JP7549582B2 - 予測可能かつ安定な導入遺伝子発現を有するｓｓｉ細胞および形成の方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１日の出願日を有する米国仮特許出願第６２／７３９，５４６号の出願の利益を主張し、該仮特許出願は参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。

異種ポリペプチドの発現のための宿主細胞中での組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｒＰ）発現カセットの組込みが長年実行されてきた。伝統的に、発現カセットの組込みのためにゲノム中に存在する二本鎖切断を利用するランダム組込み（ｒａｎｄｏｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；ＲＩ）プロセスが使用されていた。残念なことに、位置雑多性効果に起因して、組み込まれる遺伝子コピーの数および組込み部位における発現的特徴の両方はＲＩプロセスにおいて高度に変動性であって、望ましくない表現型上の不均質性を生じさせることがある。そのため、ＲＩプロセスは、有用な細胞系の開発において組込み事象の高価なスクリーニングを要求する。さらに、発現を増加させるために使用される遺伝子増幅方法は、ゲノムにおける不安定性（例えば、欠失、重複、転座）の他に、発現修飾性のエピジェネティックな作用（例えば、メチル化、ヒストン修飾、ヘテロクロマチン侵入）を生じさせることがある。結果として、ＲＩ製造性の細胞系は多くの場合に不安定であり、経時的な製造の低減を示す。

より最近では、部位特異的組込み（ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；ＳＳＩ）が開発されており、ＳＳＩでは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦＬＰ－ＦｒｔシステムまたはバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムなどの部位特異的リコンビナーゼシステムに由来する組換え標的部位（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ；ＲＴＳ）の組込みを通じて細胞ゲノム中に「ランディングパッド」が形成される。ＳＳＩ細胞系中にカセットを組み込むプロセスは、リコンビナーゼ媒介性カセット交換（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｓｓｅｔｔｅ－ｅｘｃｈａｎｇｅ；ＲＭＣＥ）と称される。ＲＭＣＥは、一般に、リコンビナーゼをコードする発現ベクターと、リコンビナーゼ標的化配列により隣接される目的の遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＧＯＩ）を含有する標的化発現ベクターとの共トランスフェクションを伴う。（ドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡの両方において）交換されるカセットの５’および３’末端において別個のＲＴＳを使用することにより、ＳＳＩ組込みアプローチは、組換えが方向性の方式で起こることおよび好ましいカセット領域のみが交換されることを確実にすることができる。

残念なことに、ＳＳＩ生成性の細胞系もまた、制限を有し得る。例えば、ＳＳＩシステムは、ベクター標的化およびＧＯＩを発現する細胞系の生成のための必要条件としてゲノムへのＲＴＳの挿入を要求する。ＲＴＳ挿入は、一般に、ＲＩによりまたは限定された数の特定のゲノム領域中に実行されるため、結果としてもたらされる細胞系は依然として不安定性および経時的な製造の低減にさらされる。さらに、ＳＳＩは、一般に、組み込まれる遺伝子コピーの低い数を結果としてもたらし、これはｒＰ製造タイターを間接的に制限する可能性がある。

組換え遺伝子の組み込まれるコピーを増加させる１つの方法は、累積的または蓄積的ＳＳＩと称される（例えば、Ｋａｍｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：１１０６－１４（２０１０）、Ｋａｗａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：２６７－７９（２０１２）およびＴｕｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０２：５２－６９（２０１０）を参照）。そのような方法は、単一の部位に逐次的にｒＰ発現カセットの複数のコピーを積み込むためのＲＭＣＥの繰返しのラウンドを含むことができる。

当該技術分野において必要とされるのは、宿主細胞のゲノム内の転写的に活性かつ高度に安定な座位においてＲＴＳを組み込むＳＳＩ細胞系である。そのような細胞系は、ＧＯＩの安定かつ長期間の発現が可能であろう。

刊行物、特許、および特許出願が本明細書において参照され、それらの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、導入遺伝子挿入部位からの転写出力の他に、その発現系の安定性は、その領域中のクロマチンの３次元（３Ｄ）構造により強く影響を及ぼされるという認識に基づく。本開示は、構造の決定および３次元におけるゲノムの確認（ゲノムの３Ｄマッピング）のためのこの認識に基づく方法を記載する。開示される３Ｄマッピング方法は、とりわけ、例えば、Ｈｉ－Ｃおよび他の染色体コンホメーション捕捉方法（Ｅｌｚｏ ｄｅ Ｗｉｔ ａｎｄ Ｗｏｕｔｅｒ ｄｅ Ｌａａｔ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１２ ２６：１１－２４）ならびにプロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｈｉ－Ｃ）（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２５：５８２－９７（２０１５））などの技術の利用を通じて実行することができる。３Ｄマッピングプロトコールにより得られる情報を利用する方法の他に、該方法により形成され得る哺乳動物細胞もまた記載される。本出願は、マルチレベル３Ｄゲノムマップを生成し、次にその情報を使用して異種遺伝子の発現のための最適なゲノム組込み部位を同定する方法を教示する。例えば、マッピングされた３Ｄゲノム構造を調べることにより、高性能を呈するらしい組込み部位を同定することができる。

一実施形態では、本開示は、高組込み性（ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ；ＨＩ）座位においてＲＴＳを含む哺乳動物細胞を対象とする。ＨＩ座位は、ゲノムクロマチンの３Ｄ階層構造の解析を通じて本発明者らにより同定された高性能ゲノム部位である。有益なことに、ＨＩ座位は、ゲノムの安定な、転写的に活性の環境中にあり、予測可能かつ安定なレベルのＧＯＩ発現を与えるために繰り返して標的化され得る。

ＨＩ座位は、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内にあることができ、そしてまた、トポロジカル関連ドメイン（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ；ＴＡＤ）境界の約３０，０００塩基対以内にあることができる。追加的に、ＨＩ座位は、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップすることができる。ＨＩ座位は、ＧＯＩの発現がインサイチューの内因性プロモーターにより駆動されるのか、それとも異種プロモーターにより駆動されるのかに依存して変動することができる。例えば、ＧＯＩの発現がインサイチューの内因性プロモーターにより駆動される細胞系において、ＨＩ座位は、転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ；ＴＳＳ）とオーバーラップすること、およびその下流にあることができる。さらに、この実施形態では、ＨＩ座位は、活性の、および一部の実施形態では完全にアノテーション付きでもある、遺伝子座、例えば、その発現生成物またはその欠如が細胞に対して不可欠でない活性の遺伝子とオーバーラップすることができる。ＧＯＩの発現が異種プロモーターにより駆動される細胞系において、ＨＩ座位は、一般に、活性のまたは転写されない遺伝子座の外部にあることができる。例えば、そのような細胞中のＨＩ座位は、活性の遺伝子のいかなる関連付けられるプロモーター領域ともオーバーラップしない、または一実施形態では、いかなる活性の遺伝子の約１，０００塩基対以内にもない（例えば、いかなる活性の完全にアノテーション付きの遺伝子の約１，０００塩基対以内にもない）座位を包含することができる。

一部の実施形態では、細胞は、複数のＲＴＳ、例えば、少なくとも２つのＲＴＳ、少なくとも４つのＲＴＳ、または一部の実施形態ではよりいっそう多くを含むことができる。例えば、細胞は、単一のＨＩ座位中、別個のＨＩ座位中、および／または別々の座位（例えば、ＦｅｒＩＬ４座位）中に複数のＲＴＳを含むことができる。

一部の実施形態では、ＲＴＳは、Ｆｒｔ部位、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位、またはａｔｔ部位を含むことができる。一部の実施形態では、ＲＴＳは、配列番号１２６～１５５の中から選択される配列を含むことができる。

本明細書に包含される細胞種は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、全てのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、全てのバリアントを含むＣＨＯグルタミンシンセターゼノックアウト細胞、ＨＥＫ細胞、接着および懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞を含むことができるがそれに限定されない。

一実施形態では、細胞は、ＧＯＩ、例えば、染色体組込みされたＧＯＩ、例えば、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子、補助的遺伝子、または遺伝子の組合せを含むことができる。ＧＯＩは、発現困難（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ；ＤｔＥ）タンパク質、例えば、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、またはモノクローナル抗体（例えば、二重特異性もしくは三重特異性モノクローナル抗体）をコードすることができる。一実施形態では、ＧＯＩは、単一のＨＩ座位内の２つのＲＴＳの間に位置することができる。細胞は、一部の実施形態では、複数のＧＯＩを組み込むことができる。例えば、細胞は、単一のＨＩ座位内に２つもしくはより多くのＧＯＩを組み込むことができ、その１つもしくはより多くが異なるＨＩ座位中にある複数のＧＯＩを組み込むことができ、かつ／またはＨＩ座位および別々の座位の任意の組合せ中に複数のＧＯＩを組み込むことができる。一部の実施形態では、細胞は、リコンビナーゼ遺伝子、例えば、一実施形態では染色体組込みされ得る、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を組み込むことができる。

組換え細胞を製造する方法もまた開示される。例えば、方法は、細胞ゲノムの接近可能なクロマチンにおいてピークをマッピングすること、および、接近可能なクロマチンにおいてマッピングされたピーク内で、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内にあり、かつトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）境界の約３０，０００塩基対以内にもあるピークの第１のセットを同定することを含むことができる。一実施形態では、ピークの第１のセットは、（例えば、主成分分析法（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ；ＰＣＡ）により定義されるような）活性のゲノムコンパートメント内にあることができ、かつ（例えば、ＡＴＡＣ－ｓｅｑにより定義されるような）オープンクロマチン内にもあることができるが、これは方法の要求ではなく、他の実施形態では、ピークの第１のセットは、マッピングされた接近可能なクロマチンの全体内の活性のゲノムコンパートメント内にあるピークを含むことができる。方法はまた、ピークの第１のセットの中で、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップするものを同定することを含むことができる。ＨＩ座位は、次に、これらの基準に適合するピークの中で定義され得る。ＨＩ座位の同定後に、ＲＴＳをＨＩ座位に挿入することができる。任意選択的に、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子もまた細胞に挿入することができる。

ＨＩ座位からの遺伝子の発現がインサイチューの内因性プロモーターにより駆動される実施形態では、方法は、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップするピークの第１のセットの中で、ＴＳＳ、特に、その発現生成物またはその欠如が不可欠でない活性の遺伝子のＴＳＳとオーバーラップするピークの第２のセットを同定することをさらに含むことができる。ＨＩ座位をピークのこの第２のセット内で定義することができ、ＨＩ座位は、活性の遺伝子とオーバーラップし、かつ活性の遺伝子のＴＳＳの下流にある。

ＨＩ座位からの遺伝子の発現が異種プロモーターにより駆動される実施形態では、方法は、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップするピークの第１のセット内で、活性の遺伝子ともそれらの関連付けられるプロモーター領域ともオーバーラップしない接近可能なクロマチン内のピークを同定することをさらに含むことができ、ＨＩ座位をピークのこの第２のセット内で定義することができる。

方法はまた、ＧＯＩをコードする交換可能なカセットを含むベクターを細胞にトランスフェクトすることおよび交換可能なカセットをＨＩ座位に組み込むことを含むことができる。ＨＩ座位において染色体に組み込まれた交換可能なカセットを含む細胞を次に組換えタンパク質産生細胞として選択することができる。

任意選択的に、方法は、追加のＲＴＳを細胞に組み込むことを含むことができる。例えば、追加のＲＴＳは、第１のＲＴＳと同じＨＩ座位、１つもしくはより多くの追加のＨＩ座位、および／または１つもしくはより多くの別々の座位に組み込むことができる。

別の実施形態によれば、細胞ゲノムの接近可能なクロマチンにおいてピークをマッピングすること、および、接近可能なクロマチンにおいてマッピングされたピーク内で、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内にあり、かつトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）境界の約３０，０００塩基対以内にもあるピークの第１のセットを同定することを含む、組換え細胞を製造する方法が開示される。一実施形態では、ピークの第１のセットは、（例えば、主成分分析法（ＰＣＡ）により定義されるような）活性のゲノムコンパートメント内にあることができ、かつ（例えば、ＡＴＡＣ－ｓｅｑにより定義されるような）オープンクロマチン内にもあることができるが、これは方法の要求ではなく、他の実施形態では、ピークの第１のセットは、マッピングされた接近可能なクロマチンの全体内の活性のゲノムコンパートメント内にあるピークを含むことができる。方法はまた、ピークの第１のセット内で、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップするものを同定することを含むことができる。複数のＨＩ座位を次に、マッピングされたピークの結果としてもたらされるセット内で定義することができる。方法は、（例えば、ＲＩプロトコールにしたがって）ＲＴＳを複数の細胞に組み込むこと、および次にその複数の細胞からＨＩ座位に組み込まれたＲＴＳを含む細胞を選択することをさらに含むことができる。任意選択的にまた、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子をその選択された細胞に挿入することができる。

一実施形態では、方法により同定されたＨＩ座位を有効性にしたがって順位付けすることができる。例えば、ＨＩ座位は、各座位と関連付けられる１つまたはより多くの遺伝子の発現レベル、各座位から最近接のＴＡＤ境界までの距離、および各座位の予測されるエンハンサー相互作用の数のうちの１つまたはより多くにしたがって順位付けすることができる。ＨＩ座位に組み込まれたＲＴＳを含む細胞が選択される１つのそのような実施形態では、ＨＩ座位挿入部位の順位にしたがって細胞を選択することができる。

一実施形態では、ＨＩ座位を定義する方法はまた、ＨＩ座位が、インサイチューの内因性プロモーターまたは異種プロモーターのいずれを用いて駆動される異種遺伝子を発現するために利用されることが意図されるのかに依存することができる。例えば、ＨＩ座位からの遺伝子の発現がインサイチューの内因性プロモーターにより駆動される実施形態では、方法は、上記に定義されるようなマッピングされたピークの結果としてもたらされるセット内で、その発現生成物またはその欠如が不可欠でない活性の遺伝子などの、活性の遺伝子のＴＳＳとオーバーラップするピークを同定することをさらに含むことができる。同定された遺伝子とオーバーラップし、かつこれらの同定された遺伝子のＴＳＳの下流にあるピークの第２のセットを次に定義することができ、ＨＩ座位をピークのこの第２のセット内で定義することができる。

ＨＩ座位からの遺伝子の発現が異種プロモーターにより駆動される実施形態では、方法は、上記に定義されるようなマッピングされたピークの結果としてもたらされるセット内で、いかなる遺伝子、例えば、いかなる活性の遺伝子とも、それらの関連付けられるプロモーター領域ともオーバーラップしないピークの第２のセットを同定することをさらに含むことができ、ＨＩ座位をピークのこの第２のセット内で定義することができる。

方法はまた、ＨＩ座位に組み込まれたＲＴＳを含む選択された細胞にＧＯＩをコードする交換可能なカセットを含むベクターをトランスフェクトすることおよび交換可能なカセットをＨＩ座位に組み込むことを含むことができる。染色体に組み込まれた交換可能なカセットを含む細胞を次に組換えタンパク質産生細胞として選択することができる。

任意選択的に、方法は、追加のＲＴＳを細胞に組み込むことを含むことができる。例えば、追加のＲＴＳは、第１のＨＩ座位、１つもしくはより多くの追加のＨＩ座位、および／または１つもしくはより多くの別々の座位に組み込むことができる。

当業者に対するその最良の形態を含む本発明の主題の完全かつ実施可能にする開示は、添付の図面への参照を含めて、本明細書の残りの部分においてより具体的に示される。
１は、ゲノムの３Ｄマップの生成ならびに候補ＨＩ座位を定義および順位付けするためのその利用の方法の一実施形態を示すフローチャートを提示する。図表は、逐次的なフィルタリングまたはスクリーニングプロセスの要約を示し、該プロセスにより、マルチレベル３Ｄゲノムマップを生成するために使用されるデータを次に使用して候補ＨＩ座位を同定することができる。 図２Ａは、個々のＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ未加工スキャフォールドの解像（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）においてＬＡＣＨＥＳＩＳアセンブリーにマッピングされたデータについてのゲノムワイドＨｉ－Ｃヒートマップのセクションを示す。シス相互作用のみをプロットしており、最小ＬＡＣＨＥＳＩＳ群７、８および９は視覚的明確性を理由に含めていない。 図２Ｂは、個々のインプットＣＨＯ－Ｋ１ＳＶスキャフォールドおよび最終ＬＡＣＨＥＳＩＳアセンブリーにマッピングされたＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ １０Ｅ９ Ｈｉ－Ｃ複製物にわたる近接シス（＜１０ｋｂ）、遠方シス（＞１０ｋｂ）およびトランス特有の、有効なジタグ（ｄｉ－ｔａｇｓ）の平均パーセンテージを表し示す１００％に積み上げられた棒グラフを示す。比較のために、ヒト胚性幹細胞およびマウス胎仔肝細胞に由来する同等のＨｉ－Ｃデータセットの複製物にわたり平均化した、近接シス、遠方シスおよびトランスジタグの分布を含めている（Ｎａｇａｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｈｉ－Ｃ ｒｅｓｕｌｔｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎ－ｎｕｃｌｅｕｓ ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１６，１７５（２０１５））。 図３Ａは、候補ＨＩ座位配列番号３の構造的特徴を示す（位置を菱形により指し示す）。候補座位は活性のユークロマチン様領域内に存在することを示すＨｉ－Ｃ ＰＣＡの結果（左）。近傍において同定されたＴＡＤに対する候補座位の位置（中央）。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ１シグナルを用いてアノテーションされた候補座位ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片ならびにベイト付きのプロモーターＨｉｎｄＩＩＩ制限断片の位置の相互作用プロファイル（右）。 図３Ｂは、候補ＨＩ座位配列番号２の構造的特徴を示す（位置を菱形により指し示す）。候補座位は活性のユークロマチン様領域内に存在することを示すＨｉ－Ｃ ＰＣＡの結果（左）。近傍において同定されたＴＡＤに対する候補座位の位置（中央）。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ１シグナルを用いてアノテーションされた候補座位ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片ならびにベイト付きのプロモーターＨｉｎｄＩＩＩ制限断片の位置の相互作用プロファイル（右）。 図３Ｃは、現行の産業上関連するＦｅｒ１Ｌ４ランディングパッドの構造的特徴を示す（位置を菱形により指し示す）。候補座位は活性のユークロマチン様領域内に存在することを示すＨｉ－Ｃ ＰＣＡの結果（左）。近傍において同定されたＴＡＤに対する候補座位の位置（中央）。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ１シグナルを用いてアノテーションされた候補座位ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片ならびにベイト付きのプロモーターＨｉｎｄＩＩＩ制限断片の位置の相互作用プロファイル（右）。 図４Ａ～図４Ｄは、ＣＭＶプロモーターの制御下の組み込まれたｅＧＦＰレポーターカセットの発現についての表１から取られたゲノム座位のサブセットのスクリーニングの結果を示す。候補座位を図１に記載のスクリーニングプロセスにより同定し、座位特異的ガイドＲＮＡと組み合わせてＣａｓ９ヌクレアーゼを使用して同一のＣＭＶ－ｅＧＦＰ発現カセットを該座位に標的化することにより経験的に試験した。図４Ａに示されるドナープラスミド内に含有されるＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットを、トランスフェクション後のプラスミドからのＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットのインビボＣａｓ９媒介性切断のために要求される「シュードｇＲＮＡ」（ｐｓｅｕｄｏ ｇＲＮＡ）配列も発現する細胞にトランスフェクトした。プラスミドから放出されると、ＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットは、ＢｂｓＩ部位においてｇＲＮＡスキャフォールド配列の上流でドナープラスミドにクローニングされた、座位特異的ｇＲＮＡの発現により要求されるゲノム座位への組込みのために標的化される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、別々のプラスミド（図示せず）上での共トランスフェクションにおいて供給した。図４Ｂは、図４Ｃに示される各プールについてのＧＦＰ＋細胞のメジアンＧＦＰシグナルと共に、Ｃａｓ９およびＣＭＶ－ｅＧＦＰドナープラスミドの両方のトランスフェクションの１３日後の、チャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞系（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１５：３１（６）１６４５－５６）のプールにおいて達成されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。図４Ｃにおいて、各標的座位についての２つのバーはフローサイトメーター解析の技術的複製物を表す。各プールにおけるＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットのオンターゲット組込みを確認するために、抽出されたゲノムＤＮＡに対してＰＣＲベースのアッセイを使用した（図４Ｄ）。ＰＣＲ生成物はオンターゲットゲノム組込みにおいてのみ製造され、ドナープラスミドのみ（「Ｄ」）が鋳型として使用された場合にはＰＣＲ生成物は製造されない。「ドナー」はドナープラスミドを指し、「Ｈｅｔ対照」はヘテロクロマチン対照組込み部位を指し、「Ｆｅｒ１ｌ４」は、以下において言及される１０Ｅ９細胞系を用いたランディングパッドを指す。 同上。 同上。 同上。

本議論は例示的な実施形態の説明に過ぎず、本開示のより広い態様を限定することは意図されないことが当業者により理解されるべきである。

本開示は、一般に、細胞ゲノムの３Ｄマップの構築、および１つの具体的な実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣細胞ゲノムの３Ｄマップの構築を対象とする。組換え導入遺伝子が発現され得る高性能組込み部位（ＨＩ座位）を同定するためのそのようなマップの使用もまた開示される。３Ｄマップは、本明細書にさらに記載される１つの具体的な実施形態では、ゲノムワイド転写活性に関するＲＮＡ－Ｓｅｑデータの他に核ヒストンのメチル化およびアセチル化のデータセットと組み合わせたＡＴＡＣ－ｓｅｑ（Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．１０：１２１３－８（２０１３））、Ｈｉ－Ｃ、およびプロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃなどの直交的方法の組合せの使用により生成することができる。そのようなアプローチを通じて、３Ｄゲノムの他にその発現プロファイルの大域的な描写を生成することができ、これはＨ１座位の認識および設計の情報を与えることができる。

一実施形態によれば、ＨＩ座位内に組み込まれたＲＴＳを含む哺乳動物細胞が開示される。哺乳動物細胞を組み込んだｒＰ産生細胞系およびそのような哺乳動物細胞を形成する方法もまた開示される。本明細書に記載のＨＩ座位および細胞ゲノム中のＨＩ座位を同定する方法は、哺乳動物細胞中のクロマチンの３Ｄ階層構造の理解およびマッピングを通じて開発された。ＨＩ座位は、クロマチンの接近可能性およびエピジェネティックな安定性の両方を提供することができる転写的に活性の環境中に存在する。そのため、１つまたはより多くのＨＩ座位において（すなわち、完全に内部に、オーバーラップして、または＋／－約５Ｋｂで）ＲＴＳを組み込んだＳＳＩ哺乳動物細胞は、予測可能かつ安定な導入遺伝子の製造を提供することができる。例えば、開示されるような哺乳動物細胞中でのＧＯＩの発現は、約７０、約１００、約１５０、約２００、または約３００世代にわたり安定であり得る。本明細書において利用される場合、発現は、製造開始の直後の初期発現レベルと比較した場合に経時的に約３０％もしくはそれ未満だけ減少し、または同じレベルもしくは増加したレベル（例えば、約３０％もしくはそれより大きい）に維持される場合に「安定」であると考えることができる。一部の実施形態では、発現は、容量生産性が±３０％未満で変化し、または同じレベルに維持される場合に安定であると考えられる。一部の実施形態では、ＳＳＩ宿主細胞は、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、もしくは約５ｇ／Ｌまたはより多くのＧＯＩの発現生成物を製造することができる。一部の実施形態では、ＳＳＩ細胞（例えば、ＳＳＩ細胞系）は、さらなる選択なしに培養において維持することができる。そのため、開示される細胞系は、規制機関にとってより許容可能なものであり得る。

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、値が、値を決定するために用いられている方法／デバイスについて本来備わっている誤差の変動、または研究対象の間で存在する変動を含むことを指し示すために使用される。典型的には、該用語は、状況に依存して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％程度またはそれ未満の変動性を包含することが意味される。

一実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来することができる。この議論の大半はＣＨＯ細胞および細胞系に言及するが、本開示はいかなる具体的な細胞種にも決して限定されないことが理解されるべきであり、本明細書において言及される場合、「哺乳動物細胞」という用語は、哺乳目の任意のメンバーからの細胞を含む。本明細書に包含される哺乳動物細胞としては、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞、およびウシ細胞などを挙げることができるがそれに限定されない。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞（例えば、マウス骨髄腫、例えば、ＮＳ０もしくはＳＰ２／０細胞系）、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、全てのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）、全てのバリアントを含むＣＨＯグルタミンシンセターゼノックアウト細胞（例えば、ＧＳ－ＫＯ（商標）、Ｘｃｅｅｄ（商標））、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、または任意のＣＨＯ由来の細胞である。

一実施形態によれば、ゲノム内に天然に存在するＨＩ座位を同定することができ、この同定を使用して、ＨＩ座位のうちの１つまたはより多くにおいて染色体組込みされた異種核酸分子を組み込んだ哺乳動物細胞を開発することができる。例えば、異種核酸分子は、組換えタンパク質の製造用の細胞系の形成においてＧＯＩを発現するために設計された外因性のカセットを包含することができる。

本明細書において使用される場合、「核酸」、「核酸分子」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能であり、共有結合的に連結したヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。該用語は、ポリ（リボ核酸）（ＲＮＡ）およびポリ（デオキシリボ核酸）（ＤＮＡ）を含み、これらの両方は、一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡとしては、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドまたはベクターＤＮＡ、および合成ＤＮＡが挙げられるがそれに限定されない。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＭＩＲＮＡが挙げられるがそれに限定されない。

本明細書において使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は交換可能であり、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、該形態は、コーディングされたおよびコーディングされないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。「鎖」およびポリペプチド「鎖」という用語は本明細書において交換可能に使用され、単一のペプチド骨格のアミノ酸のポリマー形態を指す。「アミノ酸」という用語は、天然および非天然、すなわち合成の両方のアミノ酸を指す。

本明細書において使用される場合、「組換え」という用語は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関して使用される場合、天然に存在することが知られていない遺伝材料の新たな組合せを意味し、またはその結果としてもたらされる。組換え分子は、組換え技術の分野において利用可能な任意の周知の技術により製造することができ、該技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子切断（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用する）、ＤＮＡライゲーション（例えば、ＤＮＡリガーゼ酵素を使用する）、ＲＩ、ＲＭＣＥ、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の技術、核酸分子、ペプチド、またはタンパク質の固体状態合成の他に、技術の組合せが挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、「組換え」は、天然に存在することが知られていないウイルスベクターまたはウイルス、例えば、ウイルスベクターまたはウイルス中に１つまたはより多くの突然変異、核酸挿入、または異種遺伝子を有するウイルスベクターまたはウイルスを指す。一部の実施形態では、「組換え」は、天然に存在することが知られていない細胞または宿主細胞、例えば、細胞または宿主細胞中に１つまたはより多くの突然変異、核酸挿入、または異種遺伝子を有する細胞または宿主細胞を指す。

本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドのアセンブリーを指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸分子を含む。「遺伝子」はまた、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）および後続する（３’非コーディング配列）調節エレメントとして作用することができる核酸断片を指す。異種遺伝子は、単一のコピーで、複数のコピーで、かつ／または予め定義されたコピー数において宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。

本明細書において使用される場合、「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現の何らかの態様を制御する遺伝子エレメントを指す。

本明細書において使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、または「プロモーター領域」という用語は交換可能であり、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、かつ下流のコーディングまたは非コーディング配列の転写の開始に関与するＤＮＡ調節領域／配列を指す。本開示の一部の例では、プロモーター配列は、転写開始部位（本明細書においてｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ（ＴＳＳ）と称されることもある）を含み、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最小数のエレメントを含むように上流に伸長する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＴＳＳの他に、ＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメインを含む。真核性プロモーターは、常にではないが多くの場合に、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーター、リーキープロモーター（ｌｅａｋｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）、合成プロモーターなどを含む様々なプロモーターが、本開示の宿主細胞および／またはベクターにおいて遺伝子発現を駆動するために使用されてもよい。

本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、それが位置する宿主細胞とは異なる種に由来するか、または同じ種に由来するが、該種（もしくは宿主細胞）において異なる位置に天然に見出される、核酸配列、例えば、任意選択的にＧＯＩに作動可能に連結したプロモーターを指す。異種核酸配列は原核システムまたは真核システムに由来することができる。異種調節配列と関連付けられた（例えば、異種プロモーターの下流にあり、その開始を通じて転写される）コーディングまたは非コーディング配列は、異種調節配列にとって内因性であることができ（例えば、異種プロモーターは、天然の状況における配列に作動可能に連結している）、または異種調節配列にとって異種であることができる（例えば、異種プロモーターは、天然の状況における配列に作動可能に連結していない）。

本明細書において使用される場合、「内因性」という用語は、宿主細胞中に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、内因性プロモーターは、作動可能に連結して、宿主細胞にとって異種である下流のコーディングまたは非コーディング配列の転写を開始させることができる。

本明細書において使用される場合、「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結した」という用語は交換可能であり、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が製造されるような方式での核酸配列の連結を指す。該用語はまた、機能的タンパク質が製造されるような方式でのアミノ酸配列の連結を指す。例えば、ＧＯＩ、補助的遺伝子、リコンビナーゼコーディング遺伝子、または非コーディング配列は、プロモーターに作動可能に連結していることができ、核酸配列は、宿主細胞に染色体組込みされることができる。

本明細書において言及される場合、「染色体組込みされた」または「染色体組込み」という用語は、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞の染色体への核酸配列の安定な組込み、すなわち、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に染色体組込みされた核酸配列を指す。

本明細書において使用される場合、「染色体座位」および「座位」（ｌｏｃｕｓ）（複数形：「ｌｏｃｉ」）という用語は交換可能に使用され、細胞の染色体上の核酸の定義された位置を指す。一部の実施形態では、座位は少なくとも１つの遺伝子を含んでもよい。例として、染色体座位は、約５００塩基対～約１００，０００塩基対、約５，０００塩基対～約７５，０００塩基対、約５，０００塩基対～約６０，０００塩基対、約２０，０００塩基対～約５０，０００塩基対、約３０，０００塩基対～約５０，０００塩基対、または約４５，０００塩基対～約４９，０００塩基対を含むことができる。一部の実施形態では、染色体座位は、定義された核酸配列の５’および／または３’末端へ向けて約１００塩基対、約２５０塩基対、約５００塩基対、約７５０塩基対、約１，０００塩基対、または約５，０００塩基対まで伸長することができる。

一実施形態では、方法は、ゲノム中のＨＩ座位を同定することを含むことができる。ＨＩ座位は、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内にあることができ、かつトポロジカル関連ドメイン境界の５’方向または３’方向のいずれかにおいて約３０，０００塩基対以内にあることができる。一実施形態では、ピークの第１のセットは、（例えば主成分分析法（ＰＣＡ）により定義されるような）活性のゲノムコンパートメント内にあることができ、かつ（例えばＡＴＡＣ－ｓｅｑにより定義されるような）オープンクロマチン内にもあることができるが、これは方法の要求ではなく、他の実施形態では、ピークの第１のセットは、マッピングされた接近可能なクロマチンの全体内の活性のゲノムコンパートメント内にあるピークを含むことができる。ＨＩ座位はまた、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用する領域とオーバーラップすることができる。よって、ＨＩ座位の同定は、これらの基準を満たすピークのセットを同定するためのゲノムの３Ｄマッピングを含むことができる。

本明細書において使用される場合、「トポロジカル関連ドメイン」、および「ＴＡＤ」、ならびに「コンタクトドメイン」という用語は交換可能に使用され、互いと優先的に物理的に相互作用する核酸配列を含有する高度に保存されたゲノム領域を指す。そのため、ＴＡＤ内の核酸配列は、ＴＡＤの領域外に存在する配列とよりも頻繁に互いと物理的に相互作用する。ＴＡＤは、何千から何百万もの塩基対に伸長することができる。ＴＡＤは、活性転写と関連付けられる因子が濃縮され得る境界領域（「ＴＡＤ境界」）により仕切られ得る。例えば、ＴＡＤ境界領域は、比較的高いレベルのＣＴＣＦ結合を呈することができる。ＴＡＤ境界領域はまた、比較的多数のｔＲＮＡ遺伝子およびハウスキーピング遺伝子（例えば、アクチン、ＧＡＰＤＨ、ユビキチンなど）の存在により認識され得る

本明細書において使用される場合、「エンハンサー」、「エンハンサーエレメント」、「推定上の活性のエンハンサーエレメント」、および「予測される活性のエンハンサーエレメント」という用語は交換可能に使用され、標的遺伝子の転写速度を増加させることができ、かつアノテーション付きの転写開始部位の２Ｋｂ上流または２Ｋｂ下流の領域とオーバーラップしないが、ＣｈｒｏｍＨＭＭ分析（例えば、Ｅｒｎｓｔ ａｎｄ Ｋｅｌｌｉｓ Ｍ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１２：２４７８－２４９２（２０１７）を参照）により指し示されるように、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑシグナル（オープンな接近可能なクロマチンを指し示す）、ならびにＨ３Ｋ４ｍｅ１およびＨ３Ｋ２７ａｃヒストンマーク（Ｓｈｌｙｕｅｖａ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．１５：２７２－８６）について濃縮されている、ＤＮＡ調節領域／配列を指す。

「エンハンサーエレメント」という用語はまた、「相互作用性の推定上の活性のエンハンサー制限断片」を包含することができ、これは、それ自体はアノテーション付きの転写開始部位（ＴＳＳ）を含有せず、かつ／または（ＣｈｒｏｍＨＭＭ分析により指し示されるような）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３もしくはＨ３Ｋ９ｍｅ３のいずれかのヒストンマークについて濃縮されたゲノム領域とオーバーラップしないが、（上記に定義されるような）推定上の活性のエンハンサーとオーバーラップし、かつシスおよび複数のＰＣＨｉ－Ｃ（プロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃ）複製物において、アノテーション付きＴＳＳを含有するＨｉｎｄＩＩＩ制限断片と相互作用する、ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を指す。

エンハンサーエレメントは、コーディングまたは非コーディング配列用のプロモーターに連結されることができ、プロモーターおよび関連付けられる遺伝子の上流または下流のいずれかに位置することができる。エンハンサーエレメントは、多くの場合に、いずれかの方向で置かれた場合に活性を呈することができ、エンハンサーは、プロモーターからかなりの距離に位置する場合に活性であってもよい。例えば、エンハンサーエレメントは、ＴＳＳの約１，０００，０００まで上流または下流のいずれかに位置することができ、ＴＳＳと連続または非連続であることができる。エンハンサー活性を検出する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照。そのようなエンハンサーエレメントと関連付けられる活性（最初にウイルス配列（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１）について、およびその後に後生動物の遺伝子座を起源とする配列（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３）について記載された）としては、プラスミド構築物内のプロモーターに対するエレメントの位置または方向性にかかわらない転写の活性化が挙げられる。

図１に示されるように、方法は、接近可能なクロマチン内のピークの同定を含むことができる。本明細書において使用される場合、「ピーク」という用語は、ＤＮＡシークエンシングリードの数（すなわち、シークエンシングリード深さ）の増加を含むゲノムの領域を指す。例えば、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑにより明らかにされるようなゲノム領域についての正規化されたバックグラウンドモデルより高いシークエンシングリード深さの増加はオープンクロマチンを指し示すことができる一方、ＰＣＨｉ－Ｃ実験からの２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限断片の間のシークエンシングリードの数における設定された閾値より高い増加（例えば、５またはより高い正規化されたＣＨｉＣＡＧＯスコア；Ｃａｉｒｎｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６．１７：１２７）は、２つのゲノム領域の間の統計的に有意なシス相互作用を指し示す。「ピーク」という用語はまた、Ｈｉ－ＣおよびＰＣＨｉ－Ｃなどの技術により明らかにされるようなゲノム中の２点の間のコンタクト頻度における予め決定された閾値より高い増加を指すことができる。

一部の実施形態では、ピーク同定は、例えば、ＣｈＩＰ－シークエンシングまたはＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ（メチル化ＤＮＡ免疫沈降シークエンシング）プロトコールといったシークエンスプロトコールを行う帰結として実行することができる。当該技術分野において公知であるような任意のピークコーリングツールが、本明細書において定義されるようなピークの同定において利用されてもよい。公知のピークコーリングツールの多くは、転写因子ＣｈＩＰ－ｓｅｑについてのみまたはＤＮａｓｅ－ｓｅｑについてのみなど、一部の種類のアッセイについてのみ最適化されている。しかしながら、本明細書に包含されるピーク同定の方法論はそのようなツールに限定されず、ＤＦｉｌｔｅｒ、ＧＥＭ、ＭＡＣＳ２（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｅｌ－ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ（２００８）ｖｏｌ．９（９）ｐｐ．Ｒ１３７）、ＭＵＳＩＣ、ＢＣＰ、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ－ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ（商標）およびＺＩＮＢＡが挙げられるがそれに限定されない任意のピークコーリング方法およびソフトウェアを利用することができる。ピークコーリング方法としては、検出の一般化された最適な理論に基づく方法の他に、異なる種類のシークエンシングデータと共に利用することができるものを挙げることができる。

目的の配列中のピークのマッピングおよび同定のために選択されるデータセットは、同定されているピークの種類に依存して最適化することができる。さらに、ピークは、参照配列としての複数のデータセットの利用を通じて同定することができる。例えば、ピークは、シミュレートされたＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセット、現実のデータセット、その組合せの利用を通じて、および数学的解析（例えば、候補ピークを順位付けするためのポアソン検定の利用）と組み合わせて同定することができる。データセットとしては、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ（例えば、Ｇｉｒｅｓｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２０１６／００６０６９１号；Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，ｅｔ ａｌ．２０１５ “ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ：Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓａｙｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ．” Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏ １０９：２１．２９．１－２１．２９．９を参照）、Ｈｉ－Ｃ、プロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃ（ＰＣＨｉ－Ｃ）（例えば、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２０１６／０１９４７１３号を参照）、ＲＮＡ－ｓｅｑ、およびその任意の組合せを挙げることができるがそれに限定されない。当該技術分野において公知であるような他のデータセット、例えば、Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ ＣｈｉＰ－Ｓｅｑデータセット（アクセッション番号－ＰＲＪＥＢ９２９１）を利用することができる（例えば、Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１３（１０）：２２４１－５３（２０１６）を参照）。一部の実施形態では、例えばＳＡＬＳＡまたはＬＡＣＨＥＳＩＳソフトウェアを使用して、目的の配列中のＨＩ座位の同定において利用することができる染色体スケールのデノボの参照ゲノムデータをアセンブルするために複数のデータセット（例えば、複数のＨｉ－Ｃデータセット）を利用することができる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１３ “Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１：１１１９－１１２５を参照）。

図１に示されるように、ＨＩ座位は、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内にあることができる（図３も）。そのため、図１に指し示されるように、ゲノム上のＨＩ座位の同定は、（例えば、ＡＴＡＣ－ｓｅｑを利用するピークコーリングアルゴリズムの利用を通じた）接近可能なクロマチンにおけるピークの初期同定、続いてそれらのピークのいずれが活性のゲノムコンパートメント中に存在するのかを決定するための解析を含むことができる。図１に示される同定ステップの特定の順序は代表的なものに過ぎず、開示される方法は、ゲノムの様々な態様がマッピングされるいかなる具体的な順序にも限定されないことが理解されるべきである。例えば、図１に示される実施形態では、活性のゲノムコンパートメント内にある接近可能なクロマチン内の全てのピークを同定するステップは、ＴＡＤの３０Ｋｂ以内に位置するピークの同定の前に実行されるが、実施形態におけるこれらおよび他のステップの具体的な順序を改変することができる。

一実施形態によれば、目的の配列の活性のゲノムコンパートメント内に見出される接近可能なクロマチンのピークの同定は、目的のゲノム配列の参照配列との比較により実行することができる。参照配列は、単一の既知の配列であることができ、または（例えば、複数のＨｉ－Ｃおよび／もしくはＰＣＨｉ－Ｃデータセットを用いるＬＡＣＨＥＳＩＳソフトウェアの利用を通じて）既知の配列のコンピレーションを通じてアセンブルされたものであり得る。一実施形態では、参照配列は、目的の全てのピーク、例えば、参照配列の全てのＡＴＡＣ－Ｓｅｑピークを同定するために調べることができる。活性のゲノムコンパートメント中に見出されるピークとの接近可能なクロマチン中に見出されるピークの比較は、参照配列の接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント中に存在するピークのセットを提供することができる。参照配列に対して目的の配列がマッピングされたら、接近可能なクロマチン中および活性のゲノムコンパートメント内にある目的の配列中のピークを同定するためにフィルタリングプロトコールを実行することができる。

ＨＩ座位はまた、ＴＡＤ境界領域の約３０，０００塩基対以内にあることができる。よって、一実施形態では、図１に示されるように、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント中に存在する目的の配列中のピークのセットの同定に続いて、ピークのこのセットをさらに解析して、それらのピークのいずれがＴＡＤ境界領域の約３０，０００塩基対（上流または下流のいずれか）以内にもあるのかを決定することができる。これは、同じまたは異なる参照配列に対する目的の配列のマッピングを通じて実行することができる。必要な場合、マッピングの前にＴＡＤ境界領域を参照配列において同定することができる。一実施形態では、ＴＡＤ境界領域は、「方向性指数」（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を使用して記載される方法にしたがって同定することができる（例えば、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，“Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．” Ｎａｔｕｒｅ．４８５（７３９８）：３７６－８０を参照）。当然、ＴＡＤ境界領域を同定するための他の方法およびツールを同様に利用することができる。

一実施形態（以下の実施例セクションにおいてさらに記載される）では、活性のゲノムコンパートメントおよびＴＡＤ境界位置の同定は、例えば、目的の配列にマッピングされたＬＡＣＨＥＳＩＳソフトウェアの使用により得られるゲノムアセンブリーに対してアルゴリズムを適用することにより、目的の配列に対して参照配列（例えば、ゲノムアセンブリー、Ｈｉ－Ｃデータセットの１つまたはコンピレーションなど）を比較することにより実行することができる。ＴＡＤ境界が同定されたら、ゲノムの接近可能なクロマチンセクションの少なくとも活性のゲノムコンパートメントにわたり完全な１つまたはより多くの参照ゲノム配列の利用を通じて、各ＴＡＤ境界の約３０，０００塩基対以内のピークを同定することができる。

図１に示される実施形態に示されるように、ＴＡＤ境界の約３０，０００塩基対以内にあり、かつ接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内にもあると同定されたピークのセットをさらに調べて、それらのピークのいずれがまた、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用（トランス相互作用もまた本明細書に包含されるが、一般にシス相互作用）するゲノムの領域とオーバーラップするのかを決定することができる。例えば、方法は、ＰＣＨｉ－Ｃ、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、ＣｈｒｏｍＨＭＭ、またはその組合せなどであるがそれに限定されないデータセットを使用する、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域の同定を含むことができる。一実施形態では、統計的に有意なエンハンサー相互作用予測は、目的の配列に対してマッピングされた参照配列のＰＣＨｉ－ＣおよびＣｈｒｏｍＨＭＭ分析により同定することができる。目的の配列中に以前に同定されたピークを次にさらにフィルタリングして、エンハンサーエレメントと相互作用するもののみを含めることができる。このさらなるフィルタリングは、ピークのセットをこれらの領域内に入るものに狭めることができる。結果としてもたらされるフィルタリングされたピークのセットを使用してゲノムのＨＩ座位を同定することができ、すなわち、これらのピークのそれぞれはゲノムの潜在的なＨＩ座位を定義することができる。

ゲノムに挿入される異種遺伝子の転写の駆動において使用されることが意図されるプロモーターの種類に依存してＨＩ座位のさらなる精密化を実行することができる。

異種プロモーターがＧＯＩの転写において使用される実施形態におけるＨＩ座位は、好ましくは、ゲノムのいかなる遺伝子ともオーバーラップすることができない。一実施形態では、ＨＩ座位は、ゲノムのいかなる活性の遺伝子ともオーバーラップしない座位を含むことができるが、異種プロモーターを組み込む実施形態は、活性の遺伝子とのオーバーラップの欠如に限定されない。一実施形態では、ＨＩ座位は、いかなる遺伝子のいかなるプロモーターともオーバーラップせず、または一実施形態では、ゲノムのいかなる活性の遺伝子のいかなるプロモーターともオーバーラップしない。一実施形態では、ＨＩ座位は、いかなるそのようなプロモーターのいずれの側においても約１，０００塩基対以内に入らない。そのため、一実施形態では、方法は、目的の配列に対する参照配列の再マッピングを通じて以前に得られた潜在的なＨＩ座位をフィルタリングして、目的の配列のこれらの領域（例えば、活性の遺伝子およびそれらの関連付けられるプロモーター領域（プロモーターの±約１，０００塩基対））に対して外的なピークを同定することをさらに含むことができる。これらのピークを次に、望ましいＨＩ座位として同定することができる。

インサイチューの内因性プロモーターがＧＯＩの転写において使用される実施形態において使用するためのＨＩ座位は、その発現または発現の欠如が細胞に対して不可欠でない、すなわち、組換え細胞がその活性の遺伝子なしで生存することができる、活性の遺伝子についてのインサイチューの内因性のＴＳＳとオーバーラップすることができる。そのため、図１の右側のフロー経路に示されるように、方法は、目的の配列に対する参照配列の再マッピングを通じて以前に得られた潜在的なＨＩ座位をフィルタリングして、接近可能なクロマチンの活性のコンパートメント内の不可欠でない活性の遺伝子およびそれらの関連付けられるＴＳＳを同定することをさらに含むことができる。目的の遺伝子はまた、挿入されるＲＴＳの発現における遺伝子のプロモーターの使用に影響し得る他の特徴、例えば、致死性について調べることができる。好適な遺伝子のこれらの領域とオーバーラップするピークを次に、望ましいＨＩ座位として同定することができる。

具体的な応用のための所望のカテゴリーの全てに適する、結果としてもたらされるピークのセットは、ゲノムのＨＩ座位を提供することができる。例えば、異種プロモーターの利用を包含する応用において使用するためのＨＩ座位は、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント中かつＴＡＤ境界の約３０，０００塩基対（上流または下流）以内に位置するピークを含むことができる。追加的に、これらのＨＩ座位は、エンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップすることができ、一般に、遺伝子ともそれらの関連付けられるプロモーター領域ともオーバーラップしない。

インサイチューの内因性プロモーターの利用を包含する応用において使用するためのＨＩ座位もまた、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント中かつＴＡＤ境界の約３０，０００塩基対（上流または下流）以内に位置するピークを包含することができ、これらのＨＩ座位もまた、エンハンサーエレメントと相互作用するゲノムの領域とオーバーラップすることができる。追加的に、これらのＨＩ座位は、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内に制限され、かつ細胞に対して不可欠でないと分類された機能を有する活性の遺伝子の内因性のＴＳＳとオーバーラップする。

一実施形態では、方法は、ＨＩ座位の同定後にそれを順位付けすることを含むことができる。例えば、ＨＩ座位は、座位と関連付けられる１つまたはより多くの遺伝子の発現レベル、座位から最近接のＴＡＤ境界までの距離、予測されるエンハンサー相互作用の数、および座位と関連付けられる１つまたはより多くの遺伝子の定常状態ｍＲＮＡレベルのうちの１つまたはより多くに基づいて順位付けすることができる。例えば、一実施形態では、各同定されたＨＩ座位は、単一のパラメーターのみにしたがって順位付けすることができ、全てのＨＩ座位についてのこれらの複数の順位を次に解析して、全体的な順位を決定することができる。コンビナトリアル解析は、所望により、重み付けすることができ、またはそうしなくてもよい。例えば、各座位の各順位についての単純和のスコアを利用して、非重み付けのコンビナトリアル方法にしたがって全体的な順位を決定することができる。高い順位の座位、例えば、高発現遺伝子と関連付けられ、最近接のＴＡＤ境界まで近く、および多数のエンハンサー相互作用を有することが予測されるものは、ＲＴＳの挿入のための非常に望ましい座位であり得る。

記載される方法の利用を通じて、ＨＩ座位を任意の哺乳動物細胞において同定することができる。例として、以下の表１は、開示される方法にしたがって同定されたＣＨＯゲノムＨＩ座位の例を提供する。しかしながら、ＣＨＯゲノムＨＩ座位は表１の座位に決して限定されず、配列番号１～１２５のいずれか１つに対する相同配列が本明細書に包含されることを理解されたい。他の実施形態では、ＣＨＯゲノムＨＩ座位は、以下の表１において同定されるように座位の５’および／または３’末端に対して約５，０００塩基対、約１，０００塩基対、約７５０塩基対、約５００塩基対、約２５０塩基対、または約１００塩基対以内にあることができる。

ＨＩ座位は、表１の配列と比較した場合に少数のミスマッチまたはギャップを有することができる。例えば、本明細書に包含されるＣＨＯゲノムＨＩ座位は、以下に記載の配列と約１０個またはより少ないミスマッチを有することができる。例えば、本明細書に包含されるＣＨＯ ＨＩ座位は、表１に記載されるような配列と１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１個のミスマッチを有することができ、かつ／または表１に記載されるような配列と比較した場合に５個もしくはより少ないギャップを有することができる。

本明細書において定義されるようなＨＩ座位はまた、配列番号１～１２５のいずれか１つの部分を包含することができ、配列番号１～１２５の全長配列に限定されない。例えば、ＨＩ座位は、配列番号１～１２５のいずれか１つの部分のみに同等の配列または相同の配列であるゲノム配列、例えば、配列番号１～１２５のいずれか１つの約５ｂｐから約９８％またはそれ未満までの領域に対して同等または相同のゲノム配列を包含することができる。例として、本明細書に包含されるＨＩ座位は、配列番号１～１２５のいずれか１つの約５ｂｐから全長の約９５％、９０％、８５％、８０％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％までに対して同等または相同の配列を含むことができる。

本明細書において利用される場合、「ホモログ」または「相同の配列」という用語は、特に与えられた比較配列に対して、例えば、表１の配列番号１～１２５のいずれか１つまたは配列番号１～１２５のいずれか１つの部分に対して、配列相同性を有するヌクレオチド配列を指す。本明細書において使用される場合、「配列相同性」という用語は、アライメントされたヌクレオチドの間の類似性を最大化する配列のアライメントに基づき、かつ同一のヌクレオチドの数、ヌクレオチドの総数、ならびに配列アライメント中のギャップの存在および長さの関数である、２つの配列の同一性または類似性の程度の度合を指す。標準的なパラメーターを使用して配列類似性を決定するための様々なアルゴリズムおよびコンピュータープログラムが利用可能である。一実施形態では、配列相同性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて利用可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１ －１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕ－ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（ｌ－２）：２０３－１４に記載されている、核酸配列用のＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定することができる。一実施形態では、２つのヌクレオチド配列の配列相同性は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム用の以下のパラメーター：ワードサイズ＝１ １、ギャップオープニングペナルティ＝－５、ギャップ伸長ペナルティ＝－２、マッチリウォード＝１、およびミスマッチペナルティ＝－３に基づくスコアにより決定することができる。

以下の表１の配列は、公的に利用可能なＢＧＩ ＣＨＯデータベースの他に、ＮＣＢＩ遺伝子配列データベースにおいて公的に利用可能なＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）を参照している。表１の配列のＧｅｎＢａｎｋアセンブリーアクセッション番号はＧＣＡ＿０００２２３１３５．１であり、表１の配列のＢＧＩ ＣＨＯ ＲｅｆＳｅｑアセンブリーアクセッション番号は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより２０１１年８月２３日に提出されたＧＣＦ＿０００２２３１３５．１である。表１において言及される「開始」および「終了」番号は、公的に利用可能な完全配列内の各ＨＩ座位の開始および終了ヌクレオチドを指す。

一実施形態によれば、ゲノムのＨＩ座位が同定されたら、ゲノムのＨＩ座位においてランディングパッドを含むように哺乳動物細胞を改変することができる。例えば、一実施形態では、具体的なＨＩ座位を（例えば、同定されたＨＩ座位の順位により）選択することができ、（例えば、配列番号１～１２５のいずれか１つの中もしくはそれとオーバーラップするまたは配列番号１～１２５のいずれか１つの５’末端もしくは３’末端のいずれかの約５，０００塩基対、約１，０００塩基対、約７５０塩基対、約５００塩基対、約２５０塩基対、もしくは約１００塩基対以内もしくはそれとオーバーラップする）部位特異的組込み部位の形成においてその座位にＲＴＳを挿入することができる。

一実施形態では、組込みプロトコールを実行して、複数の細胞のゲノムにランダムに発現カセットを組み込むことができる。例えば、一実施形態では、ランダム組込みプロトコールを実行することができ、検出可能なマーカーを持つ発現カセットを細胞に組み込むことができる。続いて、細胞を調べて、カセットの組込み部位を決定することができ、ＨＩ座位（例えば、一実施形態では、高い順位のＨＩ座位）において組込み部位を含む細胞を選択することができる。その選択された細胞を次に利用して、（例えば、配列番号１～１２５のいずれか１つの中もしくはそれとオーバーラップするまたは配列番号１～１２５のいずれか１つの５’末端もしくは３’末端のいずれかの約５，０００塩基対、約１，０００塩基対、約７５０塩基対、約５００塩基対、約２５０塩基対、もしくは約１００塩基対以内もしくはそれとオーバーラップする）ＨＩ座位におけるランディングパッドを確立することができる。

本明細書において言及される場合、「ランディングパッド」という用語は、宿主細胞に染色体組込みされたＲＴＳを含む核酸配列を指す。一部の実施形態では、ランディングパッドは、宿主細胞に染色体組込みされた２つまたはより多くのＲＴＳを含む。ランディングパッドは、１つまたはより多くの別個の染色体座位に組み込まれることができる。例えば、別個のランディングパッドは、１、２、３、４、５、６、７、または８個の別個の染色体座位に組み込まれることができ、別個の染色体座位のうちの１つまたはより多くはＨＩ座位であることができる。

本明細書において言及される場合、「部位特異的組込み部位」、「組換え標的部位」、「ＲＴＳ」、および「部位特異的リコンビナーゼ標的部位」という用語は交換可能に使用され、部位特異的リコンビナーゼにより認識され、かつ部位特異的組換え事象の間のクロスオーバー領域であり得る、短い、例えば、約６０塩基対未満の、核酸部位または配列を指す。一部の実施形態では、組換え標的部位は、約６０塩基対未満、約５５塩基対未満、約５０塩基対未満、約４５塩基対未満、約４０塩基対未満、約３５塩基対未満、または約３０塩基対未満であることができる。一部の実施形態では、組換え標的部位は、約３０～約６０塩基対、約３０～約５５塩基対、約３２～約５２塩基対、約３４～約４４塩基対、約３２塩基対、約３４塩基対、または約５２塩基対であることができる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位の例としては、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位、ｆｒｔ部位、ａｔｔ部位およびｄｉｆ部位が挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、組換え標的部位は、配列番号１２６～１５５に示されるものと実質的に同じ配列を有する核酸である。

一部の実施形態では、ＲＴＳは、表２から選択されるｌｏｘ部位である。本明細書において言及される場合、「ｌｏｘ部位」という用語は、Ｃｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒することができるヌクレオチド配列を指す。様々な非同一のｌｏｘ部位が当該技術分野において公知である。様々なｌｏｘ部位の配列は、それら全てが、組換えが起こる８塩基対の非対称コア領域に隣接する同一の１３塩基対逆位反復を含有するという点で類似している。部位の方向性および異なるｌｏｘ部位の中でのバリエーションの原因となるのは非対称コア領域である。これらの実例的（非限定的）な例としては、天然に存在するｌｏｘＰ（Ｐ１ゲノム中に見出される配列）、ｌｏｘＢ、ｌｏｘＬおよびｌｏｘＲ（これらはＥ．ｃｏｌｉ染色体中に見出される）の他に、いくつかの突然変異体またはバリアントｌｏｘ部位、例えば、ｌｏｘＰ ５１１、ｌｏｘΔ８６、ｌｏｘΔ １１７、ｌｏｘＣ ２、ｌｏｘＰ ２、ｌｏｘＰ ３およびｌｏｘＰ ２３が挙げられる。一部の実施形態では、ｌｏｘ組換え標的部位は、表２に見出される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸である。

本明細書において使用される場合、核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」または「同一性％」という用語は、指定された比較ウインドウにわたり配列がアライメントされた場合に同じである、比較された配列中の残基のパーセンテージを指す。比較ウインドウは、配列をアライメントおよび比較することができる少なくとも１０残基から１，０００残基を超えるセグメントであることができる。配列同一性の決定のためのアライメントの方法は当該技術分野において周知であり、ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）などの公的に利用可能なデータベースを使用して行うことができる。

一部の実施形態では、ＲＴＳは、ｌｏｘΔ８６、ｌｏｘΔ１１７、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＰ ２、ｌｏｘＰ ３およびｌｏｘＰ ２３から選択されるｌｏｘ部位である。

一部の実施形態では、ＲＴＳは、表３から選択されるＦｒｔ部位である。本明細書において言及される場合、「Ｆｒｔ部位」という用語は、酵母２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子の生成物、ＦＬＰリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒することができるヌクレオチド配列を指す。様々な非同一のＦｒｔ部位が当該技術分野において公知である。様々なＦｒｔ部位の配列は、それら全てが、組換えが起こる８塩基対の非対称コア領域に隣接する同一の１３塩基対逆位反復を含有するという点で類似している。部位の方向性および異なるＦｒｔ部位の中でのバリエーションの原因となるのは非対称コア領域である。これらの実例的（非限定的）な例としては、天然に存在するＦｒｔ（Ｆ）、およびいくつかの突然変異体またはバリアントＦｒｔ部位、例えば、Ｆｒｔ Ｆ１およびＦｒｔ Ｆ２が挙げられる。一部の実施形態では、Ｆｒｔ組換え標的部位は、表３に見出される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸である。

一部の実施形態では、ＲＴＳは、表４から選択されるｒｏｘ部位である。本明細書において言及される場合、「ｒｏｘ部位」という用語は、Ｄｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒することができるヌクレオチド配列を指す。様々な非同一のｒｏｘ部位が当該技術分野において公知である。これらの実例的（非限定的）な例としては、ｒｏｘＲおよびｒｏｘＦが挙げられる。一部の実施形態では、ｒｏｘ組換え標的部位は、表４に見出される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸である。

一部の実施形態では、ＲＴＳは、表５から選択されるａｔｔ部位である。本明細書において言及される場合、「ａｔｔ部位」という用語は、λインテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼが部位特異的組換えを触媒することができるヌクレオチド配列を指す。様々な非同一のａａｔ部位が当該技術分野において公知である。これらの実例的（非限定的）な例としては、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ｐｒｏＢ、ｔｒｐＣ、ｇａｌＴ、ｔｈｒＡ、およびｒｒｎＢが挙げられる。一部の実施形態では、ａｔｔ組換え標的部位は、表５に見出される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する核酸である。

一部の実施形態では、細胞は、複数（例えば、少なくとも４つ）のＲＴＳ、例えば、複数の別個のＲＴＳを含むことができ、ＲＴＳの任意の有用な組合せを使用することができる。本明細書において使用される場合、「別個の組換え標的部位」または「別個のＲＴＳ」という用語は、非同一のまたはヘテロ特異的な組換え標的部位を指す。例えば、いくつかのバリアントＦｒｔ部位が存在するが、組換えは、通常、２つの同一のＦｒｔ部位の間でのみ起こることができる。一部の実施形態では、別個の組換え標的部位は、同じ組換えシステムからの非同一の組換え標的部位（例えば、ＬｏｘＰおよびＬｏｘＲ）を指す。一部の実施形態では、別個の組換え標的部位は、異なる組換えシステムからの非同一の組換え標的部位（例えば、ＬｏｘＰおよびＦｒｔ）を指す。一部の実施形態では、別個の組換え標的部位は、同じ組換えシステムからの組換え標的部位および異なる組換えシステムからの組換え標的部位の組合せ（例えば、ＬｏｘＰ、ＬｏｘＲ、Ｆｒｔ、およびＦｒｔ１）を指す。例えば、一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、少なくとも２つの別個のＲＴＳであって、少なくとも１つのＲＴＳがＨＩ座位に染色体組込みされており、かつ少なくとも１つのＲＴＳが、Ｆｅｒ１Ｌ４（例えば、米国特許出願第１４／４０９，２８３号を参照）、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨＡ、またはＭＧＡＴ１から選択される染色体座位に染色体組込みされているものを含むことができる。

ＨＩ座位にＲＴＳを組み込んだ細胞は、組換えタンパク質産生細胞を製造するためにさらに加工することができる。ＲＴＳに加えて、組換えタンパク質産生主体は、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むことができる。リコンビナーゼとも称されるリコンビナーゼ酵素は、部位特異的組換えにおいて組換えを触媒する酵素である。一実施形態では、部位特異的組換えのために利用され得るようなリコンビナーゼは、非哺乳動物システムに由来することができる。例えば、リコンビナーゼは、細菌、バクテリオファージ、または酵母に由来することができる。

一部の実施形態では、リコンビナーゼをコードする核酸配列を宿主細胞に組み込むことができる。例えば、リコンビナーゼをコードする核酸配列を、分子生物学に公知の方法により宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、リコンビナーゼポリペプチド配列を細胞に直接的に送達することができる。

利用され得るようなリコンビナーゼ酵素の例としては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ＫＤリコンビナーゼ、Ｂ２Ｂ３リコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、γδリゾルバーゼ／インベルターゼ、ＰａｒＡリゾルバーゼ／インベルターゼ、Ｔｎ３リゾルバーゼ／インベルターゼ、Ｇｉｎリゾルバーゼ／インベルターゼ、φＣ３１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼまたは別の機能的なリコンビナーゼ酵素が挙げられるがそれに限定されない。

一実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼを利用することができる。ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製の間のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μプラスミドのコピー数の増幅に関与する部位特異的組換え反応を触媒する。ＦＬＰリコンビナーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種に由来することができ、一実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に由来することができる。一部の実施形態では、ＦＰＬリコンビナーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株に由来する。ＦＬＰリコンビナーゼは、熱安定性の突然変異体ＦＬＰリコンビナーゼ、例えば、ＦＬＰ１またはＦＬＰｅであることができる。一部の実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする核酸配列はヒト最適化コドンを含む。

Ｃｒｅリコンビナーゼは、リコンビナーゼのＩｎｔファミリーのメンバーであり（Ａｒｇｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ Ｊ．５：４３３）、細菌だけでなく真核細胞においてもｌｏｘ部位（ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｘ－ｉｎｇ ｏｖｅｒ）の効率的な組換えを行うことが示されている（Ｓａｕｅｒ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２０８７；ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６）。Ｃｒｅリコンビナーゼは、一実施形態では、バクテリオファージ、例えば、Ｐ１バクテリオファージに由来することができる。

一実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＩ座位内に染色体組込みされたＲＴＳを含むことができ、ＳＳＩ組込みプロトコールにしたがって目的の遺伝子をコードする交換可能なカセットを含むベクターを細胞にトランスフェクトすることができる。ＨＩ座位内に交換可能なカセットが組み込まれたら、染色体に組み込まれた交換可能なカセットを含む組換えタンパク質産生細胞を選択することができる。選択は、例えば、当業者に公知の方法を使用してマーカーの存在の検出を通じて行うことができ、またはマーカーの非存在の検出を通じて行うことができる。

ＳＳＩプロトコールは、１つまたはより多くの遺伝子を宿主細胞染色体に導入するために使用することができる。本明細書において使用される場合、「部位特異的組込み」は、特定の部位における染色体への核酸配列の組込みを指すことができ、「部位特異的組換え」を意味することもでき、これは、配列または標的部位のコグネイトペアにおいて組換えを行う特定の酵素による２つのＤＮＡパートナー分子の再構成を指す。部位特異的組換えは、相同組換えとは対照的に、パートナーＤＮＡ分子の間のＤＮＡ相同性を要求せず、ＲｅｃＡ非依存性であり、いかなるステージにおいてもＤＮＡ複製を伴わない。一部の実施形態では、部位特異的組換えは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞中での核酸の部位特異的組込みを達成するために部位特異的リコンビナーゼシステムを使用する。リコンビナーゼシステムは、典型的には、３つのエレメント：２つのマッチするＤＮＡ配列（組換え標的部位）および特定の酵素（リコンビナーゼ）からなる。リコンビナーゼは、マッチする組換え部位の間の組換え反応を触媒する。

２つのＲＴＳ配列に関する「マッチする」という用語は、リコンビナーゼにより結合され、２つの配列の間の部位特異的組換えに影響する能力を有する２つの配列を指す。一部の実施形態では、細胞のＲＴＳにマッチする交換可能なカセットのＲＴＳは、細胞のＲＴＳに実質的に同一の配列を有するカセットのＲＴＳを指す。一部の実施形態では、交換可能なカセットは、宿主細胞ゲノムに染色体組込みされたＲＴＳのうちの１または２つに実質的に同一の配列を含有する。

本明細書において使用される場合、「トランスフェクション」は、細胞への、ベクターを含む外因性核酸分子の導入を指す。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞の内側に外因性核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞において表現型の変化を誘導するものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができ、かつ／または染色体外で一時的にもしくは長期の期間にわたり細胞により維持されることができる。外因性核酸分子または断片を発現する宿主細胞または生物は、「組換え」、「形質転換」、または「トランスジェニック」生物と称される。

ベクター（発現ベクターとも称される）は、別のＤＮＡセグメントを取り付けて、細胞中での取り付けられたＤＮＡセグメントの複製および／または発現をもたらすことができる任意の好適なレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドであることができる。ベクターとしては、エピソーム（例えば、プラスミド）および非エピソームベクターを挙げることができる。例えば、一実施形態では、例えば非対称分割により、多数の細胞世代後に細胞の集団から除去／喪失されるエピソームベクターを利用することができる。ベクターはウイルスまたは非ウイルスベクターであることができ、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで核酸分子を細胞に導入することができる。合成ベクターもまた本明細書に包含される。ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、およびリポフェクションが挙げられるがそれに限定されない周知の方法により所望の宿主細胞に導入されてもよい。ベクターは、プロモーターを含む様々な調節エレメントを含むことができる。

本明細書において使用される場合、「交換可能なカセット」、「発現カセット」、および「カセット」という用語は交換可能に使用され、遺伝子を含有し、かつＲＴＳを含むことができる移動性の遺伝子エレメントを指す。一部の実施形態では、交換可能なカセットは、複数のＲＴＳおよび／または複数の遺伝子を含むことができる。例えば、交換可能なカセットは、レポーター遺伝子または選択遺伝子と組み合わせてＧＯＩを含むことができる。

ＧＯＩは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子、補助的遺伝子またはその組合せを含むことができるがそれに限定されない。

本明細書において使用される場合、「レポーター遺伝子」という用語は、その発現が細胞に容易に同定および測定され得る表現型を付与する遺伝子を指す。例えば、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質遺伝子または選択遺伝子を含むことができる。一実施形態では、選択遺伝子は、そうでなければ必須の栄養分となるであろうものを欠いた培地中で生存する能力を細胞に付与する生成物をコードすることができる。一部の実施形態では、選択遺伝子は、抗生物質または薬物に対する抵抗性を細胞に付与することができる。選択遺伝子は、宿主細胞に具体的な表現型を付与するために使用されてもよい。選択培地中で生存するために宿主細胞が選択遺伝子を発現する場合、該遺伝子は陽性選択遺伝子と言われる。具体的な遺伝子を含有する宿主細胞に反対して選択するための選択遺伝子を使用することもでき、この方式において使用される選択遺伝子は陰性選択遺伝子と称される。

本明細書において使用される場合、「治療目的の遺伝子」という用語は、任意の機能的に関連するヌクレオチド配列を指す。そのため、治療目的の遺伝子は、その発現が治療的な組換えタンパク質の調製に所望されるタンパク質をコードする任意の遺伝子を含むことができる。好適な治療目的の遺伝子の代表的（非限定的）な例としては、モノクローナル抗体、二重特異性モノクローナル抗体、および抗体薬物コンジュゲートが挙げられる（血液凝固因子、タンパク質発現が転写に限定されたよく発現されるｍＡｂ、ＥＰＯなどのホルモン、免疫融合タンパク質（Ｆｃ融合物）、三重特異性ｍＡｂなどを含む）。

本明細書において使用される場合、「補助的遺伝子」または「ヘルパー遺伝子」という用語は交換可能に使用され、第２の遺伝子の発現を補助する、または第２の遺伝子の生成物の安定化、フォールディング、もしくは翻訳後修飾を補助する、または第２の遺伝子の生成物の製造を促進する細胞環境を作製する第１の遺伝子を指す。一部の実施形態では、第２の遺伝子はＤｔＥタンパク質（またはその部分）をコードする。補助的遺伝子は、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）、転写因子、シャペロン、シャペロニン、シンセターゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、糖転移酵素、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、リパーゼ、またはアルキラーゼ（ａｌｋｙｌａｓｅ）をコードすることができる。

ＧＯＩは、よく発現される治療用タンパク質をコードする遺伝子を所望のコピー数において包含することができる。例えば、よく発現される治療用タンパク質をコードする遺伝子は、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー、または１０コピーのコピー数であることができる。

本明細書において使用される場合、「発現困難タンパク質」という用語は、製造が困難なタンパク質を指す。例えば、ＤｔＥタンパク質の製造は、タンパク質発現が高度に調節されなければならないため、タンパク質を宿主細胞から回収することが困難であるため、タンパク質がミスフォールディングしやすいため、タンパク質がクリッピングしやすいため、タンパク質が分解しやすいため、タンパク質が凝集しやすいため、タンパク質が可溶性に乏しいため、タンパク質が膜結合タンパク質であるため、タンパク質の精製が困難であるため、タンパク質が細胞傷害性であるため、タンパク質が複数のポリペプチド鎖、例えば、２、３もしくは４つのポリペプチド鎖を含むため、またはその任意の組合せのために、困難であり得る。例えば、ＤｔＥタンパク質は、ＤｔＥタンパク質を製造するためにホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーを形成する複数のポリペプチド鎖を含むことができる。そのような一実施形態では、ＤｔＥタンパク質の鎖は、組換え細胞の同じまたは異なるＲＴＳと関連付けられ得る１つまたはより多くの目的の遺伝子上にコードされることができる。ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーは、共有結合性相互作用、非共有結合性相互作用、またはその組合せを通じて形成され得る。ＤｔＥタンパク質はまた、ＤｔＥタンパク質を製造するために補助的遺伝子の発現が要求されるタンパク質、またはＤｔＥタンパク質を製造するために翻訳後修飾が要求されるタンパク質であることができる。

ＤｔＥタンパク質は、モノクローナル抗体、例えば、二重特異性モノクローナル抗体または三重特異性モノクローナル抗体であることができる。ＤｔＥタンパク質の他の例としては、免疫グロブリンのＦｃドメインが第２のペプチドに作動可能に連結した融合タンパク質であるＦｃ融合タンパク質が挙げられる。ＤｔＥタンパク質は、酵素、膜受容体、および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＡＧ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）であることができる。

一実施形態では、ＧＯＩは２つのＲＴＳの間に位置することができ、すなわち、ＲＴＳのうちの１つは遺伝子の５’に位置し、異なるＲＴＳは遺伝子の３’に位置することができる。一部の実施形態では、ＲＴＳは、それらの間に位置する遺伝子に直接的に隣接して位置する。一部の実施形態では、ＲＴＳは、それらの間に位置する遺伝子から定義された距離において位置する。一部の実施形態では、ＲＴＳは方向性の配列である。一部の実施形態では、それらの間に位置する遺伝子の５’および３’のＲＴＳは直接的に配向している（すなわち、それらは同じ方向に配向している）。一部の実施形態では、それらの間に位置する遺伝子の５’および３’のＲＴＳは逆に配向している（すなわち、それらは反対の方向に配向している）。

一部の実施形態では、細胞は１つまたはより多くの追加のＧＯＩを含むことができ、１つまたはより多くの追加のＧＯＩは染色体組込みされることができる。第２の目的の遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子（例えば、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子）、補助的遺伝子、またはその組合せであることができる。追加のＧＯＩは、第１のＧＯＩと同じＨＩ内、第２のＨＩ座位内、または別々の座位内に位置することができる。

第２のＧＩＯは、第１のＧＯＩを細胞にトランスフェクトするために使用されるものと同じまたは異なるベクターの使用を通じて細胞に組み込まれることができる。例えば、第１の目的の遺伝子をコードする第１の交換可能なカセットを含む第１のベクターおよび第２の目的の遺伝子をコードする第２の交換可能なカセットを含む第２のベクターを細胞にトランスフェクトすることができる。第１のカセットをＨＩ座位に組み込むことができ、かつ第２のカセットを同じＨＩ座位、第２のＨＩ座位、または別々の座位に組み込むことができる。例えば、第２のカセットをＦｅｒ１Ｌ４座位に組み込むことができる。所望の位置において染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセットおよび第２の交換可能なカセットの両方を含む組換えタンパク質産生細胞を次に選択することができる。

有益なことに、ｒＰ発現細胞の調製においてＨＩ座位中に位置するランディングパッドを使用するＳＳＩは、ｒＰ発現細胞のプールがその遺伝子構成において均質であることを確実にすることができる。追加的に、ｒＰ発現細胞を調製するためにＨＩ座位中に位置するランディングパッドを使用するＳＳＩは、ｒＰ発現細胞のプールがその効率において均質であることを確実にすることができる。例えば、産生細胞のプールは、第２のヘルパー遺伝子に対する第１のヘルパー遺伝子の比において均質であることができ、かつ／または産生細胞のプールは、治療目的の遺伝子に対するヘルパー遺伝子の比において均質であること。よって、ｒＰ発現細胞を調製するためにＨＩ中に位置するランディングパッドを使用するＳＳＩは、より一貫したｒＰ製造物品質を確実にすることができる。

原核および／または真核細胞系を含む、本明細書に記載の細胞系は、任意の好適なデバイス、設備および方法を使用して培養することができる。さらに、実施形態では、デバイス、設備および方法は、懸濁細胞または足場依存（接着）細胞を培養するために好適であり、薬学およびバイオ医薬製品、例えば、ポリペプチド製造物、核酸製造物（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、または哺乳動物もしくは微生物細胞および／もしくはウイルス、例えば、細胞および／もしくはウイルスならびにマイクロバイオータ療法において使用されるものの製造のために構成された製造処理のために好適である。

細胞は、製造物、例えば、組換え治療用または診断用製造物を発現または産生することができる。細胞により産生される製造物の例としては、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体模倣物（抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関しないポリペプチド分子、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、もしくはＩｇＮＡＲ）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療剤（例えば、抗がん性腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法およびウイルス免疫療法用のウイルスベクター）、細胞治療剤（例えば、多能性幹細胞、間葉幹細胞および成体幹細胞）、ワクチンもしくは脂質被包性粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）もしくはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質またはアミノ酸を挙げることができるがそれに限定されない。実施形態では、デバイス、設備および方法は、バイオシミラーを製造するために使用することができる。

開示される方法は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞もしくは下等真核細胞、例えば、酵母細胞もしくは糸状真菌細胞などの他に、原核細胞、例えば、グラム陽性もしくはグラム陰性細胞、ならびに／または真核もしくは原核細胞の生成物、例えば、大スケールの方式において真核細胞により合成される、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）の製造を可能とすることができる。一部の実施形態では、マイクロバイオータ治療において利用される微生物およびその胞子の使用もまた開示される。本明細書において他に記載されなければ、デバイス、設備、および方法は、ベンチスケール、パイロットスケール、および完全製造スケールのキャパシティが挙げられるがそれに限定されない任意の所望の容量または製造キャパシティを含むことができる。

さらに、本明細書において他に記載されなければ、デバイス、設備、および方法は、任意の好適なリアクターまたはバイオリアクターを含むことができ、これには、撹拌槽、エアリフト、繊維、マイクロファイバー、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴流床バイオリアクターが含まれるがそれに限定されない。本明細書において使用される場合、「リアクター」または「バイオリアクター」は、発酵槽もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「リアクター」という用語は「発酵槽」と交換可能に使用される。発酵槽または発酵という用語は、微生物および哺乳動物の両方の培養を指す。例えば、一部の態様では、例となるバイオリアクターユニットは、以下：栄養分および／もしくは炭素供給源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵もしくは細胞培養培地の入口および出口流れ、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（例えば、かき混ぜ）、ならびに／または洗浄／滅菌のうちの１つもしくはより多く、または全てを行うことができる。発酵ユニットなどの例となるリアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含有してもよく、例えば、ユニットは、各ユニット中に１～約１００もしくはより多くのバイオリアクター、例えば、各ユニット中に約１０～約９０、もしくは約２０～約８０のバイオリアクターを有することができ、かつ／または、設備は、設備内に単一もしくは複数のリアクターを有する複数のユニットを含有してもよい。バイオリアクターは、バッチ、セミフェドバッチ、フェドバッチ、灌流、および／または連続発酵プロセスのために好適なものであることができる。任意の好適なリアクター直径を使用することができる。例えば、バイオリアクターは約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの容量を有することができる。非限定的な例としては、約２５０ｍＬ～約１０Ｌ、約１０Ｌ～約５００Ｌ、約２０Ｌ～約２００Ｌ、約５００Ｌ～約５，０００Ｌ、または約５，０００Ｌ～約５０，０００Ｌの容量が一部の実施形態では挙げられる。追加的に、好適なリアクターは、複数回使用、単回使用、使い捨て、または非使い捨てのものであることができ、金属合金、例えば、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌもしくは任意の他の好適なステンレス鋼）およびＩｎｃｏｎｅｌ、プラスチック、ならびに／またはガラスを含む、任意の好適な材料から形成されたものであり得る。

実施形態では、本明細書において他に記載されなければ、本明細書に記載のデバイス、設備、および方法はまた、他に記載されていない任意の好適なユニット操作および／または機器、例えば、そのような製造物の分離、精製、および単離のための操作および／または機器を含むことができる。任意の好適な設備および環境を使用することができ、これは例えば、伝統的なスティックビルト設備、モジュール式、移動性かつ一時的な設備、または任意の他の好適な構築、設備、および／もしくはレイアウトである。例えば、一部の実施形態では、モジュール式のクリーンルームを使用することができる。追加的に、他に記載されなければ、本明細書に記載のデバイス、システム、および方法は、単一の位置もしくは設備において収容および／もしくは実行することができ、または代替的に別々のもしくは複数の位置および／もしくは設備において収容および／もしくは実行することができる。

非限定的な例として、非限定的に、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号、同２０１２／００７７４２９号、同２０１１／０２８０７９７号、同２００９／０３０５６２６号、ならびに米国特許第８，２９８，０５４号、同７，６２９，１６７号、および同５，６５６，４９１号（これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる）は、好適であり得る、例となる設備、機器、および／またはシステムを記載している。

組換え細胞は、以前に議論されたように哺乳動物細胞であることができ、１つの具体的な実施形態では、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、全てのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、全てのバリアントを含むＣＨＯグルタミンシンセターゼノックアウト細胞など）であることができるが、本開示はこれらの細胞に限定されない。ＨＩ座位中にＲＴＳを組み込み得るような細胞の他の例としては、接着および懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性またはハイブリドーマ細胞系を挙げることができる。真核細胞はまた、鳥細胞、細胞系または細胞株、例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、またはＥＢｖｌ３などであることができる。

一部の実施形態では、真核幹細胞を利用することができる。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）および間葉幹細胞（ＭＳＣ）であることができる。分化した形態の本明細書に記載の任意の細胞が本明細書に包含される。

真核細胞は、下等真核細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、およびＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓもしくはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属（例えば、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどであることができる。

真核細胞は、真菌細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｚｙａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａ）、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（例えば、Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（例えば、Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（例えば、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ（例えば、Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ（例えば、Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ（例えば、Ｍ．ｏｒｚｙａｅ）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、Ｎｅｃｔｒｉａ（例えば、Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ（例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ（例えば、Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、またはＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（例えば、Ｖ．ｄａｈｌｉａ））であることができる。

真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１－ＴＮ－５Ｂ１－４）、もしくはＢＴ１－Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えば、Ａｍｐｈｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ（シアノバクテリア）、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、もしくはＯｃｈｒｏｍｏｎａｓ属のもの）、または植物細胞（例えば、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、もしくはエノコログサ属植物）、もしくは双子葉植物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓもしくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からの細胞であることができる。

細胞は細菌または原核細胞であることができる。例えば、グラム陽性細胞、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを利用することができる。使用することができるＢａｃｉｌｌｕｓとしては、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｎａｔｔｏ、またはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを挙げることができる。実施形態では、細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ３ＮＡおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８である。Ｂａｃｉｌｌｕｓは、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５６、４８４ Ｗｅｓｔ １２ｔｈ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ ４３２１０－１２１４から入手可能である。

グラム陰性細胞、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、例えば、ＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１－ＢｌｕｅおよびＯｒｉｇａｍｉなどの他に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株に由来するもの、例えば、ＢＬ－２１またはＢＬ２１（ＤＥ３）などを利用することができ、これらの全ては商業的に入手可能である。好適な宿主細胞は、例えば、カルチャーコレクション、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から商業的に入手可能である。一部の実施形態では、細胞は、治療剤として利用される他のマイクロバイオータを含む。これらとしては、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｖｅｒｒｕｍｉｃｒｏｂｉａ、ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａおよびｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属するヒトマイクロバイオーム中に存在するマイクロバイオータが挙げられる。マイクロバイオータは、好気性、絶対嫌気性または通性嫌気性のものを含むことができ、かつ細胞または胞子を含むことができる。治療的なマイクロバイオータはまた、遺伝学的にマニピュレートされた生物およびそれらの改変において利用されるベクターを含むことができる。他のマイクロバイオーム関連の治療的な生物は、古細菌、真菌およびウイルスを含むことができる。例えば、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ ４８６，２０７－２１４（１４ Ｊｕｎｅ ２０１２）；Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，４８９（７４１５）：２５０－２５６（２０１２）；Ｌｌｏｙｄ－Ｐｒｉｃｅ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：５１（２０１６）を参照。

ｒＰ産生細胞を培養して、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸または他の有用な生化学的中間体もしくは代謝物を製造することができる。例えば、約４，０００ダルトンから約１４０，０００ダルトンより大きい分子量を有する分子を製造することができる。細胞により製造される分子は、広範な複雑性を有することができ、グリコシル化を含む翻訳後修飾を含むことができる。

製造され得るようなタンパク質としては、例えば、ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（またはボツリヌス神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ－１６、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン－２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ－ｎ３（注射）、インターフェロンアルファ－ｎｌ、ＤＬ－８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（ガンマ－１ａ）、インターフェロンガンマ、サイモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、Ｒｅｂｉｆ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗しょう症）、カルシトニン注射剤（骨疾患）、カルシトニン（経鼻、骨粗しょう症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト表皮増殖因子（外用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ、エプタコグアルファ（活性化型）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、Ａｌｐｈｎｍａｔｅ、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド持続放出デポー（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＫＰ－１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（成長阻害）、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ－３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（頬側、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ ｍＴｃ－アプシタイド注射、ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、グラチラマー酢酸塩、Ｇｅｐｏｎ、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ、インターフェロン－アルファ２、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、インターフェロンアルファコン－１、インターフェロンアルファ、Ａｖｏｎｅｘ組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ－１１１、Ｓｈａｎｖａｃ－Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（外用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ、ＰＥＧ－Ｉｎｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｏｍｉｎ、組換えチリダニアレルギー脱感作注射、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１－８４（ｓｃ、骨粗しょう症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ、Ｖｉｔｒａｓｅ、組換えインスリン、インターフェロン－アルファ（経口ロゼンジ）、ＧＥＭ－２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブ－ペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（ニードルフリー注射、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００）、ＶＧＶ－１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、Ａｕｒｏｇｒａｂ、酢酸ペキシガナン（ｐｅｘｉｇａｎａｎａｃｅｔａｔｅ）、ＡＤＩ－ＰＥＧ－２０、ＬＤＩ－２００、デガレリクス、シントレデキン・ベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ－１３７９、ＩＳＡｔｘ－２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗しょう症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ－１２３、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ（ａｍｅｄｉｐｌａｓｅ）、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ－９５０７、テデュグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ－４１２、成長ホルモン（持続放出注射）、組換えＧ－ＣＳＦ、インスリン（吸入、ＡＩＲ）、インスリン（吸入、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ－３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染症（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ－ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ－５３１、ＭＢＰ－８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン（ｏｐｅｂａｃａｎ）、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ－１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ、ルスプルチド（ｌｕｓｕｐｕｌｔｉｄｅ）、ＭＰ５２（ベータ－リン酸三カルシウムキャリア、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプリューセル－Ｔ、ＣＴＰ－３７、Ｉｎｓｅｇｉａ、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ（ａｌｆｉｍｅｐｒａｓｅ）、Ｐｕｒｉｃａｓｅ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ－１００８Ｍ、組換えＦＧＦ－Ｉ（注射剤、血管疾患）、ＢＤＭ－Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ－２１６、Ｐ－１１３、ＭＢＩ－５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ－０７、ＯＰＩ－４５、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ、Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ、ＡＢＴ－５１０、Ｂｏｗｍａｎ Ｂｉｒｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＸＭＰ－６２９、９９ ｍＴｃ－Ｈｙｎｉｃ－Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ－９９０８、テベレリクス（持続放出）、オザレリクス（ｏｚａｒｅｌｉｘ）、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ－５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ－３２１、Ｐｅｐｓｃａｎ、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ－０１５、ＩＬ－２１、ＡＴＮ－１６１、シレンギチド、Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ－２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ－３１４５、ＣＡＰ－２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１－ＤＭＩ、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ－２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ－ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ－Ｐ、ＢＬＰ－２５、ＣｅｒＶａｘ－１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入）、ｒＡＡＴ（皮膚科）、ＣＧＲＰ（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、サイモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ－２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ－１、ＡＣ－１００、サケカルシトニン（経口、エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、カルシトニン（経口、骨粗しょう症）、エキサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ－ＴＭ－６０１、ＫＫ－２２０、Ｔ－１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマタイド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（外用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第Ｖ１１１因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ－１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ－００２、膵島細胞新生療法、ｒＧＬＰ－１、ＢＩＭ－５１０７７、ＬＹ－５４８８０６、エキセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ－００１０、ＧＡ－ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＣＭ－９６０４、酢酸リナクロチド（ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄ ｅａｃｅｔａｔｅ）、ＣＥＴｉ－１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ（注射剤）、即効性インスリン（注射剤、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン（経口、エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｃｏｕｓ）注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入乾燥粉末、喘息）、Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ、ＲＧ－１０６８、ＭＭ－０９３、ＮＢＩ－６０２４、ＡＴ－００１、ＰＩ－０８２４、Ｏｒｇ－３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（外用）、ｒＥＶ－１３１（眼科）、ｒＥＶ－１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ－７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ－９９００７ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＴＹ－００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ－ｎ３（外用）、ＩＲＸ－３、ＲＤＰ－５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁塩刺激リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アルカリホスファターゼ（ａｌａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＥＰ－２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ－ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ－１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ－２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ－１、Ｘｅｎ－２１７４、ＣＪＣ－１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ－６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ－００２、ＢＧＣ－７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ－１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽菌ワクチン、Ｖａｃｃ－５ｑ、Ｖａｃｃ－４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔ Ｔｏｘｏｉｄ、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ－１３３４０、ＰＴＨ（１－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ－Ｃ、ＰＴＨアナログ（外用、乾癬）、ＭＢＲＩ－９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ－Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ－２１０、組換えｐｌａｇｕｅ ＦＩＶワクチン、ＡＧ－７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ－ｐ１／Ｄｅｒ－ｐ２／Ｄｅｒ－ｐ７アレルゲン標的化ワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、突然変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ－１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ－５、ＣＤＸ－１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ－９８０８、ＶＴ－１１１、イクロカプチド（ｉｃｒｏｃａｐｔｉｄｅ）、テルベルミン（ｔｅｌｂｅｒｍｉｎ）（皮膚科、糖尿病性足潰瘍）、ルピントリビル、レティクローゼ（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ－０１１、ＡＬＴＵ－１４０、ＣＧＸ－１１６０、アンギオテンシン治療ワクチン、Ｄ－４Ｆ、ＥＴＣ－６４２、ＡＰＰ－０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ－０７（経口、結核）、ＤＲＦ－７２９５、ＡＢＴ－８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗がん剤）、ＤＴ３ＳＳＩＬ－３、ＴＳＴ－１００８８、ＰＲＯ－１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニン－Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ－ｈＥＧＦ、ＡＥ－３７、トラスツズマブ－ＤＭ１（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ－ＤＭ１）、Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｇ、ＩＬ－１２（組換え）、ＰＭ－０２７３４、ＩＭＰ－３２１、ｒｈＩＧＦ

－ＢＰ３、ＢＬＸ－８８３、ＣＵＶ－１６４７（外用）、Ｌ－１９ベースの放射免疫療法剤（がん）、Ｒｅ－１８８－Ｐ－２０４５、ＡＭＧ－３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ－００１、ＡＶＥ－９６３３、ＡＣ－９３０１、ＮＹ－ＥＳＯ－１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原治療剤）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ－５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ－０６、ＡＰ－２１４、ＷＡＰ－８２９４Ａ（注射剤）、ＡＣＰ－ＨＩＰ、ＳＵＮ－１１０３１、ペプチドＹＹ［３－３６］（肥満症、鼻腔内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３－Ｆｃ、ＢＮ－００３、ＢＡ－０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１－３４（経鼻、骨粗しょう症）、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＴ－１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ－００３、ＰＴＨ（７－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科、ドライアイ）、ＣＡＢ－２、ＣＴＣＥ－０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ－Ｆｃ、ＣＮＴＯ－５２８、ＡＭＧ－１１４、ＪＲ－０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ－９５１、７１６１５５、ＳＵＮ－Ｅ７００１、ＴＨ－０３１８、ＢＡＹ－７３－７９７７、テベレリクス（即時放出）、ＥＰ－５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ－Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ－８８９、Ｏｒｇ－４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ－９９１、ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝臓選択性インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９－ＩＬ－２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ－１５０、ＡＬＴＵ－１３９、ＥＮ－１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少性障害）、ＡＬ－１０８、ＡＬ－２０８、神経増殖因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ－３１７、ＣＧＸ－１００７、ＩＮＮＯ－１０５、経口テリパラチド（エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、ＧＥＭ－ＯＳ１、ＡＣ－１６２３５２、ＰＲＸ－３０２、ＬＦｎ－ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ－１０４３、Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ小児ワクチン、マラリアワクチン、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ワクチン、新生Ｂ群ストレプトコッカスワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ－５９）、中耳炎療法、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１－３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ－１０１、ＰＧＮ－００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ－２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ－８０２４、ＧＩ－５００５、ＡＣＣ－００１、ＴＴＳ－ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（頬側制御放出）、オネルセプト、およびＴＰ－９２０１を挙げることができる。

製造され得るようなペプチドの他の例としては、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢＴＨＥＲＡ（商標））エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、またはバイオシミラーおよびバイオベターを含む任意の他の好適なポリペプチドが挙げられるがそれに限定されない。

他の好適なポリペプチドは、以下の表６およびＵＳ２０１６／００９７０７４に列記されるものである。本発明の開示は、本明細書に記載されるような製造物の組合せおよび／またはコンジュゲート［（すなわち、マルチタンパク質、（ＰＥＧ、毒素、他の活性の原料成分に共役した）修飾タンパク質を包含することを当業者は認め得る。

実施形態では、ポリペプチドは、表７に示されるようなホルモン、血液凝固／凝血因子、サイトカイン／増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン、またはペプチドであることができる。

実施形態では、タンパク質は、表８に示されるような多重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体である。

実施例１
直交的方法によりゲノムの多次元マップを生成し、次にその１つまたは複数のマップを使用して、予測される高い発現および安定性を伴う導入遺伝子の標的化された組込みのための候補ＨＩ座位のリストを生成するプロセスの実施例が記載される。多次元マップを使用して候補座位のリストを得るために用いられるフィルタリングプロセスまたはアルゴリズムを図１に要約し、以下に記載する。

最初に、マルチレベル遺伝学的およびエピジェネティックデータがその後に付加される参照ゲノムアセンブリーを構築した。

ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ １０Ｅ９チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に由来するＨｉ－Ｃデータ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１５：３１（６）１６４５－５６）を使用して、ショートリードＩｌｌｕｍｉｎａ配列から初期に構築されたＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（１０Ｅ９の祖先細胞系）シークエンシングスキャフォールドのデノボのアセンブリーの情報を与えた。近接性ベースのライゲーションの結果として、直鎖配列上で互いに近くに存在する領域、および／または同じ染色体内の領域の間でのコンタクトの密度の増加によりＨｉ－Ｃデータを特徴付ける。そのため、Ｈｉ－Ｃを使用して、断片化された参照アセンブリー内の以前に単離された配列スキャフォールドの間の接続を確認することができる。３つの生物学的複製物からの３億１千万を超える特有の、有効なＨｉ－Ｃリードペアアライメントを使用して、報告されたＬＡＣＨＥＳＩＳアルゴリズム（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，１１１９－１１２５（２０１３））を介してＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ配列スキャフォールドをクラスター化し、順序付けしかつ方向付けた。ＬＡＣＨＥＳＩＳアセンブリーは１１４６のインプット配列スキャフォールドを含み、元々のＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ配列の９０．５２％を含む。最終のアセンブリーは、インプット配列スキャフォールドを１３の高い信頼度の群にクラスター化し、長さプロファイルは１２Ｍｂ～４５５Ｍｂの範囲に及んだ。

ＬＡＣＨＥＳＩＳアセンブリーに対してアライメントされた１０Ｅ９細胞系からのＨｉ－Ｃデータは、より確立されたヒトおよびマウス参照アセンブリーと関連付けられるものと似たゲノムワイドコンタクトマップ（図２Ａ）を生成し、ヒト胚性幹細胞およびマウス胎仔肝細胞に由来する同等のＨｉ－Ｃデータセットと合致する有効なリードペアのシス／トランス比を有した（図２Ｂ）。

チャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞系に由来するペアードエンドＨｉ－Ｃ配列データおよびプロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃ（ＰＣＨｉ－Ｃ）配列データの３つの複製物（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１５：３１（６）１６４５－５６）をデフォルトのパラメーターの下でＨｉＣＵＰバージョン０．５．９．ｄｅｖ（Ｗｉｎｇｅｔｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５，４：１３１０））を通じて個々に処理した。目的の配列に対して特有にアライメントされた有効なリードペアのマッピングを、ＨｉＣＵＰパイプラインの部分としてＢｏｗｔｉｅバージョン１．１．０（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９；１０（３）：Ｒ２５）を使用して実行した。

Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１３（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１２１３－１２１８）に記載のプロトコールにしたがって生成され、チャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞系に由来するペアードエンドＡＴＡＣ－Ｓｅｑ配列データの３つの複製物を２つのレーンにわたりシークエンシングした。全ての結果としてもたらされたＦＡＳＴＱファイルをトリミングして、ペアードエンドモードにおいてシークエンシングアダプター配列を除去した後に、ペアードエンドモードおよび２，０００塩基対の最大断片長さにおいてＢｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ，Ｓａｌｚｂｅｒｇ Ｓ．Ｆａｓｔ ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｏｗｔｉｅ ２．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２，９：３５７－３５９）を使用して目的の配列へのマッピングを行った。同じ試料に対応するその後のＢＡＭファイルを特製のＰｅｒｌスクリプトを使用して次にマージし、２０未満のマッピングクオリティスコアを有するアライメントをＳａｍｔｏｏｌｓのビュー機能を使用して試料マージＢＡＭファイルから除去した（Ｌｉ Ｈ．，Ｈａｎｄｓａｋｅｒ Ｂ．，Ｗｙｓｏｋｅｒ Ａ．，Ｆｅｎｎｅｌｌ Ｔ．，Ｒｕａｎ Ｊ．，Ｈｏｍｅｒ Ｎ．，Ｍａｒｔｈ Ｇ．，Ａｂｅｃａｓｉｓ Ｇ．，Ｄｕｒｂｉｎ Ｒ．および１０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ（２００９）Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｍａｐ（ＳＡＭ）ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５，２０７８－９）。

懸濁適応性のＣＨＯ－Ｋ１細胞系に由来する報告されたヒストン修飾ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ配列データセット（Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１３（１０）：２２４１－５３（２０１６）－ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｄｅ ＰＲＪＥＢ９２９１）をダウンロードし、各ＦＡＳＴＱファイルをトリミングしてシングルエンドモードにおいてシークエンシングアダプター配列を除去した。トリミングされたＦＡＳＴＱファイルを次に、シングルエンドモードおよび１，０００塩基対の最大断片長さにおいてＢｏｗｔｉｅ２を使用して目的の配列に対してマッピングした。同じヒストン修飾の異なる時点に対応するＢＡＭファイルを特製のＰｅｒｌスクリプトを使用してマージし、もう一度、２０未満のマッピングクオリティスコアを有するアライメントをＳａｍｔｏｏｌｓのビュー機能を使用して試料マージＢＡＭファイルから除去した。

チャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞系に由来するペアードエンドトータルＲＮＡ－Ｓｅｑデータの３つの複製物からのＦＡＳＴＱファイル（Ｚｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．２０１５）をトリミングして、ペアードエンドモードにおいてシークエンシングアダプター配列を除去した。トリミングされたＦＡＳＴＱファイルを次に、デフォルトのパラメーターの下でペアードエンドモードにおいてＨｉＳａｔ２（Ｋｉｍ Ｄ，Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ．ＨＩＳＡＴ：ａ ｆａｓｔ ｓｐｌｉｃｅｄ ａｌｉｇｎｅｒ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２，１２：３５７－３６０）を使用して目的の配列にマッピングした。４０未満のマッピングクオリティスコアを有するアライメントを除去し、複製物データセットをＳｅｑｍｏｎｋ内でマージした。ライブラリーは非鎖特異的なペアードエンドであること、およびアノテーション付きエクソンとオーバーラップするリードのみを定量化すべきであることを指定して、ＳｅｑＭｏｎｋ（Ｂａｂｒａｈａｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ － ＳｅｑＭｏｎｋ Ｍａｐｐｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ、Ｓｉｍｏｎ Ａｎｄｒｅｗｓによる）内のＲＮＡ－Ｓｅｑ定量パイプラインを使用してＲＮＡ－Ｓｅｑ定量（ＲＰＫＭ値）を実行した。結果としてもたらされた定量を異なる転写物長さについて正規化し、ｌｏｇ変換した。負のｌｏｇ－ＲＰＫＭ値を有する遺伝子座には全て、下流の解析のために０の値を与えた。

Ｈｉ－Ｃ解析
３つの複製物からのフィルタリングおよびマッピングされたＨｉ－Ｃ ＢＡＭファイルを特製のＰｅｒｌスクリプトを使用してマージした。Ｈｉ－Ｃ要約ファイルを特製のＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用してマージされたＢＡＭファイルから作製した後に、ＨＯＭＥＲ（Ｈｅｉｎｚ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０１０ Ｍａｙ ２８；３８（４）：５７６－５８９．ＰＭＩＤ：２０５１３４３２）タグＨｉ－Ｃディレクトリを作製した。

５Ｋｂの解像度、２５Ｋｂの超解像度および１Ｍｂの最大相互作用距離カットオフを用いて上記のＨｉ－Ｃタグディレクトリを「ｆｉｎｄＨｉＣＤｏｍａｉｎｓ．ｐｌ」ＨＯＭＥＲスクリプトに供することによりトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）を同定した。アルゴリズム内で利用したＴＡＤ境界は、出力ファイル中で定義されるドメインの塩基対末端であった。

５０Ｋｂの解像度および１００Ｋｂの超解像度を用いて上記のＨｉ－ＣタグディレクトリをＨＯＭＥＲ「ｒｕｎＨｉＣｐｃａ．ｐｌ」スクリプトに供することにより、活性のゲノムコンパートメントの同定を媒介する主成分分析を実行した。シード領域として１５２の「活発に発現される」遺伝子座位（チャイニーズハムスター卵巣１０Ｅ９細胞系からの定常状態ＲＮＡ－Ｓｅｑデータの定量により決定される）の選択を使用して第１の２つの主成分を同定した。第１の主成分が異なる染色体アームの分離を表す場合、第２の主成分からのデータを使用した。全ての他の「染色体」について、第１の主成分からのデータを使用した。アルゴリズム内で利用した「活性」ドメインは、上記に議論した主成分分析データの融合をＨＯＭＥＲ「ｆｉｎｄＨｉＣＣｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．ｐｌ」スクリプトに供することにより同定した。

この解析後にアルゴリズムにインプットされたデータは、目的の配列内で同定されたＴＡＤ境界位置および目的の配列内で同定された活性のコンパートメントの座標を含んだ。

ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ解析
以下のパラメーター；－ｑ ０．０１ －－ｎｏｌａｍｂｄａ －－ｎｏｍｏｄｅｌ －－ｃａｌｌ－ｓｕｍｍｉｔｓを用いてＭＡＣＳ２「ｃａｌｌｐｅａｋ」機能を使用して目的の配列にマッピングされた３つ全ての複製物のＡＴＡＣ－Ｓｅｑフィルタリング、マージＢＡＭファイルにおいて接近可能なクロマチンにおけるピークを同定した。ＧｅｎｏｍｉｃＲａｎｇｅｓ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｍ，Ｈｕｂｅｒ Ｗ，Ｐａｇｅｓ Ｈ，Ａｂｏｙｏｕｎ Ｐ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｍ，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ Ｒ，Ｍｏｒｇａｎ Ｍ，Ｃａｒｅｙ Ｖ（２０１３）．“Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒａｎｇｅｓ．” ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９）を使用して定義される、３つ全ての複製物においてオーバーラップするピークのユニオンをアルゴリズム内でその後に使用した。

ＰＣＨｉ－Ｃ解析
デフォルトのパラメーターの下でＣＨｉＣＡＧＯバージョン１．１．３（Ｃａｉｒｎｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６．１７：１２７）を使用してプロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃデータセットから有意なプロモーター相互作用を同定した。プロモーターキャプチャーＲＮＡベイトライブラリーを目的の配列に対して設計し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を含有するベイト付きのプロモーターのリストを作製した。ＣＨｉＣＡＧＯを実行する前に、特製のＰｅｒｌスクリプトを使用して、アライメントされたＰＣＨｉ－Ｃ ＢＡＭファイルをフィルタリングして、ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を含有するこれらのベイト付きのプロモーターの１つともオーバーラップしないリードペアを除去した。ＣＨｉＣＡＧＯを次に、デフォルトのパラメーターを使用して個々の複製物、フィルタリングされたＢＡＭファイルに対して実行した。３つの複製物のうちの少なくとも２つにおいて統計的に有意として分類されたシス相互作用をさらなる使用のために抽出した。

ＣｈｒｏｍＨＭＭ分析
フィルタリングされた、マージされたＡＴＡＣ－Ｓｅｑおよび目的の配列に対してアライメントされた報告されたＣｈＩＰ－Ｓｅｑ ＢＡＭファイルを使用して、１７の状態のＣｈｒｏｍＨＭＭモデルの製造の情報を得た（Ｅｒｎｓｔ ａｎｄ Ｋｅｌｌｉｓ Ｍ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１２：２４７８－２４９２（２０１７）。状態２および３は潜在的な活性のエンハンサー領域であるという属性を与えられ、状態１１、１２、１４、１５および１６は、潜在的な抑圧的な特徴を有する領域として割り当てられた。

潜在的な活性のエンハンサーＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のリストを、アノテーション付きＴＳＳの２Ｋｂ以内にない少なくとも１つのＣｈｒｏｍＨＭＭ状態２または３の領域と最初にオーバーラップする制限断片として定義した。これらの候補制限断片をその後にフィルタリングして、「抑圧的」ＣｈｒｏｍＨＭＭ状態領域（１１、１２、１４、１５および１６）のいずれかならびに／またはＰＣＨｉ－Ｃ解析セクション内にリストされたＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を含有するベイト付きのプロモーターともオーバーラップするものを除去した。

アルゴリズムの目的のために、少なくとも２つのＰＣＨｉ－Ｃ複製物において統計的に有意として分類されたシスＰＣＨｉ－Ｃ相互作用のリストを潜在的な活性のエンハンサーＨｉｎｄＩＩＩ制限断片のリストに対してフィルタリングして、アルゴリズム内で利用されるシスの統計的に有意な相互作用の再現性のあるプロモーター：予測されるエンハンサーのセットを得た。

アルゴリズムのこのバージョンにより発見された、結果としてもたらされた潜在的なＨＩ座位を表１に記載する。包含されるＨＩ座位は、これらの部位＋／－特定の同定された部位のいずれかの側へ約５，０００塩基対を含んだ。最近接のＴＡＤ境界に対する近接性、再現性のある予測されたエンハンサーのシス相互作用の数、および「関連付けられる」遺伝子の定常状態ｍＲＮＡレベルに関する各部位についての順位付けの非重み付けの和の合計に基づいて予測される成績にしたがって表１における部位を順位付けしている。

候補ＨＩ座位が３Ｄゲノムマップ内でどこに位置するのかの例を候補ＨＩ座位配列番号３について図３Ａ、候補ＨＩ座位配列番号２について図３Ｂにおいて提供し、図３Ｃにおいて現行の産業上関連するＦｅｒＩＬ４ランディングパッドについてのものと比較している。特に注意すべきことは、１）ＴＡＤ境界、２）ＡＴＡＣ－Ｓｅｑにより決定されたオープンクロマチンにおけるマッピングされたピーク、３）領域にマッピングされたプロモーター捕捉Ｈｉ－Ｃ相互作用、および４）マッピングされたエピジェネティックマークと比較した空間的位置である。

実施例２
図１に概説し、実施例１に記載した手順を使用してＨＩ座位を同定する方法の能力を実証するために、上位に順位付けされた候補座位のうちの５つおよびより低く順位付けされた座位のうちの５つを経験的な評価のために選んだ。これは、同定された座位におけるゲノム組込みのために標的化されたレポーター遺伝子カセットの発現を測定することにより達成された。２つの対照；チャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞系（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１５：３１（６）１６４５－５６）のヘテロクロマチン領域および５’隣接配列、Ｆｅｒ１ｌ４ランディングパッドと共に標的座位を評価した。ヘテロクロマチン対照領域は、いかなる再現可能に有意なＰＣＨｉ－Ｃ相互作用に関与するＨｉｎｄＩＩＩ制限断片ともオーバーラップしない接近可能なクロマチンにおいてピークを表した。ピークはまた、不活性のゲノムコンパートメント内の「転写されない」Ｆｂｘｌ２遺伝子（Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＩＤ ＮＷ＿００３６１３９９７．１、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＪＨ０００４１８．１）の約１４ｋｂ上流に存在し、構成的なヘテロクロマチンヒストンマーク、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が存在する領域とオーバーラップする。これらの対照を含めることで、候補座位の査定のための直接的な参照点が提供された。

候補座位を試験するために、特別に設計された「シュードｇＲＮＡ」のための認識部位により隣接される、構成的なＣＭＶプロモーターの制御下のｅＧＦＰ発現カセットからなる、特別に設計されたＧＦＰドナー鋳型プラスミドを構築した（図４Ａ）。トランスフェクション後のインビボ切除を媒介するための特別に設計されたシュードｇＲＮＡ配列を使用する前提は、報告された一般的な遺伝子タグ付加技術（Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０２３７．）から採用した。レポーター遺伝子に加えて、ドナープラスミドは、共にＵ６プロモーターの制御下であり、かつ共にＲａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８（１１）：２２８１－２３０８）において指定されるｇＲＮＡスキャフォールド配列を含む、シュードｇＲＮＡおよび座位特異的ｇＲＮＡ配列（ＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットを目的の座位に標的化するため）の両方を含有した。さらには、座位特異的ｇＲＮＡカセット骨格は、再びＲａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）において概説されたクローニング戦略を使用する座位特異的ｃｒＲＮＡ配列の組込みを可能とするｇＲＮＡスキャフォールド配列の上流の２つのＢｂｓＩ制限部位からなるものであった。シュードｇＲＮＡは全ての実験において一定のままであった一方、座位特異的ｇＲＮＡは、ＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットの座位特異的標的化を可能とするために変動させた。

ドナーおよびＣａｓ９プラスミドの共トランスフェクション後に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットに隣接する認識部位へのシュードｇＲＮＡの結合により指令された際にドナープラスミドからＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットを切断する。カセットは次に、座位特異的ｇＲＮＡと組み合わせて働くＣａｓ９による標的ゲノムＤＮＡ切断後の細胞の内因性のＮＨＥＪ（非相同末端結合）機構により標的ゲノム座位において組み込まれるはずである。

各候補座位について、オフターゲットゲノム切断を媒介する傾向を考慮に入れた自社製ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ設計ツールを使用してｃｒＲＮＡ標的配列を同定した。関連する候補座位にわたり別個の領域にそれぞれ特異的な、上位３つに順位付けされたｃｒＲＮＡ標的配列を選んだ。これらの配列を次に、Ｕ６プロモーターの下流かつｇＲＮＡスキャフォールド配列の上流でＢｂｓＩ部位においてドナープラスミドに個々にクローニングして、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３において概説されるように標的座位についての最終の発現されるｇＲＮＡを作製した。各標的座位について、個々のｃｒＲＮＡ配列を含有する３つの別々のドナープラスミドを構築した。等モル比の３つの構築されたドナープラスミドを混合することにより各候補座位について無菌の５μｇのドナープラスミドライブラリーを作製した。これらのライブラリーを次に５μｇの無菌のＣａｓ９－Ｐｕｒｏプラスミド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｕ－００５１００－１２０）と共にチャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞にトランスフェクトして、トランスフェクションにおいて合計で１０μｇのプラスミドＤＮＡを得た。

１００μＬのＴＥ緩衝液中の１０μｇのプラスミドＤＮＡに対して０．７ｍＬのＣＤ－ＣＨＯ培地中の１×１０^７個の生存細胞の細胞対ＤＮＡトランスフェクション比を用いて、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステムを使用してエレクトロポレーションにより継代培養の２または３日目のチャイニーズハムスター卵巣ＳＳＩ １０Ｅ９細胞にドナーおよびＣａｓ９プラスミドをトランスフェクトした。３連のトランスフェクションキュベットを次に３０ｍＬの予め温めたＣＤ－ＣＨＯ培地にプールし、回復させた。解析の前に培養物を合計で１３日間回復させた。この時間の間に、培養培地を４日目に交換し、培養物を７日目および１０日目に１ｍＬ当たり１×１０^６個の生存細胞の細胞密度で継代培養した。

解析の日に各細胞プールから２０，０００個の細胞の二重の注入を、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ １２ＨＴ卓上フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーにより細胞当たりのＧＦＰ出力について解析した。（図４Ｂ）において、特定のゲノム座位を標的化する各トランスフェクションプール中のＧＦＰ＋細胞の平均パーセンテージを観察することができた。いかなる座位特異的ｇＲＮＡも欠いたドナープラスミドを、ドナープラスミドのランダムな、相同性非依存のゲノム組込みから達成されるＧＦＰ発現および／またはプール派生物後に残っている残余の一過性のプラスミドからの発現についての陰性対照（「プラスミド対照」）として含めた。（図４Ｃ）において、各プールについてのＧＦＰ＋細胞のメジアンＧＦＰシグナルを示す。座位のこの試料から、大スケールの、ランダムな、経験的なスクリーニングにより高性能ゲノム部位として以前に同定されたＦｅｒ１Ｌ４部位（（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１５：３１（６）１６４５－５６））と発現性能においておおよそ同等のＨＩ座位を同定できたことを観察することができる。

ＣＭＶ－ｅＧＦＰカセットのオンターゲット組込みが、上記で解析したプールにおいて起こったことを実証するために、製造者の説明書の下でＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して各細胞プールからゲノムＤＮＡを抽出した。ＧＦＰ発現カセットの標的化された組込みを、ＧＦＰ特異的プライマーならびに各候補組込み座位の上流および下流の配列に特異的なプライマーを使用してＰＣＲを介してアッセイした。座位配列番号４を別にして、全ての候補座位において標的化された組込みが確認された（図４Ｄ）。この研究におけるプライマーの組合せを使用して、Ｆｅｒｌ１４座位からのセンスアンプリコンは観察されなかった。

本発明に対するこれらおよび他の修飾およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲においてより具体的に示される本発明の精神および範囲から離れることなく、当業者により実施され得る。追加的に、様々な実施形態の態様は、全体的または部分的のいずれかで相互交換されてもよいことが理解されるべきである。さらには、以上の記載は例に過ぎず、そのような添付の特許請求の範囲において記載されるものよりも本発明を限定することは意図されないことを当業者は認める。

Claims (19)

1. 第１の高組込み性（ＨＩ）座位において染色体組込みされた第１の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、前記第１のＨＩ座位が、接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内かつトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）境界の３０，０００塩基対以内にあり、前記第１のＨＩ座位が、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用する細胞ゲノムの領域とオーバーラップする、細胞。
2. 前記第１のＨＩ座位が、配列番号１～１２５のうちの１つを含むか、または配列番号１～１２５のいずれか１つの５’末端もしくは３’末端のいずれかの５，０００塩基対以内にあるか、もしくはそれとオーバーラップする、請求項１に記載の細胞。
3. 請求項１または２に記載の細胞であって、ここで：
   前記第１のＨＩ座位が、活性のゲノムコンパートメント内の転写開始部位（ＴＳＳ）とオーバーラップする；あるいは、
   前記第１のＨＩ座位が遺伝子座とオーバーラップしない；あるいは、
   前記第１のＨＩ座位が、遺伝子座のインサイチューの内因性プロモーターとオーバーラップせず、たとえば前記第１のＨＩ座位が、前記プロモーターの１，０００塩基対以内にない、
   前記細胞。
4. 前記第１のＨＩ座位が、活性のゲノムコンパートメント内の転写開始部位（ＴＳＳ）とオーバーラップし、前記ＴＳＳが、活性の遺伝子に作動可能に連結しており、前記活性の遺伝子の発現または発現の欠如が、前記哺乳動物細胞に対して不可欠ではない、請求項３に記載の細胞。
5. 第２の別個のＲＴＳを含み、任意選択で追加の別個のＲＴＳを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞であって、ここで：
   前記第１のＲＴＳおよび前記第２の別個のＲＴＳが、前記第１のＨＩ座位内に染色体組込みされている；あるいは、
   前記第２の別個のＲＴＳが、第２のＨＩ座位内に染色体組込みされている；あるいは、
   前記第２の別個のＲＴＳが、別々の座位において染色体組込みされていて、たとえば前記別々の座位がＦｅｒ１Ｌ４座位であり、
   かつ、任意選択で、前記ＲＴＳのうちの少なくとも１つが、ｆｒｔ部位、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位、またはａｔｔ部位であり、たとえば前記ＲＴＳのうちの少なくとも１つが、配列番号１２６～１５５の中から選択される配列を含む、前記細胞。
6. 前記哺乳動物細胞が、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）もしくはそのバリアント、ＣＨＯグルタミンシンセターゼノックアウト細胞もしくはそのバリアント、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはその接着もしくは懸濁適応性のバリアント、ＨｅＬａ細胞、またはＨＴ１０８０細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞であって、第１の目的の遺伝子をさらに含み、前記第１の目的の遺伝子が染色体組込みされている
   、
   前記細胞。
8. 前記第１の目的の遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的の遺伝子、補助的遺伝子、またはその組合せを含み、たとえば前記目的の遺伝子が、発現困難タンパク質、たとえばＦｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、またはモノクローナル抗体からなる群から選択される発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む治療目的の遺伝子を含む、請求項７に記載の細胞。
9. さらに、前記第１の目的の遺伝子が、２つのＲＴＳの間に位置する、請求項７または８に記載の細胞。
10. 前記第１の目的の遺伝子が、前記第１のＨＩ座位内に位置する、請求項７または８に記載の細胞。
11. 第２の目的の遺伝子をさらに含み、任意選択でさらに第３の目的の遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞であって、ここで：
    前記第２の目的の遺伝子および前記第３の目的の遺伝子が、存在する場合は、染色体組込みされていて、かつ、前記第２の目的の遺伝子が、前記第１のＨＩ座位内に位置する；あるいは、
    前記第１の目的の遺伝子が、前記第１のＨＩ座位内に位置し、かつ前記第２の目的の遺伝子が、第２のＨＩ座位内または別々の座位内に位置する；あるいは、
    ａ．前記第１の目的の遺伝子、前記第２の目的の遺伝子、および前記第３の目的の遺伝子のうちの少なくとも１つが、前記第１のＨＩ座位内にあり、かつ
    ｂ．前記第１の目的の遺伝子、前記第２の目的の遺伝子、および前記第３の目的の遺伝子のうちの少なくとも１つが、第２のＨＩ座位内にある、
    前記細胞。
12. 部位特異的リコンビナーゼ遺伝子をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞であって、任意選択で、前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が染色体組込みされている、前記細胞。
13. 組換え細胞を製造する方法であって、
    ａ．細胞ゲノムの接近可能なクロマチンにおいてピークをマッピングすること、
    ｂ．前記マッピングされたピーク内で、前記接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内かつトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）境界の３０，０００塩基対以内にあるピークの第１のセットを同定すること、
    ｃ．ピークの前記第１のセット内で、第１の高組込み性（ＨＩ）座位を定義することであって、前記第１のＨＩ座位が、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用する前記ゲノムの領域とオーバーラップする、前記定義すること、および
    ｄ．第１の組換え標的部位（ＲＴＳ）を前記第１のＨＩ座位内に挿入すること
    を含む、方法。
14. 組換え細胞を製造する方法であって、
    ａ．細胞ゲノムの接近可能なクロマチンにおいてピークをマッピングすること、
    ｂ．前記マッピングされたピーク内で、前記接近可能なクロマチンの活性のゲノムコンパートメント内かつトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）境界の３０，０００塩基対以内にあるピークの第１のセットを同定すること、
    ｃ．前記接近可能なクロマチン内で、少なくとも１つのエンハンサーエレメントと相互作用する前記ゲノムの領域を同定すること、
    ｄ．ピークの前記第１のセット内で、複数の高組込み性（ＨＩ）座位を定義することであって、前記複数のＨＩ座位の各ＨＩ座位が、同定された領域とオーバーラップする、前記定義すること、
    ｅ．組換え標的部位（ＲＴＳ）を複数の細胞に組み込むこと、および
    ｆ．前記複数の細胞から、ＨＩ座位において組み込まれた前記ＲＴＳを含む細胞を選択すること
    を含む、方法。
15. 前記ＨＩ座位が、配列番号１～１２５のうちの１つを含むか、または配列番号１～１２５のいずれか１つの５’末端もしくは３’末端のいずれかの５，０００塩基対以内にあるか、もしくはそれとオーバーラップする、請求項１３または１４に記載の方法。
16. ピークの前記第１のセット内で、その発現生成物またはその欠如が不可欠でない遺伝子のための任意の転写開始部位（ＴＳＳ）とオーバーラップするピークを同定すること、および前記遺伝子とオーバーラップし、かつ前記ＴＳＳの下流にあるピークの第２のセットを定義することであって、前記ＨＩ座位が、ピークの前記第２のセット内に定義される、前記定義することをさらに含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ピークの前記第１のセット内で、いかなる遺伝子ともオーバーラップしないピークの第３のセットを同定することであって、前記ＨＩ座位が、ピークの前記第３のセット内に定義される、前記同定することをさらに含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 第１の目的の遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターを請求項１３に記載の細胞または請求項１４に記載の複数の細胞にトランスフェクトすること、および前記第１の交換可能なカセットを該細胞のＨＩ座位内に組み込むことをさらに含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法であって、
    染色体に組み込まれた前記第１の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質産生細胞を選択することをさらに含む、
    前記方法。
19. 前記ＨＩ座位を順位付けすることをさらに含む、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法であって、たとえば、前記ＨＩ座位が、各座位と関連付けられる１つまたはより多くの遺伝子の発現レベル、各座位から最近接のＴＡＤ境界までの距離、各座位における予測されるエンハンサー相互作用の数、および各座位と関連付けられる１つまたはより多くの遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルのうちの１つまたはより多くにしたがって順位付けされる、前記方法。