の数を正確に反映し、検出されたシグナルは、標的分子の有無に非常に特異的であった（図４）。

（図１および図２の詳細な説明）
図１は、記載された本発明の一実施形態のワークフローを示す。工程１では、試料（１０２）内の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をライゲーション複合体のセット（１０４）と接触させる。ライゲーション複合体は、標的核酸（１０６）上にアニーリングする。
工程２では、選択的に、標的結合ライゲーション複合体を試料材料から試料不純物（１０３）を残して捕捉した。
工程３では、アニーリングしたライゲーション複合体をライゲーションし、ライゲーションされたライゲーション複合体を得る。
工程４では、複数の試料（１１０）からのライゲーションされたライゲーション複合体を一緒にプールする（１１２）。
工程５では、プローブ配列は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３６８０、 ＤＰＯＬ＿ＢＰＰＨ２）または他の鎖置換ポリメラーゼを用いたローリングサークル増幅によって増幅され、結果的にプローブ（１１１６）の長いコンカテマーコピーが得られる。
工程６では、選択的に、コンカテマープローブのコピーは、ＥｃｏＲＩなどの制限エンドヌクレアーゼまたはＩ－ＣｅｕＩなどのホーミングヌクレアーゼを使用して単量体単位に切断され、および、選択的にさらに、ＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲを使用して増幅される。
工程７では、増幅されたＤＮＡは、次世代ＤＮＡシーケンシングを使用してシーケンシングされる。
工程８では、ＤＮＡシーケンシング結果は、生物情報学パイプラインを使用して標的計数に変換される。

図２Ａは、本明細書の一実施形態による、複数のプローブエンティティを有するプローブトリプレットの原理構造を示す。複数のプローブエンティティは、試料アニーリングの前に組み立てられた左プローブ、右プローブおよび架橋オリゴを含む。
左プローブの最初の塩基は、選択的に、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾１（２０２）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。
左プローブの１５～２５塩基は、架橋結合配列１（２０４）を含み、これは、架橋部位１と呼ばれる効率的な架橋オリゴ結合のための化学修飾塩基をさらに含み得る。
左プローブは、選択的に、分子特異性バーコードまたはバーコード１（２０６）と呼ばれる試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む、５’末端から続く１０～２０塩基をさらに含む。左プローブは、５’末端から続く１５～３０塩基をさらに含み、遺伝子標的（２０８）に結合する。２０４または２０８のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴ（２２６）への親和性を増加させる化学修飾を含み得る。左プローブの最後の塩基は、選択的に、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾１（２１０）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。

右プローブの最初の塩基は、選択的に、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾２（２１４）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。右プローブの５’末端からの１５～３０塩基は、遺伝子標的（２１６）に結合する右プローブの一部を含む。右プローブの５’末端から続く１０～２０塩基は、選択的に、バーコード２（２１８）と呼ばれる分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む。右プローブの最後の１５～２５塩基は、架橋配列２（２２２）と呼ばれる、効率的な架橋オリゴ結合のための配列を含む。２０４、２０８、２１６または２２０のヌクレオチドのいくつかまたはすべては、標的または架橋オリゴに対するプローブの親和性を増加させる化学修飾を含み得る。

架橋配列３（２２８）と呼ばれる架橋オリゴの５’末端からの最初の１５～２５塩基は、右プローブの架橋配列１（２０４）と逆相補的であり、選択的に結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列４（２２４）と呼ばれる架橋最後の１５～２５塩基は、左プローブ（２２０）の架橋配列２と逆相補的であり、選択的に、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
ここで、架橋配列には、ＥｃｏＲＩなどの制限エンドヌクレアーゼまたはＩ－ＣｅｕＩ（２２６）などのホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位が含まれている。架橋オリゴの５’末端には、選択的に、ライゲーション複合体を捕捉するために使用される捕捉部分（２３０）が含まれる。

図２Ｂは、本明細書の一実施形態による、第１のプローブと第２のプローブとの間の間隙充填を示す。ここで、架橋オリゴは、架橋配列１（２２８）と架橋配列２（２２４）との間に間隙１を含む。間隙２は、プローブ１と２（２０８と２１６）との標的結合部の間に形成される。これらの間隙は、ポリメラーゼおよび１以上のヌクレオチドを導入することによって充填される。
この処理のために、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、およびＡｍｐｌｉｇａｓｅなどのＤＮＡリガーゼの混合物を使用することができる。ポリメラーゼは、（ａ）ユニバーサル架橋オリゴ配列に相補的であり、および（ｂ）標的配列に相補的であるヌクレオチドを付加し、それによって２つの間隙、すなわち、第１のプローブと第２のプローブとの間の間隙を埋め、ＤＮＡリガーゼのその後の作用により、架橋オリゴと標的配列に相補的な左側のプローブと右側のプローブが環状複合体へのライゲーションがもたらされる。

図２Ｃは、本明細書の一実施形態による、複数のプローブエンティティを有するプローブクインテットの原理構造を示す。複数のプローブエンティティは、左プローブ、右プローブおよび３つのオリゴからなる架橋体を含む。
ここで、プローブ複合体は左プローブと第２の架橋（２２８と２３６）の間、第２の架橋と右プローブ（２４０と２２２）の間、第１と第３の架橋オリゴ（２３８と２４２）の間、および左右プローブ（２０８と２１６）との間に間隙を含む。これらの間隙は、ポリメラーゼおよび１以上のヌクレオチドを導入することによって充填される。この処理のために、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＴａｑポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、およびＡｍｐｌｉｇａｓｅなどのＤＮＡリガーゼの混合物を使用することができる。ポリメラーゼは、これらの間隙を埋め、ＤＮＡリガーゼのその後の作用により、プローブと架橋オリゴの環状複合体へのライゲーションがもたらされる。

左プローブの１５～２５塩基は、架橋結合配列１（２２８）を含み、これは、選択的に、架橋配列１と呼ばれる効率的な架橋オリゴ結合のための化学修飾塩基を含んでもよい。左プローブは、さらに選択的に、ライブラリーのインデックス付けに使用されるユニバーサル配列（２０４）を含む、５’末端から続く１０～２０塩基をさらに含む。左プローブは、選択的に、バーコード１（２０６）と呼ばれる分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む、５’末端から続く１０～２０塩基をさらに含む。左プローブは、５’末端から続く１５～３０塩基をさらに含み、遺伝子標的（２０８）に結合する。２２８のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴへの親和性を増加させる化学修飾（２２６）を含み得る。左プローブの最後の塩基は、選択的に、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾１（２１０）と呼ばれる隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。

右プローブの最初の塩基は、選択的に、酵素的ライゲーションのためのリン酸部分、または修飾２（２１４）と呼ばれる、隣接プローブの５’末端への化学的ライゲーションを可能にする修飾を含む。右プローブの５’末端からの１５～３０塩基は、遺伝子標的（２１６）に結合する右プローブの一部を含む。右プローブの５’末端から続く１０～２０塩基は、選択的に、バーコード２（２１８）としての分子特異性バーコードまたは試料特異性バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む。右プローブの５’末端から続く１０～２０塩基は、選択的にユニバーサル配列（２２０）を含む。架橋配列８（２２２）と呼ばれる右プローブの最後の１５～２５塩基は、第３の架橋オリゴ（２２４）の架橋配列７と逆相補的である。２０８、２１６、２２２または２２８のヌクレオチドの一部または全部は、プローブの標的または架橋オリゴへの親和性を増加させる化学修飾を含み得る。

架橋配列３（２２６）と呼ばれる第１の架橋オリゴの５’末端からの最初の１５～２５塩基は、右プローブの架橋配列１（２２８）と逆相補的であり、選択的に、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列２（２３８）と呼ばれる第１の架橋オリゴの最後の１５～２５塩基は、第２の架橋オリゴの架橋配列４配列（２３６）と逆相補的であり、選択的に、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。第１の架橋オリゴの５’末端は、選択的に、ライゲーション複合体を捕捉するために使用される捕捉部分（２３０）を含む。

架橋配列５（２４０）と呼ばれる第２の架橋オリゴの５’末端からの最初の１５～２５塩基は、第３の架橋オリゴの架橋配列６（２４２）と逆相補的であり、選択的に、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。架橋配列４（２３６）と呼ばれる第２の架橋オリゴの最後の１５～２５塩基は、第１の架橋オリゴの架橋配列２配列（２３８）と逆相補的であり、選択的に、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。

架橋配列６（２４２）と呼ばれる５’末端からの第３の架橋オリゴの最初の１５～２５塩基は、第２の架橋オリゴの架橋配列５（２４０）と逆相補的であり、選択的に結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
架橋配列７（２２４）と呼ばれる第１の架橋オリゴの最後の１５～２５塩基は、右プローブの架橋配列８配列（２２２）と逆相補的であり、結合を増加させるための化学修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
第３の架橋オリゴの３’末端は、間隙充填中の伸長を防止するために、リン酸（または他の切断可能な）部分（２３４）を含んでいてもよい。

Claims (14)

1. 複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出のための方法であって、
   （ｉ）前記複数の試料中の各標的ヌクレオチド配列に、
   第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
   前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、および第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み；
   前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、および第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み；および、
   前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および第３のバーコードを含み；および、
   前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し；および、
   前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼの認識配列を含み；
   および、前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、第１の捕捉部分を含む、工程と、
   （ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして前記架橋オリゴ複合体を形成できる複数のヌクレオチドと接触させ、自己アニーリングによって複数のライゲーション複合体を形成する工程と、
   （ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる、工程と、
   （ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的ヌクレオチド配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する、工程と、
   （ｖｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記第１および第２のプローブを前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間のギャップを埋めるようにライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する、工程と、
   （ｖｉｉｉ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から標的ヌクレオチド配列を、鎖置換ポリメラーゼによるローリングサークル増幅を使用して１以上の一本鎖コンカテマー配列を得るために増幅する、工程と、
   （ｉｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得られた１以上の一本鎖コンカテマー配列を、エンドヌクレアーゼの認識配列を含む特定のオリゴヌクレオチドでアニーリングに供し、前記特定のオリゴヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼに対する認識部位を有するアニーリングされた複合体が得られるように、工程（ｉ）で指定された前記認識配列とアニーリングする、工程と、
   （ｘ）工程（ｖｉｉｉ）で得られた前記一本鎖コンカテマー配列または工程（ｉｘ）で得られたアニーリングされた複合体を、前記エンドヌクレアーゼで切断する、工程と、
   （ｘｉ）工程（ｘ）で切断された断片、または工程（ｖｉｉｉ）で得られた一本鎖コンカテマー配列を、ハイスループットシーケンシング技術に供して、前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードのバーコード配列を決定する工程と、および
   （ｘｉｉ）前記第１の標的特異性部分および／または前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１の配列バーコードおよび／または前記第２の配列バーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含む方法。
2. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、および前記架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つが第１の捕捉部分を含み、
   前記工程（ｉｖ）の後に、前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させ、および、固体支持体に結合していない試料の成分から固体支持体に結合したハイブリダイゼーション複合体を分離する、工程（ｖ）を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（ｖｉ）の後に、前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする、工程（ｖｉｉ）を含む請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記複数の試料が、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは第１の捕捉部分を含み、
   前記工程（ｖ）を含み、前記工程（ｖ）の前に前記試料中に含まれる核酸を濃縮する工程を含まない、請求項２に記載の方法。
6. 前記第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは第１の捕捉部分を含み、
   前記工程（ｖ）を含み、前記第1の捕捉部分はビオチン部分であり、前記第２の捕捉部分はストレプトアビジン部分またはアビジン部分である、請求項２又は５に記載の方法。
7. 前記第１のプローブまたは第２のプローブまたは架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つは第１の捕捉部分を含み、
   前記工程（ｖ）を含み、前記工程（ｖ）と（ｖｉ）の間に洗浄工程が行われる、請求項２、５、６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、
   （ｉ）１～５個の３’突出塩基、および／または
   （ｉｉ）３’リン酸、および／または
   （ｉｉｉ）３’末端から３番目の位置以内の１または複数のホスホロチオエート修飾を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１の標的特異性部分、前記第２の標的特異性部分、前記第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または前記第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを含有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記工程（ｖｉｉｉ）は、ｐｈｉ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔポリメラーゼを用いて実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１のプローブは、第１のユニバーサル配列を含み、前記第２のプローブは第２のユニバーサル配列を含み、ＰＣＲ増幅は、前記第１および第２のユニバーサル配列に結合するプライマーを使用して、工程（ｘ）と工程（ｘｉ）との間で行われ、および前記プライマーは、工程（ｘｉ）におけるその後の配列決定のためのアダプターを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 第１の配列バーコードまたは第２の配列バーコード、またはその両方は、分子バーコードを含み、
    工程（ｘｉｉ）において、前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定することを、標的あたりの、および試料あたりの分子バーコードの数を数えることによって行う、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ２つ以上の試料または２以上の遺伝子座／対立遺伝子の組み合わせに対して、前記第１の配列バーコード、前記第２の配列バーコードまたは第３のバーコードが使用されて、１以上の配列および／または多型の試料の遺伝子型を決定する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 複数の容器を含むパーツのキットであって、
    少なくとも１つの容器は、第１のプローブおよび第２のプローブの１以上のセットを含み、および少なくとも１つの容器が、１以上の架橋オリゴ、または架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチドを含み、
    前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列と、および、第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端の第１の標的特異性部分とを含み、
    前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分と、および、第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端の第２の架橋オリゴ特異性配列とを含み、
    前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、各前記第１および第２のプローブ中の各前記第１および第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、および、第３のバーコードを含み、
    前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中にそれぞれ存在し、および、
    前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つはエンドヌクレアーゼに対する認識配列を含み、および、
    前記エンドヌクレアーゼに対する認識部分が得られるように、前記認識配列とアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドをさらに含む、キット。
    

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