JP7586894B2

JP7586894B2 - 共有結合リガンドのプロテオームワイドな発見のための方法およびその組成物

Info

Publication number: JP7586894B2
Application number: JP2022505603A
Authority: JP
Inventors: ピンカオ; ユアンユアン; チャオチャン
Original assignee: ブリッドジーンバイオサイエンシズインコーポレイテッド
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2024-11-19
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: US20220276253A1; JP2022543560A; CN114174492A; EP4010459A1; CA3148610A1; EP4010459A4; US12392778B2; WO2021026162A1; AU2020326694A1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年８月５日出願の米国特許第６２／８８２，７５７号（その全内容は、参照によりその全体が組み込まれる）の優先権の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、概して、標的発見、より具体的には、プロテオーム中のタンパク質と求電子化合物との共有結合相互作用を同定および定量化するための、比較質量分析法分析に基づくプロファイリング方法に関する。

背景情報
多くの薬物および薬物候補は、細胞内の特定のタンパク質中のアミノ酸残基の共有結合修飾によって作用する。かかる共有結合修飾の主な形態は、薬物または薬物候補中の求電子部分と、タンパク質中の求核性アミノ酸との間で生じる。特定のタンパク質を共有結合的に修飾することができるさらなる化学プローブおよび薬物の発見は、天然の生物学的系における様々なタンパク質との化合物反応性を全体的にマッピングする一般的な方法から利益を得るであろう。

全細胞プロテオーム中の様々な構成要素との反応性化学プローブの結合相互作用を同定および定量化するための改善された方法に対する需要が存在する。

本発明は、数百または数千のタンパク質を用いる、求電子化合物の結合相互作用を並行して同定および定量化することによる、リガンド発見のための方法および組成物を提供する。

したがって、一実施形態では、開示は、目的のプローブ化合物に共有結合するタンパク質標的を同定するための方法を提供する。方法は、（ａ）プロテオミック試料（例えば、生細胞、細胞溶解物、または生きた動物）を、求電子部分、およびアルキン部分またはアジド部分などのクリック可能なタグを有するプローブ化合物と接触させることであって、求電子部分が、タンパク質標的中の求核性アミノ酸残基に共有結合する、ことと、（ｂ）プロテオミック試料を分析して、プローブ化合物によって共有結合されるタンパク質を検出し、それによってタンパク質標的を同定することと、を含む。一態様では、クリック可能なタグは、検出可能な標識に共有結合的に連結し、求核性アミノ酸残基は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの誘導体から選択される。クリック可能なタグは、アルキン基であり得る。

別の実施形態では、開示は、タンパク質標的を同定するための方法を提供する。方法は、（ａ）第１のタンパク質含有試料を、求電子部分を有しかつ末端のクリック可能なタグを欠く競合化合物と接触させることと、（ｂ）（ａ）の試料を、求電子部分および末端のクリック可能なタグを含むプローブ化合物と接触させることと、（ｃ）第２のタンパク質含有試料をプローブ化合物と接触させることであって、求電子部分が、タンパク質標的中の求核性アミノ酸残基に結合する、ことと、（ｄ）第１のタンパク質含有試料中のプローブ化合物で修飾されたタンパク質の量を、第２のタンパク質含有試料中のものと比較して検出することによって、タンパク質標的を同定することと、を含む。一実施形態では、プローブ化合物は、共有結合的に誘導体化されてクリック可能なタグから外れた検出可能な標識をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ビオチンであり得る。求電子反応性アミノ酸残基は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの誘導体から選択され得る。クリック可能なタグは、アルキン基であり得る。

いくつかの実施形態では、方法は、第１のタンパク質含有試料および第２のタンパク質含有試料を、プローブ化合物中のクリック可能なタグとの反応性を有するリンカー基を含む検出可能な標識と反応させることをさらに含む。方法はまた、検出可能な標識をタグ付けされたタンパク質標的を富化することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、富化したタンパク質標的のプロテアーゼ消化を実施することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、第１のタンパク質含有試料および第２のタンパク質含有試料中の、様々なプローブ化合物に結合したタンパク質の量を定量化し、かつ比較することを含み得る。定量化および比較は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を用いる液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して実施することができる。

様々な実施形態では、方法は、（ａ）および（ｂ）のプロテオミック試料を、タグ、例えば、ビオチンを有する化合物と反応させて、ビオチンタグをタンパク質標的にコンジュゲートすることをさらに含む。本化合物は、プローブ分子のクリック可能なタグと共有結合を形成することができる反応性基を有するであろう。タグがビオチンである場合、例えば、ビオチンで標識されたタンパク質標的は、次いで、ストレプトアビジンによって富化され、プロテアーゼ消化を施され得る。次いで、生じたペプチドを、等圧質量タグで化学標識し、比較質量分析法分析を容易にする。

いくつかの実施形態では、プローブ化合物上の求電子基は、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール（ｃａｒｂｏｎｙｄｉｌｍｉｄａｚｏｌｅ）、およびカルボジイミドからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、プローブ化合物上の求電子基は

からなる群から選択され得る。

さらに別の実施形態では、開示は、検出可能な標識に共有結合的に連結したクリック可能なタグを含むプローブに共有結合した求核性アミノ酸残基を含む、修飾された非天然型タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ビオチンであり得る。様々な実施形態では、求電子反応性アミノ酸残基は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの誘導体から選択される。

なお別の実施形態では、開示は、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール、およびカルボジイミドからなる群から選択される求電子部分と、アルキン部分またはアジド部分などのクリック可能なタグとを有するプローブを提供し、クリック可能なタグは、任意選択的に、検出可能な標識に共有結合的に連結している。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ビオチンであり得る。本明細書にさらに開示されるのは、生物学的アッセイを実施するためのプローブ化合物の使用である。
[本発明1001]
タンパク質標的を同定するための方法であって、
（ａ）プロテオミック試料を、求電子部分およびクリック可能なタグを含むプローブ化合物と接触させることであって、前記求電子部分が、前記タンパク質標的中の求核性アミノ酸残基に共有結合する、ことと、
（ｂ）前記プロテオミック試料を分析して、前記タンパク質標的を検出し、それによって前記タンパク質標的を同定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記クリック可能なタグが、検出可能な標識にさらに共有結合的に連結される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
タンパク質標的を同定するための方法であって、
（ａ）第1のタンパク質含有試料を、求電子部分を有しかつ末端のクリック可能なタグを欠く競合化合物と接触させることと、
（ｂ）（ａ）の前記試料を、前記求電子部分および前記末端のクリック可能なタグを含むプローブ化合物と接触させることと、
（ｃ）第2のタンパク質含有試料を前記プローブ化合物と接触させることであって、前記求電子部分が、前記タンパク質標的中の求核性アミノ酸残基と結合する、ことと、
（ｄ）前記第1のタンパク質含有試料中のプローブ化合物で修飾されたタンパク質の量を、前記第2のタンパク質含有試料中のプローブ化合物で修飾されたタンパク質の量と比較して検出することによって、前記タンパク質標的を同定することと
を含む、前記方法。
[本発明1004]
前記プローブ化合物が、共有結合的に誘導体化されて前記クリック可能なタグから外れた検出可能な標識をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記検出可能な標識が、ビオチンを含む、本発明1002または1004の方法。
[本発明1006]
前記求核性アミノ酸残基が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記クリック可能なタグが、アルキン基である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記プローブ化合物上の前記求電子基が、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール、およびカルボジイミドからなる群から選択される、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記プローブ化合物上の前記求電子基が、
[化1]

からなる群から選択される、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記第1のタンパク質含有試料および前記第2のタンパク質含有試料を、前記プローブ化合物中の前記クリック可能なタグとの反応性を有するリンカー基を含む検出可能な標識と反応させることをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1011]
前記検出可能な標識をタグ付けされたタンパク質標的を富化することをさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記富化したタンパク質標的のプロテアーゼ消化を実施することをさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記第1のタンパク質含有試料および前記第2のタンパク質含有試料中の、プローブ化合物に結合したタンパク質の量を定量化および比較することをさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記定量化および比較を、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を用いる液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を使用して実施する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
クリック可能なタグを含むプローブ化合物に共有結合した求核性アミノ酸残基を含む、修飾された非天然型タンパク質。
[本発明1016]
前記求核性アミノ酸残基が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、本発明1015のタンパク質。
[本発明1017]
ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール、およびカルボジイミドからなる群から選択される求電子部分と、クリック可能なタグとを含む、プローブ化合物。
[本発明1018]
前記クリック可能なタグが、検出可能な標識に共有結合的に連結される、本発明1017のプローブ化合物。
[本発明1019]
前記検出可能な標識が、ビオチンである、本発明1018のプローブ化合物。
[本発明1020]
生物学的アッセイを実施するための、本発明1017～1019のいずれかのプローブ化合物の使用。

開示の一実施形態でのプローブを示す図形表現である。本開示のいくつかの態様による、ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞内のプロテオームにおける化合物１のトップヒットとして同定されるグアノシン一リン酸合成酵素（ＧＭＰＳ）を示すグラフである。化合物１の分子量に対応する、３２９ダルトン（Ｄａ）のはっきりとした質量シフトを誘導した、化合物１との組換えＧＭＰＳのインキュベーションを示すグラフである。蛍光に基づくアッセイを使用した、ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞における、化合物１によるＧＭＰＳの用量依存的係合を示すグラフである。２９０ｎｍでの吸光度の減少を監視することによる分光アッセイを使用した、化合物１のＩＣ_５０の決定を示すグラフである。ＳＫ－ＭＬ－２８腫瘍増殖の化合物１阻害を示すグラフである。本開示のいくつかの態様による、タンパク質標的を同定する方法を示すフローチャートである。

発明の詳細な説明
本発明は、複合体プロテオーム中の様々なタンパク質との共有結合相互作用について、求電子化合物をプロファイリングするための革新的な方法に基づく。本方法は、全細胞プロテオーム中の数千のタンパク質との共有結合薬物または共有結合薬物候補の相互作用を同時に並行して同定および定量化することができる。

本組成物および方法について記載する前に、かかる組成物、方法、および条件は変動し得るので、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されないことが理解されるものである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲にのみ限定されるので、本明細書で使用される用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるものである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別途示されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示などを閲読する際に当業者には明らかになるであろう、本明細書に記載の１つ以上の種類の方法および／またはステップを含む。

求電子基または求電子剤は、タンパク質またはポリペプチド中に存在するものを含む、多くの官能基と反応することができる。いくつかの実施形態では、チオール基を含有するＮ末端システインは、ハロゲンまたはマレイミドと反応し得る。チオール基は、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、ハロゲン化アリールなどのアリール化剤などの多数のカップリング剤との反応性を有することが知られている。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，”ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６），ｐｐ．１４６－１５０に記載されている。いくつかの実施形態では、マレイミドは、特により高いｐＨ範囲で、リジンの側鎖のε－アミノ基、またはアルギニンの５－グアニジノ基などのアミノ基と反応することができる。ハロゲン化アリールは、かかるアミノ基とも反応することができる。ハロアセチル誘導体は、ヒスチジンのイミダゾリル側鎖窒素、メチオニンの側鎖のチオエーテル基、リジンの側鎖のε－アミノ基、およびアルギニンの５－グアニジノ基と反応することができる。限定されないが、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、および無水物を含む、リジンの側鎖のε－アミノ基またはアルギニンの５－グアニジノ基と反応する、多くの他の求電子試薬を使用することができる。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，”ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６），ｐｐ．１３７－１４６に記載されている。加えて、いくつかの求電子試薬は、ジアゾアルカンおよびジアゾアセチル化合物、カルボニジルミダゾール、ならびにカルボジイミドなどの、アスパルテートおよびグルタメートのものなどのカルボキシレート側鎖と反応することができる。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，”ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６），ｐｐ．１５２－１５４に記載されている。さらに、反応性ハロアルカン誘導体を含む、セリン、トレオニン、およびチロシンの側鎖におけるものなどの、ヒドロキシル基と反応するであろう求電子試薬が知られている。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，”ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９６），ｐｐ．１５４－１５８に記載されている。

いくつかの態様では、求電子剤または求電子基としては、限定されないが、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール、およびカルボジイミドを挙げることができる。いくつかの態様では、求電子基は、

からなる群から選択され得る。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。

本明細書で使用される場合、単独でまたは組み合わせた「アルキル」または「アルカン」という用語は、１～２０個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルキル基を指す。ある特定の実施形態では、当該アルキルは、１～１０個の炭素原子を含むであろう。さらなる実施形態では、当該アルキルは、１～６個の炭素原子を含むであろう。アルキル基は、任意選択的に、本明細書で定義されるように置換され得る。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソ－アミル、ヘキシル、オクチル、ノイルなどが挙げられる。本明細書で使用される場合、単独でまたは組み合わせた「アルキレン」という用語は、メチレン（－ＣＨ_２－）などの２つ以上の位置に結合した直鎖または分岐鎖飽和炭化水素に由来する飽和脂肪族基を指す。別途指定されない限り、「アルキル」という用語は、「アルキレン」基を含み得る。

本明細書で使用される場合、単独でまたは組み合わせた「アシル」という用語は、アルケニル、アルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロ環、またはカルボニルに結合した原子が炭素である任意の他の部分に結合したカルボニルを指す。「アセチル」基は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３基を指す。「アルキルカルボニル」または「アルカノイル」基は、カルボニル基を通じて親分子部分に結合したアルキル基を指す。かかる基の例としては、メチルカルボニルおよびエチルカルボニルが挙げられる。アシル基の例としては、ホルミル、アルカノイル、およびアロイルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、単独でまたは組み合わせた「ハロ」、「ハロゲン化物」、または「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。

開示は、目的のプローブに共有結合するタンパク質を同定するための、方法、ＩｓｏｂａｒｉｃＭａｓｓＴａｇｇｅｄＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＩＭＴＡＣ（商標））を提供する。方法は、（ａ）生細胞、または細胞溶解物、または生きた動物などのプロテオミック試料を、求電子部分、およびアルキン部分などのクリック可能なタグを有するプローブと接触させることと、（ｂ）プロテオミック試料を分析して、プローブによって共有結合されるタンパク質を検出し、それによって共有結合タンパク質標的を同定することと、を含み得る。

方法は、（ａ）１つのプロテオミック試料を２つのアリコートに分割することと、（ｂ）第１のアリコートを、求電子部分を有し、クリック可能なタグを欠く競合化合物と接触させることと、（ｂ）試料からの第２のアリコートを、ＤＭＳＯまたは（ａ）で使用されるのと異なる量の同じ競合物と接触させることと、（ｃ）試料の両方を、求電子部分およびアルキン部分などの追加の末端のクリック可能なタグを含有するプローブと接触させることと、（ｄ）２つのアリコート中の、プローブに結合したタンパク質の量を比較することによって、タンパク質標的を同定することと、を含み得る。一実施形態では、プローブは、競合物と同一のコア構造および求電子部分を共有し、追加の末端アルキン部分を含有する。第１のアリコートをプローブ化合物と反応させる前に、第１のアリコートを競合化合物で事前に処理することによって、目的のタンパク質標的のみが検出されるであろうように、プローブ化合物と、第２のアリコートの対照として機能し得る、求核性アミノ酸残基を含むタンパク質との間のバックグラウンド相互作用を除去するのに役立つ。

求電子化合物のタンパク質標的の同定によって、タンパク質標的は、細胞機能および疾患関連性について評価されるであろう。タンパク質標的が、ヒト疾患、例えば、がんおよび炎症の進行に重要な役割を果たす場合、求電子化合物は、疾患、例えば、がんまたは炎症の治療のための医薬品としてさらに誘導体化され、開発され得る先導化合物とみなすことができる。

様々な実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって求電子化合物の標的として同定されるタンパク質を提供する。
Ｒ_１Ｃ≡ＣＨ
式（Ｉ）

本明細書で使用される場合、クリック可能なタグの例は、式（Ｉ）を含む末端アルキン部分である。いくつかの実施形態では、Ｒ_１は、求電子基を担持するコアであり得、求電子基は、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール、およびカルボジイミドからなる群から選択され得る。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸で構成され、当業者によってタンパク質として認識される組成物を指す。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字または３文字のコードが使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸の重合体を指すように同義的に使用される。重合体は、線状または分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは標識構成要素とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されている、アミノ酸重合体を包含する。また、定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、不自然なアミノ酸、合成アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野において既知の他の修飾物である。

場合によっては、ポリペプチドの機能的断片は、約１０～約８０の長さのアミノ酸残基を含む。場合によっては、機能的断片は、約１５～約７０、約２０～約６０、約３０～約５０、または約４０～約８０の長さのアミノ酸残基を含む。場合によっては、機能的断片は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、またはそれ以上の長さのアミノ酸残基を含む。

タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ^２）は、化学試料を分析する能力を増加するために、追加の反応ステップを使用して２つ以上の質量分析器を一緒に結合させた機器分析における技法を指す。等圧質量タグと称される試薬のファミリーに属するタンデム質量タグ（ＴＭＴ）は、タンパク質、ペプチド、および核酸などの生物学的巨大分子の質量分析法（ＭＳ）に基づく定量化および同定に使用される化学標識を指す。

スキーム１の例示的なＴＭＴの化学構造によって示されるように、セット内のすべての質量タグ付け試薬は、アミン反応性ＮＨＳエステル基、スペーサーアーム（質量正規化剤）、およびＭＳ／ＭＳ質量レポーターで構成される同じ公称質量（すなわち、等圧である）および化学構造を有する。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）および電子移動解離（ＥＴＤ）によるＭＳ／ＭＳ断片化部位もスキーム１に示されている。試薬は、アミン反応性ＮＨＳエステル基を介して、細胞に基づく試料または組織試料から調製されたペプチドを標識することができる。独自のレポーター質量は、ＭＳ／ＭＳスペクトルの低質量領域にあるＭＳ／ＭＳスペクトルを生じる。これは、検出可能な標識の使用を介して標的タンパク質を富化した後、プローブ化合物によって標的化されたタンパク質からのペプチド断片化中の相対的なタンパク質発現レベルを報告するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、プローブ化合物は、標的タンパク質と共有結合した後、クリック可能なタグを介して検出可能な標識とのさらなる連結が可能になり得る。クリック可能なタグは、銅（Ｉ）媒介性クリックケミストリーを介したアルキン基とアジド基との間の反応などの官能性である。参照により本明細書に組み込まれるＨ．Ｃ．ＫｏｌｂａｎｄＫ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ，２００３，８（２４）；１１２８－１１３７を参照されたい。

いくつかの実施形態では、小分子化合物は、反応性アミノ酸残基との結合について、本明細書に記載のプローブと競合する。場合によっては、小分子化合物は、化合物と反応性アミノ酸残基との相互作用を促進する断片部分を含む。場合によっては、小分子化合物は、疎水性相互作用、水素結合、またはそれらの組み合わせを促進する小分子断片を含む。多くの場合、リガンドは、非天然型であるか、または反応性アミノ酸残基もしくは反応性アミノ酸残基含有タンパク質のアミノ基との反応後に非天然型生成物を形成する。

以下の実施例は、本発明の利点および特色をさらに示すために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。本実施例は、典型的な使用され得るものであるが、当業者に既知の他の手順、方法論、または技法を代替的に使用してもよい。

実施例１
ＩＭＴＡＣ（商標）を使用するプロテオームワイドな共有結合リガンドの発見
複合体プロテオーム中の様々なタンパク質との共有結合相互作用について、求電子小分子をプロファイリングするための方法について記載する。本方法は、求電子化合物と全細胞プロテオーム中の様々なタンパク質との間の共有結合相互作用を同定および定量化し、潜在的な療法を開発するためにさらに利用され得る新しい貴重なデータを提供することができる。

以下の方法論を利用して、開示の方法を実施した。

生細胞または細胞溶解物のプロテオームを２つの同一の量に分割する。

競合物中の求電子剤の反応性に応じて１０ｎＭ～１００μＭの範囲であり得る一定濃度で３０～２４０分間、求電子競合物（競合物）で第１の試料を処理する。

陰性対照としてＤＭＳＯなどの純粋な溶媒で、第２の試料を処理する。第１の試料のように、インキュベーション時間を一貫して維持する（３０～２４０分）。

競合物と同じコア構造および求電子部分を共有するが、追加の末端アルキン部分を含有する求電子プローブ（プローブ）で、両方の試料を処理する。

アゾ－ビオチン－アジドでクリックケミストリー反応を実施して、ビオチンタグをプローブで修飾されたタンパク質にコンジュゲートする。

ストレプトアビジン磁気ビーズで、ビオチン化タンパク質を富化する。

ビーズ上トリプシン消化を実施する。

生じたトリプシンペプチドをＴＭＴ（タンデム質量タグ）で標識し、標識したペプチドを収集し、溶液中で組み合わせる。

ジチオナイトナトリウムを使用して、プローブで標識されたペプチドを磁気ビーズから切断し、収集し、別個のチューブ内で組み合わせる。

前の２つのステップからの試料に、液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法分析を施す。

競合物で処理した試料とＤＭＳＯで処理した試料との間の１つの対象タンパク質のＴＭＴレポーターイオンの強度の比は、競合物と対象タンパク質との間の結合相互作用の強度を示す。

プローブと標的タンパク質との結合親和性（ＩＣ_５０）は、競合物濃度を変動させ、多重ＴＭＴ（６重または１０重）を使用することによって得ることができる。

図１は、方法で使用されるプローブを示す概略図であり、一方、添付文書Ａは、例えば、トリプシン消化されたペプチドを標識するために利用され得る例示的なタグを示す。

図１を参照すると、構造図の「Ｅ」は、求電子官能基または求電子剤を示し、「コア」は、プローブ、競合物１、または競合物２分子のコア構造を指し、「－」（競合物２）、「＝」（競合物１）、および「≡」（プローブ）は、個々の分子における具体的な追加の官能基を示す。プローブ設計の重要な側面としては、以下が挙げられる：１）すべての反応性プローブ（本明細書ではプローブと称される）は、コア構造、求電子基、およびアルキンタグなどのクリック可能なタグを含有する（以下の説明の例としてアルキンタグが使用されるであろう）、２）対応する競合化合物（本明細書では競合物と称される）は、同じコア構造および求電子基を含有するが、アルキンタグを欠く、３）プローブおよび競合物は、アルキン同等部分を除いて互いに同一の構造を有し得る（図１に示されるように、プローブは、三重結合含有末端アルキンを含有し、競合物１および競合物２は、代わって同等な位置にアルケンおよびアルカンを含有する）。

実施例２
ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞プロテオームのＩＭＴＡＣスクリーニング
ヒトがん細胞プロテオームの調製。ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞を、３７℃の５％の二酸化炭素（ＣＯ_２）インキュベーターで、１０％のウシ胎仔血清を補充したＡＴＣＣ配合Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（カタログ番号３０－２００３）中で培養した。インビトロ標識実験用に、細胞を９０％のコンフルエンシーまで増殖させ、ＰＢＳで３回洗浄し、冷たいＰＢＳ中で破壊した。１４００×ｇで３分間の遠心分離によって細胞ペレットを単離し、さらなる使用まで、細胞ペレットを－８０℃で保管した。収集した細胞ペレットを、ＰＢＳ緩衝液中での超音波処理によって溶解させた。各実験の前に、凍結細胞パレットから新たにプロテオームを調製した。

インビトロ化合物処理。スキーム２に示される化合物１および２を、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／０５５５０４（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１６３５）に従って設計および合成した。プロテオーム試料を、ＰＢＳ中タンパク質１ｍｇ／溶液ｍＬに希釈した。各プロファイリング実験用に、プロテオーム試料の一方のアリコート（０．５ｍｌ）を、対照として０．５μｌのＤＭＳＯで処理し、他方のアリコートを、０．１μＭの最終濃度のＤＭＳＯ中０．５μｌの化合物２で処理した。室温で６０分間処理した後、氷冷したメタノールを試料に添加して、タンパク質を沈殿させた。沈殿物を０．５ｍｌの氷冷したＤＰＢＳ中に再懸濁させ、１ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中に溶解させた１錠のＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤錠剤を５μｌ添加した。

インサイチュ化合物処理。１５ｃｍのペトリ皿内で、ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞を９０％のコンフルエンシーまで増殖させた後、５％のＣＯ_２下、３７℃で３０分～１時間、２０μｌのＤＭＳＯを含有する２０ｍｌの培地で対照としてプレート１をインキュベートし、０．１μＭの最終濃度の化合物２を含有する２０ｍｌの培地でプレート２をインキュベートする。細胞を２０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄し、５％のＣＯ_２下、３７℃でさらに３０分～１時間、１μＭの化合物１を含有する２０ｍｌの培地で両方のプレートをインキュベートする。細胞スクレーパーを使用して、１０ｍｌのＤＰＢＳ中で細胞を収集する。ＴｈｅｒｍｏＳｏｒｖａｌｌＸＴ遠心分離器でスピンダウンした後、ペレットを０．５ｍｌの氷冷したＤＰＢＳ中に再懸濁させ、１ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中に溶解させた１錠のＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤錠剤を５μｌ添加する。ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｆｉｅｒプローブソニケーターを使用して細胞を溶解させ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＭｉｃｒｏｆｕｇｅ２０Ｒ遠心分離器を使用して溶解物をスピンダウンし、上清を収集した。

クリックケミストリー。模擬試料または化合物で処理したプロテオーム試料（０．５ｍｇの細胞溶解物）の各々を、１ｍＭの最終濃度のＴＣＥＰ、２５ｍＭのＴＢＴＡ、および１ｍＭのＣｕＳＯ_４を添加することによって、クリックケミストリー（アセチレン－アジド環化付加）を使用して、ビオチン－アゾ－アジド（１００μＭの最終濃度）またはＤＤＥ－ビオチン－アジド（２５０μＭの最終濃度）とコンジュゲートした。試料を室温で１時間反応させた。クリックケミストリーステップの後、沈殿したタンパク質に氷冷したメタノールを添加した。

酵素による消化。ＰＢＳ中１．２％の２００μｌのＳＤＳでタンパク質ペレットを再懸濁させ、ＤＴＴ溶液（１０ｍＭの最終濃度）を添加し、６０℃で３０分間インキュベートする。室温の暗所で４０分間、ヨードアセトアミド溶液（２５ｍＭの最終濃度でインキュベートする。事前に洗浄した磁気ビーズに試料を添加し、チューブリボルバーで混合しながら室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ中４Ｍの尿素、およびＰＢＳ中１．２％のＳＤＳ、水、および１００ｍＭのＴＥＡＢで、順次ビーズを洗浄する。１００μｌの５０ｍＭのＴＥＡＢにビーズを再懸濁させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度の４μｌのＬｙｓ－Ｃトリプシンを各試料に添加する。３７℃のＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで一晩消化させる。

ＴＭＴ標識化。製造業者の指示書に従って、ＴＭＴ標識化を実行した。簡潔には、使用直前に、ＴＭＴ標識試薬を室温に平衡化する。０．８ｍｇのバイアルでは、各バイアルに４１μｌの無水アセトニトリルを添加する。時折ボルテックスしながら、試薬を５分間溶解させる。チューブを短時間遠心分離して溶液を収集する。各試料に４１μｌのＴＭＴ標識試薬の各々を慎重に添加し、ピペッティングによってしっかりと混合する。室温で１時間、反応物をインキュベートする。８μｌの５％のヒドロキシルアミンを試料に添加し、１５分間インキュベートして反応をクエンチする。試料を含有するチューブを磁気スタンドに置き、上清を収集し、合わせる。各試料を２００μｌのＤＰＢＳで洗浄し、洗浄液を合わせ、もう一度繰り返す。最後に、上清を１つのチューブに合わせる。チューブを磁気スタンドに数分間置き、新しいチューブに移してビーズの残留物を除去する。

ＬＣ／ＭＳＭＳ分析。ＴＭＴで標識した試料を、ＯａｓｉｓＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ）固相抽出カラムで脱塩した。溶出した有機試料を乾燥させた後、ＬＣ／ＭＳＭＳ分析用に、適切な２０μｌの５％のＡＣＮ、０．１％のギ酸中で試料を再構成する。Ｅａｓｙ－ＳｐｒａｙソースおよびＵｌｔｉｍａｔｅ３０００Ｎａｎｏ－ＬＣシステムを備えたＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＬｕｍｏｓＴｒｉｂｒｉｄ質量分析器を使用して、ＴＭＴで標識したペプチドを分析した。分離には、ＰｅｐＭａｐ（商標）ＲＳＬＣＣ１８カラム（２μｍ、１００Ａ、７５μｍ×２５ｃｍ）を使用した。移動相は、勾配溶出液を使用する、水およびアセトニトリルからなった。カラムを平衡化し、０．３μｌ／分の流量の勾配条件下（表１）で溶出させた。試料注入体積は、６μｌであった。

ＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＬｕｍｏｓＴｒｉｂｒｉｄ質量分析器を以下のように操作した：完全ＭＳ分解能をｍ／ｚ２００で１２０，０００に設定し、完全ＭＳＡＧＣ目標値は５０ｍｓの最大ＩＴで４Ｅ５であり、ＲＦレンズ値を３０に設定した。ｍ／ｚを３７５～１５７５に設定し、ＭＩＰＳ特性をペプチドに設定した。ＭＳ２スペクトルでは、強度閾値を１Ｅ４に設定し、ＭＳ２スペクトルでは、ｄｄＭＳ２ＩＴＨＣＤモデルを使用し、単離幅を０．７ｍ／ｚに設定し、活性化種類はＨＣＤであり、ＨＣＤ衝突エネルギー［％］は３８であった。ＡＧＣ目標値を１Ｅ５に設定し、ＭＳ２検出用に、分解能３０，０００でｏｒｂｉｔｒａｐを用いた。

ＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒおよび自社開発のソフトウェアを使用して、質量分析データを処理した。ＴＭＴタグシグナルをＩＭＴＡＣスコアに変換して、化合物１と標的タンパク質との間の見かけ結合親和性を表した。ＩＭＴＡＣスコアが高いほど、化合物１とタンパク質との間の相互作用が強い。

化合物１は、ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞でのＩＭＡＴＣスクリーニングにおいて、数百のタンパク質を同定した。結合しているタンパク質を含む化合物１間には、結合親和性の広範な分布が存在する。図２に示されるように、グアノシン一リン酸合成酵素（ＧＭＰＳ）を、化合物１のトップヒットとして同定した。図２は、本開示のいくつかの態様による、ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞内のプロテオームにおける化合物１のトップヒットとして同定されるグアノシン一リン酸合成酵素（ＧＭＰＳ）を示すグラフである。図２に示されるＩＭＴＡＣスコアは、ＴＭＣタグシグナルに由来し、本質的には、試験した小分子と試料中のすべての異なるタンパク質との間の結合強度の相対的な定量値を提供する。ゼロのＩＭＴＡＣスコアは、特定のタンパク質に対する結合親和性がほとんどないことを指摘する。より高いＩＭＴＡＣスコアは、小分子と標的タンパク質との間のより強い結合強度を示す。トップヒットＧＭＰＳと２番目ヒットとの間には大きなＩＭＴＡＣスコア差があり、プロテオーム内のＧＭＰＳに対する化合物１の高い選択性を示している。

ＧＭＰＳは、キサントシン一リン酸をグアノシン一リン酸に変換する重要な酵素である。これは、プリン生合成デノボ経路の重要な構成要素である。リンパ球細胞は、プリン生合成デノボ経路のみを使用して、ＤＮＡ合成の原材料を提供することができるので、デノボ経路を特異的に阻害することによって、免疫細胞の増殖を防止することができる。したがって、ＧＭＰＳ阻害剤は、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）などの自己免疫疾患の免疫抑制治療として機能し得る。

１）質量分析法を使用して、化合物１のＧＭＰＳとの共有結合相互作用の確認および結合部位の同定、２）化合物１とＧＭＰＳとの係合のゲル内蛍光による測定、３）生化学的ＩＣ_５０の決定、ならびに４）細胞に基づくアッセイを使用して、化合物１の存在下でのＧＭＰＳの活性の測定、５）インビボ研究における有効性を含む、異なる生化学的アッセイおよび細胞に基づくアッセイを使用して、化合物１とＧＭＰＳとの相互作用を評価した。

化合物１とＧＭＰＳとの共有結合相互作用を確認するために、３７℃で１時間、１：２のモル比で組換えＧＭＰＳを化合物１とインキュベートし、質量分析法を使用して、３２９Ｄａのタンパク質の質量増加を観察し、したがって、図３に示されるように、共有結合を確認した。図３は、化合物１の分子量に対応する、３２９ダルトン（Ｄａ）のはっきりとした質量シフトを誘導した、化合物１との組換えＧＭＰＳのインキュベーションを示すグラフである。化合物１の処理後にトリプシン化ＧＭＰＳのＭＳ／ＭＳを分析することによって、Ｃｙｓ１０４として結合部位を同定した。

実施例３
化合物１とＧＭＰＳとの間の結合の特徴評価
ＧＭＰＳに対する化合物１の標的係合を測定するために、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦＢＳを含有する適切な培地を含む６ウェルプレート中で約９０％のコンフルエンスまで増殖させた。増殖培地を除去し、様々な濃度のプローブ（ＤＭＳＯ中１，０００倍のストック溶液）またはビヒクル対照を含有する新鮮な培地で３０分間、細胞を処理した。ＩＣ_５０測定のために、まず、３０分間間隔で３回１ｎＭ～１０００ｎＭの３７℃の化合物２でインキュベートし、次いで、さらに２０分間３７℃の１００ｎＭの化合物１で細胞を処理した。プローブ処理後、培地を除去し、細胞を氷冷したＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む８０μＬのＮＰ４０溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％のＮＰ－４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に、ペレットを再懸濁させた。溶解物を氷上で２０分間インキュベートし、１８，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離することによって分画した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって上清試料の各々からタンパク質濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌに調節した。１００μＬの総体積中、２５μＭのＴＡＭＲＡ－アジド（ＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙＴｏｏｌｓ）、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００μＭのトリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ、ＴＣＩ）、および１ｍＭのＣｕＳＯ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の最終濃度で、ＣｕＡＣＣを実施した。反応を室温の暗所で１時間実施した後、４０μｌの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を添加し、５分間煮沸することによって終了させた。３０μｌの試料を、４～２０％のＳＤＳ－ＰＡＧＥに充填し、分解した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ画像化システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で、５３２ｎｍで励起させ、６１０ｎｍで発光させて可視化した。図４に示されるように、蛍光画像を灰色スケールで表示し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ定量化ソフトウェアを使用して、蛍光シグナルの強度を定量化した。図４は、蛍光に基づくアッセイを使用した、ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞における、化合物１によるＧＭＰＳの用量依存的係合を示すグラフである。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ＥＣ_５０（１６ｎＭ）値を計算した。

生化学的ＩＣ_５０決定のために、ＥＰＰＳ（ｐＨ７．８）、ＥＤＴＡ（１００μＭ）、ＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＸＭＰ（２００μＭ）、グルタミン（５ｍＭ）を含有する反応緩衝液を調製した。ブランク緩衝液は、ＸＭＰが存在しないことを除いて、同じ成分を等濃度で調製した。ＥＰＰＳ（ｐＨ７．８）中の変動する濃度（０．１μＭ～１００μＭの範囲）で、タンパク質溶液を調製した。ＵＶ－ｖｉｓを動態モードに設定し、吸光度波長を２９０ｎＭに設定した。ブランク緩衝液での自動零点規正に続いて、４９５μｌの反応緩衝液を５μＬの各タンパク質溶液でインキュベートし、所望の濃度の１０００倍の０．５μＬの薬物を反応混合物に添加し、３０分間にわたって２９０ｎＭでの吸光度の減少を観察した。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）での非線形回帰「用量応答阻害」モデルを使用して、プローブおよび競合物分子のＩＣ_５０値を計算した。図５に示されるように、化合物１は、６．６ｎＭのＩＣ_５０を有し、非常に強力であることが示された。図５は、２９０ｎｍでの吸光度の減少を監視することによる分光アッセイを使用した、化合物１のＩＣ_５０の決定を示すグラフである。

実施例４
化合物１の療法的効果のインビボ特徴評価
メラノーマＣＤＸモデルを使用して、プリンサルベージデノボ経路を標的化することを通じて、化合物１の療法的潜在性のインビボ確認を提供した。このモデルには、ＳＫ－ＭＥＬ－２８腫瘍細胞（０．１ｍＬのＰＢＳおよびＭａｔｉｇｅｌ中５×１０^６、１：１）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下接種（ｓｃ）した。腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ^３（１００～２５０ｍｍ^３）に達したら、化合物１の治療を開始し、５日間１日２回、続いて９日間１日１回、皮下で与えた。治療期間を通じて、腫瘍サイズを記録した。対照と比較して、化合物１は腫瘍サイズを低減することが可能であり、開始した８日目には、図７に示されるように、治療期間の終わりまで低減増加に差がある。化合物１は、ＳＫ－ＭＬ－２８腫瘍増殖を阻害した。６０ｍｇ／ｋｇの化合物１を、５日間１日２回、続いて９日間１日１回皮下で与えた。ビヒクル対照は、５％のＤＭＳＯおよび９５％の２０％の２－ヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン溶液からなった。各群は８匹の雌マウスを含んだ。ｔ検定は、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅを使用して行った。図６は、ＳＫ－ＭＬ－２８腫瘍増殖の化合物１阻害を示すグラフである。図６に示される全体的な傾向は、インビトロ活性がインビボ環境に転換した証拠を提供し、インビボ有効性の統計的に顕著な実証を達成するために化合物１の効力を向上させる必要があることを示した。

図７は、本開示のいくつかの態様による、タンパク質標的を同定する方法を示すフローチャートである。ステップ７０１は、生細胞、細胞溶解物、または生きた動物のプロテオームを、試料１および試料２として２つの同一の試料に分割する。ステップ７０２は、試料１を競合化合物でインキュベートする。ステップ７０３は、プローブ化合物を、競合化合物で処置した試料１および試料２でインキュベートする。ステップ７０４は、検出可能な標識をそれぞれ、試料１および試料２と反応させ、これによって、標的タンパク質の富化が可能になる。ステップ７０５は、富化した標的タンパク質のプロテアーゼ消化を実施する。また、ステップ７０６は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を使用するタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を実施して、試料１および試料２からの富化された標的タンパク質を比較し、これによって、プローブ化合物を共有結合する標的タンパク質の同定および定量化が可能になる。

本発明は、上の実施例を参照しながら説明されてきたが、修正および変形が、本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解されるであろう。本発明の例示的な実施例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる添付文書Ａとして本明細書に添付される。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims

タンパク質標的を同定するための方法であって、
（ａ）第１のタンパク質含有試料を、コア構造および求電子部分を含むが末端のクリック可能なタグを欠く競合化合物と接触させて、前記競合化合物で処理した試料を得る工程であって、前記クリック可能なタグが末端アルキン部分であり、前記求電子部分が前記タンパク質標的中の求核性アミノ酸残基に結合する、工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記競合化合物で処理した試料を、同じコア構造、同じ求電子部分および前記クリック可能なタグを含むプローブ化合物と接触させる工程と、
（ｃ）第２のタンパク質含有試料を前記競合化合物と接触させる工程なく、前記第２のタンパク質含有試料を前記プローブ化合物と接触させる工程と、
（ｄ）前記第１のタンパク質含有試料中のプローブ化合物で修飾されたタンパク質の量を、前記第２のタンパク質含有試料中のプローブ化合物で修飾されたタンパク質の量と比較して検出することによって、前記タンパク質標的を同定する工程と
を含む、前記方法。
工程（ｄ）が、前記競合化合物と前記タンパク質標的との間の結合相互作用を定量化することをさらに含む、および／または工程（ｄ）が、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）を用いるＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
工程（ａ）の前に、プロテオームを２つの同等のタンパク質含有試料に分割して、前記第１のタンパク質含有試料および前記第２のタンパク質含有試料を得る工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記プローブ化合物で修飾されたタンパク質が、前記クリック可能なタグを介して検出可能な標識でさらに誘導体化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記検出可能な標識が、ビオチンを含む、請求項４に記載の方法。
前記タンパク質標的中の前記求核性アミノ酸残基が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記求電子部分が、ハロゲン化アルキル、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルハロゲン、マレイミド、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、エポキシド、オキシラン、カルボネート、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニジルミダゾール、およびカルボジイミドからなる群から選択される求電子基である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記プローブ化合物上の前記求電子部分が、

からなる群から選択される求電子基である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のタンパク質含有試料および前記第２のタンパク質含有試料をそれぞれ、検出可能な標識および前記プローブ化合物中の前記クリック可能なタグとの反応性を有する基を含む化合物と反応させて、検出可能な標識をタグ付けされたタンパク質標的を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記検出可能な標識をタグ付けされたタンパク質標的を富化することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
前記富化したタンパク質標的のプロテアーゼ消化を実施することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。