JP7522409B2 - Application of CNT and fructose dehydrogenase to electrodes - Google Patents
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Description
ＣＮＴを電極に応用する技術分野について開示される。 The technical field of applying CNTs to electrodes is disclosed.
ナノカーボンは電気の伝導率が高いことから他の物質との電子伝達を行う導電材料としての応用が進んでいる。例えばナノカーボンをカーボンと樹脂および有機溶剤からなるインクに混合し基板上に印刷してバイオセンサ用の電極として用いることが提案されている（特許文献１）。また、ナノカーボンの一種であるカーボンナノチューブは過酸化物を測定するセンサに用いられたり（特許文献２）、酵素とともにフィルム状に成形し、センサや燃料電池の電極として用いられたりしている（特許文献３）。 Nanocarbons have a high electrical conductivity, and are therefore increasingly being used as conductive materials for electron transfer with other substances. For example, it has been proposed to mix nanocarbons with an ink consisting of carbon, resin, and an organic solvent, print the ink on a substrate, and use it as an electrode for a biosensor (Patent Document 1). Carbon nanotubes, a type of nanocarbon, are used in sensors that measure peroxides (Patent Document 2), and are formed into a film together with enzymes and used as electrodes in sensors and fuel cells (Patent Document 3).
ナノカーボンを電極に利用する技術をフルクトースデヒドロゲナーゼを用いた電極に応用した電極を提供することが１つの課題である。 One of the challenges is to provide an electrode that applies the technology of using nanocarbon in electrodes to an electrode that uses fructose dehydrogenase.
斯かる課題を解決する手段として、下記を包含する発明が提供される。
項１．
金属基板上にカーボンナノチューブ及びフルクトースデヒドロゲナーゼを含む層を有する、電極。
項２．
該カーボンナノチューブが単層カーボンナノチューブである、項１に記載の電極。
項３．
該カーボンナノチューブの平均直径が２ｎｍ未満である、項１又は２に記載の電極。
項４．
該層が分散剤を更に含む、項１～３のいずれかに記載の電極。
項５．
該分散剤がコール酸ナトリウムである、項４に記載の電極。
項６．
該層がβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼを更に含む、項１～５のいずれかに記載の電極。
項７．
項１～６のいずれかに記載の電極を備えたセンサ。
項８．
フルクトース測定用である、項７に記載のセンサ。
項９．
該層がβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼを含み、スクロース測定用である、項７に記載のセンサ。
項１０．
項１～６のいずれかに記載の電極または項７～９のいずれかに記載のセンサを用いてフルクトースを検出する方法。
項１１．
該層がβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼを含む、項７～９のいずれかに記載のセンサを用いてスクロースを測定する方法。
As a means for solving such problems, the invention includes the following.
An electrode having a layer comprising carbon nanotubes and fructose dehydrogenase on a metal substrate.
Item 5.
5. The electrode according to
Item 6.
Item 6. The electrode according to any one of
Item 7.
Item 7. A sensor comprising the electrode according to any one of
Item 8.
Item 8. The sensor according to item 7, which is for measuring fructose.
Item 9.
Item 8. The sensor according to Item 7, wherein the layer contains β-D-fructofuranosidase and is for measuring sucrose.
A method for detecting fructose using the electrode according to any one of
Item 11.
フルクトースデヒドロゲナーゼを用いた糖の検出を感度良く行うことができる。 Sugar detection can be performed with high sensitivity using fructose dehydrogenase.
電極は、金属基板上にカーボンナノチューブ（「ＣＮＴ」とも称する。）及び／又はフルクトースデヒドロゲナーゼを含む層を有することが好ましい。ＣＮＴとフルクトースデヒドロゲナーゼとは、単一の層に存在しても別々の層に存在してもよい。一実施形態において、ＣＮＴ及びフルクトースデヒドロゲナーゼは、２つの層に明確に分離できない層（実質的に単一の層）に存在することが好ましい。 The electrode preferably has a layer containing carbon nanotubes (also referred to as "CNTs") and/or fructose dehydrogenase on a metal substrate. The CNTs and fructose dehydrogenase may be present in a single layer or in separate layers. In one embodiment, the CNTs and fructose dehydrogenase are preferably present in a layer that cannot be clearly separated into two layers (substantially a single layer).
ＣＮＴの種類は特に制限されず、例えば、単層ＣＮＴ、二層ＣＮＴ、三層以上の多層ＣＮＴであってもよい。一実施形態において、ＣＮＴは、良好な検出感度を実現するため、単層ＣＮＴであることが好ましい。一実施形態において、ＣＮＴの直径は、２ｎｍ未満であることが好ましく、１．５ｎｍ以下が好ましく、１．４ｎｍ以下が好ましく、１．３ｎｍ以下が好ましく、１．２ｎｍ以下が好ましい。一実施形態において、ＣＮＴの直径は、０．１ｎｍ以上、０．５ｎｍ以上、０．６ｎｍ以上、０．７ｎｍ以上、又は０．８ｎｍ以上が好ましい。一実施形態において、ＣＮＴの長さは０．１～１０００μｍであることが好ましい。ＣＮＴは市販されているものを購入して使用してもよく、合成して使用してもよい。ＣＮＴの製造方法は公知である。カーボンナノチューブの直径は、ラマン分光法、光吸収スペクトル、近赤外蛍光分光法、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定することができる。 The type of CNT is not particularly limited, and may be, for example, a single-walled CNT, a double-walled CNT, or a multi-walled CNT having three or more layers. In one embodiment, the CNT is preferably a single-walled CNT in order to achieve good detection sensitivity. In one embodiment, the diameter of the CNT is preferably less than 2 nm, preferably 1.5 nm or less, preferably 1.4 nm or less, preferably 1.3 nm or less, and preferably 1.2 nm or less. In one embodiment, the diameter of the CNT is preferably 0.1 nm or more, 0.5 nm or more, 0.6 nm or more, 0.7 nm or more, or 0.8 nm or more. In one embodiment, the length of the CNT is preferably 0.1 to 1000 μm. The CNT may be purchased from a commercial source or may be synthesized. The method for producing the CNT is known. The diameter of the carbon nanotube can be measured by Raman spectroscopy, optical absorption spectroscopy, near-infrared fluorescence spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), or atomic force microscopy (AFM).
フルクトースデヒドロゲナーゼは、フルクトースの脱水素反応を触媒する活性を有し、その反応に伴って、電子をＣＮＴを介して電極に受け渡すことができる酵素であれば、その種類は制限されない。フルクトースデヒドロゲナーゼがフルクトースを酸化する際に生じる電子の量を測定することにより、試料中のフルクトースの量を測定することができる。よって、該層が積層された金属基板または電極を備えたセンサを用いて試料中のフルクトースを検出し、その量を測定することができる。 There are no limitations on the type of fructose dehydrogenase, so long as it is an enzyme that has the activity of catalyzing the dehydrogenation reaction of fructose and can transfer electrons to an electrode via CNTs as a result of the reaction. The amount of fructose in a sample can be measured by measuring the amount of electrons produced when fructose dehydrogenase oxidizes fructose. Therefore, fructose in a sample can be detected and its amount measured using a sensor equipped with a metal substrate or electrode on which the layer is laminated.
一実施形態において、フルクトースデヒドロゲナーゼは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸以外の補酵素を持つものであることが好ましい。フルクトースデヒドロゲナーゼの由来については特定されないが、一実施形態においてグルコノバクター由来または酢酸菌由来のものが好ましい。 In one embodiment, the fructose dehydrogenase preferably has a coenzyme other than nicotinamide adenine dinucleotide or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. The origin of the fructose dehydrogenase is not specified, but in one embodiment, it is preferably derived from Gluconobacter or Acetobacter.
該層に含有させる酵素の量は任意であり、目的に応じて設定できるが、例えば、０．１～１００Ｕ／ｍｍ２とすることができる。ここで１Ｕは１分間に１マイクロモルのフルクトースが酸化される酵素量である。 The amount of enzyme contained in the layer is arbitrary and can be set according to the purpose, but can be, for example, 0.1 to 100 U/ mm2 , where 1 U is the amount of enzyme that oxidizes 1 micromole of fructose per minute.
金属基板は、電極として用いることができるものであれば特に制限されない。金属電極は、絶縁性基板に金属膜が固定されたものであることが好ましい。金属膜は、例えば、白金、金、パラジウムなどの貴金属、カーボン、銅、アルミニウム、ニッケル、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ Ｔｉｎ Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、又はＺｎＯ（酸化亜鉛）などで形成することができる。一実施形態において、金属膜は、白金、金、パラジウムなどの貴金属で形成されていることが好ましい。絶縁性の基板としては、例えば、プラスチック（例えば、ＰＥＴ）、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、または、生分解性材料などで形成されたものが挙げられる。このような金属電極は公知である。 The metal substrate is not particularly limited as long as it can be used as an electrode. The metal electrode is preferably an insulating substrate with a metal film fixed thereto. The metal film can be formed of, for example, a noble metal such as platinum, gold, or palladium, carbon, copper, aluminum, nickel, titanium, ITO (Indium Tin Oxide), or ZnO (Zinc Oxide). In one embodiment, the metal film is preferably formed of a noble metal such as platinum, gold, or palladium. Examples of insulating substrates include those formed of plastic (e.g., PET), photosensitive materials, paper, glass, ceramics, or biodegradable materials. Such metal electrodes are publicly known.
金属基板上のＣＮＴ及び／又はフルクトースデヒドロゲナーゼを含む層は、ＣＮＴが該層内で分散した状態で存在するように、分散剤を含有することが好ましい。分散剤は、ＣＮＴの凝集（bundling）を防止することができる化合物であれば特に限定されない。分散剤としては、例えば、アニオン系化合物、カチオン系化合物およびノニオン系化合物から選択される少なくとも１種の化合物を用いることができる。 The layer containing CNTs and/or fructose dehydrogenase on the metal substrate preferably contains a dispersant so that the CNTs are present in a dispersed state within the layer. The dispersant is not particularly limited as long as it is a compound that can prevent the bundling of CNTs. As the dispersant, for example, at least one compound selected from an anionic compound, a cationic compound, and a nonionic compound can be used.
アニオン系化合物としては、例えば、コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン系化合物としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。ノニオン系化合物としては、オクチルフェノールエトキシレート（ダウケミカル社製のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－３０５、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－４０５など）、または、ポリソルベート類（ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）など）が挙げられる。一実施形態において好ましい分散剤は、コール酸ナトリウムである。 Examples of anionic compounds include sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, or sodium dodecylbenzenesulfonate. Examples of cationic compounds include cetyltrimethylammonium bromide. Examples of nonionic compounds include octylphenol ethoxylate (Triton-X-100, Triton-X-114, Triton-X-305, Triton-X-405, etc., manufactured by The Dow Chemical Company), or polysorbates (Polysorbate 20 (Tween 20), Polysorbate 40 (Tween 40), Polysorbate 60 (Tween 60), Polysorbate 80 (Tween 80), etc.). In one embodiment, the preferred dispersant is sodium cholate.
一実施形態において、分散剤（例えば、コール酸ナトリウム）は、０．２５ｗ／ｖ％～０．７５ｗ／ｖ％の濃度で液体に溶解して使用することが好ましい。 In one embodiment, the dispersant (e.g., sodium cholate) is preferably used dissolved in a liquid at a concentration of 0.25 w/v% to 0.75 w/v%.
金属基板上にＣＮＴ及びフルクトースデヒドロゲナーゼを含む層を形成することは、例えば、適当な液体にＣＮＴ及びフルクトースデヒドロゲナーゼ（並びに、必要に応じて分散剤等）を添加し、これらが分散した液体を基板上に滴下し、乾燥させることで実施することができる。ＣＮＴ及びフルクトースデヒドロゲナーゼを分散させる液体は特に制限されないが、水またはｐＨ２～ｐＨ１０の緩衝液であることが望ましく、例えば超純水、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、及びトリス緩衝液等が挙げられる。一実施形態において、ＣＮＴを適当な液体（好ましくは、分散剤を含む）に添加し、音波破砕機等を用いて分散させ、それを金属基板上に滴下し、乾燥させた後、フルクトースデヒドロゲナーゼを含有する液体をその上に滴下し、乾燥させて、ＣＮＴ及びフルクトースデヒドロゲナーゼを含む該層を形成することが好ましい。 The layer containing CNTs and fructose dehydrogenase can be formed on a metal substrate by, for example, adding CNTs and fructose dehydrogenase (and, if necessary, a dispersant, etc.) to a suitable liquid, dripping the liquid in which they are dispersed onto the substrate, and drying. The liquid in which the CNTs and fructose dehydrogenase are dispersed is not particularly limited, but is preferably water or a buffer solution having a pH of 2 to 10, such as ultrapure water, glycine buffer, acetate buffer, phosphate buffer, Good's buffer, and Tris buffer. In one embodiment, it is preferable to add CNTs to a suitable liquid (preferably containing a dispersant), disperse the liquid using a sonicator or the like, drip the liquid onto a metal substrate, dry it, and then drip a liquid containing fructose dehydrogenase onto it and dry it to form the layer containing CNTs and fructose dehydrogenase.
該層には、フルクトースデヒドロゲナーゼの活性やフルクトースデヒドロゲナーゼとＣＮＴ及びＣＮＴと金属基板の間の電子の授受を阻害しない限り、任意の他の成分を含むことができる。他の成分としては、例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ以外の酵素、ｐＨ緩衝剤（例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、及びグッド緩衝液等）、糖（ショ糖、乳糖等）、塩（リン酸塩、硫酸アンモニウム等）、アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン等））等を挙げることができる。これら酵素以外の物質は、酵素の安定化剤として機能する場合がある。 The layer may contain any other components as long as they do not inhibit the activity of fructose dehydrogenase or the transfer of electrons between fructose dehydrogenase and the CNTs, and between the CNTs and the metal substrate. Examples of other components include enzymes other than fructose dehydrogenase, pH buffers (e.g., phosphate buffer, citrate buffer, Good's buffer, etc.), sugars (sucrose, lactose, etc.), salts (phosphate, ammonium sulfate, etc.), amino acids (glycine, alanine, serine, etc.), etc. These substances other than enzymes may function as stabilizers for the enzymes.
一実施形態において、該層は、フルクトースデヒドロゲナーゼに加えて、β－Ｄ－フルクトフラノシダーゼを含むことが好ましい。β－Ｄ－フルクトフラノシダーゼは、サッカラーゼ、インベルターゼ、インバーターゼ、又はインベルチンとも称され、スクロースを加水分解し、フルクトースを遊離する活性を有する。よって、β－Ｄ－フルクトフラノシダーゼでスクロースを加水分解し、遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロゲナーゼが更に脱水素することによって生じた電子の量を測定することにより、試料中に存在するスクロースの量を測定することが可能である。このようにして、フルクトースデヒドロゲナーゼとβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼを含む層が積層された金属基板または電極を備えたセンサをスクロース測定用のセンサとして用いることができる。 In one embodiment, the layer preferably contains β-D-fructofuranosidase in addition to fructose dehydrogenase. β-D-fructofuranosidase is also called saccharase, invertase, invertase, or invertin, and has the activity of hydrolyzing sucrose to liberate fructose. Therefore, it is possible to measure the amount of sucrose present in a sample by hydrolyzing sucrose with β-D-fructofuranosidase and measuring the amount of electrons generated by further dehydrogenating the liberated fructose with fructose dehydrogenase. In this way, a sensor equipped with a metal substrate or electrodes on which a layer containing fructose dehydrogenase and β-D-fructofuranosidase is laminated can be used as a sensor for measuring sucrose.
一実施形態において、金属基板の表面には、上記層を形成し易くするために、親水性高分子膜が形成されていてもよい。親水性高分子膜としては、例えば、アセトニトリルプラズマ重合膜、カルボキシメチルセルロースやメチルセルロールなどの親水性高分子、または、ポリビニルピロリドンなどの両親媒性高分子からなる膜などが挙げられる。 In one embodiment, a hydrophilic polymer film may be formed on the surface of the metal substrate to facilitate the formation of the layer. Examples of hydrophilic polymer films include acetonitrile plasma polymerization films, films made of hydrophilic polymers such as carboxymethylcellulose and methylcellulose, and films made of amphiphilic polymers such as polyvinylpyrrolidone.
センサは上記の金属基板または電極を備えることが好ましい。上記電極は、通常、センサ中の作用電極となる。センサは、更に、カウンター電極及び参照電極を備えることが好ましい。このようなセンサの構成は、当該技術分野において公知である。また、センサは、ポテンションスタット及び電流検出回路等のバイオセンサが通常備える構成を備えることができる。 The sensor preferably comprises the metal substrate or electrode described above. The electrode typically serves as the working electrode in the sensor. The sensor preferably further comprises a counter electrode and a reference electrode. Such sensor configurations are known in the art. The sensor may also comprise configurations typically found in biosensors, such as a potentiostat and current detection circuitry.
上述の電極またはそれを備えたセンサを用いてフルクトースを精度良く検出することができる。フルクトースは任意の物質に由来し得、例えば、他の糖類（例えば、スクロース）に由来し得る。センサは、通常測定器に装着されて使用される。測定器に装着されたセンサに試料（血液など）を供給すると、試料中の測定対象物質（フルクトース）とフルクトースデヒドロゲナーゼが反応し、活性中心近傍に存在するＣＮＴへ、トンネル効果によって電子が伝達され、電流が生じる。センサの作用極および対極と電気的に接続された測定器により、この電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が可能である。作用極と対極の間に電圧を印加した際に流れる電流は、分析対象物濃度と相関がある。電流値と予め作成した検量線から分析対象物の濃度を決定することができる。 Fructose can be detected with high accuracy using the above-mentioned electrode or a sensor equipped with the electrode. Fructose can be derived from any substance, for example, from other sugars (e.g., sucrose). The sensor is usually attached to a measuring device when used. When a sample (such as blood) is supplied to the sensor attached to the measuring device, the substance to be measured (fructose) in the sample reacts with fructose dehydrogenase, and electrons are transferred to the CNTs present near the active center by the tunnel effect, generating a current. This current can be measured using a measuring device electrically connected to the working electrode and counter electrode of the sensor, allowing the amount of the substance to be measured contained in the sample to be determined. The current that flows when a voltage is applied between the working electrode and counter electrode is correlated with the concentration of the analyte. The concentration of the analyte can be determined from the current value and a calibration curve created in advance.
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these.
実施例１
以下の（１）～（５）のカーボンナノチューブのそれぞれの粉末３０ｍｇを別個の０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液に懸濁し３０ｍＬの懸濁液を５種類調製した。
（１）単層カーボンナノチューブ、直径：０．８ｎｍ（中央値），０．７－０．９ｎｍ（測定法：近赤外蛍光分光法）（ＳＧ６５ｉ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
（２）単層カーボンナノチューブ、直径：１．０ｎｍ（中央値），０．５－１．５ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ１．０：（株）名城ナノカーボン）
（３）単層カーボンナノチューブ、直径：１．５ｎｍ（中央値），１．２－１．７ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ１．５：（株）名城ナノカーボン）
（４）単層カーボンナノチューブ、直径：２．０ｎｍ（中央値），１．５－２．５ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ２．０：（株）名城ナノカーボン）
（５）多層カーボンナノチューブ、直径：９．５ｎｍ（中央値），５－１５ｎｍ（測定法：ＴＥＭ）（ＮＣ７０００：Ｎａｎｏｃｙｌ）
Example 1
Five types of 30 mL suspensions were prepared by suspending 30 mg of each of the carbon nanotube powders (1) to (5) in separate 0.5 w/v % aqueous sodium cholate solutions.
(1) Single-walled carbon nanotubes, diameter: 0.8 nm (median), 0.7-0.9 nm (measurement method: near-infrared fluorescence spectroscopy) (SG65i: Sigma-Aldrich)
(2) Single-walled carbon nanotubes, diameter: 1.0 nm (median), 0.5-1.5 nm (measurement method: Raman spectroscopy (RBM)) (MEIJO eDIPS EC1.0: Meijo Nanocarbon Co., Ltd.)
(3) Single-walled carbon nanotubes, diameter: 1.5 nm (median), 1.2-1.7 nm (measurement method: Raman spectroscopy (RBM)) (MEIJO eDIPS EC1.5: Meijo Nanocarbon Co., Ltd.)
(4) Single-walled carbon nanotubes, diameter: 2.0 nm (median), 1.5-2.5 nm (measurement method: Raman spectroscopy (RBM)) (MEIJO eDIPS EC2.0: Meijo Nanocarbon Co., Ltd.)
(5) Multi-walled carbon nanotubes, diameter: 9.5 nm (median), 5-15 nm (measurement method: TEM) (NC7000: Nanocyl)
これらのカーボンナノチューブ懸濁液を１８℃でチップ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０Ｄ：日本エマソン株式会社）を用いて出力３０％、１時間処理することによりカーボンナノチューブを分散させた。これらの超音波処理液を２１０，０００ｇ、２時間の超遠心にかけ上清の８０％を回収した。これらの回収液をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット １００ｋ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮し、０．７５～１．５ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液を得た。 These carbon nanotube suspensions were treated at 18°C with a tip-type ultrasonic crusher (Branson Sonifier 450D: Emerson Japan Co., Ltd.) at 30% output for 1 hour to disperse the carbon nanotubes. These ultrasonically treated solutions were ultracentrifuged at 210,000 g for 2 hours to recover 80% of the supernatant. These recovered solutions were concentrated using an Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit 100k (Merck) to obtain carbon nanotube dispersions of 0.75 to 1.5 mg/mL.
ＰＥＴシートに金を蒸着させ、９ｍｍ２の作用電極部位を持つ電極チップを作製した（図１）。上記（１）～（５）のカーボンナノチューブの分散液又は０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液のいずれかを５μＬ作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に溶解したフルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡（株）製、２Ｕ／μＬ、グルコノバクター由来）５μＬを作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、作用電極部位に２％ナフィオン液を５μＬ滴下し、乾燥させ、カーボンナノチューブ及びフルクトースデヒドロゲナーゼを作用電極に固定化した。 Gold was evaporated onto a PET sheet to prepare an electrode chip with a working electrode area of 9 mm2 (Figure 1). 5 μL of either the carbon nanotube dispersion liquid (1) to (5) above or a 0.5 w/v% sodium cholate aqueous solution was dropped onto the working electrode area and dried. After drying, 5 μL of fructose dehydrogenase (Toyobo Co., Ltd., 2 U/μL, derived from Gluconobacter) dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 5.3) was dropped onto the working electrode area and dried. After drying, 5 μL of 2% Nafion solution was dropped onto the working electrode area and dried, and the carbon nanotubes and fructose dehydrogenase were immobilized on the working electrode.
電気化学アナライザー（ＡＬＳ／ＣＨＩ ６６０Ｂ：ビー・エー・エス社）の作用極に上記で作製した電極チップ、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金線をセットした。この３電極をフルクトースを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に浸漬し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を実施した。０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は４８ｍＭのフルクトース濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムを図２（直径０．８ｎｍのカーボンナノチューブ）、図３（直径：１．０ｎｍのカーボンナノチューブ）、図４（直径：１．５ｎｍのカーボンナノチューブ）、図５（直径２．０ｎｍのカーボンナノチューブ）、図６（直径９．５ｎｍのカーボンナノチューブ）、図７（コール酸ナトリウム水溶液；カーボンナノチューブなし）に示す。これらのサイクリックボルタモグラムにおいて－０．８Ｖから＋０．８Ｖへ掃引する際の＋０．６Ｖの電流値は以下の通りであった。 The electrode chip prepared above was set as the working electrode of an electrochemical analyzer (ALS/CHI 660B: BAS Co., Ltd.), a silver/silver chloride electrode as the reference electrode, and a platinum wire as the counter electrode. These three electrodes were immersed in 50 mM citrate buffer (pH 5.3) containing fructose, and measurements were performed by cyclic voltammetry. Cyclic voltammograms measured for fructose concentrations of 0 mM, 10 mM, 20 mM, and 48 mM are shown in Figure 2 (carbon nanotubes with a diameter of 0.8 nm), Figure 3 (carbon nanotubes with a diameter of 1.0 nm), Figure 4 (carbon nanotubes with a diameter of 1.5 nm), Figure 5 (carbon nanotubes with a diameter of 2.0 nm), Figure 6 (carbon nanotubes with a diameter of 9.5 nm), and Figure 7 (aqueous sodium cholate solution; no carbon nanotubes). In these cyclic voltammograms, the current values at +0.6 V when sweeping from -0.8 V to +0.8 V were as follows:
以上の結果より、フルクトースの測定には、単層カーボンナノチューブが好ましく、カーボンナノチューブの直径が２．０ｎｍ未満の場合により精度良くフルクトースの測定が可能であることが確認された。 These results confirm that single-walled carbon nanotubes are preferable for measuring fructose, and that fructose can be measured more accurately when the diameter of the carbon nanotubes is less than 2.0 nm.
実施例２
直径１．０ｎｍ（中央値）の単層カーボンナノチューブ（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ１．０：（株）名城ナノカーボン）の粉末３０ｍｇを０．２５ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、又は１ｗ／ｖ％のコール酸ナトリウム水溶液に懸濁し３０ｍＬの懸濁液を３種類調製した。
Example 2
30 mg of single-walled carbon nanotube powder (MEIJO eDIPS EC1.0: Meijo Nanocarbon Co., Ltd.) having a diameter of 1.0 nm (median) was suspended in 0.25 w/v%, 0.5 w/v%, or 1 w/v% aqueous sodium cholate solution to prepare three types of 30 mL suspensions.
これらのカーボンナノチューブ懸濁液を１８℃でチップ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０Ｄ：日本エマソン株式会社）を用いて出力３０％、１時間処理することによりカーボンナノチューブを分散させた。これらの超音波処理液を２１０，０００ｇ、２時間の超遠心にかけ上清の８０％を回収した。これらの回収液をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット １００ｋ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮し、０．７５～１．５ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液を得た。 These carbon nanotube suspensions were treated at 18°C with a tip-type ultrasonic crusher (Branson Sonifier 450D: Emerson Japan Co., Ltd.) at 30% output for 1 hour to disperse the carbon nanotubes. These ultrasonically treated solutions were ultracentrifuged at 210,000 g for 2 hours to recover 80% of the supernatant. These recovered solutions were concentrated using an Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit 100k (Merck) to obtain carbon nanotube dispersions of 0.75 to 1.5 mg/mL.
実施例１と同様に、ＰＥＴシートに金を蒸着させ、９ｍｍ２の作用電極部位を持つ電極チップを作製した。上記３種類のいずれかのカーボンナノチューブの分散液を５μＬ作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に溶解したフルクトースデヒドロゲナーゼ（２Ｕ／μＬ）５μＬを作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、作用電極部位に２％ナフィオン液を５μＬ滴下し、乾燥させ、カーボンナノチューブ及びフルクトースデヒドロゲナーゼを作用電極に固定化した。 As in Example 1, gold was evaporated onto a PET sheet to prepare an electrode chip having a working electrode area of 9 mm2. 5 μL of any of the above three types of carbon nanotube dispersion liquid was dropped onto the working electrode area and dried. After drying, 5 μL of fructose dehydrogenase (2 U/μL) dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 5.3) was dropped onto the working electrode area and dried. After drying, 5 μL of 2% Nafion solution was dropped onto the working electrode area and dried, and the carbon nanotubes and fructose dehydrogenase were immobilized on the working electrode.
電気化学アナライザー（ＡＬＳ／ＣＨＩ ６６０Ｂ：ビー・エー・エス社）の作用極に上記で作製した電極チップ、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金線をセットした。この３電極をフルクトースを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に浸漬し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を実施した。０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は４８ｍＭのフルクトース濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムは図８（０．２５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム）、図９（０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム）、図１０（１ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム）に示すものとなった。このサイクリックボルタモグラムにおいて－０．８Ｖから＋０．８Ｖへ掃引する際の＋０．６Ｖの電流値は以下の通りであった。 The electrode chip prepared above was set as the working electrode of an electrochemical analyzer (ALS/CHI 660B: BAS Corporation), a silver/silver chloride electrode as the reference electrode, and a platinum wire as the counter electrode. These three electrodes were immersed in 50 mM citrate buffer (pH 5.3) containing fructose, and measurements were performed by cyclic voltammetry. The cyclic voltammograms measured for fructose concentrations of 0 mM, 10 mM, 20 mM, and 48 mM were shown in Figure 8 (0.25 w/v% sodium cholate), Figure 9 (0.5 w/v% sodium cholate), and Figure 10 (1 w/v% sodium cholate). In this cyclic voltammogram, the current value at +0.6 V when sweeping from -0.8 V to +0.8 V was as follows:
実施例３
直径１．０ｎｍ（中央値）の単層カーボンナノチューブ（ＭＥＩＪＯ ｅＤＩＰＳ ＥＣ１．０：（株）名城ナノカーボン）の粉末３０ｍｇを０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液に懸濁し３０ｍＬの懸濁液を調製した。
Example 3
30 mg of powder of single-walled carbon nanotubes (MEIJO eDIPS EC1.0: Meijo Nanocarbon Co., Ltd.) having a diameter of 1.0 nm (median value) was suspended in a 0.5 w/v % aqueous solution of sodium cholate to prepare 30 mL of suspension.
このカーボンナノチューブ懸濁液を１８℃でチップ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０Ｄ：日本エマソン株式会社）を用いて出力３０％、１時間処理することによりカーボンナノチューブを分散させた。これらの超音波処理液を２１０，０００ｇ、２時間の超遠心にかけ上清の８０％を回収した。これらの回収液をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット １００ｋ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮し、０．７５～１．５ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液を得た。 The carbon nanotube suspension was treated at 18°C with a tip-type ultrasonic crusher (Branson Sonifier 450D: Emerson Japan Co., Ltd.) at 30% output for 1 hour to disperse the carbon nanotubes. The ultrasonic treated solution was ultracentrifuged at 210,000g for 2 hours to recover 80% of the supernatant. The recovered solution was concentrated using an Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit 100k (Merck) to obtain a carbon nanotube dispersion of 0.75 to 1.5 mg/mL.
実施例１と同様に、ＰＥＴシートに金を蒸着させ、９ｍｍ２の作用電極部位を持つ電極チップを作製した。上記のカーボンナノチューブの分散液を５μＬ作用電極部位に滴下し乾燥させた。乾燥後、以下の（１）または（２）のいずれかの酵素液５μＬを作用電極部位に滴下し乾燥させた。
（１）５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）にフルクトースデヒドロゲナーゼ（２Ｕ／μＬ）を溶解
（２）５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）にフルクトースデヒドロゲナーゼ（２Ｕ／μＬ）とβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ（東洋紡（株）製「インベルターゼ」；４Ｕ／μＬ）を溶解
酵素液を乾燥後、作用電極部位に２％ナフィオン液を５μＬ滴下し、乾燥させ、カーボンナノチューブ及び酵素を作用電極に固定化した。
As in Example 1, gold was evaporated onto a PET sheet to prepare an electrode chip having a working electrode of 9 mm2. 5 μL of the above carbon nanotube dispersion was dropped onto the working electrode and allowed to dry. After drying, 5 μL of the enzyme solution (1) or (2) below was dropped onto the working electrode and allowed to dry.
(1) Fructose dehydrogenase (2 U/μL) was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 5.3). (2) Fructose dehydrogenase (2 U/μL) and β-D-fructofuranosidase (Invertase; 4 U/μL, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 5.3). After drying the enzyme solution, 5 μL of 2% Nafion solution was dropped onto the working electrode and dried, and the carbon nanotubes and the enzyme were immobilized on the working electrode.
電気化学アナライザー（ＡＬＳ／ＣＨＩ ６６０Ｂ：ビー・エー・エス社）の作用極に上記で作製した電極チップ、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金線をセットした。この３電極をフルクトースまたはスクロースを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）に浸漬し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を実施した。０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は４８ｍＭのフルクトース濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムは図１１（酵素：フルクトースデヒドロゲナーゼのみ）、図１２（酵素：フルクトースデヒドロゲナーゼとβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ）、０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は４８ｍＭのスクロース濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムは図１３（酵素：フルクトースデヒドロゲナーゼのみ）、図１４（酵素：フルクトースデヒドロゲナーゼとβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ）に示すものとなった。このサイクリックボルタモグラムにおいて－０．８Ｖから＋０．８Ｖへ掃引する際の＋０．６Ｖの電流値は以下の通りであった。 The electrode chip prepared above was set as the working electrode of an electrochemical analyzer (ALS/CHI 660B: BAS Corporation), a silver/silver chloride electrode as the reference electrode, and a platinum wire as the counter electrode. These three electrodes were immersed in a 50 mM citrate buffer solution (pH 5.3) containing fructose or sucrose, and measurements were performed by cyclic voltammetry. Cyclic voltammograms measured at fructose concentrations of 0 mM, 10 mM, 20 mM, or 48 mM are shown in Figure 11 (enzyme: fructose dehydrogenase only) and Figure 12 (enzymes: fructose dehydrogenase and β-D-fructofuranosidase), while cyclic voltammograms measured at sucrose concentrations of 0 mM, 10 mM, 20 mM, or 48 mM are shown in Figure 13 (enzyme: fructose dehydrogenase only) and Figure 14 (enzymes: fructose dehydrogenase and β-D-fructofuranosidase). In this cyclic voltammogram, the current value at +0.6 V when sweeping from -0.8 V to +0.8 V was as follows:
以上の結果より、フルクトースデヒドロゲナーゼを用いる電極にβ－Ｄ－フルクトフラノシダーゼを追加することで、スクロースの測定が可能であることが示された。 These results show that it is possible to measure sucrose by adding β-D-fructofuranosidase to an electrode that uses fructose dehydrogenase.
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