JP7534796B2

JP7534796B2 - 標的化ナノ粒子、及び真菌感染に関連するそれらの使用

Info

Publication number: JP7534796B2
Application number: JP2021562931A
Authority: JP
Inventors: サレシュアンバティ，; リチャードビー．ミーガー，; ザッカリールイス，; シャオロンリン，; ミシェルモマニー，
Original assignee: ユニバーシティーオブジョージアリサーチファウンデーション，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2024-08-15
Anticipated expiration: 2040-01-08
Also published as: WO2020146514A1; EP3908263A4; CN113573699A; JP2022518626A; EP3908263A1; US20220331349A1; CA3126039A1

Description

本出願は、２０１９年１月８日に出願された米国仮出願第６２／７８９，８６２号及び２０１９年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／９１３，４８９号の優先権を主張し、その両方はこの参照によってそれらの全体が本明細書に援用される。

数百種の固有の真菌は、いくつか挙げると、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症（渓谷熱）、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、皮膚糸状菌症、及びニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）を包含する様々な疾患を引き起こす。総体としては、病原性真菌は異なる器官に感染するが、皮膚及び肺が最も一般的な部位である。いくつかの真菌性疾患は日常生活に支障をきたすだけであるが、他のものは生命を脅かす。真菌感染の病理の理解における進歩にもかかわらず、真菌感染を診断及び治療するための現行の方法は不十分である。

真菌感染の診断、治療、または予防のための標的化ナノ粒子（例えばリポソーム）が、本明細書において提供される。いくつかのリポソームは、抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含む。本明細書において提供されるリポソームにおいて、標的化分子はリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、抗真菌剤はリポソーム中にカプセル化される。

複数のリポソームを真菌感染を有するかまたは真菌感染を発症するリスクがある対象へ投与することを含み、複数の各々のリポソームが抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、抗真菌剤がリポソーム中にカプセル化される、対象における真菌感染を治療または予防する方法がさらに提供される。

抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子が各々のリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、抗真菌剤が各々のリポソーム中にカプセル化される、複数のリポソームを作製する方法も提供される。方法は、（ａ）抗真菌剤を溶媒中で約６０℃で約１０分間～約３０分間溶解または懸濁すること、（ｂ）懸濁物中の複数のリポソームを、ステップａ）の抗真菌物質／溶媒溶液と、約６０℃で約３～約５時間または約３７℃で約２４～１２０時間混合することによって、各々のリポソームの中へ抗真菌剤をカプセル化すること、及び（ｃ）カプセル化された抗真菌剤を含むリポソームを、脂質へコンジュゲートされた標的化分子と、約６０℃で約４５分間～約９０分間接触させることによって、各々のリポソームの外側表面の中へ標的化分子を取り込むこと、を含む。

標的真菌抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、標的化分子が、標的化分子が標的真菌抗原に結合する場合にシグナルを生成する分子へ連結される、リポソームも提供される。いくつかの例において、標的化分子は、蛍光タンパク質の断片（複数可）のＣ末端及び／またはＮ末端へ連結される。

対象、または対象からのサンプルにおける真菌感染を検出するための方法であって、ａ）対象、または対象からのサンプルを複数のリポソームと接触させ、複数の各々のリポソームが標的真菌抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、標的化分子が、標的化分子が標的真菌抗原に結合する場合にシグナルを生成する分子へ連結されること；及びｂ）シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、を含む、前記方法がさらに提供される。

本出願は以下の図を含む。これらの図は、組成物及び方法のある特定の実施形態及び／または特色を例証すること、ならびに組成物及び方法の任意の記載（複数可）を補足することが意図される。書面による記載がかかるが事例であることを明示的に示さない限り、これらの図は組成物及び方法の範囲を限定するものではない。

例示的なコドン最適化可溶性マウスデクチン－１（ｓデクチン－１）をコードする核酸配列（配列番号：１）を示す。ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引く。ｐＥＴ－４５Ｂ＋のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）の中へのクローニングのための部位に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で示し、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基についてのコドン（ＡＡＧ）を太字で示し、リジンコドンはイタリック体である。マウスｓデクチン－１配列（ＣＬＥＣ７Ａ、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＳ３７６７０．１）をプレーンテキストで示し、ＡｌａコドンＧＣＴならびに終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称はＭｍｓＤｅｃｔｉｎ１ｌｙｓｈｉｓである。ヌクレオチド配列の長さは６０４の塩基対であり、５９７塩基対は１９９アミノ酸の長さのタンパク質をコードする。例示的なコドン最適化マウスｓデクチン－１をコードする核酸を、ｐＥＴ－４５Ｂ＋の中へクローン化した。配列番号：１によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。これは、マウスｓデクチン－１ポリペプチドを含むポリペプチドである。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸配列及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を太字で示し、リジンはイタリック体である。マウスｓデクチン－１アミノ酸残基をプレーンテキストで示し（配列番号：２のアミノ酸２３～１９９）、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。本明細書において開示されるポリペプチド配列の任意のものの中の終止コドンは、ポリペプチドが由来する天然ポリペプチドの一部分でないならば、任意選択で、１つまたは複数の終止コドンを含まないポリペプチドを産生するように除去され得ることは理解される。マウスｓデクチン－１ポリペプチドを含むタンパク質は、１９９アミノ酸の長さであり、２２，３８９．６６ｇ／モルの分子量（ＭＷ）である。理論上のｐＩは７．７４である。親和性タグ（例えば（Ｈｉｓ）６親和性タグ）を含む本明細書において記載される任意のタンパク質が、Ｈｉｓタグを除去するように修飾され得ることは理解される。いくつかの例において、本明細書において記載される任意のヌクレオチド配列は、翻訳後及び／または精製後に親和性タグを除去するためのプロテアーゼ切断部位をさらに含み得る。例示的なコドン最適化可溶性マウスデクチン－２（ｓデクチン－２）をコードする核酸配列（配列番号：３）を示す。ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引く。ｐＥＴ－４５Ｂ＋のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）の中へのクローニングのための部位に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で示し、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基についてのコドン（ＡＡＧ）を太字で示し、リジンコドンはイタリック体である。ＣＬＥＣ６Ａマウスデクチン２遺伝子からのコドン最適化ｓデクチン－２をプレーンテキスト示し、Ａｌａコドン（ＧＣＴ）及び終止コドン（ＴＡＡ及びＴＴＡ）に下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称はＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓである。核酸配列の長さは５７４の塩基対であり、５６７塩基対は１９０アミノ酸の長さのタンパク質をコードする。例示的なコドン最適化マウスｓデクチン－２をコードする核酸を、ｐＥＴ－４５Ｂ＋の中へクローン化した。配列番号：３によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。このポリペプチドは、マウスｓデクチン－２タンパク質を含む。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を太字で示し、リジンはイタリック体である。マウスｓデクチン－２アミノ酸残基をプレーンテキストで示し（配列番号：４のアミノ酸２３～１８９）、Ｃ末端のＡｌａ残基（Ａ）（太字）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。産生されるマウスｓデクチン－２を含むポリペプチドは、１８９アミノ酸を有し、２１，６９９．２５ｇ／モルのＭＷであり、６．３３の理論上のｐＩである。例示的なコドン最適化可溶性マウスデクチン－３（ｓデクチン－３）をコードする核酸配列（配列番号：５）を示す。ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引く。ｐＥＴ－４５Ｂ＋のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）の中へのクローニングのための部位に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で示す。反応性ｌｙｓ（Ｋ）コドン（ＡＡＧ）を太字で示し、リジンはイタリック体である。ＣＬＥＣ４Ｄマウスデクチン－３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３４９４９．３）からのコドン最適化ｓデクチン－３を、プレーンテキストで示し、Ａｌａコドン（ＧＣＴ）及び終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引く。終止コドンを太字で示す。代替の遺伝子名称はＭｍｓＤｅｃｔｉｎ３ｌｙｓｈｉｓである。ヌクレオチド配列の長さは６０４の塩基対であり、５９７塩基対は１９９アミノ酸の長さであるタンパク質をコードする。例示的なコドン最適化マウスｓデクチン－３をコードする核酸を、ｐＥＴ－４５Ｂ＋の中へクローン化した。配列番号：５によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。このポリペプチドは、マウスｓデクチン－３タンパク質を含む。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を太字で示し、リジンはイタリック体である。マウスｓデクチン－３アミノ酸残基をプレーンテキストで示し（配列番号：６のアミノ酸２３～１９９）、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。ポリペプチドは、１９９アミノ酸の長さであり、２３，０２３．７２ｇ／モルのＭＷであり、６．５２の理論上ｐＩである。例示的なコドン最適化可溶性ヒトデクチン－１（ｓデクチン－１）をコードする核酸配列（配列番号：７）を示す。ヒトｓデクチン－１ＤＮＡ配列を、ベクターｐＥＴ－４５Ｂ＋から発現させる。ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列及びＨｉｓタグの９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引く。クローニング部位のＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）（配列番号：２４）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。エンテロキナーゼプロセッシング部位についてのコドンは小文字フォントである。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基（ＡＡＡ及びＡＡＧ）についてのコドンを太字で示し、リジンコドンはイタリック体である。ヒトｓデクチン－１配列（ＣＬＥＣ７Ａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９７９４７）を、プレーンテキストで示し、発現のためにコドンを最適化した。ＡｌａコドンＧＣＴならびに終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。この配列についての代替の名称はＨｓｓＤｅｃｔｉｎ１ｌｙｓｈｉｓである。ヒトｓデクチン－１をコードするヌクレオチド配列は６４９塩基対の長さを有し、２１４アミノ酸の長さであるポリペプチドをコードする。例示的なコドン最適化ヒトｓデクチン－１をコードする核酸を、ｐＥＴ－４５Ｂ＋の中へクローン化した。配列番号：７によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。これは、ヒトｓデクチン－１タンパク質を含むポリペプチドである。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。エンテロキナーゼプロセッシング部位は小文字フォントである。ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を太字で示し、リジンはイタリック体である。ヒトｓデクチン－１アミノ酸残基をプレーンテキストで示し（配列番号：８のアミノ酸３５～２１４）、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。ポリペプチドは、２１４アミノ酸の長さであり、２３，７０３．２０ｇ／モルのＭＷであり、６．２２の理論上ｐＩである。例示的なコドン最適化可溶性ヒトデクチン－２（ｓデクチン－２）をコードする核酸配列（配列番号：９）を示す。ヒトｓデクチン－２ヌクレオチド配列を、ベクターｐＥＴ－４５Ｂ＋から発現させる。ヌクレオチド配列の長さは約５８０の塩基対であり、６１６塩基対は２０３アミノ酸の長さのタンパク質をコードする。Ｈｉｓタグを含む９つのコドンのベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列を四角で囲って、開始コドンに下線を引く。クローニング部位のＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）（配列番号：２４）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。エンテロキナーゼプロセッシング部位についてのコドンは小文字フォントである。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で示し、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基についてのコドン（ＡＡＧ）を太字で示し、リジンコドンはイタリック体である。ＣＬＥＣ６Ａヒトデクチン２遺伝子（ｃＤＮＡＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１３１７９９９）からのコドン最適化ｓデクチン－２を、プレーンテキストで示す。ＡｌａコドンＧＣＴならびに終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字で示す。代替の遺伝子名称はＨｓｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓである。例示的なコドン最適化ヒトｓデクチン－２をコードする核酸を、ｐＥＴ－４５Ｂ＋の中へクローン化した。配列番号：９によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。このポリペプチドは、ヒトｓデクチン－２タンパク質を含む。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。エンテロキナーゼプロセッシング部位は小文字フォントである。ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を太字で示し、リジンはイタリック体である。ヒトｓデクチン－２アミノ酸残基をプレーンテキストで示し（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００７０３４．１）（配列番号：１０のアミノ酸３６～２０３）、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。ポリペプチドは、２０３アミノ酸の長さであり、２２，９６９ｇ／モルのＭＷであり、５．９１の理論上ｐＩである。例示的なコドン最適化可溶性ヒトデクチン－３（ｓデクチン－３）をコードする核酸配列（配列番号：１１）を示す。ヒトｓデクチン－３ＤＮＡ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ中のベクターｐＥＴ－４５Ｂ＋から発現させる。ｈｉｓｔタグを備えた９つのコドンのベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列を四角で囲って、開始コドンに下線を引く。ｐＥＴ－４５Ｂ＋のＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）（配列番号：２４）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）の中へのクローニングのための部位に、それぞれ下線を引く。エンテロキナーゼプロセッシング部位についてのコドンは小文字フォントである。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で示し、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基についてのコドン（ＡＡＧ）を太字で示し、リジンコドンはイタリック体である。ＣＬＥＣ４Ｄヒトデクチン－３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿０８０３８７）からのコドン最適化ｓデクチン－３を、プレーンテキストで示す。ＡｌａコドンＧＣＴならびに終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称はＨｓｓＤｅｃｔｉｎ３ｌｙｓｈｉｓである。ヌクレオチド配列は６２８塩基対の長さを有し、２０７アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする。例示的なコドン最適化ヒトｓデクチン－３をコードする核酸を、ｐＥＴ－４５Ｂ＋の中へクローン化した。配列番号：１１によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。このポリペプチドは、ヒトｓデクチン－３タンパク質を含む。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。エンテロキナーゼプロセッシング部位は小文字フォントである。ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を太字で示し、リジンはイタリック体である。ヒトｓデクチン－３アミノ酸残基（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５２５１２６）をプレーンテキストで示し（配列番号：１２のアミノ酸３５～２０７）、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。タンパク質は、２０７アミノ酸の長さであり、２３，６６２ｇ／モルのＭＷであり、７．６４の理論上ｐＩである。ＶｅｎｕｓのＮ末端部分へ融合された、例示的なコドン最適化可溶性マウスデクチン－１（ｓデクチン－１）をコードする核酸配列（配列番号：１３）を示す。膜ドメインを含まない可溶性マウスデクチン－１アミノ酸配列が、別の種からの可溶性デクチン－１アミノ酸配列（例えば配列番号：８において記載されるヒトデクチン－１アミノ酸配列またはその断片）と交換可能であることが理解される。マウスまたは他の種からのデクチン－２及びデクチン－３のアミノ酸配列（またはその断片）も、本明細書において記載されるコンストラクトの任意のもの中で使用されて、真菌感染を検出することができる。ＭｍｓＤＥＣＴＩＮ１ＶｙＮは、ＢｉＦＣ診断薬の半分をコードする、ｐＥＴ－４５Ｂ＋中で発現されるコドン最適化ＤＮＡ配列である。長さ：１，１６８塩基対であり、１，１６１塩基対は３８５アミノ酸の長さであるタンパク質をコードする。ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引く。クローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。短いＧｌｙＳｅｒＧｌｙフレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で、続いて、ＶｅｎｕｓＶｙＮＴ１５４Ｍ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫＡ９５３３５から修飾された突然変異Ｖｅｎｕｓタンパク質のＮ末端の半分である）についての配列をコードするヌクレオチド配列（４６５塩基対）を小文字で、続いて、長いＧｌｙＳｅｒスペーサーを太字で反応性リジンをイタリック体で、続いて、５２８残基の長さのマウスｓデクチン－１配列（ＣＬＥＣ７Ａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ３７６７０．１）をプレーンテキストで示し、太字の終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡで終了する。配列番号：１３によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。このポリペプチドは、マウスＭｍｓＤｅｃｔｉｎ１ＶｙＮタンパク質を含む。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。第１のＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカーを太字で、続いて、Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質ＶｙＮのＣ末端部分（突然変異Ｔ１５４Ｍを備えたＶｅｎｕｓ残基１～１５５（配列番号：１４のアミノ酸１５～１６９）を表わす）を小文字で示す。これに、脂質担体へのカップリングのためのイタリック体の反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を含有する長いＧｌｙＳｅｒスペーサー配列、次いでプレーンテキストのマウスｓデクチン－１アミノ酸残基（配列番号：１４のアミノ酸２１１～３８７）が続く。ポリペプチドは、３８７アミノ酸の長さであり、４２，１８１．６２ｇ／モルのＭＷであり、６．５５の予測ｐＩである。ＶｅｎｕｓのＣ末端部分へ融合された、例示的なコドン最適化可溶性マウスデクチン－１（ｓデクチン－１）をコードする核酸配列（配列番号：１５）を示す。ＭｍｓＤＥＣＴＩＮ１ＶＣは、ＢｉＦＣ診断薬の半分をコードする、ｐＥＴ－４５Ｂ＋中で発現させることができるコドン最適化ＤＮＡ配列である。長さ：９５５であり、９４８は３１６アミノ酸の長さであるタンパク質をコードする。ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引く。開始及び終了のクローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンを太字で示す。次いで、Ｖｅｎｕｓの配列をコードするＣ末端アミノ酸（アミノ酸残基１５５～２３８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫＡ９５３３５から修飾され、Ｔ１５４Ｍ突然変異を含有するタンパク質）をコードする配列（２５２ヌクレオチド）を、小文字で示す。次いで、長いＧｌｙＳｅｒフレキシブルリンカーを太字で、脂質担体へのカップリングのためのイタリック体の反応性リジンと共に示す。これに、５２８残基の長さのマウスｓデクチン－１配列（ＣＬＥＣ７Ａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＡＡＳ３７６７０．１）（プレーンテキスト中で示される）が続き、太字の終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡで終了する。配列番号：１５によってコードされるアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。このポリペプチドは、マウスＭｍｓＤｅｃｔｉｎ１ＶＣタンパク質を含む。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲う。第１のＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー配列を太字フォントで示す。次いで、Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質のＣ末端半分（Ｖｅｎｕｓ残基１５５～２３８（配列番号：１６のアミノ酸１５～９８）（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＡＫＡ９５３３５）を表わす）を小文字で示す。次いで、イタリック体の反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基を含有する長いＧｌｙＳｅｒフレキシブルスペーサーを太字で示す。マウスｓデクチン－１アミノ酸残基をプレーンテキストで示し（アミノ酸１４０～３１６）、続いて、終止コドンを入れるのに使用されるＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）はインフレームである。ポリペプチドは、３１６アミノ酸の長さであり、３４，０８１．２１ｇ／モルのＭＷであり、６．８の予測ｐＩである。ｐＥＴ－４５Ｂ中で発現される、ＭｍＤＥＣ２ＶｙＮ（ＭｍＤＥＣ２ＶｙＮコドン最適化ＤＮＡ配列でもある）（配列番号：１７）。長さ：５７７ｂｐであり、ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引き、クローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンは太字であり、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基ＡＡＧはイタリック体の太字である。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化されたマウスデクチン２遺伝子ＣＬＥＣ６Ａからのｓデクチン－２配列はプレーンテキストであり、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、続いて、ＶｅｎｕｓＶｙＮＴ１５４Ｍについての配列（ＡＫＡ９５３３５から修飾された突然変異Ｖｅｎｕｓタンパク質のＮ末端半分）をコードする４６５ヌクレオチド長は小文字であり、Ａｌａ（Ａ）コドンＧＣＴならびに２つの終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称：ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓ、長さ：１０８４ｂｐであり、終結のためには７未満であり、切断部位に続いて、３５９残基のタンパク質をコードする。しかし、ｐＥＴ－４５ｂ＋の中へサブクローン化するために、ＫｐｎＩ部位（ＧＧＴＡＣＣ（配列番号：２３））で開始する、より短い１０５７ｂｐのバージョンをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取り寄せた。合成される最終的なＭｍｓＤＥＣ２ＶｙＮタンパク質（配列番号：１８）。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲い、ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基は太字であり、リジンはイタリック体である。１６６のマウスｓデクチン－２アミノ酸残基（配列番号：１８のアミノ酸２３～１８８）はプレーンテキストであり、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、Ｖｅｎｕｓの残基１～１５５は突然変異Ｔ１５４Ｍを備えており（配列番号：１８のアミノ酸２０４～３５９）、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。全部で３５９アミノ酸、ＭＷ４０，１９８ｇ／モル。ｐＩ６．０４。Ｏ．Ｄ．２８０１．９４０／ｍｇ／ｍＬ。ＭｍＤＥＣ２ＶＣ（ｐＥＴ－４５Ｂ中で発現される、ＭｍＤＥＣ２ＶＣコドン最適化ＤＮＡ配列でもある）（配列番号：１９）。長さ：５７７ｂｐであり、ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引き、クローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンは太字であり、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基ＡＡＧはイタリック体の太字である。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化されたマウスデクチン２遺伝子ＣＬＥＣ６Ａからのｓデクチン－２配列はプレーンテキストであり、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、次いでＶｅｎｕｓの配列をコードするＣ末端アミノ酸についての配列（アミノ酸残基１５５～２３８、ＡＫＡ９５３３５から修飾されたタンパク質）をコードする２５２ヌクレオチド長は小文字であり、Ａｌａ（Ａ）コドンＧＣＴならびに２つの終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称：ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓ。長さ：８７１ｂｐであり、終止コドンのためには７ｂｐ未満であり、切断部位に続いて、２８８残基のタンパク質をコードする。しかし、ｐＥＴ－４５ｂ＋の中へサブクローン化するために、ＫｐｎＩ部位（ＧＧＴＡＣＣ（配列番号：２３））で開始する、より短い８４４ｂｐのバージョンをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取り寄せた。合成される最終的なＭｍｓＤＥＣ２ＶＣ２タンパク質（配列番号：２０）。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲い、ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基は太字であり、リジンはイタリック体である。１６６のマウスｓデクチン－２アミノ酸残基（配列番号：２０のアミノ酸２３～１８８）はプレーンテキストであり、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、Ｖｅｎｕｓ残基１５５～２３８（配列番号：２０のアミノ酸２０４～２８８）があり、続いて、２つの終止コドン及びＰａｃＩ部位はインフレームである。全部で２８８アミノ酸、ＭＷ３２，０９８ｇ／モル。ｐＩ６．１６、Ｏ．Ｄ．２８０２．０２ＯＤ／ｍｇ／ｍＬ。細胞抽出物中の及び精製後の、可溶性デクチン－１（ｓデクチン－１）のＳＤＳＰＡＧＥ分析を示す。ｓデクチン－１タンパク質を、Ｌｕｒｉａブロス中で一晩増殖させたＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株においてＩＰＴＧ誘導無しでｐＥＴ－４５Ｂプラスミドから産生し、ＧｕＨＣｌバッファー中で可溶化し、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂によって精製し、ＳＤＳＰＡＧＥによって調査した。還元剤βメルカプトエタノール及びトリトン－Ｘ１００界面活性剤も含有するバッファーの中への抽出は、それら無しのバッファー（右側レーン）に比べて、不溶性封入体からの回収率を大幅に増加させた（中央レーン）。クマシーブルーにより染色した１２％のアクリルアミドゲル上でタンパク質を調査した。尿素バッファーによる細胞の抽出は、非常に少ないタンパク質をもたらした。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ（ｓデクチン－１、アンホテリシンＢ、及びローダミンをロードしたリポソーム）のモデルの概略図である。アンホテリシンＢ（ＡｍＢ、青色の卵形構造）を、１００ｎｍの直径のリポソームの脂質二重層の中へインターカレートした。ｓデクチン－１（ＤＥＣ、緑色の球状構造）を、脂質担体ＤＳＰＥ－ＰＥＧへカップルし、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＤＥＣ及び赤色蛍光ＤＨＰＥ－ローダミン（赤色の星）の両方とも、リポソーム膜の中へ挿入した。ｓデクチン－１、ローダミン、ＡｍＢ、及びリポソーム脂質は、それぞれ１：２：１３：１００のモル比である。２つのｓデクチン－１モノマー（２つのＤＳＥＰ－ＰＥＧ－ＤＥＣ分子）は、細胞壁β－グルカン（赤色の糖部分）に結合するために、膜中で一緒に浮遊しなくてはならない。調査した２つのリポソーム対照は、２２ｋＤａのｓデクチン－１の代わりに等ｕｇ量の６５ｋＤａのＢＳＡを含有するＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬ（すなわち０．３３のＢＳＡ：２：１３：１００のモル比）、及びタンパク質コーティングを欠如するＡｍＢｉｓｏｍｅ様リポソーム（ＡｍＢ－ＬＬ）（０：２：１３：１００のモル比）であった。これらのモル比、１００ｎｍの直径のリポソームの表面面積、及び脂質二重層の１０^６ｎｍ^２あたり５×１０^６脂質分子という出版された推定値から、各々のリポソーム中におよそ３，０００のローダミン分子及び各々のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ中に約１，５００のｓデクチン－１モノマーがあることが推定された。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、発芽しているＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの膨潤した分生子及び発芽管へ強く結合したが、ＡｍＢ－ＬＬは結合しなかったことを示す。Ａ．ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの膨潤した分生子（白色矢印）及び発芽体発芽管に結合した。Ｂ．ローダミン赤色蛍光ＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬは結合しなかった。赤色チャンネルがこの画像でのように強調された場合でさえ、リポソームは検出されなかった。最も小さな赤色ドットは、蛍光に基づいて観察される個別の１００ｎｍの直径のリポソームを表わす（橙色矢印）。リポソームの大きなクラスターは、より明るく赤色に染色された領域を形成する。Ｃ～Ｆ．Ｃ及びＤをＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した。Ｅ及びＦをＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した。Ａ及びＢ．細胞をＶＭＭ＋１％のグルコース中で３７℃で８時間増殖させた。標識をリポソーム希釈バッファーＬＤＢ中で６０分間遂行した。すべての３つのリポソーム調製物を、リポソームｓデクチン－１及びＢＳＡタンパク質が１ｕｇ／１００ｕＬの最終濃度であるように、１：１００に希釈した。発芽体を、細胞質ＥＧＦＰ発現について緑色チャンネル単独及びリポソームについて赤色チャンネルで観察した。Ａ及びＢを油浸下の６３×で撮影した。Ｃ～Ｆを倒立蛍光顕微鏡で２０×で撮影した。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、成熟したＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞の膨潤した分生子及び菌糸に結合したが、非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬは結合しなかったことを示す。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子を発芽させ、ＶＭＭ＋１％のグルコース中で３７℃で１６時間増殖させてから、蛍光リポソームにより染色した。Ａ～Ｄは、ｓデクチン－１が１ｕｇ／１００ｕＬであるように１：１００に希釈したローダミン赤色蛍光ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬにより、ならびにＥ及びＦは、同等量の赤色蛍光ＡｍＢ－ＬＬにより６０分間染色した。Ａ．ＤＩＣ画像単独。Ｂ．ＤＩＣ及び赤色蛍光画像の組み合わせ。Ａ及びＢは、ローダミン蛍光ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが膨潤した分生子（白色矢印）及び菌糸へ結合したことを示す。Ｃ～Ｆは、リポソームの赤色蛍光と共に細胞質の緑色ＥＧＦＰを調査した。最も小さな赤色ドットは、強い蛍光に起因する目視可能な個別の１００ｎｍの直径のリポソームを表わす（橙色矢印）。Ｃ及びＤは、ほぼすべての分生子及び大部分の菌糸がＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたことを示す。Ｅ及びＦは、ＡｍＢ－ＬＬが結合しなかったことを示す。Ａ及びＢを油浸下の６３×で撮影し、７つの積層画像をマージした。Ｃ～Ｆを倒立蛍光顕微鏡で２０×で撮影した。ｓデクチン－１コートリポソーム（ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ）が、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの細胞へ強く結合したことを示す。Ａ、Ｃ、及びＥは、ＬＤＢ中で１：１００に希釈したＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬにより標識したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株Ｓｃ５３１４及びＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ株Ｈ９９の明視野画像である。Ｂ、Ｄ、及びＦは明視野画像及び赤色蛍光画像の組み合わせであり、ローダミン標識ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬがこれらの細胞へ強く結合することを示す。プレーンの非コートＡｍＢ－ＬＬは、これらの細胞へ検出可能に結合しなかった。Ａ及びＢを油浸下の６３×で、Ｃ～Ｆを倒立蛍光顕微鏡の２０×で撮影した。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、対照ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ何桁も多く結合し、結合は可溶性β－グルカンによって阻害された。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、ＶＭＭ＋１％のグルコースで３７℃で３６時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定するかまたは生きたままで調査し、リポソーム希釈バッファー中のリポソームの１：１００の希釈物により１時間インキュベーションした。未結合のリポソームを洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を図４及び５中でのように２０×で撮影した。各々の写真視野は、およそ２５の膨潤した分生子及び菌糸の広範囲なネットワークを含有していた。Ａ、Ｂ、Ｃ．ホルマリン固定細胞の標識。Ｄ、Ｅ、Ｆ．生細胞の標識。Ｇ、Ｈ、Ｉ．１ｍｇ／ｍＬのラミナリン（可溶性β－グルカン）ｖｓ対照としての１ｍｇ／ｍＬのスクロースによる、固定細胞のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識の阻害。Ａ、Ｄ、及びＧ．赤色蛍光のリポソーム及びリポソームのクラスターの数をカウントし、１視野あたりで平均し、ｌｏｇ１０スケール上にプロットした。数の平均を各々の棒の上方の垂直軸上に示す。標準誤差を示す。棒グラフを構築するのに使用されたリポソームの例示的な視野を、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、及びＩ中で示す。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ５０の付近のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ＋１％のグルコース）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー、またはＡｍＢの示された濃度（Ａ～Ｄ３ｕＭのＡｍＢ、Ｅ０．０９ｕＭのＡｍＢ、Ｆ０．１８ｕＭのＡｍＢ）を増殖培地へ送達するリポソーム調製物により、同じ時間で処理した。生存率及び増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬（Ａ及びＣ）（全細胞エステラーゼ活性を測定する）を使用して、または菌糸の長さ（Ｂ及びＤ）もしくはパーセント発芽（Ｅ及びＦ）によって推定した。培地中にＣＴＢを有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからのバックグラウンドの蛍光を差し引いた。標準誤差を示す。Ｂ及びＤ中の挿入図写真は、ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬで処理したサンプルについてアッセイした菌糸の長さの例を示す。Ｂ及びＤ中の菌糸の長さの１単位は５ミクロンに等しい。Ａ及びＢならびにＣ及びＤは、２つの完全な生物学的反復実験からの結果を、異なるバッファー中で調製及び保存したリポソームと比較する。Ａ及びＢにおいて、リポソームを、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ（β－メルカプトエタノール））中で、及びＣ～Ｆは、ＲＮ＃５バッファー（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン（ｐＨ７．２）、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中で調製し、細胞を、５６時間（Ｃ、Ｄ）または３６時間（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）増殖させた。Ｇ．分生子のパーセント発芽に基づく用量－応答曲線。分生子、及び様々な濃度ＡｍＢを送達するリポソームを、ＶＭＭ＋グルコース中で、マイクロタイタープレートのウェルに一緒にプレーティングした。３７℃で８時間後に、発芽した分生子のパーセントを定量した。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢについてのＥＤ_５０の付近及びそれ未満のＡｍＢ濃度で、ＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞の増殖を有効に阻害したことを細胞質ＧＦＰ蛍光に基づいて示す。４，５００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子のサンプルを、Ｖｏｇｅｌ最少培地（ＶＭＭ）＋１％のグルコースで９６ウェルマイクロタイタープレート中で発芽及び増殖させ、リポソーム希釈バッファー対照、または２ｕＭのＡｍＢ（Ａ）及び０．６７のＡｍＢ（Ｂ）を送達するＡｍＢロードリポソーム調製物の希釈物により処理し、３７℃で３６時間インキュベーションした。細胞完全性を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＡ１１６３株中のＥＧＦＰレポーターからの細胞質緑色蛍光の量に基づいてアッセイした。培地を有するが細胞及びリポソームを欠くウェルからの蛍光バックグラウンドを差し引いた。リポソームを使用前にＲＮ＃５バッファー中で保存し、リポソーム希釈バッファーＬＤＢにより希釈した。ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、非コートＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬよりも、ＨＥＫ２９３細胞への毒性が低かったことを示す。ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞をリポソームにより２時間処理し、その後リポソームを洗浄した。次いで、細胞を追加の１６時間インキュベーションし、アッセイした。リポソームは、合計で３０または１５ｕＭのＡｍＢを培地へ送達した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅエステラーゼアッセイにより、細胞生存率及び生存を推定した。対象、または対象からのサンプルにおける真菌のβ－グルカン及びマンナン多糖類の検出のために固定化された例示的なデクチンコートリポソームの図解モデルを示す。ＤＥＣ－ＢｉＦＣ－Ｌは、緑色蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓＶｙＮ１５５のＮ末端半分へ融合した５００のｓデクチンモノマー（青色）（例えばＤＥＣ－ＶＮ－）及びＶｅｎｕｓＶＣ１５５のＣ末端半分へ融合した５００のｓデクチンモノマー（ＤＥＣ－ＶＣ－）によりコートされたリポソームであり、それらは真菌のβ－グルカンまたはマンナンを急速に認識及び結合して、ｓデクチンダイマーを形成し、アセンブルされたＶｅｎｕｓを導き、それは強い緑色二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルを生じるだろう。真菌細胞または放出されたβ－グルカンもしくはマンナンに接触する場合のみに、これらのリポソームは緑色蛍光シグナルを生じるだろう。これらのリポソームが例えばビオチン－ストレプトアビジン結合を経由して不溶性マトリックスへ付着されている場合に、標準的な蛍光装置類を使用して、大量の血清中の低濃度の真菌多糖類を検出することができる。真菌のβ－グルカン及びマンナンの検出のための、ＤＥＣ－ＨＲＰ－Ｌ（デクチンコートリポソーム）のモデルの概略図である。ｓデクチン（ＤＥＣ、緑色の球状構造）及びホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、六角形）を、脂質担体ＤＳＰＥ－ＰＥＧまたはＤＳＰＥへカップルし、リポソーム膜の中へ挿入した。ｓデクチン、ＨＲＰ、ＰＥＧ、及びリポソーム脂質は、それぞれ約１：１：１３：１００のモル比である。２つのｓデクチンモノマー（２つのＤＳＥＰ－ＰＥＧ－ＤＥＣ分子）は、細胞壁β－グルカンまたはマンナン（赤色の糖部分）に結合するために、膜中で一緒に浮遊しなくてはならない。これらのリポソームが真菌の固定サンプルへ結合した後に、過剰な未結合のリポソームを洗浄する。次いで、ＨＲＰ酵素活性のために基質（４－クロロ－１－ナフトール及びペルオキシド）を添加する。基質の添加後に、ＨＲＰ生成の紫色沈殿物を測定して、結合された全量のＤＥＣ－ＨＲＰ－Ｌ及び全量の真菌多糖類を決定する。修飾したマウスｓデクチン－２ＤＮＡＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓのＤＮＡ配列（配列番号：３）を示す。ＭｍｓＤＥＣＴＩＮ２ｌｙｓｈｉｓのコドン最適化ＤＮＡ配列を、ｐＥＴ－４５Ｂ中にクローン化した。ＮＣＢＩＢａｎｋｉＴ＃ＭＮ１０４６７９。長さ：５７７ｂｐであり、ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引き、クローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンは太字であり、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基ＡＡＧはイタリック体の太字である。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化されたマウスデクチン２遺伝子ＣＬＥＣ６Ａからのｓデクチン－２配列はプレーンテキストであり、Ａｌａ（Ａ）コドンＧＣＴならびにＰａｃＩ部位内の太字の２つの終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡで終了する。コーディング配列及び２つの終止コドンの長さ：５７４ｂｐであり、１８９残基のタンパク質をコードする。代替の遺伝子名称：ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓ。Ｅ．ｃｏｌｉ中で合成されるｓデクチン－２（ＤＥＣ２）タンパク質（配列番号：４）を示す。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸ペプチド配列及び（Ｈｉｓ）６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲い、ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基は太字であり、リジンはイタリック体である。１６６のマウスｓデクチン－２アミノ酸残基をプレーンテキストで示し、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了する。全部で１８９アミノ酸であり、ＭＷ２１，７６３．２９ｇ／モルであり、６．３３の理論上ｐＩである。ｓデクチン－２配列は、天然のマウスデクチン－２配列からのアミノ酸残基４４～２０９を表わす。代替のタンパク質名称：ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓタンパク質。精製したｓデクチン－２のＳＤＳＰＡＧＥ分析を示す。ｓデクチン－２を発現しない及び発現する粗製Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１抽出物ならびに精製したｓデクチン－２タンパク質を、クマシーブルーにより染色した１２％のゲル上のＳＤＳＰＡＧＥによって調査した。分子量マーカー、及び２２ｋＤａの修飾ｓデクチン－２のおよその分子量を、左側に示す。ローダミン及びアンホテリシンＢをロードした、ｓデクチン－２コートリポソームのモデルを示す。アンホテリシンＢ（ＡｍＢ、青色の卵形構造）を、１００ｎｍの直径のリポソームの脂質二重層の中へインターカレートした。ｓデクチン－２（ＤＥＣ２、緑色の球状構造）を、脂質担体ＤＳＰＥ－ＰＥＧへカップルし、ＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ及び赤色蛍光ＤＨＰＥ－ローダミン（赤色の星）の両方とも、それらの脂質部分（ＤＳＰＥ及びＤＨＰＥ）を経由してリポソーム膜の中へ挿入した。ｓデクチン－２、ローダミン、ＡｍＢ、及びリポソーム脂質は、１：２：１１：１００のモル比である。２つのｓデクチン－２モノマー（２つのＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ分子）は、真菌マンナン（赤色の糖部分）に結合するために、膜中で一緒に浮遊しなくてはならない。これらのモル比、１００ｎｍの直径のリポソームの表面面積、及び脂質二重層の１０^６ｎｍ^２あたり５×１０^６脂質分子という出版された推定値から、各々のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ中におよそ１，５００のｓデクチン－１モノマー、３，０００のローダミン分子、及び各々のリポソーム中に１６，５００のＡｍＢ分子があることが推定された。多様な形態のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合した、ｓデクチン－２コートリポソーム（ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ）を示す。Ａ．酵母細胞。細胞を、微分干渉顕微鏡（緑色、ＤＩＣ）、及び赤色のローダミンの蛍光標識ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによって強調表示する。Ｂ及びＣ．偽菌糸（Ｐｓ－Ｈｙｐ）及び菌糸（Ｈｙｐ）。細胞は内在性ＧＦＰ蛍光を介して強調表示される。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）へ結合した。Ｄ、Ｅ、Ｆ．成熟した菌糸。Ｄ．Ｅにおいて染色された細胞の菌糸を取り囲む細胞外マトリックスを示す明視野顕微鏡法。Ｅ．リポソームの明視野画像及び赤色蛍光の組み合わせ。Ｆ．Ｅにおけるものに匹敵するマトリックスの典型的な染色の反復の追加の画像。すべての細胞を、ＬＤＢ２バッファー中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色された（Ｅｘ－）、細胞外マトリックスを示す。矢印は個別のリポソームを示す。写真を油浸下の６３×拡大で撮った。複数の独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞に付随する細胞外マトリックスへ結合したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを示す。ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、両方の種の大きなクラスターで細胞外マトリックス（Ｅｘ）及びまれに細胞壁へ結合した。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。酵母細胞を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ、ならびに莢膜のグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）へのマウスモノクローナル抗体１８Ｂ７及び二次ヤギ抗マウス抗体Ａｌｅｘａ４８８（緑色）により共染色した。すべての細胞を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。Ａ．細胞の明視野画像。Ｂ．ＧＸＭ特異的抗体染色細胞の緑色蛍光画像。Ｃ．Ｂ及びＤのマージ蛍光画像。Ｄ．赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ。Ｅ、Ｆ、及びＧは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ｅ及びＦ．１０時間増殖させ、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色した発芽体の明視野画像及び蛍光画像の組み合わせ。Ｇ．２４時間増殖させた成熟した菌糸。両方の種を、ＬＤＢ２中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの１：２００の希釈物により１時間染色した（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより染色されたか（Ｅｘ＋）、または染色されなかったかもしくは弱くは染色されたか（Ｅｘ－）、あるいは１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった（Ｅｘ－／－）、細胞外マトリックスを示す。写真を、油浸下の６３×拡大（プレートＡ～Ｆ）または２０×（プレート２Ｇ）で撮った。３つの独立した真菌細胞の標識研究から類似する画像を得た。ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄ（ローダミン標識ＤＥＣ２）及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌糸細胞を取り囲む菌体外多糖マトリックスに類似するパターンで結合したことを示す。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子を、ＶＭＭ＋１％のグルコース＋０．５％のＢＳＡ中で顕微鏡チャンバースライド上で低密度で発芽させ、３７℃で２４時間増殖させ、細胞を固定してから、ローダミン標識ＤＥＣ２タンパク質（ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄ）またはＤＥＣ２コートリポソームにより１時間染色した。Ａ及びＢは、ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄである。Ｃ及びＤは、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬである。２０×撮影の微分干渉画像（ＤＩＣ、プレートＡ及びＣ）及びＤＩＣ及び赤色蛍光画像の組み合わせ（プレートＢ及びＤ）で、細胞を撮影した。細胞が非常に分散しており、１つのプレート中で複数の例示的な細胞を示したかったので、これらの画像は、分離した写真視野から採取し、互いに隣接させて置いた細胞画像から作製した複合物である（共通の視野へと移動した細胞の点線のアウトラインを参照）。画像は、調査した真菌細胞コロニーの９０％を表す。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ｓデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、対照ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞へ１～２桁多く効率的に結合したことを示す。固定真菌細胞の密集した視野を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームの１：２００の希釈物により１時間インキュベーションした（例えば０．５μｇのｓデクチン－２／１００μＬ）。未結合のリポソームを１時間後に洗浄した。赤色蛍光画像の複数の視野を２０×で撮影し、赤色蛍光の面積をＩｍａｇｅＪで推定した。写真画像の例を棒グラフの右側に示す。Ａ、Ｂ、及びＣは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓであり、Ｄ、Ｅ、及びＦは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである。Ｇ、Ｈ、及びＩは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓである。Ａ、Ｄ、及びＧ中で、平均からの標準誤差を提示し、差が何倍か及びｐ値を示して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬとＡｍＢ－ＬＬの結合を区別する。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の特異性、安定性、及び速度を示す。Ａ、Ｂ、及びＣ．結合の特異性。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、スクロースまたはラミナリンではなく可溶性酵母マンナンによって阻害された。各々の多糖類を１時間の染色手順の間に１０ｍｇ／ｍＬで添加した。Ｄ、Ｅ、及びＦ．結合の安定性。図３Ａ～Ｃ中のデータを生成するのに使用したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照リポソームにより染色したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞のプレートを、ＰＢＳ中に置き、暗所で２か月間保存し、再撮影し、リポソーム結合の面積を再定量した。Ｇ及びＨ．結合の速度。いくつかの偽菌糸及び菌糸から構成されるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成熟した培養物をＶＭＭ＋２０％のＦＢＳ中で２４ウェルマイクロタイタープレートの表面上で増殖させ、固定し、ブロックし、示された時間でＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理した。すべての３つの実験において、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬをＬＤＢ２で１：２００ｗ／ｖに希釈し（１００μＬ中で０．５μｇのｓデクチン－２）、ＬＤＢ２により４回洗浄した。複数の赤色蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡で各々の時間点について２０×の拡大で撮り、赤色蛍光リポソーム染色の平均面積を推定した。平均からの標準誤差を、Ａ、Ｄ、Ｇ、及びＨ中で示す。Ａ及びＤ中で、調査した数の平均及び視野の数を、各々の棒の上方の垂直軸上に示す。Ａ及びＤ中で、差が何倍か及びｐ値を、マンナン阻害（Ａ）またはＡｍＢ－ＬＬ（Ｄ）に比べた、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスについて示す。これらの結果は、２つの生物学的反復を表す。ｓデクチン－２をコートしたアンホテリシンＢロードリポソームによる、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの阻害及び殺傷を示す。Ａ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ。偽菌糸及び早期菌糸のステージにおける細胞を、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上でＲＰＭＩ培地＋０．５％のＢＳＡ中で増殖させた。細胞を、示されるように１．０、０．５、０．２５、及び０．１２μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより３０分間処理し、培地により２回洗浄し、追加の１６時間増殖させ、次いでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。Ｂ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞を、液体のＹＰＤ培地＋０．５％のＢＳＡ中で激しく振盪しながら２時間増殖させ、示されるように０．４、０．２、または０．１μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより４時間または一晩処理した。細胞を希釈し、ＹＰＤ培地上にプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を複数のプレートからカウントした。Ｃ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。分生子を、ＶＭＭ＋グルコース＋０．５％のＢＳＡで９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート中で９時間発芽させ、示されるように０．５及び０．２５μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより２時間処理し、培地により２回洗浄し、一晩増殖させ、次いでフェノールレッド指標を欠如するＲＰＭＩ＋０．５％のＢＳＡ中のＣＴＢ試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。対照ウェルは菌糸が過剰増殖して培地から突出し、したがって、これらのウェル中でより多くの細胞があったとしても、低い代謝活性を有し低いシグナルを生成した。Ｄ．ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。アッセイ条件は、増殖培地での希釈の前にＬＤＢ１バッファー（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋１ｍＭのＢＭＥ）の中でリポソームを最初に希釈した以外は、Ｃにおけるアッセイに類似していた。Ａ、Ｃ、及びＤ中のＣＴＢアッセイについては、ＣＴＢ試薬によりインキュベーションされた培地からの蛍光バックグラウンドを差し引いた。標準誤差をすべての値について示し、差が何倍か及びｐ値を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬへＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスを比較して推定した。２つ以上の生物学的反復は類似する結果をもたらした。ｓデクチン－２をコートしたアンホテリシンＢロードリポソームによる、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの阻害及び殺傷を示す。Ａ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ。偽菌糸及び早期菌糸のステージにおける細胞を、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上でＲＰＭＩ培地＋０．５％のＢＳＡ中で増殖させた。細胞を、示されるように１．０、０．５、０．２５、及び０．１２μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより３０分間処理し、培地により２回洗浄し、追加の１６時間増殖させ、次いでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。Ｂ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞を、液体のＹＰＤ培地＋０．５％のＢＳＡ中で激しく振盪しながら２時間増殖させ、示されるように０．４、０．２、または０．１μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより４時間または一晩処理した。細胞を希釈し、ＹＰＤ培地上にプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を複数のプレートからカウントした。Ｃ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。分生子を、ＶＭＭ＋グルコース＋０．５％のＢＳＡで９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート中で９時間発芽させ、示されるように０．５及び０．２５μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより２時間処理し、培地により２回洗浄し、一晩増殖させ、次いでフェノールレッド指標を欠如するＲＰＭＩ＋０．５％のＢＳＡ中のＣＴＢ試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。対照ウェルは菌糸が過剰増殖して培地から突出し、したがって、これらのウェル中でより多くの細胞があったとしても、低い代謝活性を有し低いシグナルを生成した。Ｄ．ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。アッセイ条件は、増殖培地での希釈の前にＬＤＢ１バッファー（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋１ｍＭのＢＭＥ）の中でリポソームを最初に希釈した以外は、Ｃにおけるアッセイに類似していた。Ａ、Ｃ、及びＤ中のＣＴＢアッセイについては、ＣＴＢ試薬によりインキュベーションされた培地からの蛍光バックグラウンドを差し引いた。標準誤差をすべての値について示し、差が何倍か及びｐ値を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬへＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスを比較して推定した。２つ以上の生物学的反復は類似する結果をもたらした。ｓデクチン－２をコートしたアンホテリシンＢロードリポソームによる、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの阻害及び殺傷を示す。Ａ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ。偽菌糸及び早期菌糸のステージにおける細胞を、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上でＲＰＭＩ培地＋０．５％のＢＳＡ中で増殖させた。細胞を、示されるように１．０、０．５、０．２５、及び０．１２μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより３０分間処理し、培地により２回洗浄し、追加の１６時間増殖させ、次いでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。Ｂ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞を、液体のＹＰＤ培地＋０．５％のＢＳＡ中で激しく振盪しながら２時間増殖させ、示されるように０．４、０．２、または０．１μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより４時間または一晩処理した。細胞を希釈し、ＹＰＤ培地上にプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を複数のプレートからカウントした。Ｃ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。分生子を、ＶＭＭ＋グルコース＋０．５％のＢＳＡで９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート中で９時間発芽させ、示されるように０．５及び０．２５μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより２時間処理し、培地により２回洗浄し、一晩増殖させ、次いでフェノールレッド指標を欠如するＲＰＭＩ＋０．５％のＢＳＡ中のＣＴＢ試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。対照ウェルは菌糸が過剰増殖して培地から突出し、したがって、これらのウェル中でより多くの細胞があったとしても、低い代謝活性を有し低いシグナルを生成した。Ｄ．ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。アッセイ条件は、増殖培地での希釈の前にＬＤＢ１バッファー（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋１ｍＭのＢＭＥ）の中でリポソームを最初に希釈した以外は、Ｃにおけるアッセイに類似していた。Ａ、Ｃ、及びＤ中のＣＴＢアッセイについては、ＣＴＢ試薬によりインキュベーションされた培地からの蛍光バックグラウンドを差し引いた。標準誤差をすべての値について示し、差が何倍か及びｐ値を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬへＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスを比較して推定した。２つ以上の生物学的反復は類似する結果をもたらした。ｓデクチン－２をコートしたアンホテリシンＢロードリポソームによる、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの阻害及び殺傷を示す。Ａ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ。偽菌糸及び早期菌糸のステージにおける細胞を、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上でＲＰＭＩ培地＋０．５％のＢＳＡ中で増殖させた。細胞を、示されるように１．０、０．５、０．２５、及び０．１２μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより３０分間処理し、培地により２回洗浄し、追加の１６時間増殖させ、次いでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。Ｂ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞を、液体のＹＰＤ培地＋０．５％のＢＳＡ中で激しく振盪しながら２時間増殖させ、示されるように０．４、０．２、または０．１μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより４時間または一晩処理した。細胞を希釈し、ＹＰＤ培地上にプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を複数のプレートからカウントした。Ｃ．ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。分生子を、ＶＭＭ＋グルコース＋０．５％のＢＳＡで９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート中で９時間発芽させ、示されるように０．５及び０．２５μＭのＡｍＢを培地へ送達するリポソームにより２時間処理し、培地により２回洗浄し、一晩増殖させ、次いでフェノールレッド指標を欠如するＲＰＭＩ＋０．５％のＢＳＡ中のＣＴＢ試薬を使用して、代謝活性についてアッセイした。対照ウェルは菌糸が過剰増殖して培地から突出し、したがって、これらのウェル中でより多くの細胞があったとしても、低い代謝活性を有し低いシグナルを生成した。Ｄ．ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬによるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ。アッセイ条件は、増殖培地での希釈の前にＬＤＢ１バッファー（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋１ｍＭのＢＭＥ）の中でリポソームを最初に希釈した以外は、Ｃにおけるアッセイに類似していた。Ａ、Ｃ、及びＤ中のＣＴＢアッセイについては、ＣＴＢ試薬によりインキュベーションされた培地からの蛍光バックグラウンドを差し引いた。標準誤差をすべての値について示し、差が何倍か及びｐ値を、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬへＡｍＢ－ＬＬのパフォーマンスを比較して推定した。２つ以上の生物学的反復は類似する結果をもたらした。デクチン－２標的化抗真菌物質ロードリポソームの有効性の調査のための、肺アスペルギルス症の２つの免疫抑制モデル及び時系列を示す。Ａ．ステロイドモデル。Ｂ．白血球減少モデル。デクチン標的化抗真菌薬ロードリポソームを示す。例えばデクチン－１またはデクチン－２の炭水化物認識ドメインによりコートされた、抗真菌薬ロードリポソームは、侵襲性真菌細胞及びバイオフィルムへ特異的に結合し、抗真菌薬を真菌細胞へ能動的に送達する。標的化リポソームは、非標的化薬物ロードリポソーム（例えばＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標））または界面活性剤により可溶化した抗真菌薬（左側）よりも、真菌細胞へ何桁も効率的に結合する（右側）。したがって、標的化リポソームは、動物細胞についてより低い相対的親和性を有し、非標的化リポソームに比べてより低い全薬物濃度で、はるかに高い用量の抗真菌薬を真菌細胞へ送達する。真菌細胞を殺傷するのに要求される有効用量を低減させることによって、動物細胞への毒性は低くなる。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株ＣＥＡ１０からの分生子は急速に発芽して、ＣＤ１マウスの肺中で感染中心の確立することを示す。Ｄ０（図２１）に、ＣＤ１Ｓｗｉｓｓに２×１０^６のＣＥＡ１０分生子を咽頭に接種した。Ｄ２（感染の４８時間後）に、マウスを安楽死させ、感染した肺の様々な肺葉の手動で調製した薄切片（例えば約０．５ｍｍ厚）を、ホルマリン中で固定し、真菌キチンについてカルコフロールホワイトにより１時間染色した。落射蛍光写真画像を、ＬｅｉｃａＤＭ６０００複合顕微鏡でＤＡＰＩフィルターセット励起_Ａ３６０／発光_Ａ４７０を使用して撮った。Ａ．大部分の切片は、何百もの染色された菌糸を備えた１つの大きい感染中心を示した。写真を５×拡大で撮った。Ｂ．感染中心は菌糸伸長のクラスターから構成されていた。発芽していない分生子は観察されなかった。写真を２０×拡大で撮った。免疫抑制媒介性アスペルギルス症のステロイドマウスモデルに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、肺における真菌量の低減で有意に有効であったことを示す。免疫抑制されたＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウス（ステロイドモデル図２１Ａ）に、２×１０^６のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子ＣＥＡ１０株を感染させ（０日目）、翌日（１日目）に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームにより処理したか、またはリポソームを希釈するのに使用したバッファー（バッファー対照）により処理した（図２１Ａ中の時系列を参照）。４日目まで生存した各々の処理群からの３匹のマウスを安楽死させ、１つの肺あたりの真菌量を２つの独立した方法によって決定した。Ａ～Ｃ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）。Ａ．３つの処理群について、１つの肺あたりのＣＦＵの平均数を比較する棒グラフ。Ｂ及びＣは、それぞれＡｍＢ－ＬＬ処理群及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理群について調査した細胞の視野の２０×拡大で撮った例示的な写真画像である。ホモジナイズした肺組織を栄養豊富な増殖培地上にプレーティングし、プレートを一晩インキュベーションし、真菌細胞の数をマイクロコロニーをカウントすることによって、ＣＦＵを推定した。標準誤差を線及びひげにより示す。Ｄ．ｒＤＮＡの相対量。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の相対量（ＲＱ）を、図２４Ａ中でアッセイした３つの肺の同じ３セットからの肺ホモジネートの並列のサンプルでｑＰＣＲによって決定した。データを、最も高いレベルの１匹のバッファー対照マウスにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡのレベルへ正規化した（すなわちこのマウスのＲＱを１．０へ設定する）。免疫抑制媒介性アスペルギルス症のステロイドマウスモデルに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、肺における真菌量の低減で有意に有効であったことを示す。免疫抑制されたＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウス（ステロイドモデル図２１Ａ）に、２×１０^６のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子ＣＥＡ１０株を感染させ（０日目）、翌日（１日目）に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームにより処理したか、またはリポソームを希釈するのに使用したバッファー（バッファー対照）により処理した（図２１Ａ中の時系列を参照）。４日目まで生存した各々の処理群からの３匹のマウスを安楽死させ、１つの肺あたりの真菌量を２つの独立した方法によって決定した。Ａ～Ｃ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）。Ａ．３つの処理群について、１つの肺あたりのＣＦＵの平均数を比較する棒グラフ。Ｂ及びＣは、それぞれＡｍＢ－ＬＬ処理群及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理群について調査した細胞の視野の２０×拡大で撮った例示的な写真画像である。ホモジナイズした肺組織を栄養豊富な増殖培地上にプレーティングし、プレートを一晩インキュベーションし、真菌細胞の数をマイクロコロニーをカウントすることによって、ＣＦＵを推定した。標準誤差を線及びひげにより示す。Ｄ．ｒＤＮＡの相対量。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の相対量（ＲＱ）を、図２４Ａ中でアッセイした３つの肺の同じ３セットからの肺ホモジネートの並列のサンプルでｑＰＣＲによって決定した。データを、最も高いレベルの１匹のバッファー対照マウスにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡのレベルへ正規化した（すなわちこのマウスのＲＱを１．０へ設定する）。免疫抑制媒介性アスペルギルス症のステロイドマウスモデルに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、肺における真菌量の低減で有意に有効であったことを示す。免疫抑制されたＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウス（ステロイドモデル図２１Ａ）に、２×１０^６のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子ＣＥＡ１０株を感染させ（０日目）、翌日（１日目）に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームにより処理したか、またはリポソームを希釈するのに使用したバッファー（バッファー対照）により処理した（図２１Ａ中の時系列を参照）。４日目まで生存した各々の処理群からの３匹のマウスを安楽死させ、１つの肺あたりの真菌量を２つの独立した方法によって決定した。Ａ～Ｃ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）。Ａ．３つの処理群について、１つの肺あたりのＣＦＵの平均数を比較する棒グラフ。Ｂ及びＣは、それぞれＡｍＢ－ＬＬ処理群及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理群について調査した細胞の視野の２０×拡大で撮った例示的な写真画像である。ホモジナイズした肺組織を栄養豊富な増殖培地上にプレーティングし、プレートを一晩インキュベーションし、真菌細胞の数をマイクロコロニーをカウントすることによって、ＣＦＵを推定した。標準誤差を線及びひげにより示す。Ｄ．ｒＤＮＡの相対量。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の相対量（ＲＱ）を、図２４Ａ中でアッセイした３つの肺の同じ３セットからの肺ホモジネートの並列のサンプルでｑＰＣＲによって決定した。データを、最も高いレベルの１匹のバッファー対照マウスにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡのレベルへ正規化した（すなわちこのマウスのＲＱを１．０へ設定する）。免疫抑制媒介性アスペルギルス症のステロイドマウスモデルに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、肺における真菌量の低減で有意に有効であったことを示す。免疫抑制されたＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウス（ステロイドモデル図２１Ａ）に、２×１０^６のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子ＣＥＡ１０株を感染させ（０日目）、翌日（１日目）に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームにより処理したか、またはリポソームを希釈するのに使用したバッファー（バッファー対照）により処理した（図２１Ａ中の時系列を参照）。４日目まで生存した各々の処理群からの３匹のマウスを安楽死させ、１つの肺あたりの真菌量を２つの独立した方法によって決定した。Ａ～Ｃ．コロニー形成単位（ＣＦＵ）。Ａ．３つの処理群について、１つの肺あたりのＣＦＵの平均数を比較する棒グラフ。Ｂ及びＣは、それぞれＡｍＢ－ＬＬ処理群及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理群について調査した細胞の視野の２０×拡大で撮った例示的な写真画像である。ホモジナイズした肺組織を栄養豊富な増殖培地上にプレーティングし、プレートを一晩インキュベーションし、真菌細胞の数をマイクロコロニーをカウントすることによって、ＣＦＵを推定した。標準誤差を線及びひげにより示す。Ｄ．ｒＤＮＡの相対量。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の相対量（ＲＱ）を、図２４Ａ中でアッセイした３つの肺の同じ３セットからの肺ホモジネートの並列のサンプルでｑＰＣＲによって決定した。データを、最も高いレベルの１匹のバッファー対照マウスにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡのレベルへ正規化した（すなわちこのマウスのＲＱを１．０へ設定する）。免疫抑制媒介性アスペルギルス症の白血球減少マウスモデルに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、肺における真菌量の低減で有意に有効であったことを示す。免疫抑制されたＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウス（ステロイドモデル図２１Ｂ）に、５×１０^５のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子ＣＥＡ１０株を感染させ（０日目）、翌日に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームにより処理したか、またはリポソームを希釈するのに使用したバッファー（対照）により処理した（図２１Ｂ中の時系列を参照）。各々の処理群からの３匹のマウスを安楽死させ、１つの肺あたりの真菌量を２つの独立した方法によって決定した。Ａ．Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓコロニー形成単位（ＣＦＵ）。３つの処理群について、１つの肺あたりのＣＦＵの平均数を比較する棒グラフ。標準誤差を線及びひげにより示す。Ｂ．真菌細胞ｒＤＮＡの相対量。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の相対量（ＲＱ）を、Ａ中でアッセイした３つの肺の同じ３セットからの肺ホモジネートの並列のサンプルでｑＰＣＲによって決定した。データを、最も高いレベルの１匹の対照マウスにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡのレベルへ正規化した（すなわちこのマウスのＲＱは１．０である）。（図２６）免疫抑制媒介性アスペルギルス症の白血球減少マウスモデルに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、肺における真菌量の低減で２桁多く有効であったことを示す。免疫抑制されたＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウス（ステロイドモデル図２１Ｂ）に、５×１０^５のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子ＣＥＡ１０株を感染させ（０日目）、翌日（１日目）に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームにより処理したか、またはリポソームを希釈するのに使用したバッファー（バッファー対照）により処理した（図２１Ｂ中の時系列を参照）。各々の処理群からの３匹のマウスを安楽死させ、１つの肺あたりの真菌量を２つの独立した方法によって決定した。Ａ．Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓコロニー形成単位（ＣＦＵ）。３つの処理群について、１つの肺あたりのＣＦＵの平均数を比較する棒グラフ。標準誤差を線及びひげにより示す。Ｂ．真菌細胞ｒＤＮＡの相対量。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）の相対量（ＲＱ）を、Ａ中でアッセイした３つの肺の同じ３セットからの肺ホモジネートの並列のサンプルでｑＰＣＲによって決定した。データを、最も高いレベルの１匹の対照マウスにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡのレベルへ正規化した（すなわちこのマウスのＲＱは１．０である）。真菌マンナンのＢｉＦＣ検出のためのデクチン－２Ｖｅｎｕｓ融合物の配列をコードするＤＮＡを示す。ＭｍＤＥＣ２ＶｙＮのＤＮＡ配列である。ｐＥＴ－４５Ｂ中で発現される、ＭｍＤＥＣ２ＶｙＮコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号：１７）。長さ：５７７ｂｐであり、ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引き、クローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンは太字であり、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基ＡＡＧはイタリック体の太字である。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化されたマウスデクチン２遺伝子ＣＬＥＣ６Ａからのｓデクチン－２配列はプレーンテキストであり、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、続いて、ＶｅｎｕｓＶｙＮＴ１５４Ｍについての配列（ＡＫＡ９５３３５から修飾された突然変異Ｖｅｎｕｓタンパク質のＮ末端半分）をコードする４６５ヌクレオチド長は小文字であり、Ａｌａ（Ａ）コドンＧＣＴならびに２つの終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称：ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓ、長さ：１０８４ｂｐであり、終結のためには７未満であり、切断部位に続いて（ｉ．ｇ．、１０７７ｂｐ）、３５９残基のタンパク質をコードする。しかし、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取り寄せたものは、ｐＥＴ－４５ｂ＋の中へサブクローン化するために、ＫｐｎＩ部位（ＧＧＴＡＣＣ（配列番号：２３））で開始する、より短い１０５７ｂｐのバージョンであった。真菌マンナンのＢｉＦＣ検出のためのデクチン－２Ｖｅｎｕｓ融合物のタンパク質配列を示す。ＤＥＣ２－ＶｙＮのタンパク質配列である。合成される最終的なＤＥＣ２－ＶｙＮタンパク質（配列番号：１８）。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＮ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲い、ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基は太字であり、リジンはイタリック体である。１６６のマウスｓデクチン－２アミノ酸残基をプレーンテキストで示し、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、Ｖｅｎｕｓの残基１～１５５は突然変異Ｔ１５４Ｍを備えており、太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのに使用されるコドンはインフレームである。全部で３５９アミノ酸、ＭＷ４０，１９８ｇ／モル。ｐＩ６．０４。Ｏ．Ｄ．２８０１．９４０／ｍｇ／ｍＬ。真菌マンナンのＢｉＦＣ検出のためのデクチン－２Ｖｅｎｕｓ融合物の配列をコードするＤＮＡを示す。ＭｍＤＥＣ２ＶＣのＤＮＡ配列である。ＭｍＤＥＣ２ＶＣ（ｐＥＴ－４５Ｂ中で発現される、ＭｍＤＥＣ２ＶＣコドン最適化ＤＮＡ配列でもある）（配列番号：１９）。長さ：５７７ｂｐであり、ベクターｐＥＴ－４５ｂ＋配列の９つのコドンを四角で囲って、開始コドンに下線を引き、クローニング部位のＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）（配列番号：２３）及びＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）（配列番号：２１）に、それぞれ下線を引く。ＧｌｙＳｅｒ（Ｇ，Ｓ）フレキシブルリンカー残基についてのコドンは太字であり、反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基ＡＡＧはイタリック体の太字である。Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化されたマウスデクチン２遺伝子ＣＬＥＣ６Ａからのｓデクチン－２配列はプレーンテキストであり、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、次いでＶｅｎｕｓの配列をコードするＣ末端アミノ酸についての配列（アミノ酸残基１５５～２３８、ＡＫＡ９５３３５から修飾されたタンパク質）をコードする２５２ヌクレオチド長は小文字であり、Ａｌａ（Ａ）コドンＧＣＴならびに２つの終止コドンＴＡＡ及びＴＴＡに下線を引き、終止コドンは太字である。代替の遺伝子名称：ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ２ｌｙｓｈｉｓ、長さ：８７１ｂｐであり、終止コドンのためには７ｂｐ未満であり、切断部位に続いて、２８８残基のタンパク質をコードする。しかし、ｐＥＴ－４５ｂ＋の中へサブクローン化するために、ＫｐｎＩ部位（ＧＧＴＡＣＣ（配列番号：２３））で開始する、より短い８４４ｂｐのバージョンをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取り寄せた。真菌マンナンのＢｉＦＣ検出のためのデクチン－２Ｖｅｎｕｓ融合物のタンパク質配列を示す。ＤＥＣ２－ＶＣのタンパク質配列である。合成される最終的なＤＥＣ２－ＶＣタンパク質（配列番号：２０）。ｐＥＴ－４５Ｂ＋からのＣ末端アミノ酸及び（Ｈｉｓ）_６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：２２）親和性タグを四角で囲い、ＧｌｙＳｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカー残基及び反応性ｌｙｓ（Ｋ）残基は太字であり、リジンはイタリック体である。１６６のマウスｓデクチン－２アミノ酸残基をプレーンテキストで示し、ＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーは１５残基であり、Ｖｅｎｕｓの残基は１５５～２３８であり、追加の太字のＣ末端のＡｌａ残基（Ａ）で終了し、このＡｌａ残基のコドンは終止コドン及びＰａｃＩ部位を入れるのにインフレームで使用される。全部で２８８アミノ酸、ＭＷ３２，０９８ｇ／モル。ｐＩ６．１６、Ｏ．Ｄ．２８０２．０２ＯＤ／ｍｇ／ｍＬ。多糖類を含有する真菌マンナンの検出のためのＶｅｎｕｓタンパク質の相補的な断片へ融合したデクチン－２によりコートされたリポソームのタンパク質デザイン及びモデルを示す。Ａ．用いられた診断用のリポソームのモデル。緑色蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓＶｙＮ１５５のＮ末端断片へ融合したｓデクチン－２モノマー（青色）（例えばＤＥＣ２－ＶｙＮ）及びＶｅｎｕｓＶＣのＣ末端断片へ融合したｓデクチン－２モノマー（ＤＥＣ２－ＶＣ）によりコートされたリポソームは、真菌マンナンを認識及び結合して、ｓデクチン－２ダイマーを形成し、アセンブルされたＶｅｎｕｓタンパク質及び強い緑色二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルを導く。これらの真菌診断用のリポソームは、真菌細胞壁中のマンナン、マンナンを含有する、菌体外多糖マトリックス、バイオフィルム、または放出された可溶性多糖類に接触する場合のみに、緑色蛍光シグナルを生じる。ＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣを各々脂質担体ＤＳＰＥ－ＰＥＧへカップリングし、リポソーム膜の中へ挿入した。ＤＥＣ２カップルモノマーを、全ＤＥＣ２タンパク質及びリポソーム脂質が、１：１００のモル比または１モルパーセントＤＥＣ２であるようにリポソームの中へ挿入した。このモル比、１００ｎｍの直径のリポソームの表面面積、及び脂質二重層の１０^６ｎｍ^２あたり５×１０^６脂質分子という出版された推定値^７８から、各々のＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソーム中におよそ１，５００のＤＥＣ２モノマー（すなわち７５０のＤＥＣ２－ＶｙＮ融合タンパク及び７５０のＤＥＣ２－ＶＣ融合タンパク質）があると計算した。表２を参照されたい。これらのリポソームは、例えばビオチン－ストレプトアビジン結合を経由して、不溶性マトリックスへ容易に付着することができる（図の右側）。この構成において、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬は、標準的な蛍光装置類を使用して、血清の中へ放出された真菌マンナン含有多糖類の非常に低い濃度を検出することができる。Ｂ．デクチン－２Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質のデザイン。２つの別個のデクチン－２融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。１つを突然変異Ｖｅｎｕｓタンパク質ＶｙＮのＮ末端へ、他をＶｅｎｕｓタンパク質ＶＣのＣ末端断片へ、融合させた。Ｖｅｎｕｓタンパク質のこれらの十分に特徴づけられた相補的な２つの断片は、相互作用する担体タンパク質のアセンブリ（すなわち本明細書におけるＤＥＣ２ダイマー）によって接近させた場合に、アセンブルしてＢｉＦＣシグナルを生じることが公知である。異なる長さのフレキシブル（ｇｌｙｓｅｒ）_ｎｇｌｙスペーサーは機能的ドメインを分離して、動き及び機能のある程度の独立性を許容する。ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬がマンナン特異的Ｖｅｎｕｓ緑色蛍光シグナルを生成することを示す。各々の多糖類を、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームによる２３℃で２時間のインキュベーションの間に、９６ウェルマイクロタイタープレート中のウェルの列へ１ｍｇ／ｍＬで添加した。デキストランによるインキュベーションからの平均バックグラウンドシグナルを、他のすべてのサンプルから差し引いた。差が何倍であるかを、予想される標的の酵母α－マンナンと真菌β－グルカンとスクロースとの間で示す。標準誤差を線及びひげによって示す。ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームがＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞依存性緑色蛍光シグナルを生成することを示す。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（ＣＥＡ１０株）の４，５００の分生子を、ＶＭＭ＋１％のグルコース中でリジンコート２４ウェルマイクロタイタープレート上で３７℃で７２時間発芽及び増殖させ、ホルマリン中で固定し、ＬＤＢ２バッファーの中で洗浄した。Ａ～Ｈ．細胞を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２中のリポソームＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬の１：１００の希釈物によりインキュベーションした。最終的なＤＥＣ２タンパク質濃度は約１ｕｇ／１００ｕＬであった。真菌細胞のコロニーを２０×拡大でペアで撮影した。ペアの明視野画像及びマージした蛍光画像を示す。Ｉ及びＪ．希釈バッファーによりインキュベーションした対照細胞を示す画像であり、赤色チャンネルを緑色チャンネルからのごくわずかな蛍光のバックグラウンドを示すために弱めた。左側のＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞のコロニーの明視野画像である。右側のＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊは、左側の隣接する明視野画像のＶｅｎｕｓ緑色蛍光タンパク質画像とマージした明視野画像（赤色）である。３０Ｂ中の白色矢印は、シグナルを生じない稀な菌糸を示す。

以下の記載は、本組成物及び方法の様々な態様及び実施形態を列挙する。特定の実施形態が組成物及び方法の範囲を定義することは意図されない。むしろ、実施形態は、少なくとも開示される組成物及び方法の範囲内に含まれる非限定的例を単に提供するものである。

世界的には、国内外で３億人以上が真菌感染に罹患する。いくつかの真菌性疾患は、急性且つ重症である。他の真菌感染は再発性であり、いくつかは慢性である。毎年約２００，０００、４００，０００、及び１，０００，０００の症例が、それぞれアスペルギルス症、カンジダ症、及びクリプトコッカス症であり、死亡率は驚くほど高い。皮膚の真菌感染（皮膚糸状菌症）は、最も一般的な真菌感染である。世界的な集団のうちの４～１０パーセント（例えば３億人超）が、足の真菌感染（水虫感染、足部白癬）、及び特に、日常生活に支障をきたすほどかもしれない足指爪の感染（爪真菌症）を有すると推定され得る。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ及び関連するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種は、アスペルギルス症を引き起こす。生命を脅かすアスペルギルス症を発症する最も高いリスクがある患者は、例えば幹細胞移植もしくは臓器移植からの免疫系の弱体化を有するか、または様々な肺疾患（結核、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、または喘息が挙げられる）を有するものである。免疫不全の患者の中で、アスペルギルス症は、カンジダ症の次に２番目に頻度の高い真菌感染である。侵襲性アスペルギルス症の治療に付随する追加費用は、１名の小児あたり４０，０００ドル及び１名の成人あたり１０，０００ドルと推定される。アスペルギルス症の患者は、抗真菌薬（アンホテリシンＢ、イトラコナゾール、ボリコナゾール、フルコナゾール等）により治療される。しかしながら抗真菌療法を行っても、アスペルギルス症の免疫不全の患者の１年の生存は２５～６０％にすぎない。さらに、アスペルギルス症を治療するすべての既知の抗真菌剤は、ヒト細胞に対してかなり毒性である（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｇｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｙｓｔｅｍｉｃｆｕｎｇａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ＆ＣｈｉｌｄＨｅａｌｔｈ１５：６０３－６０８（２０１０））。抗真菌薬送達を改善し、広範囲の真菌病原体に対する抗真菌剤の治療有効性を促進する、及び／または対象へ投与された場合に抗真菌剤の毒性を低減する、標的化されたリポソームが、本明細書において提供される。

ナノ粒子
真菌細胞へ薬物の送達のためのナノ粒子が、本明細書において提供される。全体を通して使用されるように、ナノ粒子は、いくつか挙げると、脂質ナノ粒子、例えばリポソームもしくは非リポソーム脂質ナノ粒子（例えば非水性コア（ＬＮＰ）を備えた脂質ナノ粒子）、デンドリマー、ポリマーミセル、ナノカプセル、またはナノスフェアであり得るがこれらに限定されない。例えば、抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子がナノ粒子の外側表面の中へ取り込まれ、抗真菌剤がナノ粒子中にカプセル化される、ナノ粒子（例えばリポソーム）が本明細書において提供される。ナノ粒子（例えばリポソーム）を本明細書において記載される真菌へ標的化するのに使用される標的化分子は、様々な組成の薬物ロードナノ粒子を真菌細胞へ標的化することができる。他の例としては、酸化鉄ナノ粒子、多糖類ゲルナノ粒子、及びシリカナノ粒子が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において使用される時、リポソームという用語は、少なくとも１つの脂質二重層によって囲まれた水性区画または水性緩衝区画を指す。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層によって囲まれた区画（すなわち内部の空洞または空間）中に、水溶液、化合物、薬物、または他の物質を保有することが可能である。リポソームは、サイズ（すなわち直径）が変動し得る。例えば、リポソームは、約１０００ナノメートル（ｎｍ）以下のサイズを有し得る。例えば、リポソームは、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約５０ｎｍ～約１００ｎｍのサイズを有し得る。リポソームとしては、薬剤（例えば抗真菌剤）のカプセル化のための区画を含むリポソーム、リポソームの外側へ付着されるかまたは外側の中へ取り込んだ標的化分子を含むリポソーム、及びカプセル化された抗真菌剤を含むリポソームが挙げられる。カプセル化された抗真菌剤は、リポソームの内部空間中に完全または部分的に所在する抗真菌剤である。例えば本明細書において記載されるリポソームのうちの任意ものにおいて、抗真菌剤のうちの少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、リポソームの内部空間またはリポソームの脂質二重層の中へ取り込まれる。

本明細書において記載されるナノ粒子（例えばリポソーム）のうちの任意のものは、脂質に対して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０モルパーセント、またはそれ以上の抗真菌剤を含有し得る。換言すれば、ナノ粒子は、１：１００、２：１００、３：１００、４：１００、５：１００、６：１００、７：１００、８：１００、９：１００、１０：１００、１１：１００、１２：１００、１３：１００、１４：１００、１５：１００、１６：１００、１７：１００、１８：１００、１９：１００、２０：１００、またはそれ以上のモル比の抗真菌剤対リポソーム脂質を含み得る。本明細書において使用される時、モル比は、２つの構成成分のモルにおける量間の比、例えば標的化分子のモル数と脂質のモル数（標的化分子：脂質のモル）または抗真菌剤のモル数と脂質のモル数（抗真菌剤のモル：脂質のモル）との間の比である。そして同様に、ナノ粒子は、０．００２：１００、０．０５：１００、０．１：１００、０．５：１００、１：１００、２：１００、３：１００、４：１００、５：１００、１０：１００、１５：１００、２０：１００、２５：１００、またはそれ以上のモル比の標的タンパク質対リポソーム脂質を含み得る。

本明細書において記載されるリポソームのうちの任意のものの２つ以上の複数が提供される。例えば、複数のリポソームは、約２～約１×１０^１４（１００兆）のリポソームを含み得る。例えば、複数のものは、少なくとも１００、２５０、５００、７５０、１０００、５０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１００万、またはそれ以上のリポソームを有し得る。リポソームは、当業者に公知のまたは後に見出される任意の好適な方法によって作製され得る。概して、リポソームは、薄フィルム水和技法、続いて少数の凍結融解サイクルによって調製され得る。リポソーム懸濁物も、当業者に公知の方法に従って調製され得る。リポソームの調製のための例示的な方法は、Ａｋｂａｒｚａｄｅｈｅｔａｌ．（“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ：ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＮａｎｏｓｃａｌｅＲｅｓ．Ｌｅｔｔ．８（１）：１０２（２０１３）中で記載され、その全体は参照することによって本明細書に援用される。

概して、様々な脂質成分が、リポソームを作製するのに使用され得る。これらは、生理的なｐＨで非荷電形態または中性の双性イオン形態で存在する中性脂質を包含する。かかる脂質としては、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、及びセレブロシドが挙げられる。本明細書において記載される脂質のうちの任意のものの合成誘導体も、脂質ナノ粒子を作製するのに使用され得る。脂質ナノ粒子は、ステロール（例えばコレステロール）も含み得る。脂質ナノ粒子は、およそ生理的なｐＨで正味の正電荷を保有する陽イオン性脂質も含み得る。かかる陽イオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル－Ｎ，Ｎ－Ｎ－トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）；３β－（Ｎ－－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（「ＤＣコレステロール」）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－アンモニウムトリフルオルアセテート（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔａｔｅ）（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジレオイル（ｄｉｌｅｏｙｌ）－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。陰イオン性脂質も、本明細書において記載される脂質ナノ粒子中での使用に好適である。陰イオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノーロアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、及び中性脂質へ連結された他の陰イオン修飾基が挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの例において、リポソームは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）コンジュゲートポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、スフィンゴミエリン、コレステロール、またはその任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ－分子量（ＭＷ５００）～ＰＥＧ－ＭＷ２００００であり得る。本明細書において記載される脂質のうちの任意のものは、本明細書において記載されるリポソームの構成成分であることに加えて、真菌細胞上の抗原に結合する標的化分子またはその断片へコンジュゲートされ得る。いくつかの例において、本明細書において記載される脂質のうちの任意のもののＰＥＧ化バージョンは、真菌細胞上の抗原（例えば真菌細胞壁抗原または真菌細胞菌体外多糖マトリックス抗原）に結合する標的化分子またはその断片へコンジュゲートされ得る。

全体を通して使用されるように、標的化分子は、真菌細胞上の抗原についての結合親和性（任意選択で特異的結合親和性）を有する分子であり、抗体、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、または小分子が挙げられることができるがこれらに限定されない。全体を通して使用されるように、真菌細胞上の抗原または標的真菌細胞抗原は、真菌細胞周期の任意のステージの真菌細胞に付随する任意の抗原であり得る。例えば、そして限定的ではなく、抗原は、真菌細胞に付随し得る（例えば真菌細胞壁中に埋め込まれた抗原、真菌細胞壁へ付着した抗原、または真菌細胞表面抗原）。真菌細胞に付随する抗原は、真菌細胞へ直接的または間接的にも結合し得る、（例えば真菌細胞壁へ直接的または間接的に結合する）。抗原は、真菌細胞によって産生されるか、または真菌細胞に付随する、真菌の菌体外多糖マトリックス（例えばバイオフィルム）の抗原でもあり得る。いくつかの例において、菌体外多糖マトリックスは、真菌細胞、または真菌細胞の集団へ接着するかまたは結合する。真菌細胞に付随する菌体外多糖マトリックスは、必ずしもそうである必要はないが、真菌細胞、またはそれに付随する真菌細胞の集団によって産生され得ることが理解される。全体を通して使用されるように、抗原は、タンパク質、脂質、または炭水化物であり得るがこれらに限定されない。

全体を通して使用されるように、ポリペプチド、タンパク質、及びペプチドは、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書において互換的に使用される。本明細書において使用される時、当該用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を網羅し、全長タンパク質を包含し、アミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合によって連結される。

全体を通して使用されるように、核酸という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれか形態での、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、当該用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を網羅する。別段の指示のない限り、特定の核酸配列は、明示的に指示された配列に加えて。保存的に修飾されたそのバリアント（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的な配列も黙示的に網羅する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基により置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８（１９９４））。

各々の事例において、具体的な核酸またはポリペプチドの配列が列挙される場合に、列挙された配列へ少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％。９０％、９５％、９９％）の同一性を有する配列を含む実施形態も提供される。配列に関する同一性または類似性は、配列をアライメントさせ、必要であるならばギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後に、開始アミノ酸残基と同一（すなわち同じ残基）である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。例えば、配列番号：１～２０へ少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％。９０％、９５％、９９％）の同一性を有するポリペプチド及び核酸配列が、本明細書において提供される。配列番号：１～２０中で記載されるヒスチジンタグ及び／またはリンカー配列を含まないポリペプチド及び核酸配列も提供される。配列番号：１～２０中で記載されるヒスチジンタグ及び／またはリンカー配列を含まないポリペプチド及び核酸配列へ少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％。９０％、９５％、９９％）の同一性を有するポリペプチド及び核酸配列も、本明細書において提供される。本明細書において記載されるポリペプチドをコードする核酸も提供される。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の至適のアライメントは、例えばＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９７０）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８）の類似性についての検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ中の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アライメント及び視覚的検査（例えばＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９５ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって、遂行され得る。

本明細書において開示されるポリペプチドのうちの任意のものは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。非限定例として、以下のリストは、多くの場合対応するバリアントの生物学的活性の有意な修飾をもたらさずに実行される可能性の高い可能な置換を要約する。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、及びプロリン（Ｐ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）ならびに
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．（１９８４）も参照されたい。かかる変化／置換を行う際に、アミノ酸の疎水性親水性指標も考慮され得る。タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能の付与における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野において理解される（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ；（１９８２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１５７（１）：１０５－３２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性性質が、もたらされたタンパク質の二次構造に寄与し、それは今度は、他の分子（例えば酵素、基質、受容体；ＤＮＡ、抗体、抗原、及び同種のもの）と当該タンパク質の相互作用を定義することが認められている。

本明細書において提供されるポリペプチドのうちの任意のもの（例えば可溶性デクチン－１、デクチン－２、またはデクチン－３モノマー）は、Ｎ末端またはＣ末端の欠失または短縮を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸は、本明細書において提供される任意のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失され得、依然として少なくとも１つの機能（例えば別の可溶性デクチンモノマーとのダイマー化）を保持する。図中で説明されるように、可溶性デクチンモノマーポリペプチド配列がプレーンテキスト中で示される。上で説明されるように、ヒスチジンタグまたはリンカー配列を含まないこれらの配列は、ポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端から欠失され得る、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸の欠失によって短縮され得る。

本明細書において記載されるポリペプチドのうちの任意のものを含む組成物も提供される。例えば、可溶性デクチン－１、デクチン－２、もしくはデクチン－３のモノマーポリペプチド、またはその断片を含むポリペプチドを含む組成物が、本明細書において提供される。任意選択で、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸２３～１９９、配列番号：４のアミノ酸２３～１８９、配列番号：６のアミノ酸２３～１００、配列番号：８のアミノ酸３５～２１４、配列番号：１０のアミノ酸３６～２０３、または配列番号：１２のアミノ酸３５～２０７を含むか、またはそれらからなり得る。配列番号：２のアミノ酸２３～１９９、配列番号：４のアミノ酸２３～１８９、配列番号：６のアミノ酸２３～１００、配列番号：８のアミノ酸３５～２１４、配列番号：１０のアミノ酸３６～２０３、または配列番号：１２のアミノ酸３５～２０７を含むか、またはそれらからなる、ポリペプチドの断片も提供される。例えば、そして限定的ではなく、配列番号：２のアミノ酸２３～１９９、配列番号：４のアミノ酸２３～１８９、配列番号：６のアミノ酸２３～１００、配列番号：８のアミノ酸３５～２１４、配列番号：１０のアミノ酸３６～２０３、または配列番号：１２のアミノ酸３５～２０７を含むポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含む断片も提供される。任意選択で、ポリペプチドは、蛍光部分（例えば、そして限定的ではなく、ローダミン）へ連結されるかまたはコンジュゲートされる。組成物は、実施例において記載されるように、バッファー（例えば約０．５Ｍ～約１．５ＭのＬ－アルギニンを含む復元バッファー）を含み得る。例えば、そして限定的ではなく、組成物は、約０．０５～０．１５Ｍの間のＮａＨ２ＰＯ４、約１０ｍＭ～２０ｍＭの間のトリエタノールアミン、約０．５Ｍ～１．５Ｍの間のＬ－アルギニン、約５０～２００ｍＭの間のＮａＣｌ、約２．５ｍＭ～７．５ｍＭの間のＥＤＴＡ、及び約０．２５～７．５ｍＭの間のＢＭＥ（ｐＨ７．２）を含むバッファーを含み得る。任意選択で、組成物は、約０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、約１０ｍＭのトリエタノールアミン、約１ＭのＬ－アルギニン、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約５ｍＭのＥＤＴＡ、及び５ｍＭのＢＭＥ（ｐＨ７．２）を含むバッファーを含み得る。組成物のうちの任意のものを含むキットも提供される。任意選択で、キットは、変性バッファーまたは還元バッファー（例えばβ－メルカプトエタノールを含む還元バッファー）を含む。本明細書において記載されるリポソームのうちの任意のものを含むキットも提供される。

全体を通して使用されるように、抗体という用語は、ナノボディ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する任意のクラスの免疫グロブリンの全体（すなわちインタクト抗体）、そして、特異的抗原に結合する能力を保持する抗体の断片を網羅するがこれらに限定されない。例えば米国特許第４，７０４，６９２号（それらの内容は参照によって全体が本明細書に援用される）中で記載されるように、抗体断片及び抗原結合タンパク質（単一鎖抗体）のコンジュゲートも有用である。

全体を通して使用されるように、アプタマーは、標的抗原へ選択的に結合するオリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）またはペプチド分子である。例えばＬａｋｈｉｎｅｔａｌ．“Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ＳｏｌｕｔｉｏｎｓａｎｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓ，”ＡｃｔａＮａｔｕｒａｅ５（４）：３４－４３（２０１３）；及びＲｅｖｅｒｄａｔｔｏｅｔａｌ．，“Ｐｅｐｔｉｄｅａｐｔａｍｅｒｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｃｕｒｒ．ＴｏｐＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５（１２）：１０８２－１０１（２０１５））（この参照によってそれらの全体が本明細書に援用される）を参照されたい。

本明細書において使用される時、特異的に結合するまたは選択的に結合する、という用語は、非特異的または非選択的な相互作用とは、測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば分子の標的抗原への結合を、対照分子の結合に比較して決定することによって測定され得る。特異的結合は、標的抗原に類似する対照分子（過剰量の標識されていない標的抗原等）との競合によって決定され得る。その事例において、標識標的のプローブへの結合が、過剰な非標識標的抗原によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が示される。

任意選択で、２つの標的化分子～約１０，０００の標的化分子が、本明細書において提供されるリポソームの中へ取り込まれ得る。例えば、約５～約１００、約５～約２００、約５～約３００、約５～約４００、約５～約５００、約５～約６００、約５～約７００、約５～約８００、約５～約９００、約５～約１０００、約５～約１１００、約５～約１２００、約５～約１３００、約５～約１４００、約５～約１５００、約５～約１６００、約５～約１７００、約５～約１８００、約５～約１９００、約５～約２０００、約５～約２２５０、約５～約２５００、または約５～約３０００の標的化分子、約５～約３５００、約５～約４０００の標的化分子、約５～約４５００の標的化分子、約５～約５０００の標的化分子、約５～約５５００の標的化分子、約５～約６０００の標的化分子、約５～約６５００の標的化分子、約５～約７０００の標的化分子、約５～約７５００の標的化分子、約５～約８０００の標的化分子、約５～約８５００の標的化分子、約５～約９０００の標的化分子、約５～約９５００の標的化分子、または約５～約１０，０００が、本明細書において記載される１つまたは複数のリポソームの中へ取り込まれ得る。いくつかの例において、約２つの分子～約３，０００の標的化分子が、直径１００ｎｍの非粒子状物質の中へ取り込まれる。当業者は、ナノ粒子の中へ取り込まれ得る標的化分子の数（例えばナノ粒子のサイズに依存して、約２～１０，０００以上の標的化分子）を計算する方法を知らないであろう。

全体を通して使用されるように、リポソームの外側表面の中への標的化分子の取り込みによって、標的化分子がリポソームの外側脂質二重層の中へ取り込まれるかリポソームへ付着されることを意味する。取り込みは、脂質二重層の中への標的化分子の挿入またはインターカレーションによって起こり得る。リポソームへの結合は、例えばリポソームの外側脂質二重層の中へ取り込まれた分子への親和性によって起こり得る。例えば、リポソームは、ビオチン（例えば脂質二重層の中へ挿入されたＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ビオチン）、及びストレプトアビジンへ連結された標的化分子によりコートすることができる。代替的に、標的化分子はリポソームの外側表面へコンジュゲートされ得る。標的化分子は、当技術分野において公知の多数の方法によってリポソームへコンジュゲートされ得る（例えばＡｒｒｕｅｂｏｅｔａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓｖｏｌ．２００９，ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ４３９３８９（２００９））。リポソームは、ストレプトアビジン／ビオチン結合、チオール／マレイミドケミストリー、アジド／アルキンケミストリー、テトラジン／シクロオクチンケミストリー、及び他のクリックケミストリーを経由して、標的化分子へもコンジュゲートされ得る。これらの化学的操作は、ホスホロアミダイト合成の間または合成後のいずれかで調製される。本明細書において使用される時、クリックケミストリーは、主として特異的生体分子と選択された基質を連結することが意図される生体適合性のある反応を指す。クリックケミストリー反応は水によって妨害されず、最少の非毒性副産物を生成し、高い熱力学的駆動力によって特徴づけられ、この高い熱力学的駆動力は、高い反応特異性により、単一反応産物の高収率へと迅速且つ不可逆的に駆動する。

標的化分子は、１つまたは複数の型の真菌細胞、または真菌細胞の集団（動物真菌病原体（例えばヒト真菌病原体）及び植物病原体からの細胞が挙げられるこれらに限定されない）上の抗原に結合し得る。ヒト真菌病原体の例としては、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ等）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ属の種（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ等）、Ｃａｎｄｉｄａ属の種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ａｕｒｉｓ等）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属の種（Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓ及びＣ．ｐｏｓａｄａｓｉｉ等）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ及びＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属の種（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ等）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属の種（Ｐ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ等）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ属の種（Ｓ．ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ等）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｎｅｆｆｅｉ（以前はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍが挙げられるがこれらに限定されない。

植物真菌病原体の例としては、Ａｅｃｉｄｉｕｍｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ａｅｃｉｄｉｕｍｍｏｒｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｐａｄｗｉｃｋｉｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｒｉｔｉｃｉｎａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｙａｌｉｉｎｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｍｙｌｏｓｔｅｒｅｕｍａｒｅｏｌａｔｕｍ、Ａｐｉｏｇｎｏｍｏｎｉａｅｒｙｔｈｒｏｓｔｏｍａ、Ａｒｋｏｏｌａｎｉｇｒａ、Ｂａｌａｎｓｉａｏｒｙｚａｅ－ｓａｔｉｖａｅ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｂｅｒｅｎｇｅｒｉａｎａ、Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａｐｓｅｕｄｏｎａｖｉｃｕｌａｔａ（ツゲ材の先枯病）、Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａｐｓｅｕｄｏｎａｖｉｃｕｌａｔａ、Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓｆａｇａｃｅａｒｕｍ、Ｃｈａｌａｒａｆｒａｘｉｎｅａ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａａｂｉｅｔｉｓ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａｈｉｍａｌｅｎｓｉｓ、Ｃｈｒｙｓｏｍｙｘａｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｉ、Ｃｉｂｏｒｉｎｉａａｌｌｉｉ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｇｉｇａｎｔｅａ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｓｏｒｇｈｉ、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍｆｌａｃｃｉｄｕｍ、Ｃｒｕｍｅｎｕｌｏｐｓｉｓｓｏｒｏｒｉａ、Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｖｅｘａｎｓ、Ｄｉｄｙｍｅｌｌａｆａｂａｅ－Ａｓｃｏｃｈｙｔａｆａｂａｅ、Ｅｎｄｏｐｈｙｌｌｕｍｋａｅｒｎｂａｃｈｉｉ、Ｅｘｏｂａｓｉｄｉｕｍｖｅｘａｎｓ、Ｇｅｒｗａｓｉａｉｍｐｅｒｉａｌｉｓ、Ｇｅｒｗａｓｉａｍａｙｏｒｉｉ、Ｇｅｒｗａｓｉａｒｏｓａｅ、Ｇｅｒｗａｓｉａｒｕｂｉ、Ｇｅｒｗａｓｉａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｇｏｐｌａｎａｄｉｏｓｃｏｒｅａｅ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｍｉｙａｂｅｉ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｙａｍａｄａｅ、Ｈａｍａｓｐｏｒａａｃｕｔｉｓｓｉｍａ、Ｈａｍａｓｐｏｒａａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｈａｍａｓｐｏｒａｈａｓｈｉｏｋａｉ、Ｈａｍａｓｐｏｒａｌｏｎｇｉｓｓｉｍｉ、Ｈａｍａｓｐｏｒａｒｕｂｉ－ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ、Ｈａｍａｓｐｏｒａｓｉｎｉｃａ、Ｈａｒｐｏｐｈｏｒａｍａｙｄｉｓ、Ｈｅｍｉｌｅｉａｖａｓｔａｔｒｉｘ、Ｋｕｅｈｎｅｏｌａｊａｐｏｎｉｃａ、Ｋｕｅｈｎｅｏｌａｌｏｅｓｅｎｅｒｉａｎａ、Ｌａｃｈｎｅｌｌｕｌａｗｉｌｌｋｏｍｍｉｉ、Ｌｅｐｔｏｇｒａｐｈｉｕｍｗｉｎｇｆｉｅｌｄｉｉ、Ｍａｉｎｓｉａｒｕｂｉ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａｃａｐｒａｅａｒｕｍ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａｌａｒｉｃｉ－ｅｐｉｔｅａ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａｌａｒｉｃｉ－ｐｅｎｔａｎｄｒａｅ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａｌａｒｉｃｉ－ｐｅｎｔａｎｄｒａｅ、Ｍｏｎｉｌｉａｐｏｌｙｓｔｒｏｍａ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ、Ｏｃｈｒｏｐｓｏｒａａｒｉａｅ、Ｏｌｉｖｅａｔｅｃｔｏｎａｅ、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａｌｏｎｇｉｃｏｌｌｕｍ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａｒａｄｉｉ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａａｍｐｅｌｏｐｓｉｄｉｓ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａｅｕｖｉｔｉｓ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａｍｅｉｂｏｍｉａｅ、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ、Ｐｈｏｍａｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍａｃｕｍｉｎａｔｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍａｒｃｔｉｃｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍａｒｉｓａｎｅｎｓｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍａｓｓａｍｅｎｓｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｂａｒｃｌａｙｉ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｂｕｌｂｏｓｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｂｕｔｌｅｒｉ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｆｏｒｍｏｓａｎｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｇｒｉｓｅｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｈｉｒａｔｓｕｋａｎｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｋａｍｔｓｃｈａｔｋａｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｎａｍｂｕａｎｕｍ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｐａｕｃｉｌｏｃｕｌａｒｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｒｏｓａｅ－ｍｏｓｃｈａｔａｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｒｏｓａｅ－ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｒｏｓａｅ－ｒｕｇｏｓａｅ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｒｕｂｉ－ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍｙａｍａｄａｎｕｍ、Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｌｅｏｌａｒｉａｐｉｓｔａｃｉａｅ、Ｐｉｌｅｏｌａｒｉａｔｅｒｅｂｉｎｔｈｉ、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａｏｂｄｕｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａａｇｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｂｕｘｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｅｒｙｔｈｒｏｐｕｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｇｌｙｃｅｒｉａｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｄｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｈｏｒｉａｎａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｋｕｅｈｎｉｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｍｃｃｌｅａｎｉｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｍｉｓｃａｎｔｈｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｐｉｔｔｉｅｒｉａｎａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｐｓｉｄｉｉ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｕｂｓｔｒｉａｔａ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｖｅｒｏｎｉｃａｅ－ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａｓｔｒｕｍｃｏｒｙｌｉ、Ｓｅｔｏｍｅｌａｎｏｍｍａｈｏｌｍｉｉ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａｐｏｉｎｓｅｔｔｉａｅ、Ｓｐｏｒｉｓｐｏｒｉｕｍｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｍ、Ｓｐｏｒｉｓｏｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｉ、Ｔｈｅｃａｐｈｏｒａｓｏｌａｎｉ、Ｔｈｅｋｏｐｓｏｒａａｒｅｏｌａｔｅ、Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓａｇｒｏｐｙｒｉ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓｇｌａｄｉｏｌｉ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓｎｙｉｋｅｎｓｉｓ、Ｕｒｏｍｙｃｅｓｔｒａｎｓｖｅｒｓａｌｉｓ、及びＵｒｏｍｙｃｌａｄｉｕｍｔｅｐｐｅｒｉａｎｕｍが挙げられるがこれらに限定されない。対象における真菌感染を検出、治療、または予防することに加えて、本明細書において提供される方法のうちの任意のものは、植物における真菌感染を検出、治療、または予防するのに使用され得ることが理解される。例えば、そして限定的ではなく、真菌感染は、葉、茎、根、花弁、萼片、雄しべ、心皮、及び種子の表面、または植物からの粉砕サンプルもしくは抽出物で、検出、治療、または予防され得る。

いくつかの例において、標的化分子は、Ｃ型レクチン受容体またはその断片である。他の例において、標的化分子は、キチン結合タンパク質またはその断片である。本明細書において記載される標的化分子の断片は、断片が由来するタンパク質またはポリペプチドと同じまたは異なる結合親和性により、真菌細胞上の標的抗原へ結合することができるポリペプチドである。標的化分子として使用され得るＣ型レクチン受容体の例としては、デクチン－１（ＣＬＥＣ７Ａ、マウスＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＳ３７６７０及びヒトＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿９２２９３８）、デクチン－２（ＣＬＥＣ６Ａ、マウスＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０６４３８５及びヒトＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｑ６ＥＩＧ７）、デクチン－３（ＣＬＥＣ４Ｄ、マウスＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３４９４９及びヒトＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３４９４９）、及びデクチン－１、デクチン－２、デクチン－３の断片が挙げられる。真菌細胞上のβ－グルカン及び／またはマンナンへ結合するアミノ酸配列を含む、デクチン－１、デクチン－２、デクチン－３の断片も、標的化分子として使用され得る。例示的な標的化分子としては、マウスデクチン－１のβ－グルカン結合断片のアミノ酸配列を含む、配列番号：２が挙げられるがこれらに限定されない。配列番号：２は、除去できるＮ末端Ｈｉｓタグを含む。可溶性デクチン－１を作製するのに使用される核酸コンストラクト（例えば配列番号：７～１４）のうちの任意のものは、デクチン－１ポリペプチドの発現後にＮ末端Ｈｉｓタグ配列を除去するために、選択的プロテアーゼ切断部位をさらに含み得る。選択的プロテアーゼ切断部位としては、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、エンテロペプチダーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子、及びライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって認識されるペプチドプロテアーゼプロセッシング部位が挙げられるがこれらに限定されない。別の例示的な標的化分子は、配列番号：６を含む可溶性デクチン－３ポリペプチドである。配列番号：６は、マウスデクチン－３のアミノ酸４４～２１９を含む。追加の例示的な標的化分子としては、配列番号：８、１０、及び１２をそれぞれ含む可溶性ヒトデクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３のポリペプチドが挙げられる。配列番号：８、１０及び１２は、それぞれヒトデクチン－１のアミノ酸６９～２４８、ヒトデクチン－２のアミノ酸４２～２０９、及びヒトデクチン－３のアミノ酸４４～２１５を含む。ヒトデクチン－１のアミノ酸６９～２４８、ヒトデクチン－２のアミノ酸４２～２０９、及びヒトデクチン－３のアミノ酸４４～２１５の断片、例えばヒトデクチン－１のアミノ酸６９～２４８、ヒトデクチン－２のアミノ酸４２～２０９、及びヒトデクチン－３のアミノ酸４４～２１５を含むかまたはそれらからなるポリペプチドのＣ末端及び／またはＮ末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸の欠失を含む断片も提供され、記載されるリポソーム、ポリペプチド、または組成物のうちの任意のものにおいて使用され得る。

デクチン－１はＴ細胞中で発現される膜貫通受容体であり、マウス及びヒトにおけるＣＬＥＣ７Ａ（Ｃ型レクチンドメイン含有７Ａ、β－グルカン受容体、ＧＲ）遺伝子によってコードされる。デクチン－１は、真菌細胞壁中の様々なβ－グルカンに結合し、病原性及び非病原性の真菌の表面上に曝露される細胞壁構成成分の存在を膜貫通シグナリングして先天性免疫応答を刺激するための一次受容体である。ヒト及びマウスのデクチン－１はそれぞれ２４４アミノ酸及び２４７アミノ酸の長さの原形質膜タンパク質であるが、ｍＲＮＡのスプライスバリアントはより短いヒトアイソフォームを産生する。デクチン－１はモノマーとして膜中で浮遊するが、図３中で示されるデクチン－１標的化リポソームのデザインにおいてモデル化されるようなダイマーとしてβ－グルカンへ結合する。１７６アミノ酸の長さ（２０ｋＤａ）の細胞外Ｃ末端ドメインは、可溶性ｓデクチン－１として単独で操作され得、β－グルカン結合ドメインを含有する。β１→３グルカンは構造的に多様なクラスの多糖類であり、それゆえ、ｓデクチン－１は、２．６ｍＭ～２．２ｐＭの範囲のＫｄ親和定数で、様々なβ－グルカンに差異的に結合する。汎真菌結合活性を有するので、デクチン－１及びその断片（例えばβ－グルカン結合断片）は例示的な標的化分子であり、１つまたは複数の型の真菌細胞（例えば、そして限定的ではなくＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、及び／またはＣｒｙｐｔｏｃｃｏｃｕｓ属の細胞）を殺傷するのに使用され得る。

リポソームの真菌多糖類標的化のために使用され得るマンナン及びマノース（ｍａｎｏｓｅ）の結合ドメインを備えた他の哺乳動物タンパク質は、マンノース受容体Ｃ型Ｉ（ヒトＭＲＣ１、ＮＧ＿０４７０１１）、マンノース結合タンパク質２（ＭＢＬ２、ＮＧ＿０３３９５５）、及びＣ型レクチンドメインファミリー４メンバーＬ（ＣＤ２０９、ＣＬＥＣ４Ｌ、またはＤＣ－ＳＩＧＮ、ヒトＮＧ＿０１２１６７）、またはその断片である。標的化分子として使用され得る真菌炭水化物結合ドメインを備えた非哺乳動物のタンパク質の例としては、細菌及び昆虫のグルカン結合タンパク質ＣＢＭ１１（例えばＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓからのＴＹＰ７７４９５）及びＣＢＭ３９（例えばＯｏｃｅｒａｅａｂｉｏｒｉからのＥＺＡ５３４１０）、細菌マンナン結合タンパク質ＣＢＭ２７（例えばＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓからのＰＷＶ９８６５２）、ＣＢＭ３５（例えばＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の種ＯＶ１９１からのＰＹＥ６５４６７）、ＣＢＭ４６（例えばＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の種５９８ＫからのＧＢＦ７７５４６）、及びＭＶＬ（例えばＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｅｒｎａｒｄｅｔｉｉからのＡＺＢ３５７９７）、またはその断片）が挙げられるがこれらに限定されない。

標的化分子として使用され得るキチン結合ドメインを備えた哺乳動物タンパク質の例としては、キチナーゼ－１（ＣＨＩＴ１、ヒトＮＧ＿０１２８６７）、キチナーゼ－３様－１（ＨＣＧＰ３９、ＣＨＩ３Ｌ１、ヒトＮＧ＿０１３０５６）、キチナーゼ－３様－２（ＣＨＩ３Ｌ２、ヒトＮＭ＿００１０２５１９７）、酸性キチナーゼ（ＣＨＩＡ、ヒト遺伝子ケアＩＤＧＣ０１Ｐ１１１２９１）、及びキトビアーゼ（ＣＴＢＳ、ヒト遺伝子カードＧＣ０１Ｍ０８４５４９）、またはその断片が挙げられるがこれらに限定されない。標的化分子として使用され得るキチン結合ドメインを備えた非哺乳動物タンパク質の例としては、細菌ＣＢＭ５（例えばＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓからのＴＤＸ９９１９４）、ならびに植物及び／または真菌のＣＢＭ１８（例えばＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌｆａｌｆａｅからのＡＹＵ５６５４９）及びＣＢＭ１９（例えばＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓＮＲＲ１５５５からのＸＰ＿０１８２９０９７９）が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において記載される標的化リポソーム中に取り込まれ得るかまたはカプセル化され得る抗真菌物質としては、ポリエン系抗真菌物質またはアゾール系抗真菌物質が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエン系抗真菌物質の例としては、アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、ヒタチマイシン、及びリモシジンが挙げられるがこれらに限定されない。アゾール系抗真菌物質の例としては、イミダゾール（例えばビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、及びチオコナゾール）、トリアゾール（例えばアルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール）、チアゾール（例えばアバフンジン）、及びエキノキャンディン（例えばカスポファンギン、ミカファンギン、及びアニデュラフンギン）が挙げられるがこれらに限定されない。

アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）は、アスペルギルス症を包含する多くの種類の真菌感染のために最も一般的に使用される薬剤である。アンホテリシンＢの副作用としては神経毒性及び／または腎毒性及び／または肝毒性が挙げられ、多くの場合患者の死をもたらす。ＡｍＢは疎水性であり、図３中でモデル化されるようにリポソームの脂質二重層の中へインターカレートされる。市販の非標的化の球状のＡｍＢロードリポソーム（ＡｍＢ－ＬＬ）は、多くの場合ＡｍＢｉｓｏｍｅと称される。ＡｍＢ－ＬＬは、様々な器官へより効率的に透過し、細胞壁を透過し、２番目に最も一般的に使用されるＡｍＢ製品（デオキシコール酸塩界面活性剤で可溶化したＡｍＢ）よりも、わずかに高い有効な用量のＡｍＢで毒性の低減を示す。しかしながら、ＡｍＢ－ＬＬは、それでもなお患者の５０％において腎臓毒性等のＡｍＢヒト毒性を生ずる。感染したマウスをＡｍＢ－ＬＬにより処理した場合に、大きな真菌細胞集団が大抵の場合残ったままである。この大きな残存する集団が、界面活性剤可溶化ＡｍＢ及びＡｍＢ－ＬＬで治療したヒト患者で治療後の再発及びその後の死亡が高率である理由である可能性が高い。本明細書において提供される標的化リポソームは、真菌細胞を有効に標的化する、及び／または抗真菌剤（例えばＡｍＢ）の毒性を低減するようにデザインされる。

いくつかの例において、リポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子またはその断片を含まないリポソームの中へ取り込まれるかまたはその中にカプセル化された抗真菌薬の濃度に比較して、標的化分子が真菌細胞上の抗原に結合する場合は、抗真菌薬の濃度は低減される。タンパク質コートリポソームを形成すること（すなわちポリペプチド、例えばＣ型レクチン受容体またはその断片によりリポソームをコートすること）によって、より低い濃度の抗真菌剤が真菌感染を治療または予防するのに使用され、したがって抗真菌薬の対象への投与に付随する毒性を減少させ得る。より低い毒性は、より長い期間にわたる標的化抗真菌剤の延長使用を可能にし、それは、現在のところ達成されている不十分な低減に勝って、真菌量を低減させるだろう。より低い毒性は、本明細書において記載される標的化リポソームが予防的に（例えば鼻内噴霧器として）使用されて肺感染が確立する前に予防することを可能にすることができるだろう。

いくつかのリポソームにおいて、抗真菌薬の濃度の低減または減少は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージである。いくつかの例において、毒性の低減は、インビトロ及び／またはインビボの腎細胞毒性及び／または肝細胞毒性の低減である。別の例において、リポソーム中のＡｍＢの濃度の低減は、リポソーム脂質に対して約１１モルパーセントから、リポソーム脂質に対して約１～１０モルパーセントへ低減される。いくつかの標的化リポソームにおいて、抗真菌剤の濃度は、リポソーム脂質のパーセントに対して約１～約２０モルパーセントの抗真菌剤の範囲であり得る。例えば、抗真菌剤の濃度は、リポソーム脂質のパーセントに対して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０モルパーセント抗真菌剤であり得る。

いくつかの例において、真菌細胞上の抗原に結合する標的化分子（例えばリポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子）を含まないリポソームに比較して、標的化リポソームは、動物細胞（例えばヒト細胞）について減少した親和性を有する、及び／または当該動物細胞へより低い毒性である。いくつかの例において、対象の肺細胞、腎細胞、または肝細胞についての標的化リポソームの親和性に比較して、標的化リポソームは、対象の肺中の真菌細胞についてより高い親和性を有する。したがって、本明細書において提供されるリポソームを使用して、抗真菌剤を対象へ送達する一方で、非真菌細胞（例えばヒトの肺細胞、腎細胞、または肝細胞）に対する抗真菌剤の効果を最小限にし、それによって、抗真菌剤の毒性を低減することができる。本明細書において記載される抗真菌剤を含むリポソームのうちの任意のものを使用して、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで真菌感染を低減または減少させる。

標的化リポソームを作製する方法
抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子が各々のリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、抗真菌剤が各々のリポソーム中にカプセル化される、複数のリポソームを作製する方法であって、（ａ）抗真菌剤を溶媒中で約６０℃で約１０分間～約３０分間溶解するステップ、（ｂ）懸濁物中の複数のリポソームを、ステップ（ａ）の抗真菌物質／溶媒溶液と、約６０℃で約３～約５時間または約３７℃で約２４～１２０時間混合することによって、各々のリポソームの中へ抗真菌剤をカプセル化するステップ；及び（ｃ）カプセル化された抗真菌剤を含むリポソームを、脂質へコンジュゲートされた標的化分子と、６０℃で約４５分間～約９０分間接触させることによって、各々のリポソームの外側表面の中へ標的化分子を取り込むステップ、を含む前記方法が、本明細書において提供される。

本明細書において提供されるリポソームを作製する方法において、抗真菌剤は任意の好適な溶媒中で溶解され得る。抗真菌物質及びその特性に依存して、当業者は、溶解のために有効な溶媒を選択する方法に精通しているであろう。いくつかの例において、抗真菌剤（例えばアンホテリシンＢ）は、ＤＭＳＯ水溶液またはホルムアミド中で溶解される。他の疎水性または両疎媒性の溶媒も使用され得る。任意選択で、抗真菌剤は、約１０～約１２０分間溶解され得る。例えば、抗真菌剤は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０分間溶解され得る。

任意選択で、抗真菌剤は、約５５℃～約６５℃の温度で（例えば約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５セルシウス度で）溶解され得る。任意選択で、抗真菌剤は、懸濁物中の複数のリポソームを、抗真菌物質／溶媒溶液（溶解された抗真菌剤）と、約５５℃～約６５℃で（例えば約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５セルシウス度で）約３～約５時間混合することによって、各々のリポソームの中へカプセル化される。別の例において、抗真菌剤は、懸濁物中の複数のリポソームを、抗真菌物質／溶媒溶液（溶解された抗真菌剤）と、約３５℃～約４５℃で（例えば約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５セルシウス度で）約２４～１２０時間混合することによって、各々のリポソームの中へカプセル化される。別の例において、抗真菌剤は、懸濁物中の複数のリポソームを、抗真菌物質／溶媒溶液（溶解された抗真菌剤）と、約３５℃～約４５℃で（例えば約３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５セルシウス度で）約７２～１００時間混合することによって、各々のリポソームの中へカプセル化される。

任意選択で、本明細書において記載されるリポソームを作製する方法のうちの任意のものにおいて、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン３、またはその結合断片からなる群から選択される、Ｃ型レクチン受容体またはその断片は、アルギニンを含む復元バッファー中で維持され、リポソームの中への取り込みの前に変性される。任意選択で、本明細書において記載されるリポソームを作製する方法のうちの任意のものは、抗真菌剤及び標的化分子を含むリポソームを、アルギニンを含む復元バッファー中で保存することをさらに含み得る。任意選択で、復元バッファーは約０．５～約１．５Ｍのアルギニンを含み得る。任意選択で、復元バッファーは、約０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、約１０ｍＭのトリエタノールアミン、約１ＭのＬ－アルギニン、約１００ｍＭのＮａＣｌ、約５ｍＭのＥＤＴＡ、及び５ｍＭのＢＭＥ（ｐＨ７．２）を含み得る。

いくつかの方法において、標的化分子は脂質へコンジュゲートされる。標的化分子へコンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ化脂質または非ＰＥＧ化脂質であり得る。標的化分子へコンジュゲートされ得る脂質の例、及び標的化リポソームの中へ取り込まれ得る抗真菌剤の例は、上で説明される。いくつかの例において、各々のリポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子は、Ｃ型レクチン受容体（例えばデクチン－１、デクチン－２、デクチン－３、またはその断片）、キチン結合タンパク質、菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ）結合タンパク質、もしくはその断片、または抗体である。

記載される方法によって作製された複数の標的化リポソームは、任意の数のリポソーム（例えば約２～約１００，０００，０００のリポソーム）を含む複数のものを産生し得る。標的化リポソームを作製するプロセスの間に、抗真菌剤をカプセル化しないいくつかのリポソーム、またはリポソームの外側表面の中へ標的化分子を取り込まないリポソームがあり得ることが理解される。したがって、リポソームのうちの少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または９９．９％が、カプセル化された抗真菌剤、及び真菌細胞上の抗原に結合する標的化分子を有し、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれる、複数の標的化リポソームが本明細書において提供される。

真菌感染の検出
標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及びシグナル生成分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、標的化分子が標的真菌細胞抗原に結合する場合にシグナル生成分子が検出可能なシグナルを生成する、リポソームも本明細書において提供される。いくつかの例において、シグナル生成分子は、標的化分子へ連結されるかまたは付着される。他の例において、シグナル生成分子は、リポソームの外側表面の中へ取り込まれるかまたは当該外側表面へ付着される。これらのリポソームを使用して、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで、真菌または真菌感染の存在を検出することができる。真菌細胞、または１つもしくは複数の真菌細胞（すなわち真菌細胞の集団）は検出され得る。検出可能なシグナルは、直接的または間接的に検出され得る。例えば、シグナル生成分子は、直接検出される蛍光の色素、標識、またはプローブ（例えばローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、アクリジンオレンジ等）であり得る。

いくつかの例において、標的化分子は、画像化技法（いくつか挙げると、磁気共鳴画像化、ラジオグラフィー、ポジションエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）スキャンが挙げられるがこれらに限定されない）を使用して、直接インビボで検出され得る分子へ連結される。インビボの画像化を使用して真菌感染を検出するのに使用され得る分子の例としては、いくつか挙げると、金属タンパク質、フェリチン、トランスフェリン、アクアポリン、及び化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）レポートが挙げられるがこれらに限定されない。例えばＳｉｌｉｎｄｉｒｅｔａｌ．“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓａｎｄｔｈｅｉｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇ，”Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ２０（５）：４０１－４１５（２０１２）；及びＭｕｋｈｅｒｊｅｅｅｔａｌ．“ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＭＲＩＲｅｐｏｒｔｅｒｓ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｎｅｗｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，”Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．ＭａｇｎＲｅｓｏｎ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．１０２－１０３：３２－４２（２０１７））を参照されたい。別の例において、標的化分子は、二次抗体を使用して間接的に検出することができる一次抗体またはその断片（例えば抗体のＦｃ断片）へ連結される。いくつかの例において、標的真菌抗原は、真菌細胞上にある。他の例において、標的真菌抗原（例えば真菌細胞壁構成成分）は、生物学的サンプルの中へ真菌細胞から放出される。

いくつかの例において、真菌細胞抗原へ結合された場合に、リポソームそれ自体がシグナルを生成する。このシグナルは、リポソーム結合後に１つまたは複数のステップにおいて生成され得る。１ステップのシグナリング系の例が図１１及び２８Ａ中で示され、ここで、リポソームは任意選択で固体支持体へ付着されても付着されなくてもよい。この例において、対象または生物学的サンプルは、蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された可溶性デクチン（標的化分子）を含む融合タンパク質を含むリポソーム、及び蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された可溶性デクチン（標的化分子）を含むリポソームと接触させられる。蛍光タンパク質の例としては、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、例えばＶｅｎｕｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、そして、これらのタンパク質の誘導体（例えば突然変異誘導体）が挙げられるがこれらに限定されない。例えばＣｈｕｄａｋｏｖｅｔａｌ．“ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＩｍａｇｉｎｇＬｉｖｉｎｇＣｅｌｌｓａｎｄＴｉｓｓｕｅｓ，”ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ９０（３）：１１０３－１１６３（２０１０）；及びＳｐｅｃｈｔｅｔａｌ．，“ＡＣｒｉｔｉｃａｌａｎｄＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＲｅｖｉｅｗｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＴｏｏｌｓｆｏｒＬｉｖｅ－ＣｅｌｌＩｍａｇｉｎｇ，”ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ７９：９３－１１７（２０１７））を参照されたい。

いくつかの例において、標的化分子（例えば可溶性デクチン－１、デクチン－２、デクチン－３、またはその断片）は、真菌細胞上のβ－グルカンまたはマンナンの結合に際して、リポソームの表面上でダイマーを形成する。蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された第１の標的化分子、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された第２の標的化分子の両方を表面上で提示するリポソームが、真菌感染した対象（例えばいくつか挙げると、対象の眼、耳、喉、膣、鼻通路、皮膚、または爪）、または対象からのサンプル（例えば尿、血液、血清、涙液、喀痰、肺洗浄物、組織の擦過物またはホモジネート）と接触させられる場合に、リポソームの表面の中へ取り込まれた可溶性デクチンモノマーは、真菌細胞上に存在するかまたは真菌細胞に由来するβ－グルカンまたはマンナンへの結合に際してダイマーを形成するだろう。第１の標的化分子及び第２の標的化分子は、同じであるかまたは異なり得る。

ダイマー形成は、蛍光タンパク質のＣ末端断片と蛍光タンパク質のＮ末端断片との間の相互作用、すなわち補完（二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ））に影響し、その結果、例えば携帯型の蛍光光、蛍光顕微鏡、蛍光マイクロタイタープレートリーダー、蛍光フローセル分析器、または他の蛍光検出機器によって、この相互作用から生成されたシグナルを蛍光を経由して検出することができる。真菌のグルカンもしくはマンナン、または真菌それ自体に結合する場合に、蛍光シグナルを生じるデクチンコートリポソームの図解モデルが、図１１及び２８Ａ中で示される。このコンストラクトは、真菌多糖類へのリポソーム結合及び後続のシグナル産生の両方が、洗浄ステップまたは追加の試薬の添加無しに、同じ単一臨床的ステップで起こる、１ステップアッセイを可能にする。例えばＫｉｌｐａｔｒｉｃｋｅｔａｌ．“ＡＧＰｒｏｔｅｉｎ－ＣｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＤｉｍｅｒＩｍａｇｉｎｇＡｓｓａｙＲｅｖｅａｌｓＳｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹＹ１／Ｙ５ＲｅｃｅｐｔｏｒＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．８７：７１８－７３２（２０１５））を参照されたい。

２ステップ及び３ステップの診断アッセイを可能にする例示的なコンストラクトは、図３中のローダミン蛍光リポソーム及び図１２中のホースラディシュペルオキシダーゼ連結リポソームにより図示される。両方の診断アッセイについて、過剰な未結合の診断用リポソームは第２のステップにおいて洗浄される。図４、５及び６中でのように、残存する結合されたローダミン標識リポソームの蛍光（図３）は、直接アッセイされ得る。ＨＲＰコートリポソーム（図１２）は、ＨＲＰ酵素活性のための基質（４－クロロ－１－ナフトール及び過酸化物）が添加され、約１０～約３０分間インキュベーションされる第３のステップを要求する。酵素の産物は、分光光度法でまたは顕微鏡においてアッセイされ得きる紫色の沈殿物である。このシグナルは、結合されたリポソームの量、及びしたがって真菌多糖類の量の尺度である。他のシグナル生成酵素はＨＲＰの代わりに使用され得、ルシフェラーゼ（光の放射のため）、β－グルクロニダーゼ及びβ－ガラクトシダーゼ（色産生のため）、ならびにプロタミン（ＭＲＩシグナルのため）が挙げられるがこれらに限定されない。任意の真菌細胞抗原標的化分子（例えば抗体またはその断片、アプタマー、小分子等）を使用して、結合の間にデクチンダイマー化を要求しない、真菌細胞及び真菌細胞成分のためのマルチステップリポソーム検出系が構築され得るだろう。

真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、標的化分子が蛍光タンパク質のＣ末端断片またはＮ末端断片へ連結されるかまたは融合される、リポソームも本明細書において提供される。したがって、リポソームは、真菌細胞抗原へ結合する標的化分子及び蛍光タンパク質のＣ末端またはＮ末端を含む、融合タンパク質を含む。これらの複数のリポソームも提供される。いくつかの例において、複数のものは、蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された標的化分子を含むリポソームの第１のサブセット、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された標的化分子を含むリポソームの第２のサブセットを含む。

いくつかの例において、標的化分子（例えば可溶性デクチン－１、デクチン－２、またはその断片）は、真菌細胞上のβ－グルカンまたはマンナンの結合に際してダイマーを形成する。蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された第１の標的化分子、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された第２の標的化分子を表面上で提示するリポソームが、真菌感染した対象（例えばいくつか挙げると、対象の眼、耳、喉、膣、鼻通路、皮膚、または爪）、または対象からのサンプル（例えば尿、血液、血清、涙液、喀痰、肺洗浄物、組織の擦過物またはホモジネート）と接触させられる場合に、リポソームの表面の中へ取り込まれた、可溶性のデクチン－１、デクチン－２、またはデクチン－３モノマーは、対象中にまたは対象からのサンプル中に存在する任意の真菌細胞上のβ－グルカンまたはマンナン、そしてこれらの真菌から放出された任意の可溶性のβ－グルカンまたはマンナンへの結合に際してダイマーを形成するだろう。ダイマー形成は、蛍光タンパク質のＣ末端断片と蛍光タンパク質のＮ末端断片との間の相互作用、すなわち補完（例えば二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ））に影響し、その結果、例えば蛍光顕微鏡、蛍光マイクロタイタープレートリーダー、蛍光フローセル分析器、または他の蛍光検出機器を使用することによって、この相互作用から生成されたシグナルを蛍光を経由して検出することができる。例えばＫｉｌｐａｔｒｉｃｋｅｔａｌ．“ＡＧＰｒｏｔｅｉｎ－ＣｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＤｉｍｅｒＩｍａｇｉｎｇＡｓｓａｙＲｅｖｅａｌｓＳｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹＹ１／Ｙ５ＲｅｃｅｐｔｏｒＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．８７：７１８－７３２（２０１５））を参照されたい。真菌のグルカンもしくはマンナン、または真菌それ自体に結合する場合に、蛍光シグナルを生じるデクチンコートリポソームの図解モデルが、図１１及び２８Ａ中で示される。このコンストラクトは、真菌多糖類へのリポソーム結合及び後続のシグナル産生の両方が、洗浄ステップまたは追加の試薬の添加無しに、同じ単一臨床的ステップで起こる、１ステップアッセイを可能にする。例えばＫｉｌｐａｔｒｉｃｋｅｔａｌ．“ＡＧＰｒｏｔｅｉｎ－ＣｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＤｉｍｅｒＩｍａｇｉｎｇＡｓｓａｙＲｅｖｅａｌｓＳｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹＹ１／Ｙ５ＲｅｃｅｐｔｏｒＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．８７：７１８－７３２（２０１５））を参照されたい。

標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＮ末端部分またはＣ末端部分を含む、融合ポリペプチドが本明細書においてさらに提供される。これらの融合ポリペプチドを使用して、真菌感染を検出することができる。いくつかの例において、標的化分子は、Ｃ型レクチン受容体、抗体、真菌細胞壁結合タンパク質、キチン結合タンパク質、またはその断片である。いくつかの例において、標的化分子は、デクチン－１、デクチン－２、デクチン－３、またはその断片である。いくつかの例において、蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質またはその誘導体である。

対象、または対象からのサンプルにおける真菌感染を検出するための方法であって、（ａ）対象、または対象からのサンプルを複数のリポソームと接触させ、複数の各々のリポソームが標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及びシグナル生成分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、標的化分子が標的真菌細胞抗原に結合する場合にシグナル生成分子が検出可能なシグナルを生成すること；及びｂ）シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、を含む、前記方法が本明細書において提供される。この方法を使用して、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで真菌感染を検出することができる。いくつかの例において、真菌細胞抗原は、細胞上の真菌細胞抗原である。他の例において、真菌細胞抗原は、生物学的サンプル中の可溶性真菌細胞抗原（例えばβ－グルカンまたはマンニン（ｍａｎｎｉｎ））である。いくつかの例において、標的化分子は、シグナル生成分子へ連結される。他の例において、シグナル生成分子は、リポソームの外側表面の中へ取り込まれるかまたは当該外側表面へ付着される。いくつかの例において、標的化分子は、シグナル生成酵素（例えばＨＲＰ、ルシフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ、及びβ－ガラクトシデアーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅａｓｅ））へ連結される。他の例において、標的化分子は、蛍光タンパク質（例えばローダミン、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等）へ連結される。蛍光タンパク質の断片（例えば任意の蛍光タンパク質のＮ末端またはＣ末端）は、標的化分子へ連結され得る。他の例において、標的化分子は、抗体またはその断片へ連結される。

対象、または対象からのサンプルにおける真菌感染を検出するための方法であって、（ａ）対象、または対象からのサンプルを複数のリポソームと接触させ、複数の各々のリポソームが、蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された標的化分子、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された標的化分子を含み、標的化分子が、真菌細胞上の標的抗原に結合すること、ならびに（ｂ）蛍光タンパク質のＮ末端とＣ末端断片との間の相互作用によって生成された蛍光シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、を含む、前記方法が本明細書において提供される。いくつかの方法において、蛍光シグナルは、紫外線光もしくは蛍光顕微鏡、または二分子蛍光補完の定量的蛍光検出のための機器（すなわちＢｉＦＣ分析）を使用して検出される。

真菌感染を検出するいくつかの方法において、複数の各々のリポソームは、ａ）蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された少なくとも約５００の標的化分子；ｂ）蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された少なくとも約５００の標的化分子を含む。例えば、リポソームは、蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された少なくとも約２５０、５００、１００、１５００、２０００、または２５００の標的化分子、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された少なくとも約２５０、５００、１００、１５００、２０００、または２５００の標的化分子を含み得る。

対象、または対象からのサンプルにおける真菌感染を検出する方法であって、ａ）対象、または対象からのサンプルを、標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＮ末端部分を含む、第１の複数の融合ポリペプチド、ならびに標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＣ末端部分を含む、第２の複数の融合ポリペプチドと接触させること；ならびにｂ）蛍光タンパク質のＮ末端とＣ末端断片との間の相互作用によって生成された蛍光シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、を含む、前記方法がさらに提供される。

いくつかの例において、複数のリポソームが、固体支持体上で固定化される。固体支持体材料の非限定的例としては、ガラス、修飾または官能化されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、ならびにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、またはＴｅｆｌｏｎＪが挙げられる）、ナイロン、ニトロセルロース、多糖類、樹脂剤、シリカまたはシリカベースの材料（ケイ素及び修飾ケイ素が挙げられる）、炭素、金属、無機ガラス、及びプラスチックが挙げられる。固体支持体のサイズ及び形状は変動し得る。固体支持体は平面であり得るか、固体支持体はウェルであり得るか、または代替的に、固体支持体はビーズもしくはスライドであり得る。いくつかの実施形態において、固体支持体は、マルチウェルプレートのウェルである。他の例において、固体支持体は、磁気ビーズ、アガロースベースの樹脂、またはアガロースビーズであり得る。他の例において、固体支持体は、非アガロースクロマトグラフィー媒質、モノリス、またはナノ粒子を含む。例えば、クロマトグラフィー媒質は、例えばメタクリレート、セルロース、またはガラスであり得る。他の例において、ナノ粒子は、金ナノ粒子または磁性ナノ粒子である。

全体を通して使用されるように、対象によって、個体が意味される。対象は、成人の対象または小児の対象であり得る。小児の対象は、生まれた時から１８歳の年齢中の範囲の対象を包含する。したがって、約１０歳、５歳、２歳、１歳、６か月齢、３か月齢、１か月齢、１週齢、または１日齢未満の小児の対象も、対象として含まれる。好ましくは、対象は、動物、例えば哺乳動物（霊長動物等）、及びより好ましくはヒトである。非ヒト霊長動物も同様に対象である。対象という用語は、飼育動物（ネコ、イヌ等）、家畜（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、及び実験用動物（例えばフェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモット等）を包含する。したがって、獣医学的使用及び医学的製剤が、本明細書において企図される。

本明細書において使用される時、生物学的サンプルは対象に由来したサンプルであり、任意の細胞、組織、または生物学的流体が挙げられるがこれらに限定されない。サンプルは、血液、血漿、血清、喀痰、尿、唾液、気管支肺胞洗浄液、生検（例えば肺、肝臓腎臓、皮膚等からの器官組織から単離された例えば組織または細胞）、膣分泌物、鼻汁、皮膚、胃液分泌、または骨髄試料であり得えるがこれらに限定されない。

対象は、植物または植物からの種子でもあり得る。生物学的サンプルは、植物にも由来し得るが、任意の細胞、組織、または植物滲出液に限定されない。サンプルは、葉、茎、根、花弁、萼片、雄しべ、心皮、及び種子の表面またはそれらの粉砕サンプルもしくは抽出物であり得るがこれらに限定されない。

真菌感染を治療または予防するための方法
対象における真菌感染を治療または予防するための方法も提供される。方法は、有効量の複数の本明細書において記載されるリポソームのうちの任意のものを、真菌感染を有するかまたは真菌感染を発症するリスクがある対象へ投与することを含み、複数の各々のリポソームが抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、抗真菌剤がリポソーム中にカプセル化される。本明細書において提供されるリポソームまたは複数のリポソームのうちの任意のものは医薬組成物であり得る。

当該方法を使用して、任意の動物（例えばヒト）における真菌感染を治療または予防することができる。ヒト真菌感染の例としては、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ等）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ属の種（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ等）、Ｃａｎｄｉｄａ属の種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ａｕｒｉｓ等）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ属の種（Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓ及びＣ．ｐｏｓａｄａｓｉｉ等）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ及びＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属の種（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ等）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ属の種（Ｐ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ等）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ属の種（Ｓ．ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ等）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｎｅｆｆｅｉ（以前はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍが挙げられるがこれらに限定されない。

全体を通して、治療する、治療すること、及び治療は、真菌感染の１つまたは複数の影響または症状を低減または遅延させる方法を指す。対象は、真菌感染と診断され得る。治療は、単なる症状ではなく背景病理を低減する方法も指し得る。対象への投与の効果は、疾患の１つもしくは複数の症状の低減、疾患の重症度の低減、疾患の完全な除去、または１つもしくは複数の症状の開始もしくは悪化の遅延であるがこれらに限定されない効果を有し得る。例えば、開示される方法は、治療の前の対象に比較した場合に、または対照の対象もしくは対照値に比較した場合に、対象における疾患の１つまたは複数の症状に約１０％の低減があるならば、治療であると判断される。したがって、低減は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。

本明細書において使用される時、予防する、予防すること、または予防によって、疾患または障害の発症、発生率、重症度、または再発を妨げるか、遅延させるか、回避するか、除去するか、妨害するか、停止するか、または妨害する方法が意味される。例えば、開示される方法は、治療を受けなかった真菌感染または真菌感染の再発が起こりやすい対照の対象に比較して、真菌感染または真菌感染の再発が起こりやすい対象における真菌感染の発症、発生率、重症度、または再発の低減または遅延があるならば、予防であると判断される。真菌感染の発症、発生率、重症度、または再発の低減または遅延は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％またはその間の任意の量の低減であり得る。

いくつかの方法において、対象は、免疫不全である。例えば、対象は、いくつか挙げると、幹細胞、器官、組織、もしくは骨髄の移植を受けた対象、がんを有する対象、がん療法（例えば化学療法、免疫療法、または放射線療法）を受ける対象、コルチコステロイドを服用する対象、ＨＩＶに感染したかもしくは後天性免疫不全症候群を有する対象、肝炎を有する対象、Ｂ細胞欠損の対象、またはＴ細胞欠損の対象であり得る。

いくつかの方法において、対象は、対象の肺機能に影響する１つまたは複数の障害（例えば肺線維症、肺炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、結核、肺気腫、またはサーコイドーシス）を有する。

本明細書において提供される方法は、真菌感染が有るかまたは真菌感染のリスクがある対象を選択することを任意選択で含む。当業者は、真菌感染の対象を診断する方法に精通していている。例えば、健康診断が遂行され得る。以下の試験：臨床サンプルの顕微鏡検査、組織病理学、培養、及び血清学のうちの１つまたは複数も、使用され得る。臨床サンプルの分子診断学及び抗原検出も使用され得る（例えばＫｏｚｅｌａｎｄＷｉｃｋｅｓ“ＦｕｎｇａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．４（４）：ａ０１９２９９（２０１４）を参照）。

本明細書においてさらに提供される方法は、有効量の第２の治療剤または療法を対象へ施すことを任意選択で含む。第２の治療剤または療法は、複数のリポソームの投与の前に、それと同時に、またはそれに後続して、対象へ施され得る。いくつかの方法において、第２の治療法は、外科手術である。いくつかの方法において、第２の治療剤は、第２の抗真菌剤である。抗真菌剤は、上で記載されるポリエン系抗真菌物質、アゾール系抗真菌物質、イミダゾール、トリアゾール、またはエキノキャンディンのうちの任意のものであり得る。

医薬組成物
有効量という用語は、全体を通して使用されるように、所望される生理的応答を生じ、例えば、真菌感染を治療または予防するのに必要な任意の量として定義される。投与のための投薬量範囲は、疾患または障害の１つまたは複数の症状が影響される（例えば低減または遅延される）、所望される効果を生じるのに十分な大きさのものである。投薬量は、実質的な有害副作用（望まれない交差反応、望まれない細胞死、及び同種のもの等）を引き起こす程多量であるべきでない。概して、投薬量は、阻害物質の型、対象の種、年齢、体重、全体的な健康、性別、及び食餌、投与のモード及び時間、排泄率、薬物の組み合わせ、ならびに特定の病態の重症度により変動し、当業者によって決定され得る。投薬量は、任意の禁忌の事象において個別の医師によって調整され得る。投薬量は変動することができ、１用量で投与され得るか、または毎日もしくは延長した間隔で複数の用量で投与され得る。

本明細書において記載されるリポソームのうちの任意のものは、組成物（例えば医薬組成物）で提供され得る。組成物は、本明細書において開示される１つまたは複数のリポソームを含み得る。任意選択で、１つまたは複数のリポソームを含む組成物は、キット中にある。医薬組成物としては、例えば治療有効量の本明細書において記載されるリポソームのうちの任意のもの及び医薬担体を含む、医薬組成物が挙げられる。担体という用語は、化合物または組成物と組み合わせた場合に、調製、貯蔵、投与、送達、実効性、選択性、またはその意図された使用もしくは目的のための化合物もしくは組成物の他の特色を、支援または容易にする、化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最小限にし、対象における任意の有害な副作用を最小限にするように選択され得る。かかる薬学的に許容される担体としては、滅菌された生体適合性のある医薬担体が挙げられ、生理食塩水、緩衝生理食塩水、人工的脳脊髄液、デキストロース、及び水が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において記載されるリポソームのうちの任意のものを含む医薬組成物は、標準的な技法に従って調製され得、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。概して、通常の生理食塩水は、薬学的に許容される担体として用いられるだろう。他の好適な担体としては、例えば水、緩衝水または緩衝生理食塩水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシン、デキストロース、及び同種のものが挙げられ、安定性促進のための糖タンパク質（アルブミン、リポタンパク質及びグロブリン等）が挙げられる。これらの組成物は、通常滅菌されている。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含有し得る。かかる賦形剤としては、それ自体で、組成物を投与される個体へ有害な免疫応答を誘導せず、過度の毒性無しに投与され得る任意の医薬剤が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、糖、及びエタノール等の液体が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、及び同種のもの等）；及び有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、及び同種のもの等）は、その中に含まれ得る。追加で、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、及び同種のもの等の補助物質は、かかるビヒクル中に存在し得る。これらの材料を含有する薬学的に許容される担体、賦形剤、及び製剤の調製は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＬｏｙｄＶ．Ａｌｌｅｎｅｔａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ（２０１２）中で記載される。

水溶液は、使用のためにパッケージングされ得るか、または無菌条件下で濾過及び凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌された水溶液と組み合わせられる。組成物は、生理学的条件に近づけるために要求されるような薬学的に許容される補助物質（ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤、ならびに同種のもの、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム等）を含有し得る。追加で、リポソーム懸濁物は、貯蔵に際してのフリーラジカル及び脂質過酸化損傷に対して脂質を保護する、脂質保護剤を含み得る。親油性フリーラジカルクエンチャー（アルファトコフェロール等）及び水溶性鉄特異的キレーター（フェリオキサミン等）が、好適である。

医薬製剤中のリポソームの濃度は、広く変動し、すなわち、重量当たりで約０．０５％未満から、通常約２～５％でまたは少なくとも２～５％で、１０～３０％ほどまでであり得、選択される特定の投与モードに従って、主として液体体積、粘度によって選択されるだろう。または、リポソームは乾燥もしくは凍結乾燥され、使用時に水もしくはバッファー中で所望される濃度へ再懸濁され得る。リポソームの量または投与されるリポソーム中の活性薬剤の量は、使用された特定の標識、診断されている疾患状態、及び臨床医の判断に依存するが、概して体重１キログラムあたり約０．０１～約１５０ｍｇ、好ましくは約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の間、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ体重の間であり、それは単回用量でまたは個別の用量（１日あたり１～４回等）の形態で投与され得る。投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日またはそれ以上遂行され得る。当業者は、薬剤及びそれを受ける対象の具体的な特徴に基づいて、以下に記載されるように投薬量を調整するだろう。

本明細書において開示される組成物は、局所的または全身的な治療が所望されるかどうかに、及び治療される領域に依存して、多数の手法で投与される。組成物は、複数の投与経路のうちの任意のものを介して投与され、経口、鼻内、吸入経由、ネブライザー経由、非経口、静脈内、腹腔内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、脳室内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的な投与が挙げられる。医薬組成物は、例えば局所適用または局所注射によって、治療を必要とする領域へ局所的にも送達され得る。医薬組成物は、ポンプを経由してまたは外科手術部位でも送達され得る。本明細書において記載される投与方法の任意のものについての有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系に由来する用量－応答曲線から推測され得る。

開示される方法及び組成物のために使用され得るか、それらと併用して使用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの産物である、材料、組成物、及び構成要素が開示される。これら及び他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合に、これらの化合物の各々の様々な個別の及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な参照が明示的に開示されなくてもよいが、各々は本明細書において具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び検討され、当該方法中に含まれる多数の分子へ行われ得る多数の修飾が検討されるならば、当該方法の各々及びすべての組み合わせ及び順列ならびに可能な修飾は、相反することが具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、任意のサブセットまたはこれらの組み合わせも具体的に企図及び開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップが挙げられるがこれらに限定されない、本開示のすべての態様へ適用される。したがって、遂行され得る様々な追加のステップがあるならば、任意の具体的な方法ステップまたは開示される方法の方法ステップの組み合わせにより、これらの追加のステップのうちの各々が遂行され得ること、及び、各々のかかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットは具体的に企図され、開示されたと判断されるべきであることが理解される。

本明細書において引用される出版物、及びそれらが引用される資料は、その全体が参照することによって具体的に本明細書に援用される。

以下の実施例は、限定ではなく単なる例示の手段として提供される。当業者であれば、本質的に同じまたは類似の結果をもたらすように変化または修飾され得る、多様な重要でないパラメーターを容易に認識するだろう。

実施例１
デクチン－１
真菌の増殖
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ株Ａ１１６３を、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅリボソームタンパク質２７プロモーターの制御下の緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰ（いくつかの実験において真菌細胞をモニターするために使用した）を保有する、Ｋａｎｇｅｔａｌ．（“Ａｄｕａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂａｓｅｄ，ｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｏｌｆｏｒＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａａｎｄＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ．ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔＢｉｏｌ４２：４８３－４９２（２００５））中で記載されるプラスミドｐＢＶ１２６により形質転換して、株ＡＥＫ０１２を得た。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ胞子を、Ｖｏｇｅｌの最少培地中のプレート（ＶＭＭ、１％のグルコース、１．５％の寒天）上で７日間増殖させ、分生子をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ中で収集した。蛍光リポソーム局在化ならびに増殖阻害及び殺傷のアッセイのために、２０，０００及び４，５００のＡＥＫ０１２分生子を、ＶＭＭ、１％のグルコース、０．５％のＢＳＡ中で、それぞれ２４ウェル及び９６ウェルのポリ－Ｌ－リジンコーティングプレート上に、３７℃で８時間から４日の範囲の様々な期間でプレーティングした（Ｍｏｍａｎｙ２００１Ｃｈａｐｔｅｒ７．ＵｓｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｙｃｌｅ，ｐ１１９－１２５．ＩｎＴａｌｂｏｔＮＪ（ｅｄ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥｘｅｔｅｒ，Ｅｘｅｔｅｒ，ＵＫ；及びＳａｓａｋｉｅｔａｌ．（ＨｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌｓｇａｍｍａＨ２ＡｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ．ＥｕｋａｒｙｏｔＣｅｌｌ１３：９９０－１０００（２０１４））。ＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓＳｃ５３１４及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓＨ９９は、ポテトデキストロース液体培地中で一晩前増殖させた。次いで細胞を滅菌水により３回洗浄し、ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地中で再懸濁し、ポリ－Ｌ－リジンコートプレート上で３７℃で１０時間増殖させた。すべての真菌細胞の増殖をＢＳＬ２実験室中で実行した。リポソーム染色された真菌の蛍光画像化のために、すべての３つの真菌をＰＢＳにより３回洗浄し、ＰＢＳ中の４％のホルムアルデヒド中で１５～６０分間固定し、１回洗浄し、ＰＢＳ中で４℃で保存した。

可溶性デクチン－１の産生
ｐＥＴ－４５Ｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）の中へクローン化したＭｓ－ｓデクチン－１による例示的なコドン最適化Ｅ．ｃｏｌｉ発現コンストラクトの配列を、図１中で示す。このコンストラクトは、ベクターに規定されたＮ末端（Ｈｉｓ）_６親和性タグ、フレキシブルスペーサー、２つのリジン残基、別のフレキシブルスペーサー、続いてＣ末端の１７６アミノ酸のマウスｓデクチン－１ドメインを含有する、わずかに修飾した１９８アミノ酸の長さのｓデクチン－１タンパク質をコードした。ＩＰＴＧ誘導無しのＬｕｒｉａブロス中で一晩増殖させた１Ｌの細菌培養（ＢＬ２１株）によりスタートして、およそ４５ｍｇ／Ｌの２２ｋＤａのｓデクチン－１を得た（図２）。ｓデクチン－１を、ｐＨ＝８．０、６Ｍの塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ、ＦｉｓｈｅｒＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓＢＰ１７８）、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＢＭＥ、０．１％のトリトンＸ１００中で細胞沈殿から抽出した。ｓデクチン－１をこのバッファー中でニッケル親和性樹脂（ＱｉａＧｅｎ、＃３０２１０）へ結合させ、ｐＨ６．３へ調整したこのバッファー中で洗浄し、ｐｈ４．５へ調整したこのバッファー中で溶出させた。溶出させたタンパク質のｐＨを、長期貯蔵のために１ＭのｐＨ１０．０ＭのトリエタノールアミンによりｐＨ７．２へ直ちに中和した。４０ｍｇの９５％を超える純粋なタンパク質を回収した（図２）。添加された新鮮な５ｍＭのＢＭＥを含むこの同じＧｕＨＣｌバッファー中の６ｕｇ／ｕＬのｓデクチン－１のサンプルを、トリエタノールアミンによりｐＨ８．３へさらに調整し、４モル過剰量の脂質担体試薬ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－３４００－ＮＨＳ（Ｎａｎｏｓｏｆｔｐｏｌｙｍｅｒｓ、１５４４－３４００）を２３℃で１時間反応させて、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＤＥＣを作製した。復元及び保存のバッファーＲＮ＃５（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ７．２、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中のＢｉｏ－ＧｅｌＰ－６アクリルアミド樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１５０－０７４０）上でのゲル排除クロマトグラフィーを使用して、取り込まれていないＤＳＰＥ－ＰＥＧ及びＧｕＨＣｌを除去した。ＲＮ＃５の組成を、多数の穏やかな変性バッファー及びクラウディングバッファー（それらの大部分は、修飾デクチン－１タンパク質が数日後に溶液から脱落する結果となった）の試験によって、経験的に決定した。タンパク質は、ＲＮ＃５中で保存した場合に溶液中で無期限に残り、ＢＭＥにより新たに還元すれば、ＲＮ＃５から正常な生物学的バッファーへと希釈された場合に活性のある炭水化物結合形態へ容易に復元することができる。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＢＳＡを、同じプロトコールによってウシ血清アルブミンＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ａ－８０２２）から調製した。

アンホテリシンＢ、ｓデクチン－１、ＢＳＡ、及びローダミンのリポソームの中への遠隔ローディング
滅菌ＰＥＧ化リポソームをＦｏｒｍｕＭａｘＳｃｉ．Ｉｎｃ．から得た（ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、５０：４５：５モル％、１００ｎｍの直径、リポソーム懸濁物中で６０ｕモル／ｍＬ脂質、約４×１０^１２リポソーム／ｍＬ、＃Ｆ１０２０３Ａ）。市販のＡｍＢｉｓｏｍｅ（注射のためのアンホテリシンｂリポソーム、Ｇｉｌｅａｄ、Ａｖａｎｔｉ）は、およそ１１モルパーセントＡｍＢを含有する。リポソームの小バッチを、リポソーム脂質に対して１１モルパーセントアンホテリシンＢ（ＡｍＢ、ＳｉｇｍａＡ４８８８）と共に、遠隔でロードして、ＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬを作製し、これを、この研究を通して使用した。例えば、ＡｍＢ（１．８ｍｇ、１．９５ｕモル）を、６０℃で１０～２０分間加熱し、時折混合することによって１３ｕＬのＤＭＳＯ中で溶解して、油様の透明な茶色のＡｍＢ溶液を得た。２５０ｕＬの滅菌リポソーム懸濁物（１５ｕモルのリポソーム脂質）をＡｍＢ－油へ添加し、回転台上で３７℃で９６時間混合し、その時に大部分のＡｍＢはリポソームの中へインターカレートされた。取り込まれていないＡｍＢ（０．３ｕモル）は、Ａ４０６での分析によって定量化されるように油相中に残存したが、１．６５ｕモルがリポソーム中で結合し、リポソームは脂質のモルに対して１１モルパーセントのＡｍＢとなった。分離した調製においてＢｉｏＧｅｌＡ－０．５Ｍのアガロース樹脂（ＢｉｏＲａｄ１５１－０１４０）でのゲル排除クロマトグラフィー及びＡ４０６の除外された画分の調査から、１１モルパーセントのＡｍＢがリポソーム中で保持されることが確認された。より多い量またはより少ない量のＡｍＢを、油相中でより高い量またはより低い量のＡｍＢでスタートすることによって、リポソームの中へロードすることができる。およそ１１モルパーセントのＡｍＢを備えたこれらのリポソームは、全体にわたってＡｍＢ－ＬＬと称される。

ＲＮ＃５バッファー中のＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ｓデクチン－１コンジュゲート及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＢＳＡコンジュゲートを、６０℃で６０分間のインキュベーションによって、リポソーム脂質のモルに対して、それぞれ１．０及び０．３３モルパーセントのタンパク質でＡｍＢ－ＬＬのリン脂質二重層膜の中へのそれらのＤＳＰＥ部分を経由して組み込んで、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ及びＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬを作製した。この同じ６０℃インキュベーションの間に、赤色蛍光タグ（リサミンローダミンＢ－ＤＨＰＥトリエタノールアミン塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｌ１３９２））も、リポソーム脂質に対して２モルパーセントで取り込んだ（Ｙａｏｅｔａｌ．ｐＨＬＩＰ（Ｒ）－ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＰＥＧｙｌａｔｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅｓｔｏｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＪＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ１６７：２２８－２３７（２０１３）；Ｈｅｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＰＣＲ：ａｇｅｎｅｒｉｃｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎｔｉｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＪＮａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：２６（２０１２）；及びＧａｒｒｅｔｔｅｔａｌ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓｆｕｓｅｗｉｔｈｓｐｅｒｍｃｅｌｌｓａｎｄｉｎｄｕｃｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｉｍｐｅｒｍｅａｎｔａｇｅｎｔｓ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１４１７：７７－８８（１９９９））。ＢｉｏＧｅｌＡ－０．５Ｍ樹脂でのゲル排除クロマトグラフィーから、リポソームの中へのローダミン－ＤＨＰＥ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧタンパク質挿入がこれらのモル比で本質的に定量的であることが確認された。４℃で保存したＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、およそ２か月間結合特異性を保持した。自由条件下の保管は、シェルフライフを延長することができる。

リポソーム結合の顕微鏡法
ホルマリン固定または生の真菌細胞または動物細胞を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ（ＰＢＳｐＨ７．２、０．５％のＢＳＡ、５ｍＭのＢＭＥ）中のＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬリポソーム、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬリポソーム、及びＡｍＢ－ＬＬリポソームによりインキュベーションし、未結合のリポソームを、同じＬＤＢ中の１５分間～２時間のインキュベーション（個別の図を参照）後に洗浄した。ローダミン赤色蛍光リポソーム、緑色ＥＧＦＰのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、及び微分干渉（ＤＩＣ）照射細胞の画像を、ＬｅｉｃａＤＭ６０００Ｂ自動化顕微鏡で６３×の油浸下で撮った（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ）。細胞をプレートから取り出し、顕微鏡用スライド上に広げた。７つのＺスタック画像を１ミクロン間隔で記録し、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＣ２０１８でマージした。マイクロタイタープレート上の細胞の明視野画像及び／または赤色蛍光画像及び／または緑色蛍光画像を、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７０倒立顕微鏡及びＯｌｙｍｐｕｓＰＥＮＥ－ＰＬ７デジタルカメラで１０×、２０×、または４０×で直接撮り、明視野レイヤー及び／またはカラーのレイヤーをＰｈｏｔｏｓｈｏｐでマージした（図４Ｃ～４Ｆ、５Ｃ～５Ｆ、６Ｃ～６Ｆ）。

細胞増殖及び生存率アッセイ
リポソームストックを８００ｕＭのＡｍＢで保存し、最初にリポソーム希釈バッファー（ＬＤＢ）または増殖培地の中へ２～２０倍希釈し、次いで示された濃度で、使用のための細胞の増殖培地の中へさらに１０倍または２０倍希釈した。全希釈は、典型的には２５０倍～４，０００倍の範囲であった。２０ｕＬの基質を使用して、１００または２００ｕＬの増殖培地中の真菌細胞または動物細胞を処理し、３７℃で４時間インキュベーションしてから、５０ｕＬの３％のＳＤＳの添加によって反応を停止して、製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ、文書＃Ｇ８０８０）に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）細胞生存率アッセイを遂行した。エステラーゼＣＴＢ産物の赤色蛍光（励起４８５／発光５９０）を、ＢｉｏｔｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨＴマイクロタイタープレートリーダーにおいて測定した。６つのウェルからのデータを各々のデータポイントについて平均化し、標準誤差を計算した（図８Ａ、８Ｃ）。発芽（図８Ｅ～８Ｆ）及び菌糸の長さ（図８Ｂ、８Ｄ）アッセイについてのデータを、１０×及び／または２０×で撮った複数の写真画像から手動で収集した。細胞を４％のホルムアルデヒド及びＰＢＳ中で固定した後に、ＥＧＦＰ発現Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓＡ１１６３細胞の生存率の緑色蛍光アッセイを、励起４９５／発光５２０でマイクロタイタープレートリーダーで遂行した（図９）。

結果
アンホテリシンＢをロードしたｓデクチン－１コートリポソームの調製
ＰＥＧ化リポソームを、リポソーム脂質のモルに対して１１モルパーセントのＡｍＢで遠隔でロードして対照のＡｍＢロードリポソーム（ＡｍＢ－ＬＬ）を作製し、それは、構造及びＡｍＢ濃度において、市販のＡｍＢｉｓｏｍｅ（ＧｉｌｅａｄＡｍＢｉｓｏｍｅ）に類似する。ｓデクチン－１（ＤＥＣ、図１、図２）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、ＰＥＧ化脂質担体（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）により修飾した。１モルパーセントのＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＤＥＣをＡｍＢ－ＬＬの中へ取り込んでｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬを作製し（図３）、０．３３モルパーセントのＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＢＳＡをＡｍＢ－ＬＬの中へ取り込んでＢＳＡ－Ａｍｂ－ＬＬを作製した。ｓデクチン－１（ＭＷ２２ｋＤａ）及びＢＳＡ（ＭＷ６５ｋＤａ）のこのモル比は、リポソームの両方のセットをコートする同等なｕｇ量のタンパク質をもたらす。これらのタンパク質をコートするリポソームが同じＡｍＢ－ＬＬから作製されたので、すべて３つのリポソーム調製物は、脂質のモルに対して１１モルパーセントのＡｍＢを含有する。２モルパーセントのＤＨＰＥ－ローダミンをすべて３つのクラスのリポソームの中へロードして、赤色蛍光ＡｍＢ－ＬＬ、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬ、及びＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬを作製した。

ｓデクチン－１コートリポソームＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、真菌細胞へ強く結合する
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ発芽体で遂行したアッセイにおいて、ローダミン赤色蛍光ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、図４中で示されるように膨潤した分生子及び発芽管へ強く結合した。ｓデクチン－１標的化リポソームは、多くの場合、特定の領域へ多数で結合するかまたは凝集した。１００ｎｍのリポソームは小さすぎるので光学顕微鏡法によって解像することができないが、個別のリポソームは、やや均一なサイズの小さな赤色蛍光ドットとして目視可能である（橙色矢印、図４Ａ）。各々のリポソームが１０００を上回るローダミン分子を含有するので（図３）、それらは各々、単一リポソームとして目視されるのに十分な強さで蛍光を発する。本質的にすべての発芽体はＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬに結合する（図４Ｃ及び４Ｄ）。発芽していない分生子への結合は検出されなかった（図示せず）。ＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬ（図４Ｂ）及びウシ血清アルブミンコートリポソームＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬ（図４Ｅ及び４Ｆ）は、分生子または発芽管へ検出可能に結合しなかった。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬによる最大標識は１５～３０分間以内に達成され、プレートを４℃でＰＢＳ中で暗所で保存した場合に、細胞へ結合したＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬの強い赤色蛍光シグナルは数週間維持された。

ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、図５中で示されるように、多くの成熟細胞からの膨潤した分生子及び菌糸へも結合した。この場合もやはり、ｓデクチン－１－標的化リポソームは多くの場合塊で結合したが、いくつかのかなり均一なサイズの個別の小さな赤色ドットは、目視可能であり、それらは個別の蛍光リポソームであるように見える（橙色矢印、図５Ａ）。発芽管の標識とは異なり、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、様々なｓデクチン－１調製物の結合についての初期の報告中でのように、成熟した菌糸のサブセットのみへ結合した（図５Ｃ及び５Ｄ）。ＡｍＢ－ＬＬは成熟した菌糸へ検出可能に結合せず（図５Ｅ及び５Ｆ）、また、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬも結合しなかった（図示せず）。最終的に、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓの菌糸及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓＨ９９細胞も標識した（図６）。簡潔に言えば、デクチンをコートしたアンホテリシンＢロードリポソームは、真菌細胞へ効率的に結合したが、非コートＡｍＢｉｓｏｍｅ様リポソーム及びＢＳＡコートリポソームは結合しなかった。

固定及び生の真菌細胞へのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ及び対照ＬＬの結合を、未結合のリポソームを洗浄した後に、個別の蛍光リポソーム及び蛍光リポソームの塊（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌糸の密集した視野へ結合したもの）の数のカウントによって定量した。図７Ａ～Ｆは、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、対照リポソーム、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬ、またはＡｍＢ－ＬＬよりも１００倍超の高頻度で固定及び生の菌糸へ結合したことを示す。図７Ｇ～Ｉは、ｓデクチン－１コートＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬの結合が、可溶性β－グルカン（ラミナリン）の添加によって５０倍超阻害されるが、スクロースによっては阻害されないことを示し、真菌細胞への結合がβ－グルカンに特異的であることを証明する。

ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬによる真菌の殺傷及び増殖阻害
様々な真菌細胞増殖及び生存率アッセイを、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの様々な株について、２～３ｕＭのＡｍＢの推定ＥＤ_５０及び０．５～１ｕＭのＡｍＢの推定ＭＩＣの付近のＡｍＢ濃度を送達するリポソームによりＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓを処理した後に、遂行した。大部分のこれらの実験において、４，５００の分生子を発芽させ、薬物ロードリポソームと一緒に９６ウェルマイクロタイタープレート中で３６～５６時間インキュベーションした。図８は、標的化ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ（デクチン－１をコートしたＡｍＢロードリポソーム）が、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬまたは非コートＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞をはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖を阻害したことを示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（ＣＴＢ）試薬によるアッセイは、３ｕＭのＡｍＢを送達するＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬによる細胞の処理が、ＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡコートリポソームＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬ（同じ量の薬物を保有する）よりも、一桁多く有効にＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓを殺傷したことを示した（図８Ａ）。ＣＴＢ試薬は、細胞の完全性及び生存率についての代用として、全細胞質エステラーゼ活性をアッセイする。リポソーム活性をスコアリングする第２の方法として、菌糸の長さを調査した。菌糸の長さアッセイは、３ｕＭのＡｍＢを送達するＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、菌糸成長の阻害ではるかに有効だったことを示す、意外にも類似する結果をもたらした（図８Ｂ）。完全な生物学的反復実験において、異なるＡｍＢ遠隔ローディング方法、独立したｓデクチン－１及びＢＳＡ、ならびにローダミンローディング、ならびに異なるリポソーム希釈バッファーを使用して、３ｕＭのＡｍＢを送達する場合に、類似するが、わずかに劇的でない結果が得られた（図８Ｃ及び８Ｄ）。ＣＴＢ試薬及び菌糸の長さのアッセイは、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの殺傷または増殖の阻害で、ほぼ一桁多く有効であったことを示した。

様々なリポソーム調製物の存在下において発芽した分生子のパーセントを測定する、リポソームＡｍＢ活性の追加のアッセイを用いた（図８Ｅ及び８Ｆ）。わずか０．０９ｕＭ及び０．１８７ｕＭのＡｍＢを送達するＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子の発芽を数倍有効に阻害した。

リポソーム活性の第４のアッセイを使用して、ＥＧＦＰを発現するＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＡＥＫ０１２株によって生じられる内在性蛍光の緑色シグナル（図９）を調査した。緑色蛍光のレベルをアッセイする場合に、この場合もやはり、２ｕＭまたは０．６７ｕＭのいずれかのＡｍＢを送達するＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、真菌細胞増殖の阻害でより有効であった。要約すると、様々なアッセイは、標的化ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、非コートＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡコートＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞をはるかに効率的に殺傷したかまたは増殖もしくは発芽を阻害したことを実証した。

図８Ｇ中で示される分生子のパーセント発芽をアッセイする用量－応答曲線は、３つの型のリポソームのパフォーマンスにおける幅広い隔たりを例証する。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは他の２つの型のリポソームより優れ、活性は濃度に比例し、それらは、広範囲の濃度にわたってＡｍＢ－ＬＬより優れている。恐らくＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬが、ＡｍＢ－ＬＬが結合することを可能にする真菌原形質膜へのリポソーム膜のランダムアクセスをブロックするので、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬは常に最も性能が悪い。これらのアッセイのタイミングは、これらの曲線の正確な形状に影響し、早期に遂行されたアッセイは低濃度で差をより良好に分離し、より長いインキュベーションは、より高度に細胞増殖を阻害するため、最も高い濃度のＡｍＢで差を分離する。このことは、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬが対照リポソームよりも優れている濃度の全体の範囲にわたって、リポソーム調製物の中での最適な差をアッセイすることを困難にした。しかし全体的には、３つのクラスのリポソームの関係性は常に同じままである。

ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬの動物細胞結合及び毒性の低減
ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３細胞生存率についてのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅアッセイは、デオキシコール酸塩ミセル懸濁物中のＡｍＢ－ＬＬ及びＡｍＢが、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりもＨＥＫ２９３細胞に対してより毒性であったことを示した（図１０）。タンパク質によるリポソームのコーティングは、恐らく動物細胞の原形質膜によるそれらの取り込みを減速する。細胞を１５または３０ｕモルのＡｍＢを送達する様々な調製物により２時間処理し、ＡｍＢを含有する過剰材料を洗浄し、３７℃で一晩増殖させ、次いでアッセイした。

診断
５００の標的化分子（例えばフレキシブルリンカーを経由してＶｅｎｕｓ緑色蛍光タンパク質のＮ末端半分へ融合されたｓデクチン－１モノマー（例えばＤＥＣ１－ＶＮ））によりコートされ、同様に５００の標的化分子（例えばフレキシブルリンカーを経由してＶｅｎｕｓのＣ末端半分へ融合されたｓデクチン－１モノマー（ＤＥＣ１－ＶＣ））によりコートされたリポソームは、低い濃度の真菌β－グルカンを、急速に認識し、結合して、ｓデクチン－１ダイマーを形成し、Ｖｅｎｕｓをアセンブルし、強い緑色二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルを生じるだろう。これらの例示的なＢｉＦＣレポーターコンストラクトのＤＮＡ及びタンパク質配列についての配列番号：１３、１４１５及び１６（図１Ｍ、１Ｎ、１Ｏ、及び１Ｐ）を参照されたい。追加の配列のデクチン－２ＢｉＦＣ融合物についての配列番号：１７、１８、１９、２０（図１Ｑ、１Ｒ、１Ｓ、１Ｔ、及び図２７Ｄ中の図解）も参照されたい。本明細書において提供されるコンストラクトのうちの任意のものにおいて、標的化配列のＮ末端またはＣ末端断片を使用することができる。例えば、デクチン－１、デクチン－２、またはデクチン－３のＮ末端またはＣ末端断片である。いくつかの例において、各々のリポソーム上の何百または何千のｓデクチン－１モノマーの存在は、検出の迅速性及び感度を保証する。このアッセイは、デクチンが、細胞上または溶液中のグルカンまたはマンナンへ、ダイマーとしてのみ緊密に不可逆的に結合するという事実に依存する。

任意選択で、これらの真菌標的化リポソームが不溶性マトリックスへ付着されている場合に、標準的な蛍光装置類を使用して、大量の対照バッファー及び血清中のさらに低濃度の真菌細胞表面分子（例えばβ－グルカン）をインビトロで検出することができる。不溶性マトリックスへの結合は、感度の良い検出のために、大量のサンプル材料へ曝露すると同時に蛍光シグナルをより小さな体積に濃縮して保つ。血清に加えて、固定化されたリポソームは、尿、肺洗浄液、または可溶化した組織抽出物中の真菌及び可溶性真菌細胞壁物質をアッセイすることができた。

いくつかの例において、標的化リポソームを使用して真菌マンナンを検出することができる。これは、例えば蛍光タンパク質のＮ末端半分へ融合された約５００のｓデクチン－２モノマー（例えばＶｅｎｕｓＤＥＣ２－ＶＮ）によりリポソームをコートし、相補的な蛍光タンパク質のＣ末端半分へ融合された約５００のｓデクチン－２またはデクチン－３モノマー（Ｖｅｎｕｓ、ＤＥＣ２－ＶＣ、ＤＥＣ３－ＶＣ）により同じリポソームをコートすることによって達成することができる。デクチン－２のホモダイマーは、真菌壁マンナンへ強く結合するが、モノマーは有意に結合しない。デクチン－２とデクチン－３との間のヘテロ二量体は、それらの個々のホモダイマーよりも、マンナンを強く結合することができた。

この系は、アッセイが、（１）血清をリポソームマトリックスと組み合わせて６０分間以内に完了すること、（２）１ステップで完了すること、（３）非常に低い濃度の多糖類を高感度で検出すること、（４）低価格であること、（５）最少の操作者の訓練及び専門知識が要求されること、及び／または（６）ほぼすべての真菌病原体を検出することを可能にするだろう。これらのリポソームは、血液、血清、尿、肺滲出液、肺、眼、喉、膣、皮膚、ならびに手指の爪及び足指の爪中の侵襲性真菌の１ステップアッセイを可能にするに違いない。図１１は、真菌のβ－グルカン及びマンナン多糖類の１ステップの検出についての自由浮遊のまたは固定化されたデクチンコートリポソームの１つの可能なモデルを図示する。１ステップの検出によって、標的細胞壁構成成分へのリポソームの結合及びシグナル生成が、生化学的に連結され、すなわち検出が、追加のプロセッシングステップまたは試薬についての必要性無しに起こることが意味される。

タンパク質が容易に凝集し、水性バッファー中で不溶性且つ不活性になるので、マウスまたはヒトのｓデクチン－１の生化学的産生は複雑であった。本明細書において示されるように、ｓデクチンの溶解性の問題は、様々なアプローチ（非常に短い荷電したペプチドタグの使用、タンパク質の抽出、精製、及び化学修飾の間の６ＭのＧｕＨＣｌの含有、タンパク質可溶化剤（１Ｍのアルギニン）を含有するバッファー中での復元、リポソームローディング、及び貯蔵の遂行、ならびにスルフヒドリル還元剤の含有が挙げられる）を組み合わせることによって克服された。

以前の報告は、マウスｓデクチン－１が、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの膨潤した分生子及び発芽管へ効率的に結合するが、たとえあったとしても成熟した菌糸へ非能率的に結合し、発芽していない分生子へ全く結合しないことを示した（Ｓｔｅｅｌｅｅｔａｌ．Ｔｈｅｂｅｔａ－ｇｌｕｃａｎｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｃｔｉｎ－１ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ１：ｅ４２（２００５））。菌糸への結合の欠如は、成熟した静止細胞の表面上のβ－グルカンレベルが非常に低減したこと、または恐らく成熟細胞壁中でβ－グルカンがあまり接近可能ではないことに起因し得る。ここで、ｓデクチン－１コート蛍光ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、膨潤した分生子、発芽管、及び菌糸のサブセットへ効率的に結合し、リポソームの表面に提示された本明細書において記載される修飾ｓデクチン－１が、β－グルカンについての正常な親和性を保持することが示唆された。これらの結合データは、ｓデクチン－１の化学的修飾形態（例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧ－デクチン－１）が、真菌細胞結合特異性を保存することができることを初めて示した。さらに、蛍光ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬ結合は急速であり、何週間も細胞へ安定的に結合されたままであった。精製ｓデクチン－１は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの丸い酵母細胞、及び菌糸中では親細胞と成熟した芽との間で領域へ結合し、菌糸へ結合しないことが報告されている。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌糸の結合に比較して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓへのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬの結合は非能率的であったが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの菌糸に沿った複数の部位でのＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬの妥当な結合が示された（図６）。１０００超のｓデクチン－１分子によりコートしたリポソームのより高い結合力が、ペンタマーのＩｇＭ抗体の結合力に匹敵する、急速な結合、及び結合されたリポソームの非常に遅い放出を保証する可能性がある。各々のリポソーム上の何千のローダミン分子の存在は、明確な蛍光シグナルを検出する機会も増加させることができる。多数の実験において、ＢＳＡブロッカーを含む異なる結合バッファー及び様々なインキュベーション期間を使用して、非コートＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬの真菌細胞への有意な親和性は、検出されなかった。しかしながら、ＢＳＡブロッカーがインキュベーションで含まれなかった予備実験において、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの膨潤した分生子へ弱く結合した。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種は、それぞれ半子嚢菌類ならびに真正子嚢菌類、及び帽菌類の３つの進化的に異なる群の真菌に属し、それは共通の祖先から何億年前に別れている。ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは３種のすべてへ特異的に結合し、多くの病原性真菌の外側細胞壁中で見出されるβ－グルカンは、ｓデクチン－１標的化リポソームへ接近可能になることが示唆される。しかしながら、デクチン－１は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に比較して、Ｃａｎｄｉｄａ属へ比較的弱く結合するが、デクチン－２はより強く結合する。このことから、真菌病原体の着実な汎真菌検出には、グルカン及びマンナンの両方を検出するアッセイが要求され得ることが示唆される。

本明細書において示されるように、別個の細胞アッセイ方法を使用する様々な生物学的及び実験的な反復実験において、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、同じレベルのＡｍＢを送達するＡｍＢｉｓｏｍｅ様ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を効率的に殺傷または阻害した。本実験のすべてにおいて、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、３ｕＭの推定されたＥＤ_５０の付近またはそれ未満で試験した幅広い多様なＡｍＢ濃度にわたって、対照リポソームよりも、数倍～一桁多い殺真菌性であった。ＡｍＢ－ＬＬを超えるＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬの有意に強い活性は、０．０９４ｕＭのＡｍＢ程の低いＡｍＢ濃度（ＡｍＢのＭＩＣより十分に下）ででさえ、検出された。これらの研究は、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬがＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの殺傷及び増殖の阻害についてのＡｍＢのＥＤ_５０及びＭＩＣを有意に減少させることを示す。

非コートリポソームの脂質膜は、動物細胞（それは真菌細胞とは異なり細胞壁によって保護されない）の脂質膜へ受動的に結合する。しかしながら、リポソームのタンパク質コーティング、及びマウスまたはヒトの血清アルブミンによるコーティングは、特に、動物モデルからのリポソームのクリアランスを低減し、したがってリポソーム半減期を増加させる。恐らく、タンパク質コーティングは、原形質膜によるリポソーム膜の直接的相互作用を遅らせて、薬物の受動的送達を低減する。ｓデクチン－１によるリポソームのタンパク質コーティングは、動物細胞の原形質膜とリポソーム膜の直接的相互作用を低減し、したがって、リポソームの動物細胞との相互作用及び動物細胞への融合を低減する。ＡｍＢ－ＬＬに比べて、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬのヒト腎臓細胞への毒性の低減を示す、本明細書において記載される結果は、この見解と一致する。

要約すると、ｓデクチン－１は、ＰＥＧ化脂質担体へ任意選択でコンジュゲートされ、モノマーとしてリポソームの中へ挿入された場合に、機能性複合体を形成し、多様な真菌種の細胞壁中でβ－グルカンを効率的に結合することが可能である。０．０９４～３ｕＭのＡｍＢ濃度を送達するＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬについての複数の増殖阻害及び生存率アッセイは、ｓデクチン－１標的化リポソームが、本明細書のＡｍＢ－ＬＬによってモデル化されるような非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅについて報告されるものより十分下で、リポソームＡｍＢのＥＤ５０を低下させたことを示唆する。さらに、ＤＥＣ－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢｉｓｏｍｅ様リポソームよりも、動物細胞についてより低い親和性を有し、当該動物細胞へより低い毒性であった。これらの結果をまとめると、抗真菌療法の標的化のために汎真菌担体としてｓデクチン－１コートリポソームを使用することは妥当である。

実施例２
デクチン－２
細胞培養
ＡＤＨ１プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＣＡＩ４、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓＡ１１６３、及び野生型Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓＨ９９－αを、液体の、Ｖｏｇｅｌの最少培地（ＶＭＭ）＋１％のグルコース（８５）＋０．５％のＢＳＡ、または赤色指標色素不含ＲＰＭＩ１６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＫＵ－１１８３５－０３０）＋０．５％のＢＳＡ、またはＹＰＤ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース）中で、振盪しながら、または２４ウェルもしくは９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート上で、またはガラス顕微鏡チャンバースライド上で、増殖させ、３７℃で３～３６時間インキュベーションした。プレートをＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓについてポリ－Ｌ－リジンにより前コートし、ガラスの顕微鏡用スライドをすべての３つの種について前コートした。すべての真菌細胞の増殖をＢＳＬ２実験室中で実行した。細胞が、結合の顕微鏡分析のために蛍光リポソームにより処理される前に、真菌細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、ＰＢＳ中の４％のホルムアルデヒド中で６０分間固定し、３回洗浄し、ＰＢＳ中で４℃で保存した。

ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＨＴ－２９（ＡＴＣＣＨＴＢ－３８）及びヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ－２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ－１５７３）を、５％のＣＯ_２を補足した空気で３７℃インキュベーター中で、赤色指標色素を欠如するＲＰＭＩ培地＋１０％のウシ胎仔血清で９６ウェルマイクロタイタープレート中で増殖させた。一晩の抗真菌処理後のそれらの生存率及び代謝活性を、培地の中へ１：１０希釈したＣＴＢ試薬を使用し、３７℃で６０～９０分間インキュベーションして、１処理あたり８ウェルでアッセイした。

ｓデクチン－２の産生及び化学修飾
デクチン－２のカルボキシ末端端部は、マンナン認識ドメイン（ｓデクチン－２）を含有する。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ｐＥＴ－４５Ｂの中へクローン化した、ＭｍｓＤｅｃｔｉｎ－２ｌｙｓｈｉｓのコドン最適化Ｅ．ｃｏｌｉ発現コンストラクトの配列を、図１３中で示す。５７７塩基対の長さのＤＮＡ配列は、ベクターに規定されたＮ末端（Ｈｉｓ）_６親和性タグ、追加のフレキシブルＧｌｙＳｅｒスペーサー、架橋のためのリジン残基を備えた配列ＬｙｓＧｌｙＬｙｓ、別のフレキシブルスペーサー、続いてＣ末端の１６６アミノ酸の長さのマウスｓデクチン－２ドメインを含有する、わずかに修飾した１８９アミノ酸の長さのｓデクチン－２タンパク質をコードする。修飾ｓデクチン－２タンパク質（ＤＥＣ２）をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、マウスｓデクチン－１について上で記載したように精製し、続いてセファクリルＳ－１００ＨＲ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７０６１２１０）でゲル排除クロマトグラフィーの余剰ステップを行った。タンパク質を、図１４中のクマシーブルーにより染色したＳＤＳＰＡＧＥゲル上に示す。新鮮に添加した５ｍＭの２－メルカプトエタノールを含むこの同じＧｕＨＣｌバッファー中の５μｇ／ｕＬのｓデクチン－２のサンプルを、１ＭのｐＨ１０のトリエタノールアミンによりｐＨ８．３へ調整し、４モル過剰量のＤＳＰＥ－ＰＥＧ－３４００－ＮＨＳ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）コンジュゲートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎａｎｏｓｏｆｔｐｏｌｙｍｅｒｓから、１５４４－３４００）の反応性スクシンイミジルエステルＮＨＳ部分と２３℃で１時間反応させて、ＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを作製した（補足図Ｓ１）。復元及び保存のバッファーＲＮ＃５（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ８．０、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２－メルカプトエタノール）中のＢｉｏ－ＧｅｌＰ－６アクリルアミド樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１５０－０７４０）を介するサイズ排除クロマトグラフィーで、取り込まれていないＤＳＰＥ－ＰＥＧ及びＧｕＨＣｌを除去した（５１）。ＢＳＡ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを、同じプロトコールによってＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ、Ａ－８０２２）から調製したが、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ標識の間はＧｕＨＣｌ及びＢｉｏ－ＧｅｌＰ６クロマトグラフィーの間はＬ－アルギニンを欠如するバッファーであった。同じ手順を使用して同じＧｕＨＣｌバッファー中でＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを作製することによって、ローダミン標識ｓデクチン－２（ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄ）を調製したが、標識は、４モル過剰のｓデクチン－２に対してローダミン－ＮＨＳ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃４６４０６）により遂行した。加水分解された未結合のローダミン試薬及び不要な塩を、ＲＮ＃５バッファー中のＢｉｏ－ＧｅｌＰ２樹脂上のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄから除去した。ＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥでのように、ＲＮ＃５は、より穏やかな生物学的バッファーの中へ希釈した場合に、ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄを、活性のある炭水化物結合形態へと容易に復元する状態に保つ。

ＡｍＢ、ｓデクチン－２、ＢＳＡ、及びローダミンのリポソームの中への遠隔ローディング
ＦｏｒｍｕＭａｘＳｃｉ．Ｉｎｃ．からの滅菌ＰＥＧ化リポソーム（ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、ＦｏｒｍｕＭａｘ＃Ｆ１０２０３Ａ）でスタートして、１００％のリポソーム脂質に対して１１モルパーセントのＡｍＢ（ＡｍＢ、ＳｉｇｍａＡ４８８８）を含むリポソームの小さなバッチを調製して、上記のようにＡｍＢ－ＬＬを作製した（表１を参照）。

ＲＮ＃５バッファー及びＰＢＳ中のそれぞれＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥコンジュゲート及びＢＳＡ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥコンジュゲートを、６０℃で３０分間のインキュベーションによって、ＡｍＢ－ＬＬのリン脂質二重層膜の中へそれらの脂質ＤＳＰＥ部分を経由して組み込んで、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ及びＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬを作製した（上で記載されるプロトコールに類似する）。これらの同じ６０の℃インキュベーションの間に、２モルパーセントの赤色蛍光タグ（リサミンローダミンＢ－ＤＨＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｌ１３９２））も、ｓデクチン－２コートリポソーム及びＢＳＡコートリポソームならびにＡｍＢ－ＬＬの中へ取り込んだ。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの二重サンプルに、Ｂｉｏ－ＧｅｌＡ０．５Ｍ樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃１５１－０１４０）上でのゲル排除クロマトグラフィーを行った。蛍光リポソームは、樹脂から効率的に排除された。ｓデクチン－２（２．２ＯＤＡ_２８０／ｍｇ／ｍＬ）またはローダミンが、ゲル中に含まれる低分子量画分で検出されなかったので、両方がリポソームの中へ効率的にロードされると結論した。新鮮な２ｍＭのＢＭＥを、結合アッセイまたは殺傷アッセイにおける各々の使用の前に、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬへ添加した。ＲＮ＃５中で４℃で保存したＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、少なくとも１２か月間完全な真菌細胞結合特異性及び殺傷活性を保持するように思われた。

真菌細胞へ結合したリポソーム及びＤＥＣ２－Ｒｈｏｄの顕微鏡法
ホルマリン固定真菌細胞を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのトリエトアノラミン（ｔｒｉｅｔｈｏａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、５％のＢＳＡ、ｐＨ８．０）中で、ＢＭＥを新鮮に添加して、２３℃でリポソームと共にインキュベーションした。細胞と共にインキュベーションする前に、デクチン－２タンパク質濃度が０．５μｇ／１００μＬであるように、リポソームストックを１：２００で希釈した。１５分間、１時間、またはそれより長いインキュベーション後に、未結合のリポソームを、４回のＬＤＢ２の交換により洗浄した。ローダミン赤色蛍光リポソーム、緑色蛍光細胞、及び微分干渉（ＤＩＣ）照射細胞のマージした画像を、顕微鏡用スライド上で増殖させた細胞について、ＬｅｉｃａＤＭ６０００Ｂ自動化顕微鏡で６３×の油浸下で撮った。細胞と共にインキュベーションする前に、ｓデクチン－２タンパク質濃度が同様に０．５μｇ／１００μＬであるように、ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄストックも１：２００で希釈した。マイクロタイタープレート上の細胞の明視野画像、ＤＩＣ画像、ならびに赤色蛍光画像（励起５６０／発光６４５）及び緑色（励起５００／発光５３５）蛍光画像を、ＯｌｙｍｐｕｓＰＥＮＥ－ＰＬ７デジタルカメラを使用して、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７０倒立顕微鏡で２０×で撮り、明視野レイヤー及び／または蛍光カラーのレイヤーをＰｈｏｔｏｓｈｏｐでマージした。２０×拡大のリポソーム結合の領域を、リポソームによって照射された赤色蛍光領域を単に捕捉するためにＩｍａｇｅ＞Ａｄｊｕｓｔ＞Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＞Ａｐｐｌｙを使用し、各々の画像についての領域データをファイル中に置くためにＡｎａｌｙｚｅ＞Ｍｅａｓｕｒｅを使用して、ＩｍａｇｅＪ（ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）の中へ未修飾の赤色蛍光ＴＩＦ画像の８ビットグレースケールのコピーを取得することによって定量した。概して６～１０の写真画像を分析し、大部分の領域推定値について平均した。しかしながら、染色強度が写真視野Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞の中で広く変動したので、９０の画像を各々の処理について分析した。明視野画像、ＤＩＣ画像、及び蛍光画像も、マイクロソープ（ｍｉｃｒｏｓｏｐｅ）チャンバースライド中で増殖させた細胞について、ＬｅｉｃａＤＭ６０００Ｂ自動化顕微鏡で、２０×で、または６３×の油浸下で、撮った。

グルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）特異的なモノクローナル抗体１８Ｂ７をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＡＢＦ２０６９）から得て、１：２００希釈（０．５ｕｇ／１００μＬ）で使用し、これも１：２００で希釈したヤギ抗マウス二次抗体Ａｌｅｘａ４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１００１）により可視化し、ＧＦＰフィルター（励起５００／発光５３５）により撮影した。

リポソーム処理に続く増殖阻害アッセイ及び生存率アッセイ
リポソームストックを６１５～８００μＭのＡｍＢで保存し、典型的には最初にリポソーム希釈バッファー（ＬＤＢ２）の中へ３０～６００倍希釈し、次いで増殖培地の中へ１：１１で希釈して、２μＭ～０．１μＭまでの範囲の示された最終的な殺真菌物質の濃度を達成した。対照細胞に同等量のＬＤＢ２を与えた。本発明者がＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓについて最近記載したように、３～４時間ＣＴＢ試薬によりインキュベーションし、Ｂｉｏ－ＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨＴの蛍光マイクロタイタープレートリーダー中で９６ウェルプレートを分析して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（ＣＴＢ）細胞生存率アッセイ及び代謝活性アッセイを遂行した。対照ウェルからの蛍光バックグラウンドを実験ウェルから差し引いた。８ウェルからのデータを各々のデータポイントについて平均化した。これらのアッセイは多くのバックグラウンドを有しており、細胞をＶＭＭ中でアッセイしたならば感度は低くなった。このプロトコールまたはＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓについて出版された別のＣＴＢプロトコールを使用して、この種で匹敵する細胞生存率アッセイを遂行する場合に、ＣＴＢ試薬からの任意の蛍光シグナルを検出することはできなかった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞生存率の代替測定として、ＹＰＤ中で１ｍＬの細胞を増殖させ、増殖の示された時間についての薬物ロードリポソームを添加し、細胞を希釈し、ＹＰＤ上でプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントすることによって、アッセイを遂行した。殺真菌物質ロードリポソームによる処理後のＹＰＤ中で増殖する細胞の中の死んだＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞の画分を、５０μｇ／ｍＬでヨウ化プロピディウムを培地へ添加し、３７℃で６０分間インキュベーションすることによってアッセイした。培地を除去し、蛍光顕微鏡のためにＰＢＳにより置き換え、赤色蛍光タンパク質チャンネル（励起５６０／発光５９５）を使用し、染色細胞及び非染色細胞の全数に対する染色された死細胞のパーセントをスコアリングした。ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬによる実験において、すべてのリポソームを、ＬＤＢ２の代わりにＬＤＢ１（ＰＢＳ＋５％のＢＳＡ＋１ｍＭのＢＭＥ）（５１）により希釈した。

デクチン－２は、ヒト及びマウスのＣ型レクチン（ＬＥＣｔｉｎ）受容体遺伝子ＣＬＥＣ６Ａによってコードされる。デクチン－２は、マンノタンパク質中のα－マンナンならびにＮ結合型マンナン及びＯ結合型マンナンに結合する（４２～４６）。デクチン－２はいくつかのリンパ球の原形質膜中で発現され、そのマンナン結合ドメイン（ｓデクチン－２）はこれらの細胞の外側上に及びそのシグナリングドメインは細胞質中である。デクチン－２は、活動性真菌感染の宿主にシグナリングする先天性免疫受容体として機能する。

実施例１において説明されるように、デクチン－１をコートしたアンホテリシンＢ（ＡｍＢ）ロードリポソームは、内部細胞壁中のβ－グルカンへ標的化され、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓの複数の細胞タイプへ及びＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ酵母細胞へ効率的に結合した。デクチン－１をコートしたＡｍＢロードリポソーム（ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬ）は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞を効率的に阻害し殺傷する。しかしながら、デクチン－１リポソームは、恐らくβ－グルカンをマスクする厚いマンナン多糖類及びマンノタンパク質の外側層の存在に起因して、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓへ弱く結合する。ここで、ＡｍＢロードリポソームを、マウスデクチン－２のマンナンに結合するドメイン（ｓデクチン－２）によりコートした。ｓデクチン－２をコートしたＡｍＢロードリポソームは、非標的化薬物ロードリポソームに比べて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓへ効率的に結合し、細胞の増殖及び生存率を劇的に低減させた。

結果
殺真菌物質をロードしたｓデクチン－２コート蛍光リポソームの調製。
本明細書において構築した、殺真菌物質をロードしたｓデクチン－２コートリポソームのモデルを、図１５中で示す。リポソーム構築方法及びリポソーム組成は、上で記載したｓデクチン－１コートリポソームのものに非常に類似していた。リポソーム脂質のモルに対して、１１モルパーセントのアンホテリシンＢ（ＡｍＢ）を、ＰＥＧ化リポソームの膜の中へ遠隔でロードして、ＡｍＢロードリポソームＡｍＢ－ＬＬを作製した。参考までに、広く使用される市販のＡｍＢロード非標的化リポソーム製品ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）は、リポソーム脂質のモルに対して、１０．６モルパーセントのＡｍＢを含有する（表１）。マウスｓデクチン－２配列を、アミノ末端に小さなリジンタグを含有するようにデザインした（図１３）。それをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ（図１４）、精製したｓデクチン－２タンパク質をこのリジンタグを経由してＮＨＳ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥへコンジュゲートし、ＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを作製した。次いでＤＥＣ２－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを、リポソーム脂質のモルに対して１モルパーセントのタンパク質分子（１リポソームあたり１，５００分子ｓデクチン－２）で、ＤＳＰＥ脂質部分を経由してＡｍＢ－ＬＬの中へ取り込んで、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを作製した。同様に、そしてタンパク質コートリポソーム対照として、０．３３モルパーセントのウシ血清アルブミンを脂質担体を経由してＡｍＢ－ＬＬの中へ取り込んで、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬを作製した。これは、リポソームのこれらの２つのセットの表面上に同等なμｇ量の２２ｋＤａのｓデクチン－２及び６６ｋＤａのＢＳＡタンパク質をもたらした。非コートＡｍＢ－ＬＬ（市販の製品ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）に非常によく類似する）も、リポソーム対照として供した。２モルパーセントのＤＨＰＥ－ローダミンも、すべての３つのリポソーム調製物のリポソーム膜の中へ取り込んだ。したがって、リポソームのすべて３つのセットは、同じ１１モルパーセントのＡｍＢ及び２モルパーセントのローダミンを含有した。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの組成を、ＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬ、ＡｍＢ－ＬＬ、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）、及びＡｍＢ／ミセルのものと表１中で比較する。

ｓデクチン－２コートリポソーム（ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ）は対照リポソームよりも多様な真菌種へより強く結合した
ｓデクチン－２コート赤色蛍光ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ酵母細胞、偽菌糸、及び菌糸へ強く結合した（図１６）。ｓデクチン－２コートリポソームの大部分は、これらの細胞に付随する細胞外多糖類マトリックスへ大きなクラスターで結合した。さらに、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、これらの細胞を取り囲む細胞外マトリックスの大きなサブセットへ結合した（Ｅｘ＋）一方で、マトリックスのうちのいくつかの領域はｓデクチン－２コートリポソームを明確に結合しなかった（Ｅｘ－）（図１６Ｅ）。１００ｎｍのリポソームは小さすぎるので光学顕微鏡法によって解像することができないが、１リポソームあたり推定３，０００のローダミン分子（図１５）は、個別のリポソームからの蛍光シグナルの目視を可能にする。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁へ直接結合する個別のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ（白色矢印、図１５Ａ）またはリポソームクラスターは、めったに観察されなかった。これとは対照的に、個別のｓデクチン－１コートリポソームは、Ａｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞の細胞壁へ高頻度で結合した。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ酵母細胞へ強く結合した（図１７）。モノクローナル抗体１８Ｂ７は、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの莢膜及び菌体外多糖中で見出されるグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）について特異的である。抗体１８Ｂ７は、明視野画像（Ｅｘ＋、図１７Ａ）において目視可能な細胞莢膜のすべてではなく大部分、及び菌体外多糖のすべてではなく大部分を染色した（図１７Ｂ）。大部分の１８Ｂ７に強く共染色されたＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、菌体外多糖マトリックス中のＧＸＭ領域を染色したが、莢膜の１８７Ｂ標識ＧＸＭを染色しなかった（図１７Ｃ、１７Ｄ）。さらに、１８Ｂ７またはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのどちらでも染色されなかった、細胞外マトリックスのうちのいくつかの領域があった（Ｅｘ－／－、図１７Ａ）。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの発芽した分生子及び菌糸によって産生された菌体外多糖マトリックスへ大きなクラスターで結合した（図１７Ｅ、１７Ｆ、１７Ｇ）。この場合もやはり、結合が細胞壁それ自体に付随していることは、たとえあるとしてもほとんどない。同様に、菌体外多糖マトリックスが染色されないかまたは弱く染色される領域があるように思われる（Ｅｘ－、図１７Ｅ及び１７Ｆ）。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、調査したすべての３つの真菌種の細胞壁の緊密に架橋された多糖類内のマンナンへ弱く結合したかまたは全く結合しなかったので、リポソームが１００ナノメートルの直径サイズであるのでそれらの接近を制限するか、またはｓデクチン－２がリポソーム膜中で提示された場合に何らかの形で完全な活性が制限されると判断された。溶液中のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの回転直径は、ｓデクチン－２タンパク質及び付随する水分子によるそれらのコーティングに起因して、それらの物理的サイズの推定値よりもさらに大きいだろう。ｓデクチン－２それ自体は２２ＫＤａの原子量を有し、したがって溶液中の回転直径は約４ナノメートルと推定され得る。ローダミンカップルｓデクチン－２（ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄ）を調製した。ローダミンの原子量（０．４８ｋＤ）及び１つまたは２つのローダミンをカップルする分子は、ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄについてのサイズ推定値にほとんど影響しないだろう。赤色蛍光ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌糸細胞を取り囲む大部分の菌体外多糖マトリックスへ強く結合した（図１８、プレートＡ及びＢ）。結合のパターン及び結合の強度は、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのものとは識別不可能であった（図１８、プレートＣ及びＤ）。

対照の非コートＡｍＢ－ＬＬ及びＢＳＡコートＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬに比較して、真菌細胞へ結合するＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの効率を定量した。蛍光リポソームシグナルの領域を、真菌細胞でほぼコンフルエントのリポソーム染色培養を撮った複数の赤色蛍光写真画像から測定した（図１９）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの偽菌糸及び菌糸、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ酵母細胞、ならびにＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの菌糸へ５０倍～１５０倍効率的に結合した（図１９Ａ、１９Ｄ、１９Ｇ）。これらの測定を行うために定量した蛍光リポソームの写真画像の例を、各々の棒グラフに隣接して提示する（図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ、１９Ｆ、１９Ｈ、１９Ｉ）。

Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ偽菌糸及び菌糸へ結合する蛍光リポソームの領域のこの同じ定量的アッセイを使用して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの結合の特異性、安定性、及び速度（図２０）を特徴づけた。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ標識は、結合アッセイの間に、可溶化した酵母マンナンの含有によって７５％阻害されたが、可溶性β－グルカンラミナリン、またはグルコース－フルクトース含有二糖スクロースの同じ濃度によっては阻害されなかった（図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ）。この結果は、ｓデクチン－２の出版された炭水化物特異性に一致して、細胞外マトリックスへ結合するｓデクチン－２標的化リポソームは、マンナン特異的であったことを確認した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞へ結合するＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの安定性を、図１９Ａ中で調査されたＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ染色調製物を撮ること、及び４℃のリン酸緩衝生理食塩水中で暗所でそれらを保存することによって調査した。２か月後に、これらの細胞を再撮影し、リポソーム染色を定量した。細胞へのＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の蛍光強度は、強いままであり、ＡｍＢ－ＬＬの非特異的結合よりも５０倍強いと評価された（図２０Ｄ、２０Ｅ、２０Ｆ）。この結果は、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬそれ自体が比較的安定的であり、細胞へのそれらの結合も比較的安定的であることを示唆する。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ結合の速度を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ偽菌糸細胞及び菌糸細胞の密集した視野を１０秒～９０分間の範囲の期間でリポソームへ曝露してから、未結合のリポソームを洗浄することによって推定した（図２０Ｇ、２０Ｈ）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ標識の領域は急速に増加し最初の１５分間指数関数的に（図２０Ｇ）、次いで減速したが、９０分間後に完了したように見えなかった（図２０Ｈ）。

要約すると、デクチン－２をコートしたＡｍＢロードリポソーム（ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ）は、インビトロで増殖させたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞外マトリックス中に存在する真菌マンナンへ特異的に安定的に急速に結合した一方で、対照リポソームの非特異的結合はほとんど観察されなかった。微量のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのみの細胞壁への結合があった。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＡ．のｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞を取り囲む細胞外マトリックスの部分へ効率的に結合した。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによる増殖阻害及び殺傷
様々な真菌細胞増殖及び生存率のアッセイを、この殺真菌物質についての最小阻止濃度（ＭＩＣ）の付近のＡｍＢ濃度を送達する、ｓデクチン－２コートリポソーム及び対照リポソームにより、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの活発に増殖する培養を処理した後に遂行した（図２１）。ＡｍＢについてのアッセイ条件及び送達方法に依存して、これらの種についての推定されたＡｍＢのＭＩＣは０．０６～１．３μＭの範囲である。

４，０００のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ酵母細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートの個別のウェルの中へ接種し、それらを偽菌糸及び早期菌糸のステージまで６時間増殖させ、細胞を薬物ロードリポソームにより処理した。３０分間のインキュベーション後に、リポソームを洗浄し、細胞を追加の１６時間増殖させた。図２１Ａは、１μＭのＡｍＢ～０．１２５μＭのＡｍＢまでを送達する標的化ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、同じ濃度のＡｍＢの送達する非コートＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を９０倍～３倍より効率的に殺傷または阻害することを示す。これらの実験において、細胞が３０分間しかリポソーム薬物へ曝露されなかったことを考えると、この差は注目すべきものである。これらのデータをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ試薬を使用して得て、細胞の完全性及び生存率についての代用として細胞質レダクターゼ活性を査定した。死細胞または代謝的に不活性な細胞は、レサズリン基質を蛍光レゾルフィン産物へ還元しない。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を、リポソームにより継続的に１６時間の期間全体、またはより高い薬物濃度により処理することは、すべての３つの薬物ロードリポソームサンプルについてあまりにも多くの細胞死をもたらし、異なるリポソーム調製物の中の差を明らかに分離することができなかった。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの６か月経過した調製物は、新鮮に還元される限り、それらの完全な抗真菌活性を保持した。リポソーム処理後の生存細胞数もアッセイした。液体培養の栄養豊富な培地中で増殖するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ酵母細胞を、２μＭのＡｍＢを送達するリポソームによりインキュベーションした。リポソームを３０分後に洗浄した。追加の６時間の増殖後に、培養物を希釈し、栄養豊富な培地の寒天プレート上でコロニー形成単位（ＣＦＵ）についてアッセイした。ＣＦＵに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、液体中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ酵母細胞の阻害または殺傷に３倍有効であった（図１３Ａ）。

液体中で増殖するＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ酵母細胞を、０．４μＭのＡｍＢを送達するリポソームにより４時間、ならびに０．４、０．２、及び０．１μＭのＡｍＢを送達するリポソームにより一晩処理した（図２１Ｂ）。各々の処理の終了時に、細胞を希釈し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を栄養豊富な培地の寒天プレート上でアッセイした。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、０．２μＭのＡｍＢである一晩の最適な処理により、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの殺傷により２．５倍～１１倍有効であった。代替のアッセイとして、マイクロタイタープレート上で増殖するＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ酵母細胞を、１μＭのＡｍＢを送達するリポソームにより５時間処理した。細胞を、ヨウ化プロピディウムによりそれらをインキュベーションすることによって細胞死について直ちにアッセイした。ヨウ化プロピディウムは死細胞に侵入するが、生細胞には侵入せず、それが二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡの短い領域の中へインターカレートする場合に、赤色蛍光を発する。ヨウ化プロピディウムアッセイは、これらの処理条件下で、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが非コートＡｍＢ－ＬＬよりもＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ細胞の殺傷に５倍効率的であったことを示した（図１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ）。

Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓを、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）について推定されたＭＩＣ（０．５μＭ）の付近及びそれ未満のＡｍＢ濃度を送達するリポソームにより処理した。発芽管が分生子のうちの９５％から最初に出現し始めた場合に、分生子は発芽し、非常に早期の発芽体ステージまで増殖した。次いで細胞を、ＡｍＢ含有リポソームまたはリポソーム希釈バッファーにより２時間処理し、未結合のリポソームを増殖培地により洗浄した。細胞を追加の１９時間増殖させ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ試薬により生存率及び代謝活性についてアッセイした。０．５μＭ及び０．２５μＭのＡｍＢを送達するＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをそれぞれ２０倍及び３６倍効率的に殺傷または増殖を阻害した（図２１Ｃ）。このアッセイの間に、希釈バッファー対照処理Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞は過剰増殖し、マイクロタイターウェル中で厚い菌糸のマットを生成することが指摘される。したがって、これらの対照細胞からの代謝活性及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅシグナルは低かった。

デクチン－１標的化ＡｍＢロードリポソームも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの膨潤した分生子、発芽体、及び菌糸細胞へ効率的に結合し、これらの細胞を阻害及び殺傷するが、それらはα－マンナンではなくβ－グルカンに結合する。この以前の研究において、細胞は、全体のアッセイの間にリポソームにより継続的にインキュベーションされ、洗浄されなかった。２つのデクチンの薬物標的化効率のより直接的な比較のために、ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬを、最初にリポソームをＬＤＢ１の中へ希釈し、細胞を１６時間増殖させたという点を除いて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのために本明細書において使用された同じアッセイデザイン（２時間後にリポソームを洗浄する）を使用して調査した。０．５μＭ及び０．２５μＭのＡｍＢを送達するＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをそれぞれ２８倍及び５倍効率的に殺傷または増殖を阻害した（図２１Ｄ）。このアッセイ条件を使用する、デクチン－１及びデクチン－２による標的化ＡｍＢロードリポソームからの結果は非常に類似する。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの動物細胞への毒性
ヒトＨＥＫ２９３及びヒトＨＴ－２９細胞の急速に増殖する培養物を、各々１５μＭのＡｍＢを送達する様々なリポソーム及びデオキシコール酸塩ミセル懸濁物により一晩処理した。代謝活性及び生存率のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅアッセイに基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも１０％～２０％多く毒性であり、ＡｍＢデオキシコール酸塩（ＡｍＢ／ＤＯＣ）ミセルよりも２～５倍毒性が低かった（図１４）。これらの細胞を、より低いＡｍＢ濃度（例えば３μＭのＡｍＢ）を受け取るように処理した場合に、ＡｍＢ／ＤＯＣミセルのみが測定可能な毒性を示した。蛍光顕微鏡法によって調査した場合に、３つのリポソーム調製物のどれも、これらの細胞株のいずれかに任意の特定の親和性を有するようには思われなかった。

要約すると、デクチン－２のＮ末端ドメイン（ｓデクチン－２）を脂質担体へカップルし、このコンジュゲートをリポソームの中へ挿入し、その結果、各々のモノマーのＣ末端炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）はリポソーム膜から外向きで面していた。３つの多様なヒト真菌病原体の細胞外マトリックスへの効率的な結合が、これらのＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬについて観察されたことを考慮すると、ｓデクチン－２モノマーは、効率的なマンナン結合のために必要な機能性ダイマーを形成するために、立体配座的に自由である必要があり、Ｃ型レクチン受容体は、多くの場合それらの基質のうちのいくつかを弱く結合する。マンナン関連多糖類へのｓデクチン－２結合について出版された推定の５０％有効濃度（ＥＣ５０）は、マンノースについてのおよそ２０ｍＭから、マンナン－α－１－２－マンナンについての２ｍＭ、マンノグリカンについての１５０μＭまでの範囲である。２ｍＭ～２．２ピコモルまでの範囲の様々なβ－グルカン結合についてのＥＣ５０を有するデクチン－２に最も近いパラログ（デクチン－１）に比較して、これは実際は弱い結合である。各々のリポソーム上におよそ１，５００のｓデクチン－２モノマーを有することによって生成されるより大きな結合力は、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの真菌細胞への結合について観察された急速で強く安定的な結合をもたらした可能性がある。

すべての３つの種の細胞外マトリックスへのＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの効率的な結合についてのこのデータは、それらの菌体外多糖のマンナンに富む含有量と一致する。しかしながら、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓマトリックスのうちのいくつかの領域は、ｓデクチン－２コートリポソームにより染色されなかったか、または弱く染色され、マトリックス中でマンナンの分布が不均一であることまたはこれらの領域中でマンナンがリポソームｓデクチン－２への曝露からマスクされることのいずれかを示唆する。菌体外多糖マンナンへのＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬの結合は、はるかに小さなサイズのＤＥＣ２－Ｒｈｏｄの結合よりも制限されないことが示され、サイズ制限は主要な限定ではないであろうことを示唆する。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬが、これらの真菌種のうちの任意のものの細胞壁へ微量レベルよりも多く結合したという説得力のある証拠はなかった。細胞壁マンナン含有量は増殖培地及び化学分析の方法に基づいて広く変動するが、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの推定された細胞壁マンナン多糖類含有量は２２％であり、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでは４０％であり、Ａ．ｕｍｉｇａｔｕｓでは１５～４１％である。ローダミン標識ｓデクチン－２（ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄ）は、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬと類似する強度及びパターンでＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの菌体外多糖マトリックスへ結合したが、ＤＥＣ２－Ｒｈｏｄは細胞壁を染色しなかった。したがってこの場合もやはり、はるかに大きなＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬについてのサイズ障壁は、細胞壁結合の欠如について説明するようには思われない。したがって、これらの研究結果は、細胞壁マンナンがｓデクチン２媒介性リポソーム結合から化学的にマスクされ得ることを示唆する。この結果は、ｓデクチン－１結合及びＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬ結合からのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁のβ－グルカンのマスキングに類似する。

Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、単細胞の卵形の酵母ならびに多細胞の楕円体の偽菌糸形態及び細長い菌糸形態の中で可逆的にスイッチする。すべての３つのステージは、細胞外マトリックスの産生及び宿主組織への接着が可能である。すべての３つのマトリックスはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬに結合し、このことは、殺真菌物質をロードしたデクチン２コートリポソーム療法がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの病原性を低減する可能性を有することを示唆した。

ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢの同じ濃度を送達するプレーンな非コートＡｍＢ－ＬＬまたはＢＳＡコートＢＳＡ－ＡｍＢ－ＬＬよりも、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓをはるかに効率的に阻害または殺傷した。ＣＴＢ試薬に基づく代謝活性アッセイ、ＣＦＵに基づく細胞増殖アッセイ、及び死細胞のヨウ化プロピディウム染色の組み合わせから、細胞の阻害及び殺傷の両方が起こることが確認された。３０分間ほど～数時間のＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによるインキュベーションは、結果的に有意な殺傷をもたらした。ＡｍＢについて報告されたＭＩＣ値（ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）に同等な非コートＡｍＢ－ＬＬが細胞の阻害または生存にほとんどまたはまったく影響を有しない濃度）の付近またはそれ未満のＡｍＢ濃度を送達する場合に、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、真菌細胞の阻害または殺傷に３倍～９０倍効率的であった。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、すべての３つの種にＡｍＢ－ＬＬよりも５０～１５０倍良く結合し、試験したいくつかの条件下で、ＡｍＢ－ＬＬよりも１１～９４倍効率的にそれらを阻害及び殺傷した。

ＡｍＢまたは他のリポソームパッケージング治療殺真菌物質についてのＭＩＣの有意な低減は、殺真菌物質用量及び薬物の投与の頻度の低減をもたらし、それは今度は宿主毒性を低減するに違いない。１５μＭのＡｍＢ（それは本明細書において真菌細胞を殺傷するのに使用されよりも、１５～１５０倍高いＡｍＢ濃度であった）を送達する場合に、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは動物細胞へ特に毒性ではなかったということが本明細書において示される。

カンジダ症、アスペルギルス症、及びクリプトコッカス症のマウスモデルにおけるｓデクチン－２標的化抗真菌物質の将来の試験の間のｓデクチン－２の免疫原性の問題を回避するために、これらの研究を、マウスｓデクチン－２タンパク質配列により遂行した。ヒトｓデクチン－２タンパク質配列はマウスタンパク質に７２％同一であり、わずか２アミノ酸短いだけである。したがって、臨床試験における使用のために、殺真菌物質ロード治療リポソームを標的化するようにヒトタンパク質を操作することは可能である。

要約すると、新たな抗真菌療法についての切実な必要性がある。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの多様な細胞ステージによって産生される細胞外マトリックスへ効率的に結合した。３つの種すべての増殖阻害及び殺傷についてのＡｍＢのＭＩＣの付近のまたはそれ未満のＡｍＢ濃度を送達するＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、リポソームにパッケージングされた薬物のｓデクチン－２の標的化が、非標的化リポソームＡｍＢよりも、殺真菌効果を一桁またはそれ以上で改善したことを示した。真菌細胞へ標的化された薬物をロードしたリポソームが広範囲の適用による汎抗真菌療法として有意な可能性を有することを提案することは妥当である。

実施例３
デクチン－２コート抗真菌リポソームは、肺アスペルギルス症のマウスモデルにおける真菌量を抑制する
真菌細胞培養
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓＣＥＡ１０（ＣＢＳ１４４．８９、ＡＴＣＣＭＹＡ１１６３）のヒト臨床分離株は、アスペルギルス症のマウスモデルにおいて以前に使用されている（ＤｅｓｏｂｅａｕｘａｎｄＣｒａｙ，“ＲｏｄｅｎｔＭｏｄｅｌｓｏｆＩｎｖａｓｉｖｅＡｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓｄｕｅｔｏＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ：ＳｔｉｌｌａＬｏｎｇＰａｔｈｔｏｗａｒｄＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，”ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，８４１（２０１７）を参照）。ＣＥＡ１０を、Ｖｏｇｅｌの最少培地（ＶＭＭ）＋１％のグルコース＋各々１００ｕｇ／ｍＬのカナマイシン及びアンピシリンを含有する１．５％の寒天プレート上で、３７℃で６日間増殖させるによって、分生子を調製した。ガラスビーズ及びリン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０によりプレートを穏やかに振盪することによって、分生子を収穫した。分生子を滅菌した４０ミクロンのナイロンメッシュフィルター（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ．＃２２３６３５４７、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ）を介して濾過し、１×ｇで一晩沈降させて分生子を濃縮し、分生子の細胞密度を血球計数器で決定した。発芽率は１００％近くであることが示された。

抗代謝物質及びステロイドの調製
３５ｍｇ／ｍＬのシクロホスファミド（Ｃａｙｍａｎ＃１３８４９）ストックを生理食塩水ｐＨ７．４中で調製し、１７５ｍｇ／ｋｇマウス体重で送達した。酢酸コルチゾン（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、＃２３７９８、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）の懸濁物を脱イオン水中で２２．４ｍｇ／ｍＬで調製し、１１２ｍｇ／ｋｇで送達した。４０ｍｇ／ｍＬのトリアムシノロン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ＃Ｔ６３７６、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）のストックをＤＭＳＯ中で調製し、４℃で保存した。このストックをＰＢＳ中で１：４ｖ／ｖに希釈して、４０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与の直前に水性懸濁物を調製した。

肺アスペルギルス症の免疫抑制媒介性マウスモデル
７週齢の非近交系メスＣＤ１（ＣＤ－１ＩＧＳ）Ｓｗｉｓｓマウスを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｓから得た（各々２５ｇ～３０ｇ）。ＣＤ１マウスは実験的アスペルギルス症の大多数の研究において使用されている^５６。ステロイドモデル（図２２Ａ）：－１日目（Ｄ－１）及びＤ３に４０ｍｇ／ｋｇマウス体重のトリアムシノロン^６３の腹腔内投与によって、マウスを免疫抑制した（図２２）。白血球減少モデル（図２２Ｂ）：Ｄ－３での１７５ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドの単一ＩＰ注射及び次いでＤ－１での４０ｍｇ／ｋｇのトリアムシノロンの単一皮下注射を使用して、マウスを免疫抑制した。これらのマウスが真菌量をアッセイするために４日目で安楽死させられることになっていたので、マウスに後続する免疫抑制物質の注射を与えなかった。

免疫抑制したマウスを、Ｄ１での５０μＬの分生子サンプルの咽頭吸引によって感染させた（図２２）。症状の進行は、グルーミングの欠如及び逆立った毛並みにより最初に開始し、次いで軽度の嗜眠であった。一旦マウスが重度の嗜眠を示したならば、及び／または体重の２５％を失ったならば、臨床的に死亡したと宣言され、麻酔に続いて頸椎脱臼によって安楽死させた。真菌量実験のために、すべての動物をＤ４で安楽死させた。すべてのマウスのプロトコールは、米国連邦政府及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｏｒｇｉａ’ｓＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって概説される、非ヒト動物の倫理的取り扱いについてのガイドラインを満たした。

手動で調製したマウス肺の切片中の真菌キチンをカルコフロールホワイトＲＣ（ＢｌａｎｋｏｐｈｏｒＢＢＨＳＶ－２５６０Ｂａｙｅｒ，Ｃｏｒｐ．）により染色した。２５ｍＭのストックを、２１８μＬのＤＭＳＯ中で５ｍｇを溶解し、４℃で暗所で保存することによって調製した。２５ｕＭのカルコフロールホワイトの最終的な濃度へＰＢＳ＋５％のＤＭＳＯの中へ１：１，０００でストックを希釈することによって調製した溶液中で、組織を染色した。

コロニー形成単位（ＣＦＵ）及びリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって推定した真菌量。
Ｄ４まで生存する動物から切除した肺を秤量し、何百ものおよそ１ｍｍ^３の直径片へとミンスし、ミンスした問題のサブセットを使用して正確に全体の肺をサンプリングできるように、片を混合した。ＣＦＵ：２５ｍｇの肺組織を２００μＬのＰＢＳ中でホモジナイズし、各々１００μｇ／ｍＬのカナマイシン及びアンピシリンを含有するＹＰＤ（酵母ポテトデキストロース）寒天プレート上で滅菌されたガラスビーズを振盪することによって広げた。３７℃で１６時間のインキュベーション後に、真菌のマイクロコロニーをカウントし、いくつかを４×拡大でＥＶＯＳ画像化系で撮影した（図２５Ｂ、２５Ｃ）。図２５Ａ及び図２６Ａ中で報告したＣＦＵの数を、各々の顕微鏡視野に比べた全体のプレートの領域及び各々の肺の重量について修正した。ｑＰＣＲ：ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（＃６９５０４、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５ｍｇの各々の肺からの並列のサンプルから、ＤＮＡを抽出した。製造者の指示に従って、組織を１８０ｕＬのバッファーＡＴＬ及び２０ｕＬのプロテイナーゼＫと混合した。この時点で、ガラスビーズを添加し、室温で１０分間中程度のスピードでサンプルをビーズビーター（ＲＥＴＳＣＨＭＭ３００ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｉｌｌ）で振盪することによって、真菌細胞壁を破壊するように、プロトコールを修飾した。ホモジネートは透明の液体であり、肺細胞及び真菌細胞の両方は完全にＡＴＬのバッファー中で可溶化されたことを示唆するが、若干の浮遊脂質を含有していた。この材料をＱｉａｇｅｎＳｈｒｅｄｄｅｒＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ（カタログ番号７９６５４）を介して濾過して、浮遊脂質を除去した。この時点で、推奨される５６℃で１０分間のインキュベーションにより開始するＤＮＡ調製のための製造者プロトコールへ戻した。典型的には１０ｕｇのＤＮＡを２５ｍｇの肺組織から得た。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、以前に記載されたアプローチ^６５に類似して、１００ｎｇの肺ＤＮＡのサンプル中のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓｒＲＮＡ反復配列の量を推定した。複数の新たなプライマーペアを、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子中の遺伝子間スペーサー（ＩＧＳ）のためにデザインした。低サイクル閾値（Ｃｔ）及び単一の解離ピークを与える最適なプライマーペアは、以下の配列（Ａｆ１８ＳｒＲＮＡ２Ｓフォワードプライマー、５’－ＧＧＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＡ及びＡｆ１８ＳｒＲＮＡ２Ａリバースプライマー５’－ＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＡＣＣＡＴ）を有していた。非感染肺組織を調査した場合に、このプライマーペアは、ＰＣＲの４５のサイクル後でさえ検出可能な産物を生じなかった。すべてのＣｔ値を、ｄＣｔ方法を使用して、対照感染肺サンプルについて決定した低Ｃｔ値へ正規化することによって、真菌ｒＤＮＡＩＧＳの相対量（ＲＱ）を決定した（Ｌｉｖａｋｅｔａｌ．“Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２（－ＤｅｌｔａＤｅｌｔａＣ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ２５，４０２－４０８（２００１）を参照）。

結果
本明細書において記載されるように、Ｃ型レクチン受容体のデクチン－１及びデクチン－２を使用して、グルカン及びマンナン（大部分の真菌病原体の細胞壁及び菌体外多糖マトリックス中で見出される多糖類）へそれぞれ、薬物ロードリポソームを標的化する、抗真菌薬のための新たな送達系が開発された。いくつかの実例において、デクチン－２コートＡｍＢリポソームは、非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様リポソーム薬物に比較して、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの９０％阻害及び殺傷のためのリポソームＡｍＢのインビトロ有効用量を約１０～９０倍低減させた。本明細書において、免疫抑制媒介性マウス肺アスペルギルス症のステロイドモデル及び白血球減少モデルの両方を用いて、この新たなクラスの治療剤のインビボの有効性を研究した。これらの実験を、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）によって送達されるＡｍＢについての最小阻止濃度（文献中で報告された０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重）の付近で遂行した。本明細書における両方のモデルについて、デクチン－２標的化ＡｍＢロードリポソームが、同じ低ＡｍＢ濃度を送達する非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様リポソーム（ＡｍＢ－ＬＬ）に比べて、肺中の真菌量を１～２桁以上低減したことが示された。抗真菌薬の有効用量を劇的に低減させることによって、標的化汎抗真菌リポソームは、それらが侵襲性感染または局在性感染であるかにかかわらず、多様な真菌性疾患をより安全に治療する新たな臨床パラダイムを生成する力を有する。

本明細書において記載されるように、２つのＣ型レクチン受容体（デクチン－１（ＤＥＣ１）及びデクチン－２（ＤＥＣ２））の炭水化物認識ドメインを使用して、真菌のβ－グルカン及びα－マンナンへ抗真菌薬ロードリポソームを標的化した。デクチン標的化リポソームは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの細胞壁及び菌体外多糖マトリックスへ特異的に結合する。非標的化リポソームは特異的に結合せず、抗真菌物質を真菌細胞へ受動的に送達することしかできない。本明細書において示されるように、ＤＥＣ１及びＤＥＣ２をコートしたアンホテリシンＢ（ＡｍＢ）ロードリポソーム（ＤＥＣ１－ＡｍＢ－ＬＬ及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ）は、発生中のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのすべてのステージ（非膨潤及び膨潤した胞子、発芽体及び菌糸を包含する）へ効率的に結合する。それらは、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様リポソーム（ＡｍＢ－ＬＬ）よりも、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓを約１０倍～約９０倍効率的に阻害及び／または殺傷し、薬物のインビトロ有効用量を一桁低減させる。この真菌細胞を標的化する技術がアスペルギルス症のマウスモデルにおいてインビボで有効かどうかを、本明細書において研究した。図２３中の図解（右側）は、デクチンをコートする抗真菌薬ロードリポソームが、真菌細胞及びそれらの菌体外多糖マトリックスへ結合すること、及びしたがって薬物を真菌細胞の近辺へ特異的に標的化することを図示する。このことはまた、哺乳動物細胞の表面から遠ざけて抗真菌物質を濃縮する。これとは対照的に、非標的化薬物は、抗真菌物質をすべての細胞へ受動的に送達する（図２３、左側）。

Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓは、アスペルギルス症（４つの最も生命を脅かす真菌性疾患のうちの１つ）の主要な原因病原体である。世界的に、アスペルギルス症の急性症例はおよそ３００，０００名と推定される。２０１７年単独でも、米国におけるアスペルギルス症の治療費は患者あたり５８，０００～１０５，０００米ドルの範囲であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ感染からの米国の年間医療費は合計１５億ドルであった。アスペルギルス症は、すべての真菌感染を治療する費用のうちの１７％を占める。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓはありふれた土壌生物であるが、家庭及び職場で見出される。大部分の人々は感染せずに、毎日何千もの胞子を吸入する。生命を脅かす侵襲性真菌感染（アスペルギルス症等）を発症する最も高いリスクがある患者は、概して弱体化した免疫系を有する、及び／または様々な肺疾患を有し、真菌感染が確立する機会が増加する。免疫不全の患者の中で、アスペルギルス症は、カンジダ症の次に２番目に頻度の高い真菌感染である。さらに、免疫抑制物質を服用するがん患者、幹細胞及び臓器の移植患者の増加に起因して、免疫不全個体（様々な日和見真菌感染にかかりやすい）の数は増加している。

アスペルギルス症による患者は、抗真菌物質（アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カスポファンギン、及び様々なアゾール系薬物等）により治療される。ほぼすべての抗真菌剤は疎水性であり、それらの低い水溶解度は、薬物送達についての問題を提示する。脂質二重膜の中へインターカレートされたＡｍＢを備えたリポソーム薬物製剤（ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）等）または同等物（ＡｍＢ－ＬＬ等）は、様々な器官へより効率的に透過し、真菌細胞壁を透過し、高用量のＡｍＢで、界面活性剤で可溶化したＡｍＢ（例えばＡｍＢ－ＤＯＣ）よりも、腎毒性の低減及び点滴毒性の低下を示す。ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）及びそれらの同等物のＡｍＢ－ＬＬは、バイオフィルム中に存在するＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの殺傷にしばしば使用される。デクチンがバイオフィルムを構成することを支援する菌体外多糖マトリックスへ結合するので、デクチン標的化技術は、バイオフィルム中の抗真菌活性を改善することができた。しかしながら、すべての抗真菌剤は、リポソーム中にパッケージングされるかどうかにかかわらず、十分な殺真菌効果の欠如、薬物耐性真菌種の増加、ならびに細胞及び器官への宿主毒性に起因する深刻な限定を有する。例えば、リポソームＡｍＢは、腎臓毒性を引き起こす（例えば、ＡｌｌｅｎＵ．“Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｇｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｙｓｔｅｍｉｃｆｕｎｇａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ”Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ＆ＣｈｉｌｄＨｅａｌｔｈ１５，６０３－６０８（２０１０）；及びＤｕｐｏｎｔＢ．“ＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆｔｈｅｌｉｐｉｄｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ”ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒ４９Ｓｕｐｐｌ１，３１－３６（２００２）を参照）。アンホテリシンＢを記載するのに、その副作用から「アンホテリブル（Ａｍｐｈｏｔｅｒｒｉｂｌｅ）」というあだ名が、臨床医によってしばしば使用される。薬物療法を行ったとしても、アスペルギルス症患者の１年生存についての症例死亡率は、患者の基礎疾患に依存して、概して１０％～９０％の範囲にすぎない。患者の約１０％については、侵襲性アスペルギルス症が脳アスペルギルス症（脳の感染）へ進行し、それは９９％の死亡率である。

本明細書において記載されるデクチンベースの技術の使用のための目標のうちの１つは、免疫抑制媒介性アスペルギルス症のマウスモデルにおいてインビボで、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの阻害及び殺傷のためのデクチン－２コートリポソーム薬物の有効性の増加を実証することである（Ｄｅｓｏｕｂｅａｕｘｅｔａｌ．，“ＡｎｉｍａｌＭｏｄｅｌｓｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ”ＣｏｍｐＭｅｄ６８，１０９－１２３（２０１８））。非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬよって送達されるＡｍＢについての最小阻止濃度の付近で行うと、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、同じＡｍＢ濃度を送達するＡｍＢ－ＬＬに比べて、劇的に肺中の真菌量を低減させたことが見出された。

異なる出版物は、免疫抑制されたＣＤ１非近交系Ｓｗｉｓｓマウスにおいて致死性アスペルギルス症感染を誘導するには、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株ＣＥＡ１０の１×１０^４～１×１０^７の分生子の範囲の鼻腔内の接種物のサイズが必要であることを示唆する（Ｄｅｓｏｕｂｅａｕｘｅｔａｌ．；及びＨｅｒｂｓｔｅｔａｌ．“Ａｎｅｗａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｒｅｌｅｖａｎｔｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｓｏｌｉｄ－ｏｒｇａｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ”ＤｉｓＭｏｄｅｌＭｅｃｈ６，６４３－６５１（２０１３）を参照）。マウス肺へ送達した場合に、ＣＥＡ１０は、より一般的には使用されるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＡｆ２９３株よりも、より速く発芽し、より高い病原性を示すように思われる。ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）またはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬとして送達されたＡｍＢについて報告された最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、インビボのモデルにおいて０．０６～１．０ｍｇ／ｋｇマウス体重の広い範囲であり、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの株に依存して広く変動するように思われる。ＡｍＢ－ＬＬについて低用量のＡｍＢで行うことによって、インビボの非標的化リポソームに比べて、インビボの真菌細胞へ標的化されたデクチンコートリポソームについての最大のパフォーマンスの改善を実証しようとした。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの培養における増殖及び生存率のＡｍＢ－ＬＬ処理についてのインビトロのＭＩＣの付近で行うと、デクチン標的化リポソームのインビトロのパフォーマンスが１桁または２桁改善したことが以前に実証された。本明細書において記載される実験は、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬによって送達される０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇが、感染した対照マウスと比べた肺中のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓレベルのわずかな低下を測定するのに十分であることを示唆した。

健康なマウスは、健康なヒトの様にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種による感染に天然に耐性がある。したがって、急性アスペルギルス症を発症させるにはマウスを免疫抑制しなければならない。免疫抑制の２つの異なるマウスモデル（ステロイドモデル及び白血球減少モデルは、抑制される免疫細胞機能の質及び使用される免疫抑制の重症度の両方において異なる。肺アスペルギルス症のマウスモデルにおけるデクチン－２コート抗真リポソームの有効性を調査するための２つのプロトコール及び時系列を、図２２中で示す。簡潔には、ステロイドモデルにおいて、ＣＤ１マウスを合成ステロイドのトリアムシノロンまたはコルチゾンにより免疫抑制し（図２２Ａ）、その一方で、白血球減少モデルにおいて（図２２Ｂ）、マウスを抗代謝物質シクロホスファミド及びステロイドの両方により免疫抑制した。免疫抑制媒介性アスペルギルス症のステロイドモデル及び白血球減少モデルにおいて、免疫抑制したマウスに、０日目（Ｄ０）にそれぞれ２×１０^６及び１００，０００のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子（株ＣＥＡ１０）を咽頭に接種した。Ｄ２（感染後２日目）までに、直径およそ１ｍｍまたはそれ以上の少なくとも１つの大きい感染中心が、検査したマウス肺のほぼすべての肺葉中で観察された。これらの感染中心は短い菌糸のクラスターから構成された（図２４）。真菌接種後のＤ１に（図２２）、感染させたマウスを、３つの群の中へランダムに分離した。１つの処理群に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達するデクチン－２コートＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを投与し、第２のリポソーム処理群に、同様に０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇを送達する非標的化ＡｍＢ－ＬＬを投与し、対照のモック処理群に、リポソーム希釈バッファーのみを投与した。すべての分生子及びリポソームを、肺疾患のモデルについて以前に記載されるように咽頭送達方法を介してマウスへ投与した（ＤｅＶｏｏｇｈｔｅｔａｌ．“Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌａｓｐｉｒａｔｉｏｎ：ａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｒｏｕｔｅｆｏｒｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｃｈｅｍｉｃａｌ－ｉｎｄｕｃｅｄａｓｔｈｍａ，”Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ２５９，８４－８９（２００９）を参照）。

真菌量は、非標的化ＡｍＢ－ＬＬに比べて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理により劇的に減少した。
肺中の真菌量に対する抗真菌リポソーム処理の効果を調査した。第一に、免疫抑制媒介性アスペルギルス症のステロイドモデル（図２２Ａ）を用いた。ＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウスを、Ｄ－１及びＤ３にトリアムシノロンにより免疫抑制した。Ｄ０に、当該マウスを２×１０^６のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子により感染させた。マウスを、Ｄ１に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくはＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームまたはリポソームを希釈するのに使用した対照バッファーにより処理した。Ｄ１～Ｄ４の間に、各々の処理群中の動物の何匹かは死亡したが、各々の処理群から少なくとも３匹の動物がＤ４まで生存した。Ｄ４に、各々の群からランダムに選択した生存する３匹の動物を安楽死させ、肺を収穫し、秤量した。肺の真菌量を、２つの方法によって調査した（図２５）。ホモジナイズした肺組織を栄養豊富な増殖培地にプレーティングし、１６時間後に、図２５Ａ中で示されるように、１つの肺あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均数を推定した。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理したマウスは、ＡｍＢ－ＬＬ処理マウスよりも１２．５倍低い数、及びリポソーム希釈バッファーにより処理された対照マウスよりも２０．５倍低い数のコロニーを形成できる生きた真菌細胞を示した。これらのデータを生成するのに使用した真菌細胞マイクロコロニーの視野の例示的な画像を、ＡｍＢ－ＬＬ処理マウスについて図２５Ｂ及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理マウスについて図２５Ｃ中で示す。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによって生成される真菌量の減少の独立した推定値を得るために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応ｑＰＣＲを使用して、３つの処理群の各々中で同じ３匹のマウスからホモジナイズした肺組織の並列のサンプルに対するＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのリボソームｒＤＮＡ遺伝子コピーの相対量（図２５Ｄ）を測定した。ｒＤＮＡの相対量の推定値に基づいて、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによる処理は、１つの肺あたりの真菌量を、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬにより処理したマウスのレベルよりも２２倍低く及び対照マウスのレベルよりも４０倍低く低減した。両方の真菌量実験中で送達されるＡｍＢの濃度（０．２ｍｇ／ｋｇ）は、アスペルギルス症のマウスモデルにおけるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ真菌量に対するＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）について報告されたＭＩＣの範囲中である。対照動物に比べて真菌量のおよそ４０％の低下がＡｍＢ－ＬＬについて観察され、濃度が非標的化薬物についてのＭＩＣの上限であることが示唆される。

第二に、免疫抑制媒介性アスペルギルス症の白血球減少マウスモデルを用いた。このモデルはマウスをアスペルギルス症へさらにかかりやすくし、急性感染を確立するためにより低用量の分生子を要求する（図２２Ｂ）。ＣＤ１Ｓｗｉｓｓマウスを、Ｄ－３にシクロホスファミド及びＤ－１にトリアムシノロンにより免疫抑制した。Ｄ０に、当該マウスを５×１０^５のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子により感染させた。マウスを、Ｄ１に、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重を送達する、標的化ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬリポソームもしくは非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬリポソームまたはリポソームを希釈するのに使用した対照バッファーにより処理した。４日目（Ｄ４）に、すべての３つの処理群中のすべて動物は、１匹を除いて、依然として生存していた。１匹の対照バッファー処理動物は４日目の朝に死亡し、残存する対照動物及び１匹のＡｍＢ－ＬＬ処理マウスはグルーミングの低減を示した。ＡｍＢ－ＬＬ処理群及びＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理群中の残存するすべての動物は、比較的健康であると思われた。各々の処理群から生存する３匹の動物をランダムに選択し、安楽死させ、それらの肺を収穫し、真菌量を直前に記載される２つの方法によって推定した（図２６）。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬにより処理したマウスは、ＡｍＢ－ＬＬ処理マウスに比べて、１つの肺あたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の１００倍低い平均数を示した（図２６Ａ）。明らかに、真菌細胞への抗真菌リポソームの標的化は、リポソーム中にパッケージングされたＡｍＢの有効性を劇的に改善した。ＡｍＢ－ＬＬ処理マウスのＣＦＵの平均数はより低かったが、対照バッファー処理動物とは統計的に区別不可能であった。ＡｍＢ－ＬＬ処理群における高い真菌量は、グルーミングの低減を示した１匹のマウスが非常に高い真菌力価を有していたという事実によって歪曲される。これとは対照的に、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ処理マウスの１匹には検出可能な真菌コロニーがなく、その処理群について非常に低い平均ＣＦＵに寄与する。真菌量の独立した推定値として、同じマウスからホモジナイズした肺組織の並列のサンプルから調製したＤＮＡに対するＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのｒＤＮＡ遺伝子コピーの相対量（図２６Ｂ）も調査した。ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによる処理は、１つの肺あたりの真菌量を、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬにより処理されたマウスのレベルよりも６００倍低く低減した。明らかに、真菌細胞へのリポソームＡｍＢの標的化にデクチン－２を使用することは、肺中の真菌量の低減のための薬物パフォーマンスを劇的に改善する。

本明細書において記載されるように、リポソームを抗体で標的化することへの代替物は、真菌細胞及びそれらの菌体外多糖マトリックス中のマンナンへリポソーム薬物を標的化する汎真菌送達系においてデクチン－２のＣ型レクチン炭水化物認識ドメインを用いることによって、開発された（図２３）。２つの主要な理由のために、抗体が、リポソームを真菌病原体へ標的化するためのアプローチとして、デクチンコートリポソームほど有効ではない可能性があるという懸念があった。第一に、高親和性モノクローナル抗体はあまりにも特異性が高く、グルカン、マンナン、キシログルカン架橋、及びマンノタンパク質の特定のサブセットのみと反応し、したがって真菌種の小さなサブセットどころか同じ種の真菌細胞のサブセットしか標的化しないという可能性がある。多様な侵襲性真菌病原体に対するデクチン標的化リポソームの汎抗真菌活性は、それらを大規模で費用のかかる臨床開発にふさわしいものとするはずである。第二に、モノクローナル抗体の同じモル濃度を産生する費用の数パーセントで、Ｅ．ｃｏｌｉ中でデクチン－１及びデクチン－２の機能的な炭水化物認識ドメイン（ＤＥＣ１及びＤＥＣ２）を産生するより楽な方法が開発された。この場合もやはり、低い試薬費用は、急性侵襲性真菌疾患及び表在性真菌感染を治療する改善された抗真菌剤の臨床開発を促進するはずである。

本明細書において提示されたデータは、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬがＡｍＢの同じ低用量を送達する非標的化ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）様ＡｍＢ－ＬＬに比べて、抗真菌活性を劇的に促進したことを実証する。免疫抑制媒介性マウスアスペルギルス症の２つの異なるモデルを使用して、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）同等物（ＡｍＢ－ＬＬ）に比べて、肺中の真菌量を１～２桁低減した。ＤＥＣ２－ＡＭＢ－ＬＬによる処理が、本明細書において記載されるマウスモデルにおけるマウス生存率の改善を提供するであろうことが予想される。真菌量の劇的な低減から、患者の長期生存の改善が推測されるだろう。

同等に重要なことは、わずか０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇマウス体重（アスペルギルス症のマウスモデルにおいてインビボのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対するリポソームＡｍＢについて報告されたＭＩＣの下限の付近の濃度）を送達する、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬを使用して、劇的な効果が示されたという事実である。本明細書において記載される研究において、両方のモデルを使用して、０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇを送達するＡｍＢ－ＬＬは、真菌量に対して中等度の影響があったか、または影響がなかった。アスペルギルス症の肺モデルにおけるＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）またはＡｍＢ－ＬＬの有効性を調査する研究では、概して肺中の真菌量に対して最大の抗真菌効果を生じ、マウス生存率を有意に改善するには、５～２０ｍｇＡｍＢ／ｋｇの濃度が要求された。さらに、複数回用量のＡｍＢ－ＬＬを感染後の数日にわたって送達することが、真菌量の有意な低減及びマウス生存を保証するために多くの場合必要であった。しかし本明細書において、標的化ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬによって送達された低用量のＡｍＢは、真菌量の劇的な低減を生じたことが実証され、それは、最近の文献中のマウスモデルにおけるＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）によって生じた真菌量の低減についての大部分の報告よりも劇的である。ＡｍＢの有効用量を有意に低下させること及び対照アスペルギルス症に必要とされる用量数を低減させることによって、デクチン－２標的化リポソームＡｍＢ薬物（ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬ等）は、ヒト器官毒性をもたらさない濃度で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種の感染を有効に制御するだろう。

さらに、わずか０．２ｍｇＡｍＢ／ｋｇを送達し、真菌量を何桁も低減するデクチン－２標的化リポソームを使用して、本明細書において報告されたデータから、抗真菌ロードリポソームを真菌細胞へ直接標的化することが、隣接する肺の細胞及び組織を標的化するよりもはるかに有効である可能性があることが示唆される。抗真菌薬ロードリポソームの真菌細胞への接近は、それらの細胞へ送達された薬物の局所濃度を増加させる可能性が高い。本明細書において提供されるインビトロデータは、デクチン－２がＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの菌体外多糖マトリックス中のα－マンナンを主として標的化し、細胞壁のマンナン含有物を標的化しないことを示唆する。デクチン－２が、マウスモデルにおいてインビボのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌体外多糖マトリックスを主として標的化することはまだ確認していない。

アスペルギルス症に最もかかりやすい様々な患者集団が苦しむ異なる型の免疫抑制を模倣する、若干の異なるアスペルギルス症マウスモデルがある。本明細書において、免疫抑制のステロイドモデル及び白血球減少モデルの両方を使用して、真菌感染を媒介した（図２２）。ステロイドモデルにおいて、マウスを合成グルココルチコイドトリアムシノロンにより前処理し、当該前処理は、いくつかのＴ細胞及びＢ細胞の活性の抑制によって適応的免疫応答を損ない、肺組織の中へのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ菌糸の分裂増殖の増加を可能にするものである。ステロイド免疫抑制マウスモデルは、固形臓器移植を受ける免疫抑制患者、及び特にアスペルギルス症にかかりやすい患者である幹細胞移植を受ける患者の免疫不全状態を有効に模倣する（Ｄｅｓｏｕｂｅａｕｘｅｔａｌ．を参照）。しかしながら、このモデルの短所は、影響を受けた組織及び特に肺へ好中球の過剰な動員があり、劇的な炎症応答をもたらすということである。免疫系が部分的にのみ無効になるので、比較的大きな真菌接種物のサイズ（少なくとも２×１０^６の分生子）が、マウスの１００％が急性アスペルギルス症を発症することを保証するのに必要であった。５００，０００～１０^６の分生子の範囲のより小さな接種物のサイズにより処理された大部分のマウスは、抗真菌物質処理無しに生存し、その一方で、５×１０^６により処理されたほぼすべてのマウスはすべてＤ３までに死亡した。ステロイドモデルにおける早ければＤ１及びＤ２での何匹かの接種したマウスの喪失から、リポソーム処理が有効になる前に、マウスが炎症及び感染で死亡する可能性があることが示唆された。それにもかかわらず、真菌細胞へ標的化されたＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、低用量のＡｍＢを送達する非標的化ＡｍＢ－ＬＬに比べて肺中の真菌量を低減した。

実験の次のセットにおいて、白血球減少マウスモデル（図２２Ｂ）を、シクロホスファミド及びトリアムシノロンにより前処理したマウスにおいて用いた。シクロホスファミドはＤＮＡ合成阻害物質及び抗代謝物質であり、Ｂ細胞及びメモリーＴ細胞を包含する様々な白血球集団において、アポトーシス及び急速な低減を誘導する。これはステロイド（トリアムシノロン）の免疫抑制効果へ追加される。このモデルは、大部分の先天性応答及び免疫応答を消失させ、ステロイドモデルよりも、真菌細胞の分裂増殖の制限がはるかに少ない。重症の白血球減少症は、造血幹細胞移植レシピエントの免疫抑制状態を模倣する。これらのマウスが重症の白血球減少症を有するので、真菌接種物のより小さなサイズを使用することができ、それは初期の疾患進行を減速する。感染の初期の進行を遅らせることで、ＡｍＢ－ＬＬまたはＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬのいずれかによる処理が真菌量を低減する時間の猶予を可能にし、将来の実験においてマウスの生存を改善するだろうことが期待された。

両方のモデルは、真菌細胞へ標的化されたリポソームが、低用量のＡｍＢを送達する非標的化リポソームに比べて、肺中の真菌量を低減したという統計的に説得力のある証拠を生じた。図２６中で示されるように、ＡｍＢの低用量での肺中の真菌量のかかる劇的な低減から、マウスの生存率の改善及び動物への毒性の低減が確実に推測されるだろう。

本明細書において示されるように、ＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬは、インビトロで増殖させたＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの菌体外多糖マトリックス中のマンナンへ効率的に結合し、すべての３つの真菌種を殺傷する有効性を改善した。上で記載される実験から、デクチン－２標的化リポソーム媒介性抗真菌薬送達が、免疫抑制媒介性アスペルギルス症の２つの別個のマウスモデルにおいて、インビボのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓを阻害及び殺傷する有効性を劇的に改善したことが示された。複数の真菌病原体に対して有効な活性を示すインビトロのデータ、及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓでの本明細書において提示されるインビボのマウスのデータを考慮して、抗真菌薬のデクチン－２標的化は、他の多くの侵襲性真菌疾患（カンジダ症及びクリプトコッカス症が挙げられる）、及び恐らく皮膚糸状菌症（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍによって引き起こされる水虫感染及び爪の爪真菌症等）に対する汎抗真菌適用を有するだろう。

実施例４
診断
細胞培養
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ株ＣＥＡ１０（ＡＴＣＣＭＹＡ１１６３）を、ポリＬ－リジンにより前コートした２４ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート上で、Ｖｏｇｅｌの最少培地（ＶＭＭ）＋１％のグルコース^７７または赤色指標色素無しのＲＰＭＩ１６４０培地＋１％のグルコース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＫＵ－１１８３５－０３０、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で３７℃で１２～１６時間増殖させた。細胞をＰＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４）により洗浄し、４％のホルムアルデヒドにより４５分間固定し、ＰＢＳにより３×洗浄してから、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームによりインキュベーションした。

Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質
コドン最適化Ｅ．ｃｏｌｉ発現コンストラクトＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣの配列を、もたらされるタンパク質配列及びいくつかの予測されるタンパク質特性と一緒に、図２７中で示す。１５アミノ酸の長さのＧｌｙＳｅｒリッチフレキシブルスペーサーで、Ｖｅｎｕｓ断片からＤＥＣ２配列を分離した。２アミノ酸ほどの短いスペーサーが、ｐＥＴ－ＢｉＦＣ等のＢｉＦＣコンストラクト中で一般に使用される。約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５アミノ酸またはより長いスペーサーが、これらのコンストラクト中で使用され得ることが理解される。この例において、比較的長いスペーサーを使用して、融合タンパク質の相補的なＶｙＮ部分及びＶＣ部分が、リポソーム上に接近して置かれる間に、自然発生的に会合することを妨げた。両方の遺伝子配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、ｐＥＴ－４５Ｂ発現ベクターの中へサブクローン化した。修飾したタンパク質を、３７℃で６時間のＩＰＴＧ誘導に続いてＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１株中で発現させた。マウスｓデクチン－１について以前に記載されるように、両方を細胞から抽出し、ニッケル親和性カラム上で精製し、変性バッファー＃１（ｐＨ＝８．０、６ＭのＧｕＨＣｌ（ＦｉｓｈｅｒＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓＢＰ１７８）、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリエタノールアミン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２－メルカプトエタノール、０．１％のトリトン－Ｘ１００）中で保存した。

ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬の構築
新鮮に添加した５ｍＭの２－メルカプトエタノールを含むこの同じＧｕＨＣｌバッファー中の５μｇ／μＬの２つのタンパク質のサンプルを、１ＭのｐＨ１０のトリエタノールアミンによりｐＨ８．３へ調整し、４モル過剰量のＤＳＰＥ－ＰＥＧ－３４００－ＮＨＳ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）コンジュゲートポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎａｎｏｓｏｆｔｐｏｌｙｍｅｒｓから、１５４４－３４００）の反応性スクシンイミジルエステルＮＨＳ部分と２３℃で１時間反応させた。ＰＥＧ－ＤＳＰＥ部分のＰＥＧ部分は、これらの疎水性タンパク質をわずかにより可溶性にし、ＤＳＰＥはリポソーム膜の中へ挿入を可能にする脂質である。復元及び保存のバッファーＲＮ＃５（０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリエタノールアミン、ｐＨ８．０、１ＭのＬ－アルギニン、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２－メルカプトエタノール）中のＢｉｏ－ＧｅｌＰ－６アクリルアミド樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃１５０－０７４０）を介するサイズ排除クロマトグラフィーで、取り込まれていないＤＳＰＥ－ＰＥＧ及びＧｕＨＣｌを除去した^６９。２つの修飾したタンパク質を、活性アッセイまたはリポソームの中への取り込みにおける使用までＲＮ＃５中でおよそ５μｇ／μＬで保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、ＧｕＨＣｌが透析によって除去された後のタンパク質純度のレベルを調査した。

リポソームの中へのＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣの遠隔ローディング
ＦｏｒｍｕＭａｘＳｃｉ．Ｉｎｃ．からの滅菌ＰＥＧ化リポソーム（ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ、ＦｏｒｍｕＭａｘ＃Ｆ１０２０３Ａ）でスタートして、リポソームの小さなバッチを、１００％のリポソーム脂質に対して、各々０．５モルパーセントの、ＤＳＰＥ－ＰＥＧにより修飾したＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣ（依然としてＲＮ＃５バッファー中である）を添加して、ＰＢＳ中での６０℃で３０分間のインキュベーションによって調製して、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬を作製した（表２）。表２は、全量のリポソーム脂質を１００モルパーセントで表わし、ＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣのモルとして、本明細書において検討したＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームの化学組成を示し、最近記載されたアンホテリシンＢロードＤＥＣ２－ＡｍＢ－ＬＬに比較した。ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームを、蛍光アッセイでの使用の前に、リポソーム希釈バッファー＃２（ＬＤＢ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのトリエトアノラミン（Ｔｒｉｅｔｈｏａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、５％のＢＳＡ、ｐＨ８．０）の中へ希釈した。

可溶性多糖類及び細胞へのＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬の結合
無細胞アッセイ。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの可溶性マンナン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０８４Ｋ３７８９）、Ｌａｍｉｎａｒｉａｄｉｇｉｔａｔｅからのラミナリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ－９６３４）、スクロース（Ｓｉｇｍａ）、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種から精製して、４０，０００の分子量にサイズ分画したデキストランＴ４０（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ、カタログ番号５５１０００４０９００７）の多糖類ストックを、ＰＢＳ中で１０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いでこれらを、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームを含有するＬＤＢ２バッファーの中へ１：１０で希釈してから、室温でインキュベーションした。

細胞ベースのアッセイ。ホルマリン固定真菌細胞を、リポソーム希釈バッファーＬＤＢ２（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのトリエトアノラミン（ｔｒｉｅｔｈｏａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、５％のＢＳＡ、ｐＨ８．０）中で、ＢＭＥを新鮮に添加して、２３℃でリポソームと共にインキュベーションした。細胞と共にインキュベーションする前に、ＤＥＣ２タンパク質構成要素の濃度ｗ／ｖがそれぞれ２μｇ／１００μＬ、１．０μｇ／１００μＬ、または０．５のμｇ／１００μＬの間であるように、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣリポソームをＬＤＢ２バッファーの中へ希釈した。インキュベーションを２３℃または４℃で遂行した。Ｖｅｎｕｓの緑色蛍光ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームにより染色された真菌コロニーの画像を、ＧＦＰフィルターを使用して、ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ７０倒立顕微鏡で２０×で撮り、並列の画像を明視野で撮った。明視野画像から緑色チャンネルデータ及び青色のチャンネルデータを差し引き、緑色蛍光チャンネルからの緑色チャンネルデータを追加して戻すことによって、マージ画像をＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐで作成した。

結果
デクチン－２はリンパ球の膜中でモノマーとして漂うが、真菌細胞壁、菌体外多糖マトリックス、バイオフィルム、ならびに組織及び血液の中へ放出された多糖類断片中のα－マンナンに結合するために、細胞外Ｃ型レクチン受容体ドメインのダイマーを形成しなくてはならない。ダイマー化は、真菌感染の免疫系にシグナルを伝える。二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）に基づいた無細胞の汎真菌検出系を操作するために、ダイマー化のデクチン－２の特性を用いた。デクチン－２（ＤＥＣ２）の炭水化物認識ドメインを、緑色蛍光タンパク質ＶＥＮＵＳの２つの相補的な断片（ＶｙＮ及びＶＣ）へ融合させた。ＤＥＣ２－ＶｙＮ。ＤＥＣ２－Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質を脂質担体ＤＳＰＥ－ＰＥＧにより修飾し、リポソーム膜中でモノマーとして一緒に浮遊させて、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬を作製した。ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓに結合すると、真菌細胞特異的な緑色蛍光シグナルを生じた。細胞特異的でない蛍光シグナルは、生じなかった。試薬が可溶性多糖類へ結合すると、マンナン特異的なシグナルを生じた。今後の取り組みは、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓへの結合に際して生成されるシグナルを探索することであろう。ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ技術には、生命を脅かす侵襲性真菌感染についての、単純で迅速な１ステップ診断薬としての可能性がある。

侵襲性真菌感染は、真菌に関連しない疾患としてしばしば誤診される。抗真菌薬療法の遅延は、患者の死亡リスクを有意に増加させる。以下に、非真菌疾患として、アスペルギルス症、カンジダ症及びクリプトコッカス症の誤診の例がある。アスペルギルス症及び結核（ＴＢ）の多くの症状が同じであり、最初の誤診、及び抗真菌薬による治療の代わりのＴＢを治療する抗菌薬の投与を導く。同様に、侵襲性カンジダ症は、細菌感染として多くの場合誤診され、これらの患者は広域スペクトラム抗菌薬により治療される。さらに、抗菌薬による患者の治療は、Ｃａｎｄｉｄａ属の種による過剰増殖を促進し、侵襲性カンジダ症の急性症例になる患者の機会を増加させる。クリプトコッカス性髄膜炎は、脳腫瘍としてしばしば誤診され、したがって患者は抗真菌薬により直ちに治療されない。真菌感染を同定し、それらから類似する総体症状（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｙ）の有る非真菌疾患を識別する、信頼できて迅速で感度の良い汎真菌診断薬が本明細書において提供される。

真菌感染を診断する現行の方法の信頼性、迅速性、及び感度に関する深刻なはっきりとした問題がある。カンジダ症の診断のための最も一般的な技法はインビトロの培養であり、それは１ｍＬあたりわずか１細胞を検出することができる。しかし、感染直後にＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ酵母細胞が宿主組織中で隠れて真菌細胞ベースの血清検出を回避することができるので、細胞培養技法及びＰＣＲでさえ、当該疾患の患者のうちの５０％でカンジダ症を検出しない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＣａｎｄｉｄａ属の種が、真菌特異的な多糖類を血清、喀痰、気管支肺胞洗浄液、及び尿の中へ放出するので、真菌多糖類のアッセイ、特にマンナン及びガラクトマンナン及びβ－グルカンの免疫アッセイが考案された。しかしながら、急性アスペルギルス症についての現行のマンナン及びガラクトマンナンアッセイ（例えばＰｌａｔｅｌｉａＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びβ－グルカン汎真菌アッセイ（例えばＦｕｎｇｉｔｅｌ、ＢｅａｃｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、主として多ステップの免疫学的ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイである。これらの市販のアッセイは厳密には信頼できず、感染を検出できないか、または患者の有意な割合で偽陽性を示すかのいずれかである。さらに、これらのアッセイはポイントオブケアの設備に容易に適合せず、さらに診断を遅延させる。クリプトコッカス性髄膜炎は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の抗原の抗体ベースのＥＬＩＳＡ及びラテラルフローアッセイならびにＰＣＲアッセイを真菌ＤＮＡのために使用して診断されるが、患者の脳脊髄液のサンプルへ適用した場合に、これらのアッセイは類似する限定を有する。繰り返すが、早期検出は、侵襲性真菌疾患の多くの患者の生命を救うだろう。明らかに、より信頼でき単純で迅速な１ステップのポイントオブケアの真菌診断薬が、侵襲性真菌疾患の患者の管理ミスを低減するためにぜひとも必要である。

デクチン－２（ＣＬＥＣ６Ａ遺伝子）は、マウス及びヒトのいくつかのクラスのリンパ球の表面上で発現される膜貫通受容体を含有するＣ型レクチン（ＬＥＣｔｉｎ）ドメインである。デクチン－２は、真菌のαマンナンならびにマンノタンパク質へ結合するとダイマーまたはマルチマーを形成して、真菌感染の先天性免疫系及び適応性免疫系にシグナルを伝える。しかしながら、高分子量の多型性真菌多糖類と細胞膜受容体の相互作用について、親和定数を決定することは困難である。様々な出版物から採用されたモデルのマンナンについてのｓデクチン－２－タンパク質融合物の親和性の推定値から、当該融合物はマンナン含有多糖類について中等度の親和性のみしか有していないことが示唆される。しかしなお、Ｃｌｅｃ４ｎ^－／－ヌルマウスへの野生型の応答の比較は、マンナンポリマーの１ｎｇ／ｍＬの濃度にデクチン－２シグナリングが最大に応答することを実証し、このことは、親和定数（Ｋｄ）がサブナノモル範囲中であることを示唆する。

本明細書において示されるように、ｓデクチン－２（ＤＥＣ２）コートリポソームは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの菌体外多糖マトリックスへ、非常に急速に効率的に、そして比較的不可逆的に結合する。したがって、ＤＥＣ２による新たな汎真菌診断薬の開発が進められた。Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種は、それぞれＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ綱（子嚢菌門）、Ｔｒｅｍｅｌｌｏｍｙｃｅｔｅｓ綱（担子菌門）、及びＥｕｒｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ綱（子嚢菌門）の３つの進化的に異なるクラスの真菌に属する。それらは、真菌界の進化の比較的初期の８億～１３億年前に、共通の祖先から別れたことが推定される。ＤＥＣ２コートリポソームがすべての３つの細胞外マトリックスへ特異的に結合したので、このことから、大部分の病原性真菌の細胞外マトリックス中で見出されるマンナンが、ＤＥＣ２ベースの診断薬によって認識される構造で、十分に保存されるだろうということが示唆される。

本明細書において、マンナン含有多糖類への結合に際してダイマーを形成するというＤＥＣ２の特性を、二分子蛍光補完（ＢｉｍｏｌｅｃｕｌａｒＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＢｉＦＣ）によって蛍光シグナルを生じるために使用した。蛍光タンパク質ＶＥＮＵＳの相補的な断片へ融合したＤＥＣ２を調製し、同じリポソーム中で一緒に組み合わせた。もたらされたＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞へ結合した場合に、明瞭な蛍光シグナルを生じた。この技術は、多様な病原性真菌、それらの菌体外多糖マトリックス、バイオフィルム、及び放出された多糖類についての単純で迅速な１ステップのポイントオブケアのアッセイを産生することができた。

ＤＥＣ２を使用するリポソームベースの１ステップの検出系のモデルを、図２８中で図解する。これは、ＤＥＣ２が真菌マンナン及びＢｉＦＣへ結合すると、ＤＥＣ２がダイマー化することに基づく。２つの別個のｓデクチン－２タンパク質を産生した。第１のものは、緑色蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓのＮ末端部分ＶｙＮ（Ｖｅｎｕｓ残基１～１５５、突然変異Ｔ１５４Ｍ）へ融合して、ＤＥＣ２－ＶｙＮを作製した（図２８Ａ、２８Ｂ）。ＶｙＮＶｅｎｕｓ突然変異断片は、Ｃ末端Ｖｅｎｕｓ断片との自然発生的な会合が低減される、Ｃ末端断片との会合に際して強いシグナルを生じる、及び他の蛍光タンパク質のＮ末端断片または非修飾ＶＮ断片に比べて短所がほとんど無いという利点を有する。産生された第２のタンパク質は、ｓデクチン－２をＶｅｎｕｓのＣ末端部分ＶＣ（Ｖｅｎｕｓ残基１５５～２３８）へ融合して、ＤＥＣ２－ＶＣを作製した（図２８Ａ、２８Ｂ）。このＶＣ断片は、ＢｉＦＣ適用において以前に成功しているＶｙＮとパートナーになった。２つのコードＤＮＡ及び２つのＢｉＦＣ融合タンパク質（ＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣ）の正確な配列を、図２７中で示す。両方のコード配列をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、タンパク質を塩酸グアニジン変性バッファーの中へ抽出し、本明細書において記載される方法を使用して、親和性クロマトグラフィーによって精製した。まだ変性している間に、相補的なペアの融合タンパク質を各々、遊離リジン残基を経由して、アミン反応性の両疎媒性脂質試薬ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳへカップリングした。次いでＤＳＰＥ－ＰＥＧ修飾タンパク質を、カップルしたＤＳＰＥ部分を経由して、同じ１００ナノメートルの直径のリポソームの膜の中へ、等モル比で挿入して、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームを作製した（図２８Ａ）。各々の１００ｎｍのリポソームの中へ挿入されるＤＥＣ２融合タンパク質の数は、リポソーム脂質分子の数に対して、１モルパーセントのＤＥＣ２または１，５００のＤＥＣ２分子へ限定された。換言すれば、各々のリポソーム中におよそ７５０のＤＥＣ２－ＶｙＮ及び７５０のＤＥＣ２－ＶＣタンパク質分子がある。本明細書における目標は、２つのＶｅｎｕｓ断片の自然発生的な会合（それはマンナン結合無しの蛍光の高いバックグラウンドシグナルを生成し得る）を回避するのに十分なほどに低いタンパク質の濃度を使用するが、試薬が真菌マンナンに遭遇した場合に、有効な結合、ダイマー化、及び強いシグナルを増進するのに十分なほどに高いＤＥＣ２の濃度を使用することであった。ＤＥＣ２－ＶｙＮモノマー及びＤＥＣ２－ＶＣモノマー（リポソーム膜中で一緒に浮遊する）が、真菌細胞マンナンに結合すると、ダイマーまたはマルチマーをほとんど排他的に形成するであろうことが提案された。ＤＥＣ２ダイマー化が、Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質－ＶｙＮ及び－ＶＣの相補的部分のアセンブリを増進して、ＢｉＦＣシグナルを生じるであろうことも提案された。

無細胞のマイクロタイタープレートアッセイを予備形成してＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームが多糖類α－マンナンについて特異的な蛍光シグナルを生じたことを実証した。１μｇ／１００μＬのＤＥＣ２タンパク質を培地へ送達するＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームを、α－マンナンを含有する可溶性酵母マンナン、ラミナリン（可溶性β－グルカン）、スクロース（グルコース及びフルクトースの二糖）、及びデキストラン（α－グルカン）によりインキュベーションした。シグナルを、ＧＦＰチャンネルで蛍光マイクロタイタープレートリーダーで観察した。図２９は、統計的に有意に高いレベルのＶｅｎｕｓ緑色蛍光が、他の多糖類によるものに比べて、マンナンを含有するウェル中で観察されたことを示す（ｐ＝＜０．０１）。これらの結果は、デクチン－２について予想されるように、シグナルがマンナンに比較的特異的であるという見解を支持する。最大シグナルは２時間後に観察され、より長いインキュベーションにより減少した。

細胞ベースの顕微鏡によるアッセイを予備形成して、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームが真菌細胞特異的蛍光シグナルを生じたことを実証した。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子をポリＬ－リジンコートマイクロタイタープレート上で発芽させ、直径３００～５００ミクロンの小さなコロニーを形成する初期の菌糸ステージまで一晩に増殖させた。細胞をホルマリン中で固定し、リポソーム希釈バッファーの中で洗浄した。細胞を、２μｇ／１００μＬ、１μｇ／１００μＬ、及び０．５μｇ／１００μＬの全ＤＥＣ２タンパク質濃度をインキュベーション培地へ送達する、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬によりインキュベーションした。

ＢｉＦＣシグナルは、倒立蛍光顕微鏡のＧＦＰチャンネル（励起５１５／発光５２８）で容易に観察された。図３０は、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬（１μｇＤＥＣ２タンパク質／１００μＬ）がＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓコロニーへ結合した場合に形成された蛍光シグナルを示す。ＢｉＦＣ蛍光シグナルは真菌細胞と会合した時のみ観察され、したがって特異的真菌細胞である（図３０Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）。調査した１００を上回る真菌細胞のコロニーの全部は、試薬に結合した。シグナルは、各々の真菌コロニーの中央で最も強かった。各々のコロニーの中央が最も厚い細胞層及び最も古い細胞を有し、リジンコートプレートの表面への接着を援助する接着性マンナンに富む菌体外多糖を産生するのに最も時間がかかっていることに注目されたい。本発明者は、ＤＥＣ２が、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓによって産生された菌体外多糖の結合に特に優れていること、及び菌体外多糖の沈着が、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬への結合を促進するであろうことを以前に示した。大部分の長さにわたって染色される長い菌糸がある。最大シグナルは、２～３日間のインキュベーション後に観察された。蛍光シグナルを示さず、恐らく試薬に結合しなかった菌糸体の例があった（白色矢印、図３０Ｂ）。同様に強い真菌細胞特異的なシグナルも２μｇＤＥＣ２／１００μＬを送達するリポソームを使用して検出され、０．５μｇＤＥＣ２／１００μＬでわずかに弱いシグナルが検出された。蛍光は、細胞の間（図３０Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、または真菌細胞を欠如する対照ウェル中で観察されなかった。バッファーによりインキュベーションされた対照細胞は、緑色蛍光シグナルを示さなかった（図３０Ｉ及びＪ）。

ＢｉＦＣコンストラクト中の蛍光タンパク質の選択としてのＶｅｎｕｓ
Ｖｅｎｕｓは、２つの理由でＢｉＦＣ汎真菌診断薬を構築するための最適な蛍光タンパク質として選択された。第一に、Ｖｅｎｕｓが選ばれたのは、最もよく研究された黄色、緑色、及びセルリアンブルーの蛍光タンパク質のいくつかうちで、パートナータンパク質によって一緒になることを強制されたのではない場合に、Ｖｅｎｕｓの２つの断片（Ｃ末端断片ＶＣ及び変異Ｎ末端断片ＶｙＮ）では、最も低い自然発生的な会合速度が報告されていたからである。自然発生的な会合は、所望される標的への融合タンパク質の結合に依存しない蛍光シグナルを生じ、ＢｉＦＣ技術の開始以来の問題であった。低い自然発生的な会合速度は、偽陽性（すなわち真菌細胞マンナンの非存在下における蛍光シグナル）を生じない診断試薬の開発に必須であると判断された。第二に、Ｖｅｎｕｓは最も明るい蛍光タンパク質の１つで、非常に明るい黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ファミリー中のタンパク質に由来する。量子収率（吸収した光子あたりの放出した光子）は、０．５～０．６の範囲中である（例えば理論上１００％収率のうちの５０～６０％）^７０。これは、蛍光細胞化学のために一般的に使用される最も蛍光性の低分子量の蛍光分子のうちの１つであるローダミンの量子収率の０．７に類似する。

ＢｉＦＣ試薬リポソーム
ＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣの両方を含有するＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームは、複数の理由のために、溶液中で遊離した２つの可溶性タンパク質ＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣを使用する代わりに、デザインされた。第一に、ＤＥＣ２モノマーは比較的不溶性であり、６Ｍの塩酸グアニジンバッファー中で保存することによって、溶解状態で維持される。第二に、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－部分の添加は、ＤＥＣ２モノマーを安定化し、部分的に可溶化し穏やかに変性させる１Ｍのアルギニン含有バッファー中で一定期間保存することを可能にする。この修飾はリポソームの中への修飾したタンパク質の挿入のために必須である。しかしながら、２つのタンパク質のこの修飾形態は、リポソーム不含有の診断試薬として使用され得る可能性がある。第三に、リポソームを使用して、操作するのがより容易である安定的な試薬中でＤＥＣ２モノマーの局所濃度を制御した。本明細書における目標は、この場合もやはり、高いＤＥＣ２濃度であるが、それが連結されるＶｅｎｕｓ断片の自然発生的な会合及び有意な測定可能な蛍光バックグラウンドを導くほど高い濃度ではないものを達成することであった。これらの初期の実験において、例えば、１，５００のＤＥＣ２モノマー（すなわち７５０のＤＥＣ２－ＶｙＮモノマー＋７５０のＤＥＣ２－ＶＣモノマー）が有効であったということが見出された。リポソームを４℃で２か月間保存した後でさえ、自然発生的なシグナル形成は観察されなかった。モノマーの濃度を増加または減少させることができることが理解される。第四に、そして恐らく最も重要なことには、試薬リポソームの結合力の特性が蛍光シグナルの強度を指数関数的に増加させるはずである。結合力のための能力は、ペンタマーのＩｇＭ抗体について観察されるような、各々のリポソーム上に複数のマンナン結合部位を有することによって生成される。一旦１つのＤＥＣ２－ＶｙＮ及びＤＥＣ２－ＶＣのペアがマンナンに富む真菌多糖類中のマンナンに結合したならば、結合がリポソーム上の隣接するＤＥＣ２分子に広がるにつれて、シグナルは、マンナンに富む多糖類中の隣接するマンナン部分への結合を増幅させるはずである。一旦シグナルが発生し始めたならば、結合力はシグナルも安定させるはずである。可溶性ＢｉＦＣ診断薬試薬は、これらの利点を提供することができない。本明細書において提示されたデータは、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームにより遂行された。結果は明らかに肯定的であり、試薬によって生成される蛍光性のシグナルが真菌細胞特異的であることに疑いの余地はほとんどない。

他の例において、より短いスペーサーを使用して、より迅速なシグナル形成のためにＶｙＮ断片及びＶＣ断片をより効率的に一緒にすることを強制できる。本明細書において記載される系を使用して、真菌サンプルとＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬を組み合わせて、約３０分、４０分、または６０分間以内に最大のシグナルを得ることができる。

α－マンナンへのデクチン－２炭水化物認識ドメインの緊密な結合は、白血球の表面上でインビボのダイマー形成を伴う。細胞外炭水化物認識ドメインＤＥＣ２によってダイマーを形成するというこの特性は、インビトロで作動する真菌細胞特異的な診断薬の開発に成功裡に用いられた。ＤＥＣ２を蛍光タンパク質ＶＥＮＵＳの２つの相補的断片へ融合して、ＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームを作製した。単純にＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ細胞とＤＥＣ２－ＢｉＦＣ試薬リポソームをインキュベーションすることによって、明瞭な真菌細胞特異的な緑色蛍光性のシグナルが生じた。したがって、本技術は、侵襲性真菌疾患の患者の管理ミスを低減する、単純な１ステップのポイントオブケアの真菌診断薬、及び恐らく表在性真菌疾患の診断薬として使用され得る。

さらに、多様な標的真菌多糖類に結合すると、マルチマーを形成する多数のＣ型レクチン結合タンパク質があり、これを用いて本診断技術を発展させることができる可能性がある（例えばＨａｒｄｉｓｏｎｅｔａｌ．“Ｃ－ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅａｎｔｉｆｕｎｇａｌｉｍｍｕｎｉｔｙ，”ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ．１３，８１７－８２２（２０１２）を参照）。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、前記標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、前記抗真菌剤が前記リポソーム中にカプセル化される、前記リポソーム。
（項目２）
前記真菌細胞上の前記標的抗原が、真菌細胞壁抗原、または前記真菌細胞に付随する菌体外多糖マトリックス中の抗原である、項目１に記載のリポソーム。
（項目３）
前記標的化分子が、Ｃ型レクチン受容体、抗体、真菌細胞壁結合タンパク質、菌体外多糖結合タンパク質、キチン結合タンパク質、またはその断片である、項目１または２に記載のリポソーム。
（項目４）
前記Ｃ型レクチン受容体が、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３、またはその断片からなる群から選択される、項目１～３のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目５）
前記Ｃ型レクチン受容体またはその断片が、前記真菌細胞上のβ－グルカンまたはマンナンへ結合するポリペプチドを含む、項目４に記載のリポソーム。
（項目６）
前記抗真菌剤が、ポリエン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、またはエキノキャンディン系抗真菌剤である、項目１～５のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目７）
前記ポリエン系抗真菌剤が、アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）である、項目６に記載のリポソーム。
（項目８）
前記標的化分子またはその断片が、脂質またはＰＥＧ化脂質へコンジュゲートされる、項目１～７のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目９）
前記抗真菌薬の濃度が、リポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子を含まない前記リポソーム中にカプセル化された前記抗真菌薬の濃度に比較して、低減される、項目１～８のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目１０）
前記リポソームが、リポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子を含まない前記リポソームに比較して、動物細胞について減少した親和性を有する、及び／または前記動物細胞へより低い毒性である、項目１～９のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目１１）
前記真菌細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の細胞である、項目１～１０のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目１２）
前記真菌細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞である、項目１～１１のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目１３）
項目１～１２のいずれか１項に記載の複数のリポソーム。
（項目１４）
標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及びシグナル生成分子を含み、前記標的化分子がリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、前記標的化分子が前記標的真菌細胞抗原に結合する場合に、前記シグナル生成分子がシグナルを生成する、前記リポソーム。
（項目１５）
前記シグナル生成分子が前記標的化分子へ連結される、項目１４に記載のリポソーム。
（項目１６）
前記シグナル生成分子が、前記リポソームの外側表面の中へ取り込まれるかまたは外側表面へ付着される、項目１４に記載のリポソーム。
（項目１７）
前記シグナル生成分子が、蛍光色素または蛍光ポリペプチドである、項目１４～１６のいずれか１項に記載のリポソーム。
（項目１８）
前記標的化分子が、蛍光タンパク質のＣ末端断片及び／またはＮ末端断片へ連結される、項目１５に記載のリポソーム。
（項目１９）
項目１４～１８のいずれか１項に記載の複数のリポソーム。
（項目２０）
各々の前記複数のリポソームが、蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された標的化分子、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された標的化分子を含む、項目１８に記載の複数のリポソーム。
（項目２１）
各々のリポソームが、蛍光タンパク質のＮ末端断片へ連結された少なくとも約５００の標的化分子、及び蛍光タンパク質のＣ末端断片へ連結された少なくとも約５００の標的化分子を含む、項目２０に記載の複数のもの。
（項目２２）
前記標的化分子が、デクチン－１、デクチン－２、またはデクチン－３である、項目１４～２１のいずれか１項に記載の複数のもの。
（項目２３）
前記複数のものが、固体支持体上で固定化される、項目１４～２２のいずれか１項に記載の複数のもの。
（項目２４）
項目１３に記載の複数のリポソームを含む、医薬組成物。
（項目２５）
有効量の項目１３に記載の複数のリポソームを、真菌感染を有するかまたは真菌感染を発症するリスクがある対象へ投与することを含む、前記対象における真菌感染を治療または予防する方法。
（項目２６）
項目２４に記載の医薬組成物を、真菌感染を有するかまたは真菌感染を発症するリスクがある対象へ投与することを含む、前記対象における真菌感染を治療または予防する方法。
（項目２７）
前記真菌感染が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の感染、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の感染、Ｃａｎｄｉｄａ属の感染、またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の感染がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓの感染である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記対象が免疫不全である、項目２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記対象が、肺炎、喘息、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、結核、肺気腫、またはサーコイドーシスを有する、項目２５～２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記リポソームが、局所的、鼻内、全身的、または吸入経由で投与される、項目２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
第２の治療剤または療法が前記対象へ施される、項目２５～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記第２の療法が外科手術である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記第２の治療剤が第２の抗真菌剤である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、前記標的化分子が各々のリポソームの外側表面の中へ取り込まれ、前記抗真菌剤が各々のリポソーム中にカプセル化される、複数のリポソームを作製する方法であって、
ａ）前記抗真菌剤を溶媒中で約６０℃で約１０分間～約３０分間溶解するステップ；
ｂ）懸濁物中の複数のリポソームを、ステップ（ａ）の前記抗真菌物質／溶媒溶液と、約６０℃で約３～約５時間または３７℃で約２４～１２０時間混合することによって、各々のリポソームの中へ前記抗真菌剤をカプセル化するステップ；及び
ｃ）前記カプセル化された抗真菌剤を含む前記リポソームを、前記標的化分子と６０℃で約４５分間～約９０分間接触させることによって、各々のリポソームの外側表面の中へ前記標的化分子を取り込むステップ、
を含む、前記方法。
（項目３６）
前記標的化分子が脂質へコンジュゲートされる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記脂質がＰＥＧ化脂質である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記標的化分子が、Ｃ型レクチン受容体、抗体、キチン結合タンパク質、またはその断片である、項目３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｃ型レクチン受容体またはその断片が、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン３、またはその結合断片からなる群から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン３、またはその結合断片からなる群から選択される、前記Ｃ型レクチン受容体またはその断片が、アルギニンを含む復元バッファー中で維持され、前記リポソームの中への取り込みの前に還元される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
抗真菌剤及び標的化分子を含む前記リポソームを、アルギニンを含む復元バッファー中で保存することをさらに含む、項目３５～４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記抗真菌剤が、ポリエン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、またはエキノキャンディン系抗真菌剤である、項目３５～４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記ポリエン系抗真菌剤がアンホテリシンＢである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
対象、または対象からのサンプルにおける真菌感染を検出する方法であって、
ａ）前記対象、または前記対象からのサンプルを、項目１４～２２のいずれか１項に記載の複数のリポソームと接触させること；
ｂ）シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、
を含む、前記方法。
（項目４５）
前記標的化分子が、蛍光タンパク質、抗体もしくはその断片、または酵素へ連結される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記シグナルが直接的または間接的に検出される、項目４４または４５に記載の方法。
（項目４７）
対象、または前記対象からのサンプルにおける真菌感染を検出する方法であって、
ａ）前記対象、または前記対象からのサンプルを、項目２０または２１に記載の複数のリポソームと接触させること；
ｂ）前記蛍光タンパク質のＮ末端断片とＣ末端断片との間の相互作用によって生成された蛍光シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、
を含む、前記方法。
（項目４８）
前記蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質またはその誘導体である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記サンプルが、固体支持体上で固定化された前記複数のものと接触させられる、項目４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記サンプルが、血清、血液、または尿のサンプルである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記蛍光シグナルが二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルによって検出される、項目４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＮ末端部分またはＣ末端部分を含む、融合ポリペプチド。
（項目５３）
前記標的化分子が、Ｃ型レクチン受容体、抗体、真菌細胞壁結合タンパク質、キチン結合タンパク質、またはその断片である、項目５２に記載の融合ポリペプチド。
（項目５４）
前記標的化分子が、デクチン－１もしくはデクチン－２、またはその断片である、項目５３に記載の融合ポリペプチド。
（項目５５）
前記蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質またはその誘導体である、項目５２～５４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
（項目５６）
対象、または前記対象からのサンプルにおける真菌感染を検出する方法であって、
ａ）前記対象、または前記対象からのサンプルを、標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＮ末端部分を含む、第１の複数の融合ポリペプチド、ならびに標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＣ末端部分を含む、第２の複数の融合ポリペプチドと接触させること、
ｂ）前記蛍光タンパク質のＮ末端断片とＣ末端断片との間の相互作用によって生成された蛍光シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、
を含む、前記方法。
（項目５７）
前記サンプルが、血清、血液、または尿のサンプルである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記蛍光シグナルが二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルによって検出される、項目５６～５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記標的化分子がＣ型レクチン受容体またはその断片である、項目５６～５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記断片が、前記Ｃ型レクチン受容体のＮ末端断片またはＣ末端断片である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記Ｃ型レクチン受容体が、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３、またはその断片である、項目５６～６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
ａ）デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３、またはその断片からなる群から選択されるＣ型レクチン受容体；ならびに
ｂ）復元バッファー、
を含む、組成物。
（項目６３）
前記復元バッファーが、約０．５ＭのＬ－アルギニン～１．５ＭのＬ－アルギニンを含む、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３、またはその断片からなる群から選択される前記Ｃ型レクチン受容体が、検出可能な標識を含む、項目６２または６３に記載の組成物。
（項目６５）
前記Ｃ型レクチン受容体が、配列番号：２のアミノ酸２３～１９９、配列番号：４のアミノ酸２３～１８９、配列番号：６のアミノ酸２３～１００、配列番号：８のアミノ酸３５～２１４、配列番号：１０のアミノ酸３６～２０３、配列番号：１２のアミノ酸３５～２０７、またはその断片を含むポリペプチド配列を含む、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記検出可能な標識が蛍光標識である、項目６４または６５に記載の組成物。
（項目６７）
項目６１～６６のいずれか１項に記載の組成物を含む、キット。
（項目６８）
項目のいずれか１項に記載のリポソームまたは項目１～２３のいずれか１項に記載の複数のリポソームを含む、組成物。
（項目６９）
項目６８に記載の組成物を含む、キット。

Claims

リポソームであって、抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含み、前記標的化分子が前記リポソームの外側表面の中へ取り込まれるＣ型レクチン受容体であり、前記抗真菌剤が前記リポソーム中にカプセル化される、リポソーム。
前記真菌細胞上の前記標的抗原が、真菌細胞壁抗原、または前記真菌細胞に付随する菌体外多糖マトリックス中の抗原である、請求項１に記載のリポソーム。
前記Ｃ型レクチン受容体が、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３、またはその断片からなる群から選択される、請求項１または２に記載のリポソーム。
前記Ｃ型レクチン受容体またはその断片が、前記真菌細胞上のβ－グルカンまたはマンナンへ結合するポリペプチドを含む、請求項３に記載のリポソーム。
前記抗真菌剤が、ポリエン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、またはエキノキャンディン系抗真菌剤である、請求項１～４のいずれか１項に記載のリポソーム。
前記ポリエン系抗真菌剤が、アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）である、請求項５に記載のリポソーム。
前記標的化分子またはその断片が、脂質またはＰＥＧ化脂質へコンジュゲートされる、請求項１～６のいずれか１項に記載のリポソーム。
前記抗真菌薬の濃度が、リポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子を含まない前記リポソーム中にカプセル化された前記抗真菌薬の濃度に比較して、低減される、請求項１～７のいずれか１項に記載のリポソーム。
前記リポソームが、リポソームの外側表面の中へ取り込まれる標的化分子を含まない前記リポソームに比較して、動物細胞について減少した親和性を有する、及び／または前記動物細胞へより低い毒性である、請求項１～８のいずれか１項に記載のリポソーム。
前記真菌細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載のリポソーム。
前記真菌細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓの細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のリポソーム。
請求項１～１１のいずれか１項に記載の複数のリポソーム。
請求項１２に記載の複数のリポソームを含む、医薬組成物。
請求項１２に記載の複数のリポソームを含む組成物であって、真菌感染を有するかまたは真菌感染を発症するリスクがある対象における真菌感染を治療または予防するための組成物。
真菌感染を有するかまたは真菌感染を発症するリスクがある対象における真菌感染を治療または予防するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
前記真菌感染が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の感染、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の感染、Ｃａｎｄｉｄａ属の感染、またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属である、請求項１４または１５に記載の組成物。
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の感染がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓの感染である、請求項１６に記載の組成物。
前記対象が免疫不全である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の組成物。
前記対象が、肺炎、喘息、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、結核、肺気腫、またはサーコイドーシスを有する、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の組成物。
前記組成物が、局所的、鼻内、全身的、または吸入経由で投与されることを特徴とする、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の組成物。
前記組成物が、第２の治療剤または療法と組み合わせて前記対象へ投与されることを特徴とする、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の組成物。
前記第２の療法が外科手術である、請求項２１に記載の組成物。
前記第２の治療剤が第２の抗真菌剤である、請求項２１に記載の組成物。
抗真菌剤、及び真菌細胞上の標的抗原に結合する標的化分子を含む複数のリポソームを作製する方法であって、前記標的化分子が各々のリポソームの外側表面の中へ取り込まれるＣ型レクチン受容体であり、前記抗真菌剤が各々のリポソーム中にカプセル化され、前記方法が、
ａ）前記抗真菌剤を溶媒中で約６０℃で約１０分間～約３０分間溶解するステップ；
ｂ）懸濁物中の複数のリポソームを、ステップ（ａ）の前記抗真菌物質／溶媒溶液と、約６０℃で約３～約５時間または３７℃で約２４～１２０時間混合することによって、各々のリポソームの中へ前記抗真菌剤をカプセル化するステップ；及び
ｃ）前記カプセル化された抗真菌剤を含む前記リポソームを、前記標的化分子と６０℃で約４５分間～約９０分間接触させることによって、各々のリポソームの外側表面の中へ前記標的化分子を取り込むステップ、
を含む、方法。
前記標的化分子が脂質へコンジュゲートされる、請求項２４に記載の方法。
前記脂質がＰＥＧ化脂質である、請求項２５に記載の方法。
前記Ｃ型レクチン受容体またはその断片が、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン３、またはその結合断片からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
前記Ｃ型レクチン受容体が、アルギニンを含む復元バッファー中で維持され、前記リポソームの中への取り込みの前に還元される、請求項２７に記載の方法。
抗真菌剤及び標的化分子を含む前記リポソームを、アルギニンを含む復元バッファー中で保存することをさらに含む、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
前記抗真菌剤が、ポリエン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、またはエキノキャンディン系抗真菌剤である、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記ポリエン系抗真菌剤がアンホテリシンＢである、請求項３０に記載の方法。
対象、または前記対象からのサンプルにおける真菌感染を検出する方法における使用のための、複数のリポソームを含む組成物であって、前記方法は、
ａ）前記対象、または前記対象からのサンプルを、前記組成物と接触させること；
ｂ）蛍光タンパク質のＮ末端断片とＣ末端断片との間の相互作用によって生成された蛍光シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、
を含み、前記複数のリポソームのそれぞれが、前記蛍光タンパク質の前記Ｎ末端断片に連結した標的化分子と、前記蛍光タンパク質の前記Ｃ末端断片に連結した標的化分子とを含み、前記標的化分子が標的真菌細胞抗原に結合し、前記標的化分子が前記リポソームの外側表面の中へ取り込まれ、前記標的化分子が前記標的真菌細胞抗原に結合する場合に、前記蛍光タンパク質がシグナルを生成する、組成物。
それぞれのリポソームが、前記蛍光タンパク質の前記Ｎ末端断片へ連結された少なくとも約５００の標的化分子、及び前記蛍光タンパク質の前記Ｃ末端断片へ連結された少なくとも約５００の標的化分子を含む、請求項３２に記載の組成物。
前記蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質またはその誘導体である、請求項３２または３３に記載の組成物。
前記サンプルが、固体支持体上で固定化された前記複数のものと接触させられる、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の組成物。
前記サンプルが、血清、血液、または尿のサンプルである、請求項３５に記載の組成物。
前記蛍光シグナルが二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルによって検出される、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の組成物。
対象、または前記対象からのサンプルにおける真菌感染を検出する方法における使用のための組成物であって、前記組成物は、標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＮ末端部分を含む、第１の複数の融合ポリペプチド、ならびに標的真菌細胞抗原に結合する標的化分子及び蛍光ポリペプチドのＣ末端部分を含む、第２の複数の融合ポリペプチドを含み、前記方法は、
ａ）前記対象、または前記対象からのサンプルを、前記組成物と接触させること、
ｂ）前記蛍光タンパク質のＮ末端断片とＣ末端断片との間の相互作用によって生成された蛍光シグナルを検出し、シグナルが真菌感染の存在を示すこと、
を含む、前記組成物。
前記サンプルが、血清、血液、または尿のサンプルである、請求項３８に記載の組成物。
前記蛍光シグナルが二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）シグナルによって検出される、請求項３８または３９に記載の組成物。
前記標的化分子がＣ型レクチン受容体またはその断片である、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の組成物。
前記断片が、前記Ｃ型レクチン受容体のＮ末端断片またはＣ末端断片である、請求項４１に記載の組成物。
前記Ｃ型レクチン受容体が、デクチン－１、デクチン－２、及びデクチン－３、またはその断片である、請求項４１に記載の組成物。
請求項１～１１のいずれか１項に記載のリポソームまたは請求項１２に記載の複数のリポソームを含む、組成物。
請求項４４に記載の組成物を含む、キット。