JP7526421B2 - Method for forming lipid bilayer membrane, and partition and device therefor - Google Patents
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Description
本発明は、脂質二重膜の形成方法並びにそのための隔壁及び器具に関する。 The present invention relates to a method for forming a lipid bilayer membrane, as well as a partition and an apparatus for the same.
生物を構成する細胞や、細胞内に存在するミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体等の各種オルガネラ、細胞核等は、外側が生体膜で覆われており、この生体膜は、基本的に脂質二重膜から構成されている。生理活性を有する様々なタンパク質、すなわち、レセプターや酵素等がこの脂質二重膜を貫通する形で脂質二重膜上に保持されている。これらの膜貫通タンパク質は、生体内で重要な役割を果たしている。特に、細胞膜上に存在する各種レセプターは、生体内に存在するリガンドと結合することにより、様々な生理学的反応を引き起こす引き金になることがわかっている。このため、レセプターの機能を亢進する各種リガンドや、レセプターの機能を阻害する阻害剤等が医薬品として用いられており、また、新たな医薬品として利用可能な天然又は人工のリガンドや阻害剤が研究されている。 The cells that make up living organisms, the various organelles present within the cells, such as mitochondria, Golgi bodies, and endoplasmic reticulum, and the cell nucleus, are covered on the outside with a biological membrane, which is basically composed of a lipid bilayer. Various proteins with physiological activity, such as receptors and enzymes, are held on the lipid bilayer in a manner that penetrates the lipid bilayer. These transmembrane proteins play important roles in the body. In particular, it is known that various receptors present on the cell membrane trigger various physiological reactions by binding to ligands present in the body. For this reason, various ligands that enhance receptor function and inhibitors that inhibit receptor function are used as medicines, and natural or artificial ligands and inhibitors that can be used as new medicines are also being researched.
また、脂質二重膜にタンパク質を保持してセンサーとして利用することも知られている。例えば、脂質二重膜に嗅覚レセプタータンパク質を保持して臭気センサーとしたり、液滴接触法で脂質二重膜を形成する際の液滴中に、被検物質と特異的に結合する特異結合性物質を含ませ、一方、脂質二重膜にイオンチャネルタンパクを保持して、被検物質が存在する場合には被検物質が特異結合性物質と結合してイオンチャネルを閉塞するようにしたセンサーも知られている。 It is also known that proteins held in lipid bilayer membranes can be used as sensors. For example, an odor sensor can be created by holding an olfactory receptor protein in a lipid bilayer membrane, or a sensor can be created in which a specific binding substance that specifically binds to a test substance is contained in the droplets used to form the lipid bilayer membrane by the droplet contact method, while an ion channel protein is held in the lipid bilayer membrane, so that when the test substance is present, the test substance binds to the specific binding substance and blocks the ion channel.
従来、脂質二重膜の形成方法として広く用いられている方法として、液滴接触法が知られている（特許文献１～４等）。液滴接触法では、通常、第１のウェルと、該第１のウェルと隣接して配置される第２のウェルと、前記第１のウェルと前記第２のウェルを隔てる隔壁とを具備する器具が用いられる。隔壁は、脂質二重膜が形成される貫通孔を有する。第１のウェルと第２のウェルにそれぞれ脂質膜形成性の脂質を含む脂質液を添加し、次いで、各ウェルに電解質の水溶液を添加すると、隔壁の貫通孔を塞ぐ形で脂質二重膜が形成される。脂質二重膜内に保持すべきタンパク質等は、通常、水溶液中に含まれている。 Conventionally, the droplet contact method has been widely used as a method for forming a lipid bilayer membrane (Patent Documents 1 to 4, etc.). In the droplet contact method, an apparatus is usually used that includes a first well, a second well arranged adjacent to the first well, and a partition wall separating the first well from the second well. The partition wall has a through-hole through which a lipid bilayer membrane is formed. When a lipid liquid containing lipid membrane-forming lipids is added to each of the first well and the second well, and then an aqueous solution of an electrolyte is added to each well, a lipid bilayer membrane is formed by blocking the through-hole of the partition wall. Proteins, etc. to be held in the lipid bilayer membrane are usually contained in the aqueous solution.
従来の液滴接触法は、脂質二重膜の形成方法として有用であるが、もし、液滴接触法と比較して、脂質二重膜を形成するために使用する脂質の量を低減することができ、より再現性良く短時間で脂質二重膜を形成することができ、さらに、脂質二重膜に保持させるタンパク質等の使用量を低減させることができれば、有利であることは言うまでもない。 The conventional droplet contact method is useful as a method for forming lipid bilayer membranes, but it goes without saying that it would be advantageous if it were possible to reduce the amount of lipid used to form a lipid bilayer membrane compared to the droplet contact method, form a lipid bilayer membrane with better reproducibility in a shorter time, and further reduce the amount of protein, etc., that is retained in the lipid bilayer membrane.
したがって、本発明の目的は、公知の液滴接触法と比較して、脂質二重膜を形成するために使用する脂質の量を低減することができ、より再現性良く短時間で脂質二重膜を形成することができ、さらに、脂質二重膜に保持させるタンパク質等の使用量を低減させることが可能な、新規な脂質二重膜形成方法並びにそれに用いられる新規な隔壁及び脂質二重膜形成器具を提供することである。 The object of the present invention is therefore to provide a novel lipid bilayer membrane formation method that can reduce the amount of lipid used to form a lipid bilayer membrane, can form a lipid bilayer membrane with better reproducibility in a shorter time than known droplet contact methods, and can reduce the amount of protein, etc., that is retained in the lipid bilayer membrane, as well as a novel partition and lipid bilayer membrane formation device used therein.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、従来の液滴接触法に用いられている、２つのウェルを隔てる隔壁の貫通孔の内壁に開口するスリットを形成し、このスリットに脂質液を供給し、次いで２つのウェルの一方に水溶液を添加し、さらに他方のウェルに水溶液を添加することにより、隔壁の貫通孔を塞ぐ形で脂質二重膜が形成されることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive research, the inventors of the present application discovered that by forming a slit on the inner wall of the through-hole of a partition separating two wells, which is used in the conventional droplet contact method, supplying a lipid liquid to this slit, and then adding an aqueous solution to one of the two wells and then adding an aqueous solution to the other well, a lipid bilayer membrane is formed that blocks the through-hole of the partition, and thus completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1) 脂質二重膜が形成される貫通孔を有する、鉛直方向に配置された隔壁であって、前記貫通孔の内壁にスリットが形成された隔壁の前記スリットに脂質膜形成性の脂質を含む脂質液を供給し、前記内壁表面に前記脂質液を露出させる工程と、
前記隔壁により隔てられる一方の側に第１の水溶液を加えて前記貫通孔に脂質一重膜を形成する工程と、
前記隔壁により隔てられる他方の側に第２の水溶液を加えて前記貫通孔に脂質二重膜を形成する工程と、
をこの順序で含む、脂質二重膜の形成方法。
(2) 前記スリットの内面が撥水処理されている、(1)記載の方法。
(3) 前記貫通孔の内壁が、前記貫通孔の内部に向かって突出するテーパ状であり、該テーパ状の内壁の頂部に前記スリットが開口している、(1)又は(2)記載の方法。
(4) 前記貫通孔の平面形状が円形であり、その直径が0.5μｍ～800μｍである(1)～(3)のいずれか１項に記載の方法。
(5) 前記スリットの厚みが０．１μｍ～２００μｍである(1)～(4)のいずれか１項に記載の方法。
(6) 前記スリットが、前記内壁の全周に亘って形成されている(1)～(5)のいずれか１項に記載の方法。
(7) (1)記載の脂質二重膜の形成方法に用いられる、鉛直方向に配置された隔壁であって、
脂質二重膜が形成される貫通孔と、
該貫通孔の内壁に開口し、かつ、前記隔壁の外部に連通する、脂質液を供給して前記内壁表面に該脂質液を露出させることが可能なスリットと、
を具備する、脂質二重膜形成用隔壁。
(8) 前記隔壁内部に、平面的に広がり、前記隔壁の外部に開口する凹部を有し、該凹部の一端が前記スリットを形成している、(7)記載の隔壁。
(9) 前記スリットの内面が撥水処理されている、(7)又は(8)記載の隔壁。
(10) 前記貫通孔の内壁が、前記貫通孔の内部に向かって突出するテーパ状であり、該テーパ状の内壁の頂部に前記スリットが開口している、(7)～(9)のいずれか１項に記載の隔壁。
(11) 前記貫通孔の平面形状が円形であり、その直径が0.5μｍ～800μｍである(7)～(10)のいずれか１項に記載の隔壁。
(12) 前記スリットの厚みが０．１μｍ～２００μｍである(7)～(11)のいずれか１項に記載の隔壁。
(13) 前記スリットが、前記内壁の全周に亘って形成されている(7)～(12)のいずれか１項に記載の隔壁。
(14) 第１のウェルと、該第１のウェルと隣接して配置される第２のウェルと、前記第１のウェルと前記第２のウェルを隔てる隔壁とを具備し、該隔壁が、(7)～(13)のいずれか１項に記載の隔壁である、脂質二重膜形成器具。
That is, the present invention provides the following.
(1) a step of supplying a lipid liquid containing lipid membrane -forming lipids to a slit in a vertically disposed partition having a through-hole in which a lipid bilayer membrane is formed, the slit being formed in an inner wall of the through-hole, and exposing the lipid liquid on a surface of the inner wall;
a step of adding a first aqueous solution to one side separated by the partition to form a lipid monolayer in the through-hole;
adding a second aqueous solution to the other side separated by the partition to form a lipid bilayer membrane in the through-hole;
A method for forming a lipid bilayer membrane, comprising the steps of :
(2) The method according to (1), wherein the inner surface of the slit is treated to be water repellent.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the inner wall of the through hole is tapered toward the inside of the through hole, and the slit opens at the top of the tapered inner wall.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the planar shape of the through hole is circular and the diameter thereof is 0.5 μm to 800 μm.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the slit has a thickness of 0.1 μm to 200 μm.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the slit is formed along the entire circumference of the inner wall.
(7) A vertically disposed partition wall used in the method for forming a lipid bilayer membrane according to (1),
A through-hole in which a lipid bilayer membrane is formed;
a slit that opens on an inner wall of the through hole and communicates with the outside of the partition wall, and through which a lipid liquid can be supplied to expose the lipid liquid on the inner wall surface;
A partition for forming a lipid bilayer membrane comprising:
(8) The partition according to (7), further comprising a recess inside the partition that extends in a plane and opens to the outside of the partition, one end of the recess forming the slit.
(9) The partition wall according to (7) or (8), wherein the inner surface of the slit is treated to be water repellent.
(10) A partition wall described in any one of (7) to (9), wherein the inner wall of the through hole is tapered protruding toward the inside of the through hole, and the slit opens at the top of the tapered inner wall.
(11) The partition wall according to any one of (7) to (10), wherein the planar shape of the through hole is circular and the diameter thereof is 0.5 μm to 800 μm.
(12) The partition wall according to any one of (7) to (11), wherein the slit has a thickness of 0.1 μm to 200 μm.
(13) A partition wall according to any one of (7) to (12), wherein the slit is formed along the entire periphery of the inner wall.
(14) A lipid bilayer membrane forming device comprising a first well, a second well disposed adjacent to the first well, and a partition separating the first well and the second well, the partition being the partition described in any one of (7) to (13).
本発明の方法によれば、脂質液をウェルに添加するのではなく、隔壁内のスリットに供給するので、公知の液滴接触法に比較して脂質液の使用量が少なくなる。脂質としては、生体膜を模倣するために生体膜の構成成分と同様なリン脂質が用いられているが、高価なリン脂質の使用量を従来の1/100程度にまで低減することができるので有利である。また、本発明の方法によれば、液滴接触法と比較して、再現性良く短時間で脂質二重膜を形成することができる。さらに、水溶液と脂質液は、脂質二重膜を形成する貫通孔でのみ接触し、それ以外の場所では完全に分離されているので、水溶液中に含めた貴重なタンパク質等が、脂質液中に分散して無駄になることを防止することができ、したがって、脂質二重膜に保持させるタンパク質等の使用量を低減させることができる。 According to the method of the present invention, the lipid liquid is not added to the well but is supplied to the slit in the partition, so that the amount of lipid liquid used is less than that of the known droplet contact method. As the lipid, phospholipids similar to the components of biological membranes are used to mimic biological membranes, and the amount of expensive phospholipid used can be advantageously reduced to about 1/100 of the conventional amount. In addition, according to the method of the present invention, a lipid bilayer membrane can be formed with good reproducibility in a short time compared to the droplet contact method. Furthermore, the aqueous solution and the lipid liquid come into contact only at the through-holes that form the lipid bilayer membrane, and are completely separated at other places, so that valuable proteins, etc. contained in the aqueous solution can be prevented from being dispersed in the lipid liquid and wasted, and therefore the amount of proteins, etc. used to be held in the lipid bilayer membrane can be reduced.
本発明の脂質二重膜の形成方法は、公知の液滴接触法とは大きく異なるが、使用する器具としては、隔壁の構造を除けば、基本的に液滴接触法と同様な器具を使用することができる。図１は、特許文献３の図１と同じであるが、本発明の方法においても、液滴接触法で用いられる、公知の脂質二重膜形成器具と基本的に同様な構造の器具を用いることができる。 The lipid bilayer membrane formation method of the present invention is significantly different from the known droplet contact method, but the equipment used can be essentially the same as that used in the droplet contact method, except for the structure of the partition. Figure 1 is the same as Figure 1 of Patent Document 3, but the method of the present invention can also use equipment with a structure basically similar to that of the known lipid bilayer membrane formation equipment used in the droplet contact method.
図１は、本発明の方法においても好ましく用いることができる脂質二重膜形成器具の一具体例の模式図であり、図１(a)が平面図、図1(b)が図1(a)中のb-b'線切断部端面図である。この具体例では、基板１０中に、第１のウェル１６及び第２のウェル１４が形成され、それらの境界が隔壁１２により隔てられている。このような構成のものは、ダブルウェルチャンバー(DWC)と呼ばれている。隔壁１２には、貫通孔１８（図１の(b)参照）が設けられている。図１に示す例では、ウェルの平面形状が基本的に円形であり、２つの円が接する境界部分のみが直線状になっているが、ウェルの形状は限定されるものではなく、上記貫通孔を有する隔壁によって隔てられていれば、他の形状でも問題はない。ウェルのサイズは、特に限定されず、通常、直径が2mm～8mm程度、特には3mm～5mm程度、深さは通常、直径の50%～200%、特には50%～100%程度であるが、この範囲よりも大きくても小さくても本発明の方法を実施することが可能である。隔壁に設けられた貫通孔の数は１個でも複数個でもよい。 Figure 1 is a schematic diagram of one specific example of a lipid bilayer membrane forming device that can be preferably used in the method of the present invention, where Figure 1(a) is a plan view and Figure 1(b) is an end view of the section taken along line b-b' in Figure 1(a). In this specific example, a first well 16 and a second well 14 are formed in a substrate 10, and the boundary between them is separated by a partition 12. Such a configuration is called a double well chamber (DWC). The partition 12 is provided with a through hole 18 (see Figure 1(b)). In the example shown in Figure 1, the planar shape of the well is basically circular, and only the boundary part where the two circles meet is linear, but the shape of the well is not limited, and other shapes are also acceptable as long as they are separated by a partition having the above-mentioned through hole. The size of the well is not particularly limited, and the diameter is usually about 2 mm to 8 mm, particularly about 3 mm to 5 mm, and the depth is usually about 50% to 200% of the diameter, particularly about 50% to 100%, but the method of the present invention can be carried out with wells larger or smaller than this range. The number of through holes provided in the partition wall may be one or more.
本発明では、隔壁の構造に特徴がある。本発明で用いられる隔壁１２の貫通孔１８近傍の拡大模式切断部端面図を図２に示す。なお、全ての図において、説明を分かり易くするために、各構成要素のサイズの比率は、実物とは大きく異なっていることがある。図２中の各参照番号は、図１中の各参照番号を踏襲している。参照番号２０は、本発明の方法により形成された脂質二重膜を示している。また、参照番号２２ａ及び２２ｂは、図１には図示されていないが、各ウェルの底部に設けられた電極であり、脂質二重膜を介して流れる電流を測定するための回路を接続するためのものである。このような電極も公知のDWCで通常、設けられている。 The present invention is characterized by the structure of the partition. FIG. 2 shows an enlarged schematic cut end view of the vicinity of the through hole 18 of the partition 12 used in the present invention. In all the figures, the size ratio of each component may be significantly different from the actual one in order to make the explanation easier to understand. Each reference number in FIG. 2 follows each reference number in FIG. 1. Reference number 20 indicates the lipid bilayer membrane formed by the method of the present invention. Also, reference numbers 22a and 22b are electrodes provided at the bottom of each well, not shown in FIG. 1, and are used to connect a circuit for measuring the current flowing through the lipid bilayer membrane. Such electrodes are also usually provided in known DWCs.
本発明の隔壁１２の内壁には、スリット２４が形成されている。スリット２４は、隔壁１２の外部に連通しており（後述）、隔壁１２の外部からスリット２４に脂質液を供給することが可能になっている。隔壁１２の内面は、図２に示すように、貫通孔１８の内部に向かって突出するテーパ状となっており（すなわち、図２中の角度θが９０度未満、好ましくは75度～60度）、このテーパ状の内壁の頂部にスリット２４が開口していると、脂質二重膜が形成されやすくなるので好ましい。脂質液を流れ易くし、かつ、スリット２４に供給された脂質液が、キャピラリストップバルブ(capillary stop valve)効果により、スリット２４の開口部で停止するように、スリット２４の内面を撥水処理（親油性処理）することにより、表面の撥水性、親油性を制御することが好ましい。表面の撥水性、親油性の制御方法は、基板の材料、濡れ性に応じて表面修飾する官能基を変更する方法などがあり、好ましくは、隔壁１２の材料としてガラス基板を用いて、フルオロカーボン系の分子をガラス基板の表面官能基に修飾する方法を挙げることができる。この過程で使用する撥水性表面の形成過程及び方法、たとえばシランカップリング剤、加熱による重合の方法などについては、特に制限はなく、市販の処理剤を用いて公知の方法により行うことができる（下記実施例参照）。スリットの厚み（図２における左右方向の幅）は、脂質二重膜が形成されるのであれば特に限定されないが、通常、0.1μｍ～２００μｍ、好ましくは１μｍ～１００μｍ程度である。また、脂質二重膜が形成されるのであれば特に限定されないが、スリット２４は、貫通孔１８の内壁の全周に亘って形成されていることが、脂質二重膜を良好に形成する上で好ましく、隔壁の製造も容易になるので好ましい。また、貫通孔１８の平面形状も、脂質二重膜が形成されるのであれば特に限定されないが、通常、円形又は円形に近い形状であり、円形が好ましい。貫通孔１８の平面形状が円形の場合、その直径は、通常、0.5μｍ～800μｍ程度であり、好ましくは、10～400μｍである。 The inner wall of the partition 12 of the present invention has a slit 24 formed therein. The slit 24 is connected to the outside of the partition 12 (described later), and it is possible to supply lipid liquid to the slit 24 from the outside of the partition 12. As shown in FIG. 2, the inner surface of the partition 12 is tapered toward the inside of the through-hole 18 (i.e., the angle θ in FIG. 2 is less than 90 degrees, preferably 75 degrees to 60 degrees), and it is preferable that the slit 24 is opened at the top of this tapered inner wall, since this makes it easier to form a lipid bilayer membrane. It is preferable to control the water repellency and lipophilicity of the surface by subjecting the inner surface of the slit 24 to a water repellent treatment (lipophilic treatment) so that the lipid liquid flows easily and the lipid liquid supplied to the slit 24 stops at the opening of the slit 24 due to the capillary stop valve effect. The method of controlling the water repellency and lipophilicity of the surface includes a method of changing the functional group to be surface-modified depending on the material and wettability of the substrate, and a preferred method is to use a glass substrate as the material of the partition 12 and modify the surface functional group of the glass substrate with fluorocarbon molecules. The process and method of forming the water repellent surface used in this process, such as a silane coupling agent and a polymerization method by heating, are not particularly limited, and can be performed by a known method using a commercially available treatment agent (see the following examples). The thickness of the slit (width in the left-right direction in FIG. 2) is not particularly limited as long as a lipid bilayer membrane is formed, but is usually about 0.1 μm to 200 μm, preferably about 1 μm to 100 μm. In addition, although it is not particularly limited as long as a lipid bilayer membrane is formed, it is preferable that the slit 24 is formed around the entire circumference of the inner wall of the through-hole 18 in order to form a lipid bilayer membrane well and to facilitate the manufacture of the partition. In addition, the planar shape of the through-hole 18 is also not particularly limited as long as a lipid bilayer membrane is formed, but is usually circular or close to circular, and circular is preferable. When the planar shape of the through hole 18 is circular, its diameter is usually about 0.5 μm to 800 μm, and preferably 10 to 400 μm.
図３に、本発明の隔壁の好ましい一具体例の斜視図を示す。なお、図３に示す隔壁１２の貫通孔１８の近傍は、図２を参照して上記した通りである。図３に示す具体例では、２枚のガラス基板を積層し、貼り合わせて隔壁１２を構成している。作製工程の詳細は後述するが、簡単に述べると、平面的な広がりのある凹部を形成したガラス基板２枚を凹部同士が向き合うように貼り合わせ、この凹部をスリット２４としている。２枚のガラス基板を貼り合わせた後、貫通孔１８を各基板に形成することにより、貫通孔の内壁の全周にスリット２４を開口させている。上記した凹部は、各ガラス基板の端部まで延びているので、２枚のガラス基板を貼り合わせると、隔壁１２の外部に開口する開口部２６となる。開口部２６は、スリット２４の一端であり、また、スリット２４は、貫通孔１８の内壁にも開口しているので、開口部２６から脂質液を供給して、貫通孔１８の内壁に脂質液を露出させることが可能である。図３の隔壁１２を、DWCに設置した模式的斜視図を図４に示す。 3 shows a perspective view of a preferred embodiment of the partition wall of the present invention. The vicinity of the through hole 18 of the partition wall 12 shown in FIG. 3 is as described above with reference to FIG. 2. In the embodiment shown in FIG. 3, two glass substrates are laminated and bonded together to form the partition wall 12. Details of the manufacturing process will be described later, but in brief, two glass substrates each having a planarly expanding recess are bonded together so that the recesses face each other, and the recesses are used as the slits 24. After bonding the two glass substrates together, the through hole 18 is formed in each substrate, thereby opening the slits 24 around the entire periphery of the inner wall of the through hole. Since the recesses described above extend to the ends of each glass substrate, when the two glass substrates are bonded together, the openings 26 open to the outside of the partition wall 12 are formed. The openings 26 are one end of the slits 24, and the slits 24 also open to the inner wall of the through hole 18, so that lipid liquid can be supplied from the openings 26 to expose the lipid liquid on the inner wall of the through hole 18. Figure 4 shows a schematic perspective view of the partition wall 12 in Figure 3 installed in a DWC.
次に、図３に示す隔壁１２の作製方法の一具体例を、図５を参照して説明する。 Next, a specific example of a method for fabricating the partition 12 shown in FIG. 3 will be described with reference to FIG. 5.
この具体例では、１枚の隔壁１２は、上記のとおり、凹部を形成した２枚のガラス基板を貼り合わせて作製する。先ず、図５の(1)に示すように、各ガラス基板３０に、フォトリソグラフィなど微細パターン形成技術によって加工領域外となるエッチングマスク３２を作製する。エッチングマスク３２の材料としては、例えば市販のフォトレジスト単体を用いることができる。また、より加工精度を確保するためには、ガラス基板３０の材料に対してエッチングの選択性の高い材料をシード層に成膜することができる。エッチングの方法は特に限定されないが、面精度を著しく粗面化しない方法が好ましい。例えば、フォトレジストとクロム／金の薄膜をエッチングマスクとし、緩衝液を含むフッ酸でエッチングする方法を用いることができる。 In this specific example, one partition 12 is fabricated by bonding two glass substrates with recesses formed therein as described above. First, as shown in FIG. 5(1), an etching mask 32 is fabricated on each glass substrate 30 by a fine pattern forming technique such as photolithography, which is outside the processing area. For example, a commercially available photoresist alone can be used as the material for the etching mask 32. In addition, in order to ensure higher processing accuracy, a material having high etching selectivity with respect to the material of the glass substrate 30 can be formed as a seed layer. Although the etching method is not particularly limited, a method that does not significantly roughen the surface accuracy is preferable. For example, a method can be used in which a photoresist and a thin film of chromium/gold are used as an etching mask, and etching is performed with hydrofluoric acid containing a buffer solution.
次いで、図５の(2)に示すように、エッチングした領域に撥水ポリマーを表面修飾する。好ましくは、ガラス基板３０のエッチングした凹部領域に、フルオロカーボン系の分子をガラス基板の表面官能基に修飾して、フルオロカーボンコート層３４を形成する方法である。この過程で使用する撥水性表面の形成過程及び方法，たとえばシランカップリング剤、加熱による重合の方法などについては、特に制限はなく、市販品を利用することができる（下記実施例参照）。 Next, as shown in FIG. 5(2), the etched area is surface-modified with a water-repellent polymer. Preferably, the etched recessed area of the glass substrate 30 is modified with fluorocarbon molecules on the surface functional groups of the glass substrate to form a fluorocarbon coating layer 34. There are no particular limitations on the process and method for forming the water-repellent surface used in this process, such as silane coupling agents and polymerization methods by heating, and commercially available products can be used (see the examples below).
次いで、図５の(3)に示すように、エッチングマスク３２の除去を行った後，脂質二重膜を形成する開口領域を、裏面から基板貫通のエッチングによって行う。このとき，新たにフォトリソグラフィなどでエッチングマスク３６を形成する。エッチングの手法は、貫通孔の内壁に順テーパが形成される、すなわち貫通エッチングにより形成される貫通孔１８の内壁が、上記のようにテーパ状となる手法が好ましい。このような手法として、特に限定されないが、たとえばブラストエッチングなどが利用できる。 Next, as shown in FIG. 5(3), after removing the etching mask 32, the opening region for forming the lipid bilayer is etched from the back surface of the substrate. At this time, a new etching mask 36 is formed by photolithography or the like. The etching method is preferably one that forms a forward taper on the inner wall of the through hole, i.e., the inner wall of the through hole 18 formed by the through etching is tapered as described above. Such a method is not particularly limited, but for example, blast etching can be used.
次いで、図５の(4)に示すように、エッチングマスクを除去し、表面を洗浄する。この方法は、(2)のフルオロカーボン系分子の表面修飾を侵さないものが好ましい。 Next, as shown in Figure 5 (4), the etching mask is removed and the surface is cleaned. It is preferable to use a method that does not damage the surface modification with fluorocarbon molecules (2).
次いで、図５の(5)に示すように、洗浄した２枚のガラス基板を、半導体基板接合技術によって接合する。接合の方法は，エッチングによって形成したスリットに充填する脂質液に対する薬品耐性を有するものであればとくに制約はない。たとえばエポキシ系高分子による接合、金属拡散接合、原子拡散接合、加熱による直接接合などが利用可能であり、好ましくはガラス基板の表面官能基の脱水反応などを利用した直接接合を利用する。図５の(5)に示されるように、２枚のガラス基板３０にそれぞれ形成された凹部が合わさってスリット２４になる。 Next, as shown in FIG. 5(5), the two cleaned glass substrates are bonded by semiconductor substrate bonding technology. There are no particular restrictions on the bonding method, so long as it is chemically resistant to the lipid liquid that fills the slits formed by etching. For example, bonding with epoxy polymers, metal diffusion bonding, atomic diffusion bonding, direct bonding by heating, etc. can be used, and preferably direct bonding using a dehydration reaction of the surface functional groups of the glass substrates is used. As shown in FIG. 5(5), the recesses formed on each of the two glass substrates 30 are joined to form the slits 24.
なお、図５の(5)に示される隔壁を用いて脂質二重膜を形成した図を図５の(6)に示す。スリット２４には脂質液が充填され、貫通孔１８を塞ぐ形で脂質二重膜２０が形成される。 Figure 5(6) shows a lipid bilayer membrane formed using the partition shown in Figure 5(5). The slit 24 is filled with lipid liquid, and the lipid bilayer membrane 20 is formed by blocking the through-hole 18.
上記した隔壁を用いて本発明の方法により脂質二重膜を形成する方法の好ましい一具体例を、図４に示すように隔壁をDWCに設置した脂質二重膜形成器具を用いて場合を例として、図６を参照してその作用と共に以下に説明する。 A preferred embodiment of the method for forming a lipid bilayer membrane by the method of the present invention using the above-mentioned partition wall will be described below with reference to FIG. 6, using as an example a lipid bilayer membrane forming device in which a partition wall is installed in a DWC as shown in FIG. 4.
図６は、隔壁１２の貫通孔１８近傍の模式的切断部端面図である。先ず、開口部２６（図４参照）から、脂質液を供給する。そうすると、脂質液が貫通孔１８の内壁に形成されたスリット２４にまで到達する。図６ (a)において、下向き及び上向きの矢印は、脂質液の流れを示している。脂質液がスリット２４の先端部まで到達すると、キャピラリストップバルブ効果により、脂質液は、凸状のメニスカスを形成してスリット２４の先端部で停止する（図６ (a))。 Figure 6 is a schematic cross-sectional end view of the vicinity of the through-hole 18 of the partition wall 12. First, lipid liquid is supplied from the opening 26 (see Figure 4). The lipid liquid then reaches the slit 24 formed in the inner wall of the through-hole 18. In Figure 6 (a), the downward and upward arrows indicate the flow of lipid liquid. When the lipid liquid reaches the tip of the slit 24, the capillary stop valve effect causes the lipid liquid to form a convex meniscus and stop at the tip of the slit 24 (Figure 6 (a)).
次に、隔壁１２により隔てられる一方の側（図２に示す第１のウェル１６）に水溶液を加える。そうすると、水溶液と脂質液の界面同士が接触し、図６(b)に示されるように、キャピラリストップバルブ効果が解除され、水溶液と脂質液の界面に、貫通孔１８を塞ぐ形で、脂質単分子層である脂質一重膜２８が自発的に形成される（図６(b)）。 Next, an aqueous solution is added to one side (first well 16 shown in FIG. 2) separated by partition 12. Then, the interfaces of the aqueous solution and lipid solution come into contact with each other, and as shown in FIG. 6(b), the capillary stop valve effect is released, and a lipid monolayer 28, which is a lipid monolayer, is spontaneously formed at the interface between the aqueous solution and lipid solution, blocking through-hole 18 (FIG. 6(b)).
次に、隔壁１２により隔てられる他方の側（図２に示す第２のウェル１４）に水溶液を加える。そうすると、図６(c)に示されるように、他方側の水溶液と脂質液の間にも、先と同様に脂質一重膜が形成され、結果として、脂質二重膜２０が形成される。なお、先に形成される脂質一重膜２８と、後から形成される脂質一重膜との間に挟まれた脂質液は、疎水性相互作用や毛管力等の影響によって２枚の脂質一重膜が接近して隣接することにより、押し出されて図６(c)の上向き及び下向きの矢印で示されるようにスリット２４内を逆流し、２層の脂質一重膜の間から排出され、結果として、脂質液を間に含まない脂質二重膜２０が形成される。 Next, an aqueous solution is added to the other side (second well 14 shown in FIG. 2) separated by the partition 12. Then, as shown in FIG. 6(c), a lipid monolayer is formed between the aqueous solution and lipid liquid on the other side in the same manner as before, resulting in the formation of a lipid bilayer membrane 20. Note that the lipid liquid sandwiched between the lipid monolayer membrane 28 formed earlier and the lipid monolayer membrane formed later is pushed out as the two lipid monolayer membranes approach each other due to the influence of hydrophobic interactions, capillary forces, etc., and flows back through the slit 24 as shown by the upward and downward arrows in FIG. 6(c), and is discharged from between the two lipid monolayer membranes, resulting in the formation of a lipid bilayer membrane 20 that does not contain lipid liquid.
なお、本発明の方法で使用される脂質液及び電解質水溶液は、従来の液滴接触法で用いられている脂質液及び電解質水溶液と同じものを用いることができる。すなわち、脂質二重膜を構成するリン脂質としては、例えば、ジフィタノイルフォスファチジルコリン(diphytanoyl phosphatidylcholine,DPhPC)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(dipalmytoyl phosphatidylcholine)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(Dioleoyl phosphatidylcholine,DOPC)等を好ましい例として挙げることができる。これらの脂質分子は，市販品の試薬グレードのものを利用することができる。脂質二重膜を溶解する有機溶媒は、例えばn-デカンなどの脂肪族炭化水素溶媒を用いることができる。有機溶媒中の脂質分子濃度は特に限定されないが、安定した脂質二重膜の形成には通常5 mg/mL以上、好ましくは20 mg/mL以上である。また、電解質水溶液としては、通常、塩化カリウムのような塩を含むリン酸緩衝液のような水系緩衝液が用いられる。 The lipid liquid and electrolyte aqueous solution used in the method of the present invention can be the same as those used in the conventional droplet contact method. That is, preferred examples of phospholipids constituting the lipid bilayer include diphytanoyl phosphatidylcholine (DPhPC), dipalmytoyl phosphatidylcholine, and dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC). These lipid molecules can be commercially available reagent grade products. An aliphatic hydrocarbon solvent such as n-decane can be used as the organic solvent for dissolving the lipid bilayer. The lipid molecule concentration in the organic solvent is not particularly limited, but is usually 5 mg/mL or more, preferably 20 mg/mL or more, to form a stable lipid bilayer. In addition, an aqueous buffer solution such as a phosphate buffer containing a salt such as potassium chloride is usually used as the electrolyte aqueous solution.
脂質二重膜は、該脂質二重膜に保持された状態におけるタンパク質の性質や機能を調べたり、該タンパク質に結合して、その生理活性を変化させるリガンドをスクリーニングしたりその性質を調べたりする各種測定に好適に用いられるものであるので、脂質二重膜は、タンパク質を含んでいることが好ましく、特に生体内で生体膜に保持された状態で機能している膜貫通タンパク質が好ましい。脂質二重膜に保持するタンパク質としては、各種レセプターや酵素を挙げることができ、例としては、α－ヘモリシン、グラミシジン、アラメチシンなどのペプチドタンパク質類、各種イオンチャンネル、ABCトランスポータタンパク質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。タンパク質が水溶性の場合、上記水溶液としてタンパク質の水溶液を用いることが好ましく、水系緩衝液中にタンパク質を含む水溶液を用いることがさらに好ましい。これらの溶液中のタンパク質の濃度は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができるが、通常、0.1nM～10nM程度、好ましくは0.5nM～2nM程度である。なお、タンパク質は、２つのウェルのいずれか一方に添加される水溶液中に含まれていればよいが、両方のウェルに添加される水溶液中に含まれていてもよい。また、２つのウェルに添加される水溶液は、同じ組成のものでも異なる組成のものでもよい。 The lipid bilayer membrane is preferably used for various measurements such as examining the properties and functions of a protein held in the lipid bilayer membrane, screening ligands that bind to the protein and change its physiological activity, and examining the properties of the ligands. Therefore, the lipid bilayer membrane preferably contains a protein, and in particular, a transmembrane protein that functions in a living body while held in a biological membrane is preferable. Examples of proteins held in the lipid bilayer membrane include various receptors and enzymes, and examples include peptide proteins such as α-hemolysin, gramicidin, and alamethicin, various ion channels, ABC transporter proteins, etc., but are not limited to these. When the protein is water-soluble, it is preferable to use an aqueous solution of the protein as the aqueous solution, and it is even more preferable to use an aqueous solution containing the protein in an aqueous buffer. The concentration of the protein in these solutions is not particularly limited and can be selected appropriately, but is usually about 0.1 nM to 10 nM, preferably about 0.5 nM to 2 nM. The protein may be contained in the aqueous solution added to either one of the two wells, but may also be contained in the aqueous solutions added to both wells. Furthermore, the aqueous solutions added to the two wells may be of the same composition or different compositions.
なお、形成した脂質二重膜を活用する場合、脂質二重膜に保持された、チャネルタンパク質等を通過する電流、すなわち、脂質二重膜を介して流れる電流の値を測定することが通常、行われる。これは、通常、上記した各ウェルの底部に設けられた電極（図２参照）に、電流測定のための増幅回路を接続して行われる。このような回路は、従来の液滴接触法で用いられているものと同じであって周知であり、例えば、特許文献１に記載されている。 When utilizing the formed lipid bilayer membrane, it is common to measure the value of the current passing through the channel protein or the like held in the lipid bilayer membrane, i.e., the current flowing through the lipid bilayer membrane. This is usually done by connecting an amplifier circuit for measuring the current to the electrodes (see FIG. 2) provided at the bottom of each well. Such circuits are the same as those used in the conventional droplet contact method and are well known, and are described in, for example, Patent Document 1.
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described below based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
１．脂質二重膜形成器具
図１に示す脂質二重膜器具を作製した。基板１０の厚さは４mm、第１のウェル１６及び第２のウェル１４の直径は４mm、高さは３mmであった。また、各ウェルの底部に透孔を設け、銀-塩化銀電極２２ａ、２２ｂ(図２参照）を配置した。ウェルの交錯領域に、微細加工技術によって作製した隔壁１２（後述）を設置し、シール部材によって基板１０に固定した。
1. Lipid bilayer membrane forming device The lipid bilayer membrane device shown in Figure 1 was fabricated. The thickness of the substrate 10 was 4 mm, and the diameter and height of the first well 16 and second well 14 were 4 mm and 3 mm, respectively. Furthermore, through holes were provided at the bottom of each well, and silver-silver chloride electrodes 22a, 22b (see Figure 2) were placed therein. A partition 12 (described later) fabricated by microfabrication technology was placed in the intersection region of the wells, and fixed to the substrate 10 by a sealing member.
２． 隔壁の作製
図５を参照して上記した方法により隔壁を作製した。２枚のガラス基板としては、厚さ0.15 mmの硼珪酸ガラス基板を用いた。基板の内部に形成する、スリット２４となる凹部は、クロム、金の成膜およびフォトレジストのパターニングによってエッチングマスクを形成し、フッ化水素を含むエッチング液を用いてエッチングを行うことにより形成した。クロム、金のエッチングマスクは、スパッタリング成膜装置によって成膜され、それぞれおよそ50nm、200nm程度であった、エッチングマスクに使用するフォトレジストとしては、メッキ用フォトレジスト（PMER, 東京応化工業株式会社）を用いた。フォトリソグラフィによるエッチングマスクのパターニングは、マスクアライナ（MA6，SUSS microtech Co. Ltd）を用いて行った。ガラス基板のエッチングはウェットエッチングによって行い、フッ化水素に硫酸、硝酸を混合させた溶液を用いて行った、エッチングを平滑化するため、スターラーによる溶液の撹拌を併用した。エッチング深さは約20μｍであった。凹部の表面をフルオロカーボンで撥水化するため、表面に市販のシランカップリング剤を塗布し、表面官能基と重合させた上で、真空成膜装置でフルオロカーボンを成膜した。成膜ガスはC4F8であり、100nm程度の膜を成膜した。ガラス基板を洗浄した後に、基板の裏面にブラストエッチング用のフォトレジスト（NCM２５０、ニッコーマテリアルズ）をラミネートし、マスクアライナを用いて脂質二重膜形成用の開口のパターンを形成した。その後、アルミナの粉体を基板に吹き付けることで側壁に順テーパが形成された開口を形成した。その後、エッチングマスクを除去し、基板を硫酸、過酸化水素を含む溶液で洗浄した後に、２枚の基板同士を、凹部が向かい合う方向に積層した状態で、３００℃の加熱と加圧により直接接合を行った。なお、上記の手順は、隔壁を量産するために、大きなガラス板に各隔壁の凹部を多数形成し、最後に、基板をブレードダイサーで矩形に切り出すことで、多数の所望の隔壁を得た。各隔壁の大きさは3.2 mm x 5.3 mm、脂質二重膜を形成する開口の大きさは，直径400μmであった。
2. Preparation of Partition Walls Partition walls were prepared by the method described above with reference to FIG. 5. The two glass substrates were borosilicate glass substrates with a thickness of 0.15 mm. The recesses to be the slits 24 formed inside the substrates were formed by forming an etching mask by film formation of chromium and gold and patterning the photoresist, and etching with an etching solution containing hydrogen fluoride. The chromium and gold etching masks were formed by a sputtering film formation device and were approximately 50 nm and 200 nm, respectively. The photoresist used for the etching mask was a plating photoresist (PMER, Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.). The etching mask was patterned by photolithography using a mask aligner (MA6, SUSS microtech Co. Ltd). The glass substrate was etched by wet etching using a solution of hydrogen fluoride mixed with sulfuric acid and nitric acid. To smooth the etching, the solution was stirred with a stirrer. The etching depth was approximately 20 μm. In order to make the surface of the recesses water-repellent with fluorocarbon, a commercially available silane coupling agent was applied to the surface, polymerized with the surface functional group, and then a fluorocarbon film was formed using a vacuum film-forming device. The film-forming gas was C4F8 , and a film of about 100 nm was formed. After cleaning the glass substrate, a photoresist for blast etching (NCM250, Nikko Materials) was laminated on the back surface of the substrate, and a pattern of an opening for forming a lipid bilayer membrane was formed using a mask aligner. Then, an opening with a forward taper formed on the side wall was formed by spraying alumina powder onto the substrate. Then, the etching mask was removed, the substrate was washed with a solution containing sulfuric acid and hydrogen peroxide, and the two substrates were directly bonded by heating and pressing at 300°C with the recesses facing each other. In addition, the above procedure was carried out in order to mass-produce the partition walls, by forming a large number of recesses for each partition wall on a large glass plate, and finally cutting the substrate into a rectangle with a blade dicer to obtain a large number of desired partition walls. The size of each partition was 3.2 mm x 5.3 mm, and the size of the opening forming the lipid bilayer was 400 μm in diameter.
３． 脂質およびゲル・水溶液の準備
脂質（DPhPC, Avanti Polar Lipids）を、20 mg/mLの終濃度でn-デカンに溶解して脂質液を調製した。電解質を含む水溶液としては、イオンチャネルの解析の慣例に従い、1M KClを含むリン酸緩衝液（ｐH７．４）を用いた。
3. Preparation of lipids and gel/aqueous solutions Lipids (DPhPC, Avanti Polar Lipids) were dissolved in n-decane at a final concentration of 20 mg/mL to prepare lipid solutions. As an aqueous solution containing electrolytes, phosphate buffer (pH 7.4) containing 1 M KCl was used, in accordance with the conventional practice for the analysis of ion channels.
４． 脂質二重膜の形成
３で調製した脂質液を、隔壁１２上部の開口部２６に接触させて、スリット２４の内部に装填した。その後、電解質を含む水溶液を、２つの対になるウェルに順次、静かに装填した。脂質二重膜の形成状態を、外部に配置した撮像光学素子によって観察し、脂質二重膜の形成の確認を行った、電解質を含む水溶液を装填した直後に自発的に脂質二重膜が形成されていく様子が、光学的なコントラストによって確認された。より具体的には、脂質二重膜の隙間部分に存在する脂質液中の有機溶媒がスリット領域に向けて取り除かれることで、光の干渉により脂質二重膜の領域が暗褐色となるコントラストが形成された。これは、脂質二重膜が、光の波長より十分小さな距離で、屈折率の異なる脂質分子の界面が接触していることに起因する現象である。また，脂質二重膜の大きさは、脂質液がスリット２４に排出される作用から、時間を経るごとに増大し、貫通孔１８と同程度の大きさまで脂質二重膜が成長した。この操作は再現性高く実現することができ、概ね１分以内に所望の脂質二重膜を得ることができた。以上より、本発明の方法により脂質二重膜を形成できることが示された。
4. Formation of lipid bilayer membrane The lipid solution prepared in 3 was brought into contact with the opening 26 at the top of the partition 12 and loaded into the inside of the slit 24. Then, an aqueous solution containing an electrolyte was gently loaded into the two paired wells in sequence. The state of lipid bilayer membrane formation was observed by an externally placed imaging optical element to confirm the formation of the lipid bilayer membrane. The spontaneous formation of the lipid bilayer membrane immediately after loading the aqueous solution containing the electrolyte was confirmed by optical contrast. More specifically, the organic solvent in the lipid solution present in the gaps of the lipid bilayer membrane was removed toward the slit region, forming a contrast in which the lipid bilayer membrane region turned dark brown due to the interference of light. This is a phenomenon caused by the lipid bilayer membrane being in contact with the interface of lipid molecules with different refractive indexes at a distance sufficiently smaller than the wavelength of light. In addition, the size of the lipid bilayer membrane increased over time due to the action of the lipid solution being discharged into the slit 24, and the lipid bilayer membrane grew to a size comparable to that of the through-hole 18. This operation could be realized with high reproducibility, and the desired lipid bilayer membrane could be obtained within about one minute. From the above, it was demonstrated that a lipid bilayer membrane can be formed by the method of the present invention.
１０ 基板
１２ 隔壁
１４ 第２のウェル
１６ 第１のウェル
１８ 貫通孔
２０ 脂質二重膜
２２ａ 電極
２２ｂ 電極
２４ スリット
２６ 開口部
２８ 脂質一重膜
３０ ガラス基板
３２ エッチングマスク
３４ フルオロカーボンコート層
θ 角度
REFERENCE SIGNS LIST 10 Substrate 12 Partition 14 Second well 16 First well 18 Through hole 20 Lipid bilayer membrane 22a Electrode 22b Electrode 24 Slit 26 Opening 28 Lipid monolayer membrane 30 Glass substrate 32 Etching mask 34 Fluorocarbon coating layer θ Angle
Claims (14)
前記隔壁により隔てられる一方の側に第１の水溶液を加えて前記貫通孔に脂質一重膜を形成する工程と、
前記隔壁により隔てられる他方の側に第２の水溶液を加えて前記貫通孔に脂質二重膜を形成する工程と、
をこの順序で含む、脂質二重膜の形成方法。 a step of supplying a lipid liquid containing lipid membrane-forming lipids to a slit of a vertically disposed partition having a through-hole in which a lipid bilayer membrane is formed, the slit being formed in an inner wall of the through-hole, and exposing the lipid liquid on a surface of the inner wall;
a step of adding a first aqueous solution to one side separated by the partition to form a lipid monolayer in the through-hole;
adding a second aqueous solution to the other side separated by the partition to form a lipid bilayer membrane in the through-hole;
A method for forming a lipid bilayer membrane, comprising the steps of :
脂質二重膜が形成される貫通孔と、
該貫通孔の内壁に開口し、かつ、前記隔壁の外部に連通する、脂質液を供給して前記内壁表面に該脂質液を露出させることが可能なスリットと、
を具備する、脂質二重膜形成用隔壁。 A partition wall that is used in the method for forming a lipid bilayer membrane according to claim 1 and is disposed vertically when used ,
A through-hole in which a lipid bilayer membrane is formed;
a slit that opens on an inner wall of the through hole and communicates with the outside of the partition wall, and through which a lipid liquid can be supplied to expose the lipid liquid on the inner wall surface;
A partition for forming a lipid bilayer membrane comprising:
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Citations (7)
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| WO2010023848A1 (en) | 2008-08-26 | 2010-03-04 | パナソニック株式会社 | Artificial lipid membrane production method, and artificial lipid membrane production apparatus |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010023848A1 (en) | 2008-08-26 | 2010-03-04 | パナソニック株式会社 | Artificial lipid membrane production method, and artificial lipid membrane production apparatus |
| JP2012081405A (en) | 2010-10-10 | 2012-04-26 | Kanagawa Acad Of Sci & Technol | Method for forming lipid bilayer membrane, and apparatus for the same |
| JP2017083210A (en) | 2015-10-23 | 2017-05-18 | 公益財団法人神奈川科学技術アカデミー | Method and device for detecting target material included in gaseous sample to be detected |
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