JP7642809B2 - ジストロフィン遺伝子内の認識配列に特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ - Google Patents

ジストロフィン遺伝子内の認識配列に特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ Download PDF

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Description

本出願は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特定の態様では、本発明は、ジストロフィン遺伝子からのエクソンの除去及びデュシェンヌ型筋ジストロフィを有する対象の処置に有用な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに関する。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介したテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月１２日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーの名称はＰ１０９０７００５４ＷＯ００－ＳＥＱ－ＥＰＧであり、サイズは２７９，８１９バイトである。
デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、世界中で少年３５００人に約１人が罹患する稀なＸ連鎖筋変性障害である。この疾患は、最も大きな既知の遺伝子であるジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子は、Ｘ染色体の２．２Ｍｂに及んでおり、７９個のエクソンに由来する１４ｋｂ転写物を主にコードする。骨格筋、平滑筋、及び心筋細胞で発現される全長ジストロフィンタンパク質は、３６８５アミノ酸であり、４２７ｋＤの分子量を有する。重度のデュシェンヌ表現型は、一般に、骨格筋及び心筋からの全長ジストロフィンタンパク質の喪失に関連し、これは衰弱性筋肉変性及び最終的には心不全をもたらす。多数の異なるジストロフィン遺伝子突然変異が記載されており、それらの多くは重度のＤＭＤ又はより軽度のベッカー型筋ジストロフィのいずれかをもたらす。
ＤＭＤの処置のためにいくつかの治療戦略が追求されている。第１に、「遺伝子置換」戦略は研究の活発な分野である（非特許文献１～４）。このアプローチは、ウイルス送達ベクター、典型的にはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してジストロフィン遺伝子の機能的コピーを患者に送達することを含む。しかしながら、ジストロフィン遺伝子はサイズが大きいため、一般的なウイルスベクターの限られた担持能力と適合しない。これは、遺伝子の反復中心部分の大部分が除去されて最小機能性タンパク質のみが残る「マイクロジストロフィン」遺伝子の使用を必要とする。しかしながら、「マイクロジストロフィン」の発現が臨床的利益のために十分であることは明らかではない。さらに、このアプローチは、挿入突然変異誘発をもたらし得る患者ゲノムへのランダムな遺伝子組み込みの可能性、及び送達ベクターに対する免疫反応の可能性に悩まされる。
ＤＭＤを処置するための第２のアプローチは、健康な筋前駆細胞を患者の筋線維に移植することを含む（非特許文献５、６）。このアプローチは、移植された筋芽細胞の非効率的な遊走及び患者による免疫拒絶の可能性に悩まされる。
第３のアプローチは、ＰＴＣ１２４を使用したナンセンス突然変異の抑制を含む（非特許文献７）。しかし、これには薬物の生涯にわたる投与が必要であり、このアプローチはまだ有意な臨床的利益を何ら示していない。
ＤＭＤを処置するための第４のアプローチは、「エクソンスキップ」と呼ばれる（非特許文献８～１４）。一般に、ジストロフィン遺伝子のアミノ（Ｎ）及びカルボキシ（Ｃ）末端部分は、筋線維の膜完全性を維持する「足場」タンパク質としてのその役割に不可欠であるが、２４回のスペクトリン様反復を含む中央の「ロッドドメイン」は少なくとも部分的に必須ではない。実際、重度のデュシェンヌ表現型は、典型的には、フレームシフト及び／又は未熟終止コドンを導入するジストロフィン遺伝子の突然変異に関連し、必須Ｃ末端ドメインを欠くジストロフィンタンパク質の切断型をもたらす。全エクソンの大欠失を含む中央ロッドドメインの突然変異は、典型的には、タンパク質のＣ末端ドメインが無傷であるようにリーディングフレームを維持する場合、はるかに軽度のベッカー表現型をもたらす。
ＤＭＤは、１つ又は複数の全エクソンの欠失によって最も頻繁に引き起こされ、その結果、リーディングフレームシフトが生じる。例えば、エクソン４５は、デュシェンヌ患者において頻繁に欠失される。エクソン４５は１７６ｂｐ長であり、これは３で割り切れないので、エクソンを欠失させるとエクソン４６～７９が誤ったリーディングフレームにシフトする。１４８ｂｐ長であるエクソン４４についても同じことが言える。しかしながら、エクソン４４及び４５が欠失される場合、欠失の総サイズは３２４ｂｐであり、これは３で割り切れる。したがって、両方のエクソンの欠失は、リーディングフレームのシフトをもたらさない。これらのエクソンはジストロフィンタンパク質の非必須ロッドドメインの一部をコードするので、それらをタンパク質から欠失させると、軽度のベッカー様表現型が生じると予想される。したがって、１つ又は複数のエクソンの欠失に起因するデュシェンヌ表現型を有する患者は、潜在的に、１つ又は複数の隣接するエクソンを排除してリーディングフレームを回復させることによって処置することができる。これは、修飾オリゴヌクレオチドを使用してジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライスアクセプタ部位を遮断し、１つ又は複数の特異的エクソンがプロセシングされた転写物に存在しないようにする「エクソンスキップ」の背後にある原理である。このアプローチは、疾患誘発性ナンセンス突然変異を有するエクソン２３をスキップすることによってｍｄｘマウスモデルにおけるジストロフィン遺伝子発現を回復するために使用されている（非特許文献１５）。エクソン５１のスキップを誘導するオリゴヌクレオチド類似体もまた、初期のヒト臨床試験において有望性を示している（非特許文献１６）。このアプローチの主な制限は以下の通りである：（１）エクソンスキッププロセスは非効率的であり、比較的低レベルの機能性ジストロフィン発現をもたらす；（２）エクソンスキップオリゴヌクレオチドは、比較的短い半減期を有するので、その影響は一過性であり、反復的かつ生涯にわたる投薬を必要とする。したがって、エクソンスキップアプローチは臨床試験においていくらかの有望性を示しているが、疾患進行の改善は最小限であり、様々である。
本開示は、プレ－ｍＲＮＡではなくゲノムＤＮＡのレベルで遺伝子発現を補正することによって、現在のエクソンスキップアプローチを改善する。本発明は、しばしばメガヌクレアーゼと呼ばれる遺伝子操作された部位特異的ホーミングエンドヌクレアーゼ対を使用してジストロフィンコード配列から特定のエクソンを切除することを含むＤＭＤの永久処置である。そのようなエンドヌクレアーゼの対をジストロフィン遺伝子内のエクソンに隣接するイントロン領域の部位に標的化することによって、介在する断片をゲノムから永久的に除去することが可能である。得られた細胞及びその子孫は、非必須スペクトリンリピートドメインの一部が除去されているが、必須のＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインはインタクトである改変ジストロフィンを発現する。
ホーミングエンドヌクレアーゼ、すなわちメガヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見られる１５～４０塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼの群である。それらは、しばしば、第１群の自己スプライシングイントロン及びインテインなどの寄生性ＤＮＡエレメントに関連する。それらは、染色体に二本鎖切断を生じさせることによって、宿主ゲノムの特定の位置で相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、細胞のＤＮＡ修復機構を動員する（非特許文献１７）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、一般に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つ又は２つのコピーのいずれかを有することを特徴とする（非特許文献１８）。単一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するメンバーはモノマーとして見出される。
Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）は、藻類クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体中の２２塩基対の認識配列を認識及び切断するホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーである。遺伝子選択技術を使用して、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ切断部位の優先性が改変されている（非特許文献１９～２２）。Ｉ－ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計して、哺乳動物、酵母、植物、細菌及びウイルスゲノムの部位を含む、広く多様なＤＮＡ部位を標的とすることができるモノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載されている（特許文献１）。
特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩ及びその遺伝子操作された誘導体は通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合する短いペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに融合することができる（非特許文献２３、２４）。したがって、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物から発現することができる。２つの異なる単鎖メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を同じ細胞に送達することにより、２つの異なる部位を同時に切断することが可能である。これは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼで観察されるオフターゲット切断の極めて低い頻度と相まって、それらを本開示にとって好ましいエンドヌクレアーゼにする。
国際公開ＷＯ２００７／０４７８５９号公報 国際公開ＷＯ２００９／０５９１９５号公報
Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：７３－８０ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２４５－５６ Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：１０３６－４２ Ｏｄｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１５３９－４５ Ｐｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：８６７－７７ Ｓｋｕｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．１７：３８－４６ Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４７：８７－９１ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３５ Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－２９ Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ．２６：１７９－８４ ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１０：１５４７－５４ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＦＥＢＳ Ｊ．２８０：４２６３－８０ Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｐ．１３：３３２ Ｖｅｒｈａａｒｔ＆Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ（２０１２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２５：５８８－９６ Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：４２－４７ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＦＥＢＳ Ｊ．２８０：４２６３－８０ Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５ Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：３７５７－７４ Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１ Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８ Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－７９ Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２ Ｇｒｉｚｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９
本開示は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）内の認識配列に結合して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、並びにそのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを含む組成物及びそれらの使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対は、第１のエクソンの上流のイントロンに第１の切断部位を生成し、第２のエクソンの下流のイントロンに第２の切断部位を生成することによってジストロフィン遺伝子から複数のエクソンを除去するために使用される。本明細書に記載される特定の例では、第１の切断部位はジストロフィン遺伝子のエクソン４５の５´上流のイントロンに生成され、第２の切断部位はエクソン５５の３´下流のイントロンに生成される。このプロセスは、２つの切断部位のアニーリング及びゲノムの修復後のジストロフィン遺伝子からのエクソン４５～５５の切除及び除去を可能にする。開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによって標的化される認識配列は、第１及び第２の切断部位が互いに完全にライゲーションすることができる相補的な４塩基対の３´オーバーハングを有するように、同一の４塩基対の中心配列を有するように選択される（すなわち、一方のオーバーハング対の各塩基は、他方のオーバーハング上のその相補体と対合する）。これらのエクソンの１つ又は複数を欠く変異ジストロフィン遺伝子からエクソン４５～５５を除去することによって、このアプローチは、ジストロフィン遺伝子の正常な（すなわち、野生型）リーディングフレームの回復をもたらす。そのように処理された細胞は、中央スペクトリンリピートドメインの一部は存在しないが、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインはインタクトである、ジストロフィンタンパク質の短縮された改変形態を発現する。これは、多くの場合、疾患の重症度を低下させる。場合によっては、それはより軽度のベッカー表現型をもたらす。
したがって、一態様では、本発明は、ジストロフィン遺伝子内の認識配列に結合して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットが、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。
いくつかの実施形態では、認識配列は配列番号６を含む。
いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２４～７９を含む。
いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８、３９、又は１４９のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３６～４４のいずれか１つの残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２３６に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～３７のいずれか１つの残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。
いくつかのこのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６、３９、４０、４３、又は４４のいずれか１つの残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６～３８又は４０～４４のいずれか１つの残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３６～４４のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６～４４のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。
いくつかのそのような実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、上記第１のサブユニットと上記第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３６～４４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３６～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６０～６８のいずれか１つに記載の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６０～６８のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、認識配列は配列番号１０を含む。
いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。
いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５～５１のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４５～５２のいずれか１つの残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２３９，２４１、及び２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２５０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５又は４６のいずれか１つの残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。
いくつかのこのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４５～５２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５～５２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。
いくつかのそのような実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、上記第１のサブユニットと上記第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４５～５２のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４５～５２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６９～７６のいずれか１つに記載の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６９～７６のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、認識配列は配列番号１２を含む。
いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２４～７９を含む。
いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３～５５、５７、又は５８のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５３～５９のいずれか１つの残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３又は配列番号５５の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５５のいずれか１つの残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２５５に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６～５９のいずれか１つの残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。
いくつかのこのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号５３又は５５～５９のいずれか１つの残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５４～５９のいずれか１つの残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５３～５９のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３～５９のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。
いくつかのそのような実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、上記第１のサブユニットと上記第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５３～５９のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５３～５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７７～８３のいずれか１つに記載の核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７７～８３のいずれか１つに記載の核配列によってコードされる。
上記の各実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、核局在化シグナルを含むことができる。いくつかの実施形態では、核局在化シグナルは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、核局在化シグナルは、配列番号３と少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核局在化シグナルは配列番号３を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはｒｈ．７４キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ８キャプシドを有する。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは筋肉特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、ＭＣＫプロモータ、Ｃ５－１２プロモータ、ｓｐｃ ５－１２プロモータ、ＭＨＣＫ７プロモータ、ＣＫ８プロモータ、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ、ＳＰ－３０１プロモータ、ＳＰ－８１７プロモータ、又はＳＰ－９０５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを提供する。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはｒｈ．７４キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ８キャプシドを有する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは筋肉特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、ＭＣＫプロモータ、Ｃ５－１２プロモータ、ｓｐｃ ５－１２プロモータ、ＭＨＣＫ７プロモータ、ＣＫ８プロモータ、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ、ＳＰ－３０１プロモータ、ＳＰ－８１７プロモータ、又はＳＰ－９０５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼとを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と本明細書に記載のポリヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と本明細書に記載の組換えウイルスとを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体と本明細書に記載の脂質ナノ粒子組成物とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列とを含むポリヌクレオチドを提供し、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであるか、又は第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表１に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。
Figure 0007642809000001
Figure 0007642809000002
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、１９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５（配列番号４７）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番号４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
特定の実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表２に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。
Figure 0007642809000003
Figure 0007642809000004
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６（配列番号５６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列によって分離されている。特定の実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ配列である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む（すなわち、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列とを含む）組換えＤＮＡ構築物を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列によって分離されている。特定の実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ配列である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の核酸配列及び第２の核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは筋肉特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、ＭＣＫプロモータ、Ｃ５－１２プロモータ、ｓｐｃ ５－１２プロモータ、ＭＨＣＫ７プロモータ、ＣＫ８プロモータ、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ、ＳＰ－３０１プロモータ、ＳＰ－８１７プロモータ、又はＳＰ－９０５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の第１及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモータ及び第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモータを含む。いくつかの実施形態では、第１のプロモータ及び第２のプロモータは筋肉特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、ＭＣＫプロモータ、Ｃ５－１２プロモータ、ｓｐｃ ５－１２プロモータ、ＭＨＣＫ７プロモータ、ＣＫ８プロモータ、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ、ＳＰ－３０１プロモータ、ＳＰ－８１７プロモータ、ＳＰ－９０５プロモータ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の第１及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。
いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはｒｈ．７４キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ８キャプシドを有する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む（すなわち、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列とを含む）組換えウイルスを提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の核酸配列及び第２の核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列によって分離されている。特定の実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ配列である。
いくつかの実施形態では、プロモータは筋肉特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、ＭＣＫプロモータ、Ｃ５－１２プロモータ、ｓｐｃ ５－１２プロモータ、ＭＨＣＫ７プロモータ、ＣＫ８プロモータ、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ、ＳＰ－３０１プロモータ、ＳＰ－８１７プロモータ、又はＳＰ－９０５プロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１の核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモータ及び第２の核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモータを含む。いくつかの実施形態では、第１のプロモータ及び第２のプロモータは筋肉特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、ＭＣＫプロモータ、Ｃ５－１２プロモータ、ｓｐｃ ５－１２プロモータ、ＭＨＣＫ７プロモータ、ＣＫ８プロモータ、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ、ＳＰ－３０１プロモータ、ＳＰ－８１７プロモータ、ＳＰ－９０５プロモータ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはｒｈ．７４キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈ．７４キャプシドは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ８キャプシドを有する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む（すなわち、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列とを含む）脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容され得る担体及び本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む（すなわち、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列とを含む）医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の組換えウイルスを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子組成物を含む。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に改変された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現され、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号６を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に改変された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号６を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と（遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現される）、目的の配列を含む第２の核酸配列とを含む（遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号６を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生し、目的の配列が、切断部位においてジストロフィン遺伝子に挿入される）、１つ又は複数のポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと、目的の配列を含むポリヌクレオチドとを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号６を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生し、目的の配列が、切断部位においてジストロフィン遺伝子に挿入される方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に改変された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現され、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１０を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に改変された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１０を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と（遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現される）、目的の配列を含む第２の核酸配列とを含む（遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１０を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生し、目的の配列が、切断部位においてジストロフィン遺伝子に挿入される）、１つ又は複数のポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと、目的の配列を含むポリヌクレオチドとを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１０を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生し、目的の配列が、切断部位においてジストロフィン遺伝子に挿入される方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に改変された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現され、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１２を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に改変された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１２を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列と（遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現される）、目的の配列を含む第２の核酸配列とを含む（遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１２を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生し、目的の配列が、切断部位においてジストロフィン遺伝子に挿入される）、１つ又は複数のポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、遺伝子改変真核細胞のジストロフィン遺伝子内に挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと、目的の配列を含むポリヌクレオチドとを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが配列番号１２を含む認識配列においてジストロフィン遺伝子内に切断部位を産生し、目的の配列が、切断部位においてジストロフィン遺伝子に挿入される方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、ｍＲＮＡ又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって真核細胞に導入される。
別の態様では、本発明は、改変ジストロフィン遺伝子を含む遺伝子改変真核細胞を産生するための方法であって、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む１つ又は複数のポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼがエクソン４５の５´上流のイントロンにおける認識配列に結合して切断し、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼがエクソン５５の３´下流のイントロンにおける認識配列に結合して切断し、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼが真核細胞において発現され、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼがその認識配列においてジストロフィン遺伝子内に第１の切断部位を産生し、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼがその認識配列においてジストロフィン遺伝子内に第２の切断部位を産生し、第１の切断部位及び第２の切断部位が相補的なオーバーハングを有しており、第１の切断部位と第２の切断部位との間の介在ゲノムＤＮＡがジストロフィン遺伝子から切り取られ、ジストロフィン遺伝子がアニーリングされて改変ジストロフィン遺伝子が生成される、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号１０を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表１に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。そのような実施形態において、第１の切断部位及び第２の切断部位は、相補的な３´オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、１９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５（配列番号４７）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番号４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号１２を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。そのような実施形態において、第１の切断部位及び第２の切断部位は、相補的な３´オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表２に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６（配列番号５６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の切断部位及び第２の切断部位の相補的オーバーハング（例えば、３´オーバーハング）は、互いに完全に連結される。
いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３２又は３４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３４に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、改変ジストロフィン遺伝子において正常なリーディングフレームが回復し、全長の野生型ジストロフィン遺伝子と比較して回復している。
いくつかの実施形態では、改変ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く改変ジストロフィンポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、改変ジストロフィンポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列を含む第１のポリヌクレオチド及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは第１のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは第２のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のｍＲＮＡ及び／又は第２のｍＲＮＡは、本明細書に記載のｍＲＮＡである（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、第１の組換えＤＮＡ構築物及び／又は第２の組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の脂質ナノ粒子によって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の脂質ナノ粒子によって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の脂質ナノ粒子によって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第１の組換えウイルス及び／又は第２の組換えウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスである（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のｍＲＮＡである（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスである（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、対象の標的細胞中のジストロフィン遺伝子を改変するための方法であって、ジストロフィン遺伝子が、野生型からのジストロフィン遺伝子のリーディングフレームを変化させる突然変異によって特徴付けられ、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む１つ又は複数のポリヌクレオチドを標的細胞に送達することを含み、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼがエクソン４５の５´上流のイントロンにおける認識配列に結合して切断し、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼがエクソン５５の３´下流のイントロンにおける認識配列に結合して切断し、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼが標的細胞において発現され、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼがその認識配列においてジストロフィン遺伝子内に第１の切断部位を産生し、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼがその認識配列においてジストロフィン遺伝子内に第２の切断部位を産生し、第１の切断部位及び第２の切断部位が相補的なオーバーハングを有しており、第１の切断部位と第２の切断部位との間の介在ゲノムＤＮＡがジストロフィン遺伝子から切り取られ、ジストロフィン遺伝子がアニーリングされ、ジストロフィン遺伝子の正常なリーディングフレームが全長の野生型ジストロフィン遺伝子と比較して回復している、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号１０を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表１に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。そのような実施形態において、第１の切断部位及び第２の切断部位は、相補的な３´オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、１９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５（配列番号４７）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番号４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号１２を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表２に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。そのような実施形態において、第１の切断部位及び第２の切断部位は、相補的な３´オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６（配列番号５６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の切断部位及び第２の切断部位の相補的オーバーハング（例えば、３´オーバーハング）は、互いに完全に連結される。
いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３２又は３４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３４に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く改変ジストロフィンポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、改変ジストロフィンポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、対象はベッカー型筋ジストロフィ表現型に変換される。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸を含む第１のポリヌクレオチド及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドを標的細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは第１のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは第２のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のｍＲＮＡ及び/又は第２のｍＲＮＡは、本明細書に記載されている（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、第１の組換えＤＮＡ構築物及び/又は第２の組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の脂質ナノ粒子によって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の脂質ナノ粒子によって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の脂質ナノ粒子によって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の組換えウイルスによって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の組換えウイルスによって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、第１の組換えウイルス及び/又は第２の組換えウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスである（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを標的細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のｍＲＮＡである（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって標的細胞に送達される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスである（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、標的細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
別の態様では、本発明は、ＤＭＤの処置を必要とする対象においてＤＭＤを処置するための方法であって、ＤＭＤが、全長の野生型ジストロフィン遺伝子と比較してジストロフィン遺伝子のリーディングフレームを変化させるジストロフィン遺伝子における突然変異を特徴とし、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む有効量の１つ又は複数のポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼがエクソン４５の５´上流のイントロンにおける認識配列に結合して切断し、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼがエクソン５５の３´下流のイントロンにおける認識配列に結合して切断し、１つ又は複数のポリヌクレオチドが対象の標的細胞に送達され、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼが標的細胞において発現され、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼがその認識配列においてジストロフィン遺伝子内に第１の切断部位を産生し、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼがその認識配列においてジストロフィン遺伝子内に第２の切断部位を産生し、第１の切断部位及び第２の切断部位が相補的なオーバーハングを有しており、第１の切断部位と第２の切断部位との間の介在ゲノムＤＮＡがジストロフィン遺伝子から切り取られ、ジストロフィン遺伝子がアニーリングされ、ジストロフィン遺伝子の正常なリーディングフレームが全長の野生型ジストロフィン遺伝子と比較して回復している、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号１０を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表１に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。そのような実施形態において、第１の切断部位及び第２の切断部位は、相補的な３´オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、１９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５（配列番号４７）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番号４０）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号６を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり、第２の遺伝子操作されたヌクレアーゼは、配列番号１２を含む認識配列に結合して切断する本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、表２に提供されるメガヌクレアーゼ（及び本明細書に記載されるそのバリアント）の組み合わせから選択される。そのような実施形態において、第１の切断部位及び第２の切断部位は、相補的な３´オーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）又は本明細書に記載されるそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）又は本明細書に記載されるそのバリアントであり、第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６（配列番号５６）、又は本明細書に記載されるそのバリアントである。
いくつかの実施形態では、第１の切断部位及び第２の切断部位の相補的オーバーハング（例えば、３´オーバーハング）は、互いに完全に連結される。
いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３２又は３４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、配列番号３４に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く改変ジストロフィンポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、改変ジストロフィンポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、対象はベッカー型筋ジストロフィ表現型に変換される。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸を含む第１のポリヌクレオチド及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは第１のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは第２のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、第１のｍＲＮＡ及び/又は第２のｍＲＮＡは、本明細書に記載のｍＲＮＡである（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、第１の組換えＤＮＡ構築物及び/又は第２の組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の脂質ナノ粒子によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の脂質ナノ粒子によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の組換えウイルスによって対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、第２の組換えウイルスによって対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１の組換えウイルス及び/又は第２の組換えウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスである（すなわち、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、本方法は、第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のｍＲＮＡである（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物である（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含む）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の組換えウイルスである（すなわち、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、標的細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
別の態様では、本発明は、配列番号３２又は配列番号３４に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２に示される核酸配列を含む細胞（例えば、ヒト筋肉細胞）のゲノム中のジストロフィン遺伝子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３２に示される核酸配列を含む細胞（例えば、ヒト筋肉細胞）中の前駆体ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３４に示される核酸配列を含む細胞（例えば、ヒト筋肉細胞）のゲノム中のジストロフィン遺伝子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３４に示される核酸配列を含む細胞（例えば、ヒト筋肉細胞）中の前駆体ｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、そのゲノム中に改変ジストロフィン遺伝子を含む遺伝子改変真核細胞を提供し、改変ジストロフィン遺伝子はエクソン４５～５５が欠失しており、改変ジストロフィン遺伝子は、エクソン４４とエクソン５６との間のイントロン内に位置する配列番号３２に示される核酸配列又は配列番号３４に示される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号３２を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号３４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変真核細胞は筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）、骨格筋細胞又は心筋細胞である。
別の態様では、本発明は、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く改変ジストロフィンタンパク質であり、該ポリペプチドは、ジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現する本明細書に記載の細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬は、対象において改変ジストロフィン遺伝子を産生するのに有用である。いくつかの実施形態では、医薬はＤＭＤの処置に有用である。
別の態様では、本発明は、ＤＭＤを処置するため、改変ジストロフィンタンパク質（すなわち、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く）のレベルを増加させるため、又はＤＭＤに関連する症候を軽減するための、医薬の製造における、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に開示されるポリヌクレオチド、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現する本明細書に記載される細胞の使用を提供する。
ＤＭＤメガヌクレアーゼ認識配列のおおよその位置を提供し、ジストロフィン遺伝子から複数のエクソンを切除するための二重メガヌクレアーゼ手法を示す概略図である。示されるように、ＤＭＤ １９－２０認識配列及びＤＭＤ ３５－３６認識配列、又はＤＭＤ １９－２０認識配列及びＤＭＤ ３７－３８認識配列のいずれかに結合して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対は、ジストロフィン遺伝子からエクソン４５～５５の除去をもたらす。これらの認識配列対はイントロン内に位置し、同一の４塩基対の中心配列を有し、相補的なオーバーハングを有する切断部位を生じさせる。したがって、エクソンの除去後、遺伝子は、エクソン４４とエクソン５６との間に位置するイントロン内にある切断部位でライゲーションされる。転写後スプライシングの後、この遺伝子改変は、エクソン４４をエクソン５６とインフレームで有するジストロフィンｍＲＮＡをもたらし、これはジストロフィン遺伝子リーディングフレームを回復させ、ベッカー型ジストロフィン発現をもたらす。また、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対がＤＭＤ １９－２０認識配列及びＤＭＤ ２９－３０認識配列に結合して切断し、ジストロフィン遺伝子からエクソン４５を除去するおおよその位置も示されている。 本開示の例示的な認識配列を示す概略図であり、ヒトジストロフィン遺伝子内のＤＭＤ １９－２０（配列番号６及び７）、ＤＭＤ ２９－３０（配列番号８及び９）、ＤＭＤ ３５－３６（配列番号１０及び１１）、及びＤＭＤ ３７－３８（配列番号１２及び１３）認識配列のセンス配列及びアンチセンス配列を含む。本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによって標的化される各ＤＭＤ認識配列は、２つの認識半部位を含む。各認識半部位は、４塩基対の中心配列によって分離された９塩基対を含む。例えば、ＤＭＤ １９－２０認識配列は、４塩基対の中心配列ＧＴＡＴを有する５´ＤＭＤ１９半部位及び３´ＤＭＤ２０半部位を有する。 本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは第１の認識半部位（例えば、ＤＭＤ１９）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは第２の認識半部位（例えば、ＤＭＤ２０）に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置され得る。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置され得る。 ＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼの配列のアラインメントを提供する。 ＤＭＤ ３５－３６遺伝子操作メガヌクレアーゼの配列のアラインメントを提供する。 ＤＭＤ ３７－３８遺伝子操作メガヌクレアーゼの配列のアラインメントを提供する。アスタリスクは、すべてのアライメントされたヌクレアーゼの間で保存された残基を示し、スペースは、少なくとも１つのアミノ酸がメガヌクレアーゼの間で異なることを示す。 ジストロフィン遺伝子に見られる認識配列を標的とする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの概略図である。本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼについて、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株を産生した。レポーターカセットは、５´から３´の順序で以下を含んでいた：ＳＶ４０初期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５´２／３；本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６、又はＤＭＤ ３７－３８認識配列）；ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号）；及びＧＦＰ遺伝子の３´２／３。このカセットで安定にトランスフェクトした細胞は、ＤＮＡ切断誘導剤の非存在下でＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの形質導入によって導入した。ＤＮＡ切断がメガヌクレアーゼ認識配列のいずれかで誘導されると、ＧＦＰ遺伝子の重複領域が互いに組み換わり、機能的ＧＦＰ遺伝子が産生された。次いで、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージをフローサイトメトリによって決定することができた。 図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｇは、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで発現されるＤＭＤ １９－２０認識配列に結合して切断するための遺伝子操作されたＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼの効率を提供する。図６Ｃは、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで発現されるＤＭＤ ２９－３０認識配列に結合して切断するための遺伝子操作されたＤＭＤ ２９－３０メガヌクレアーゼの効率を提供する。図６Ｄ及び図６Ｈは、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで発現されるＤＭＤ ３５－３６認識配列に結合して切断するための遺伝子操作されたＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの効率を提供する。図６Ｅ、図６Ｆ及び図６Ｉは、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで発現されるＤＭＤ ３７－３８認識配列に結合して切断するための遺伝子操作されたＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの効率を提供する。相対活性指数は、メガヌクレアーゼの毒性を説明するＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを発現する細胞株に対して正規化された試験メガヌクレアーゼを発現する各細胞株についての％ＧＦＰ陽性細胞を表す。 ＭＲＣ５細胞における２つの用量で示された認識配列を標的とする試験メガヌクレアーゼの挿入及び欠失（インデル）の頻度のパーセンテージを示す棒グラフを示す。各メガヌクレアーゼを、メガヌクレアーゼのトランスフェクション後の３つの時点（２、５、及び８日目）で試験した。図７Ａは、ＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼによる編集のパーセンテージを提供する。図７Ｂは、ＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼによる編集のパーセンテージを提供する。図７Ｃは、ＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼによる編集のパーセンテージを提供する。図７Ｄは、ＤＭＤ ２９－３０メガヌクレアーゼによる編集のパーセンテージを提供する。 図８Ａ及び図８Ｂは、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列に結合して切断するように設計された１対の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによる切断後のジストロフィン遺伝子の完全ライゲーションのためのＰＣＲ産物及び配列決定データを提供する。図８Ａは、相補的なＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列の増幅ライゲーション特異的なプライマーを使用したＰＣＲ産物のゲル画像である。レーン５は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン６は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン７は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン８は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーンＭはモック対照を表す。図８Ｂは、介在ゲノム配列の切断及び切除後のＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼ認識配列の完全ライゲーションのための代表的な配列決定データを提供する。 図９Ａ及び図９Ｂは、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列に結合して切断するように設計された１対の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによる切断後のジストロフィン遺伝子の完全ライゲーションのためのＰＣＲ産物及び配列決定データを提供する。図８Ａは、相補的なＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列の増幅ライゲーション特異的なプライマーを使用したＰＣＲ産物のゲル画像である。レーン９は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン１０は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン１１は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン１２は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン１３は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン１４は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーンＭはモック対照を表す。図９Ｂは、介在ゲノム配列の切断及び切除後のＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼ認識配列の完全ライゲーションのための代表的な配列決定データを提供する。 ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ２９－３０認識配列に結合して切断するように設計された１対の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによる切断後のジストロフィン遺伝子の完全ライゲーションのためのＰＣＲ産物を提供する。相補的なＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ２９－３０認識配列の増幅ライゲーション特異的なプライマーを使用したＰＣＲ産物のゲル画像を示す。レーン１は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン２は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン３は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーン４は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８メガヌクレアーゼの組み合わせを表す。レーンＭはモック対照を表す。 切断後のライゲーション事象を検出するためのデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイで使用されるフォワードプライマー及びリバースプライマー並びに参照及び完全ライゲーションプライマーセットのためのプローブのおおよその位置を示す概略図を提供する。この概略図は、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列を例示する。 ｄｄＰＣＲによって評価される、エクソン４５～５５又はエクソン４５単独の欠失のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。図１２Ａは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３メガヌクレアーゼの組み合わせ、並びにモック対照を有するエクソン欠失データを提供する。図１２Ｂは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９メガヌクレアーゼの組み合わせ、並びにモック対照を有するエクソン欠失データを提供する。図１２Ｃは、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８ メガヌクレアーゼの組み合わせ、並びにモックコントロールを有するエクソン４５単独のエクソン欠失データを提供する。 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのさらなる異なる組み合わせを用いたｄｄＰＣＲによって評価された完全ライゲーション事象の折れ線グラフを提供する。 ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）におけるＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼの対を使用したｄｄＰＣＲによって評価されるエクソン４５～５５の欠失のパーセンテージを示す棒グラフを提供する。ＨＳＭＭ細胞に、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする２０ｎｇ、４０ｎｇ、８０ｎｇ又は１６０ｎｇのｍＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。 ＤＭＤを有する患者由来の不死化筋芽細胞株（ＡＢ１０９８細胞）におけるＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼの対を使用したｄｄＰＣＲによって評価される完全ライゲーションのパーセンテージを示す棒グラフを提供する。ＡＢ１０９８細胞に、各メガヌクレアーゼをコードする１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ、８０ｎｇ又は１６０ｎｇのｍＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。 ＡＢ１０９８細胞における、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼ、又はモック対照の各々をコードする１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ、８０ｎｇ、又は１６０ｎｇのｍＲＮＡのいずれかによる処理後のタンパク質発現データを提供する。図１６Ａは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの組み合わせ又はモック対照による処理後のジストロフィンタンパク質発現を示すグラフである。図１６Ｂは、正しいサイズでの短縮されたジストロフィンタンパク質バンド（すなわち、エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く）のゲル画像を提供する。図１６Ｃは、参照ビンキュリン遺伝子に対するジストロフィンタンパク質の量を提供する。 ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼ、又はモック対照のそれぞれをコードする１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ、８０ｎｇ又は１６０ｎｇのｍＲＮＡでのトランスフェクション後のＡＢ１０９８細胞ｍＲＮＡにおけるエクソン４４からエクソン５６へのＲＮＡスプライシングを示す棒グラフを提供する。 ＨＳＭＭ細胞における遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの示された対を使用するｄｄＰＣＲによって評価される完全ライゲーションのパーセンテージを示す棒グラフを提供する。ＨＳＭＭ細胞に、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする４０ｎｇのｍＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。 遺伝子操作されたヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）のオフターゲット効果を決定するために利用されるオリゴ捕捉アッセイの概略図を提供する。示されるように、インテグレーションカセット又はオリゴは、遺伝子操作されたヌクレアーゼ切断に起因し得るゲノム中の二本鎖切断を伴ってアニーリングする。次いで、ＤＮＡを超音波処理によってせん断し、アダプタをライゲーションし、ＰＣＲ増幅し、続いて配列分析を行って二本鎖切断の位置を決定する。 ＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトされたＤＭＤ １９－２０ｘ．１３、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１、及びＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８メガヌクレアーゼによって誘導されるオフターゲット切断を同定するためのオリゴ（オリゴヌクレオチド）捕捉アッセイの結果を示すグラフを提供する。丸で囲んだドットはオンターゲット部位を示し、丸で囲んでいないドットはオフターゲット部位を示し、Ｘ軸は検出された各オフターゲット部位に対するシーケンシングリードの数を表す。ドットの影は、オンターゲット部位と検出された各オフターゲット部位との塩基対の不一致の数を示す。ドットが列の先頭に近いほど、不一致の数は少なくなる。 ＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトされたＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３６４、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７２、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７、及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９メガヌクレアーゼによって誘導されたオフターゲット切断を同定するためのオリゴ捕捉アッセイの結果を示すグラフを提供する。丸で囲んだドットはオンターゲット部位を示し、丸で囲んでいないドットはオフターゲット部位を示し、Ｘ軸は各オフターゲット部位に対するシーケンシングリードの数を表す。ドットの列の最上部の付近の影は、オンターゲット部位と検出された各オフターゲット部位との塩基対の不一致の数を示す。 示された遺伝子操作ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの対の各々によるＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列の切断後のエクソン４５～５５に隣接するゲノムＤＮＡの全ライゲーションのパーセンテージ（％）を示す棒グラフを提供する。 ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの組み合わせで処理したＡＢ１０９８細胞におけるジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質レベルについて読み出したＷＥＳタンパク質強度を提供する。レーン１はマーカー対照である；レーン２はジストロフィンタンパク質の心臓陽性対照である；レーン３はブランク対照である；レーン４は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン５は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン６は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン７は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５及びＤＭＤ３５－３６Ｌ．３７６メガヌクレアーゼの組み合わせである。レーン８は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン９は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン１０は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン１１は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン１２は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９メガヌクレアーゼの組み合わせである。レーン１３は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン１４は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン１５は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９メガヌクレアーゼの組み合わせである；レーン１６は、ジストロフィンタンパク質の発現を欠くモックＡＢ１０９８細胞株対照である。 示された遺伝子操作ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの対の各々について、ビンキュリンのローディングコントロールに対して正規化されたＷＥＳ分析による短縮された改変ジストロフィンタンパク質レベルを示す棒グラフを提供する。 示された遺伝子操作ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの対の各々によるＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列の切断後のエクソン４５～５５に隣接するゲノムＤＮＡの全ライゲーションのパーセンテージ（％）を示す棒グラフを提供する。 示された遺伝子操作ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの対の各々について、マウス四頭筋組織溶解物の等価ローディングと比較したジストロフィン回復率（％）（その組織から生成された標準曲線に基づく）を示す棒グラフを提供する。 異なる筋肉特異的プロモータの組み合わせを利用するＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５遺伝子操作メガヌクレアーゼの対によるＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列の切断後の筋肉組織におけるエクソン４５～５５に隣接するゲノムＤＮＡの完全ライゲーションのパーセンテージ（％）を示す棒グラフを提供する。図２５Ａは、四頭筋組織における完全ライゲーションのパーセントを示す。図２５Ｂは、心臓組織における完全ライゲーションのパーセントを示す。図２５Ｃは、横隔膜組織における完全ライゲーションのパーセントを示す。図２５Ｄは、ヒラメ筋組織における完全ライゲーションのパーセントを示す。図２５Ｅは、肝臓組織における完全ライゲーションのパーセントを示す。 ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．２１９遺伝子操作メガヌクレアーゼの対によるＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列の切断後の筋肉組織におけるエクソン４５～５５に隣接するゲノムＤＮＡの全ライゲーションのパーセンテージ（％）を示す棒グラフを提供する。図２６Ａは、四頭筋組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２６Ｂは、心臓組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２６Ｃは、横隔膜組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２５Ｄは、ヒラメ筋組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２６Ｅは、肝臓組織における全ライゲーションのパーセントを示す。 総ＡＡＶ量（２ｘ１０１２又は４ｘ１０１２）によって示される２つの異なる投与量レベルでのＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５遺伝子操作メガヌクレアーゼの対によるＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列の切断後の筋肉組織におけるエクソン４５～５５に隣接するゲノムＤＮＡの全ライゲーションのパーセンテージ（％）を示す棒グラフを提供する。図２７Ａは、四頭筋組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２７Ｂは、心臓組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２７Ｃは、横隔膜組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２７Ｄは、前脛骨筋（ＴＡ）組織における全ライゲーションのパーセントを示す。図２７Ｅは、肝臓組織における全ライゲーションのパーセントを示す。 ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼによる処理後のジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質レベルについて読み出したＷＥＳタンパク質強度を提供する。図２８Ａ～図２８Ｃのレーン１～６は、ヒトジストロフィンを発現するマウス由来の全長ヒトジストロフィンのタンパク質バンド強度の標準曲線を表す。レーン７～８は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼの組み合わせを用いて１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇで処置したマウス由来の短縮された改変ジストロフィンのタンパク質バンド強度を表す。レーン９～１０は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼの組み合わせを用いて２ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇで処置したマウス由来の短縮された改変ジストロフィンのタンパク質バンド強度を表す。レーン１１～１２は、ＰＢＳを用いてメガヌクレアーゼを用いずに処置されたマウスを表す。図２８Ａは、心臓組織における示された投与量で検出された改変された短縮ジストロフィンレベルを表す。図２８Ｂは、横隔膜組織において示された投与量で検出された改変された短縮ジストロフィンレベルを表す。図２８Ｃは、四頭筋組織において示された投与量で検出された改変された短縮ジストロフィンレベルを表す。 ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９遺伝子操作メガヌクレアーゼの対によるＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列の切断後の四頭筋、心臓、及び横隔膜筋組織におけるエクソン４５～５５に隣接するゲノムＤＮＡの全ライゲーションのパーセンテージ（％）を示すグラフを提供する。 異なる筋肉特異的プロモータを利用するＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼによる処理後のジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質レベルについて読み出したＷＥＳタンパク質強度を提供する。図３０Ａ～図３０Ｃのレーン１はラダーを表す。レーン２～６は、ヒトジストロフィンを発現するマウス由来の全長ヒトジストロフィンのバンド強度を表す。レーン７は、ＣＫ８筋肉特異的プロモータの制御下で１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇのＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼの組み合わせで処置したマウスにおける短縮された改変ジストロフィンのバンド強度を表す。レーン８は、ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモータの制御下で１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇのＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼの組み合わせで処置したマウスの短縮された改変ジストロフィンのバンド強度を表す。レーン９は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９メガヌクレアーゼがＣＫ８筋肉特異的プロモータの制御下にあり、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼがＳＰｃ５－１２筋肉特異的プロモータの制御下にある、１ｘ１０１４ＶＧ／ｋのＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼの組み合わせで処置した短縮された改変ジストロフィンマウスのバンド強度を表す。レーン１０～１１はＰＢＳで処置したマウスを表す。図３０Ａは、心臓組織における示された投与量で検出された改変された短縮ジストロフィンレベルを表す。図３０９Ｂは、横隔膜組織において示された投与量で検出された改変された短縮ジストロフィンレベルを表す。図３０Ｃは、四頭筋組織において示された投与量で検出された改変された短縮ジストロフィンレベルを表す。 四頭筋（ｑｕａｄ）、心臓、及び横隔膜組織においてＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼ又はＰＢＳで処置したマウスについて、ビンキュリンローディングコントロールに対して正規化したＷＥＳ分析による改変された短縮ジストロフィンタンパク質レベルを示す棒グラフを提供する。 ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼの組み合わせ又はＰＢＳで処置したマウスの四頭筋（ｑｕａｄ）、心臓、及び横隔膜筋組織の免疫組織化学イメージングを提供する。暗染色はヒトジストロフィン検出を表し、これはメガヌクレアーゼの組み合わせで処置したマウスでのみ見られる。 図３３Ａ及び図３３Ｂは、ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ（ｈＤＭＤ）マウスにＡＡＶ９キャプシドを用いて送達されたのＰＢＳ又はＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼ対のいずれかによる処置後のマウス四頭筋組織の蛍光免疫組織化学イメージングを提供する。図３３Ａは、ＰＢＳ処置マウスの四頭筋組織におけるＰａｘ７発現の画像化を提供する。左パネルは、メガヌクレアーゼ発現を検出する一次抗体及び二次抗体による任意のバックグラウンド染色を示す対照画像である。中央パネルは、白い矢じりによって示されるＰａｘ７を発現する細胞を示す。右パネルは、Ｐａｘ７（白い矢じり）及びメガヌクレアーゼ発現を検出する抗体からの任意のバックグラウンド染色の両方を示す。図３３Ｂは、メガヌクレアーゼ処置マウスの四頭筋組織におけるメガヌクレアーゼ及びＰａｘ７発現の画像化を提供する。左パネルは、メガヌクレアーゼタンパク質及びＰａｘ７を発現する細胞を示す全矢印を有する白い矢じりによって示されるメガヌクレアーゼのみを発現する細胞を提供する。中央パネルは、白い矢じりによって示されるＰａｘ７のみを発現する細胞又は全矢印によって示されるＰａｘ７及びメガヌクレアーゼタンパク質を発現する細胞を示す。右パネルは、矢じりで示されるメガヌクレアーゼタンパク質又はＰａｘ７のいずれかを発現する細胞、又は完全な矢印で示されるメガヌクレアーゼタンパク質とＰａｘ７の両方を発現する細胞を示す。 ２つのヌクレアーゼの発現後、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５が欠失されている改変ジストロフィン転写物のｍＲＮＡ発現を検出するために使用されるＢａｓｅＳｃｏｐｅアッセイの概略図を提供する。第１のヌクレアーゼは、エクソン４５のイントロンのすぐ５´に位置する認識配列に結合して切断し、第２のヌクレアーゼは、エクソン５５のイントロンのすぐ３´に位置する認識配列に結合して切断する。示されるように、これらのイントロンに位置する認識配列に結合して切断するヌクレアーゼは、二本鎖切断をもたらし、次いでゲノムの直接の再ライゲーションによって修復される。転写及びスプライシングに続いて、エクソン４４及びエクソン５６が共にスプライシングされたｍＲＮＡが産生される。次いで、このエクソン４４～エクソン５６接合部（Ｅ４４－Ｅ５６接合部として示される）を認識するように設計されたプローブを使用して、筋肉組織切片においてこの改変ヒトジストロフィン転写物を検出する。 図３５Ａ及び図３５Ｂは、ＰＢＳ又はＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼ対のいずれかで処置したｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ（ｈＤＭＤ）マウス由来のマウス四頭筋組織のＢａｓｅＳｃｏｐｅ染色を提供する。図３５Ａは、Ｐａｘ７転写物発現についてのＰＢＳ処置マウス由来の筋肉組織のＢａｓｅＳｃｏｐｅ染色、及び改変ヒトジストロフィン転写物発現を検出するために使用されるプローブについての任意のバックグラウンド染色を示す。図３５Ｂは、Ｐａｘ７転写物発現及び改変ヒトジストロフィン転写物発現のためにＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼ対で処置したマウス由来の筋肉組織のＢａｓｅＳｃｏｐｅ染色を示す。 ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを２０ｎｇ、８０ｎｇ及び１６０ｎｇの用量で増加させた、通常ジストロフィン発現を欠くＫＭ １３２８患者細胞株のエレクトロポレーション後のジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質レベルについて読み出されたＷＥＳタンパク質強度を提供する。レーン１はラダーを表す。レーン２はモック対照を表す；レーン３～５は、２０ｎｇ、８０ｎｇ及び１６０ｎｇのメガヌクレアーゼｍＲＮＡで処理した細胞における短縮された改変ジストロフィンのバンド強度を表す。レーン６は、全長ヒトジストロフィンのバンド強度を表す。 ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを８０ｎｇで用いた、通常ジストロフィンを欠くＡＢ１０９８患者細胞株のエレクトロポレーション後の、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質レベルについて読み出されたＷＥＳタンパク質強度を提供する。レーン１は、全長ヒトジストロフィンのバンド強度を表す。レーン２はモック対照を表す；レーン３は、８０ｎｇのメガヌクレアーゼｍＲＮＡで処理した短縮された改変ジストロフィン細胞のバンド強度を表す。 ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ（ｈＤＭＤ）マウスにＡＡＶｒＨ７４キャプシドを用いて送達されたのＰＢＳ又はＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼ対のいずれかによる処置後のマウス四頭筋組織の蛍光免疫組織化学イメージングを提供する。図３８Ａは、ＰＢＳ処置マウスの四頭筋組織におけるＰａｘ７発現の画像化を提供する。左パネルは、メガヌクレアーゼ発現を検出する一次抗体及び二次抗体による任意のバックグラウンド染色を提供する対照画像である。星印は非特異的バックグラウンド検出を示す。中央パネルは、白い矢じりによって示されるＰａｘ７を発現する細胞を示す。右パネルは、Ｐａｘ７（白い矢じり）及び星印によって示されるメガヌクレアーゼ発現を検出する抗体からの任意のバックグラウンド染色の両方を示す。図３８Ｂは、１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇの投与量でのメガヌクレアーゼ処置マウス由来の四頭筋組織におけるメガヌクレアーゼ及びＰａｘ７発現の画像化を提供する。図３８Ｃは、３ｘ１０１３ＶＧ／ｋｇの投与量でメガヌクレアーゼ処置マウスからの画像化を提供する。図３８Ｄは、１ｘ１０１３ＶＧ／ｋｇの投与量でのメガヌクレアーゼ処置マウスからの画像化を提供する。図３８Ｂ～図３８Ｄの左パネルは、メガヌクレアーゼのみを発現する細胞を提供する。中央パネルはＰａｘ７を発現する細胞を示す；図３８Ｂ～図３８Ｄの右パネルは、メガヌクレアーゼタンパク質又はＰａｘ７のいずれかを発現する細胞、又はメガヌクレアーゼタンパク質とＰａｘ７の両方を発現する細胞を全矢印で示す。星印は非特異的バックグラウンド染色を示す。
配列の簡単な説明
配列番号１は、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、核局在化シグナルのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、野生型ジストロフィンタンパク質ＣＣＤＳ４８０９１．１（遺伝子ＩＤ １７５６）のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く野生型ジストロフィンタンパク質ＣＣＤＳ４８０９１．１（遺伝子ＩＤ １７５６）のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＤＭＤ １９－２０認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号７は、ＤＭＤ １９－２０認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号８は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号９は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１０は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１１は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１２は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１３は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１４は、ＤＭＤ １９－２０認識配列の第１の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１５は、ＤＭＤ １９－２０認識配列の第１の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１６は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列の第１の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１７は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列の第１の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１８は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列の第１の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１９は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列の第１の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２０は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列の第１の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２１は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列の第１の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２２は、ＤＭＤ １９－２０認識配列の第２の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２３は、ＤＭＤ １９－２０認識配列の第２の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２４は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列の第２の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２５は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列の第２の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２６は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列の第２の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２７は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列の第２の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２８は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列の第２の半部位センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２９は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列の第２の半部位アンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３０は、ライゲーションされたハイブリッドＤＭＤ １９－２０／２９－３０センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３１は、ライゲーションされたハイブリッドＤＭＤ １９－２０／２９－３０センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３２は、ライゲーションされたハイブリッドＤＭＤ １９－２０／３５－３６センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３３は、ライゲーションされたハイブリッドＤＭＤ １９－２０／３５－３６センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３４は、ライゲーションされたハイブリッドＤＭＤ １９－２０／３７－３８センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３５は、ライゲーションされたハイブリッドＤＭＤ １９－２０／３７－３８センス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３６は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４７は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．４７８遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５１２遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５２８遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号６１は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号６２は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号６４は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号６４は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号６５は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４遺伝子操作メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号６６は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５遺伝子操作メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号６７は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１遺伝子操作メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号６８は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８遺伝子操作メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号６９は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７０は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７１は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７２は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７３は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７４は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７５は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７６は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７７は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７８は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号７９は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号８０は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号８１は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．４７８遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号８２は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５１２遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号８３は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５２８遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を示す。
配列番号８４は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８５は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８６は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８７は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８８は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８９は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９０は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９１は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９２は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ１９結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９３は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９４は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９５は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９６は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９７は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９８は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号９９は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１００は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０１は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０２は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０３は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０４は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０５は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．４７８遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０６は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５１２遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０７は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５２８遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３７結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０８は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０９は、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１０は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１１は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１２は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１３は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１４は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１５は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１６は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ２０結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１７は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１８は、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１９は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２０は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２１は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２２は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２３は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４は、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２５は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２６は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２７は、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２８は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２９は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．４７８遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３０は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５１２遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３１は、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５２８遺伝子操作メガヌクレアーゼＤＭＤ３８結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３２は、リンカー配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３３は、ＤＭＤ １９－２０認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１３４は、ＤＭＤ １９－２０認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１３５は、ＤＭＤ １９－２０認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１３６は、インデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイにおいて参照として使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１３７は、インデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイにおいて参照として使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１３８は、インデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイにおいて参照として使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１３９は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１４０は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４１は、ＤＭＤ ３７－３８認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４２は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１４３は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４４は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４５は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１４６は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４７は、ＤＭＤ ２９－３０認識配列でインデルを検出するためのｄｄＰＣＲアッセイで使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４８は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１４９は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５０は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５１は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５２は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５３は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５４は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５５は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５６は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５７は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５８は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１５９は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列のＰＣＲ増幅アッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６０は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列に対するｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１６１は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列のｄｄＰＣＲアッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６２は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８のライゲーションされた認識配列のｄｄＰＣＲアッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６３は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列に対するｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１６４は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列のｄｄＰＣＲアッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６５は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６のライゲーションされた認識配列のｄｄＰＣＲアッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６６は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列に対するｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプローブの核酸配列を示す。
配列番号１６７は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列のｄｄＰＣＲアッセイに使用されるフォワードＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６８は、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０のライゲーションされた認識配列のｄｄＰＣＲアッセイに使用されるリバースＰＣＲプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１６９は、Ｃ５－１２プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７０は、マウスＭＣＫプロモータ及びエンハンサ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７１は、ヒトＭＣＫプロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７２は、野生型ＭＣＫエンハンサ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７３は、改変ＭＣＫエンハンサ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７４は、ｓｐｃ ５－１２プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７５は、ＭＨＣＫ７プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７６は、ＣＫ８プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７７は、ＳＫ－ＣＲＭ４プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７８は、ＳＰ－３０１プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１７９は、ＳＰ－８１７プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１８０は、ＳＰ－９０５プロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１８１は、筋肉ハイブリッドプロモータ配列の核酸配列を示す。
配列番号１８２は、ｒｈ．７４ ＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８３は、ＡＡＶ９キャプシドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８４は、フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１８５は、リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１８６は、プローブの核酸配列を示す。
配列番号１８７は、フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１８８は、リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１８９は、プローブの核酸配列を示す。
配列番号１９０は、フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１９１は、リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号１９２は、プローブの核酸配列を示す。
配列番号１９３は、リバースプライマーの核酸配列を示す。
発明の詳細な説明
１．１ 参照及び定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して示された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱するものではない。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１つ又は１つよりも多くを意味することができる。例えば、「ａ」細胞は、単一の細胞又は複数の細胞を意味し得る。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「又は」という単語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか／又は」の排他的な意味では使用されない。
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在する又は遺伝子操作された酵素を指すために交換可能に使用される。遺伝子操作されたヌクレアーゼには、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ、及びメガＴＡＬが含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、その切断部位にオーバーハングを生成することができる任意の遺伝子操作されたヌクレアーゼが想定される。
本明細書で使用される場合、「切断する」又は「切断」という用語は、本明細書で「切断部位」と呼ばれる、標的配列内の二本鎖切断をもたらす標的配列内の認識配列の骨格内のホスホジエステル結合の加水分解を指す。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）に由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、又は二量体化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩに対して改変されたＩ－ＣｒｅＩの遺伝子操作されたバリアントを指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのそのような改変されたバリアントを産生するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２００７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに結合されている「単鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の標的細胞で発現させた場合に実質的に非毒性であり、したがって、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合、細胞生存率への有害な影響又はメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下を観察することなく、細胞をトランスフェクトし、３７℃で維持できる。
本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一ではないＤＮＡ配列に結合する。したがって、単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリンドローム又は非パリンドローム認識配列を切断する。単鎖メガヌクレアーゼは、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがあるが、実際には二量体ではない。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体又は単鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有していてもよく、又はいかなる天然タンパク質にも見られない人工配列であってもよい。リンカーはフレキシブルであり、二次構造を欠いていてもよく、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーは、制限されずに米国特許第８，４４５，２５１号、第９，３４０，７７７号、第９，４３４，９３１号及び第１０，０４１，０５３号に包含されるものを含むことができ、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３６～５９のいずれか１つの残基１５４～１９５を示す、配列番号１３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関して「組換え」又は「遺伝子操作」という用語は、タンパク質をコードする核酸及びタンパク質を発現する細胞又は生物への遺伝子工学技術の適用の結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」又は「遺伝子操作」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果として変更された核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術；トランスフェクション、形質転換及び他の遺伝子導入技術；相同組換え；部位特異的突然変異誘発；及び遺伝子融合が含まれるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換え又は遺伝子操作されていると見なされない。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する、同じタイプの遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を指す。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列（複数可）と比較して１つ又は複数の突然変異及び／又は置換を含む突然変異体又はバリアントの対立遺伝子及びポリペプチドとは区別可能である。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは生物において正常な表現型を付与することができるが、突然変異体又はバリアントの対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼ又は天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、及び／又は対象、又は比較目的で使用される細胞、生物、及び/又は対象を指すことができる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が（又はその先祖において）、組換え技術によって意図的に改変されている細胞又は生物を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、「トランスジェニック」という用語を包含する。
本明細書で使用される場合、組換えタンパク質に関する用語「改変」は、参照配列（例えば、野生型配列又は天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、又は置換を意味する。
本明細書で使用される場合、「認識配列」又は「認識部位」という用語は、ヌクレアーゼによって結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された逆位９塩基対の「半部位」の対を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１の半部位と接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２の半部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３´オーバーハングを生じる。「オーバーハング」又は「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって産生され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼ及び単鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。
本明細書で使用される場合、「標的部位」又は「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」という用語は、ヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計的に有意なパーセント変化だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化した」結合親和性を有する。
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、ヌクレアーゼが認識配列と呼ばれる塩基対の特定の配列でのみ、又は認識配列の特定のセットでのみ二本鎖ＤＮＡ分子に結合して切断する能力を意味する。認識配列のセットは、特定の保存された位置又は配列モチーフを共有するが、１つ又は複数の位置で縮重することができる。高度に特異的なヌクレアーゼは、１つのみ又はごく少数の認識配列を切断することができる。特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ジストロフィン遺伝子」という用語は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ １７５６に関連する遺伝子、並びにその天然バリアントを指す。「ジストロフィン」という用語は、ジストロフィン遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。筋肉細胞及び筋肉前駆細胞において発現されるジストロフィンアイソフォームは、Ｄｐ ４２７ｍジストロフィンバリアントとして知られている。全長の野生型Ｄｐ４２７ｍジストロフィンポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００４００６．３及びＮＰ＿００３９９７．２は、それぞれジストロフィンＤｐ４２７ｍ ｍＲＮＡ及びポリペプチドを示す。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、ジストロフィン遺伝子は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ対で編集され、エクソン４５～５５の切除及びその後のジストロフィン遺伝子の完全ライゲーションをもたらす。野生型ジストロフィン遺伝子からのエクソン４５～５５の除去は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むジストロフィンポリペプチドをもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「完全ライゲーション」という用語は、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対による切断後のジストロフィン遺伝子内の第１の切断部位の３´オーバーハングの４つすべての塩基と第２の切断部位の相補的３´オーバーハングの４つすべての塩基とのライゲーション（すなわち、アニーリング）を指す。開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによって標的化される認識配列は、第１及び第２の切断部位が相補的な４塩基対の３´オーバーハングを有するように、同一の４塩基対の中心配列（例えば、ＧＴＡＴ）を有する。したがって、第１の３´オーバーハングの各塩基対が、第２の３´オーバーハング上のその相補塩基対と対合し、ＤＮＡリガーゼ酵素を介してライゲーションが起こる。そのような完全ライゲーションから生じる配列の例を、配列番号３２（すなわち、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列の完全ライゲーション）及び配列番号３４（すなわち、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列の完全ライゲーション）に示す。
本明細書で使用される場合、「ベッカー型筋ジストロフィ表現型」という用語は、ＤＭＤと比較してそれほど重症でない形態の筋ジストロフィを指す。ベッカー型筋ジストロフィを有する個体は、依然としてジストロフィン遺伝子内に突然変異を含むが、ＤＭＤを有する個体と比較してより機能的なジストロフィンタンパク質を筋肉細胞（例えば、筋肉前駆細胞、骨格筋細胞及び心筋細胞）に発現し、一般により良好な臨床予後をもたらす。
本明細書で使用される場合、「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、修復テンプレートとして相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－７６を参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列又は細胞に送達された外因性核酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）を参照）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は間違いを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の鋳型なしの付加又は欠失を頻繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列での切断は、標的認識部位でＮＨＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導性切断とそれに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊するフレームシフト突然変異などの突然変異をコード配列に導入することができる。したがって、遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞集団中の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。
本明細書で使用される場合、「相同アーム」又は「ヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列に相同な配列」という用語は、ヌクレアーゼによって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する、核酸分子の５´及び３´末端に隣接する配列を指す。一般に、相同アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、最大２０００塩基対又はそれよりも長くてもよく、ゲノム中のそれらの対応する配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又はそれよりも高い配列相同性を有することができる。いくつかの実施形態では、相同アームは、約５００塩基対である。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に関して、「パーセント同一性」、「配列同一性」、「パーセンテージ類似性」、「配列類似性」などの用語は、アライメントされたアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大にし、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、合計の残基又はヌクレオチドの数、並びに配列アラインメントにおけるギャップの存在及び長さの関数である、配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するために、様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方とも国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能であり（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０；Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについて以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝－１１；ギャップ伸長ペナルティ＝－１；スコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについて以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペナルティ＝－５；ギャップ伸長ペナルティ＝－２；マッチ報酬＝１；不一致ペナルティ＝－３である。
本明細書で使用される場合、２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関する「に対応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の改変が第２のタンパク質の改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び２つのタンパク質が標準的な配列アラインメントに（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）供される場合、第１のタンパク質の改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するかアライメントされることを示すために使用される。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、残基Ｘ及びＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、Ｘ及びＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。
本明細書で使用される場合、「認識半部位」、「認識配列半部位」又は単に「半部位」という用語は、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼのモノマーによって、又は単鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって、又は単鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識及び結合される二本鎖ＤＮＡ分子内の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニット内の局在配列を指す。超可変領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、又は好ましくは約５６個の残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号３６～５９のいずれか１つの２４～７９位又は２１５～２７０位に対応し得る。超可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１つ又は複数の残基を含むことができ、モノマー又はサブユニットの塩基選択性を変更するように改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合する場合にＤＮＡ骨格に結合する１つ又は複数の残基を含むことができる。そのような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変更するように改変することができる。本発明の異なる実施形態では、超可変領域は、可変性を示し塩基選択性及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる１～２０残基を含み得る。特定の実施形態では、超可変領域は、可変性を示し塩基選択性及び/又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる約１５～２０残基を含む。いくつかの実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号３６～５９のいずれか１つの位置２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７のうちの１つ又は複数に対応する。特定の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号３６～５９のいずれか１つの残基４８、５０、及び７１～７３にさらに対応し得る。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号３６～５９のいずれか１つの位置２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２５９、２６１、２６２、２６３、２６４、２６６、及び２６８のうちの１つ又は複数に対応する。特定の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号３６～５９のいずれか１つの残基２３９、２４１、及び２６３～２６５にさらに対応し得る。
ジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡレベルの文脈における「増加」という用語は、参照レベル又は対照と比較した場合の、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又はそれを超えるジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡ発現の増加を含む、参照レベルと比較したジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡ発現のレベルの任意の増加を指す。いくつかの実施形態では、ジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡレベルの増加は、野生型ジストロフィンポリペプチド又は遺伝子と比較して、短縮されたジストロフィンポリペプチド又はｍＲＮＡ転写物の増加、例えば、少なくとも１つのエクソンによってコードされるポリペプチドの一部（例えば、エクソン４５～５５によってコードされる部分）が欠損していること、又はエクソン４５～５５に対応するｍＲＮＡの一部が欠損していることを指す。
本明細書で使用される場合、ジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡレベルの文脈における「参照レベル」という用語は、例えば、対照細胞、対照細胞集団又は対照対象において、対照細胞、対照細胞集団又は処置を受けている対象における以前の時点で測定されるジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡのレベル（例えば、対照細胞、対照細胞集団又は対象から得られる投与前ベースラインレベル）、又はジストロフィンタンパク質又はｍＲＮＡの予め定義された閾値レベル（例えば、以前の実験を通して特定された閾値レベル）を指す。
本明細書で使用される場合、「対照」又は「対照細胞」という用語は、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子改変細胞をもたらした遺伝子改変のための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構築物で（すなわち、目的の形質に既知の影響を及ぼさない構築物を用いて）形質転換された細胞；又は（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型若しくは表現型の発現を誘導する条件若しくは刺激又はさらなる遺伝子改変に曝露されていない細胞を含み得る。対照対象は、例えば：野生型対象、すなわち、遺伝子改変対象をもたらした遺伝子変更のための出発対象と同じ遺伝子型の野生型対象（例えば、ジストロフィン遺伝子に同じ突然変異を有する対象）であって、対象において変化した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する条件又は刺激又はさらなる遺伝子改変に曝露されていない野生型対象を含み得る。
本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、天然には一緒に見られない調節配列及びコード配列を含むがこれらに限定されない核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、天然に見られるものとは異なる様式で配置された調節配列及びコード配列を含み得る。そのような構築物は、単独で使用されてもよく、又はベクターと組み合わせて使用されてもよい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」という用語は、所与の宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、限定されないが、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターが挙げられ得る。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択及び増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝的エレメントを十分に認識している。いくつかの実施形態では、「ベクター」はウイルスベクターも指す。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びＡＡＶが含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のエレメント間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼをコードする核酸配列と調節配列（例えば、プロモータ）との間の作動可能な連結は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結されたエレメントは、連続していても不連続であってもよい。２つのタンパク質コード領域の連結を指すために使用される場合、作動可能に連結されることは、コード領域が同じリーディングフレーム内にあることを意図する。
本明細書で使用される場合、「処置」又は「対象を処置する」という用語は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ若しくはポリヌクレオチドの対を、対象のジストロフィンタンパク質のレベルを増加させる目的で、ＤＭＤを有する対象に投与することを指す。いくつかの実施形態では、ジストロフィンタンパク質の短縮型（例えば、複数のエクソンによってコードされるアミノ酸が欠損している）の発現が増加する。いくつかの実施形態では、エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠くバージョンのジストロフィンタンパク質の発現が増加する。そのような処置は、いくつかの実施形態では、ＤＭＤ表現型をベッカー異栄養性表現型に移行させる。
本明細書で使用される場合、「ｇｃ／ｋｇ」又は「遺伝子コピー／キログラム」という用語は、核酸配列を含むポリヌクレオチドが投与される対象のキログラム単位の重量当たりの、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列のコピー数を指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益又は望ましい生物学的及び／又は臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤又は組成物、疾患及びその重症度、並びに処置される対象の年齢、体重、体調及び応答性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ若しくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対、又はそれをコードするポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドの対、又は本明細書に開示される医薬組成物は、ジストロフィンタンパク質（例えば、エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く短縮させたジストロフィンタンパク質）の発現レベルを増加させ、ＤＭＤに関連する少なくとも１つの症候を改善する。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という用語は、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する典型的には球形の構造を有する脂質組成物を指す。いくつかの製剤では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つのコンジュゲート脂質を含むことができる。ｍＲＮＡなどの核酸を封入するのに適した当技術分野で公知の脂質ナノ粒子が、本発明における使用のために企図される。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で本開示が実施され得ることを伝えることを意図している。したがって、本質的に離散的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。一例として、限定ではないが、０と２との間の値を有すると記載されている変数は、その変数が本質的に離散的である場合、０、１又は２の値をとることができ、その変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、又は０以上２以下の任意の他の実数値をとることができる。
２．１ 発明の原理
本開示は、一部には、ＤＭＤ表現型を生じさせるジストロフィン遺伝子における特定の欠失が、エンドヌクレアーゼの対を利用して、遺伝子内の正常なリーディングフレームを回復させるためにジストロフィン遺伝子内のエクソンを戦略的に欠失させることによって補償され得るという仮説に基づく。ＤＭＤ－Ｌｅｉｄｅｎデータベースは、ＤＭＤを引き起こす突然変異のほとんどが、リーディングフレームのシフトを引き起こす１つ又は複数の全エクソンの欠失であることを示す。多くの場合、突然変異の直前又は直後のエクソンを除去することによって、リーディングフレームを回復させることができる。表３に示されるように、患者の約６５％を占める２９の異なるデュシェンヌを引き起こす突然変異は、突然変異に隣接する単一エクソンを欠失させることによって補償することができる。
Figure 0007642809000005
例えば、エクソン４５の欠失に起因する疾患を有する患者は、患者の約７％で起こり、エクソン４６を欠失させる治療薬で処置することができる。エクソン５１又はエクソン４５を欠失させることができる治療薬は、それぞれ患者の１５％及び１３％を処置するために使用され得る。
特に、ジストロフィン遺伝子内の全てのＤＭＤ関連突然変異の５０％超がエクソン４５～５５に包含される。したがって、本発明の特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５は、遺伝子の正常なリーディングフレームを回復するために除去される。本明細書に開示されるように、エクソン除去は、エクソン４５の上流及びエクソン５５の下流のイントロンに一対の切断部位を生成する筋肉細胞又は筋肉前駆細胞（例えば、心筋細胞又は骨格筋細胞）における遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ対の発現によって達成され、介在ゲノム領域の切除を可能にする。このアプローチに続いて、遺伝子改変細胞（例えば、処置された対象における筋肉細胞）は、マイクロジストロフィン導入遺伝子を発現する必要なしに、マイクロジストロフィンアプローチに類似するベッカー表現型からある量の短縮されたジストロフィンタンパク質を作製することができる。この短縮されたジストロフィンは、多連続処置レジメンを必要とする他の治療法とは異なり、疾患を永続的に救済するのに十分であり得る。
したがって、単一の処置が、対象における細胞のあるパーセンテージからエクソンを永久的に欠失させることが想定される。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、筋芽細胞（すなわち、筋肉細胞）又は複製し、機能的（又は半機能的）ジストロフィンを発現する筋線維全体を生じさせることができる他の筋肉前駆細胞である。しかし、エクソン欠失の頻度が低い場合、各患者に対して複数回の処置を行う必要があり得る。
２．２ ジストロフィン遺伝子内の認識配列に結合して切断するメガヌクレアーゼ
認識配列
部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノム内でＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断は、変異原性ＮＨＥＪ修復を介して、又はトランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永久的な改変をもたらし得ることが当技術分野で公知である。ＮＨＥＪは、切断部位で突然変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化を生じさせ得る。ＮＨＥＪ関連突然変異誘発は、初期終止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を産生するフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、又はナンセンス媒介ｍＲＮＡ分解などの機構を誘因し得る。ＮＨＥＪを介して突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、野生型対立遺伝子に存在する特定の突然変異又は配列を標的とするために使用することができる。さらに、標的遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因性ポリヌクレオチドを標的遺伝子座に挿入することができる。そのような外因性ポリヌクレオチドは、目的の任意の配列又はポリペプチドをコードすることができる。
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＤＭＤ １９－２０認識配列（配列番号６）、ＤＭＤ ３５－３６認識配列（配列番号１０）、又はＤＭＤ ３７－３８認識配列（配列番号１２）に結合して切断するように設計されている。ＤＭＤ １９－２０認識配列に結合して切断する例示的なメガヌクレアーゼは、配列番号３６～４４に提供されている。ＤＭＤ ３５－３６認識配列に結合して切断する例示的なメガヌクレアーゼは、配列番号４５～５２に提供されている。ＤＭＤ ３７－３８認識配列に結合して切断する例示的なメガヌクレアーゼは、配列番号５３～５９に提供されている。各認識配列の配列、及び本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによって切断された場合に生じる４つの塩基対３´オーバーハングは、以下の表４に提供される。
Figure 0007642809000006
本開示によるジストロフィン遺伝子を改変するために、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対を同じ細胞内で一緒に利用する。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対は、エクソン４５の上流のイントロンに第１の切断部位を生成し、エクソン５５の下流のイントロンに第２の切断部位を生成するように設計され、介在ゲノム配列の除去を可能にした。驚くべきことに、サイズが５００，０００ｂｐを超えるジストロフィン遺伝子からのこのゲノム領域の切除が高効率で達成され得ることが観察された。さらに、メガヌクレアーゼ認識配列は、切断後に相補的な４塩基対の３´オーバーハングを有するように選択され、ジストロフィン遺伝子は、２つの切断部位の３´オーバーハングの完全ライゲーションによって高頻度で修復され得ることが観察された。本明細書で企図されるそのような完全にライゲーションされた認識配列は、以下の表５に提供される。
Figure 0007642809000007
これらの認識配列は、転写後改変細胞プロセス中に通常スプライシングされるイントロン配列内にあるようにさらに選択される。これは、ジストロフィン遺伝子及びコードされるポリペプチドに突然変異が導入される可能性を低下させる。
例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットと、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットとを含む。さらに、第１のサブユニットは、認識配列中の第１の認識半部位に結合し（例えば、ＤＭＤ １９半部位）、第２のサブユニットは、認識配列中の第２の認識半部位（例えば、ＤＭＤ ２０半部位）に結合する。
特定の実施形態では、本発明を実施するために使用されるメガヌクレアーゼは、単鎖メガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって連結されたＮ末端サブユニット及びＣ末端サブユニット（すなわち、上記の第１及び第２のサブユニット）を含む。２つのサブユニットの各々は、認識配列の半部位を認識して結合し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央にある。論じられるように、ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一対の４塩基対の３´一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によって相殺される。
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが単鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１及び第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置されるように配向され得る。代替の実施形態では、第１及び第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置されるように配向され得る。
本発明の例示的なＤＭＤメガヌクレアーゼを配列番号３６～５９に提供し、以下の表６～８に要約する。
Figure 0007642809000008
「ＤＭＤ１９サブユニット％」及び「ＤＭＤ２０サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＤＭＤ１９結合及びＤＭＤ２０結合サブユニット領域と、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３メガヌクレアーゼのそれぞれＤＭＤ１９結合及びＤＭＤ２０結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
Figure 0007642809000009
「ＤＭＤ３５サブユニット％」及び「ＤＭＤ３６サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＤＭＤ３５結合及びＤＭＤ３６結合サブユニット領域と、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３メガヌクレアーゼのそれぞれＤＭＤ３５結合及びＤＭＤ３６結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
Figure 0007642809000010
「ＤＭＤ３７サブユニット％」及び「ＤＭＤ３８サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＤＭＤ３７結合及びＤＭＤ３８結合サブユニット領域と、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼのそれぞれＤＭＤ３７結合及びＤＭＤ３８結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ジストロフィン遺伝子内の配列番号６を含む認識配列（すなわち、ＤＭＤ １９－２０認識配列）に結合して切断し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが、認識配列の第１の認識半部位に結合し、ＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットが、認識配列の第２の認識半部位に結合し、ＨＶＲ２領域を含む。例示的なＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼを以下に記載する。
ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３（配列番号３６）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３６の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３６の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３６の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３６の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３６の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３６の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３６の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３６の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５０に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５０に示されるの核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７（配列番号３７）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３７の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３７の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３７の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３７の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３７の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３７の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３７の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３７の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３７の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３７の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３７の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３７の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３７の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３７の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３７の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３７の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３７の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１に示される核配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９（配列番号３８）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３８の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３８の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３８の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３８の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３８の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３８の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３８の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３８の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３８の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３８の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３８の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３８の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３８の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３８の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３８の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５２に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５２に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２（配列番号３９）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３９の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３９の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３９の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３９の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３９の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３９の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３９の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３９の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３９の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３９の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３９の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２３６に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号３９の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３９の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３９の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３９の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３９の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３９の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号３９の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３９の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５３に示される核配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５３に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９（配列番号４０）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４０の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４０の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４０の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４０の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４０の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４０の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４０の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５４に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５４に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４（配列番号４１）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４１の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４０の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４１の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４１の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４１の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４１の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４１の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４１の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４１の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４１の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４１の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４１の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４１の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４１の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４１の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４１の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４１の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４１の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４１の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４１の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４１の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６５に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６５に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５（配列番号４２）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４２の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４２の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４２の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４２の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４２の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４２の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４２の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４２の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４２の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４２の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４２の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４２の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４２の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４２の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４２の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４２の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４２の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４２の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４２の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４２の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４２の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６６に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６６に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１（配列番号４３）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４３の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４３の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４３の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４３の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４３の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４３の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４３の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４３の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４３の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４３の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４３の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４３の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４３の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４３の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４３の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４３の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４３の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４３の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４３の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４３の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４３の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４３の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４３の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６７に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６７に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８（配列番号４４）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４４の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４４の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４４の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４４の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４４の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４４の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４４の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４４の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４４の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４４の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４４の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４４の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４４の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４４の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４４の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４４の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４４の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４４の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４４の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４４の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６８に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６８に示される核酸配列によってコードされる。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ジストロフィン遺伝子内の配列番号１０を含む認識配列（すなわち、ＤＭＤ ３５－３６認識配列）に結合して切断し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットが、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。例示的なＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼを以下に記載する。
ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３（配列番号４５）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４５の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４５の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４５の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４５の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２５０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４５の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４５の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４５の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４５の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６９に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６９に示されるの核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１（配列番号４６）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４６の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４６の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４６の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４６の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４６の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４６の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４６の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４６の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４６の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４６の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４６の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４６の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４６の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４６の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４６の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４６の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４６の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４６の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４６の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７０に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７０に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５（配列番号４７）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４７の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４７の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４７の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４７の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４７の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４７の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４７の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４７の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４７の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４７の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４７の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４７の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４７の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４７の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４７の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４７の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４７の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４７の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７１に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７１に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２（配列番号４８）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４８の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４８の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４８の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４８の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４８の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４８の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４８の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４８の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４８の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４８の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４８の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４８の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４８の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４８の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４８の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４８の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４８の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４８の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７２に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７２に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９（配列番号４９）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４９の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４９の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４９の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４９の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４９の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４９の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４９の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４９の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４９の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４９の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４９の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号４９の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４９の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４９の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４９の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４９の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４９の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号４９の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４９の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７３に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７３に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６（配列番号５０）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５０の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５０の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５０の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５０の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５０の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５０の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５０の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５０の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５０の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５０の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５０の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５０の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５０の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５０の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５０の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５０の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５０の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５０の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５０の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５０の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５０の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７４に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７４に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７（配列番号５１）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５１の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５１の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５１の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５１の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５１の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５１の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５１の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５１の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５１の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５１の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５１の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５１の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５１の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５１の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５１の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５１の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５１の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５１の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５１の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７５に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７５に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９（配列番号５２）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５２の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５２の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５２の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５２の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５２の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５２の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５２の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５２の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７６に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７６に示される核酸配列によってコードされる。
本発明の特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ジストロフィン遺伝子内の配列番号１２を含む認識配列（すなわち、ＤＭＤ ３７－３８認識配列）に結合して切断し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットが、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。例示的なＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼを以下に記載する。
ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５（配列番号５３）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５３の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５３の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５３の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５３の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５３の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５３の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５３の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５３の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７７に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７７に示される核配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６（配列番号５４）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５４の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５４の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５４の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５４の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５４の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５４の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５４の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５４の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５４の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５４の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５４の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５４の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５４の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５４の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５４の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５４の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５４の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７８に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７８に示される核配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９（配列番号５５）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５５の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５５の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５５の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５５の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５５の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５５の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５５の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５５の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５５の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５５の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５５の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２３９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２５５に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５５の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５５の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５５の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５５の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５５の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５５の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５５の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５５の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５５の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７９に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７９に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６（配列番号５６）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５６の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５６の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５６の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５６の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５６の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５６の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５６の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５６の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５６の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５６の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５６の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５６の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５６の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５６の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５６の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５６の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５６の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５６の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５６の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８０に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８０に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．４７８（配列番号５７）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５７の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５７の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５７の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５７の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５７の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５７の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５７の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５７の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５７の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５７の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５７の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５７の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５７の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５７の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５７の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５７の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５７の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５７の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５７の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８１に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８１に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５１２（配列番号５８）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５８の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５８の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５８の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５８の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５８の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５８の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５８の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５８の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５８の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５８の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５８の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５８の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５８の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５８の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５８の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５８の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５８の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５８の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５８の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８２に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８２に示される核酸配列によってコードされる。
ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５２８（配列番号５９）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５９の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５９の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５９の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５９の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５９の残基７～１５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５９の残基１９に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５９の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５９の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５９の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５９の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する１つ又は複数の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ又はＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１までのアミノ酸置換を有する配列番号５９の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５９の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５９の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５９の残基２１０に対応する残基にＧ、Ｓ又はＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５９の残基２７１に対応する残基にＥ、Ｑ、又はＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５９の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５９の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個までのアミノ酸置換を有する配列番号５９の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５９の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む単鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８３に示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも高い配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８３に示される核酸配列によってコードされる。
２．３ 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを送達及び発現させる方法
異なる態様では、本発明は、細胞のジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）内の認識配列に結合して切断するのに有用な本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを使用して細胞中のジストロフィン遺伝子を改変するための様々な方法、改変ジストロフィン遺伝子を含む遺伝子改変細胞を作製するための方法、及び対象の標的細胞中のジストロフィン遺伝子を改変する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを、場合によっては医薬組成物の一部として、対象に投与することによって、対象のＤＭＤを処置する方法を提供する。
それぞれの場合において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又はそれをコードするポリヌクレオチドが、ジストロフィンタンパク質を発現することができる筋肉細胞又は筋肉前駆細胞などの細胞に導入されることが想定される。本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして細胞に送達され得る。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ（例えば、環状又は線状プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、又はウイルスゲノム）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。
検出及び発現
遺伝子改変された細胞又は対象における改変ジストロフィン（すなわち、エクソン４５～５５を欠く遺伝子、又はエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠くタンパク質）の発現は、当技術分野における標準的な方法を用いて検出することができる。例えば、そのような改変ジストロフィンのレベルは、ジストロフィン遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、例えばジストロフィンｍＲＮＡレベル又はジストロフィンタンパク質レベルに基づいて評価され得る。このような改変ジストロフィンのレベル又は発現の増加は、参照レベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対レベル又は相対レベルの増加によって評価され得る。そのような改変ジストロフィンレベルは、組織生検又は血液、血清、血漿、脳脊髄液若しくは尿を含む体液などの対象から単離された生物学的試料で測定され得る。任意に、そのような改変ジストロフィンレベルは、試料中の標準的なタンパク質又は物質に対して正規化される。さらに、そのような改変ジストロフィンレベルは、本明細書の方法に従って、処置前、処置中、又は処置後の任意の時点で評価することができる。
様々な態様では、本明細書に記載される方法は、遺伝子改変された細胞、標的細胞又は対象中の改変ジストロフィン（すなわち、エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く）のタンパク質レベルを（例えば、対象から得られた細胞、組織、器官、又は生物学的試料で測定）、参照レベル（すなわち、野生型細胞又は対象におけるジストロフィンのタンパク質レベル）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、又はそれよりも高くに増加させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書中の方法は、かかる改変ジストロフィンタンパク質のレベルを、ジストロフィンの参照レベル（すなわち、野生型細胞又は対象におけるジストロフィンのタンパク質レベル）の約１０％～約１００％（例えば、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、又はそれよりも高く）に上昇させるのに有効である。
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの細胞への導入
本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、又はそれをコードするポリヌクレオチドは、本明細書で以下にさらに詳述するものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によってゲノムＤＮＡを切断するために細胞に送達され得る。
本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドとして細胞に送達され得る。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ（例えば、環状又は線状プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、又はウイルスゲノム）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結されるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１：６５９－６３）又はＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ＆Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－１０）などの構成的プロモータ、並びにテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４０３８－４５）などの誘導性プロモータが含まれる。本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、限定されないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を挙げることができる。
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列は、筋肉特異的プロモータなどの組織特異的プロモータに作動可能に連結される。いくつかの特定の実施形態では、プロモータは、筋肉前駆細胞（例えば、サテライト細胞又は幹細胞）において本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現することができる。例示的かつ非限定的な筋肉プロモータには、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６－８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が含まれる。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１６９～１８１のいずれか１つによる配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１６９を含むＣ５－１２プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７０を含むマウスＭＣＫプロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７１を含むヒトＭＣＫプロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７２を含むＭＣＫエンハンサと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７３を含む改変ＭＣＫエンハンサと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７４を含むｓｐｃ ５－１２プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７５を含むＭＨＣＫ７プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７６を含むＣＫ８プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７７を含むＳＫ－ＣＲＭ４プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７８を含むＳＰ－３０１プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７９を含むＳＰ－８１７プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１８０を含むＳＰ－９０５プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１８１を含む筋肉ハイブリッドプロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。
単一のポリヌクレオチドが、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする２つの別個の核酸配列を含むいくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子は、２つの別個のプロモータに作動可能に連結されている。代替的な実施形態では、２つのメガヌクレアーゼ遺伝子は、単一のプロモータに作動可能に連結され、いくつかの例では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチド配列によって分離され得る（Ｓｚｙｍｃｚａｋ＆Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：６２７－３８）。そのような２Ａペプチド配列としては、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ配列を挙げることができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ構築物又は発現カセット上で送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及び本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現カセット（すなわち、「カセット」）を含むことができる。
別の特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。一本鎖ＤＮＡは、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５´及び／又は３´ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５´及び／又は３´騒動アームをさらに含むことができる。
別の特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、線状化ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入され得る。そのような線状化ＤＮＡ鋳型は、当技術分野で公知の方法によって産生することができる。例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡを、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるように、１つ又は複数の制限酵素によって消化することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低減するので、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが細胞に送達される。そのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写などの当技術分野で公知の方法を使用して産生することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、７－メチル－グアノシン、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）（米国特許第７，０７４，５９６号）、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）アナログ、例えばＣａｐ １アナログ（Ｔｒｉｌｉｎｋ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて５´キャップするか、又はワクシニアキャッピング酵素などを用いて酵素的にキャップする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、コードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現及び/又はｍＲＮＡ自体の安定性を高めるために、様々な５´及び３´非翻訳配列エレメントを含んでもよい。そのようなエレメントには、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメントなどの翻訳後調節エレメントが含まれ得る。ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジン又は２－チオウリジンなどのヌクレオシド類似体又は天然に存在するヌクレオシドを含有し得る。さらなるヌクレオシド類似体としては、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号に記載されているものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞取り込みを促進するために細胞透過性ペプチド又は標的化リガンドに結合される。当該分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－２９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６、及びＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９）が挙げられる。代替的な実施形態では、遺伝子操作されたヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合してそれにより内在化されるように、標的細胞上に発現される特定の細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合される。あるいは、遺伝子操作されたヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、そのような細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガンドの一部）に共有結合又は非共有結合され得る（ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２２０－３０；及びＱｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０：１４９１－５０８）。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、肝臓の所望の領域内への（例えば、肝類洞内皮細胞若しくは造血内皮細胞、又はそれらに分化する前駆細胞に近接して）注射又は移植のために生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注射を必要とせずに標的組織の所望の領域への治療ペイロードの持続的かつ調節可能な放出を提供することができ、刺激応答性材料（例えば、温度及びｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的又は外部から加えられたキューに応答してペイロードを放出するように設計することができる（Ｄｅｒｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｓｏｃ．１０６：２０６－１４）。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１４：１５６０１０）を使用して、ナノ粒子に共有結合若しくは好ましくは非共有結合されるか、又はそのようなナノ粒子内に封入される。ナノ粒子は、長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケール送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生物学的高分子から構成されるコアを使用して設計することができ、メガヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、したがって、各メガヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を最大にする。そのようなナノ粒子の表面は、ポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質）でさらに改変されて、その表面が細胞送達及びペイロードの取り込みを増強するための追加の機能性を付与するコア－シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３：７６２１－３０）。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に指向させるために、及び/又は細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子にさらに有利にカップリングされ得る。そのような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガンドの一部）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、又はカチオン性脂質）を使用して複合体化される（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照のこと。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的部位での蓄積及び保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合及び/又は破壊を通じて細胞取り込み及び送達効率を促進することができる。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内に封入されるか、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２：５２３－３６）。ポリマー担体は、ポリマー侵食及び薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を提供するように設計することができ、高い薬物封入効率は、所望の標的細胞集団への細胞内送達まで治療ペイロードの保護を提供することができる。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：９５６－６６）。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、非特異的相互作用を低減することができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与及び/又は送達のためにエマルジョン又はナノエマルジョン（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）に製剤化される。「エマルジョン」という用語は、限定されないが、水不混和性相が水相と混合された場合に、無極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成することができる脂質構造を含む、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を指す。これらの他の脂質構造には、単層、少層、及び多層の脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が含まれるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相及び親油性相から構成される（典型的には油及び有機溶媒を含有する）。エマルジョンはまた、１つ又は複数の界面活性剤を含むことが多い。ナノエマルジョン製剤は、例えば、米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，６３５，６７６号、同第６，５５９，１８９号及び同第７，７６７，２１６号に記載されているように周知であり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマーデンドリマーに共有結合又は非共有結合する（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７：１２３－４３）。デンドリマー生成は、ペイロード容量及びサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の提示を利用して、安定性を改善し、非特異的相互作用を減少させ、細胞特異的標的化及び薬物放出を増強することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、組換えウイルス（すなわち、組換えウイルスベクター）を使用して細胞に導入される。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知であり、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び組換えＡＡＶ（Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２で概説）が挙げられる。本発明において有用な組換えＡＡＶは、標的細胞型へのウイルスの形質導入及び標的細胞におけるメガヌクレアーゼ遺伝子の発現を可能にする任意の血清型を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５ ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶｒｈ．７４の血清型（すなわち、キャプシド）を有する。異なるＡＡＶが異なる組織に局在する傾向があることは当技術分野で公知である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ １１：３４５－３４．）。ＡＡＶ８に密接に関連するＡＡＶｒｈ．７４血清型は、骨格筋及び心筋組織を含む筋肉組織を標的とするとさらに記載されている（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．７７：１１２２－３１）。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ７である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ１２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶｒｈ．７４である。ＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。組換えＡＡＶによって送達されるポリヌクレオチドは、ウイルスゲノムの一部として左（５´）及び右（３´）逆方向末端反復を含み得る。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは標的組織に直接注入される。代替の実施形態では、組換えウイルスは、循環系を介して全身送達される。
一実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子送達に使用される組換えウイルスは、自己制限組換えウイルスである。自己制限ウイルスは、ウイルスゲノム内に遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの認識配列が存在するため、細胞又は生物において限られた持続時間を有することができる。したがって、自己制限組換えウイルスは、プロモータのコード配列、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、及びＩＴＲ内のメガヌクレアーゼ認識部位を提供するように遺伝子操作することができる。自己制限組換えウイルスは、メガヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように、メガヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生物に送達する。送達されたメガヌクレアーゼはまた、自己制限組換えウイルスゲノム内にその標的部位を見つけ、この標的部位で組換えウイルスゲノムを切断する。切断されると、ウイルスゲノムの５´及び３´末端が露出され、エキソヌクレアーゼによって分解され、したがってウイルスが死滅し、メガヌクレアーゼの産生が停止する。
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが組換えウイルス（例えばＡＡＶ）によって細胞に送達される場合、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列はプロモータに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、これは、組換えウイルスからの内因性プロモータ（例えば、レンチウイルスのＬＴＲ）又は周知のサイトメガロウイルス－若しくはＳＶ４０ウイルス－初期プロモータなどのウイルス性プロモータであり得る。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列は、標的細胞（例えば、筋肉細胞又は筋肉前駆細胞）において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結される。筋肉特異的組織プロモータの例には、Ｃ５－１２、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータを含む、以前に記載された筋肉特異的プロモータが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１６９～１８１のいずれか１つによる配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１６９を含むＣ５－１２プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７０を含むマウスＭＣＫプロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７１を含むヒトＭＣＫプロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７２を含むＭＣＫエンハンサと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７３を含む改変ＭＣＫエンハンサと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７４を含むｓｐｃ ５－１２プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７５を含むＭＨＣＫ７プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７６を含むＣＫ８プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７７を含むＳＫ－ＣＲＭ４プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７８を含むＳＰ－３０１プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１７９を含むＳＰ－８１７プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１８０を含むＳＰ－９０５プロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、筋肉特異的プロモータは、配列番号１８１を含む筋肉ハイブリッドプロモータと９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含む。単一のポリヌクレオチドが、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする２つの別個の核酸配列を含むいくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子は、２つの別個のプロモータに作動可能に連結されている。代替的な実施形態では、２つのメガヌクレアーゼ遺伝子は、単一のプロモータに作動可能に連結され、いくつかの例では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチド配列によって分離され得る（Ｓｚｙｍｃｚａｋ＆Ｖｉｇｎａｌｉ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．５：６２７－３８）。そのような２Ａペプチド配列としては、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ配列を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを、目的の配列をコードする外因性核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドと組み合わせて細胞に送達することを含み、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが細胞内で発現され、細胞のジストロフィン遺伝子内の本明細書に記載の認識配列（例えば、配列番号６、配列番号１０又は配列番号１２）を認識して切断し、切断部位を生成し、外因性核酸及び目的の配列が、切断部位においてゲノムに挿入される（例えば、相同組換えによる）。いくつかのそのような例では、ポリヌクレオチドは、ゲノムへの外因性核酸及び目的の配列の相同組換えを促進するために、メガヌクレアーゼ切断部位に隣接する核酸配列に相同な配列を含むことができる。
外因性核酸を含むそのようなポリヌクレオチドは、前述の手段のいずれかによって、対象の細胞に導入され、及び/又は標的細胞に送達され得る。特定の実施形態では、外因性核酸分子を含むそのようなポリヌクレオチドは、組換えウイルス（すなわち、ウイルスベクター）、例えば組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、又は組換えＡＡＶによって導入される。外因性核酸分子を含むポリヌクレオチドを導入するのに有用な組換えＡＡＶは、ウイルスの細胞への形質導入及び外因性核酸分子配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型（すなわち、キャプシド）を有することができる。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５ ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶｒｈ．７４の血清型を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ７である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ１２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶｒｈ．７４である。組換えＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る。組換えＡＡＶを使用して導入された外因性核酸分子は、ウイルスゲノム中の５´（左）及び３´（右）逆方向末端反復に隣接することができる。
別の特定の実施形態では、外因性核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、外因性核酸分子を含むことができ、特定の実施形態では、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために５´及び３´相同アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５´相同アームの５´上流の５´ＡＡＶ ＩＴＲ配列、及び３´相同アームの３´下流の３´ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含むことができる。
別の特定の実施形態では、本発明のヌクレアーゼ及び/又は本発明の外因性核酸分子をコードする遺伝子は、線状化ＤＮＡ鋳型によるトランスフェクションによって細胞に導入することができる。遺伝子操作されたヌクレアーゼ及び/又は外因性核酸分子をコードするプラスミドＤＮＡは、例えば、環状プラスミドＤＮＡが細胞へのトランスフェクションの前に線状化されるように、１つ又は複数の制限酵素によって消化することができる。
細胞に送達される場合、本発明の外因性核酸は、前述の哺乳動物プロモータよび誘導性プロモータを含む、細胞におけるコードされたポリペプチドの発現に適した任意のプロモータに作動可能に連結され得る。本発明の外因性核酸はまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、限定されないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を挙げることができる。特定の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列は、本明細書で論じられる筋肉特異的プロモータに作動可能に連結され得る。
投与
標的組織（複数可）又は標的細胞（複数可）には、骨格筋細胞、心筋細胞、又は横隔膜の筋肉細胞などの筋肉細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的細胞は、骨格筋前駆細胞又は心筋前駆細胞などの筋肉前駆細胞である。そのような筋肉前駆細胞は、当技術分野で記載されており、対象に存在し得るか、又は誘導多能性幹細胞若しくは胚性幹細胞などの別の幹細胞集団に由来し得る（Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７：２８４ ａｎｄ Ａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｒｅｓ．９：１２７－３２）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドは、インビトロで細胞に送達される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドは、インビボで対象の細胞に送達される。本明細書で論じられるように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）として送達され得る。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、標的組織への直接注射を介して標的細胞（例えば、筋肉細胞又は筋肉前駆細胞）に供給される。あるいは、メガヌクレアーゼタンパク質、又はメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、循環系を介して全身に送達され得る。
方法の様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物、例えば本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む組換えウイルス、又はそのようなポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子は、当技術分野で公知の任意の適切な投与経路を介して投与することができる。そのような投与経路としては、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、肝臓内、経粘膜、経皮、動脈内及び舌下が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む組換えウイルス、又はそのようなポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子は、標的組織（例えば、筋肉組織）への直接注射を介して標的細胞（例えば、筋肉細胞又は筋肉前駆細胞）に供給される。他の適切な投与経路は、必要に応じて処置医師によって容易に決定することができる。
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載の遺伝子操作されたヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドを、疾患の処置を必要とする対象に投与する。必要に応じて、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドの投与量又は投与頻度は、投与する医師の判断に基づいて、処置の過程にわたって調整され得る。適切な用量は、他の要因の中でも、選択された任意のＡＡＶの詳細（例えば、血清型など）、選択された任意の脂質ナノ粒子、投与経路、処置されている対象（すなわち、対象の年齢、体重、性別及び全身状態）、及び投与様式に依存する。したがって、適切な投与量は患者によって異なり得る。適切な有効量は、当業者又は処置する医師によって容易に決定することができる。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよく、又は複数回用量が必要な場合、複数回用量スケジュールであってもよい。さらに、対象は、必要に応じて何回も投与され得る。当業者は、適切な用量数を容易に決定することができる。投与量は、代替的な投与経路を考慮に入れるか、又は治療上の利益と任意の副作用とのバランスをとるように調整する必要があり得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、分泌障害型肝毒素をコードするか、又は肝毒素として作用することなく肝細胞再生を刺激するｔＰＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの投与をさらに含む。
いくつかの実施形態では、対象に、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与し、コードする核酸配列は、約１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、又は約１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇ）の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象に、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与し、コードする核酸配列は、約１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、又は約１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象に、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与し、コードする核酸配列は、約１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１１ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、又は約１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇの用量で投与される。これらの用量は、本明細書に記載の単一の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする単一の核酸配列を含む単一のポリヌクレオチドの投与に関連することができ、あるいは、本明細書に記載の第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び本明細書に記載の第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む単一のポリヌクレオチドに関連することができ、２つのコードする核酸配列の各々が指示された用量で投与されることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、対象に、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子製剤を投与し、ｍＲＮＡの用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、対象に、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子製剤を投与し、ｍＲＮＡの用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、又は約３．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、対象に、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子製剤を投与し、ｍＲＮＡの用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、又は約２．５ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇである。
２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体及び本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は薬学的に許容され得る担体及び本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、本明細書中に記載されるようなｍＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。いくつかのそのような例では、医薬組成物中のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって構成され得るか、又は組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）によって構成され得る。他の実施形態では、本開示は、薬学的に許容され得る担体と本発明の遺伝子改変細胞とを含む医薬組成物であって、細胞が本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現する標的組織に送達され得る医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、例えば、全身投与又は標的組織への投与のために製剤化される。
本発明の様々な実施形態では、医薬組成物は、ＤＭＤを処置し、ＤＭＤ疾患表現型をベッカー型筋ジストロフィ表現型に変換し、及び／又は対象のＤＭＤに関連する症候を軽減するのに有用であり得る。
そのような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、又はそれを発現する細胞は、典型的には薬学的に許容され得る担体と混合され、得られた組成物が対象に投与される。担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容され得なければならず、対象に有害であってはならない。担体は、固体若しくは液体、又はその両方であり得、単位用量製剤として化合物と共に製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の処置に有用な１つ又は複数の追加の薬剤又は生物学的分子をさらに含むことができる。同様に、追加の薬剤（複数可）及び／又は生物学的分子（複数可）は、別個の組成物として同時投与することができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、治療有効量の本明細書に開示の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は本明細書に記載の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の任意の用量（例えば、コード核酸配列のｇｃ／ｋｇ又はｍＲＮＡのｍｇ／ｋｇ）の本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むことができる。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載の１つ又は複数の組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）を含むことができる（すなわち、ウイルスゲノム内にパッケージングされている）。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の異なる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをそれぞれが含む、本明細書に記載の２つ以上の組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）を含む。例えば、第１の組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）は、ＤＭＤ １９－２０認識配列に対して特異性を有する本明細書に記載の第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列を含む第１のポリヌクレオチド、及びＤＭＤ ３５－３６認識配列又はＤＭＤ ３７－３８認識配列に対して特異性を有する本明細書に記載の第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドを含む第２の組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）を含み得る。同じ細胞（例えば、筋肉細胞）におけるそのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対の発現は、本発明によるジストロフィン遺伝子からのエクソン４５～５５の切除を可能にする。
他の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の２つの別個の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする２つの核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む本明細書に記載の組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）を含むことができる（すなわち、ウイルスゲノム内にパッケージングされている）。例えば、組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）は、ＤＭＤ １９－２０認識配列に対して特異性を有する本明細書に記載の第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列、及びＤＭＤ ３５－３６認識配列又はＤＭＤ ３７－３８認識配列に対して特異性を有する本明細書に記載の第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対の発現は、本発明によるジストロフィン遺伝子からのエクソン４５～５５の切除を可能にする。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むことができる。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、それぞれが本明細書に記載の異なる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、本明細書に記載の２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むことができる。例えば、脂質ナノ粒子中の第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＤＭＤ １９－２０認識配列に対する特異性を有する本明細書に記載の第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし得、脂質ナノ粒子中の第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列又はＤＭＤ ３７－３８認識配列に対する特異性を有する本明細書に記載の第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし得る。同じ細胞（例えば、筋肉細胞）におけるそのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対の発現は、本発明によるジストロフィン遺伝子からのエクソン４５～５５の切除を可能にする。あるいは、医薬組成物は、各々が本明細書に記載の異なるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む脂質ナノ粒子の２つの別個の集団を含むことができ、脂質ナノ粒子の第１の集団は、ＤＭＤ １９－２０認識配列に対する特異性を有する第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に記載の第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み、脂質ナノ粒子の第２の集団は、ＤＭＤ ３５－３６認識配列又はＤＭＤ ３７－３８認識配列に対する特異性を有する第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に記載の第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。
他の特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２つの別個の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする２つの核酸配列を含む、本明細書に記載の１つのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むことができる。例えば、脂質ナノ粒子は、ＤＭＤ １９－２０認識配列に対して特異性を有する本明細書に記載の第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列、及びＤＭＤ ３５－３６認識配列又はＤＭＤ ３７－３８認識配列に対して特異性を有する本明細書に記載の第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を含み得る。同じ細胞（例えば、筋肉細胞）におけるそのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対の発現は、本発明によるジストロフィン遺伝子からのエクソン４５～５５の切除を可能にする。
本発明での使用が企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つのコンジュゲート脂質を含む。より特定の例では、脂質ナノ粒子は、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、及び約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質コンジュゲートを含むことができ、非ラメラ（すなわち、非二重層）形態を有するような方法で産生される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、及び約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質コンジュゲートを含むことができ、非ラメラ（すなわち、非二重層）形態を有するように産生される。
カチオン性脂質は、例えば、以下の１つ又は複数を含むことができる：パルミトイル－オレオイル－ノル－アルギニン（ＰＯＮＡ）、ＭＰＤＡＣＡ、ＧＵＡＤＡＣＡ、（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）（ＭＣ３）、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４及びＰａｎ ＭＣ５、１，２－ジリノレイロキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイロキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイロキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイロキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－β－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５´－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３´－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９´，１－２´－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ´－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ´－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、又はそれらの混合物。カチオン性脂質はまた、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、Ｐａｎ ＭＣ５、又はそれらの混合物であり得る。
様々な実施形態において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、又は約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含んでもよい。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含んでもよい。
非カチオン性脂質は、例えば、１つ又は複数のアニオン性脂質及び/又は中性脂質を含んでもよい。特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分の１つを含む：（１）コレステロール若しくはその誘導体；（２）リン脂質；又は（３）リン脂質とコレステロールとの混合物若しくはその誘導体。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２´－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４´－ヒドロキシブチルエーテル、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及びそれらの混合物を含む中性脂質であってもよいが、これらに限定されない。特定の実施形態では、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、又はそれらの混合物である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ又は複数のリン脂質及び／又はコレステロール）は、粒子中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％又は約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含んでもよい。非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロール又はコレステロール誘導体との混合物である場合、混合物は、粒子中に存在する全脂質の約４０、５０又は６０ｍｏｌ％までを含んでもよい。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、又はそれらの混合物の１つ又は複数を含んでもよい。１つの特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート又はＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートのいずれかを含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート又はＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートは、ＣＰＬと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むＰＥＧ－脂質を含んでもよい。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、又はそれらの混合物であり得る。
本発明での使用に適した追加のＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、ｍＰＥＧ２０００－１，２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、国際公開第２００９／０８６５５８号に記載されている。本発明での使用に適したなおさらなるＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、１－［８´－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３´，６´－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。
いくつかの場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、若しくは２ｍｏｌ％（又はその任意の画分若しくは範囲）を含んでもよい。典型的には、そのような例では、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、又は約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、若しくは１０ｍｏｌ％（又はその任意の画分若しくは範囲）を含んでもよい。典型的には、そのような例では、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
他の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの正電荷担体及び正電荷担体とは異なる少なくとも１つの負電荷担体を含有する両性リポソームを含み得、リポソームの等電点は４～８である。この目的は、リポソームがｐＨに依存して電荷を変化させながら調製されるという事実によって達成される。
所望の特性を有するリポソーム構造は、例えば、膜形成又は膜ベースのカチオン性電荷担体の量が低ｐＨではアニオン性電荷担体の量を超え、高ｐＨでは比が逆転する場合に形成される。これは、イオン化可能な成分が４～９のｐＫａ値を有する場合に常に当てはまる。媒体のｐＨが低下すると、すべてのカチオン性電荷担体がより多く帯電し、すべてのアニオン性電荷担体が電荷を失う。
両性リポソームに有用なカチオン性化合物としては、本明細書中上記で先に記載されるカチオン性化合物が挙げられる。限定されないが、強カチオン性化合物は、例えば、以下を挙げることができる：ＤＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルメタン）カルバモイル］コレステロール、ＴＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－（Ｎ´，Ｎ´，Ｎ´－トリメチルアミノエタン）コレステロール、ＢＧＳＣビスグアニジニウム－スペルミジン－コレステロール、ＢＧＴＣビス－グアニジニウム－トレン－コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＳＰＥＲ（１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロピルアルニド、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））、ＤＯＲＩＥ １，２－ジオレオイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＳＣ（１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセリルコリンエステル）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－スクシニル－２－ヒドロキシエチルジスルフィドオミチン）、ＤＤＡＢジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＤＯＧＳ（（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリコール－スペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリシン、ＣＴＡＢセチルトリメチルアルモニウムブロミド、ＣｐｙＣセチルピリジニウムクロリド、ＤＯＥＰＣ、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン又は他のＯ－アルキル－ホスファチジルコリン又はエタノールアミン、リジン、アルギニン又はオルニチンからのアミド及びホスファチジルエタノールアミン。
弱カチオン性化合物の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｈｉｓ－Ｃｈｏｌ（ヒスタミニル－コレステロールヘミスクシネート）、Ｍｏ－Ｃｈｏｌ（モルホリン－Ｎ－エチルアミノ－コレステロールヘミスクシネート）、又はヒスチジニル－ＰＥ。
中性化合物の例としては、限定されないが、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、又はジアシルグリセロールが挙げられる。
両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書に以前に記載された非カチオン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例としては、以下を挙げることができる：ＣＨＥＭＳ（コレステロールヘミスクシネート）、炭素数８～２５のアルキルカルボン酸、又はジアシルグリセロールヘミスクシネート。さらなる弱アニオン性化合物としては、アスパラギン酸又はグルタミン酸及びＰＥ並びにＰＳのアミド、及び、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくは他のアミノ酸又はアミノジカルボン酸とのそのアミドを挙げることができる。同様の原理により、ヒドロキシカルボン酸又はヒドロキシジカルボン酸とＰＳとのエステルも弱アニオン性化合物である。
いくつかの実施形態では、両性リポソームは、本明細書中上記で記載されるものなどのコンジュゲート脂質を含有し得る。有用なコンジュゲート脂質の特定の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の例は、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールである。
いくつかの実施形態では、中性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％又は約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含んでもよい。
いくつかの場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、若しくは２ｍｏｌ％（又はその任意の画分若しくは範囲）を含んでもよい。典型的には、そのような例では、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、又は約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、若しくは１０ｍｏｌ％（又はその任意の画分若しくは範囲）を含んでもよい。典型的には、そのような例では、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
中性脂質及びコンジュゲート脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残部は、様々な比率で製剤化されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含むことができる。カチオン性脂質対アニオン性脂質の比は、核酸封入、ゼータ電位、ｐＫａ、又は荷電脂質成分の存在に少なくとも部分的に依存する他の物理化学的特性の所望の特性を達成するために選択され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込みを特異的に増強する組成物を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、対象のＤＭＤの処置に有用な１つ又は複数の追加の薬剤をさらに含むことができる。
本開示はまた、医薬として使用するための、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現する本明細書に記載の細胞を提供する。本開示はさらに、ＤＭＤを処置するため、改変ジストロフィンタンパク質（すなわち、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く）のレベルを増加させるため、又はＤＭＤに関連する症候を軽減するための、医薬の製造における、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又はそれをコードする本明細書に開示されるポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現する本明細書に記載される細胞の使用を提供する。
２．５ 組換えウイルスを産生するための方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するための組換えウイルス、例えば組換えＡＡＶを提供する。組換えＡＡＶは、典型的には、ＨＥＫ－２９３などの哺乳動物細胞株で産生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、その自己複製を防止して治療遺伝子（例えば、メガヌクレアーゼ遺伝子）を送達する余地を作るために組換えウイルスから除去されるので、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必要がある。さらに、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）成分を提供する必要がある（Ｃｏｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：３７０－８１）。多くの場合、組換えＡＡＶは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで細胞株をトランスフェクトするトリプルトランスフェクションを使用して産生される。次いで、キャプシドに包まれたゲノム（ＩＴＲ及び目的の介在遺伝子（複数可））を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティクロマトグラフィを用いて精製し、続いて、目的の遺伝子（複数可）を細胞、組織又はヒト患者などの生物に送達する。
組換えＡＡＶ粒子は典型的には細胞内で産生される（製造される）ので、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼがパッケージング細胞内で発現されないことを確実にするために、本発明を実施する際に注意を払わなければならない。本発明の組換えウイルスゲノムはメガヌクレアーゼの認識配列を含み得るので、パッケージング細胞株で発現される任意のメガヌクレアーゼは、ウイルス粒子にパッケージングされ得る前にウイルスゲノムを切断することができる場合がある。これは、パッケージング効率の低下及び/又は断片化されたゲノムのパッケージングをもたらす。パッケージング細胞におけるメガヌクレアーゼ発現を防止するために、いくつかのアプローチを使用することができる。
ヌクレアーゼは、パッケージング細胞において活性でない組織特異的プロモータの制御下に置くことができる。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現又は目的の核酸配列のための本明細書に記載される任意の組織特異的プロモータを使用することができる。例えば、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を筋肉組織に送達するために組換えウイルスを開発する場合、筋肉特異的プロモータを使用することができる。筋肉特異的プロモータの例としては、限定されないが、本明細書の他の箇所に記載される筋肉特異的プロモータが挙げられる。
あるいは、組換えウイルスは、メガヌクレアーゼが発現されにくい異なる種由来の細胞にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッケージング細胞では活性ではない周知のサイトメガロウイルス又はＳＶ４０ウイルス初期プロモータなどの哺乳動物プロモータを使用して、微生物、昆虫又は植物細胞で産生され得る。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１：１３８－４３に記載されているように、バキュロウイルスシステムを使用して昆虫細胞で産生される。哺乳動物プロモータの制御下にあるメガヌクレアーゼは、これらの細胞で発現される可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：７３９－４９）。さらに、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。したがって、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンなどの哺乳動物イントロンをメガヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞内のプレｍＲＮＡ転写物から効率的にスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的メガヌクレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的メガヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞における毒性タンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素断片Ａの発現を減弱させるためにＨＧＨ及びＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンを使用し、これらの毒素遺伝子を担持する組換えＡＡＶベクターの産生を可能にすることを報告した（Ｃｈｅｎ（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１：ｅ５７）。
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ遺伝子は、小分子インデューサがメガヌクレアーゼ発現に必要とされるように、誘導可能なプロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例としては、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４）及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ ｉ（２０１１）Ｓｐｉｎｅ ３６：Ｅ６２３－８）が挙げられる。両方のシステム、並びに当技術分野で公知の同様のシステムは、小分子アクチベータ（それぞれドキシサイクリン又はエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサ及びエクジソン受容体のバリアント）に依存する。そのようなリガンド誘導性転写アクチベータを使用して本発明を実施することには、以下が含まれる。１）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に置くことであって、メガヌクレアーゼ遺伝子が、転写因子に対する（１つ又は複数の）結合部位を有すること；及び２）転写因子をコードする遺伝子をパッケージ化ウイルスゲノムに含めること。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、転写アクチベータも同じ細胞に提供されない場合は、組換えＡＡＶ送達後に標的細胞又は組織で発現されないので、後者の工程が必要である。次いで、転写アクチベータは、同族小分子アクチベータで処理された細胞又は組織においてのみメガヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子インデューサがいつどの組織に送達されるかを選択することによって、メガヌクレアーゼ遺伝子発現を時空間的に調節することを可能にするので有利である。しかし、ウイルスゲノムにインデューサを含める必要性は、担持能力が著しく制限されており、このアプローチには欠点がある。
別の特定の実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、メガヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサを発現する哺乳動物細胞株で産生される。転写リプレッサは当技術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサ、Ｌａｃリプレッサ、Ｃｒｏリプレッサ及びλリプレッサが挙げられる。エクジソン受容体などの多くの核ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサとしても作用する。本発明を実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサをコードするベクターでトランスフェクト/形質導入され、ウイルスゲノム（パッケージングベクター）中のメガヌクレアーゼ遺伝子は、リプレッサがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサの結合部位を含むように改変されたプロモータに作動可能に連結される。転写リプレッサをコードする遺伝子は、様々な位置に配置することができる。これは、別個のベクター上にコードすることができ；ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込むことができ；これは、ｃａｐ／ｒｅｐベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むことができ；又は構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。転写リプレッサ部位を組み込むように一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｃｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力な構成的ＣＭＶ及びＲＳＶプロモータを、Ｌａｃリプレッサのオペレータを含むように改変し、改変プロモータからの遺伝子発現がリプレッサを発現する細胞において大きく減弱されることを示した（Ｃｈａｎｇ＆Ｒｏｎｉｎｓｏｎ（１９９６）Ｇｅｎｅ １８３：１３７－４２）。非ヒト転写リプレッサの使用は、メガヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサを発現するパッケージング細胞でのみ抑制され、得られた組換えＡＡＶで形質導入された標的細胞又は組織では抑制されないことを確実にする。
２．６ 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのバリアント
本発明の実施形態は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びそのバリアントを包含する。本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドのバリアントを包含する。
本明細書で使用される場合、「バリアント」は、実質的に類似の配列を意味することを意図している。「バリアント」ポリペプチドは、天然タンパク質の１つ又は複数の内部部位での１つ又は複数のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び/又は天然ポリペプチドの１つ又は複数の部位での１つ又は複数のアミノ酸の置換によって「天然」ポリペプチドに由来するポリペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、バリアントが由来する親配列を含む。実施形態に包含されるバリアントポリペプチドは、生物学的に活性である。すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、本明細書に記載のジストロフィン遺伝子認識配列（例えば、ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ３５－３６、又はＤＭＤ ３７－３８認識配列）に結合して切断する能力を保持し続ける。そのようなバリアントは、例えば、人間の操作から生じ得る。実施形態の天然ポリペプチド（例えば、配列番号３６～５９）の生物学的に活性なバリアント、又は本明細書に記載の認識半部位結合サブユニットの生物学的に活性なバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される場合、天然ポリペプチド、天然サブユニット、天然ＨＶＲ１領域及び/又は天然ＨＶＲ２領域のアミノ酸配列と少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物学的に活性なバリアントは、わずか約１～４０アミノ酸残基、わずか約１～２０アミノ酸残基、わずか約１～１０アミノ酸残基、わずか約５アミノ酸残基、わずか４アミノ酸残基、３アミノ酸残基、２アミノ酸残基、又はさらには１アミノ酸残基だけ、そのポリペプチド又はサブユニットと異なり得る。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断及び挿入を含む様々な方法で改変され得る。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変バリアントは、ＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。突然変異誘発及びポリヌクレオチド変更のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ＆Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びそこに引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が最適であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に開示されるＨＶＲ１及びＨＶＲ２領域のバリアントを含み得る。親ＨＶＲ領域は、例えば、例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９又は残基２１５～２７０を含み得る。したがって、バリアントＨＶＲは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの生物学的活性（すなわち、認識配列への結合及びその切断）をバリアントＨＶＲ領域が維持するように、本明細書に例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９又は残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、バリアントＨＶＲ１領域又はバリアントＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含むことができる。この文脈において、「対応する」とは、バリアントＨＶＲ中のアミノ酸残基が、同じ相対位置で（すなわち、親配列中の残りのアミノ酸に関して）親ＨＶＲ配列中に存在する同じアミノ酸残基（すなわち、別個の同一の残基）であることを意味する。例として、親ＨＶＲ配列が位置２６にセリン残基を含む場合、残基２６に「対応する残基を含む」バリアントＨＶＲはまた、親の位置２６に対して相対的な（すなわち、対応する）位置にセリンを含む。
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３６～５９のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも高い配列同一性を有するＨＶＲ１を含む。
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３６～５９のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも高い配列同一性を有するＨＶＲ２を含む。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当数のアミノ酸改変が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、これは単独で又は組み合わせて、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で特異性が変化した遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをもたらし、その結果、得られた合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型酵素とは異なる半部位特異性を有する。表９は、認識半部位の各半部位位置（－１から－９）に存在する塩基に基づいて特異性を高めるために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのモノマー又はサブユニットにおいて行われ得る潜在的な置換を提供する。
Figure 0007642809000011
太字のエントリは野生型接触残基であり、本明細書で使用される「改変」を構成しない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖上の塩基と接触することを示す。
ＤＮＡ結合親和性及び/又は活性を調節するために、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのモノマー又はサブユニットにおいて特定の改変を行うことができる。例えば、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのモノマー又はサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩ又は配列番号３６～５９のいずれか１つの１９位に対応する残基（国際公開第２００９／００１１５９号）にＧ、Ｓ、若しくはＡ、Ｉ－ＣｒｅＩ又は配列番号３６～５９のいずれか１つの６６位に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ、若しくはＤ、及び／又は、Ｉ－ＣｒｅＩ又は配列番号３６～５９のいずれか１つの８０位に対応する残基にＥ、Ｑ、若しくはＫを含むことができる（米国特許第８，０２１，８６７号）。
ポリヌクレオチドの場合、「バリアント」は、天然ポリヌクレオチド内の１つ又は複数の部位における１つ又は複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸のバリアントが、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的バリアントは、遺伝子コードの縮重のために、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。バリアントポリヌクレオチドは、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、依然として実施形態の組換えヌクレアーゼをコードするものなどの合成由来ポリヌクレオチドを含む。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載される配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される場合、その特定のポリヌクレオチドに対する少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれよりも高い配列同一性を有するであろう。実施形態の特定のポリヌクレオチドのバリアント（すなわち、参照ポリヌクレオチド）もまた、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することができる。
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入及び置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化を生じるとは予想されない。しかしながら、置換、欠失又は挿入の正確な効果を事前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果がポリペプチドをその意図された活性でスクリーニングすることによって評価されることを理解するであろう。例えば、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのバリアントは、ジストロフィン遺伝子内に見られる認識配列に優先的に結合して切断する能力についてスクリーニングされる。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。
実施例１
ジストロフィン遺伝子内の認識配列に結合して切断するメガヌクレアーゼの特徴づけ
１．ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６及びＤＭＤ ３７－３８認識配列に結合して切断するメガヌクレアーゼ
これらの実験は、ジストロフィン遺伝子のセグメントの除去を可能にする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対を利用するように設計された。２つの位置で同時に編集するために２つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを使用するこの戦略は、複数のエクソン、特にエクソン４５～５５の切除を可能にする。場合によっては、単一ＡＡＶベクター上で送達された２つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、エクソン４５の上流かつエクソン５５の下流のイントロン配列（すなわち、遺伝子のエクソン４５～５５に隣接するイントロン）に二本鎖切断を作ることができる。
本明細書に記載されるように、使用のために選択された遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対は、同一の４塩基対の中心配列を有する認識配列を切断するように設計される。結果として、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによる切断は、相補的な粘着末端（すなわち、４塩基対、３´オーバーハング）を残し、その結果、エクソン４５～５５の「ホットスポット」の切除後にゲノム配列が完全にライゲーションされ、ＤＭＤを引き起こす突然変異の５０％超が見出される。これらのエクソンの除去は、遺伝子から５００，０００塩基対を超えるゲノム配列の切除をもたらし、遺伝子のリーディングフレームを野生型と比較して正常に戻し、前臨床モデルにおいて治療的に関連性があることが示されているより短い「ベッカー」ジストロフィンを作製する。図１は、認識配列のおおよその位置及びエクソン４４とエクソン５６との間のイントロンの結果として生じるライゲーションを提供する。転写中のその後のスプライシングは、エクソン４４がエクソン５６とインフレームであるｍＲＮＡ転写物を提供し、短縮されているが機能的なジストロフィンタンパク質をもたらす。
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの数百の潜在的な対を活性及び有効性について評価した。これらのうち、選択された数が、ジストロフィン遺伝子内で切断し、遺伝物質の完全ライゲーションを生成する能力についてさらに特徴付けられた。
ジストロフィン遺伝子のイントロン内のＤＭＤ １９－２０（配列番号６）、ＤＭＤ ２９－３０（配列番号８）、ＤＭＤ ３５－３６（配列番号１０）、及びＤＭＤ ３７－３８（配列番号１２）認識配列に結合して切断するように設計された遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書ではそれぞれＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ ２９－３０メガヌクレアーゼ、ＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼ、及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼと呼ばれる。ＤＭＤ １９－２０認識配列は、エクソン４５の５´上流のイントロンに位置する。ＤＭＤ ２９－３０認識配列は、エクソン４６の５´上流のイントロンに位置する。ＤＭＤ ３５－３６認識配列及びＤＭＤ ３７－３８認識配列はいずれも、エクソン５５の３´下流のイントロンに位置する。
各ＤＭＤ遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端核局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＤＭＤメガヌクレアーゼの第１のサブユニットは第１のＤＭＤ認識半部位に結合し、第２のサブユニットは第２のＤＭＤ認識半部位に結合する。例えば、ＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは第１のＤＭＤ認識半部位に結合し、第２のサブユニットは第２のＤＭＤ １９－２０認識半部位に結合する（図１）。
ＤＭＤメガヌクレアーゼサブユニットはそれぞれ、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。各ＤＭＤメガヌクレアーゼ結合サブユニットのＨＶＲ１領域は、配列番号３６～５９の残基２４～７９からなる。各ＤＭＤメガヌクレアーゼのＨＶＲ２領域は、配列番号３６～５９の残基２１５～２７０からなる。
２．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６及びＤＭＤ ３７－３８認識配列の切断
ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６、及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼがそれらのそれぞれのヒト認識配列に結合して切断することができるかどうかを決定するために、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを、以前に記載されたＣＨＯ細胞レポーターアッセイ（国際公開第２０１２／１６７１９２号及び図５を参照）を使用して評価した。アッセイを行うために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを有するＣＨＯ細胞レポーター株を産生した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能的ＧＦＰ遺伝子をもたらすように、各細胞株のＧＦＰ遺伝子を一対の認識配列によって中断した。
この研究のために開発されたＣＨＯレポーター細胞株では、ＧＦＰ遺伝子に挿入された１つの認識配列は、ヒトＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６、及びＤＭＤ ３７－３８認識配列であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された２番目の認識配列は、「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識及び切断されるＣＨＯ－２３／２４認識配列であった。
ＣＨＯレポーター細胞を、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７４、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３７５、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４３１、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．４５８、ＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８、ＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３７６、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４５７、ＤＭＤ ３５－３６Ｌ．４６９、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．４７８、ＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５１２、及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．５２８メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。ＣＨＯレポーター細胞に、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもトランスフェクトした。各アッセイでは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の指示に従って使用して、９６ウェルプレート中で５ｅ４ ＣＨＯレポーター細胞に９０ｎｇのｍＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、トランスフェクションの２日後、５日後及び７日後にフローサイトメトリによって評価して、トランスフェクトされていない陰性対照と比較したＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。各時点で得られたデータを、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを使用して観察されたＧＦＰ陽性細胞％に対して正規化して「活性スコア」を決定し、最も早い時点からの正規化データを最新の時点から差し引いて「毒性スコア」を決定した。次いで、活性スコア及び毒性スコアを共に加算して「活性指数」を決定し、次いで、これをＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの活性指数に対して正規化して、細胞株間のデータを比較した（「正規化された活性指数」）。
３．結果
図６Ａ～図６Ｉに示されるように、それぞれのメガヌクレアーゼのそれぞれは、それらのそれぞれの認識配列に結合して切断することができた。各メガヌクレアーゼは、陽性対照ＣＨＯ ２３－２４メガヌクレアーゼと同じかそれ以上のＧＦＰ発現レベルを提供した。
４．結論
これらの研究は、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、細胞内のそれらのそれぞれのヒト認識配列（例えば、配列番号６、８、１０及び１２の認識配列）に効率的に結合して切断することができることを実証した。
実施例２
ＤＭＤメガヌクレアーゼによって誘導される挿入及び欠失の特徴づけ
１．方法
ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼをそれぞれ、ＭＲＣ５細胞におけるそれぞれの認識配列で挿入又は欠失（「インデル」）を生成する能力について評価した。
これらの実験では、１ｅ６ ＭＲＣ５細胞に、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ ４Ｄシステムを使用して、ＤＭＤメガヌクレアーゼ（ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７、ＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８、ＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３、ＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６、又はＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９）、又はＧＦＰをコードする２ｎｇ又は１００ｎｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。ｇＤＮＡ調製のためのエレクトロポレーションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９０％を超えた。追加の時点を、ｇＤＮＡ抽出のためのエレクトロポレーションの５日後及び８日後に収集した。ｇＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを用いて調製した。
デジタル液滴ＰＣＲを利用して、ＤＭＤ １９－２０結合部位におけるプライマーＰ１、Ｆ１及びＲ１；ＤＭＤ ３７－３８結合部位におけるプライマーＰ３、Ｆ３及びＲ３；結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するための３５－３６標的部位におけるプライマーＰ４、Ｆ４及びＲ４、ＤＭＤ ２９－３０結合部位におけるプライマーＰ５、Ｆ５及びＲ５、並びに参照アンプリコンを生成するためのプライマーＰ２、Ｆ２、Ｒ２を使用して標的挿入及び欠失の頻度（インデル％）を決定した。増幅を、１×ｄｄＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ及び約５０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２０ｕＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：１サイクルの９５℃（２℃／秒ランプ）で１０分間、４４サイクルの９４℃（１℃／秒ランプ）で３０秒間、Ｘ℃（１℃／秒ランプ）で４５秒間（「Ｘ」については、以下の標的部位アニーリング温度を参照）、７２℃（０．２℃／秒ランプ）で２分間、１サイクルの９８℃で１０分間、４℃保持。液滴をＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得及び分析した。結合部位プローブの陽性コピー数を参照プローブの陽性コピー数で割り、ヌクレアーゼ処理細胞におけるＦＡＭ＋コピーの喪失をモックトランスフェクト細胞と比較することによってインデル頻度を計算した。
サイクリングアニール温度：ＭＤ １９－２０：５７℃；ＤＭＤ ３５－３６ ５９℃；ＤＭＤ ３７～３８ ５７℃；及びＤＭＤ ２９－３０ ６２℃。
Figure 0007642809000012
２．結果
ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ２９－３０、ＤＭＤ ３５－３６及びＤＭＤ ３７－３８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを、ＭＲＣ５細胞株においてインデルを生成する能力についてスクリーニングした。ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ １９－２０ｘ．８７メガヌクレアーゼはそれぞれ低ｍＲＮＡ用量で測定可能な量のインデル活性を戻し、ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７メガヌクレアーゼは、この単一ヌクレアーゼアッセイにおいてより高い効力を示した（図７Ａ）。ＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１メガヌクレアーゼはそれぞれ、低ｍＲＮＡ用量でＭＲＣ５細胞において３０％を超えるゲノム編集を戻した（図７Ｂ）。ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６、及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９メガヌクレアーゼは、低ｍＲＮＡ用量で＞３０％のゲノム編集を戻し、経時的な編集の減少はなかった（図７Ｃ）。ＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８メガヌクレアーゼは、最初は高い％のインデルを有していたが、これらは８日目に有意に減少し、一方、ＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０メガヌクレアーゼは、より低い％のインデルを有し、８日目まで安定していた（図７Ｄ）。
３．結論
これらの実験は、本発明の遺伝子操作されたＤＭＤメガヌクレアーゼが、培養細胞中のそれらの認識配列においてインデルを生成することができ、細胞が低濃度のｍＲＮＡでトランスフェクトされた場合でさえ、経時的に安定な高頻度のインデルを産生することができるものが多いことを実証した。
実施例３
ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を除去するためのメガヌクレアーゼの対の特徴づけ
１．方法
これらの実験では、ＭＲＣ５細胞のゲノムからジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を切除する能力について、ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ３５－３６、及びＤＭＤ ３７－３８認識配列を標的とする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼのペアを評価した。これを達成するために、ＭＲＣ５細胞を、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼをコードする別々のｍＲＮＡ、又はＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼをコードする別々のｍＲＮＡでトランスフェクトした。試験したＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの対には、以下が含まれた：ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３；ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１；ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．８１；ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３。試験したＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの対には、以下が含まれた：ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５；ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５；ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６；ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．６６；ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９；及びＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．７９．さらに、これらの実験はまた、ＭＲＣ５細胞のゲノムからジストロフィン遺伝子のエクソン４５のみを切除する能力についてＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ２９－３０メガヌクレアーゼの対を評価した。試験したＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ２９－３０メガヌクレアーゼの対には、以下が含まれた：ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８；ＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０；ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．４０；及びＤＭＤ １９－２０ｘ．８７及びＤＭＤ ２９－３０ｘ．１８。
１ｅ６ ＭＲＣ５細胞に、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ ４Ｄシステムを使用して、各ＤＭＤメガヌクレアーゼ又はＧＦＰをコードする４０ｎｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。ｇＤＮＡ調製のためのエレクトロポレーションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９０％を超えた。ｇＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを用いて調製した。
ｇＤＮＡを、欠失部位にまたがるプライマーセットでＰＣＲ増幅して、任意の欠失事象を増幅した。以下の表の以下のＰＣＲプライマーセットを使用した：
Figure 0007642809000013
Ｑ５ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を上記プライマー及びｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と併せて使用して、ｇＤＮＡを増幅した。サイクル条件は以下の通りであった：９８℃で４分間の１サイクル、９８℃で１０秒間の３５サイクル、Ｘ℃（アニールについては上記のＴＭを参照）で２０秒間、７２℃で１．５分間、７２℃で２分間の１サイクル、４℃保持。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で流し出し、ＵＶカメラによって可視化した。残りのＰＣＲ産物を、増幅工程で利用したのと同じプライマーを使用してサンガーシーケンシングに使用した。ＤＮＡ配列を、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを使用して分析し、予想されるテンプレートファイルと比較した。
デジタル液滴ＰＣＲを利用して、１９－２０標的部位の接合部にまたがるプライマー対及びプローブ並びに２９－３０、３５－３６、又は３７－３８のいずれかの対応するＤＭＤヌクレアーゼを利用して、大欠失の頻度（インデル％）を決定した。このアッセイは、１９－２０の左半部位と、２９－３０、３５－３６、又は３７－３８ヌクレアーゼ部位のいずれかの対応する右半部位との完全ライゲーション事象を測定する。各二重ヌクレアーゼアッセイで、プライマーＰ２、Ｆ２、Ｒ２を使用するのと同じ実施例２からの参照アンプリコンアッセイを含め、ヌクレアーゼ活性によって影響されない領域に対する大欠失の比を定量することを可能にした。概略図を図１１に見出すことができ、これは１９－２０～３７－３８の二重ヌクレアーゼ送達についてのこのアッセイを説明する。ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８の完全ライゲーションは、プライマーＰ６、Ｆ６及びＲ６を利用した。ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６の完全ライゲーションは、プライマーＰ７、Ｆ７及びＲ７を利用した。ＤＭＤ １９－２０～２９－３０の完全ライゲーションは、プライマー及びプローブＰ８、Ｆ８及びＲ８を利用した。増幅を、１×ｄｄＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ及び約５０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２０ｕＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：１サイクルの９５℃（２℃／秒ランプ）で１０分間、４４サイクルの９４℃（１℃／秒ランプ）で３０秒間、Ｘ℃（１℃／秒ランプ）で４５秒間（標的部位については、以下のアニーリング温度を参照）、７２℃（０．２℃／秒ランプ）で２分間、１サイクルの９８℃で１０分間、４℃保持。液滴をＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得及び分析した。結合部位プローブの陽性コピー数を参照プローブの陽性コピー数で割り、ヌクレアーゼ処理細胞におけるＦＡＭ＋コピーの喪失をモックトランスフェクト細胞と比較することによってインデル頻度を計算した。
サイクリングアニーリング温度：ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８は５３℃、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８は５９℃、及びＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０は５５℃。
Figure 0007642809000014
２．結果
１９－２０～３５－３６の増幅について正しいサイズのＰＣＲ産物を可視化し（図８Ａ）、対応する配列データは、１９－２０／３５－３６ヌクレアーゼ結合部位間の完全ライゲーションを示した（図８Ｂ）。１９－２０～３７－３８の増幅についても、正しいサイズのＰＣＲ産物を可視化し（図９Ａ）、対応する配列データは、１９－２０／３７－３８ヌクレアーゼ結合部位間の完全ライゲーションを示した（図９Ｂ）。さらに、正しいサイズのＰＣＲ産物を１９－２０～２９－３０の増幅について可視化した（図１０）。
３つすべての欠失事象についてのデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイは、清浄なモック反応を用いて１９－２０認識配列と２９－３０、３５－３６、又は３７－３８のいずれかからの対応する配列との間の完全ライゲーションの測定に成功した。ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６に対する完全ライゲーションは、６～１２％の範囲の欠失及びライゲーション事象を定量化した（図１２Ａ）。ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８に対する完全ライゲーションは、９～１７．９％の範囲の欠失及びライゲーション事象を定量し（図１２Ｂ）、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ２９－３０に対する完全ライゲーションは、１～３％の範囲の欠失及びライゲーション事象を定量した（図１２Ｃ）。
３．結論
これらの結果は、複数のＤＭＤ疾患関連突然変異に関連するホットスポットエクソンの除去を伴う二重編集のためのインビトロ概念実証を提供する。これらの編集事象は、１７．９％もの高さであると測定された。しかしながら、これらの編集の頻度、及びエクソン４５単独又はエクソン４５～５５のいずれかの除去は、標的部位に小さなインデルをもたらすライゲーションとは対照的に、このアッセイは完全ライゲーション事象のみを拾い上げるので、過小評価されている。さらに、これは、複数の異なる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び標的部位を用いて様々な成功レベルで達成できることが示された（図１３）。予想外にも、これらのデータは、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６／ＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼ対によるエクソン４５～５５及び５００，０００ｂｐを超える遺伝子配列の除去について、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ２９－３０メガヌクレアーゼ対による単一エクソン４５の除去と比較して、完全ライゲーションのパーセンテージが有意に高いことを示した（図１２Ｃ及び図１３）。
実施例４
初代ヒト骨格筋筋芽細胞におけるエクソン４５～５５の除去後のジストロフィン遺伝子における完全ライゲーション事象の分析
１．方法
これらの実験では、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼの編集能力を、ヒト初代筋肉細胞であるヒト骨格筋筋芽細胞において評価した。ヒト骨格筋筋芽細胞は、Ｌｏｎｚａ（ＨＳＭＭ ＣＣ－２５８０）から購入した。細胞を解凍し、骨格筋細胞増殖培地－２（ＳｋＧＭ－２）に３５００細胞／ｃｍ２で播種し、エレクトロポレーションまで７０％以下の細胞密集度に維持した。１ｅ６細胞を用いてトランスフェクションを行った。Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ ４Ｄシステムを使用して、細胞に、各ＤＭＤメガヌクレアーゼをコードする２０、４０、８０又は１６０ｎｇのｍＲＮＡを対で（ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６対）又はＧＦＰのいずれかをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートの個々のウェルの増殖培地に播種した。エレクトロポレーションの１日後、分化させる細胞を２％ウマ血清を含むＤＭＥＭＦ １２（Ｔｈｅｒｍｏ）に変更し、未分化として維持する細胞を増殖培地中で維持した。ＤＮＡ及びタンパク質抽出のためのエレクトロポレーションの２日後及び８日後に細胞を回収し、ｇＤＮＡ単離及びデジタル液滴ＰＣＲを利用して、上記の実施例３で指定されたＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８完全ライゲーションの大欠失の頻度（インデル％）を決定した。
２．結果
ＨＳＭＭ細胞株において、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡの量が増加すると、大欠失／完全ライゲーションの用量依存的増加が見られた（図１４）。エクソン４５～５５の切除後の完全ライゲーションは、低用量～高用量のｍＲＮＡについて１４％～２７％の範囲であった。
３．結論
二重送達大欠失の以前の結果をヒトＭＲＣ５細胞株において行った。対照的に、この実験は、関連する筋肉細胞株の「ホットスポット」領域を含むエクソンを切除するのに必要な認識部位でゲノムを編集する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの能力を測定した。ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列を標的とする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼｍＲＮＡの量の増加は、デジタル液滴ＰＣＲによって定量されるように、５００，０００ｂｐを超える断片を切除し、２７％までの頻度で遺伝子を完全にライゲーションして戻すことができた。これらのデータは、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ対による大規模編集/欠失のインビトロ概念実証を支持する。
実施例５
ＤＭＤ患者から単離された不死化細胞株におけるＤＭＤメガヌクレアーゼの対の量の増加後のインビトロでのジストロフィンの大欠失及び回復の分析
１．方法
ＤＭＤ患者細胞株ＡＢ１０９８において、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８ヌクレアーゼの対をさらに評価した。ＤＭＤ患者筋芽細胞株を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｙｏｌｏｇｙ（Ｓｏｒｂｏｎｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。この細胞株は、エクソン４８～５０の欠失を有する患者の脊髄筋から不死化されたものであり、欠失したエクソンによりジストロフィンタンパク質を欠損している。
細胞を３０００細胞／ｃｍ２で播種し、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ筋肉成長培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中で成長させた。Ｐ５エレクトロポレーション溶液（Ｌｏｎｚａ）中の１ｅ６細胞でトランスフェクションを行い、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニットを使用してＥＹ１００プログラムでトランスフェクトした。ヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６メガヌクレアーゼのそれぞれについて１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ、８０ｎｇ又は１６０ｎｇであった。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートの個々のウェルの増殖培地に播種した。エレクトロポレーションの１日後、分化させる細胞をＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）１０ｕｇ／ｍｌインスリン及び５０ｕｇ／ｍｌゲンタマイシンに変更し、未分化として維持する細胞を増殖培地中で維持した。ＤＮＡ及びタンパク質抽出のためのエレクトロポレーションの２日後及び８日後に細胞を回収した。ｇＤＮＡ単離及びデジタル液滴ＰＣＲを利用して、上記の実施例３で指定されたＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８完全ライゲーションの大欠失の頻度（インデル％）を決定した。タンパク質抽出のために、細胞をＴｒｙｐＬＥでプレートから回収し、ペレット化し、次いでＰＢＳですすぎ、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む１×ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって決定した。ＷＥＳ（タンパク質単純）による分析のために、溶解物を２５０ｎｇ／ｕｌに正規化し、標準プログラムを使用して６６～４４０ｋＤａモジュールで実行した。ジストロフィンの検出に使用した一次抗体は１：１０００のａｂ１５４１６８であった。一次抗体対ビンキュリン（Ａｂｃａｍ）をローディングコントロールとして使用した（１：２００）。
２．結果
このＤＭＤ患者細胞株において、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの量が増加すると、大欠失/完全ライゲーションの用量依存的増加が見られた。完全ライゲーションは、４％～２９％（低用量～高用量ｍＲＮＡ）の範囲であった（図１５）。
エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質の発現を、ＷＥＳ自動ウェスタンブロット分析によって測定した。改変ジストロフィンの量の用量依存的増加は、ＷＥＳ染色体読み取りで見られ、最高用量１６０ｎｇ（線Ｆ）、８０ｎｇ（線Ｅ）、４０ｎｇ（線Ｄ）、２０ｎｇ（線Ｃ）、１０ｎｇ（線Ｂ）及びモック（線Ａ）である（図１６Ａ）。ＷＥＳシステムは、生成された染色体データをより伝統的なウェスタンブロット図に変換し、読み出しを複製した。ジストロフィンはモック未処理ＡＢ１０９８細胞では検出されず、ジストロフィンのバンドの強度は用量範囲にわたって増加した（図１６Ｂ）。ジストロフィン回復をローディングコントロールであるビンキュリンタンパク質に対して正規化し、タンパク質回復の量をローディングに対して計算した（図１６Ｃ）。モックにおいてジストロフィンは測定されなかったが、ジストロフィンの７倍の増加が用量曲線にわたって観察された。
３．結論
これらの実験は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４８～５０を欠く患者から単離された細胞株におけるエクソン４５～５５の大欠失を報告する。この細胞株は、検出可能なレベルのジストロフィンを発現せず、ＤＭＤ疾患の良好なインビトロモデルである。図１６のＷＥＳタンパク質データは、短縮された改変ジストロフィンタンパク質の発現の回復を示し、未処理のモック細胞ではタンパク質発現はなく、すべての遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ用量範囲にわたって検出可能なレベルになった。これは、エクソン４５～５５を切除し、ジストロフィン遺伝子をベッカージストロフィン表現型に変換することによってＤＭＤ患者を処置する目的で二重遺伝子操作メガヌクレアーゼを使用することのさらなる確認及びインビトロ概念実証である。
実施例６
ＲＮＡスプライスメッセージの解析
１．方法
この研究は、メガヌクレアーゼ送達後のＲＮＡスプライスメッセージを見て、患者細胞株ＡＢ１０９８中のＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの対を特徴付けた。
細胞を培養し、実施例５に記載のようにエレクトロポレーションした。ヌクレアーゼｍＲＮＡ用量の用量は、各メガヌクレアーゼについて１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ、８０ｎｇ、又は１６０ｎｇであった（ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３６Ｌ．１６６）。フェノールクロロホルム及びＰｕｒｅｌｉｎｋ ＲＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用したＲＮＡ抽出のために８日目に細胞を回収した。ＲＮＡ単離後、ｃＤＮＡ合成を、ｉＳＣＲＩＰＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行い、ｄｄＰＣＲを利用して、エクソン４４～エクソン５６のスプライシングの頻度を決定した。処理細胞のジストロフィンスプライスメッセージを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入した遺伝子、アンキリンリピートドメイン含有タンパク質２７（ＡＮＫＲＤ２７）についての参照メッセージアッセイに対して正規化した（アッセイ＃ Ｈｓ０１０４７６２４＿ｇ１）。
ＣＤＮＡ合成条件：２５℃、室温で５分間、４６℃で２０分間プライミングし、９５℃で１分間不活性化した。９５℃で１０分間のｄｄＰＣＲサイクリング、続いて９５℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、７２℃で１分間の４５サイクル、及び９８℃で１０分間の最終不活性化。
Figure 0007642809000015
２．結果
患者細胞株において、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．１６６遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡの量が増加すると、エクソン４４～エクソン５６のスプライスメッセージの用量依存的増加が見られた。スプライスメッセージ対参照遺伝子メッセージ比は、モックにおける０．０１％から高用量ｍＲＮＡにおける９．５１％までの範囲であった（図１７）。
３．結論
これらの実験は、ＤＭＤ患者から単離された細胞株におけるジストロフィンＲＮＡメッセージのエクソン４５～５５の大欠失を実証した。この細胞株は、検出可能なレベルのジストロフィンを発現せず、ＤＭＤ疾患の良好なインビトロモデルである。図１７のスプライスメッセージデータは、エクソン４５～５５の標的化された欠失を示す。これは、エクソン４５～５５を切除し、「ベッカー」ジストロフィン表現型を回復させることによってＤＭＤ患者を処置する目的で二重遺伝子操作メガヌクレアーゼ戦略を使用することのさらなる確認及びインビトロ概念実証である。
実施例７
初代ヒト骨格筋筋芽細胞におけるエクソン４５～５５の除去後のジストロフィン遺伝子における完全ライゲーション事象の分析
１．方法
これらの実験では、実施例４に記載されているように、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼが、ヒト初代筋肉細胞であるヒト骨格筋筋芽細胞においてジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５を切除する能力を評価した。細胞を解凍し、骨格筋細胞増殖培地－２（ＳｋＧＭ－２）に３５００細胞／ｃｍ２で播種し、エレクトロポレーションまで７０％以下の細胞密集度に維持した。１ｅ６細胞を用いてトランスフェクションを行った。Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ ４Ｄシステムを使用して、各ＤＭＤメガヌクレアーゼを対でコードする４０ｎｇのｍＲＮＡ（ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３５－３６ｘ．６３；ＤＭＤ １９－２０Ｌ．２４９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．１９５；ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２；ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．２８２；ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３０２及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９；又はＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９）又はＧＦＰのいずれかを細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートの個々のウェルの増殖培地に播種した。ＤＮＡのためのエレクトロポレーションの２日後に細胞を回収した。ｇＤＮＡ単離及びデジタル液滴ＰＣＲを利用して、上記の実施例３で指定されたＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６完全ライゲーションの大欠失の頻度（インデル％）を決定した。
２．結果
図１８に示されるように、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの各対は、この初代筋芽細胞株においてエクソン４５～５５の欠失及びジストロフィン遺伝子の完全ライゲーションを示した。
３．結論
これらの結果は、ジストロフィン遺伝子内のＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６認識配列を標的とする本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対が、ジストロフィン遺伝子からエクソン４５－５５を切除し、続いてジストロフィン遺伝子の完全ライゲーションを誘導することができることをさらに実証する。これらのデータは、実施例４で提供されたデータと一致し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによる大規模な編集及び欠失のインビトロ概念実証をさらに支持する。
実施例８
追加のＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼの生成
１．方法
メガヌクレアーゼの効力及び特異性を増加させるために、３回の開発後に追加のＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼを作製した。メガヌクレアーゼ特異性は、ＯｌｉｇｏＣａｐｔｕｒｅアッセイを使用して測定した。これは、ゲノム内のＤＳＢにおける合成オリゴヌクレオチド（オリゴ）カセットの組み込みに依存する細胞ベースのインビトロアッセイである。オリゴをアンカーとして使用して、組込み部位の両側へのゲノムＤＮＡを増幅し、配列決定し、マッピングすることができる（図１９）。これにより、ヌクレアーゼの潜在的なオフターゲット編集部位の最小限に偏った評価が可能になる。この技術は、感度を高め、メガヌクレアーゼによって誘導される３´相補的オーバーハングに対応するように特異的に改変されたＧｕｉｄｅＳｅｑ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３３：１８７－９７）から適合された。ＯｌｉｇｏＣａｐｔｕｒｅ解析ソフトウェアは、配列に依存しない。すなわち、ヌクレアーゼがどのＤＮＡ配列を切断することができるかに関して、事前の想定はなされていない。ＯｌｉｇｏＣａｐｔｕｒｅアッセイでは、細胞にヌクレアーゼｍＲＮＡ及び二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする。２日後、細胞ゲノムＤＮＡを単離し、より小さなサイズに剪断した。オリゴヌクレオチドアダプタを剪断ＤＮＡにライゲーションし、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、一端にアダプタを含み他端に捕捉オリゴヌクレオチドを含む任意のＤＮＡ片を増幅させた。増幅したＤＮＡを精製し、配列決定ライブラリを調製し、配列決定した。データをフィルタリングし、オリゴヌクレオチドを捕捉した有効な部位について分析して、潜在的なオフターゲット部位を同定した。配列リードを参照ゲノムに整列させ、潜在的なメガヌクレアーゼ切断部位についてスキャンした１０００塩基対のウィンドウ内の配列をグループ化した。ＨＥＫ２９３細胞に、最適化の各回（１～３回）で複数のＤＭＤ １９－２０ヌクレアーゼのｍＲＮＡをトランスフェクトし、ｇＤＮＡを単離し、アッセイの説明において上に記載したように処理した。
２．結果
図２０に示すように、ＨＥＫ２９３細胞において各ＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼによって生成された各オフターゲット部位は、その部位で捕捉されているプローブオリゴに対する固有の配列リードの数に基づいてプロットされ、左側のドットクラスタは低いリードカウントを表し、右側のドットは高いリードカウントを表す。ＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼの特異性は、グラフの中央領域にいくつの中間部位が見出されるか、及びそれらのリードカウントがどれだけ低いかによって判断することができる。より少ないドットは、全体的に検出された潜在的なオフターゲット部位が少ないことと相関し、左に近いドットは、リードカウントが少なく、それらが正当なオフターゲットであるという信頼性が低いことと相関する。意図されたＤＭＤ標的部位は、最も高いリードカウントを有するべきであり、これは、円内のＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼドットに含めるために選択された両方のヌクレアーゼの場合である。より濃い青色のスポットによって示される標的部位配列と比較して、より少ない配列不一致にも対応する。
３．結論
１９－２０標的部位に対するメガヌクレアーゼ特異性は、３回の開発にわたって増加した。これらのメガヌクレアーゼは、標的化されたオフターゲットを特徴付けるのに必要な特異性プロファイルを有していた。
実施例９
追加のＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの生成
１．方法
メガヌクレアーゼの効力及び特異性を増加させるために、３回の開発後に追加のＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼを作製した。ヌクレアーゼ特異性を、実施例８に記載されるようにＯｌｉｇｏＣａｐｔｕｒｅアッセイを使用して測定した。
２．結果
図２１に示すように、ＨＥＫ２９３細胞において各ＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼによって生成された各オフターゲット部位は、その部位で捕捉されているプローブオリゴに対する固有の配列リードの数に基づいてプロットされ、左側のドットクラスタは低いリードカウントを表し、右側のドットは高いリードカウントを表す。ＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの特異性は、グラフの中央領域にいくつの中間部位が見出されるか、及びそれらのリードカウントがどれだけ低いかによって判断することができる。より少ないドットは、全体的に検出された潜在的なオフターゲット部位が少ないことと相関し、左に近いドットは、リードカウントが少なく、それらが正当なオフターゲットであるという信頼性が低いことと相関する。意図されたＤＭＤ標的部位は、最も高いリードカウントを有するべきであり、これは、円内のＤＭＤ３５－３６メガヌクレアーゼドットに含めるために選択された両方のヌクレアーゼの場合である。より濃い青色のスポットによって示される標的部位配列と比較して、より少ない配列不一致にも対応する。
３．結論
３５－３６標的部位に対するメガヌクレアーゼ特異性は、３回の開発にわたって増加した。これらの生成されたメガヌクレアーゼは、標的化されたオフターゲットを特徴付けるのに必要な特異性プロファイルを有していた。
実施例１０
ＤＭＤメガヌクレアーゼの対を使用したＤＭＤ患者細胞株におけるジストロフィン遺伝子の編集
１．方法
ＤＭＤ患者細胞株ＡＢ１０９８において、改善されたＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ３５－３６及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの対をさらに評価した。ＤＭＤ患者筋芽細胞株を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｙｏｌｏｇｙ（Ｓｏｒｂｏｎｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。この細胞株は、エクソン４８～５０の欠失を有する患者の脊髄筋から不死化されたものであり、欠失したエクソンによりジストロフィンタンパク質を欠損している。以下の表１４に示すように、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６又はＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８認識配列を標的とする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの対を細胞に形質導入した。
Figure 0007642809000016
細胞を３０００細胞／ｃｍ２で播種し、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ筋肉成長培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中で成長させた。Ｐ５エレクトロポレーション溶液（Ｌｏｎｚａ）中の１ｅ６細胞でトランスフェクションを行い、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘユニットを使用してＥＹ１００プログラムでトランスフェクトした。メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、ＤＭＤ １９－２０、ＤＭＤ ３５－３６、及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼのそれぞれについて４０ｎｇであった。エレクトロポレーション後、細胞を６ウェルプレートの個々のウェルの増殖培地に播種した。エレクトロポレーションの１日後、分化させる細胞をＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）１０ｕｇ／ｍｌインスリン及び５０ｕｇ／ｍｌゲンタマイシンに変更し、未分化として維持する細胞を増殖培地中で維持した。ＤＮＡ及びタンパク質抽出のためのエレクトロポレーションの２日後及び８日後に細胞を回収した。ｇＤＮＡを単離し、デジタル液滴ＰＣＲを利用して、ＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３５－３６及びＤＭＤ １９－２０～ＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼの大欠失の頻度（インデル％）を決定した。試薬、サイクリング条件及び参照アッセイを、実施例２に記載されるように行い、ＰＣＲプライマー及びプローブを切り替えて全ライゲーションを測定した。このｄｄＰＣＲアッセイでは、１９－２０結合部位の５´のフォワードプライマー及び３５－３６部位又は３７－３８部位に対して３´のリバースプライマー並びにライゲーションされた１９－２０／３５－３６部位又は１９－２０／３７－３８部位の５´の５１塩基対の配列に特異的なプローブを使用した（以下の表１５を参照）。各二重メガヌクレアーゼアッセイで、実施例２と同じ参照アンプリコンアッセイを含めることにより、メガヌクレアーゼの対によって影響されない領域に対する大欠失の比の定量を可能にした（以下の表１５を参照）。
タンパク質抽出のために、細胞をＴｒｙｐＬＥでプレートから回収し、ペレット化し、次いでＰＢＳですすぎ、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む１×ＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって決定した。ＷＥＳ（タンパク質単純）による分析のために、溶解物を２５０ｎｇ／ｕｌに正規化し、標準プログラムを使用して６６～４４０ｋＤａモジュールで実行した。ジストロフィンの検出に使用した一次抗体は、１：５０のｍａｎｄｙＳ１０であった。一次抗体対ビンキュリン（Ａｂｃａｍ）をローディングコントロールとして使用した（１：１００）。
Figure 0007642809000017
２．結果
このＤＭＤ患者細胞株において、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６又はＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの異なる対では、様々なレベルの大欠失/全ライゲーションが見られた（図２２及び図２４Ａ）。全ライゲーションは、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６の対（図２２）では８％～２２．７％、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８の対（図２４Ａ）では１％強～１２％の範囲であった。
エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質の発現を、ＷＥＳによって測定した。ＷＥＳシステムは、生成された染色体データをより伝統的なウェスタンブロット図に変換し、読み出しを複製した。ジストロフィンは、モック未処理ＡＢ１０９８細胞では検出されなかった。ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６遺伝子操作メガヌクレアーゼ対のそれぞれについて短縮された改変ジストロフィンが検出された（図２３Ａ）。短縮された改変ジストロフィンの回復をローディングコントロールであるビンキュリンタンパク質に対して正規化し、タンパク質回復の量をローディングに対して計算した（図２３Ｂ）。同様に、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８遺伝子操作メガヌクレアーゼの対で処理した細胞について、その組織から生成した標準曲線に基づくｈＤＭＤマウス四頭筋からの等量（５００ｎｇ）の溶解物の相対発現レベルと比較して、短縮された改変ジストロフィンが検出された（図２４Ｂ）。モックではジストロフィンが測定されなかったが、短縮された改変ジストロフィンが各メガヌクレアーゼ対で検出された。
３．結論
これらの実験は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４８～５０を欠く患者から単離された細胞株におけるエクソン４５～５５の大欠失を報告する。この細胞株は、検出可能なレベルのジストロフィンを発現せず、ＤＭＤ疾患の良好なインビトロモデルである。ＷＥＳタンパク質データ（図２３Ａ）並びに図２３Ｂ及び２４Ｂの定量化は、短縮された改変ジストロフィンタンパク質の発現の回復を示し、未処理のモック細胞ではタンパク質発現はなく、すべての遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ用量範囲にわたって検出可能なレベルになった。このタンパク質定量は、エクソン４５～５５を切除し、ジストロフィン遺伝子をベッカージストロフィン表現型に変換することによってＤＭＤ患者を処置する目的で二重遺伝子操作メガヌクレアーゼを使用することのさらなる確認及びインビトロ概念実証である。
実施例１１
ｈＤＭＤマウス試験（ＴＤ０６６）におけるインビボでのジストロフィン遺伝子の編集
１．方法
ｈＤＭＤマウスにおけるインビボ研究を行って、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼ対の送達によって誘導されるインビボ編集及びヒトジストロフィンタンパク質回復を調べた。ＡＡＶ９（１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ）を封入した３つの異なる構築物を用いて、後眼窩全身注射によってマウスに注射した。第１のＡＡＶは、５´から３´に、Ａ１７－１２０エンハンサ、筋肉特異的プロモータＭＨＣＫ７、ＳＶ４０イントロン配列、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３ヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ３７－３８ｘ．１５ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。さらに、２つのＡＡＶ９構築物を、各ヌクレアーゼが別個の筋特異的プロモータから駆動される２カセットアプローチを使用して調査した。各ウイルスゲノムは、ＩＴＲ直後の５´末端にＣＫ８又はＭＨＣＫ７筋特異的プロモータのいずれかを含み、次いで、ＨＢＡ２ ５´ＵＴＲ、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、次いで筋肉特異的プロモータＳＰｃ５－１２、ＸＢＧ ５´ＵＴＲ配列、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５ヌクレアーゼのコード配列、ＸＢＧ ３´ＵＴＲ配列及びＢｇＨポリアデニル化シグナルを含む。注射の１４日後、マウスを屠殺し、骨格筋（四頭筋）、心臓、横隔膜、ヒラメ筋及び肝臓の組織切片を分子分析及び組織学的分析のために収集した。実施例１０のｄｄＰＣＲアッセイでは、１９－２０結合部位の５´のフォワードプライマー、３５－３６部位の３´のリバースプライマー及びライゲーションされた１９－２０／３５－３６部位の５´の５１塩基対の配列に特異的なプローブを使用した。この実施例における完全ライゲーションアッセイは、１９～２０及び３５～３６の結合部位の完全ライゲーションに特異的なプローブ配列を、同等のフォワードプライマー対及びリバースプライマー対（１９－２０結合部位のフォワードプライマー５´、３５－３６部位へのリバースプライマー３´；表１６）と共に使用した。
Figure 0007642809000018
２．結果
単一プロモータＭＨＣＫ７ Ｐ２Ａ ＡＡＶは、すべての組織にわたって完全ライゲーション事象に成功した（平均して四頭筋で２．８％、心臓で５．３％、横隔膜で０．８５％、ヒラメ筋で３．９％及び肝臓で２．４％）。ＣＫ８／ＳＰｃ５－１２二重プロモータＡＡＶは、肝臓を除くすべての組織で完全ライゲーションに成功した（四頭筋で平均５．５％、心臓で５．９％、横隔膜で２％、ヒラメ筋で１．４５％及び肝臓で０．３％）。ＭＨＣＫ７／ＳＰＣ５１２二重プロモータＡＡＶは、平均して四頭筋で０．２％、心臓で１．７％、横隔膜で０．０４％、ヒラメ筋で１．４５％及び肝臓で０．０８％の最小の完全ライゲーション事象を有していた（図２５Ａ～２５Ｅ）。
３．結論
ここで、本発明者らは、ヒト化ＤＭＤマウスモデルにおけるホットスポット領域（エクソン４５～５５）のインビボ切除を報告する。二重プロモータＣＫ８＋ＳＰｃ５－１２の組み合わせは、肝臓でのオフ器官の編集が少なく、ｑｕａｄ、横隔膜及び心臓での編集が多いようである。
実施例１２
ｈＤＭＤマウス試験（ＴＤ０６９）におけるインビボでのジストロフィン遺伝子の編集
１．方法
ｈＤＭＤマウスにおけるインビボ研究を行って、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３７－３８Ｌ．２１９メガヌクレアーゼ対の送達によって誘導されるインビボ編集及びヒト改変ジストロフィンタンパク質回復を調べた。ＡＡＶ９（１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ）を封入した４つの異なる構築物を用いて、後眼窩全身注射によってマウスに注射した。ＡＡＶの第１のセットは、３´下流ヌクレアーゼを変化させたが、２つの間ですべての要素を等しく保った。これらは、５´から３´に、Ａ１７－１２０エンハンサ、筋肉特異的プロモータＣＫ８、ＳＶ４０イントロン配列、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９ヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９又はＤＭＤ３７－３８Ｌ．２１９ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。ＡＡＶの次のセットは、３´下流ヌクレアーゼを変化させたが、２つの間ですべての要素を等しく保った。５´から３´に、Ａ１７－１２０エンハンサ、筋肉特異的プロモータＣＫ８、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９ヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９又はＤＭＤ３７－３８Ｌ．２１９ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。注射の１４日後、マウスを屠殺し、骨格筋（四頭筋）、心臓、横隔膜、ヒラメ筋及び肝臓の組織切片を分子分析及び組織学的分析のために収集した。実施例１０に記載のようにｄｄＰＣＲを行った。
２．結果
Ａ１７－１２０ ＣＫ８ ＳＶ４０イントロンＤＭＤ１９－２０Ｌ．３２９ Ｐ２Ａ ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９を含有するＡＡＶは、すべての組織にわたって全ライゲーション事象に成功した（平均して四頭筋で３．３％、心臓で５．７％、横隔膜で２．６％、ヒラメ筋で０．６％及び肝臓で４．１％）。Ａ１７－１２０ ＣＫ８ ＳＶ４０イントロンＤＭＤ１９－２０Ｌ．３２９ Ｐ２Ａ ＤＭＤ３７－３８Ｌ．２１９を含有するＡＡＶは、すべての組織にわたって最小の全ライゲーション事象を有した（平均して四頭筋で０．７％、心臓で１．６％、横隔膜で１．４％、ヒラメ筋で０．３％及び肝臓で１．３％）。Ａ１７－１２０ ＣＫ８ ＤＭＤ１９－２０Ｌ．３２９ Ｐ２Ａ ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９を含有するＡＡＶは、すべての組織にわたって全ライゲーション事象に成功した（平均して四頭筋で５．６％、心臓で３．６％、横隔膜で３．６％、ヒラメ筋で４．３％及び肝臓で２．２％）。Ａ１７－１２０ ＣＫ８ ＤＭＤ１９－２０Ｌ．３２９ Ｐ２Ａ ＤＭＤ３７－３８Ｌ．２１９を含有するＡＡＶは、すべての組織にわたって最小の全ライゲーション事象を有した（平均して四頭筋で２．１％、心臓で３．４％、横隔膜で１．２％、ヒラメ筋で０．３５％及び肝臓で０．９３％）（図２６Ａ～２６Ｅ）。
３．結論
ここで、本発明者らは、実施例１１で使用したＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼによるエクソン４５～５５の切除、並びにＤＭＤ １９－２０ヌクレアーゼとＤＭＤ ３７－３８標的部位の異なる下流ヌクレアーゼとの対を報告する。この実験では、ＤＭＤ １９－２０メガヌクレアーゼ及びＤＭＤ ３５－３６メガヌクレアーゼの対は、ＤＭＤ １９－２０及びＤＭＤ ３７－３８メガヌクレアーゼ対よりも高いレベルの編集を有していた。プロモータの下流にＳＶ４０イントロンを追加すると、標的組織での編集が最小限に増加し、肝臓での編集が増加した。
実施例１３
ｈＤＭＤｄｅｌ５２／Ｃ５７マウス試験（ＴＤ０７５）におけるインビボでのジストロフィン遺伝子の編集
１．方法
ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ（ｈＤＭＤマウス）マウスにおけるインビボ研究を行って、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼ対の送達によって誘導されるインビボ編集及び短縮化された改変ヒトジストロフィンタンパク質回復を調べた。マウスに、１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ又は２ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇの２つの用量のＡＡＶ９を封入した１つの構築物を眼窩後全身注射によって注射した。ＡＡＶは、５´から３´に、筋肉特異的プロモータＣＫ８、ＳＶ４０イントロン配列、ＤＭＤ １９－２０ｘ．１３メガヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。注射の１４日後、マウスを屠殺し、骨格筋（四頭筋）、心臓、横隔膜、ＴＡ及び肝臓の組織切片を分子、タンパク質及び組織学的分析のために収集した。実施例１０に記載のようにｄｄＰＣＲを行った。実施例１０に記載されているように、Ｗｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、ヌクレアーゼ処置動物の四頭筋、心臓、及び横隔膜のジストロフィンタンパク質発現を評価した。ジストロフィン発現をハウスキーピングタンパク質ビンキュリンに対して正規化し、全長ジストロフィンを発現するｈＤＭＤマウスから単離したジストロフィンタンパク質の標準曲線に対して測定した。ヌクレアーゼ処置マウスからの組織切片もまた、ジストロフィン及びメガヌクレアーゼタンパク質発現を可視化するためにＩＨＣ分析に供した。
２．結果
ＣＫ８、ＳＶ４０イントロン、及びＤＭＤ１９－２０ｘ．１３ Ｐ２Ａ ＤＭＤ３７－３８ｘ．１５を１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ（１ｘ１０１２総ＡＡＶ）で含有するＡＡＶは、すべての組織にわたって全ライゲーション事象に成功した（平均して四頭筋で４．３％、心臓で３．６％、横隔膜で１．９％、ＴＡで２．５％及び肝臓で０．６％）。ＣＫ８、ＳＶ４０イントロン、及びＤＭＤ１９－２０ｘ．１３ Ｐ２Ａ ＤＭＤ３７－３８ｘ．１５を２ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ（４ｘ１０１２総ＡＡＶ）で含有するＡＡＶは、すべての組織にわたって全ライゲーション事象に成功した（平均して四頭筋で３．４％、心臓で２．７％、横隔膜で３．９％、ＴＡで２．８％及び肝臓で１．９％）（図２７Ａ～２７Ｅ）。ジストロフィン回復を、ＷＥＳタンパク質分析からの標準曲線によってタンパク質標準からのｈＤＭＤマウスにおける対応する組織からのジストロフィンタンパク質を比較することによって定量した。図２８Ａ～２８Ｃに示すように、レーン１～６は、標準曲線を表す。レーン７～８は、１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇのＤＭＤ １９－２０ｘＤＭＤ１９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼで処置したｈＤＭＤマウス由来の筋組織を表す。レーン９～１０は、２ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇのＤＭＤ１９－２０ｘ．１３及びＤＭＤ３７－３８ｘ．１５メガヌクレアーゼで処置した筋肉を表す。レーン１１～１２はＰＢＳで処置したマウスを表す。標準曲線に基づいて、処置マウスは、平均して心臓で６．５％のジストロフィン、横隔膜で１．５％のジストロフィン（低用量）又は３％のジストロフィン（高用量）、及び四頭筋で４．５％のジストロフィンを有することが分かった（図２８Ａ～２８Ｃ）。
３．結論
ここで、本発明者らは、ヒトジストロフィン遺伝子に欠失を有するヒト化ＤＭＤマウスモデルにおけるホットスポット領域（エクソン４５～５５）のインビボ切除を報告する。この遺伝子型は、疾患モデル又は患者において見出され得るものの一例である。２つの用量レベルで編集の有意差は見られなかった。このマウスモデルは、図２８Ａ～２８Ｃのレーン１１及び１２に見られるようにヒトジストロフィンを作製しない。ここで、本発明者らは、突然変異のためにヒトジストロフィンを作製しないインビボモデルにおける短縮された改変ヒトジストロフィンの回復の概念実証を報告する。
実施例１４
ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ＭＤＸマウス試験（ＴＤ０７３）におけるインビボでのジストロフィン遺伝子の編集
１．方法
ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ（ｈＤＭＤ）マウスにおけるインビボ研究を行って、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼ対の送達によって誘導されるインビボ編集及び短縮化された改変ヒトジストロフィンタンパク質回復を調べた。ＡＡＶ９（１ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ）を封入した３つの異なる構築物を用いて、後眼窩全身注射によってマウスに注射した。第１のＡＡＶは、５´から３´に、Ａ１７－１２０エンハンサ、筋肉特異的プロモータＣＫ８、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９メガヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。第２のＡＡＶは、５´から３´に、Ａ１７－１２０エンハンサ、筋肉特異的プロモータＭＨＣＫ７、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９ヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。第３のＡＡＶは、５´から３´に、筋肉特異的プロモータＣＫ８、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥ要素、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、筋肉特異的プロモータＳＰｃ５－１２、ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＢｇＨポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成された。注射の１４日後、マウスを屠殺し、骨格筋（四頭筋）、心臓、横隔膜、及び肝臓の組織切片を分子、タンパク質及び組織学的分析のために収集した。実施例１０に記載のようにｄｄＰＣＲアッセイを行った。実施例１０に記載されているように、Ｗｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、ヌクレアーゼ処置動物の四頭筋、心臓、及び横隔膜のジストロフィンタンパク質発現を評価した。ジストロフィン発現をハウスキーピングタンパク質ビンキュリンに対して正規化し、全長ジストロフィンを発現するｈＤＭＤマウスから単離したジストロフィンタンパク質の標準曲線に対して測定した。
ヌクレアーゼ処置マウスからの四頭筋組織切片もまた、ジストロフィン及びメガヌクレアーゼタンパク質発現を可視化するためにＩＨＣ分析に供した。簡潔には、四頭筋組織を脱蝋し、ＢＯＮＤ ＲＸ上で４０分間、ＥＲ１を含むＨＩＥＲ（熱誘導エピトープ回収）で処理した。スライドを、ＭｏＭ（Ｍｏｕｓｅ ｏｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ、ＶＥＣＴＯＲ）ブロッキング試薬を含む１０％ ＮＧＳ ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）中、室温で１時間ブロックし、次いで、１：１５００の希釈のウサギモノクローナル抗メガヌクレアーゼ抗体（ＰＢＩ、Ｒａｂ５４）及びマウスモノクローナル抗Ｐａｘ７抗体（ＤＳＨＢ、上清、１：５）と共に、２％ ＮＧＳを含むＰＢＳＴ中、４ Ｃで湿潤チャンバにおいて一晩インキュベートした。翌日、試料を二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１：５００）と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＤＡＰＩ核を５分間対比染色した。過剰なＢＯＮＤ ＲＸ洗浄緩衝液を除去し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ Ｖｉｂｒａｎｃｅ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを使用してカバーガラスを取り付けた。Ｚｅｉｓｓ Ａｐｏｔｏｍｅ ２．０でイメージングを行った。
Ｐａｘ７ ＲＮＡとエクソン４４及び５６のジストロフィンスのプライシングされたメッセージとの共発現についてのＢａｓｅＳｃｏｐｅ分析を四頭筋組織切片に対して行った。この技術は、直接再ライゲーションによるゲノム修復後に作製されるエクソン４４及びエクソン５６接合部にまたがる約５０塩基対の検出可能なＲＮＡプローブ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ），Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡから入手）を利用する（図３４）。スライドを脱蝋し、室温で１０分間、ＲＮＡｓｃｏｐｅ過酸化水素溶液とインキュベートした後、９５℃で１５分間、蒸気中のＲＮＡｓｃｏｐｅ １ｘＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｒｅａｇｅｎｔで標的回収し、室温で３０分間、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＩＶ処理した。ジストロフィンエクソン４４～５６接合部及びＰａｘ７のプローブを添加し、ＨｙｂＥＺオーブン中で４０℃で２時間インキュベートし、次いで５ｘＳＳＣ中で一晩保存した。製造業者のプロトコルに従ってＢａｓｅＳｃｏｐｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ（ＡＣＤ）を使用してシグナルを増強し、続いてヘマトキシリン染色を行い、Ｌｅｉｃａ ＧＴ４５０デジタルスキャナでスライドを画像化した。
２．結果
全ライゲーションは、参照部位に対して四頭筋で平均１５％、心臓及び横隔膜で約４％であった（図２９）。標準曲線を使用してｈＤＭＤマウスの対応する組織からのジストロフィンタンパク質を比較することによって、短縮された改変ジストロフィン回復を定量した（図３０Ａ～３０Ｃ）。処置マウスは、四頭筋で平均８．２％、心臓で４．２％、横隔膜で２．８％であることが分かった（図３１）。ＰＢＳで処置したｈＤＭＤマウスでは、四頭筋組織においてヒトジストロフィン又はメガヌクレアーゼの発現は検出されなかった。特に、ＤＭＤ１９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９に曝露したｈＤＭＤマウスでは、短縮された改変ヒトジストロフィンの発現が回復し、メガヌクレアーゼタンパク質染色が隣接する組織切片に存在した（図３２）。四頭筋組織切片の免疫蛍光染色は、ＰＢＳ処置動物におけるヌクレアーゼについての最小バックグラウンド染色及びサテライト細胞の透明なＰａｘ７染色（白い矢じり）を示す（図３３Ａ）。ヌクレアーゼ処置動物では、サテライト細胞におけるヌクレアーゼの発現を示すＰａｘ７陽性細胞の集団の共染色が存在する（図３３Ｂ）。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ分析は、ＰＢＳ動物におけるＰａｘ７単独（図３５Ａ）と比較して、処置動物におけるＰａｘ７及びスプライシングされたＲＮＡ産物（エクソン４４～５６）の共発現を示した（図３５Ｂ）。
３．結論
この研究は、ＤＭＤ疾患モデルにおけるエクソン４５～５５の切除及びジストロフィンタンパク質の回復のためのインビボ概念実証を実証した。
実施例１５
ＤＭＤ患者細胞株におけるジストロフィンタンパク質発現の回復
１．方法
以前、本発明者らは、エクソン４８～５０並びにジストロフィン発現が欠損しているＤＭＤ患者細胞株ＡＢ１０９８におけるジストロフィンタンパク質の回復を報告した。ここで、本発明者らは、追加のＫＭ１３２８ ＤＭＤ患者細胞株における改善されたＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼを用いた同様の結果を報告する。ＤＭＤ患者筋芽細胞株を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｙｏｌｏｇｙ（Ｓｏｒｂｏｎｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。この細胞株は、エクソン５２の欠失を有する患者の脊髄筋から不死化され、これにより、欠失エクソンに起因してジストロフィンタンパク質欠損となった。細胞をエレクトロポレーションし、培養し、以前の実施例１０に記載されているように回収した。メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、２０ｎｇ、８０ｎｇ及び１６０ｎｇのＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼであった。比較のために、ＡＢ１０９８患者細胞を８０ｎｇのＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９メガヌクレアーゼでトランスフェクトした。タンパク質を、先に実施例１０に記載したようにＷＥＳシステムを使用して抽出し、定量し、分析した。ジストロフィンの検出に使用した一次抗体は、１：５０のｍａｎｄｙＳ１０６であった。一次抗体対ビンキュリン（Ａｂｃａｍ）をローディングコントロールとして使用した（１：１００）。
２．結果
エクソン４５～５５によってコードされるアミノ酸を欠く短縮された改変ジストロフィンタンパク質の発現を、ＷＥＳ自動ウェスタンブロット分析によって測定した。改変ジストロフィンの量の用量依存的増加が見られた。短縮された改変ジストロフィンタンパク質バンドは、図３６のレーン３～５及び図３７のレーン３で可視化することができる。比較のための全長ジストロフィンのタンパク質バンドは、図３６のレーン６及び図３７のレーン１で視覚化することができる。ジストロフィンはモック未処理ＫＭ１３２８細胞では検出されず、ジストロフィンのバンドの強度は用量範囲にわたって増加した（図３６）。
ＫＭ１３２８細胞において、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤ ３５－３６Ｌ．３４９遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの量が増加すると、大欠失/完全ライゲーションの用量依存的増加が見られた。このライゲーションは、メガヌクレアーゼ対の漸増用量で短縮された改変ジストロフィンの検出の増加をもたらした（図３６）。同様に、短縮された改変ジストロフィンの発現は、ＡＢ１０９８細胞において８０ｎｇ用量のメガヌクレアーゼ対で観察された（図３７）。
３．結論
これらの実験は、ジストロフィン遺伝子に欠失を有する複数のＤＭＤ細胞株から単離された細胞株におけるエクソン４５～５５の大欠失を報告する。これらの細胞株は、検出可能なレベルのジストロフィンを発現せず、ＤＭＤ疾患の良好なインビトロモデルである。図３６及び図３７のＷＥＳタンパク質データは、短縮された改変ジストロフィンタンパク質の発現の回復を示し、未処理のモック細胞ではタンパク質発現はなく、すべての遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ用量範囲にわたって検出可能なレベルになった。これは、エクソン４５～５５を切除し、ジストロフィン遺伝子をベッカージストロフィン表現型に変換することによってＤＭＤ患者を処置する目的で二重遺伝子操作メガヌクレアーゼを使用することのさらなる確認及びインビトロ概念実証である。
実施例１６
ＡＡＶｒｈ７４を使用したｈＤＭＤｄｅｌ５２／ＭＤＸマウス試験における筋肉細胞を発現するＰＡＸ ７におけるインビボでのジストロフィン遺伝子の編集
１．方法
このインビボ研究は、は、５´から３´に、Ａ１７－１２０エンハンサ、筋肉特異的プロモータＭＨＣＫ７、ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９ヌクレアーゼのコード配列、フューリンＧＳＧ Ｐ２Ａ切断配列、ＤＭＤ３５－３６Ｌ．３４９ヌクレアーゼのコード配列、ＷＰＲＥエレメント、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むウイルスゲノムから構成されるＡＡＶの評価であった。ＤＭＤ １９－２０Ｌ．３２９及びＤＭＤＬ．３４９メガヌクレアーゼを含有するＡＡＶｒｈ７４を、ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ（ｈＤＭＤ）マウスにおいて１ ｘ１０１４、３ ｘ１０１３、１ ｘ１０１３又は５ ｘ１０１２ ＶＧ／ｋｇの後眼窩全身注射によって送達して、ＰＢＳと比較した。注射の２８日後、マウスを屠殺し、骨格筋（四頭筋）、心臓、横隔膜、及び肝臓の組織切片を分子、タンパク質及び組織学的分析のために収集した。実施例１０に記載のようにデジタル液滴ＰＣＲを行った。実施例１０に記載されているように、Ｗｅｓ（商標）システム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、ヌクレアーゼ処置ｈＤＭＤｄｅｌ５２／ｍｄｘ動物の四頭筋、心臓、及び横隔膜のジストロフィンタンパク質発現を評価した。ジストロフィン発現をハウスキーピングタンパク質ビンキュリンに対して正規化し、全長ジストロフィンを発現するｈＤＭＤマウスから単離したジストロフィンタンパク質の標準曲線に対して測定した。ヌクレアーゼ処置マウスからの組織切片もまた、実施例１４に概説されるように、ジストロフィン及びメガヌクレアーゼタンパク質発現を可視化するために蛍光免疫組織化学分析に供した。
２．結果
四頭筋組織切片の免疫蛍光染色は、ＰＢＳ処置動物におけるヌクレアーゼについての最小バックグラウンド染色及びサテライト細胞の透明なＰａｘ７染色（白い矢じり）を示す（図３８Ａ）。ヌクレアーゼ処置動物では、サテライト細胞におけるヌクレアーゼの発現を示すＰａｘ７陽性細胞の集団の共染色が存在する（図３８Ｂ）。この研究は、試験した全ての用量にわたってＰａｘ７陽性細胞におけるヌクレアーゼの発現を明らかにした：１ ｘ１０１４ＶＧ／ｋｇ（図３８Ｂ）、３ ｘ１０１３ＶＧ／ｋｇ（図３８Ｃ）、及び１ ｘ１０１３ＶＧ／ｋｇ（図３８Ｄ）。
３．結論
この研究は、二重メガヌクレアーゼをキャプシド形成するＡＡＶｒｈ７４を使用して四頭筋のサテライト細胞集団を編集するためのさらなる概念実証を提供する。この研究は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現を有する既知のサテライトマーカーであるＰａｘ７の共発現を示し、メガヌクレアーゼがこの標的集団で発現され、したがって、ＡＡＶ９キャプシドを使用した同じ構築物を用いて実施例１４で以前に示されたようにこれらの細胞を編集する可能性があることを示した。
配列表
配列番号１
MNTKYNKEFLLYLAGFVDGDGSIIAQIKPNQSYKFKHQLSLAFQVTQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVRDRGSVSDYILSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIWRLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号２
LAGLIDADG
配列番号３
MAPKKKRKVH
配列番号４
MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREKAEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQLQQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSDLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYLSTTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPALGDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGGLEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKWLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESLTFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVSMKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKELDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNLDSEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKWIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNHRFAAISHRIKTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRITDERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKELQDGIGQRQTVVRTLNATGEEIIQQSSKTDASILQEKLGSLNLRWQEVCKQLSDRKKRLEEQKNILSEFQRDLNEFVLWLEEADNIASIPLEPGKEQQLKEKLEQVKLLVEELPLRQGILKQLNETGGPVLVSAPISPEEQDKLENKLKQTNLQWIKVSRALPEKQGEIEAQIKDLGQLEKKLEDLEEQLNHLLLWLSPIRNQLEIYNQPNQEGPFDVKETEIAVQAKQPDVEEILSKGQHLYKEKPATQPVKRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPALADFNRAWTELTDWLSLLDQVIKSQRVMVGDLEDINEMIIKQKATMQDLEQRRPQLEELITAAQNLKNKTSNQEARTIITDRIERIQNQWDEVQEHLQNRRQQLNEMLKDSTQWLEAKEEAEQVLGQARAKLESWKEGPYTVDAIQKKITETKQLAKDLRQWQTNVDVANDLALKLLRDYSADDTRKVHMITENINASWRSIHKRVSEREAALEETHRLLQQFPLDLEKFLAWLTEAETTANVLQDATRKERLLEDSKGVKELMKQWQDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLRELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM
配列番号５
MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQAVTTTQPSLTQTTVMETVTTVTTREQILVKHAQEELPPPPPQKKRQITVDSEIRKRLDVDITELHSWITRSEAVLQSPEFAIFRKEGNFSDLKEKVNAIEREKAEKFRKLQDASRSAQALVEQMVNEGVNADSIKQASEQLNSRWIEFCQLLSERLNWLEYQNNIIAFYNQLQQLEQMTTTAENWLKIQPTTPSEPTAIKSQLKICKDEVNRLSDLQPQIERLKIQSIALKEKGQGPMFLDADFVAFTNHFKQVFSDVQAREKELQTIFDTLPPMRYQETMSAIRTWVQQSETKLSIPQLSVTDYEIMEQRLGELQALQSSLQEQQSGLYYLSTTVKEMSKKAPSEISRKYQSEFEEIEGRWKKLSSQLVEHCQKLEEQMNKLRKIQNHIQTLKKWMAEVDVFLKEEWPALGDSEILKKQLKQCRLLVSDIQTIQPSLNSVNEGGQKIKNEAEPEFASRLETELKELNTQWDHMCQQVYARKEALKGGLEKTVSLQKDLSEMHEWMTQAEEEYLERDFEYKTPDELQKAVEEMKRAKEEAQQKEAKVKLLTESVNSVIAQAPPVAQEALKKELETLTTNYQWLCTRLNGKCKTLEEVWACWHELLSYLEKANKWLNEVEFKLKTTENIPGGAEEISEVLDSLENLMRHSEDNPNQIRILAQTLTDGGVMDELINEELETFNSRWRELHEEAVRRQKLLEQSIQSAQETEKSLHLIQESLTFIDKQLAAYIADKVDAAQMPQEAQKIQSDLTSHEISLEEMKKHNQGKEAAQRVLSQIDVAQKKLQDVSMKFRLFQKPANFEQRLQESKMILDEVKMHLPALETKSVEQEVVQSQLNHCVNLYKSLSEVKSEVEMVIKTGRQIVQKKQTENPKELDERVTALKLHYNELGAKVTERKQQLEKCLKLSRKMRKEMNVLTEWLAATDMELTKRSAVEGMPSNLDSEVAWGKATQKEIEKQKVHLKSITEVGEALKTVLGKKETLVEDKLSLLNSNWIAVTSRAEEWLNLLLEYQKHMETFDQNVDHITKWIIQADTLLDESEKKKPQQKEDVLKRLKAELNDIRPKVDSTRDQAANLMANRGDHCRKLVEPQISELNHRFAAISHRIKTGKASIPLKELEQFNSDIQKLLEPLEAEIQQGVNLKEEDFNKDMNEDNEGTVKELLQRGDNLQQRITDERKREEIKIKQQLLQTKHNALKDLRSQRRKKALEISHQWYQYKRQADDLLKCLDDIEKKLASLPEPRDERKIKEIDRELQKKKEELNAVRRQAEGLSEDGAAMAVEPTQIQLSKRWREIESKFAQFRRLNFAQIHTVREETMMVMTEDMPLEISYVPSTYLTEITHVSQALLEVEQLLNAPDLCAKDFEDLFKQEESLKNIKDSLQQSSGRIDIIHSKKTAALQSATPVERVKLQEALSQLDFQWEKVNKMYKDRQGRFDRSVEKWRRFHYDIKIFNQWLTEAEQFLRKTQIPENWEHAKYKWYLKDLQGEIEAHTDVYHNLDENSQKILRSLEGSDDAVLLQRRLDNMNFKWSELRKKSLNIRSHLEASSDQWKRLHLSLQELLVWLQLKDDELSRQAPIGGDFPAVQKQNDVHRAFKRELKTKEPVIMSTLETVRIFLTEQPLEGLEKLYQEPRELPPEERAQNVTRLLRKQAEEVNTEWEKLNLHSADWQRKIDETLERLRELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPRDAELIAEAKLLRQHKGRLEARMQILEDHNKQLESQLHRLRQLLEQPQAEAKVNGTTVSSPSTSLQRSDSSQPMLLRVVGSQTSDSMGEEDLLSPPQDTSTGLEEVMEQLNNSFPSSRGRNTPGKPMREDTM
配列番号６
AAGGATTATGTATTACCTCCCG
配列番号７
TTCCTAATACATAATGGAGGGC
配列番号８
TAAGATTGGGTATGAGGGATAG
配列番号９
ATTCTAACCCATACTCCCTATC
配列番号１０
CTACATGGTGTATCTGACTAAG
配列番号１１
GATGTACCACATAGACTGATTC
配列番号１２
CTGGCCGAAGTATAGGAATATG
配列番号１３
GACCGGCTTCATATCCTTATAC
配列番号１４
AAGGATTAT
配列番号１５
TTCCTAATA
配列番号１６
TAAGATTGG
配列番号１７
ATTCTAACC
配列番号１８
CTACATGGT
配列番号１９
GATGTACCA
配列番号２０
CTGGCCGAA
配列番号２１
GACCGGCTT
配列番号２２
TACCTCCCG
配列番号２３
ATGGAGGGC
配列番号２４
GAGGGATAG
配列番号２５
CTCCCTATC
配列番号２６
CTGACTAAG
配列番号２７
GACTGATTC
配列番号２８
AGGAATATG
配列番号２９
TCCTTATAC
配列番号３０
AAGGATTATGTATGAGGGATAG
配列番号３１
TTCCTAATACATACTCCCTATC
配列番号３２
AAGGATTATGTATCTGACTAAG
配列番号３３
TTCCTAATACATAGACTGATTC
配列番号３４
AAGGATTATGTATAGGAATATG
配列番号３５
TTCCTAATACATATCCTTATAC
配列番号３６
MNTKYNKEFLLYLAGFVDSDGSIYATIRPVQSTKFKHTLRLWFAVTQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDNGSVSWYYLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSICACIVPRQDRKFKHQLRLFFEVGQKTKRRWFLDKLVDEIGVGYVEDTGRASRYRLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号３７
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配列番号３８
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配列番号３９
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配列番号４０
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配列番号４１
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配列番号４２
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配列番号４３
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配列番号４４
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配列番号４５
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配列番号４６
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配列番号４７
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配列番号４８
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配列番号４９
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配列番号５０
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配列番号５１
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配列番号５２
MNTKYNKEFLLYLAGFVDADGSIYACIKPHQELKFKHQLLLYFEVYQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVADRGSVSEYRLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFASIIPSQEVKFKHTLLLRFRVCQATKRRWFLDKLVDEIGVGYVSDQGSASYYTLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号５３
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配列番号５４
MNTKYNKEFLLYLAGFVDADGSIVATIRPGQELKFKHGLRLRFYVCQKTQRRWFLDKLVDEIGAGYVTDSGSVSRYELSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVHQKTKRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGSASCYHLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号５５
MNTKYNKEFLLYLAGFVDADGSIVATIRPGQELKFKHGLRLRFYVCQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVTDSGSVSRYELSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVHQSTRRRWFLDKLVDEIGAGYVYDHGSASLYSLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号５６
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配列番号５７
MNTKYNKEFLLYLAGFVDSDGSIVARIEPAQDCKFKHRLRLQFFVSQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVRDSGSVSSYDLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLHFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号５８
MNTKYNKEFLLYLAGFVDSDGSIVARIEPAQDCKFKHRLRLQFFVSQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVRDSGSVSSYLLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号５９
MNTKYNKEFLLYLAGFVDADGSIVARIEPAQDCKFKHRLRLQFFVSQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVRDSGSVSSYNLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP
配列番号６０
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCTATGCCACGATCCGGCCTGTTCAAAGTACTAAGTTCAAGCACACTCTGCGGCTCTGGTTCGCGGTCACGCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACAATGGCAGCGTCTCCTGGTACTATCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGAGGACACGGGCAGGGCGAGCAGGTACCGGCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６１
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCTTTGCCGTTATCGAGCCTGTTCAAAGTGCTAAGTTCAAGCACCGGCTGAAGCTCTCGTTCGTTGTCACTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACCAGGGCAGCGTCTCCTTTTACAGGCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGGCAGACGACAAGGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTTTGACAAGGGCAGCGCGAGCATGTACCGGCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６２
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCTATGCCAGTATCATGCCTATTCAAACGGCTAAGTTCAAGCACCGTCTGAAGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６３
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCATTGCCTTTATCATGCCTAGTCAGACGGCTAAGTTCAAGCACCGTCTGAAGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGATCGGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAAGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６４
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCATGGCCTTTATCATGCCTACTCAGACGGCTAAGTTCAAGCACCGTCTGAAGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６５
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCATGGCCTTTATCTTGCCTGAGCAGCATATGAAGTTCAAGCACCGTCTGAGGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６６
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCATGGCCTTTATCTTGCCTGAGCAGCATCTTAAGTTCAAGCACCGTCTGAGGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACACAGCGCCGATGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６７
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCATGGCCTTTATCTTGCCTGAGCAGGGTCTGAAGTTCAAGCACCGTCTGAGGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACCGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６８
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCATGGCCTTTATCATGCCTGATCAGGCGCCTAAGTTCAAGCACCGTCTGAGGCTCCAGTTCGCGGTCGCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACTTTGGCAGCGTCTCCTATTACAGGCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTGTGCCTGTATCGTGCCTCGTCAAGATCGGAAGTTCAAGCACCAGCTGCGGCTCTTTTTCGAGGTCGGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGAGGGACCTTGGCAGCGCGAGCACTTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号６９
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATGCCGACGCAGTGGACGAAGTTCAAGCACTCGCTGTTGCTCCGGTTCCGGGTCACCCAGTCGACAAGGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGATGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACCAGGGCAGGGCGAGCTACTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７０
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGATTGACTCGGGCAGCGTCTCCACGTACCGGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCTAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGCTGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCCGGGTCACCCAGGCGACAAGGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGACGGACAACGGCAGGGCGAGCTACTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７１
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGCTGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCCGGGTCTGCCAGGCGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACCAGGGCAGCGCGAGCTACTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７２
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGGAGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCCGGGTCTGCCAGGCGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACCAGGGCAGCGCGAGCTACTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７３
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGGAGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCCGGGTCTGCCAGGCGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACCAGGGCAGCGCGAGCTACTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７４
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGGAGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCAGGGTCACTCAGGCGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACGTTGGCAGCGCGAGCTATTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７５
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAACAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGGAGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCCGGGTCTGCCAGGCGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACCGTGGCAGCGCGAGCTATTACACCCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７６
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCTATGCCTGTATCAAGCCTCATCAAGAGCTTAAGTTCAAGCACCAGCTGTTGCTCTATTTCGAGGTCTATCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGGCTGACCGTGGCAGCGTCTCCGAGTACCGTCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTCTATCATTCCGTCGCAGGAGGTTAAGTTCAAGCACACTCTGCTGCTCCGTTTCCGGGTCTGCCAGGCGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATTGGTGTGGGTTACGTGTCTGACCAGGGCAGCGCGAGCTACTACACCCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAGGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７７
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCGTGGCCACTATCCGGCCGGGGCAGGAGCTGAAGTTCAAGCACGGTCTGCGGCTCAGGTTCTATGTCTGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGACGGACAGTGGCAGCGTCTCCCGTTACGAGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAGACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTGTATCCGTCCGTCGCAGAGGGCTAAGTTCAAGCACGTGCTGCAGCTCTGTTTCAGGGTCCACCAGTTGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTAGGTTACGTGTATGACTGCGGCAGCGCGAGCTTCTACCACCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCAAGACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７８
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCGTGGCCACTATCCGGCCGGGGCAGGAGCTGAAGTTCAAGCACGGTCTGCGGCTCAGGTTCTATGTCTGTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGCGGGTTACGTGACGGACAGTGGCAGCGTCTCCCGTTACGAGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATCGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTGTATCCGTCCGTCGCAGAGGGCTAAGTTCAAGCACGTGCTGCAGCTCTGTTTCAGGGTCCACCAGAAGACAAAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGTATGACCACGGCAGCGCGAGCTGCTACCACCTGTCCGAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCCACACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号７９
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配列番号８０
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配列番号８１
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配列番号８２
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACTCTGACGGTTCCATCGTTGCCAGGATCGAGCCGGCTCAGGATTGTAAGTTCAAGCACAGGCTGAGGCTCCAGTTCTTTGTCTCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGCGGGACTCTGGCAGCGTCTCCAGTTACTTGCTGTCCCAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTGTATCCGTCCGTCGCAGAGGGCTAAGTTCAAGCACGTGCTGCAGCTCTGTTTCCGGGTCTTTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTAGGTTACGTGTATGACCACGGCAGGGCGAGCATCTACCAGCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCCACACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号８３
ATGAATACAAAATATAATAAAGAGTTCTTACTCTACTTAGCAGGGTTTGTAGACGCTGACGGTTCCATCGTTGCCAGGATCGAGCCGGCTCAGGATTGTAAGTTCAAGCACAGGCTGAGGCTCCAGTTCTTTGTCTCTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTGGGTTACGTGCGGGACTCTGGCAGCGTCTCCAGTTACAATCTGTCCGAGATCAAGCCTTTGCATAATTTTTTAACACAACTACAACCTTTTCTAAAACTAAAACAAAAACAAGCAAATTTAGTTTTAAAAATTATTGAACAACTTCCGTCAGCAAAAGAATCCCCGGACAAATTCTTAGAAGTTTGTACATGGGTGGATCAAATTGCAGCTCTGAATGATTCGAAGACGCGTAAAACAACTTCTGAAACCGTTCGTGCTGTGCTAGACAGTTTACCAGGATCCGTGGGAGGTCTATCGCCATCTCAGGCATCCAGCGCCGCATCCTCGGCTTCCTCAAGCCCGGGTTCAGGGATCTCCGAAGCACTCAGAGCTGGAGCAGGTTCCGGCACTGGATACAACAAGGAATTCCTGCTCTACCTGGCGGGCTTCGTCGACGGGGACGGCTCCATCTTTGCCTGTATCCGTCCGTCGCAGAGGGCTAAGTTCAAGCACGTGCTGCAGCTCTGTTTCCGGGTCTTTCAGAAGACACAGCGCCGTTGGTTCCTCGACAAGCTGGTGGACGAGATCGGTGTAGGTTACGTGTATGACCACGGCAGGGCGAGCATCTACCAGCTGTCCCAGATCAAGCCTCTGCACAACTTCCTGACCCAGCTCCAGCCCTTCCTGAAGCTCAAGCAGAAGCAGGCCAACCTCGTGCTGAAGATCATCGAGCAGCTGCCCTCCGCCAAGGAATCCCCGGACAAGTTCCTGGAGGTGTGCACCTGGGTGGACCAGATCGCCGCTCTGAACGACTCCCACACCCGCAAGACCACTTCCGAAACCGTCCGCGCCGTTCTAGACAGTCTCTCCGAGAAGAAGAAGTCGTCCCCCTAA
配列番号８４
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配列番号８５
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配列番号８６
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配列番号８７
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配列番号８８
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配列番号８９
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配列番号９０
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配列番号９１
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配列番号９２
KEFLLYLAGFVDSDGSIMAFIMPDQAPKFKHRLRLQFAVAQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDFGSVSYYRLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLD
配列番号９３
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配列番号９４
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配列番号９５
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配列番号９６
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配列番号９７
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配列番号９８
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配列番号９９
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配列番号１００
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配列番号１０１
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配列番号１０２
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配列番号１０３
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配列番号１０４
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配列番号１０５
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配列番号１０６
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配列番号１０７
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配列番号１０８
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配列番号１０９
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配列番号１１０
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配列番号１１１
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配列番号１１２
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配列番号１１３
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配列番号１１４
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配列番号１１５
KEFLLYLAGFVDGDGSICACIVPRQDRKFKHQLRLFFEVGQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVRDLGSASTYRLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLD
配列番号１１６
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配列番号１１７
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配列番号１１８
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配列番号１１９
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配列番号１２０
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配列番号１２１
KEFLLYLAGFVDGDGSIFASIIPSQEVKFKHTLLLRFRVCQATKRRWFLDKLVDEIGVGYVSDQGSASYYTLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２２
KEFLLYLAGFVDGDGSIFASIIPSQEVKFKHTLLLRFRVTQATKRRWFLDKLVDEIGVGYVSDVGSASYYTLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２３
KEFLLYLAGFVDGDGSIFASIIPSQEVKFKHTLLLRFRVCQATKRRWFLDKLVDEIGVGYVSDRGSASYYTLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２４
KEFLLYLAGFVDGDGSIFASIIPSQEVKFKHTLLLRFRVCQATKRRWFLDKLVDEIGVGYVSDQGSASYYTLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSRTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２５
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVHQLTKRRWFLDKLVDEIGVGYVYDCGSASFYHLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２６
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVHQKTKRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGSASCYHLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２７
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVHQSTRRRWFLDKLVDEIGAGYVYDHGSASLYSLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２８
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLD
配列番号１２９
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLHFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLD
配列番号１３０
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLD
配列番号１３１
KEFLLYLAGFVDGDGSIFACIRPSQRAKFKHVLQLCFRVFQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDHGRASIYQLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSHTRKTTSETVRAVLD
配列番号１３２
SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTG
配列番号１３３
CGGGAGGTAATACATAATCC
配列番号１３４
GGGTGGGTTGCTTTACCTCTC
配列番号１３５
TGGGCTACTGCAACTCTGTT
配列番号１３６
AGGACAAAAGAGGACGGTCTGCCCTGG
配列番号１３７
TAAGACCCAGCTTCACGGAG
配列番号１３８
TATGATCGCCTGTTCCTCCA
配列番号１３９
CTGGCCGAAGTATAGGAA
配列番号１４０
CGCAACATGTGACATAAAGAG
配列番号１４１
TCTGGATATCCTCTTCTGGG
配列番号１４２
CCTACATGGTGTATCTGAC
配列番号１４３
GAACACCACCAGAAAAACAAG
配列番号１４４
CACTTCCTGTAAGACAACCAG
配列番号１４５
ATCCCTCATACCCAATC
配列番号１４６
AAAAACCACGGTGCTGTTGA
配列番号１４７
ATGGGGTCCGAGACTTTTCC
配列番号１４８
GGGTGGGTTGCTTTACCTCTC
配列番号１４９
AGAGCATGCCATCTGAGTC
配列番号１５０
GTGAAGTAGCAAAGCACCTG
配列番号１５１
AGAGCATGCCATCTGAGTC
配列番号１５２
GGGTGGGTTGCTTTACCTCTC
配列番号１５３
TTTGGTATGGGGTCCGAGAC
配列番号１５４
GTGAAGTAGCAAAGCACCTG
配列番号１５５
TTTGGTATGGGGTCCGAGAC
配列番号１５６
GGGTGGGTTGCTTTACCTCTC
配列番号１５７
GATTCTCAGAAATGGAGTGACTG
配列番号１５８
GTGAAGTAGCAAAGCACCTG
配列番号１５９
GATTCTCAGAAATGGAGTGACTG
配列番号１６０
ATCAGAAGGATTATGTATAGGAATA
配列番号１６１
GGGTGGGTTGCTTTACCTCT
配列番号１６２
TCTGGATATCCTCTTCTGGG
配列番号１６３
GTGAAGTAGCAAAGCACCTG
配列番号１６４
GTGAAGTAGCAAAGCACCTG
配列番号１６５
AGTCACTTCCTAAGCTAAGACAACC
配列番号１６６
CAGAAGGATTATGTATGAGGGATA
配列番号１６７
GTGAAGTAGCAAAGCACCTG
配列番号１６８
ATGGGGTCCGAGACTTTTCC
配列番号１６９
CGGCCGTCCGCCTTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCTCTAGA
配列番号１７０
CCATCCTGGTCTATAGAGAGAGTTCCAGAACAGCCAGGGCTACAGATAAACCCATCTGGAAAAACAAAGTTGAATGACCCAAGAGGGGTTCTCAGAGGGTGGCGTGTGCTCCCTGGCAAGCCTATGACATGGCCGGGGCCTGCCTCTCTCTGCCTCTGACCCTCAGTGGCTCCCATGAACTCCTTGCCCAATGGCATCTTTTTCCTGCGCTCCTTGGGTTATTCCAGTCTCCCCTCAGCATTCCTTCCTCAGGGCCTCGCTCTTCTCTCTGCTCCCTCCTTGCACAGCTGGCTCTGTCCACCTCAGATGTCACAGTGCTCTCTCAGAGGAGGAAGGCACCATGTACCCTCTGTTTCCCAGGTAAGGGTTCAATTTTTAAAAATGGTTTTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGTTTTTCAAGACAGGGCTCCTCTGTGTAGTCCTAACTGTCTTGAAACTCCCTCTGTAGACCAGGTCGACCTCGAACTCTTGAAACCTGCCACGGACCACCCAGTCAGGTATGGAGGTCCCTGGAATGAGCGTCCTCGAAGCTAGGTGGGTAAGGGTTCGGCGGTGACAAACAGAAACAAACACAGAGGCAGTTTGAATCTGAGTGTATTTTGCAGCTCTCAAGCAGGGGATTTTATACATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCAAACATTACATCTCTTAGAAACTATATCCAATGAAACAATCACAGATACCAACCAAAACCATTGGGCAGAGTAAAGCACAAAAATCATCCAAGCATTACAACTCTGAAACCATGTATTCAGTGAATCACAAACAGAACAGGTAACATCATTATTAATATAAATCACCAAAATATAACAATTCTAAAAGGATGTATCCAGTGGGGGCTGTCGTCCAAGGCTAGTGGCAGATTTCCAGGAGCAGGTTAGTAAATCTTAACCACTGAACTAACTCTCCAGCCCCATGGTCAATTATTATTTAGCATCTAGTGCCTAATTTTTTTTTATAAATCTTCACTATGTAATTTAAAACTATTTTAATTCTTCCTAATTAAGGCTTTCTTTACCATATACCAAAATTCACCTCCAATGACACACGCGTAGCCATATGAAATTTTATTGTTGGGAAAATTTGTACCTATCATAATAGTTTTGTAAATGATTTAAAAAGCAAAGTGTTAGCCGGGCGTGGTGGCACACGCCTTTAATCCCTGCACTCGGGAGGCAGGGGCAGGAGGATTTCTGAGTTTGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGGGCTACACAGAGAAACCCTGTCTCGAACCCCCCACCCCCCAAAAAAAGCAAAGTGTTGGTTTCCTTGGGGATAAAGTCATGTTAGTGGCCCATCTCTAGGCCCATCTCACCCATTATTCTCGCTTAAGATCTTGGCCTAGGCTACCAGGAACATGTAAATAAGAAAAGGAATAAGAGAAAACAAAACAGAGAGATTGCCATGAGAACTACGGCTCAATATTTTTTCTCTCCGGCGAAGAGTTCCACAACCATCTCCAGGAGGCCTCCACGTTTTGAGGTCAATGGCCTCAGTCTGTGGAACTTGTCACACAGATCTTACTGGAGGTGGTGTGGCAGAAACCCATTCCTTTTAGTGTCTTGGGCTAAAAGTAAAAGGCCCAGAGGAGGCCTTTGCTCATCTGACCATGCTGACAAGGAACACGGGTGCCAGGACAGAGGCTGGACCCCAGGAACACCTTAAACACTTCTTCCCTTCTCCGCCCCCTAGAGCAGGCTCCCCTCACCAGCCTGGGCAGAAATGGGGGAAGATGGAGTGAAGCCATACTGGCTACTCCAGAATCAACAGAGGGAGCCGGGGGCAATACTGGAGAAGCTGGTCTCCCCCCAGGGGCAATCCTGGCACCTCCCAGGCAGAAGAGGAAACTTCCACAGTGCATCTCACTTCCATGAATCCCCTCCTCGGACTCTGAGGTCCTTGGTCACAGCTGAGGTGCAAAAGGCTCCTGTCATATTGTGTCCTGCTCTGGTCTGCCTTCCACAGCTTGGGGGCCACCTAGCCCACCTCTCCCTAGGGATGAGAGCAGCCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTCACCCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCAGGGTGAGGGGCAGGCTGAGGGCGGCCACTTCCCTCAGCCGCAGGTTTGTTTTCCCAAGAATGGTTTTTCTGCTTCTGTAGCTTTTCCTGTCAATTCTGCCATGGTGGAGCAGCCTGCACTGGGCTTCTGGGAGAAACCAAACCGGGTTCTAACCTTTCAGCTACAGTTATTGCCTTTCCTGTAGATGGGCGACTACAGCCCCACCCCCACCCCCGTCTCCTGTATCCTTCCTGGGCCTGGGGATCCTAGGCTTTCACTGGAAATTTCCCCCCAGGTGCTGTAGGCTAGAGTCACGGCTCCCAAGAACAGTGCTTGCCTGGCATGCATGGTTCTGAACCTCCAACTGCAAAAAATGACACATACCTTGACCCTTGGAAGGCTGAGGCAGGGGGATTGCCATGAGTGCAAAGCCAGACTGGGTGGCATAGTTAGACCCTGTCTCAAAAAACCAAAAACAATTAAATAACTAAAGTCAGGCAAGTAATCCTACTCGGGAGACTGAGGCAGAGGGATTGTTACATGTCTGAGGCCAGCCTGGACTACATAGGGTTTCAGGCTAGCCCTGTCTACAGAGTAAGGCCCTATTTCAAAAACACAAACAAAATGGTTCTCCCAGCTGCTAATGCTCACCAGGCAATGAAGCCTGGTGAGCATTAGCAATGAAGGCAATGAAGGAGGGTGCTGGCTACAATCAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCCCGGGTCAC
配列番号１７１
CCTGAGTTTGAATCTCTCCAACTCAGCCAGCCTCAGTTTCCCCTCCACTCAGTCCCTAGGAGGAAGGGGCGCCCAAGCGGGTTTCTGGGGTTAGACTGCCCTCCATTGCAATTGGTCCTTCTCCCGGCCTCTGCTTCCTCCAGCTCACAGGGTATCTGCTCCTCCTGGAGCCACACCTTGGTTCCCCGAGGTGCCGCTGGGACTCGGGTAGGGGTGAGGGCCCAGGGGCGACAGGGGGAGCCGAGGGCCACAGGAAGGGCTGGTGGCTGAAGGAGACTCAGGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTTAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGCGTGAGCCCAGCCCTGGGGCGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCCGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCCAGGATACAGACAGCCCCCCTT
配列番号１７２
CCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTCACCCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGAT
配列番号１７３
CCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCCAACACCTGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTGAGCGGTTACCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGAT
配列番号１７４
TGGCCACCGCCTTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCTCTAGA
配列番号１７５
AAGCTTGCATGTCTAAGCTAGACCCTTCAGATTAAAAATAACTGAGGTAAGGGCCTGGGTAGGGGAGGTGGTGTGAGACGCTCCTGTCTCTCCTCTATCTGCCCATCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGACTAAAAAAAGGCCATGGAGCCAGAGGGGCGAGGGCAACAGACCTTTCATGGGCAAACCTTGGGGCCCTGCTGTCTAGCATGCCCCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCCTGCATGCGAAGATCTTCGAACAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCAGCCAGC
配列番号１７６
CTAGACTAGCATGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGCATGCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGC
配列番号１７７
TTCTGAGTCCTCTAAGGTCCCTCACTCCCAACTCAGCCCCATGTCCTGTCAATTCCCACTCAGTGTCTGATCTCCTTCTCCTCACCTTTCCCATCTCCCGTTTGACCCAGCTTCCTGAGCTCTCCTCCCATTCCCCTTTTTGGAGTCCTCCTCCTCTCCCAGAACCCAGTAATAAGTGGGCTCCTCCCTGGCCTGGACCCCCGTGGTAACCCTATAAGGCGAGGCAGCTGCTGTCTGAGGCAGGGAGGGGCTGGTGTGGGAGGCTAAGGGCAGCTGCTAAGTTTAGGGTGGCTCCTTCTCTCTTCTTAGAGACAACAGGTGGCTGGGGCCTCAGTGCCCAGAAAAGAAAATGTCTTAGAGGTATCGGCATGGGCCTGGAGGAGGGGGGACAGGGCAGGGGGAGGCATCTTCCTCAGGACATCGGGTCCTAGAGGACCTTGCTTCCTAGCTGGGCCTTTCCTTCTCCTCTATAAATACCAGCTCTGGTATTTCGCCTTGGCAGCTGTTGCTGCTAGGGAGACGGCTGGCTTGACATGCATCTCCTGACAAAACACAAACCCGTGGTGTGAGTGGGTGTGGGCGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGAGAGGGGGCGAGGGAGACAGGGGCGCAGGAGTCAGGCAAAGGCGATGCGGGGGTGCGACTACACGCAGTTGGAAACAGTCGTCAGAAGATTCTGGAAACTATCTTGCTGGCTATAAACTTGAGGGAAGCAGAAGGCCAACATTCCTCCCAAGGGAAACTGAGGCTCAGAGTTAAAACCCAGGTATCAGTGATATGCATGTGCCCCGGCCAGGGTCACTCTCTGACTAACCGGTACCTACCCTACAGGCCTACCTAGAGACTCTTTTGAAAGGATGGTAGAGACCTGTCCGGGCTTTGCCCACAGTCGTTGGAAACCTCAGCATTTTCTAGGCAACTTGTGCGAATAAAACACTTCGGGGGTCCTTCTTGTTCATTCCAATAACCTAAAACCTCTCCTCGGAGAAAATAGGGGGCCTCAAACAAACGAAATTCTCTAGCCCGCTTTCCCCAGGATAAGGCAGGCATCCAAATGGAAAAAAAGGGGCCGGCCGGGGGTCTCCTGTCAGCTCCTTGCCCTGTGAAACCCAGCAGGCCTGCCTGTCTTCTGTCCTCTTGGGGCTGTCCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCTCGCCTGTGGCCGCCCTTTTCCTGGCAGGACAGAGGGATCCTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGCGCCGGGGGGTGATGTCAGGAGGGCTACAAATAGTGCAGACAGCTAAGGGGCTCCGTCACCCATCTTCACATCCACTCCAGCCGGCTGCCCGCCCGCTGCCTCCTCTGTGCGTCCGCCCAGCCAGCCTCGTCCACGCCGCCACC
配列番号１７８
ACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGCCCTCAATAAAAATCTCGCATATGGCGACGGCCCTTGGCAGTACATCAAAACCTTTCAGGGCAATCACGATAACCGACCCCAGCCAATAGCACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGCACTCCTTACCACGGTCCGTATAGCCCAAACTACATGACGGTTCCCAGCCAATAGCCGCTCTAAAAATAACTCCCGGCAGCGGTATAAACCCACAGCGCTCTAAAAATAACTCCCCCGGCAGCGGTATAGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCAACCTTTCAGGGCAATCACGGTCCGCCCGGTAAATGGCACCCTCAATAAAAATCTCGCATCCCTTTGGACTTCGGCCCCATTGACGTCAATGGGGTCCAAAAAATATATCAGGGGCTTCAGGTTTCCCTACAAGGCCTGGGGACAACCCGATATGCCTGGGTCCAAAAAATATATCAGGTGGTTCAGTCGT
配列番号１７９
ACAGGGGTCCGGAACGGCAGCGGTATAAACCCACAGTGGTTCAGTCGTCCGTCCGTCGTCCACAACCGTCCAAAAAATATATCAGGAACTACATGACGGTTCACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGGTCCAAAAAATATATCAGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTAAACTACATGACGGTTCCCCCGACAGGGGTCCCTCCCCGGGTAATAACTGCAGTTACCCG
配列番号１８０
ACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGCTTGGCAGTACATCAAGCCCATTGACGTCAATAATCTTGGCAGTACATCAAACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGACCAACGACTGATTAACTCTACGTACGAAACGTATGAAGACGGACGACCCCTCGGACCCCTGAAAGGTGTGGGTCCAAAAAATATATCAGGCAAGGCCTGGGGACA
配列番号１８１
GCGGCCGCATCGATATTCGTAAACGCGTTCCTTGACACCTCTGTCTCCTCAGGTGCCTGGCTCCCAGTCCCCAGAACGCCTCTCCTGTACCTTGCTTCCTAGCTGGGCCTTTCCTTCTCCTCTATAAATACCAGCTCTGGTATTTCGCCTTGGCAGCTGTTGCTGCTAGGGCGCGCCGTTTAAACCACGTGCTCGAGAGCAGCCACTACGGGTCTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCACAACACCTGCTGCCTGAGCCTCACCCCCACCCCGGTGCCTGGGTCTTAGGCTCTGTACACCATGGAGGAGAAGCTCGCTCTAAAAATAACCCTGTCGACACGTGTCTAGACTGATCAATCAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTGATCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACTAGTGGGCTGCCCTCAGTTCACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGGTACCCAGGTAGGGACTGGCCACCCCAGCCCACCTGTCCCAATGCTGACTTAGTGCAAGGCGAGCCAGCAAGGAGGGAGGACAGGTGGCAGTGGGGGGTGAGGAGCATCTAAAAATAGCCACAAACTGAGTTCTTAAGTCTGAACCCGGTCTGCTCGCAGGTACCGGTCCCAAAGGCCGCCACCGCTAGCGATATCGGATCCTCATGA
配列番号１８２
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号１８３
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号１８４
GCTGAACAGTTTCTCAGAAAGACA
配列番号１８５
GGCTGTTTTCATCCAGGTTGTG
配列番号１８６
TCTTAAGGACCTCCAAGG
配列番号１８７
GGGTGGGTTGCTTTACCTCTCTAG
配列番号１８８
TCACATCATGAGATTTAGTCACTTCC
配列番号１８９
TTGCTACTTCACAGTAACCACATGG
配列番号１９０
GGGTGGGTTGCTTTACCTCT
配列番号１９１
TCTGGATATCCTCTTCTGGG
配列番号１９２
ATCAGAAGGATTATGTATAGGAATA
配列番号１９３
GCTATCTGGATATCCTCTTCTGGG

Claims (33)

  1. 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号６の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断する、ポリヌクレオチド。
  2. 前記ポリヌクレオチドが、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記プロモータが筋肉細胞特異的プロモータである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号６の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断する、組換えＤＮＡ構築物。
  6. 前記ポリヌクレオチドが、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項５に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  7. 前記プロモータが筋肉細胞特異的プロモータである、請求項６に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  8. 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号６の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断する、組換えウイルス。
  9. 前記組換えウイルスが、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項８に記載の組換えウイルス。
  10. 前記組換えＡＡＶが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むキャプシド又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含むキャプシドを有する、請求項９に記載の組換えウイルス。
  11. 前記ポリヌクレオチドが、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  12. 前記プロモータが筋肉細胞特異的プロモータである、請求項１１に記載の組換えウイルス。
  13. 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号１０の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断する、ポリヌクレオチド。
  14. 前記ポリヌクレオチドが、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記プロモータが筋肉細胞特異的プロモータである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  17. 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号１０の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断する、組換えＤＮＡ構築物。
  18. 前記ポリヌクレオチドが、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  19. 前記プロモータが筋肉細胞特異的プロモータである、請求項１８に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  20. 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号１０の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断する、組換えウイルス。
  21. 前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項２０に記載の組換えウイルス。
  22. 前記組換えＡＡＶが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むキャプシド又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含むキャプシドを有する、請求項２１に記載の組換えウイルス。
  23. 前記ポリヌクレオチドが、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  24. 前記プロモータが筋肉細胞特異的プロモータである、請求項２３に記載の組換えウイルス。
  25. 第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列及び第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、
    前記第１の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号６の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断するメガヌクレアーゼであり、
    前記第２の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、且つジストロフィン遺伝子内の配列番号１０の核酸配列からなる認識配列を含む部位で核酸と結合して切断するメガヌクレアーゼである、ポリヌクレオチド。
  26. 前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列又は２Ａペプチドをコードする核酸配列によって分離されている、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 請求項２５に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
  28. 前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列がＩＲＥＳ配列又は２Ａペプチドをコードする核酸配列によって分離されている、請求項２７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  29. 前記ポリヌクレオチドが、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列に作動可能に連結された筋肉細胞特異的プロモータを含む、請求項２８に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  30. 請求項２５に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶ。
  31. 前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、ＩＲＥＳ配列又は２Ａペプチドをコードする核酸配列によって分離されている、請求項３０に記載の組換えＡＡＶ。
  32. 前記ポリヌクレオチドが、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列に作動可能に連結された筋肉細胞特異的プロモータを含む、請求項３１に記載の組換えＡＡＶ。
  33. 前記組換えＡＡＶが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むキャプシド又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含むキャプシドを有する、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ。
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