JP7511741B2

JP7511741B2 - ２，３，５－置換されたチオフェン化合物の胃腸管間質腫瘍の予防、改善または治療用途

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Publication number: JP7511741B2
Application number: JP2023504835A
Authority: JP
Inventors: テ・ボ・シム; スン・ヘ・チェ; ハン・ナ・チョ; ナム・キュン・キム; ウ・ヨン・ホ; チ・マン・ソン; キィ・ヨブ・ナム; ジョン・ヒョク・ユン
Original assignee: ファロス・アイバイオ・カンパニー・リミテッド; コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2041-07-30
Also published as: KR20220015672A; EP4190331B1; EP4190331A1; WO2022025709A1; US12582639B2; JP2023535216A; EP4190331A4; KR102535840B1; US20230270733A1

Description

本発明は、２，３，５－置換されたチオフェン化合物の胃腸管間質腫瘍の予防、改善または治療用途に関する。

胃腸管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｒｏｍａｌｔｕｍｏｒ、ＧＩＳＴ）は、胃腸管、腸間膜または網状膜で発生する肉腫の中で最も多く、全肉腫の５％を占める。一般的に、完全切除によってのみ胃腸管間質腫瘍の完治が達成できるが、手術後にも肝や腹膜への再発が多く、切除が不可能であったり再発した場合、姑息な細胞毒性抗癌治療および放射線治療に反応しないので、その予後が極めて不良であった。胃腸管間質腫瘍の発生に関連する特定細胞のシグナル伝達体系が究明され、これを遮断できる、いわゆる標的抗癌剤であるイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｇｌｉｖｅｃ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を用いて驚くべき効果を達成することができた。グリベックは、前の細胞毒性抗癌剤に比べて非常に軽微な副作用を示すので、生存期間の延長のみならず、生活の質においても優れた効果を示しており、このような結果に基づいて転移性腫瘍の１次治療としての使用を越えて、手術前の先行治療、手術後の補助治療として、グリベックの効果に関する研究が進められている。

胃腸管間質腫瘍は、Ｃａｊａｌ基質細胞あるいはその前駆細胞を起源とし、ＫＩＴ突然変異（Ｄ８１６、Ｎ８２２Ｋ）によって誘導される胃腸管の間葉組織起源（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）の腫瘍である。大部分の場合（９０－９５％）、ｃ－ｋｉｔタンパク陽性であり、特徴的な紡錘形、上皮様あるいは混合型の組織学的所見を有する（ＣｏｒｌｅｓｓＣＬ，ＦｌｅｔｃｈｅｒＪＡ，ＨｅｉｎｒｉｃｈＭＣ．Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆｇａｓｔｒｏ－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｒｏｍａｌｔｕｍｏｒｓ．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２００４；２２：３８１３－３８２５．）。胃腸管間質腫瘍の８５－９０％でＫＩＴまたはＰＤＧＦＲα遺伝子の突然変異が発見されるが、このうち、ＫＩＴ遺伝子の突然変異が７５－８０％の頻度で最も多い。特に、ＫＩＴ遺伝子の突然変異のうち、エクソン１１の突然変異は約７０％を占め、エクソン９は約１５％、エクソン１３と１７の突然変異は５％未満と稀である。ＰＤＧＦＲα遺伝子の突然変異は、ＫＩＴ突然変異がない胃腸管間質腫瘍の約１／３（７％前後）で観察される（ＹａｒｄｅｎＹ，ＫｕａｎｇＷＪ，Ｙａｎｇ－ＦｅｎｇＴ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅｃ－ｋｉｔ：ａｎｅｗｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｆｏｒａｎｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｌｉｇａｎｄ．ＥＭＢＯＪ１９８７；６：３３４１－３３５１．）。胃腸管間質腫瘍では、ＫＩＴ遺伝子の突然変異（Ｄ８１６、Ｎ８２２Ｋ）によってリガンドの刺激がない場合にも、ＫＩＴ受容体タンパクが自ら活性化され、引き続き細胞分裂が促進されて腫瘍が発生する。

胃腸管間質腫瘍は、世界的に人種に関係なく発生頻度が類似していることが知られている。胃腸管間質腫瘍は、比較的稀な腫瘍で、年間人口１００万人あたり１０－２０人が発生し、全体胃腸管間質腫瘍の約２０－３０％が臨床的に悪性の経過を示すことが知られている（ＭｉｅｔｔｉｎｅｎＭ，ＬａｓｏｔａＪ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｒｏｍａｌｔｕｍｏｒｓ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｆｅａｔｕｒｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＶｉｒｃｈｏｗｓＡｒｃｈ２００１；４３８：１－１２．）。韓国の人口が約５，０００万人であることを考慮すれば、年間５００－１，０００人の胃腸管間質腫瘍患者が新たに発生し、悪性の経過を有する患者は年間約１００－３００人になると推算される。女性より男性の方でより多く発生し、５５－６５歳で最も多く発生するが、２０－３０代および小児年齢でも発生している。

そこで、本発明者らは、胃腸管間質腫瘍の治療に使用できる新規物質を開発するための研究を行って、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または治療用薬学的組成物を提供することである：

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本発明の他の目的は、下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または改善用食品組成物を提供することである：

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本発明の他の目的は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む薬学的組成物を胃腸管間質腫瘍患者に投与するステップを含む胃腸管間質腫瘍の治療方法を提供することである：

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本発明の他の目的は、胃腸管間質腫瘍を予防または治療するための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：

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本発明の一態様は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または治療用薬学的組成物を提供する：

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本発明の一具体例として、前記胃腸管間質腫瘍は、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）がバリン（Ｖａｌｉｎｅ）に置換されて発生するものであってもよい。

本発明の他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または改善用食品組成物を提供する：

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本発明の他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む薬学的組成物を胃腸管間質腫瘍患者に投与するステップを含む胃腸管間質腫瘍の治療方法を提供する：

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本発明の他の態様は、胃腸管間質腫瘍を予防または治療するための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する：

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本発明の他の態様は、胃腸管間質腫瘍を予防または治療するための薬学的組成物製造のための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する：

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本発明の一具体例による２，３，５－置換されたチオフェン化合物を含む組成物は、胃腸管間質腫瘍の増殖抑制率に優れているので、胃腸管間質腫瘍の予防、改善または治療に有用に活用できる。

ｃ－ｋｉｔタンパク質のアミノ酸配列のうち８１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）からバリン（Ｖ）に置換された突然変異を示す図である。（Ａ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、（Ｂ）スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、および（Ｃ）ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）の処理濃度によるｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株内のシグナル伝達阻害能を示す写真である。（Ａ）陰性対照群であるＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄ）、（Ｂ）（Ｃ）スニチニブ、および（Ｄ）（Ｅ）（Ｆ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１の処理濃度によるｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株のＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。（Ａ）陰性対照群であるＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄ）、（Ｂ）スニチニブ、および（Ｃ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１の処理によるｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株のｃｅｌｌｃｙｃｌｅＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。（Ａ）陰性対照群であるＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄ）、（Ｂ）スニチニブ、および（Ｃ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１の処理によるｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株の各細胞周期別ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを示すグラフである。本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）およびスニチニブの処理濃度によるＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株内のシグナル伝達阻害能を示す写真である。本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの処理濃度によるＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株の細胞死滅効果をウェスタンブロット分析方法で確認した結果を示す写真である。ｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株の異種移植マウスモデルにおいて、本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与による生存期間延長効果を示すグラフおよび表である。

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本発明の薬学的組成物に有効成分として含まれる、化学式１で表される化合物は、（Ｓ）－５－（（３－フルオロフェニル）エチニル）－Ｎ－（ピペリジン－３－イル）－３－ウレイドチオフェン－２－カルボキサミド（（Ｓ）－５－（（３－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ）－Ｎ－（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）－３－ｕｒｅｉｄｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）である。

本発明の化学式１で表される化合物であるＰＨＩ－１０１は、ヒトＧＩＳＴ細胞株であるＧＩＳＴ－Ｔ１の増殖を抑制する。ＰＨＩ－１０１は、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞で３６ｎＭのＩＣ_５０値を示すので、優れた胃腸管間質腫瘍抑制活性を示すことができる。

本発明の一具体例による薬学的組成物は、１つ以上の抗癌剤とともに投与される。

本発明の一具体例による薬学的組成物は、胃腸管間質腫瘍の治療のために、単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療、放射線治療および／または生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用できる。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、薬剤の製造に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。適した薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅｏｆｐｈａｒｍａｃｙ２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）に詳しく記載されている。

本発明の薬学的組成物は、その剤形の製剤化に必要で適切な各種基剤および／または添加物を含むことができ、その効果を低下させない範囲内で非イオン界面活性剤、シリコーンポリマー、体質顔料、香料、防腐剤、殺菌剤、酸化安定化剤、有機溶媒、イオン性または非イオン性増粘剤、柔軟化剤、酸化防止剤、自由ラジカル破壊剤、不透明化剤、安定化剤、エモリエント（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔ）、シリコーン、α－ヒドロキシ酸、消泡剤、保湿剤、ビタミン、昆虫忌避剤、香料、保存剤、界面活性剤、消炎剤、物質Ｐ拮抗剤、充填剤、重合体、推進剤、塩基性化または酸性化剤、または着色剤など公知の化合物をさらに含んで製造される。

本発明の薬学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。本発明の薬学的組成物の投与量は、成人基準で０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇであってもよい。

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与することができる。

本発明の薬学的組成物は、経口投与時に多様な剤形で投与されるが、錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤などの形態で投与可能であり、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などをさらに含むことができる。具体的には、本発明の組成物を経口投与剤形に剤形化する場合、その製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができる。前記担体、賦形剤および希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび／または鉱物油が使用できるが、これに限定されない。また、製剤化に一般的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を含んで調製されてもよいし、前記賦形剤のほか、マグネシウムステアレートまたはタルクのような潤滑剤をさらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、非経口投与可能であり、例えば、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの方法により投与されるものであってもよいが、これに限定されない。

非経口投与用剤形への製剤化は、例えば、本発明の薬学的組成物を安定剤または緩衝剤とともに水に混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアル単位投与型で製造するものであってもよい。また、前記組成物は滅菌され、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および緩衝剤などの補助剤、およびその他治療的に有用な物質を追加的に含むことができ、通常の方法によって製剤化可能である。

本発明の一具体例によれば、前記胃腸管間質腫瘍は、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）がバリン（Ｖａｌｉｎｅ）に置換されて発生したものであってもよい。

８５～９０％の胃腸管間質腫瘍は、ＫＩＴまたはＰＤＧＦＲα遺伝子の突然変異によるもので、このうち、ＫＩＴ遺伝子の突然変異が７５～８０％の頻度で最も多い。化学式１で表される化合物は、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸の突然変異、具体的には、アスパラギン酸がバリンに置換された突然変異を有する胃腸管間質腫瘍の抑制活性に優れているので、このような突然変異を有する胃腸管間質腫瘍の予防または治療に有用に活用できる。

本発明の他の態様は、化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物を胃腸管間質腫瘍患者に投与するステップを含む胃腸管間質腫瘍の治療方法を提供する。

本発明の一具体例による薬学的組成物は、化学式１で表される化合物を有効成分として含み、特に、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸の突然変異を有する胃腸管間質腫瘍に優れた抗癌効果を示す。したがって、本発明の薬学的組成物を投与する前、化学式１で表される化合物に効果を示す患者群を選別するコンパニオン診断（ＣｏｍｐａｎｉｏｎＤｉａｇｎｏｓｉｓ）ステップをさらに含むことができ、これは当業界にて公知の胃腸管間質腫瘍の診断方法によって行われる。

本発明で使われる用語、「コンパニオン診断」は、患者の特定薬物治療に対する反応性を予め予測するための診断をいう。

本発明のさらに他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または改善用食品組成物を提供する：

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本発明の食品組成物は、当業界にて通常添加する原料および成分を添加して製造することができ、有効成分である化学式１で表される化合物を含有するほか、通常の食品組成物のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。

本発明の一具体例によれば、天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、ブドウ糖、果糖など）、ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロースなど）、およびポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）のような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。前記香味剤は、天然香味剤（タウマチン）、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）および／または合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を含むことができる。

本発明の食品組成物は、上述した有効成分のほか、追加的に食品学的に許容可能または薬学的に許容可能な担体を１種以上含んで食品組成物に製剤化される。前記食品組成物の製剤形態は、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒、液状、丸、液剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤、または点滴剤などであってもよい。例えば、錠剤またはカプセル剤の形態への製剤化のために、有効成分は、エタノール、グリセロール、水などのような経口、無毒性の薬剤学的に許容可能な不活性担体と結合可能である。

本発明の食品組成物は、ビタミンＡアセテート、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビオチン、ニコチン酸アミド、葉酸、パントテン酸カルシウムからなるビタミン混合物、および硫酸第１鉄、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、クエン酸カリウム、炭酸カルシウムおよび塩化マグネシウムなど当業界にて通常添加可能な１つ以上の無機質を含むことができる。

必要な場合、適した結合剤、潤滑剤、崩壊剤および発色剤も混合物に含まれる。適した結合剤は、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはベータ－ラクトースのような天然糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガカントまたはソジウムオレートのような天然および合成ガム、ソジウムステアレート、マグネシウムステアレート、ソジウムベンゾエート、ソジウムアセテート、ソジウムクロライドなどを含むことができる。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを含むことができる。

このような成分は、独立してまたは組み合わせて使用可能であり、このような添加剤の比率は、本発明の食品組成物１００重量部あたり０～約２０重量部の範囲から選択可能であるが、これに限定されるものではない。

一方、本発明の食品組成物に通常の技術者に知られている多様な剤形の製造方法を適用して多様な食品を製造することができる。例えば、本発明の食品組成物は、飲料や丸、粉末などのような通常の健康機能食品剤形に製造されるが、これに限定されるものではない。

本発明の食品組成物は、胃腸管間質腫瘍細胞株の増殖抑制能力に特に優れているので、胃腸管間質腫瘍の予防または改善に有用に活用できる。

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以下、本発明を一つ以上の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１．ｃ－ｋｉｔ突然変異細胞株に対するＰＨＩ－１０１の抑制活性の確認
１－１．ｃ－ｋｉｔ突然変異細胞株の成長阻害能の確認
化学式１で表される化合物（以下、「ＰＨＩ－１０１」という）のｃ－ｋｉｔ突然変異細胞株に対する抑制活性を測定した。

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具体的には、ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異（図１）Ｂａ／Ｆ３細胞株を１０，０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌに合わせて、９６ウェルプレートに１００μｌずつ入れた。４時間後、Ｂａ／Ｆ３細胞株１００μｌに、１０ｐｏｉｎｔ、１／３ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌｄｉｌｕｔｉｏｎ）した対照化合物およびＰＨＩ－１０１をそれぞれ０．５μｌずつ処理して、最終濃度が最高５０μＭとなるように処理し、５％ＣＯ_２の３７℃条件で７２時間培養した。対照化合物としては、ｃ－ｋｉｔ抑制剤であるイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）およびスニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を使用した。培養後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒｇｌｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞数を測定して、対照化合物およびＰＨＩ－１０１の５０％成長抑制値（ＧＩ_５０、μＭ）を測定した。

その結果、ＰＨＩ－１０１は、対照化合物に比べてｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３突然変異細胞株に対する高い阻害能を示すことが確認され、ｐａｒｅｎｔａｌＢａ／Ｆ３細胞株に比べてより高い選択性を示すことが確認された（表１）。

１－２．ｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能の確認
ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株において、対照化合物およびＰＨＩ－１０１のｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能（ｐ－ＳＴＡＴ３、ｐ－ＥＲＫ１／２）を測定し、対照化合物としてはスニチニブおよびダサチニブを使用した。

具体的には、ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で分注し、対照化合物およびＰＨＩ－１０１をそれぞれ０．１、１および１０μＭの濃度で処理した後、２時間培養した。その後、溶解バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５、１％ＮＰ４０、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ、Ｎａ_３ＶＯ_４および２．５ｍＭＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ））を用いて細胞溶解物を得た。同量の細胞溶解物を８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥｇｅｌを用いて１００Ｖで１時間３０分間電気泳動し、分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的に移動させた。メンブレンを５％脱脂乳で室温で３０分間ブロッキングした後、一次抗体ｐ－ｃ－ｋｉｔＴｙｒｏｓｉｎｅ７１９（Ｙ７１９）、ｐ－ＳＴＡＴ３Ｔｙｒｏｓｉｎｅ７０５（Ｙ７０５）およびｐ－ＥＲＫ１／２Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ２０２／Ｔｙｒｏｓｉｎｅ２０４（Ｔ２０２／Ｙ２０４）を１：５０００で希釈して、メンブレンと４℃で１６～２０時間反応させた。発現の程度を比較するための対照群として、抗－βアクチン（ａｃｔｉｎ）を１：１００００の比率で希釈して一次抗体として使用した。以後、メンブレンをＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間３回ずつ洗浄した後、ＨＲＰ－結合抗－ｒａｂｂｉｔを二次抗体として１：１００００の比率で希釈して室温で１時間培養した後、ＴＢＳＴで５分間３回ずつ洗浄し、化学発光基質試薬を処理し、暗室でフィルムで発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出してタンパク質の発現程度を確認した。

その結果、ＰＨＩ－１０１は、対照化合物に比べてｐ－ｃ－ｋｉｔ（Ｙ７１９）リン酸化に対する高い阻害能を示し、対照化合物と類似の下位シグナル伝達（ｐ－ＳＴＡＴ３、ｐ－ＥＲＫ１／２）阻害能を示すことが確認された（図２）。

１－３．細胞死滅効果の確認
ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株にＰＨＩ－１０１を処理した後、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果を分析した。

具体的には、ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を１×１０^６／ｍｌの濃度で分け、ＰＨＩ－１０１を０．１、１、１０μＭの濃度で、対照化合物としてはスニチニブを１、１０μＭの濃度で２４時間処理した。その後、培地を除去し、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＰＢＳを除去した。Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋を含んでいるＰＢＳ１００μｌで細胞を溶かし、５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶを入れて２０分間反応させた。反応が終わると、４００μｌのＣａ^２＋、Ｍｇ^２＋を含んでいるＰＢＳを追加し、５μｌＰＩ（Ｐｒｏｐｏｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）を入れた後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ－Ｃ６、ＢＤ）を用いてＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）分析法で細胞死（ａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｄｅａｔｈ）の程度を調べた。

その結果、ＰＨＩ－１０１は、０．１μＭの濃度でも細胞死滅を強く誘導し、濃度依存的に細胞死が増加することが確認された（図３）。

１－４．細胞周期進行抑制効果の確認
ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株にＰＨＩ－１０１１μＭを処理した後、ｃｅｌｌｃｙｃｌｅＦＡＣＳ分析によりＳｕｂＧ１／ＧＯ－１ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを分析した。

具体的には、ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株１×１０^６／ｍｌの濃度で分け、ＰＨＩ－１０１および対照化合物であるスニチニブを１μＭの濃度で２４時間処理した。その後、培地を除去し、ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を７０％エタノールに入れて、４℃で２４時間固定した後、４０μｇ／ｍｌＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）および１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅが混合されたＰＢＳ緩衝溶液で３０分間反応させて、ｔｏｔａｌＤＮＡをすべて染色した。染色された細胞の細胞周期の分析はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ－Ｃ６、ＢＤ）を用いて行われた。Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の比率（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）を測定し、これに基づいて、ＳｕｂＧ１／ＧＯ－１ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを確認した。

その結果、ＰＨＩ－１０１の処理によってＳｕｂＧ１／ＧＯ－１ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが増加して、ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞周期の進行が抑制されることが確認された（図４および図５）。

実施例２．胃腸管間質腫瘍細胞株に対するＰＨＩ－１０１の抑制活性の確認
２－１．胃腸管間質腫瘍細胞株の成長阻害能の測定
胃腸管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｔｒｏｍａｌｔｕｍｏｒ、ＧＩＳＴ）細胞株に対するＰＨＩ－１０１の抑制活性を測定した。

具体的には、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株を５，０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌに合わせて、９６ウェルプレートに１００μｌずつ入れた。２４時間安定化後、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株１００μｌに、１０ｐｏｉｎｔ、１／３ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌｄｉｌｕｔｉｏｎ）した対照化合物およびＰＨＩ－１０１をそれぞれ０．５μｌずつ処理して最終濃度が最高５０μＭとなるように処理し、５％ＣＯ_２の３７℃条件で７２時間培養した。対照化合物としてはｃ－ｋｉｔ抑制剤であるイマチニブ、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、スニチニブおよびポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）を使用した。培養後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒｇｌｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞数を測定して、対照化合物およびＰＨＩ－１０１の５０％成長抑制値（ＧＩ_５０、μＭ）を測定した。

その結果、ＰＨＩ－１０１は、対照化合物と類似する水準のＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株阻害能を示すことが確認された（表２）。

２－２．ｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能の確認
胃腸管間質腫瘍細胞株において、対照化合物およびＰＨＩ－１０１のｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能（ｐ－ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－Ｓ６）を測定し、対照化合物としてはイマチニブおよびスニチニブを使用した。

具体的には、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株に１μＭの濃度の対照化合物および０．０１、０．１、１μＭの濃度のＰＨＩ－１０１を処理し、一次抗体としてｐ－ｃ－ｋｉｔＴｙｒｏｓｉｎｅ７０３（Ｙ７０３）、ｐ－ＡＫＴＴｈｒｅｏｎｉｎｅ３０８（Ｔ３０８）、ｐ－ＡＫＴＳｅｒｉｎｅ４７３（Ｓ４７３）、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ７０５（Ｙ７０５）、ｐ－ＥＲＫ１／２およびｐ－Ｓ６Ｓｅｒｉｎｅ２３５／Ｓｅｒｉｎｅ２３６（Ｓ２３５／Ｓ２３６）を１：３０００で希釈して使用したことを除けば、実施例１－２と同様の方法でｃ－ｋｉｔリン酸化と下位シグナル伝達阻害能を確認した。

その結果、ＰＨＩ－１０１は、濃度依存的にｃ－ｋｉｔおよび下位シグナルのリン酸化を減少させ、対照化合物と類似の下位シグナル阻害能を示すことが確認された（図６）。

２－３．細胞死滅効果の確認
胃腸管間質腫瘍細胞株にＰＨＩ－１０１を処理して、細胞死滅マーカーであるｃｌｅａｖｅｄＰＡＲＰの水準を分析し、対照化合物としてはイマチニブおよびスニチニブを使用した。

具体的には、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株に１μＭの濃度の対照化合物および０．０１、０．１、１μＭの濃度のＰＨＩ－１０１を２４時間処理し、一次抗体としてｃｌｅａｖｅｄＰＡＲＰを１：３０００で希釈して使用したことを除けば、実施例１－２と同様の方法で分析して、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株に対するＰＨＩ－１０１の細胞死滅効果を分析した。

その結果、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株においてｃｌｅａｖｅｄＰＡＲＰの水準がＰＨＩ－１０１の濃度依存的に増加することが確認されて、胃腸管間質腫瘍細胞株に対するＰＨＩ－１０１の細胞死滅効果を確認した（図７）。

実施例３．ｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株の異種移植マウスモデルにおけるＰＨＩ－１０１の生存期間延長効能の確認
３－１．ｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株の異種移植マウスモデルの確立
マウスは６～８週齢のＮＯＤＳＣＩＤ雌マウス（１８～２２ｇ）（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ）で用意した。マウスを実験に用いる前の７日間順化させており、健康に異常のあるマウスは実験から除いた。４０％～７０％の相対湿度に維持される２２±３℃の飼育場（３００×１８０×１５０ｍｍ）で１２時間の明暗周期でマウスを飼育した。プロトコルで明示された期間を除いた全体実験期間の間、滅菌された乾燥顆粒食品（ＢｅｉｊｉｎｇＫｅａｏｘｉｅｌｉＦｅｅｄＣｏ．，Ｌｔｄ．、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）および水をマウスが自由に摂取できるようにした。

７５Ｔフラスコで浮遊形態で培養されたｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞５０ｍｌを円錐管（ｃｏｒｎｉｃａｌｔｕｂｅ）に入れて８００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ、ｗｅｌｇｅｎｅ）で８００ｒｐｍで２分間遠心分離して洗浄した後、抗生剤およびＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）のないＲＰＭＩ１６４０（ｗｅｌｇｅｎｅ）に懸濁させた。その後、トリパンブルー（Ｔｒｙｐｈａｎｂｌｕｅ）で染色し、血球計算板（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で細胞数を測定した。生存細胞の数が１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞濃度を調節して１００μｌずつインスリン注射器（ｉｎｓｕｌｉｎｓｙｒｉｎｇｅ）に分注し、ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒを用いてマウスを補正した後、尾静脈投与してｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株の異種移植マウスモデルを作製した。

ｃ－ｋｉｔＤ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を移植して３日後、マウスを各グループ別に６匹ずつ割り当て、マウスが死亡するまでの間、毎日イマチニブ９０ｍｇ／ｋｇ、スニチニブ２０、４０ｍｇ／ｋｇ、ＰＨＩ－１０１７、２０、４０、８０ｍｇ／ｋｇの用量をそれぞれマウスに経口投与した。経口投与時、各化合物は５％１－メチル－２－ピロリドンに溶かした後、１５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ、３０％ＰＥＧＥ４００ＨＳ１５および５０％０．０５Ｍクエン酸に完全に混合して使用した。

３－２．マウスの生存期間延長の確認
ｃ－ｋｉｔＤ８１６ＶＢａ／Ｆ３細胞株の異種移植マウスモデルにおいて、ＰＨＩ－１０１の投与によってマウスの生存期間が延長されるかを確認した。

具体的には、毎日、実施例３－１のマウスモデルの皮膚状態、出血および便の状態などを確認して異常の有無をモニタリングしながら、薬物の経口投与開始後３日間隔でマウスの体重を測定して体重の変化の有無を確認した。また、毎日経口投与を進行させながらマウスの状態を確認して死亡個体を記録した。各データに対してはＯｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡを用いて各群の有意性テストを進行させ、マウスの生存期間（ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ）に対してＫａｐｌａｎＭｅｉｅｒｓｕｒｖｉｖａｌａｎａｌｙｓｉｓを用いてグラフを導出し、平均生存期間（ｍｅｄｉａｎｓｕｒｖｉｖａｌｔｉｍｅ）を求めた。

その結果、生存期間延長効果のない対照化合物とは異なり、ＰＨＩ－１０１は、７ｍｇ／ｋｇの低用量でもビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群に比べて３日の生存期間延長効果があり、８０ｍｇ／ｋｇ投与群では、ビヒクル投与群に比べて生存期間が２倍延長されたことが確認された（図８）。

これまで本発明についてその実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

Claims

下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または治療用薬学的組成物：
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前記胃腸管間質腫瘍は、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）がバリン（Ｖａｌｉｎｅ）に置換されて発生するものである、請求項１に記載の胃腸管間質腫瘍の予防または治療用薬学的組成物。
下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む胃腸管間質腫瘍の予防または改善用食品組成物：
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胃腸管間質腫瘍を予防または治療するための薬学的組成物製造のための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用：
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