JP7530723B2 - 新規タウオパチーモデル動物の作製方法 - Google Patents

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Description

NPMD NITE P-02897 NPMD NITE P-02898
特許法第３０条第２項適用 平成３０年９月１５日に発行された日本認知症学会誌ＤＥＭＥＮＴＩＡ ＪＡＰＡＮ 第３２巻第３号（第３７回日本認知症学会学術集会プログラム・抄録集）の第３９３頁（シンポジウム２２、３）にて発表
本発明は、新規タウオパチーモデル動物の作製方法および該方法により作製された新規タウオパチーモデル動物に関し、具体的には、タウシードを用意するステップ、および、該タウシードを前記動物の脳内に注入するステップを含む、孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法と、該方法により作製された新規タウオパチーモデル動物とに関する。
タウ（ｔａｕ）は微小管結合タンパク質の一種で、神経系の細胞において、微小管の重合促進や安定化に働く分子である。アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、以下「ＡＤ」という。）の患者脳には、神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ、以下「ＮＦＴ」という。）やニューロピルスレッド（ｎｅｕｒｏｐｉｌ ｔｈｒｅａｄ、以下「ＮＴ」という。）等の特徴的な神経変性に伴うタウ線維病理構造物（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｕ ｆｉｂｒｉｌ）が存在する。タウはモノマーでは水溶性のタンパク質であるが、線維化して神経細胞内に前記病理構造物の主要構成成分として蓄積し、神経細胞が死んだ後も細胞外ＮＦＴとしてその場で残る場合がある。以下ではこれらをまとめてタウ線維病理構造物という。ＡＤの他にも、タウ線維病理構造物が出現する神経変性疾患には、ピック病（Ｐｉｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ、「ＰｉＤ」という。）、皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、「ＣＢＤ」という。）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ、「ＰＳＰ」という。）、神経原線維型老年認知症（ｓｅｎｉｌｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｏｆ ｔｈｅ ＮＦＴ ｔｙｐｅ、「ＳＤ－ＮＦＴ」という。）、嗜銀顆粒性疾患（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ、「ＡＧＤ」という。）等が知られている。そこでこれらの神経変性疾患は「タウが蓄積する疾患」という意味でタウオパチーと総称されている。ＡＤにおいてタウ線維病理構造物の分布は病気の進行とともに変化する。すなわちタウ線維病理構造物は、疾患の初期には青斑核に出現し、その後、嗅内皮質や海馬にみられるようになり、最終的には皮質全体に広がるという一定の進展様式を示す。タウ線維病理構造物の分布は臨床症状と相関することから、タウ線維病理構造物の形成が神経変性を引き起こす直接要因であると予想される。
正常なタウタンパク質の構造は水溶液中ではランダムコイル状といわれているが、患者脳内で蓄積しているタウはクロスβ構造に富むアミロイド線維を形成している。線維化したタウは、モノマーのタウタンパク質をさらに凝集させる。そのため、タウタンパク質が水溶性から不溶性線維を形成する構造変化が神経変性疾患の発症に深く関与すると予想されるが、そのメカニズムは明らかではない。また、タウ線維病理構造物の脳内分布が経時的に変化するメカニズムも不明である。タウオパチーの治療法は対症療法しか存在しない。そこで、タウタンパク質の高次構造の変化によりタウ線維病理構造物が形成され、さらに該タウ線維病理構造物の脳内分布が経時的に変化するメカニズムが解明されることがタウオパチーの有効な新規治療法の開発につながると考えられる。
ＡＤをはじめとするタウオパチーには、家族性（遺伝性）のものもあるが、多くは孤発性である。そこで、正常個体で発現するのと同じタウタンパク質を正常個体で発現するのと同じ量で発現する動物においてタウ線維病理構造物の脳内分布が経時的に変化する現象を再現し、ヒトの病態をより正確に反映する疾患動物モデルを開発する必要がある。
これまでに、不溶性タウをシードとしてマウスの脳内の特定部位に注入して、タウ線維病理構造物を脳内に形成させたタウオパチーモデル実験系が数件報告されている。このうち、Clavagueraら（非特許文献１および３）と、Ibaら（非特許文献２）とは、ヒト野生型または変異型タウタンパク質を発現するトランスジェニックマウスの脳に不溶性タウを注入した。すなわち、神経特異的マウスＴｈｙ１遺伝子（非特許文献１および３）か、マウスプリオンタンパク質遺伝子（非特許文献２）かのプロモーター領域でヒト野生型または変異型タウタンパク質をコード化するＤＮＡを駆動して神経細胞で恒常的に発現させるトランスジェニックマウスを作製し、該トランスジェニックマウス脳の細胞破砕液（非特許文献１）か、ヒト変異型タウタンパク質のｍｙｃタグ融合組換えタンパク質にヘパリンを添加して調製されたタウシード（非特許文献２）か、タウオパチーのヒト患者脳の抽出液（非特許文献３）かが前記トランスジェニックマウスの脳に注入された。また非特許文献４では、野生型マウスの脳に、ＡＤ患者脳由来のタウオリゴマーまたはタウシードが注入された。そして非特許文献５では、野生型マウスの脳に、ヒト野生型タウ組換えタンパク質にβ４２アミロイドオリゴマーを添加して調製されたタウオリゴマーか、該タウオリゴマーを振盪することにより調製されたタウシードかが注入された。
非特許文献１では、注入後６、１２および１５ヶ月経過後のトランスジェニックマウス脳においてＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色でタウ線維病理構造物が検出され、経時的に該タウ線維病理構造物の脳内局在の変化が観察された。非特許文献１ではトランスジェニックマウスではなく野生型マウスに不溶性タウを注入する実験も行われたが、タウ線維病理構造物の脳内局在の変化は観察されなかった。非特許文献２では、注入後１ヶ月からタウ線維病理構造物が検出された。なお、この実験に用いられたトランスジェニックマウスは、不溶性タウを注入しなくても、月齢８－９月でタウ線維病理構造物が脳内で検出される。非特許文献３では、タウオパチーのヒト患者脳の抽出液を注入した野生型マウスの脳で注入後６ヶ月でタウ線維病理構造物が検出された。非特許文献４では、ＡＤ患者脳由来のタウオリゴマーが注入された野生型マウス脳で注入後１１ヶ月でタウ線維病理構造物が検出された。非特許文献５ではβ４２アミロイドオリゴマーを添加して調製したタウオリゴマーを注入した野生型マウスにおいて、注入後３０時間後に認知機能の低下が認められた。一方タウシード注入群では認知機能に変化は認められない。さらに、どちらの群についても、注入後数ヶ月経過後における認知機能の低下またはタウ線維病理構造物の有無については検討されていない。
マウスを孤発性タウオパチーモデル動物として用いるうえでの課題は、ヒトとマウスとでは成体の脳で発現するタウタンパク質のアイソフォームが異なることである。図１は、霊長類およびほ乳類の成体の脳において選択的スプライシングによって生じる可能性のあるタウタンパク質のアイソフォームの全てを示す模式図である（図１）。ヒトのタウタンパク質とヒト以外の動物のタウタンパク質とをコードする遺伝子は非常に相同性が高く、エキソン／イントロン構造も共通である。ヒトのタウタンパク質とヒト以外の動物のタウタンパク質とは、いずれも、タウタンパク質のアミノ末端側の第２および第３エキソンと、カルボキシル末端側の第１０エキソンとについて選択的スプライシングによるアイソフォーム多型が存在する。第２、第３および第１０エキソンを含む全てのエキソンにコードされるアミノ酸配列を含む完全長アイソフォームが最も長く、第２、第３および第１０エキソンのいずれも含まないアイソフォームが最も短い。アミノ末端側については、第２および第３エキソンをともに含むアイソフォームに加えて、第２エキソンを含むが第３エキソンを含まないアイソフォームと、第２エキソンも第３エキソンも含まないアイソフォームとが存在する。カルボキシル末端については、第１０エキソンを含むアイソフォームと、第１０エキソンを含まないアイソフォームとが存在する。アミノ末端側の選択的スプライシングとカルボキシル末端側の選択的スプライシングとは独立に起こるので、図１に示すとおり合計６種類のアイソフォームが存在する。タウタンパク質に４個ある微小管結合領域のリピート配列のうち、第１０エキソンはアミノ末端側から２番目のリピート配列に相当するため、第１０エキソンを含まない変異型ポリペプチドは微小管結合領域のリピート配列が３個の３Ｒ型とよばれ、第１０エキソンを含むポリペプチドは微小管結合領域のリピート配列が４個なので４Ｒ型とよばれる。タウオパチー疾患の発症と関係する水溶性タウタンパク質から不溶性線維を形成する構造変化は微小管結合ドメインのリピート配列の数が多いほうが起こりやすいと考えられている。そこでタウタンパク質のアイソフォーム多型のうち、特に３Ｒ型および４Ｒ型が注目される。
ヒトの胎児期の脳では３Ｒ型タウのみが発現するが成体では３Ｒ型タウおよび４Ｒ型タウとがほぼ等量発現する。これに対し、マウスでは新生仔までは３Ｒ型タウのみが発現するが、離乳期以降は４Ｒ型タウのみが発現する（非特許文献６）。この違いは第１０エキソンから第１０イントロンにかけての部分のステムループ構造の差によるものと考えられている（非特許文献７および８）。４Ｒ型タウは、微小管結合ドメインのリピート配列が３型タウより１個多いため、タウタンパク質が水溶性モノマーから不溶性線維を形成する構造変化が３Ｒ型タウより起こりやすいと考えられている。
ヒトのタウオパチー患者脳に蓄積するタウ線維病理構造物中のタウタンパク質のアイソフォーム組成は疾患ごとに異なることが知られている。すなわち、ＡＤでは３Ｒ型および４Ｒ型が等量蓄積し、ＰｉＤでは３Ｒ型のみが蓄積し、そして、ＣＢＤおよびＰＳＰでは４Ｒ型のみが蓄積することが知られている（例えば非特許文献９）。また、タウオパチーのＳＤ－ＮＦＴの他、ダウン症候群をはじめとする多数の神経疾患で３Ｒ型および４Ｒ型が等量蓄積し、タウオパチーのＡＧＤ、Ｇｌｏｂｕｌａｒ ｇｌｉａｌ ＴａｕｏｐａｔｈｙおよびＴａｕ ａｓｔｒｏｇｌｉｏｐａｔｈｙの他、ハンチントン病をはじめとする多数の神経疾患で４Ｒ型のみが蓄積することも知られている（非特許文献１０）。さらに、遺伝性家族性前頭側頭型認知症・パーキンソニズム（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ）のうちタウ遺伝子（ＭＡＰＴ）の突然変異による疾患では、アミノ酸変異ごとに３Ｒ型および４Ｒ型が等量蓄積するか、３Ｒ型または４Ｒ型のみが蓄積することも知られている（非特許文献１０）。
これに対し、これまでのタウ接種実験に関する報告では、ＡＤ患者脳の不溶性画分接種実験において、４Ｒ型タウの蓄積を誘導することしかできず、３Ｒ型タウの蓄積は誘導できなかった（非特許文献３および１１）。また、Ｐｉｃｋ病患者脳の不溶性画分接種においても、３Ｒ型タウの蓄積を誘導できなかった。そのため従来のタウオパチーモデル実験系は、３Ｒ型タウと４Ｒ型タウとがほぼ等量発現するという、ヒト成体の脳でのタウタンパク質のアイソフォーム発現パターンを再現する実験系ではなかった。マウスの他、タウオパチーの疾患モデル動物として用いる可能性の高いラットおよびマーモセットでも、脳では新生仔までは３Ｒ型タウのみが発現するが、離乳期以降は４Ｒ型タウのみが発現する（非特許文献６および１２）。
そこで、これらの実験動物について、成体の脳で３Ｒ型タウと４Ｒ型タウとがほぼ等量発現するという、ヒト成体の脳でのタウタンパク質のアイソフォーム発現パターンを再現する実験系を開発することには大きな需要がある。
Clavaguera、F.ら、Nat. Cell Biol.、11: 909 (2009) Iba、M.ら、J. Neurosci.、33: 1024 (2013) Clavaguera、F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、110: 9535 (2013) Lasagna-Reeves、C.A.ら、Sci. Rep.、2: 700 (2012) Lasagna-Reeves、C.A.ら、Mol. Neurodegener.、6: 39 (2011) Takuma、H.ら、Developmental Brain Res.、142: 121 (2003) Grover、A.ら、J. Biological. Chem.、274: 15134 (1999) D' Souza、I.およびSchellenberg G.D.、J. Biological. Chem. 277: 26587 (2002) Taniguchi-Watanabe、S.ら、Acta Neuropathol.、131: 267 (2016) Goedert、M.、FEBD Letters、592: 2383 (2018) Guo、J.L.ら、J. Exp. Med. 213: 2635 (2016) Sharma、G.ら、J. Biological. Chem.、294: 11433 (2019)
以上説明したように、成体の脳で３Ｒ型タウと４Ｒ型タウとがほぼ等量発現するという、ヒト成体の脳でのタウタンパク質の微小管結合ドメインのリピート配列のアイソフォーム発現パターンを再現する孤発性タウオパチー疾患モデル動物を開発することが本発明が解決しようとする課題である。
本発明は孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法を提供する。該方法は、タウシードを用意するステップと、該タウシードを、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の脳内に注入するステップとを含む。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、いずれの動物種でもかまわないが、マウス、ラットまたはマーモセットの場合がある。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法において、前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳に由来する場合がある。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法において、前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳由来のサルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）不溶性画分を含む場合がある。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、ゲノム編集技術、遺伝子ターゲッティング技術またはベースエディティング技術で作製される場合がある。
本発明は、孤発性タウオパチーモデル動物を提供する。本発明の孤発性タウオパチーモデル動物は、本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法により作製される。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物は、配列番号１または２に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを染色体上に有する場合がある。ここで、配列番号１は前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する突然変異マウス系統の１つであるTau 3R/4R #2の第１０エキソン領域のヌクレオチド配列であり、配列番号２は前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する別の突然変異マウス系統であるTau 3R/4R #13の第１０エキソン領域のヌクレオチド配列である。
本発明は、本発明の孤発性タウオパチーモデル動物から回収される、動物の脳を提供する。
本発明は、本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法を提供する。該解析方法は、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の脳に、タウシードを注入するステップと、前記タウシードが注入された動物の少なくとも一部から脳を回収するステップと、該脳内のタウ線維病理構造物を特徴付けるステップとを含む。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、いずれの動物種でもかまわないが、マウス、ラットまたはマーモセットの場合がある。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、ゲノム編集技術、遺伝子ターゲッティング技術またはベースエディティング技術で作製される場合がある。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法において、前記脳内のタウ線維病理構造物は、該タウ線維病理構造物に含まれるタウタンパク質のアイソフォーム組成と、該タウタンパク質のリン酸化状態と、前記タウ線維病理構造物を含む脳組織のＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色とからなるグループから選択される、少なくとも１つの特性で特徴付けられる場合がある。
本発明は、本発明の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法を提供する。該解析方法は、前記孤発性タウオパチーモデル動物を試験環境に置いて、該孤発性タウオパチーモデル動物の行動を監視するステップと、対照動物を試験環境に置いて、該対照動物の行動を監視するステップと、前記孤発性タウオパチーモデル動物の行動および前記対照動物の行動を比較するステップとを含む。
本発明は、孤発性タウオパチーモデル動物の脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、タウシードを用意するステップと、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する試験群の動物の脳内に、前記タウシードを注入するステップと、試験物質を前記試験群の動物に投与するステップと、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する対照群の動物の脳内に、前記タウシードを注入するステップと、前記試験群および対照群のそれぞれの少なくとも一部の動物から脳を回収するステップと、前記試験群および前記対照群の脳のタウ線維病理構造物を特徴付けるステップと、前記試験群の動物の脳でのタウ線維病理構造物の特徴を、前記対照群の動物の脳でのタウ線維病理構造物の特徴と比較するステップとを含む。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記脳内のタウ線維病理構造物は、該タウ線維病理構造物に含まれるタウタンパク質のアイソフォーム組成と、該タウタンパク質のリン酸化状態と、前記タウ線維病理構造物を含む脳組織のＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色とからなるグループから選択される少なくとも１つの特性で特徴付けられる場合がある。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳に由来する場合がある。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳のサルコシル不溶性画分を含む場合がある。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、ゲノム編集技術、遺伝子ターゲッティング技術またはベースエディティング技術で作製される場合がある。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、配列番号１または２に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを染色体上に有する場合がある。ここで、配列番号１は前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する突然変異マウス系統の１つであるTau 3R/4R #2の第１０エキソン－第１０イントロン領域のヌクレオチド配列であり、配列番号２は前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する別の突然変異マウス系統であるTau 3R/4R #13の第１０エキソン－第１０イントロン領域のヌクレオチド配列である。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、いずれの動物種でもかまわないが、マウス、ラットまたはマーモセットの場合がある。
本発明の孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法において、前記タウ線維病理構造物は、該タウ線維病理構造物の脳内分布の経時的変化で特徴付けられる場合がある。
霊長類およびほ乳類の成体の脳において選択的スプライシングによって生じる可能性のあるタウタンパク質のアイソフォームの全てを示す模式図。 ｓｇＲＮＡ－６およびＣａｓ９ ｍＲＮＡを顕微注入された前核期受精卵を偽妊娠マウスの子宮へ移植して誕生させ、得られたマウス仔のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動図。 本明細書の前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する突然変異マウス系統であるＴａｕ ３Ｒ／４Ｒマウスの＃２および＃１３系統と、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスとのタウ遺伝子第１０エキソンから第１０イントロンにかけての染色体ＤＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌＸによるアライメント図。 ＃２系統のヘミ接合体（＃２ ｈｅｍｉ）、＃１３系統のヘミ接合体（＃１３ ｈｅｍｉ）および野生型マウス（ＷＴ）の成体マウス脳から抽出したタンパク質サンプルについてアルカリフォスファターゼによる脱リン酸化後に電気泳動を行い、電気泳動で分離されたタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を総タウ抗体（Ｔ４６）で染色して得られたイムノブロット図。 図４と同じタンパク質サンプルについて３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）および４Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ４）を用いて得られたイムノブロット図。 ＃１３系統のヘミ接合体（＃１３ ｈｅｍｉ）、＃１３系統のホモ接合体（＃１３ ｈｏｍｏ）および野生型マウス（ＷＴ）の成体マウス脳から抽出したタンパク質サンプルについてアルカリフォスファターゼによる脱リン酸化後に電気泳動を行い、電気泳動で分離されたタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を総タウ抗体（Ｔ４６）で染色して得られたイムノブロット図。 マウス成体脳の右側線条体領域の組織にハミルトンシリンジを穿刺してタウシードを注入する様子の冠状断面模式図。 アルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（ＰｉＤ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。 ヒトＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して６ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、同一視野について異なる蛍光色素で標識した３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）および４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）を同時に用いる免疫蛍光染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。図９左上は３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）の標識蛍光色素のみを検出する条件での蛍光顕微鏡写真画像で、図９右上は４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）の標識蛍光色素のみを検出する条件での蛍光顕微鏡写真画像で、図９左下は図９左上および右上の画像を合成した（ｍｅｒｇｅｄ）画像である。 ３Ｒ型及び４Ｒ型が等量蓄積したヒトＡＤ患者脳由来のタウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った、右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。 ヒトＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して３ヶ月後（３Ｍ）、６ヶ月後（６Ｍ）および９ヶ月後（９Ｍ）に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体（Ｓｔｒｉａｔｕｍ）、大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、視床（Ｔｈａｌａｍｕｓ）および扁桃体（Ａｍｙｇｄａｌａ）の組織を薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真。 アルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（ＰｉＤ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、９ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、３Ｒ型タウ特異抗体（３Ｒｔａｕ）または４Ｒ型タウ特異抗体（４Ｒｔａｕ）による免疫組織化学染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。 アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、ヒトタウ特異抗体（ＨＴ７）およびマウスタウ特異抗体（発明者らの研究室で作製）による免疫組織化学染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。 アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、Ｇａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。 アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、１２Ｅ８（ｐＳ２６２）抗体による免疫組織化学染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真。 図１６（左）は、４Ｒ型が蓄積したヒトＣＢＤ患者脳由来のタウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウス右側線条体に接種８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った、接種側の大脳皮質の組織標本の顕微鏡写真。図１６（右）は、代表的なヒトＣＢＤ患者脳のアストロサイト斑を示す顕微鏡写真。図１６（右）のヒトＣＢＤ患者脳のアストロサイト斑と同様のアストロサイト斑が図１６（左）の突然変異マウス大脳皮質で検出された。 図１７（左）は、タウオパチー疾患のアルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードと、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）の患者脳由来タウシードと、対照の健常人（ＨＣ）脳由来タウシードとをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、接種して９ヶ月後に抜脳し、サルコシル不溶性画分を調製し、該画分を電気泳動で分離したタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を総タウ抗体（Ｔ４６）で染色して得られたイムノブロット図。図１７（右）は、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳のサルコシル不溶性画分を調製し、該画分を電気泳動で分離したタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜をの抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）を用いて染色して得られたイムノブロット図。 図１８は、タウオパチー疾患のアルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードと、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）の患者脳由来タウシードと、対照の健常人（ＨＣ）脳由来タウシードとをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、接種して９ヶ月後に抜脳し、サルコシル不溶性画分を調製し、該画分を電気泳動で分離したタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８およびｐＳ３９６）で染色して得られたイムノブロット図。 図１９は、それぞれ、タウオパチー疾患のアルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードと、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）の患者脳由来タウシードと、対照の健常人（ＨＣ）脳由来タウシードとをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、接種して９ヶ月後に抜脳し、サルコシル不溶性画分を調製し、該画分を電気泳動で分離したタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）および４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）で染色して得られたイムノブロット図。 ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後、接種直後（Ｄａｙ０）、７日後（Ｄａｙ７）、１４日後（Ｄａｙ１４）、８か月後（８Ｍ）に抜脳し、左脳と右脳に分割後、左脳および右脳のサルコシル不溶性画分を別々に調製し、該画分を電気泳動で分離したタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を抗リン酸化タウ抗体（ｐＳ３９６、図２０（上））およびマウスタウ特異抗体（発明者らの研究室で作製、図２０（下））で染色して得られたイムノブロット図。 ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後、８か月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、線条体、大脳皮質および梨状皮質を含む組織を冠状断で薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真。 ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後、８か月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、視床、視床下核、扁桃体および側頭葉を含む組織を冠状断で薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真。 ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後、８か月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、黒質を含む組織を冠状断で薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真。 ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後のタウ線維病理構造物のマウス脳内伝播と、神経回路との関係を示す模式図。矢印はある領域から別の領域を支配する投射ニューロンの情報伝達の向き、すなわち、樹状突起から軸索への向きを表し、その横は各投射ニューロンの神経伝達物質（Ｇｌｕ：グルタミン酸、ＧＡＢＡ：γアミノ酪酸、ＤＡ：ドーパミン）を表す。接種部位の線条体は白ヌキ文字で表し、タウ線維病理構造物が出現した部位を黒字で表す。 タウ線維病理構造物接種実験における従来のモデルと本発明の孤発性タウオパチーモデル動物との相違を示す模式図。
本明細書において、単数形の使用は、特に記さない限り複数形の使用を含む。すなわち、「ａ」及び「ｔｈｅ」は、該冠詞が修飾するすべてのものの１つ又は複数を指す場合がある。例えば、「遺伝子」（“ａ ｇｅｎｅ”）は、１つの遺伝子又は２つ以上の遺伝子を含む。同様に、「患者」（“ａ ｐａｔｉｅｎｔ”又は“ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ”）は、１人の患者又は複数の患者を指す場合がある。
本明細書において孤発性タウオパチーモデル動物とは、タウオパチー患者の多くを占める孤発性タウオパチー患者の脳内でタウ線維病理構造物の脳内分布が経時的に変化する現象を再現する疾患モデル動物である。本発明の孤発性タウオパチーモデル動物に用いられる動物は、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物である。本明細書において「正常タウ遺伝子のみを有する動物」とは、タウ遺伝子については、当該動物に内在性のタウ遺伝子だけを有し、当該動物以外の他の生物種由来のいかなる脳で発現可能な外来タウ遺伝子も含まない動物を指す。したがって、本明細書の「正常タウ遺伝子のみを有する動物」は、タウ以外の他の遺伝子について外来遺伝子を含んでもかまわない。また、本明細書の「正常タウ遺伝子のみを有する動物」は、脳で発現可能でない外来タウ遺伝子を含んでもかまわない。ここで、外来遺伝子とは、受精卵および胚細胞へのＤＮＡ注入、ＥＳ細胞へのトランスフェクション、動物の卵または胚へのウイルスベクター感染等を含むが、これらに限定されない経路により当該動物の生殖系列細胞に導入されたＤＮＡをいう。また外来タウ遺伝子とは、いずれかの生物種由来のタウタンパク質の少なくとも一部をコード化するＤＮＡを含む外来遺伝子を指す。ある遺伝子について「脳で発現可能な」とは、当該遺伝子が、脳で発現する転写および／または翻訳調節の機能を有するＤＮＡ（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と動作可能に連結されていて、当該遺伝子の産物であるＲＮＡまたはタンパク質が脳で産生されることを指す。
正常タウ遺伝子のみを有する動物は、タウ遺伝子の第１０エキソンの選択的スプライシングで３Ｒ型および４Ｒ型の両方を発現することが可能である。ヒトの成体の脳では、３Ｒ型および４Ｒ型とがほぼ等量発現するのに対し、マウスなどの成体の脳では４Ｒ型だけが発現する。そこで、選択的スプライシングによらずにタウ遺伝子の第１０エキソンの発現を抑制することができれば、成体の脳でも３Ｒ型を発現させることができる。その１つの解決策が、第１０エキソンの発現しない改変タウ遺伝子を安定的に生殖系列に含むトランスジェニック動物を作成することである。本明細書において、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子とは、第１０エキソンだけは発現しないが、他のすべてのエキソンは正常に発現して、選択的スプライシングによって生じるのと同じ３Ｒ型アイソフォームのタウタンパク質が産生するタウ遺伝子の変異体をいう。第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子には、スプライシングの過程で第１０エキソンがその前後に隣接するイントロンとともに切り出されて、第９エキソンが第１１エキソンと直接連結するスプライシング異常を起こす改変が施される場合がある。また、第９エキソンが第１０エキソンと連結するスプライシングが起こっても、第１０エキソンからカルボキシル末端側の翻訳が停止するナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異や、アミノ酸残基の置換、欠失を起こすミスセンス突然変異によって第１０エキソンを含むアイソフォームが存在しないか、正常なタウタンパク質の構造および機能を保持できない場合がある。
したがって、本明細書において、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、少なくとも成体の脳において、３Ｒ型アイソフォームのタウだけを発現する。特に、正常タウ遺伝子のみを有する場合には成体脳において４Ｒ型タウアイソフォームだけを発現する動物種が、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する場合には、当該改変遺伝子だけで正常タウ遺伝子を全く持たない個体（以下、「ｈｏｍｏ個体」という。）では、３Ｒ型タウアイソフォームだけを成体脳で発現することになり、当該改変遺伝子と正常タウ遺伝子とを両方とも持つ個体（以下、「ｈｅｍｉ個体」という。）では、３Ｒ型および４Ｒ型のタウアイソフォームを両方とも成体脳で発現する。そこで、正常タウ遺伝子のみを有する場合には成体脳において４Ｒ型タウアイソフォームだけを発現する動物種のｈｅｍｉ個体は、ヒトと同じタウアイソフォームパターン、すなわち、成体脳において３Ｒ型および４Ｒ型タウアイソフォームを両方とも発現するタウアイソフォームパターンを示す。そこで、当該ｈｅｍｉ個体を用いることにより、よりヒトに近いタウオパチー疾患の動物モデルを提供することができる。
本明細書において、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の動物種は、正常タウ遺伝子のみを有する場合には成体脳において４Ｒ型タウアイソフォームだけを発現する動物種であることが好ましい。タウオパチー疾患の動物モデルとしては、いずれの動物種でもかまわないが、既に神経科学分野の実験動物として利用されている動物種がより好ましい。またタウオパチー疾患は認知・行動機能を低下させるため、高度な脳機能を有する動物種であることがさらに好ましい。ここで成体脳において４Ｒ型タウアイソフォームだけを発現するか、３Ｒ型および４Ｒ型タウアイソフォームを両方とも発現するかは、必ずしも系統分類学的な近縁性だけでは説明できない。この違いは第１０エキソンから第１０イントロンにかけての部分のステムループ構造の差によるものと考えられているからである（Ｇｒｏｖｅｒ、Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４： １５１３４ （１９９９）、Ｄ’ Ｓｏｕｚａ、Ｉ．およびＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｇ．Ｄ．、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７： ２６５８７ （２００２））。例えば、齧歯類では、マウスおよびラットは成体の脳において４Ｒ型タウアイソフォームだけを発現するが、ウサギは３Ｒ型および４Ｒ型タウアイソフォームを両方とも発現する。そこで、マーモセットはヒトと同じ霊長類に属するが、成体の脳において４Ｒ型タウアイソフォームだけを発現する点でマウスおよびラットと同じ発現パターンを示す（Ｓｈａｒｍａ，Ｇ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ． Ｃｈｅｍ．、２９４： １１４３３ （２０１９））。
第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、ゲノム編集技術、遺伝子ターゲッティング技術またはベースエディティング技術で作製される。ここで、ゲノム編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ／ ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）系、ＺＦＮ （Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）系、ＴＡＬＥＮ （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）系その他のヌクレアーゼを含む複合体の系により、ＤＮＡ二本鎖を切断（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋｓ＝ＤＳＢｓ）してゲノム配列の任意の場所を削除、置換、挿入することができる遺伝子改変技術をいう（Ｄｏｕｄｎａ、Ｊ．およびＭａｌｉ、Ｐ．編、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、２０１６）。遺伝子ターゲッティング技術は、内在性の遺伝子の改変に相同組換えを用いる遺伝子改変技術である（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｒ．ら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、２０１４）。この技術も、遺伝子の削除、エキソンの除去、遺伝子の導入、点変異の導入などに用いることができる。ベースエディティング技術は、シチジンデアミナーゼをＲＮＡ誘導性の不活性型Ｃａｓ９複合体に連結することにより、ＤＮＡの二本鎖切断を起こさずに、ＤＮＡ内でＣ-Ｇ塩基対をＴ-Ａ塩基対へ変える遺伝子改変技術をいう（Ｎｉｓｈｉｄａ， Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５３： ａａｆ８７２９ （２０１６））。
本明細書におけるタウシードとは、タウ線維病理構造物を出現させる能力を有する物質で、タウオパチー疾患のヒト患者脳のタウ線維病理構造物か、タウオパチー疾患のヒト以外の動物の脳のタウ線維病理構造物かに由来する不溶性物質と、タウ線維病理構造物以外のタウタンパク質の不溶性または可溶性の複合体とを含む。本明細書におけるタウシードがタウ線維病理構造物を出現させるのは、実験動物の脳内接種の場合の他、試験管内の培養細胞の場合（国際公開公報第ＷＯ２０１３／０７３２１９号パンフレット）を含む。該タウタンパク質の複合体には、例えば硫酸デキストランおよび多硫酸ペントサンを含む硫酸化グリコサミノグリカンのようなタンパク質以外の物質とタウ単量体とを試験管内でインキュベーションして得られるタウ複合体を含む（Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：３３１１８（１９９７）、特開２０１５－１２２９７９）。前記タウ単量体は、ヒトその他の動物由来のタウタンパク質単量体と、試験管内で組み替えＤＮＡ技術により調製されたタウタンパク質の単量体またはその複合体と、試験管内の培養細胞で形成されたタウ線維病理構造物の分解産物のタウタンパク質の単量体またはその複合体とを含む。タウシードには、培養細胞または動物の脳にタウ線維病理構造物を出現させる能力を有することを条件として、タウタンパク質を含む物質であって、タウタンパク質のオリゴマー、単量体またはこれらの複合体その他の形態の物質を含む。
本明細書におけるタウシードの調製、形成あるいは蓄積は、生化学的には、界面活性剤を含まない緩衝液に不溶な分画に特定の界面活性剤（例えば、サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ））を添加して、該界面活性剤でも溶けないで遠心分離で沈殿する画分か、あるいは、可溶化の程度の異なる界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００およびサルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ））を弱い順に用いる差次的可溶化により、該差次的可溶化に用いた界面活性剤のうち可溶化の程度のより強い界面活性剤であるサルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）でも溶けないで遠心分離で沈殿する画分か（Hosokawa,M.ら、J. Neuropath. Exp. Neurol., 74:158（２０１５））のイムノブロット解析で検討できる。また、生物物理学的には、電子顕微鏡または原子間力顕微鏡で直接観察される他、蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）、あるいはチオフラビンＳ（ＴｈＳ）のような蛍光色素による蛍光発色か円偏光二色性分析かでβシート構造形成の程度を測定することができる。試験管内でタウタンパク質のモノマーと硫酸化グリコサミノグリカンとの反応で生成したタウシードは、サルコシル不溶性、前記蛍光色素による蛍光発光、線維の電子顕微鏡的形態、円偏光二色性分析結果を含むが、これらに限定されない特性により特徴付けられる。前記サルコシル不溶性画分は、例えば、タウオパチー患者から採取された脳の凍結検体（０．２ないし０．５ｇ）が５倍容量のＡ６８緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）のような緩衝液中でホモジナイズされ、懸濁液が作製され、該懸濁液にＮ－ラウロイルサルコシンナトリウムが終濃度１％添加され、３７°Ｃで３０分間インキュベーションされ、前記懸濁液が遠心分離（例えば１２，０００ ｘ ｇ、１０分間、２５°Ｃ）され、上清が回収される。、該上清はエッペンドルフ型チューブに約１３００μＬずつ分注され、さらに遠心分離（例えば１００，０００ ｘ ｇ、２０分間、２５°Ｃ）され、上清は廃棄され、沈殿は回収される。不溶性画分は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）のような緩衝液に、出発材料である前記脳の凍結検体０．２ｇないし０．５ｇあたり９０μＬの割合で懸濁され、凍結保存され、希釈することなく、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の脳に注入される。
タウシードを前記動物の脳内に注入する際、注入部位は、中脳黒質、青斑核、嗅内野、線条体、海馬を含むがこれらに限定されない。生化学的手法および免疫組織学的手法によるタウ線維病理構造物の解析には主にメス個体が用いられ、行動試験による脳機能解析には主にオス個体が用いられるが、これらに限定されない。麻酔した動物を、脳定位固定装置に固定し、タウシードを脳内に注入する。注入部位はＦｒａｎｋｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｊ．およびＰａｘｉｎｏｓ，Ｇ．（Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、第４版、２０１２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｃ．（Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、第７版、２０１３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｈａｒｄｍａｎ，Ｃ．Ｄ．およびＡｓｈｗｅｌｌ，Ｋ．Ｗ．Ｓ．（Ｓｔｒｅｏｔａｘｉｃ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ Ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｒｍｏｓｅｔ （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）、２０１２、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）をもとに決定することができる。例えば、マウスの右側線条体に注入する場合は、Ａ－Ｐ：＋０．２ｍｍ、Ｍ－Ｌ：＋２．０ｍｍ、Ｄ－Ｖ：－２．６ｍｍの条件に設定され、マウスの右側中脳黒質に注入する場合は、Ａ－Ｐ：－３．０ｍｍ、Ｍ－Ｌ：－１．３ｍｍ、Ｄ－Ｖ：－４．７ｍｍの条件に設定される。１０μＬのハミルトンシリンジのような微量注入器具を用いて、５μＬのタウシード懸濁液が注入される。マウスから脳を回収する際は断頭法で迅速に行うことができる。
脳内のタウ線維病理構造物が脳内に注入されたタウシードからどのようにして形成されるか正確なメカニズムは不明である。しかし、脳内に注入されたタウシードが神経細胞内に取り込まれて、細胞内で発現したタウタンパク質のモノマーを凝集する核となって、細胞内でＮＦＴ、ＮＴ等の特徴的な病理構造物を形成するものと考えられる。当該病理構造物の形態学的特性は組織学的観察により検出できる。かかる形態学的特性には、前記病理構造物の個別の形態の他、神経細胞内外での局在や、脳組織内での分布を含むが、これらに限定されない。また、前記病理構造物の免疫組織化学的特性および生化学的特性は、タウタンパク質に対する抗体、３Ｒ型タウタンパク質に対する抗体、４Ｒ型タウタンパク質に対する抗体、リン酸化タウタンパク質に特異的な抗体を含むが、これらに限定されない抗体との反応により検出できる。さらに、前記病理構造物の生化学的特性は、界面活性剤を含まない緩衝液に不溶な分画に特定の界面活性剤（例えば、サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ））を添加して、該界面活性剤でも溶けないで遠心分離で沈殿する画分か、あるいは、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００およびサルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ））を弱い順に用いる差次的可溶化により、該差次的可溶化に用いた界面活性剤のうち可溶化の程度のより強い界面活性剤であるサルコシルでも溶けないで遠心分離で沈殿する画分か（Hosokawa,M.ら、J. Neuropath. Exp. Neurol., 74:158（２０１５））のイムノブロット解析で検出でき、不溶性画分での検出可能性と、リン酸化等の翻訳後修飾の有無および程度とを含むが、これらに限定されない。
本明細書において「試験群」は効果を確認したい条件で処理された１個体以上の動物をいう。本明細書において、「対照群」とは、試験群と異なる条件で処理された１個体以上の動物をいう。試験群と対照群との条件の違いは、例えば注入手術を施すことまでは同じだが、注入液にタウシードが含まれるか否かの違いの場合もあれば、注入液にタウシードとともにタウシード以外の物質が含まれるかの違いの場合もあれば、注入されるタウシードの特徴が試験群と対照群とで違う場合もあれば、タウシードを注入する手術を施されるか、全く手術が施されないかの違いの場合もある。本発明のスクリーニング方法において、「試験物質」とは、スクリーニングの対象となる、タウ線維病理構造物形成に影響を与える効果が未知の医薬候補物質のそれぞれを指す。本発明の試験物質は、タウシードと同時に脳内に注入される場合もあれば、別の投与経路で投与される場合もある。前記別の投与経路は、経口投与、非経口投与、静脈、筋肉、腹腔等への注射、吸入を含むが、これらに限定されない。本発明の試験物質の投与は、タウシードを脳内注入するステップの前に、同時に、および／または、後に、１回または２回以上か、連続的にか、間歇的にか実行される場合がある。本発明のスクリーニング方法において、「対照物質」とは、タウ線維病理構造物の特性に影響を与える効果が既知の物質を指す。タウ線維病理構造物の特性の比較は、異なる条件で脳内注入手術を施した後同じ期間経過後に回収された脳のタウ線維病理構造物の特徴の比較の他、同じ条件で脳内注入手術を施された動物から異なる時期に回収された脳のタウ線維病理構造物の特徴の比較の場合を含むが、これらに限定されない。
本明細書において、動物の行動特性は、以下の行動試験に示される試験環境に置かれた動物の行動を監視、記録して、評価または測定される特徴を含むが、これらに限定されない。マウスの行動試験は、例えばＣｒａｗｌｅｙ、Ｊ．Ｎ．（Ｗｈａｔ’ｓ Ｗｒｏｎｇ Ｗｉｔｈ Ｍｙ Ｍｏｕｓｅ？： Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ、（２００７））に記載されるプロトコールを用いて行うことができる。ラットの行動試験は、例えばＷｈｉｓｈａｗ、Ｉ．Ｑ．およびＫｏｌｂ、Ｂ．（Ｔｈｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒａｔ： Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｗｉｔｈ Ｔｅｓｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （２００４））に記載されるプロトコールを用いて行うことができる。マーモセットの行動試験は、例えばＷａｔｓｏｎ、Ｃ．Ｆ．Ｉ．（Ｓｏｃｉａｌ Ｃｏｎｔａｇｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｒｍｏｓｅｔｓ （Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｉｒｌｉｎｇ博士学位論文、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｓｐａｃｅ．ｓｔｉｒ．ａｃ．ｕｋ／ｈａｎｄｌｅ／１８９３／３４４６＃ｔ１（２０１１））、および、Ｍａｒｉｎｉ、Ｒ．Ｐ．ら（Ｔｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍａｒｍｏｓｅｔ ｉｎ Ｃａｐｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１８））に記載されるプロトコールを用いて行うことができる。
本明細書において「少なくとも一部の動物から脳を回収する」とは、同じ条件で脳内注入手術を施された複数の動物からなる群を、脳内注入後同じ期間経過後に全ての動物から脳を回収するのではなく、一部の動物は残しておいて、異なる期間経過後に脳を回収することをいう。例えば、動物の脳内に注入して３ヶ月と６ヶ月とに脳を回収する場合がある。
本件明細書に添付する配列表の配列は以下のとおりである。
配列番号１：Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ ＃２の第１０エキソン領域のＤＮＡ配列
配列番号２：Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ ＃１３の第１０エキソン領域のＤＮＡ配列
配列番号３：短鎖ガイドＲＮＡ ｔａｕ ｓｇＲＮＡ相補配列候補－６のＤＮＡ配列
配列番号４：ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６調製用順方向プライマーのＤＮＡ配列
配列番号５：ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６調製用逆方向プライマーのＤＮＡ配列
配列番号６：タウ遺伝子ゲノム編集個体同定用順方向プライマーのＤＮＡ配列
配列番号７：タウ遺伝子ゲノム編集個体同定用逆方向プライマーのＤＮＡ配列
配列番号８：野生型マウスＣ５７ＢＬ／６の第１０エキソン領域のＤＮＡ配列
配列番号９：短鎖ガイドＲＮＡ ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６合成用ＤＮＡ断片のｔｒａｃｒＲＮＡ領域をコード化するレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＤＮＡ配列
配列番号１０：短鎖ガイドＲＮＡ ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６の全長ＲＮＡ配列
配列番号１１：マウスのタウ遺伝子の第１０エキソンないし第１０イントロン領域のうち第１０エキソンのスプライシングに関与する部分の配列をヒトのタウ遺伝子に置換したドナーＤＮＡ配列
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
本実施例に記載の実験は、東京都医学総合研究所動物実験倫理審査委員会において、動物実験計画登録番号１３０６６「マウス・ラット・ウサギを用いた神経変性疾患モデルの構築と治療法の検討」として平成２５年３月２９日に承認された。
実施例１ ゲノム編集法による第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の作製
（１．１）材料および方法
（1.1.1）短鎖ガイドＲＮＡの選択
マウスのゲノム上のタウ遺伝子領域の第１０エキソンから第１０イントロンにかけて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でゲノム編集ができる位置を、様々な条件を考慮して当業者に周知の方法で選定した。その結果、短鎖ガイドＲＮＡ ｔａｕ ｓｇＲＮＡ相補配列候補－６（５’－ＧＡＡＧＧＡＵＡＡＵＡＵＣＡＡＡＣＡＣＧＵＣＣＣＧＧ－３’、配列番号３）のＤＮＡ配列が選択された。
（1.1.2）Ｃａｓ９メッセンジャーＲＮＡおよび短鎖ガイドＲＮＡの調製
Ｃａｓ９プラスミド（ｐＣＭＶ－Ｃａｓ９， Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ、株式会社アンテグラル（旧：株式会社アプロサイエンス））を制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ＃Ｒ０１４５Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社）で切断し、線状化ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃２８１０４、株式会社キアゲン）を用いて精製した。該線状化ＤＮＡと、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ ＡＭ１３４５Ｍ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とを用いてＣａｓ９ ｍＲＮＡを合成した。ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＡＭ１９０８、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）によりＣａｓ９ ｍＲＮＡを精製した。本発明の単鎖ガイドＲＮＡ ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６は、Ｈｗａｎｇ、Ｗ．Ｙ．ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１：２２７（２０１３））を参考にして、前節（1.1.1）で選択されたｔａｕ ｓｇＲＮＡ相補配列候補－６と、Ｃａｓタンパク質との結合領域のＲＮＡとが連結した１本鎖ＲＮＡである。該ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６を転写反応で合成するための鋳型ＤＮＡを作製するため、ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６の３’末端側のｔｒａｃｒＲＮＡ領域をコード化するレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＤＮＡ断片（配列番号９：５’－ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡ－３’）がベクター（ｐＴＡＫＮ－２）に挿入されたｓｇＲＮＡ合成用ベクターを作成した。該ベクターを鋳型とし、ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６調製用順方向プライマーとして５’－ＧＡＣＴＴＡＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡＣＧＴＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴ－３’（配列番号４）およびｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６調製用逆方向プライマーとして５’－ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣ－３’（配列番号５）と、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ＃Ｒ０１０Ａ、タカラバイオ株式会社）およびＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃２８１０４、株式会社キアゲン）とを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応産物を精製して、ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６合成用鋳型ＤＮＡ断片とした。該ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６合成用鋳型ＤＮＡ断片とＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐ Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ＡＭ１３５４Ｍ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とを用いてＲＮＡを合成した。合成されたｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＡＭ１９０８、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）により精製した。
（1.1.3）Ｃａｓ９メッセンジャーＲＮＡおよび短鎖ガイドＲＮＡ ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６の顕微注入および胚の操作
ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６をＣａｓ９ ｍＲＮＡとともにＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統の前核期受精卵に顕微注入した。注入されたマウス胚を偽妊娠マウスの子宮へ移植した（Ｍａｌｉ， Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９： ８２３ （２０１３）、Ｗａｎｇ， Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、１５３： ９１０ （２０１３）、Ｙａｎｇ， Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、１５４： １３７０ （２０１３））。なお、一部の実験では、マウスのタウ遺伝子の第１０エキソンないし第１０イントロン領域のうち第１０エキソンのスプライシングに関与する部分の配列をヒトのタウ遺伝子に置換したドナー配列（配列番号１１）のＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターの制限酵素ＥｃｏＲＶ切断サイトにクローニングしたプラスミドの環状ＤＮＡを、ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６およびＣａｓ９ ｍＲＮＡとともにＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統の前核期受精卵に顕微注入した。配列番号１１のドナー配列には、当該ヒトのタウ遺伝子に置換したドナー配列を染色体上に取り込んだマウスの識別のため、第４９５位のヌクレオチドがチミジンとなるサイレント突然変異が導入されているので、制限酵素Ｔａｕ Ｉで切断できる。
（1.1.4）産生個体のジェノタイピング
マウスの尾よりろ紙上に血液を１滴採取し、直径１．２ ｍｍの円形に切り出した物をＰＣＲの鋳型とした。ＰＣＲは順方向プライマーとして５’－ＣＣＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＴＣＣ－３’（配列番号６）、逆方向プライマーとして５’－ＣＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＣＣ－３’（配列番号７）をＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（タカラバイオ株式会社）、用いて行った。ＡＢＩ Ｖｅｒｉｔｉ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用し、９８℃で２分間インキュベーションした後に、各サイクルが、９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、６８℃で３５秒間の順にインキュベーションする条件のサイクルを３２回繰り返してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応産物は１％アガロースゲルで電気泳動を行った。本明細書のＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスのタウ遺伝子第１０エキソンから第１０イントロンにかけての染色体ＤＮＡ配列は、該当するバンドをｐＭＤ２０－Ｔ（タカラバイオ株式会社）にクローニングした後、ダイターミネーター法により決定した。また、本明細書のＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの複数の系統と、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスとのタウ遺伝子第１０エキソンから第１０イントロンにかけての染色体ＤＮＡ配列は、Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．ら、（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２３：２９４７（２００７））に説明されるＣｌｕｓｔａｌＸ を用いてアライメントを取って解析した。
（1.1.5）イムノブロッティング
マウスの脳をＡ６８バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％ ショ糖）中でホモジナイズし、１００，０００ｘｇ、４℃で２０分間超遠心した。上清を－２０℃で保管し、一部を用いてアルカリフォスファターゼによる脱リン酸化反応を行った。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁し、１００℃で５分間加熱した。１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で２００Ｖ、４５分間電気泳動し、泳動後のゲル内で分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写されたＰＶＤＦ膜を３％ゼラチンでブロッキングしたのち、１次抗体としてＴ４６（１：１，０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社））、ＲＤ３（１：１，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルク株式会社））、ａｎｔｉ－４Ｒ（１：１，０００、当研究室で作製）、ＡＴ８（１：１，０００、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（コスモ・バイオ株式会社））、ｐＳ３９６（１：１，０００、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（メルク株式会社））およびマウスタウ特異抗体（１：１，０００、当研究室で作製）を１晩反応させた。ＰＶＤＦ膜を洗浄したのち、抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰまたは抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：５０，０００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社））と１時間反応し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて化学発光を行った。化学発光はＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（GEヘルスケア・ジャパン株式会社））で検出した。化学発光検出終了後、前記ＰＶＤＦ膜を洗浄し、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－Ｂｉｏｔｉｎまたはａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－Ｂｉｏｔｉｎ（１：５００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フナコシ株式会社））を１時間反応させた。前記ＰＶＤＦ膜を洗浄後ＡＢＣ液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フナコシ株式会社））に１時間浸漬し、ジアミノベンジジン／ＮｉＣｌ２／Ｈ２Ｏ２で発色させた。
（1.1.6）ＡＤ患者脳からのサルコシル不溶性画分の抽出
ＡＤ患者脳（０．２ｇ）を１．８ｍＬのＡ６８バッファー中でホモジネートした。さらにＡ６８バッファーを１．８ｍＬ、２０％サルコシルを４００μＬ加え、３７℃で３０分インキュベーションを行った。１００，０００ ｘ ｇ、４℃で１０分間遠 心後、上清を回収し、さらに５０，０００ｒｐｍ、４℃、２０分遠心した。ペレットを生理食塩水で洗浄し、３０μＬの３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えて超音波処理を行った（Ｇｒｏｖｅｒ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１５１３４（１９９９））。出発材料である前記脳の凍結検体０．２ｇあたり９０μＬの３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）に懸濁され、凍結保存され、希釈することなく、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の脳に注入された。対照実験に用いる健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）由来のタウシードは、前記ＡＤ患者脳と同様に不溶性画分が調製され、前記動物の脳に注入された。
（1.1.7）Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスを用いたタウ線維病理構造物の脳内伝播モデルの作製
前節（1.1.5）で説明したとおりに抽出したＡＤ患者脳のサルコシル不溶性画分をＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体（ブレグマからＡｎｔｅｒｉｏｒ－Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ＝＋０．２ｍｍ、Ｍｅｄｉａｌ－Ｌａｔｅｒａｌ＝＋２．０ｍｍ、Ｄｏｒｓａｌ－Ｖｅｎｔｒａｌ＝－２．６ｍｍ）へ接種した（マウス１匹あたり５μＬ）。接種から８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、２０％ショ糖液に置換した。脳を凍結ミクロトームで３０μｍに薄切し、免疫組織化学染色を行った。薄切切片をギ酸処理１０分、オートクレーブ１１０℃１０分、その後室温で３０分間過酸化水素処理し、ビオチン化ＡＴ８抗体（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（コスモ・バイオ株式会社））を１，０００倍希釈で反応させた。その後アビジン－ビオチン化ＨＲＰ複合体 （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フナコシ株式会社））を反応させ、ジアミノベンジジン／硫酸ニッケルアンモニウムにて発色を行った。対比染色はＫｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ液（メルク株式会社）を用いた（Ｄ’ Ｓｏｕｚａ、Ｉ．およびＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｇ．Ｄ．、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６５８７（２００２））。また、３Ｒ型および４Ｒタウ型アイソフォームに特異的な抗体による染色には、ＲＤ３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルク株式会社）、１，０００倍希釈）およびａｎｔｉ－４Ｒ抗体（当研究室で作製、１，０００倍希釈）を用い、対比染色はヘマトキシリン液を使用した。そのほか、ヒトタウ特異抗体ＨＴ７（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（コスモ・バイオ株式会社））、マウスタウ特異抗体（当研究室で作製、１，０００倍希釈）、１２Ｅ８抗体（ｐＳ２６２、当研究室で作製、１，０００倍希釈）を用いた。
（１．２）結果
（1.2.1）Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの作製
ｔａｕ ｓｇＲＮＡ－６およびＣａｓ９ ｍＲＮＡのマイクロインジェクションにより、２６匹の産仔を得た。ジェノタイピングをするためにＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を電気泳動した結果の一部を図２に示す。図２は、左端のレーンに１００ｂｐのＤＮＡサイズマーカーを、その他は２６匹の産仔のうち１～１３番までの産仔のゲノムＤＮＡから配列番号３および４のプライマー対で増幅したＤＮＡを各レーンに流した電気泳動写真である。ＰＣＲによって容易に変異の有無の判別がつく、＃２と＃１３を選択し、繁殖を行いさらなる解析を進めることにした。
ＤＮＡ配列決定の結果、タウ遺伝子の第１０エキソンの３’末端側から第１０イントロンにかけて、＃２突然変異系統は塩基対１０７個の欠失があり、＃１３突然変異系統は塩基対２１１個の挿入および塩基対４個の欠失があることが判明した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターに配列番号１１のドナー配列ＤＮＡを挿入したプラスミド由来のＤＮＡは＃２にも＃１３にも検出されなかったので、＃２および＃１３で見つかったマウスタウ遺伝子の突然変異は、ともにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のみにより誘導されたものと考えられる。図３はＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの＃２および＃１３系統と、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスとのタウ遺伝子第１０エキソンから第１０イントロンにかけての染色体ＤＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌＸによるアライメント図である。両系統とも第１０エキソン－第１０イントロンの部分にゲノム編集がおこってスプライシングの５’－ドナーサイトが破壊されており、＃１３では第１０エキソンの途中でストップコドンが現れることから、両系統とも第１０エキソンが機能しないと予測された。
（1.2.2）Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスで発現するタウアイソフォームの解析
図４は、＃２系統のヘミ接合体（＃２ ｈｅｍｉ）、＃１３系統のヘミ接合体（＃１３ ｈｅｍｉ）および野生型マウス（ＷＴ）の成体マウス脳から抽出したタンパク質サンプルについてアルカリフォスファターゼによる脱リン酸化後に電気泳動を行い、総タウ抗体（Ｔ４６）を用いてイムノブロッティングを行った結果である。図４に示すとおり、野生型マウスの脳では４Ｒ型タウのアイソフォーム３種類しか検出されなかった。しかし、＃２系統のヘミ接合体（＃２ ｈｅｍｉ）および＃１３系統のヘミ接合体（＃１３ ｈｅｍｉ）では、４Ｒ型タウのアイソフォーム３種類に加え、３Ｒ型タウのアイソフォーム３種類も検出された。つまり、＃２および＃１３系統のヘミ接合体では、ヒトと同様に、３Ｒ型および４Ｒ型タウのアイソフォーム６種類が脳内で発現していた。
図５は、図４と同じタンパク質サンプルを３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）および４Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ４）を用いてイムノブロッティングを行った結果である。図５に示すとおり、野生型マウスの成体脳では３Ｒ型タウは検出されず、４Ｒ型タウのみが検出されるのに対し、＃２ ｈｅｍｉおよび＃１３ ｈｅｍｉマウスの成体脳では３Ｒ型および４Ｒ型タウの両方が検出された。
図６は、＃１３系統のヘミ接合体（＃１３ ｈｅｍｉ）、＃１３系統のホモ接合体（＃１３ ｈｏｍｏ）および野生型マウス（ＷＴ）の成体マウス脳から抽出したタンパク質サンプルについてアルカリフォスファターゼによる脱リン酸化後に電気泳動を行い、電気泳動で分離されたタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を総タウ抗体（Ｔ４６）で染色してイムノブロッティングを行った結果である。第１０エキソン破壊ヘミ接合体マウス同士を交配することにより作製した第１０エキソン破壊ホモ接合体マウスの成体脳では４Ｒ型タウはどのアイソフォームも検出されず、３Ｒタウ型のアイソフォーム３種類だけが検出された。以上の結果から、＃２および＃１３系統は、成体の脳で３Ｒ型タウと４Ｒ型タウとがほぼ等量発現するという、ヒト成体の脳でのタウタンパク質のアイソフォーム発現パターンを再現するＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスであることが確認できた。Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの＃２および＃１３系統は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に２０１９年２月２７日付けで寄託され、それぞれ、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０２８９７およびＮＩＴＥ ＡＰ－０２８９８が付与された。さらに、２０２０年２月２６日付けで国際寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８９７およびＮＩＴＥ ＢＰ－０２８９８が付与された。
実施例２ Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスを用いるヒトタウオパチー患者脳由来シードの接種
（２．１）Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスへのヒトＡＤ患者脳由来タウシードの接種
図７は、マウス成体脳の右側線条体領域の組織にハミルトンシリンジを穿刺してタウシードを注入する様子の冠状断面模式図である。以下の実施例では、Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスとして、＃１３系統のヘミ接合体を用いた。ここではタウシードとしてＡＤ患者脳のサルコシル不溶性画分（５μｌ）を用い、Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ＃１３系統マウスヘミ接合体の右側線条体に接種した。マウスはイソフルランによる吸入麻酔によって麻酔された。導入麻酔：４ ｖｏｌ.％、０．４ Ｌ/ｍｉｎ。維持麻酔２ ｖｏｌ.％、０．２ Ｌ/ｍｉｎで麻酔をおこなった。脳定位固定装置（ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、５１６００／５１６１５）に固定された。注入部位はＦｒａｎｋｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｊ．およびＰａｘｉｎｏｓ，Ｇ．（Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ、第４版、２０１２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を基に決定された。マウスの右側線条体に注入する場合は、Ａ－Ｐ：＋０．２ｍｍ、Ｍ－Ｌ：＋２．０ｍｍ、Ｄ－Ｖ：－２．６ｍｍの条件に設定された。１０μＬのハミルトンシリンジ（ＨＡＭＩＬＴＯＮ、＃８０３３０）を用いて、５μＬのタウシード懸濁液を注入した。接種から８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った。
図８は、アルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（ＰｉＤ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真である。図８に示すとおり、いずれのタウオパチー疾患の患者脳由来シードを接種した場合でも、接種部位の右側線条体にタウ線維病理構造物が形成された。
図９は、ヒトＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して６ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）および４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）による免疫蛍光染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図９左上は３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）の標識蛍光色素のみを検出する条件での蛍光顕微鏡写真画像で、図９右上は４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）の標識蛍光色素のみを検出する条件での蛍光顕微鏡写真画像で、図９左下は図９左上および右上の画像を合成した（ｍｅｒｇｅｄ）画像である。図９に示すとおり、ヒトＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスに接種した場合には、３Ｒ型および４Ｒ型タウを有するタウ線維病理構造物が形成され、しかも、３Ｒ型および４Ｒ型タウは共局在することが観察された。
図１０は、３Ｒ型及び４Ｒ型が等量蓄積したヒトＡＤ患者脳由来のタウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図１０に示すとおり、ヒトＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスに接種した場合には、マウス脳内で、アルツハイマー病に特徴的な病理組織学的な所見である、神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）が観察された。
（２．２）Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスを用いたタウ線維病理構造物の脳内伝播
図１１は、ヒトＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して３ヶ月後（３Ｍ）、６ヶ月後（６Ｍ）および９ヶ月後（９Ｍ）に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体（Ｓｔｒｉａｔｕｍ）、大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、視床（Ｔｈａｌａｍｕｓ）および扁桃体（Ａｍｙｇｄａｌａ）の組織を薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図１１に示すとおり、接種して３ヶ月後の線条体、大脳皮質および視床と、接種して６ヶ月後の扁桃体とにおいてタウ線維病理構造物が形成され、接種後の時間経過とともにタウ線維病理構造物の形成が亢進することが観察された。
（２．３）シード依存的タウ線維病理構造物の蓄積
既に説明したとおり、ヒトのタウオパチー患者脳に蓄積するタウ線維病理構造物中のタウタンパク質のアイソフォーム組成は疾患ごとに異なることが知られている。すなわち、ＡＤでは３Ｒ型および４Ｒ型が等量蓄積し、ＰｉＤでは３Ｒ型のみが蓄積し、そして、ＣＢＤおよびＰＳＰでは４Ｒ型のみが蓄積する。図１２は、アルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（ＰｉＤ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、９ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、３Ｒ型タウ特異抗体（３Ｒｔａｕ）および４Ｒ型タウ特異抗体（４Ｒｔａｕ）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図１２に示すとおり、３Ｒ型および４Ｒ型タウが等量蓄積するＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳に接種すると、３Ｒ型および４Ｒ型タウを有するタウ線維病理構造物が形成された。４Ｒ型タウのみが蓄積するＣＢＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳に接種すると、４Ｒ型タウのみを有するタウ線維病理構造物が形成された。３Ｒ型タウのみが蓄積するＰｉＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳に接種すると、３Ｒ型タウのみを有するタウ線維病理構造物が形成された。したがって、タウシードが３Ｒ型か４Ｒ型かその両方かに対応して、３Ｒ型タウまたは４Ｒ型タウのみか、３Ｒ型および４Ｒ型の両方かを有するタウ線維病理構造物が形成されることがＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスを用いることにより生体内で実証された。
（２．４）ヒトタウシード接種によるタウ線維病理構造物の誘導
図１３は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、ヒトタウ特異抗体（ＨＴ７）およびマウスタウ特異抗体（発明者らの研究室で作製）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図１３に示すとおり、３Ｒ型および４Ｒ型タウが等量蓄積するＡＤ患者脳由来タウシードを接種する場合でも、３Ｒ型タウのみが蓄積するＰｉＤ患者脳由来タウシードを接種する場合でも、形成されたタウ線維病理構造物にはマウスタウのみが検出され、ヒトタウは検出されなかった。したがって、接種されたタウシードに含まれていたヒトタウは分解され、Ｔａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスで産生されるマウスタウが凝集してタウ線維病理構造物を形成すると考えられる。
（２．５）ヒトの病理の再現
Ｐｉｃｋ病患者の脳ではＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色は陰性であるとの過去の報告があり、それが本発明のタウオパチー疾患モデル動物で再現できるかをテストした。図１４は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、Ｇａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図１４に示すとおり、ＡＤ接種マウス脳ではＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色陽性であったが、Ｐｉｃｋ病接種マウス脳は陰性であった。
また、Ｐｉｃｋ病患者の脳ではタウのＳ２６２はリン酸化されていないという報告があるので、本発明のタウオパチー疾患モデル動物で再現できるかテストした。図１５は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、同側の線条体の組織を薄切し、１２Ｅ８（ｐＳ２６２）抗体による免疫組織化学染色を行った右側線条体領域の組織標本の顕微鏡写真である。図１５に示すとおり、ＡＤ患者脳由来タウシードを接種したマウスの脳ではタウ線維病理構造物でＳ２６２がリン酸化されている像が確認されたが、Ｐｉｃｋ病者脳由来タウシードを接種したマウスの脳ではタウ線維病理構造物でＳ２６２リン酸化抗体陽性像は観察されなかった。そこでピック病患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳内に接種して得られる本発明の孤発性タウオパチーモデル動物は、Ｇａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色性と、タウのＳ２６２のリン酸化とについて、Ｐｉｃｋ病タウの性質を再現できたと考えられる。
図１６（左）は、４Ｒ型が蓄積したヒトＣＢＤ患者脳由来のタウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウス脳の右側線条体に接種して８ヶ月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った、接種側の大脳皮質の組織標本の顕微鏡写真である。図１６（右）は、同様に固定および染色を行ったヒトＣＢＤ患者脳のアストロサイト斑を示す顕微鏡写真である。図１６（左）に示すヒトＣＢＤ患者脳由来のタウシードを接種したマウス脳でも、図１６（右）のヒトＣＢＤ患者脳と同様にアストロサイト斑が形成されたことから、ＣＢＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳内に接種して得られる本発明の孤発性タウオパチーモデル動物は、アストロサイト斑の形成について、ＣＢＤタウの性質を再現できたと考えられる。
実施例３ 生化学的解析
（３．１）接種した患者脳由来タウシードのタウアイソフォームと当該患者脳由来タウシードにより形成されたタウ線維病理構造物のタウアイソフォームとの関係
図１７（左）、１８および１９は、それぞれ、タウオパチー疾患のアルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードと、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）の患者脳由来タウシードと、対照の健常人（ＨＣ）脳由来タウシードとをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種して、接種して９ヶ月後に抜脳し、サルコシル不溶性画分を調製し、総タウ抗体（Ｔ４６）、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８およびｐＳ３９６）、３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）および４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）を用いてイムノブロッティングを行った結果である。図１７（右）は、アルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳のサルコシル不溶性画分の抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）を用いてイムノブロッティングを行った結果である。
図１７（左）に示すとおり、総タウ抗体（Ｔ４６）による検出ではＡＤ脳由来タウシードを接種したＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳のサルコシル不溶性画分で３Ｒ型タウおよび４Ｒ型タウに該当するバンドが検出され、ＣＢＤ脳由来タウシードを接種したＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳のサルコシル不溶性画分では４Ｒ型タウのみのバンドが検出され、Ｐｉｃｋ病脳由来タウシードを接種したＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳のサルコシル不溶性画分では３Ｒ型タウのみのバンドが検出された。
図１８に示すとおり、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８およびｐＳ３９６）による検出では、アルツハイマー病（ＡＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードを接種したＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳のサルコシル不溶性画分のタウがリン酸化されていた。
図１９（左）に示すとおり、３Ｒ型タウ特異抗体（ＲＤ３）による検出では、アルツハイマー病（ＡＤ）およびピック病（Ｐｉｃｋ）の患者脳由来タウシードの患者脳由来タウシードを接種したＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳のサルコシル不溶性画分のタウのバンドが検出された。図１９（右）に示すとおり、４Ｒ型タウ特異抗体（ａｎｔｉ－４Ｒ）による検出では、アルツハイマー病（ＡＤ）および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）の患者脳由来タウシードを接種したＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの脳のサルコシル不溶性画分のタウのバンドが検出された。そこで以上の生化学的解析から、接種した患者脳由来タウシードのタウアイソフォームが、当該患者脳由来タウシードにより形成されたタウ線維病理構造物のタウアイソフォームと対応することが確認された。
（３．２）接種したヒトＡＤタウシードが種の壁を越えてマウスタウをタウ線維病理構造物に変換する
図２０は、ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後、接種直後（Ｄａｙ０）、７日後（Ｄａｙ７）、１４日後（Ｄａｙ１４）、８か月後（８Ｍ）に抜脳し、左脳と右脳に分割後左脳および右脳のサルコシル不溶性画分を別々に調製し、該画分を電気泳動で分離したタンパク質サンプルを膜に転写し、該膜を抗リン酸化タウ抗体（ｐＳ３９６、図２０（上））およびマウスタウ特異抗体（発明者らの研究室で作製、図２０（下））で染色してイムノブロッティングを行った結果である。図２０（上）のｐＳ３９６抗体によるイムノブロットに示すとおり、接種直後のマウスにおいて接種した右脳にＡＤタウシード由来のバンドが検出された。７日後、接種されたタウシードはほとんど分解されていた。１４日後では接種されたタウシードは分解が進み、検出限界以下になっていた。８か月経過後、タウ線維病理構造物が検出された。図２０（下）のマウスタウ特異抗体によるイムノブロットに示すとおり、８か月経過後に検出されたタウ線維病理構造物はマウスの内在性タウを含んでいた。そこで、前記タウ線維病理構造物はマウスの内在性タウが新たに蓄積して形成されたと考えられる。
（３．３）接種したタウ線維病理構造物の伝播
右側線条体に接種後、脳のどの部位にタウ線維病理構造物が伝播しているかをＡＤタウシード接種マウス脳を用いＡＴ８抗体染色で検討した。図２１、２２および２３は、ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後、８か月後に抜脳し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、線条体、大脳皮質および梨状皮質を含む組織（図２１）、視床、視床下核、扁桃体、および側頭葉を含む組織（図２２）および、黒質を含む組織（図２３）を冠状断で薄切し、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８）による免疫組織化学染色を行った組織標本の顕微鏡写真である。図２１、２２および２３に示すとおり、線条体接種後、タウ線維病理構造物は、大脳皮質、梨状皮質（図２１）、視床、視床下核、扁桃体、側頭葉（図２２）および黒質（図２３）へ伝播したことが確認された。
図２４は、ＡＤ患者脳由来タウシードをＴａｕ ３Ｒ／４Ｒ突然変異マウスの右側線条体に接種後のタウ線維病理構造物のマウス脳内伝播と神経回路との関係を示す模式図である。図２４では、線条体と、大脳皮質、梨状皮質、視床、視床下核、扁桃体、側頭葉および黒質とを直接または間接に連絡する投射ニューロンの情報伝達の向き、すなわち、樹状突起から軸索への向きを矢印で表し、判明している場合には各投射ニューロンの神経伝達物質も記載した（Ｇｌｕ：グルタミン酸、ＧＡＢＡ：γアミノ酪酸、ＤＡ：ドーパミン）。接種部位の線条体は白ヌキ文字で表し、タウ線維病理構造物が出現した部位を黒字で表す。ヒトタウオパチー患者脳由来のタウシードが接種された線条体との物理的な距離が近い脳内の領域であっても、線条体との間で直接または間接に連絡する投射ニューロンが存在しない領域、例えば、海馬にはタウ線維病理構造物の蓄積は認められなかった。したがって、最初にタウシードが接種された線条体から脳内の他の領域へタウ線維病理構造物の蓄積が伝播するときには、投射ニューロンによる神経回路の存在が必要であると考えられる。なお、タウ線維病理構造物の伝播が認められる梨状皮質、扁桃体および側頭葉では、線条体に投射するニューロンは存在するが、線条体から投射するニューロンは知られていない。そこで、タウ線維病理構造物は投射ニューロンに沿って順行性に伝播するだけでなく、逆行性に伝播する場合もあると考えられる。
これまでのタウ接種実験に関する報告（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ、Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．、１１０： ９５３５ （２０１３）、Ｇｕｏ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２１３： ２６３５ （２０１６））では、ＡＤ患者脳の不溶性画分接種実験において、４Ｒ型タウの蓄積を誘導することしかできず、３Ｒ型タウの蓄積は誘導できなかった。また、Ｐｉｃｋ病患者脳の不溶性画分接種においても、３Ｒ型タウの蓄積を誘導できなかった。今回脳内で３Ｒ型および４Ｒ型両方のタウを成体の脳で発現する動物を用いて、ＡＤ患者脳の不溶性画分を接種し、３Ｒ型および４Ｒ型両方のタウを蓄積することができた。さらに３Ｒ型タウのみが蓄積するピック病や４Ｒ型タウのみが蓄積する皮質基底核変性症の患者脳不溶性画分を接種したところ、それぞれ３Ｒ型タウのみ、４Ｒ型タウのみが蓄積することが確認された。シード依存的なタウ凝集を証明できたと考えられる。図２５はタウ線維病理構造物接種実験における従来のモデルと本発明の孤発性タウオパチーモデル動物との相違を示す模式図である。
図２０に示すとおり、接種したヒトＡＤ患者脳由来のタウシードは接種直後に右脳で検出されたが、時間経過とともに分解され、接種後１４日では検出限界以下になった。８か月後、タウ線維病理構造物の形成が亢進したことが確認された。このタウ線維病理構造物はマウス内在性のタウを含むことが判明し、接種したヒトタウが種の壁を越えてマウスタウをタウ線維病理構造物に変換し、タウ線維病理構造物を形成させたと推察された。
本発明の孤発性タウオパチーモデル動物を用いるタウオパチー疾患患者脳由来タウシードの接種実験により、タウ線維病理構造物に（１）伝播能がある、（２）シード依存的凝集を引き起こす能力、株（ｓｔｒａｉｎ）がある、（３）種の壁を越える、という「プリオン様」性質があることが確認された。また、線条体にタウシードを接種しても、タウ線維病理構造物は線条体にだけ形成されるのではなく、線条体と神経連絡のある領域を中心に伝播していたことから、神経回路順行性および／または逆行性にタウシードまたはタウ線維病理構造物が伝播したと考えられる。そこで本発明の孤発性タウオパチーモデル動物は伝播抑制作用のある薬剤のような孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法に用いることができる。また、本発明の孤発性タウオパチーモデル動物はタウアイソフォームの成体脳での発現パターンがヒトにより近いので、該モデル動物の解析方法は、個々のタウオパチー疾患の病像および病態を反映しており有用である。

Claims (16)

  1. タウシードを用意するステップと、
    該タウシードを、第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有し、３Ｒ型タウと４Ｒ型タウをほぼ等量発現する動物の脳内に注入するステップとを含み、
    前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、マウス、ラットまたはマーモセットである、孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法。
  2. 前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳に由来する、請求項１に記載の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法。
  3. 前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳由来のサルコシル不溶性画分を含む、請求項２に記載の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法。
  4. 前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、ゲノム編集技術、遺伝子ターゲッティング技術またはベースエディティング技術で作製される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の孤発性タウオパチーモデル動物の作製方法。
  5. 第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物の脳内にタウシードが注入された孤発性タウオパチーモデル動物であって、
    前記動物は、３Ｒ型タウと４Ｒ型タウをほぼ等量発現するモデル動物であって、マウス、ラットまたはマーモセットである、孤発性タウオパチーモデル動物。
  6. 配列番号１または２に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを染色体上に有する、請求項５に記載の孤発性タウオパチーモデル動物。
  7. 請求項５または６に記載の孤発性タウオパチーモデル動物から回収される、動物脳。
  8. 請求項５または６に記載の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法であって、
    前記タウシードが注入された動物の少なくとも一部から脳を回収するステップと、
    該脳内のタウ線維病理構造物を特徴付けるステップとを含む、解析方法。
  9. 前記脳内のタウ線維病理構造物は、該タウ線維病理構造物に含まれるタウタンパク質のアイソフォーム組成と、該タウタンパク質のリン酸化状態と、前記タウ線維病理構造物を含む脳組織のＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色とからなるグループから選択される少なくとも１つで特徴付けられる、請求項８に記載の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法。
  10. 請求項５または６に記載の孤発性タウオパチーモデル動物の解析方法であって、
    前記孤発性タウオパチーモデル動物を試験環境に置いて、該孤発性タウオパチーモデル動物の行動を監視するステップと、
    対照動物を試験環境に置いて、該対照動物の行動を監視するステップと、
    前記孤発性タウオパチーモデル動物の行動および前記対照動物の行動を比較するステップとを含む、解析方法。
  11. 孤発性タウオパチー脳内のタウ線維病理構造物に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、
    タウシードを用意するステップと、
    第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有し、３Ｒ型タウと４Ｒ型タウをほぼ等量発現する試験群の動物の脳内に、前記タウシードを注入するステップと、
    試験物質を前記試験群の動物に投与するステップと、
    第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有し、３Ｒ型タウと４Ｒ型タウをほぼ等量発現する対照群の動物の脳内に、前記タウシードを注入するステップと、
    前記試験群および対照群のそれぞれの少なくとも一部の動物から脳を回収するステップと、
    前記試験群および前記対照群の脳のタウ線維病理構造物を特徴付けるステップと、
    前記試験群の動物の脳でのタウ線維病理構造物の特徴を、前記対照群の動物の脳でのタウ線維病理構造物の特徴と比較するステップとを含む、
    スクリーニング方法であって、
    前記動物がマウス、ラットまたはマーモセットである、スクリーニング方法。
  12. 前記脳内のタウ線維病理構造物は、該タウ線維病理構造物に含まれるタウタンパク質のアイソフォーム組成と、該タウタンパク質のリン酸化状態と、前記タウ線維病理構造物を含む脳組織のＧａｌｌｙａｓ－Ｂｒａａｋ銀染色とからなるグループから選択される少なくとも１つで特徴付けられる、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
  13. 前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳に由来する、請求項１１または１２に記載のスクリーニング方法。
  14. 前記タウシードはヒトタウオパチー疾患患者の脳のサルコシル不溶性画分を含む、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
  15. 前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、ゲノム編集技術、遺伝子ターゲッティング技術またはベースエディティング技術で作製される、請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  16. 前記第１０エキソンを発現しない改変タウ遺伝子を有する動物は、配列番号１または２に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを染色体上に有する、請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
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