JP7498460B2 - Manufacturing method for biodegradable plastics using seaweed as raw material - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
本発明は、海藻を含む培地でアルギン酸資化能およびポリヒドロキシアルカン酸(PHA)合成能を有する微生物を培養する工程（ａ）を含む、海藻を原料とするPHAの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid (PHA) using seaweed as a raw material, comprising step (a) of culturing a microorganism capable of assimilating alginic acid and synthesizing PHA in a medium containing seaweed.
生分解性プラスチックとは、微生物に接触しない条件では普通のプラスチックの場合と同様の性質・機能を有するが、自然環境またはコンポスト化装置においておくことで、微生物に資化され、最終的には二酸化炭素と水に分解される特性を有する、高分子材料である。生分解性プラスチックには、原料として化石資源を利用する生分解性石油由来プラスチックと、バイオマスを原料とする生分解性バイオプラスチックの2種類が存在する。二酸化炭素発生量の増加と地球温暖化が問題とされるなか、バイオプラスチックのようにバイオマスを原料とし、最終的には水と二酸化炭素に分解されて、環境に蓄積しない素材が求められている。 Biodegradable plastics are polymeric materials that have the same properties and functions as ordinary plastics when not in contact with microorganisms, but when left in the natural environment or in a composting device, they are assimilated by microorganisms and ultimately decomposed into carbon dioxide and water. There are two types of biodegradable plastics: biodegradable petroleum-derived plastics that use fossil resources as raw materials, and biodegradable bioplastics that use biomass as raw materials. With the increase in carbon dioxide emissions and global warming becoming problems, there is a demand for materials like bioplastics that use biomass as raw materials, ultimately decompose into water and carbon dioxide, and do not accumulate in the environment.
日本バイオプラスチック協会は、バイオマスプラ識別表示基準に適合する製品の条件として、バイオプラスチック度が25質量%以上の製品であることを挙げている。バイオプラスチック度が高い製品のほうが、環境への負荷が少ないといえる。100%バイオマス原料由来のバイオプラスチックとしては、ポリ乳酸やポリヒドロキシアルカン酸（PHA）などがある。 The Japan Bioplastics Association states that a product must have a bioplastic content of 25% or more by mass in order to meet the criteria for identifying and labeling biomass plastics. Products with a higher bioplastic content have a lower environmental impact. Examples of bioplastics made from 100% biomass raw materials include polylactic acid and polyhydroxyalkanoic acid (PHA).
PHAは、微生物が合成する脂肪族ポリエステルであり、炭素源およびエネルギー化合物として生理的な役割を持っており、窒素やリン源などが不足した栄養枯渇条件下で炭素源が存在する時に、細胞内に蓄積される。最も研究が進んでいるPHAの1つであるポリヒドロキシブタン酸（P(3HB)）は、1925年にLemoigne博士によって、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）から見いだされており、その後、水素細菌やラン藻類など300種類以上の細菌による合成が報告されている。このP(3HB)は、もろい性質（破壊伸び5%）であるため、融点や引張強度などが類似しているポリプロピレンと比べて商業的には劣る材料と考えられていた。しかし、1974年にWallenとRohwedderによって、3-ヒドロキシブタン酸ユニット（3HB）とは異なるヒドロキシアルカン酸（HA）ユニットが見だされて以降、様々なHAが報告され、現在は約150種類以上のモノマーユニットが報告されている。また、PHAの物性について3HB以外のモノマーユニットが組み込まれ、共重合体となることで物性が改善されることが様々な研究で示されている（非特許文献１～６）。 PHAs are aliphatic polyesters synthesized by microorganisms, and have physiological roles as carbon sources and energy compounds. They accumulate in cells when a carbon source is present under nutrient-depleted conditions in which nitrogen and phosphorus sources are in short supply. Polyhydroxybutanoic acid (P(3HB)), one of the most studied PHAs, was discovered in Bacillus megaterium by Dr. Lemoigne in 1925, and its synthesis by more than 300 types of bacteria, including hydrogen bacteria and cyanobacteria, has since been reported. This P(3HB) is brittle (elongation at break: 5%) and was considered to be an inferior material commercially compared to polypropylene, which has a similar melting point and tensile strength. However, since Wallen and Rohwedder discovered a hydroxyalkanoic acid (HA) unit different from the 3-hydroxybutanoic acid unit (3HB) in 1974, various HAs have been reported, and currently more than 150 types of monomer units have been reported. In addition, various studies have shown that the physical properties of PHA can be improved by incorporating monomer units other than 3HB to form a copolymer (Non-Patent Documents 1-6).
これまでに、さまざまな有機物を炭素源としたPHAの微生物生合成について報告されている。例えば、特許文献１は、リグニン誘導体および/またはそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属またはアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物を、リグニン誘導体およびそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法を開示する。特許文献２は、（i）糖類の存在下に、微生物に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異遺伝子およびクロストリジウム（Clostridium）属微生物由来のロイシン代謝遺伝子が導入された形質転換体を培養し、（ii）得られた培養物から、3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸とをモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法であって、糖類が単糖（グルコース）である方法を開示する。 To date, microbial biosynthesis of PHA using various organic substances as carbon sources has been reported. For example, Patent Document 1 discloses a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by a microorganism, comprising culturing a microorganism belonging to the genus Cupriavidus, Ralstonia, or Alcaligenes, which has the ability to assimilate lignin derivatives and/or their polyhydroxyalkanoic acid biosynthetic intermediate metabolites, in a medium containing at least one substance selected from the group consisting of lignin derivatives and their polyhydroxyalkanoic acid biosynthetic intermediate metabolites as a carbon source, and recovering polyhydroxyalkanoic acid from the microbial cells. Patent Document 2 discloses a method for producing a polyhydroxyalkanoic acid copolymer, which is characterized in that (i) in the presence of sugars, a transformant in which a polyhydroxyalkanoic acid polymerase mutant gene and a leucine metabolism gene derived from a Clostridium microorganism are introduced into a microorganism is cultured, and (ii) a polyhydroxyalkanoic acid copolymer containing 3-hydroxybutanoic acid and 3-hydroxy-4-methylvaleric acid as monomer units is collected from the resulting culture, in which the sugars are monosaccharides (glucose).
特許文献３は、少なくとも３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシへキサン酸を含むモノマーユニットを重合して得られるポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法であって、構成脂肪酸としてラウリン酸を４１重量％以上含有する油脂、および/または脂肪酸を炭素源とし、かつ培養開始時からのポリヒドロキシアルカン酸の平均時間生産性が１．５ｇ／Ｌ／ｈ以上になるよう、酸素移動速度を調整して微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の微生物による生産方法を開示する。これらの他にも、炭素源を糖（グルコース、フルクトース、スクロース）、油脂または脂肪酸とする微生物によるポリヒドロキシアルカン酸またはポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造方法（特許文献４～７）、炭素源が、炭素数４のカルボン酸および／または炭素数４のアルコールおよびそれらの誘導体を含むことを特徴とする、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の発酵生産方法（特許文献８）、１-ヘキセンを単一炭素源として含む培地中でポリエステルを生産する能力を有する微生物を培養することを特徴とする、微生物ポリエステルの製造方法（特許文献９）、および酢酸またはその塩を単一炭素源として含む培地中で、酢酸またはその塩を資化することにより増殖し、かつポリヒドロキシアルカン酸を生産・蓄積する能力を有する微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法（特許文献１０）等がある。 Patent Document 3 discloses a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by using microorganisms, obtained by polymerizing monomer units containing at least 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid, characterized in that the method uses fats and oils containing 41% by weight or more of lauric acid as a constituent fatty acid and/or fatty acids as a carbon source, and cultures the microorganisms while adjusting the oxygen transfer rate so that the average hourly productivity of polyhydroxyalkanoic acid from the start of culture is 1.5 g/L/h or more. Other examples include a method for producing polyhydroxyalkanoic acid or polyhydroxyalkanoic acid copolymers using microorganisms with sugars (glucose, fructose, sucrose), fats and oils, or fatty acids as the carbon source (Patent Documents 4 to 7); a method for fermentatively producing polyhydroxyalkanoic acid using microorganisms, characterized in that the carbon source contains a carboxylic acid having four carbon atoms and/or an alcohol having four carbon atoms and derivatives thereof (Patent Document 8); a method for producing microbial polyesters, characterized in that a microorganism capable of producing polyesters is cultured in a medium containing 1-hexene as the sole carbon source (Patent Document 9); and a method for producing polyhydroxyalkanoic acid, characterized in that a microorganism capable of growing by assimilating acetic acid or a salt thereof and producing and accumulating polyhydroxyalkanoic acid is cultured in a medium containing acetic acid or a salt thereof as the sole carbon source (Patent Document 10).
一方、トウモロコシやサトウキビなどの可食原料から抽出される糖やアルコールなどを用いたPHA生産は、食糧と競合し、価格の上昇をもたらしている。そのため、未利用バイオマスを利用するための研究が、地球環境に低負荷な技術として期待されている。近年、未利用バイオマスのひとつとして海藻が世界的に注目されている。日本では海藻の生産・加工の段階で大量の海藻が破棄されており、ワカメ加工においては収穫量の約60%が廃棄されている（非特許文献７）。これら海藻廃棄物は産業廃棄物として処理しなくてはならず、漁師や企業にとっては大きな負担であり、海藻廃棄物の不法投棄も問題となっている。そのため、地球環境に低負荷なバイオプラスチックの原料として海藻の利用が期待されている。 On the other hand, PHA production using sugars and alcohols extracted from edible raw materials such as corn and sugarcane competes with food, leading to rising prices. For this reason, research into utilizing unused biomass is expected to be a technology that places a low burden on the global environment. In recent years, seaweed has attracted worldwide attention as one of the unused biomass resources. In Japan, a large amount of seaweed is discarded during the seaweed production and processing stages, and in wakame processing, approximately 60% of the harvest is discarded (Non-Patent Document 7). This seaweed waste must be treated as industrial waste, which is a heavy burden on fishermen and companies, and illegal dumping of seaweed waste is also a problem. For this reason, it is expected that seaweed will be used as a raw material for bioplastics that place a low burden on the global environment.
従来、糖や植物油、アルコールなどを炭素源とするPHA生合成が報告されているが、炭素源が食糧と競合するため、海藻廃棄物など未利用バイオマスを原料とするバイオプラスチックの製造方法の開発が求められていた。従来技術において、酸および酵素で処理された海藻加水分解物を原料とする、微生物（Cupriavidus necator）によるPHA合成が報告されている（非特許文献８）。しかしながら、海藻、特に褐藻そのものを原料とするバイオプラスチックの製造に関しては知られていない。したがって、本発明は、海藻、特に褐藻そのものを原料とするPHAの製造方法を提供すること、および海藻を原料としてPHAを合成可能な新規微生物を提供することを目的とする。 Previously, PHA biosynthesis using sugar, vegetable oil, alcohol, etc. as a carbon source has been reported, but because the carbon source competes with food, there has been a demand for the development of a method for producing bioplastics using unused biomass such as seaweed waste as a raw material. In the prior art, PHA synthesis by a microorganism (Cupriavidus necator) using seaweed hydrolysate treated with acid and enzymes as a raw material has been reported (Non-Patent Document 8). However, there is nothing known about the production of bioplastics using seaweed, particularly brown algae itself, as a raw material. Therefore, the present invention aims to provide a method for producing PHA using seaweed, particularly brown algae itself, as a raw material, and to provide a novel microorganism capable of synthesizing PHA using seaweed as a raw material.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、海藻を炭素源としてPHAを合成可能な微生物、およびこの微生物を用いたPHAの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は、以下の[1]から[13]を提供する。
[1] 海藻を含む培地でアルギン酸資化能およびポリヒドロキシアルカン酸(PHA)合成能を有する微生物を培養する工程（ａ）を含む、海藻を原料とするPHAの製造方法。
[2] 上記微生物がコベティア属（Cobetia）細菌である、[1]に記載の製造方法。
[3] 上記海藻が褐藻類である、[1]または[2]に記載の製造方法。
[4] 上記褐藻類がコンブ目またはヒバマタ目に属する褐藻類である、請求項３に記載の製造方法。
[5] 培養工程（ａ）が、培養開始前のpHが3.0～9.0の範囲の培地で実施される、[1]～[4]のいずれか一に記載の製造方法。
[6] 上記微生物が、下記１）～３）から選択されるいずれかである、[1]～[5]のいずれか一に記載の製造方法。
１）受領番号NITE AP-03085として寄託された微生物。
２）受託番号NITE P-02758またはNITE P-02759として寄託された微生物。
３）下記(ａ)または(ｂ)の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有する、微生物。
(ａ) 配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列。
(ｂ) 配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列に対して90%以上の塩基配列同一性を有する塩基配列。
[7] 上記微生物は、単離微生物、寄託微生物、遺伝子改変微生物である、[1]～[6]のいずれか一に記載の製造方法。
[8] 培養工程（ａ）で得られた培養物からPHAを抽出する工程（ｂ）を更に含む、[1]～[7]のいずれか一に記載の製造方法。
[9] 上記PHAが、3-ヒドロキシブタン酸モノマー単位を含む、[1]～[8]のいずれか一に記載の製造方法。
[10] 上記PHAが、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸）である、[9]に記載の製造方法。
[11] [1]～[10]のいずれか一に記載の方法を実施してポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を得る工程、および
上記工程で得られたPHAを含むプラスチック製品を得る工程を含む、バイオプラスチック製品の製造方法。
[12] 受領番号NITE AP-03085として寄託された微生物。
[13] 下記（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有する、コベティア属細菌。
(ａ) 配列番号１に記載の塩基配列。
(ｂ) 配列番号１に記載の塩基配列に対して90%以上の塩基配列同一性を有する塩基配列。
As a result of extensive research to solve the above problems, the inventors discovered a microorganism capable of synthesizing PHA using seaweed as a carbon source, and a method for producing PHA using this microorganism, thereby completing the present invention.
Specifically, the present invention provides the following [1] to [13].
[1] A method for producing polyhydroxyalkanoic acid (PHA) using seaweed as a raw material, comprising: (a) culturing a microorganism having the ability to utilize alginic acid and synthesize polyhydroxyalkanoic acid (PHA) in a medium containing seaweed.
[2] The method according to [1], wherein the microorganism is a Cobetia bacterium.
[3] The manufacturing method described in [1] or [2], wherein the seaweed is brown algae.
[4] The manufacturing method described in claim 3, wherein the brown algae are brown algae belonging to the Laminariales or Fucales orders.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the culture step (a) is carried out in a medium having a pH in the range of 3.0 to 9.0 before the start of culture.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the microorganism is any one selected from the following 1) to 3).
1) The microorganism deposited under accession number NITE AP-03085.
2) Microorganisms deposited under accession numbers NITE P-02758 or NITE P-02759.
3) A microorganism having a 16S rRNA gene containing the following nucleotide sequence (a) or (b):
(a) a nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
(b) A nucleotide sequence having 90% or more nucleotide sequence identity to any of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3.
[7] The method for producing the present invention described in any one of [1] to [6], wherein the microorganism is an isolated microorganism, a deposited microorganism, or a genetically modified microorganism.
[8] The production method according to any one of [1] to [7], further comprising a step (b) of extracting PHA from the culture obtained in the culture step (a).
[9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the PHA contains a 3-hydroxybutanoic acid monomer unit.
[10] The method according to [9], wherein the PHA is poly(3-hydroxybutanoic acid).
[11] A method for producing a bioplastic product, comprising the steps of: obtaining polyhydroxyalkanoic acid (PHA) by carrying out the method according to any one of [1] to [10]; and obtaining a plastic product containing the PHA obtained by the above step.
[12] Microorganism deposited under accession number NITE AP-03085.
[13] A bacterium of the genus Covetia having a 16S rRNA gene containing the following nucleotide sequence (a) or (b):
(a) The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1.
(b) A nucleotide sequence having 90% or more nucleotide sequence identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1.
本発明によれば、海藻を炭素源としてバイオプラスチックを製造する方法を提供することができる。 The present invention provides a method for producing bioplastics using seaweed as a carbon source.
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。 The following description of the present invention may be based on representative embodiments and specific examples, but the present invention is not limited to such embodiments. In this specification, a numerical range expressed using "~" means a range that includes the numerical values before and after "~" as the lower and upper limits.
＜PHAの製造方法＞
本発明の海藻を原料とするポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の製造方法は、海藻を含む培地でアルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を培養する工程（ａ）を含む。
本発明の製造方法を実施することにより、海藻を炭素源として、生分解性プラスチックであるPHAを製造することができる。本発明によれば、海藻を原料としてPHAを製造することができるので、地球環境に低負荷なバイオプラスチック製品を製造することができる。
<Production method of PHA>
The method of the present invention for producing polyhydroxyalkanoic acid (PHA) using seaweed as a raw material comprises a step (a) of culturing a microorganism capable of utilizing alginic acid and synthesizing PHA in a medium containing seaweed.
By carrying out the production method of the present invention, it is possible to produce PHA, a biodegradable plastic, using seaweed as a carbon source. According to the present invention, since PHA can be produced using seaweed as a raw material, it is possible to produce bioplastic products that have a low impact on the global environment.
（海藻を含む培地）
本発明の製造方法では、海藻を含む培地で、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を培養することにより、PHAを製造することができる。海藻、特に褐藻類はアルギン酸を含むため、上記微生物はアルギン酸からPHAを合成していると考えられる。アルギン酸は、褐藻類などに含まれる多糖類であり、２種類のウロン酸（β－Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とそのＣ－５エピマーであるα－Ｌ－グルロン酸（Ｇ））が直鎖状に重合したポリマーである。
(Culture medium containing seaweed)
In the production method of the present invention, PHA can be produced by culturing microorganisms capable of assimilating alginic acid and synthesizing PHA in a medium containing seaweed. Since seaweed, particularly brown algae, contains alginic acid, it is believed that the microorganisms synthesize PHA from alginic acid. Alginic acid is a polysaccharide contained in brown algae and is a linear polymer of two types of uronic acid (β-D-mannuronic acid (M) and its C-5 epimer, α-L-guluronic acid (G)).
本発明者らは、これまでに、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を利用して、アルギン酸からPHAが製造できることを見出している。本発明者らは、本願において、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を利用して、海藻を原料としてPHAが製造できることを見出した。すなわち、海藻そのものを原料としてPHAが製造できるので、海藻からアルギン酸を抽出する工程を省くことができる。さらに、海藻は、エネルギー資源の乏しい我が国において、豊富に存在するバイオマスであることから、将来的にPHAの原料供給を輸入に頼らなくてよい可能性もある。 The inventors have previously found that PHA can be produced from alginic acid using microorganisms capable of assimilating alginic acid and synthesizing PHA. In the present application, the inventors have found that PHA can be produced using seaweed as a raw material using microorganisms capable of assimilating alginic acid and synthesizing PHA. In other words, since PHA can be produced using seaweed itself as a raw material, the step of extracting alginic acid from seaweed can be omitted. Furthermore, since seaweed is an abundant biomass in Japan, which has few energy resources, it may become unnecessary to rely on imports for the supply of raw materials for PHA in the future.
海藻の中でアルギン酸（ＡＬ－）は、カルシウムイオンなどにより無機イオン塩となって閉じ込められている。海藻からのアルギン酸の抽出は、例えば、特開2017-210534に開示によれば、海藻に炭酸ナトリウムを加え加熱して、ナトリウムイオン（Ｎａ+）とカルシウムイオン（Ｃａ2+）をイオン交換させて、水溶性のアルギン酸ナトリウムとしてアルギン酸を抽出し、次にアルギン酸抽出液から炭酸カルシウムを除去し、炭酸カルシウム除去されたアルギン酸抽出液は、酸性にしてアルギン酸を沈殿させるか、またはカルシウムイオンを加えてアルギン酸カルシウムを沈殿させてろ過し、アルギン酸またはアルギン酸カルシウムとして得ることができる。
本発明によれば、海藻を原料としてPHAを製造することができるので、海藻類からアルギン酸を抽出することを前工程に含まなくてもよく、簡便な方法でPHAを製造することができる。
In seaweed, alginic acid (AL-) is trapped as an inorganic ion salt with calcium ions, etc. According to the disclosure of, for example, JP 2017-210534 A, alginic acid is extracted from seaweed by adding sodium carbonate to seaweed, heating the seaweed, exchanging sodium ions (Na + ) with calcium ions (Ca 2+ ), extracting alginic acid as water-soluble sodium alginate, removing calcium carbonate from the alginic acid extract, and acidifying the alginic acid extract from which calcium carbonate has been removed to precipitate alginic acid, or adding calcium ions to precipitate calcium alginate, followed by filtration, to obtain alginic acid or calcium alginate.
According to the present invention, PHA can be produced using seaweed as a raw material, so that it is not necessary to include a previous step of extracting alginic acid from seaweed, and PHA can be produced by a simple method.
また、酸および酵素による海藻加水分解物を原料として用いた、微生物（Cupriavidus necator）によるPHA合成が報告されている（非特許文献８）。非特許文献８は、具体的には、原料として、ホンダワラ属（Sargassum sp.）の海藻を0.15N H2SO4の存在下で121℃で30分加熱し、さらにセルラーゼおよびセロビアーゼで処理して得られた加水分解物を用いており、この加水分解物は還元糖、特にセルロースに由来すると考えられるグルコースを含む。一方、本発明のPHAの製造方法では、加水分解といった前処理をせずに、海藻をそのまま原料として用いることができるため、より簡単な方法でPHAを製造することができる。 In addition, PHA synthesis by a microorganism (Cupriavidus necator) using seaweed hydrolysate hydrolyzed with acid and enzyme as a raw material has been reported (Non-Patent Document 8). Specifically, Non-Patent Document 8 uses a hydrolysate obtained by heating seaweed of the genus Sargassum in the presence of 0.15NH2SO4 at 121°C for 30 minutes and further treating it with cellulase and cellobiase as a raw material, and this hydrolysate contains reducing sugars, especially glucose that is thought to be derived from cellulose. On the other hand, in the method for producing PHA of the present invention, seaweed can be used as it is as a raw material without pretreatment such as hydrolysis, so that PHA can be produced by a simpler method.
本発明の製造方法において、培地の海藻含有率は、海藻の種類や微生物の種類などにより適宜設定することができるが、例えば、乾燥重量で０．５質量％から２０質量％の範囲が好ましく、１質量％から１０質量％の範囲がより好ましく、１質量％から５質量％の範囲が特に好ましい。 In the manufacturing method of the present invention, the seaweed content of the medium can be appropriately set depending on the type of seaweed and the type of microorganism, but for example, it is preferably in the range of 0.5% to 20% by mass, more preferably 1% to 10% by mass, and particularly preferably 1% to 5% by mass, on a dry weight basis.
本発明の一実施態様において、培養開始前において、海藻を含む培地のpHは約3.0～9.0の範囲、約3.0～8.0の範囲、約3.0～7.0の範囲、約3.0～6.5の範囲、約4.0～6.5の範囲、約4.5～6.5の範囲または約4.0～6.5の範囲に調製することができる。 In one embodiment of the present invention, before the start of the culture, the pH of the medium containing the seaweed can be adjusted to a range of about 3.0 to 9.0, about 3.0 to 8.0, about 3.0 to 7.0, about 3.0 to 6.5, about 4.0 to 6.5, about 4.5 to 6.5, or about 4.0 to 6.5.
本発明のPHAの製造方法に用いることができる海藻類は、褐藻類、紅藻類、緑藻類等から選択される大型藻類であり、褐藻類が好ましい。褐藻類は、アルギン酸を豊富に含むためである。褐藻類としては、コンブ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、イソガワラ目、ナガマツモ目、カヤノモリ目、ウイキョウモ目、ムチモ目、クロガシラ目、アミジグサ目、ケヤリ目、ウルシグサ目、ウスバオオギ目に属する褐藻類を挙げることができるが、これらに限定されず、世界各地の海に生育する褐藻類を利用することができる。コンブ目（Laminariales）に属する褐藻類としては、コンブ科（Laminariaceae）のコンブ属（Laminaria）、トロロコンブ属（Kjellmaniella）、カジメ属（Ecklonia）、アラメ属（Eisenia）、アントクメ属（Eckloniopsis）、アナメ属（Agarum）、スジメ属（Costaria）、ネコアシコンブ属（Arthrothamnus）、オオウキモ属（Macrocystis）およびクロシオメ属（Hedophyllum）、チガイソ科（Alariaceae）のワカメ属（Undaria）およびアイヌワカメ属（Alaria）、ツルモ科（Chordaceae）のツルモ属（Chorda）、並びにレッソニア科（Lessoniaceae）のレッソニア属（Lessonia）等を挙げることができる。ヒバマタ目（Fucales）に属する褐藻類としては、ホンダワラ科（Sargassaceae）のホンダワラ属（Sargassum、ヒジキS.fusiformeを含む）、スギモク属（Coccophora）、ヤバネモク属（Cystoseira）、ジヨロモク属（Myagropsis）およびラッパモク属（Turbinaria）、並びにヒバマタ科（Fucaceae）のヒバマタ属（Fucus）およびエゾイシゲ属（Pelvetia）を挙げることができる。 Seaweeds that can be used in the method for producing PHA of the present invention are macroalgae selected from brown algae, red algae, green algae, etc., with brown algae being preferred. This is because brown algae are rich in alginic acid. Brown algae include brown algae belonging to the orders Laminariales, Fucales, Paleophytales, Polytrichum algae, Chlorostratales, Sclerotiales, Fennelales, Sclerotiales, Sclerotiales, Dictyotales, Sceliales, Ureales, and Parsleyales, but are not limited thereto. Brown algae that grow in the seas of the world can be used. Examples of brown algae belonging to the order Laminariales include the genera Laminaria, Kjellmaniella, Ecklonia, Eisenia, Eckloniopsis, Agarum, Costaria, Arthrothamnus, Macrocystis, and Hedophyllum from the family Laminariaceae, the genera Undaria and Alaria from the family Alariaceae, the genus Chorda from the family Chordaceae, and the genus Lessonia from the family Lessoniaceae. Examples of brown algae in the Fucales order include the genera Sargassum (including S. fusiforme), Coccophora, Cystoseira, Myagropsis, and Turbinaria in the Sargassaceae family, and the genera Fucus and Pelvetia in the Fucaceae family.
シオミドロ目（Estocarpales）に属する褐藻類としては、シオミドロ科（Estocarpaceae）のシオミドロ属（Ectocarpus）、イソブドウ属（Botrytella）、ギフオルディア属（Giffordia）、およびピラエラ属（Pilayella）等を挙げることができる。イソガワラ目（Ralfsiales）に属する褐藻類としては、イソガワラ科（Ralfsiaceae）のイソガワラ属（Ralfsia）等を挙げることができる。ナガマツモ目（Chordariales）に属する褐藻類としては、ナガマツモ科（Chordariaceae）のクロモ属（Papenfusiella）、フトモズク属（Tinocladia）、ニセモズク属（Acrothrix）、マツモ属（Analipus）、ナガマツモ属（Chordaria）、オキナワモズク属（Cladosiphon）、ニセフトモズク属（Eudesme）、イワヒゲ属（Myelophycus）、チャソウメン属（Saundersella）およびイシモズク属（Sphaerotrichia）等、ナミマクラ科（Elachistaceae）のナミマクラ属（Elachista）およびソメワケグサ属（Halothrix）、ネバリモ科（Leathesiaceae）のネバリモ属（Leathesia）およびシワノカワ属（Petrospongium）、モズク科（Nemacystaceae）のモズク属（Nemacystis）、並びにイシゲ科（Ishigeaceae）のイシゲ属（Ishige）を挙げることができる。カヤモノリ目（Scytosiphonales）に属する褐藻類としては、カヤモノリ科（Scytosiphonaceae）のフクロノリ属（Colpomenia）、セイヨウハバノリ属（Petalonia）、カヤモノリ属（Scytosiphon）、コンブモドキ属（Akkesiphycus）、エゾフクロ属（Coilodesme）、ハバノリ属（Endarachne）、カゴメノリ属（Hydroclathrus）およびキタイワヒゲ属（Melanosiphon）等、ムラチドリ科（Chnoosporaceae）のムラチドリ属（Chnoospora）、並びにハバモドキ科（Punctariaceae）のハバモドキ属（Punctaria）を挙げることができる。 Brown algae belonging to the order Estocarpales include the genera Ectocarpus, Botrytella, Giffordia, and Pilayella in the family Estocarpaceae. Brown algae belonging to the order Ralfsiales include the genus Ralfsia in the family Ralfsiaceae. Brown algae in the order Chordariales include the genera Papenfusiella, Tinocladia, Acrothrix, Analipus, Chordaria, Cladosiphon, Eudesme, Myelophycus, Saundersella, and Examples include the genera Sphaerotrichia, Elachista and Halothrix from the Elachistaceae family, Leathesia and Petrospongium from the Leathesiaceae family, Nemacystis from the Nemacystaceae family, and Ishige from the Ishigeaceae family. Examples of brown algae belonging to the Scytosiphonales order include the genera Colpomenia, Petalonia, Scytosiphon, Akkesiphycus, Coilodesme, Endarachne, Hydroclathrus, and Melanosiphon from the Scytosiphonaceae family, Chnoospora from the Chnoosporaceae family, and Punctaria from the Punctariaceae family.
ウイキョウモ目（Dictoysiphonales）に属する褐藻類としては、ウイキョウモ科（Dictyosiphonaceae）のウイキョウモ属（Dictyosiphon）を挙げることができる。ムチモ目（Cutleriales）に属する褐藻類としては、ムチモ科（Cutleriaceae）のムチモ属（Cutleria）等を挙げることができる。クロガシラ目（Sphacelariales）に属する褐藻類としては、クロガシラ科（sphacelariaceae）のクロガシラ属（Sphacelaria）等が挙げられる。アミジグサ目（Dictyotales）に属する褐藻類としては、アミジグサ科（Dictyotaceae）のヤハズグサ属（Dictyopteris）、アミジグサ属（Dictyota）、ニセアミジ属（Dilophus）、サナダグサ属（Pachydictyon）、ウミウチワ属（Padina）、コモングサ属（Spatoglossum）、フタエオウギ属（Distromium）、ヤレオウギ属（Homoeostrichus）、ハイオウギ属（Pockockiella）、ジガミグサ属（Stypopodium）およびシマオウギ属（Zonaria）等を挙げることができる。ケヤリモ目（Sporochnales）に属する褐藻類としては、ケヤリモ科（Sporochnaceae）のイチメガサ属（Carpomitra）およびケヤリモ属（Sporochnus）等を挙げることができる。ウルシグサ目（Desmarestiales）に属する褐藻類としては、ウルシグサ科（Desmarestiaceae）のウルシグサ属（Desmarestia）等を挙げることができる。ウスバオオギ目(Syringodermatales)のウスバオオギ科（Syringodermataceae）のウスバオオギ（Syringoderma）等を挙げることができる。 Brown algae belonging to the order Dictoysiphonales include the genus Dictyosiphon in the family Dictyosiphonaceae. Brown algae belonging to the order Cutleriales include the genus Cutleria in the family Cutleriaceae. Brown algae belonging to the order Sphacelariales include the genus Sphacelaria in the family Sphacelariaceae. Brown algae belonging to the order Dictyotales include the genera Dictyopteris, Dictyota, Dilophus, Pachydictyon, Padina, Spatoglossum, Distromium, Homoeostrichus, Pockockiella, Stypopodium, and Zonaria in the family Dictyotaceae. Brown algae belonging to the order Sporochnales include the genera Carpomitra and Sporochnus in the family Sporochnaceae. Brown algae belonging to the Desmarestiales order include the genus Desmarestia in the family Desmarestiaceae. Examples include Syringoderma in the family Syringodermataceae in the order Syringodermatales.
本発明の一実施態様において、PHAの製造方法に用いることができる海藻類は、コンブ（Laminaria sp.）、ワカメ（Undaria sp.）やオオウキモ（Macrocystis sp.）などコンブ目（Laminariales）や、ホンダワラ（Sargassum sp.）などヒバマタ目（Fucales）に属する褐藻類を挙げることができる。コンブやワカメといった褐藻類に属する海藻はアルギン酸を乾燥体重量当たり20-40%含むことが報告されている（Hiroyuki Takeda et al., Energy Environ. Sci., 4, 2575-2581, (2011)）。また、褐藻類に含まれるアルギン酸の含量は一年を通してほぼ一定である（T. Kimura et al., Nippon Suisan Gakkaishi, 73(4), 739-744, (2007)）。よって、褐藻類は非常に有望なバイオマスといえる。 In one embodiment of the present invention, seaweeds that can be used in the method for producing PHA include brown algae belonging to the order Laminariales, such as kelp (Laminaria sp.), wakame (Undaria sp.), and Macrocystis sp., and brown algae belonging to the order Fucales, such as Sargassum sp. It has been reported that brown algae such as kelp and wakame contain 20-40% alginic acid per dry weight (Hiroyuki Takeda et al., Energy Environ. Sci., 4, 2575-2581, (2011)). In addition, the content of alginic acid contained in brown algae is almost constant throughout the year (T. Kimura et al., Nippon Suisan Gakkaishi, 73(4), 739-744, (2007)). Therefore, brown algae can be said to be a very promising biomass.
海藻は、生のまま用いてもよいし、乾燥物（凍結乾燥物、天日乾燥物、自然乾燥物、送風乾燥物、除湿空気乾燥物、熱風乾燥物、遠赤外線乾燥物など）を用いてもよく、また、ゆでる、蒸すなどの加熱処理されたものを用いてもよい。培地を微生物、例えば後記のコベティア属細菌の生育に適した塩濃度やpH条件に維持するために、除塩処理した海藻を用いてもよい。海藻は、適当な大きさに分割または切断して、或いは乳鉢と乳棒、ミキサー、粉砕機などにより粉砕して培地に混合してもよい。本発明の一実施態様において、海藻は乳鉢と乳棒、ミキサー、粉砕機などにより粉砕して培地に添加し混合することができる。PHAの合成効率が向上すると考えられるためである。海藻は、１～３センチメートル四方程度、もしくは２～３ミリメートル四方程度の大きさに細断または粉砕して用いてもよいし、または０．５ミリメートル四方以下の大きさに細断または粉砕して用いてもよい。 The seaweed may be used raw or dried (freeze-dried, sun-dried, naturally dried, blown-dried, dehumidified air-dried, hot-air-dried, far-infrared-dried, etc.), or may be heat-treated by boiling, steaming, etc. In order to maintain the medium at a salt concentration and pH suitable for the growth of microorganisms, such as the Covetia bacteria described below, desalted seaweed may be used. The seaweed may be divided or cut into appropriate sizes, or crushed with a mortar and pestle, mixer, grinder, etc., and mixed into the medium. In one embodiment of the present invention, the seaweed may be crushed with a mortar and pestle, mixer, grinder, etc., and added to the medium and mixed. This is because it is believed that the synthesis efficiency of PHA is improved. The seaweed may be used after being chopped or crushed into a size of about 1 to 3 cm square or about 2 to 3 mm square, or chopped or crushed into a size of 0.5 mm square or less.
海藻を含む培地は、海藻を含むPHA合成用培地であり、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物が生育可能な任意の培地を用いることができ、例えば、上記の海藻のほかに、無機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素）を含むことができる。培地は、そのほかに、ミネラルや微量元素、例えばリン（P）、イオウ（S）、カリウム（K）、カルシウム（Ca）、マグネシウム（Mg）、鉄（Fe）、ナトリウム （Na）、コバルト（Co）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）、ニッケル（Ni）等の塩を含むことができる。ミネラルや微量元素を含む物質の具体例として、例えば、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化カルシウム、塩化コバルト、硫酸銅（ＩＩ）、塩化ニッケル（ＩＩ）、塩化クロム（ＩＩＩ）を挙げることができる。本発明の好ましい実施態様において、海藻を含むPHA合成用培地は、海藻を含む窒素制限培地または窒素制限無機塩培地である。 The medium containing seaweed is a medium for synthesizing PHA containing seaweed, and any medium capable of growing microorganisms having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA can be used. For example, in addition to the above seaweed, it can contain an inorganic nitrogen source (e.g., ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea). The medium can also contain minerals and trace elements, such as salts of phosphorus (P), sulfur (S), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg), iron (Fe), sodium (Na), cobalt (Co), copper (Cu), zinc (Zn), and nickel (Ni). Specific examples of substances containing minerals and trace elements include calcium chloride, magnesium sulfate, potassium nitrate, sodium chloride, iron (III) chloride, calcium chloride, cobalt chloride, copper (II) sulfate, nickel (II), and chromium (III) chloride. In a preferred embodiment of the present invention, the medium for synthesizing PHA containing seaweed is a nitrogen-limited medium or a nitrogen-limited inorganic salt medium containing seaweed.
（微生物）
本発明のPHAの製造方法は、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を用いて実施することができる。アルギン酸資化能は、アルギン酸を単一の炭素源として増殖できる性質である。PHA合成能は、PHAを生合成できる性質である。アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物は、アルギン酸を単一の炭素源としてPHAを合成する能力を有する微生物であるということができる。アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物は、アルギン酸の他に、アルギン酸分解物を資化し、PHA合成することができる微生物であってもよい。
(Microorganisms)
The method for producing PHA of the present invention can be carried out using a microorganism having alginic acid assimilation ability and PHA synthesis ability. Alginic acid assimilation ability is the property of being able to grow using alginic acid as the sole carbon source. PHA synthesis ability is the property of being able to biosynthesize PHA. It can be said that a microorganism having alginic acid assimilation ability and PHA synthesis ability is a microorganism having the ability to synthesize PHA using alginic acid as the sole carbon source. A microorganism having alginic acid assimilation ability and PHA synthesis ability may be a microorganism that can assimilate alginic acid decomposition products in addition to alginic acid and synthesize PHA.
微生物がアルギン酸資化能を有するかどうかは、アルギン酸を単一の炭素源として含む培地で培養して、微生物が増殖するかどうかにより判断することができる。例えば、試験微生物を、唯一の炭素源として濃度１質量％のアルギン酸ナトリウムを含む培地において、試験微生物の増殖に適した条件（温度、pH、酸素、ナトリウム塩濃度等）下で培養して、試験微生物が増殖した場合には、試験微生物はアルギン酸資化能を有すると判断することができる。試験微生物の増殖は、濁度法、平板培養法、および乾燥菌体重量法などにより測定することができる。 Whether a microorganism has the ability to utilize alginic acid can be determined by culturing it in a medium containing alginic acid as the sole carbon source and determining whether the microorganism grows. For example, a test microorganism is cultured in a medium containing 1% sodium alginate as the sole carbon source under conditions suitable for the growth of the test microorganism (temperature, pH, oxygen, sodium salt concentration, etc.). If the test microorganism grows, it can be determined that the test microorganism has the ability to utilize alginic acid. The growth of the test microorganism can be measured by the turbidity method, plate culture method, dry cell weight method, etc.
微生物がPHA合成能を有するかどうかは、窒素やリンが制限された培地で培養して、PHAを合成するかどうかにより判断することができる。例えば、試験微生物を、単一炭素源として濃度１～2％のグルコースを含む、窒素源が制限された無機塩培地において、試験微生物の増殖に適した条件下で培養して、試験微生物が体内にPHAを蓄積した場合には、試験微生物はPHA合成能を有すると判断することができる。PHAの蓄積は、Nile RedやNile Blue A染色法で確認することができるほか、透過型顕微鏡による細胞内におけるPHA顆粒の観察、乾燥菌体から得られたクロロホルム抽出物の1H-NMR分析、エタノリシス処理したクロロホルム抽出物のガスクロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）などにより判断することができる。また、蓄積されたPHAがPHBである場合には、硫酸によるクロトン酸変換処理をしてから高速液体クロマトグラフィーで分析して、PHBの蓄積を判断することができる。 Whether a microorganism has the ability to synthesize PHA can be determined by culturing it in a nitrogen- or phosphorus-limited medium and determining whether it synthesizes PHA. For example, if a test microorganism is cultured in a nitrogen-limited inorganic salt medium containing 1-2% glucose as the sole carbon source under conditions suitable for the growth of the test microorganism and the test microorganism accumulates PHA in its body, the test microorganism can be determined to have the ability to synthesize PHA. The accumulation of PHA can be confirmed by Nile Red or Nile Blue A staining method, and can also be determined by observing PHA granules in cells using a transmission microscope, 1H -NMR analysis of chloroform extracts obtained from dried cells, gas chromatography or gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) of chloroform extracts treated with ethanolysis, etc. If the accumulated PHA is PHB, the accumulation of PHB can be determined by converting it to crotonic acid using sulfuric acid and then analyzing it using high performance liquid chromatography.
上記アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物は、例えばプロテオバクテリア門（Proteobacteria）に属する海洋細菌であってもよく、例えばハロモナス科（Halomonadaceae）に属する細菌であってもよい。プロテオバクテリア門に属する細菌は、グラム陰性細菌である。海洋細菌とは、海洋に生息する細菌であり、海水中でよく生育することができる。 The microorganisms having the above-mentioned ability to utilize alginic acid and synthesize PHA may be, for example, marine bacteria belonging to the phylum Proteobacteria, for example, bacteria belonging to the family Halomonadaceae. Bacteria belonging to the phylum Proteobacteria are gram-negative bacteria. Marine bacteria are bacteria that live in the ocean and can grow well in seawater.
上記アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物は、コベティア属（Cobetia）に属する細菌であってもよい。コベティア属に属する細菌としては、コベティア・マリナ（Cobetia marina）、コベティア・パシフィカ（Cobetia pacifica）、コベティア・アムフィレクティ（Cobetia amphilecti）、およびコベティア・リトラリス（Cobetia litoralis）並びにコベティア属に属することが16S rDNA配列から推測される未記載種などを挙げることができる。本発明では、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物は、コベティア属から選択することができ、コベティア・マリナ（Cobetia marina）およびその近縁種（未記載の種を含む）から選択することが好ましく、後記の実施例に記載する5-25-4-2株細菌、5-11-6-3株細菌および5-28-6-1株細菌が属する種から選択することがより好ましく、5-25-4-2株細菌、5-11-6-3株細菌および5-28-6-1株細菌を使用することが特に好ましい。なお、コベティア・マリナは、過去にアルスロバクター・マリヌス（Arthrobacter marinus）、シュードモナス・マリナ（Pseudomonas marina）、ダリア・マリナ（Dalya marina）、ハロモナス・マリナ（Halomonas marina）と分類されていた(Arahal DR, et al., (December 2002) Systematic and Applied Microbiology. 25 (2): 207-11)。 The microorganism having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA may be a bacterium belonging to the genus Cobetia. Examples of the bacterium belonging to the genus Cobetia include Cobetia marina, Cobetia pacifica, Cobetia amphilecti, and Cobetia litoralis, as well as undescribed species that are inferred to belong to the genus Cobetia from the 16S rDNA sequence. In the present invention, the microorganism having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA can be selected from the genus Cobetia, preferably from Cobetia marina and its closely related species (including undescribed species), more preferably from species including 5-25-4-2, 5-11-6-3, and 5-28-6-1 strains described in the Examples below, and it is particularly preferable to use 5-25-4-2, 5-11-6-3, and 5-28-6-1 strains. Kobetia marina was previously classified as Arthrobacter marinus, Pseudomonas marina, Dalya marina, and Halomonas marina (Arahal DR, et al., (December 2002) Systematic and Applied Microbiology. 25 (2): 207-11).
本発明の一実施態様では、上記アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物が、下記１）～３）から選択されるいずれかであってもよい。
１）受託番号NITE P-03085（受領番号NITE AP-03085）として寄託された微生物。
２）受託番号NITE P-02758またはNITE P-02759として寄託された微生物。
３）下記(ａ)または(ｂ)の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有する、微生物。
(ａ) 配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列。
(ｂ) 配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列に対して90%以上の塩基配列同一性を 有する塩基配列。
In one embodiment of the present invention, the above-mentioned microorganism having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA may be any one selected from the following 1) to 3).
1) The microorganism deposited under accession number NITE P-03085 ( accession number NITE AP-03085 ) .
2) Microorganisms deposited under accession numbers NITE P-02758 or NITE P-02759.
3) A microorganism having a 16S rRNA gene containing the following nucleotide sequence (a) or (b):
(a) a nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
(b) A nucleotide sequence having 90% or more nucleotide sequence identity to any of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3.
上記微生物は、配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列に対して90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有し、且つアルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物であることができる。更には、上記微生物は、配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列に対して90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有し、且つアルギン酸資化能およびPHA合成能を有する、コベティア属に属する微生物であることができる。また、配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有し、且つアルギン酸資化能およびPHA合成能を有する、コベティア属に属する微生物であることができる。 The above microorganism may be a microorganism having a 16S rRNA gene containing a base sequence having 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of base sequence identity to the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA. Furthermore, the above microorganism may be a microorganism belonging to the genus Covetia, having a 16S rRNA gene containing a base sequence having 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of base sequence identity to the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA. The microorganism may also be a microorganism belonging to the genus Covetia, which has a 16S rRNA gene containing a base sequence in which one or several bases have been substituted, inserted, deleted and/or added in the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and has the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA.
塩基配列は、常法により解析することができる。例えば、微生物のDNAから16S rRNA遺伝子を増幅させる方法としては、プライマーを用いるPCR法等が挙げられるがこれに限定されない。PCR法により得られた増幅産物を、DNAシークエンサー等に供し、塩基配列を解析することができる。 The base sequence can be analyzed by standard methods. For example, a method for amplifying the 16S rRNA gene from the DNA of a microorganism includes, but is not limited to, the PCR method using primers. The amplified product obtained by the PCR method can be subjected to a DNA sequencer or the like to analyze the base sequence.
塩基配列同一性は、比較する２本の塩基配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本の塩基配列間で同一である塩基のパーセントとして定義される。塩基配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＸまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。 Sequence identity is defined as the percentage of bases that are identical between two sequences after aligning the two sequences and introducing gaps, if necessary, to obtain the maximum percent sequence identity. Sequence identity can be determined, for example, by using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalX, or Megalign (DNASTAR) software.
本明細書で言う「１もしくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列」における「１もしく数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。 In the present specification, the range of "one or several" in the "base sequence in which one or several bases have been substituted, inserted, deleted and/or added" is not particularly limited, but means, for example, about 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, even more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
上記微生物が、単離微生物、寄託微生物、遺伝子改変微生物であってもよい。また、上記コベティア属細菌が、単離菌株、寄託菌株、遺伝子改変遺伝子改変菌株であってもよい。単離微生物または単離菌株は、自然サンプルから分離された微生物または菌株である。自然サンプルの例として、海水、海中生物、海藻、汽水域の水、汽水域の生物、岩、土および砂を挙げることができる。自然サンプルを、任意の培地、例えばZoBell 2216E海水培地、MS培地、ダイゴIMK培地などで、10℃～42℃で、24～72時間、pH5～10の条件で培養し、コロニーを分離することができる。ZoBell 2216E海水培地やMS培地などを用いる培養の前に、ろ過海水中で予備培養することができる。単離したコロニーを、アルギン酸含有培地で培養し、アルギン酸含有培地で増殖性を示し、PHA合成していると判断されたコロニーを選択することができる。Nile Redは疎水性色素であり、生体内の中性脂質やPHAなどの疎水性物質と反応し赤く呈色するので、PHA合成能を有する微生物のスクリーニングに使用することができる。 The microorganism may be an isolated microorganism, a deposited microorganism, or a genetically modified microorganism. The Covetia bacteria may be an isolated strain, a deposited strain, or a genetically modified strain. The isolated microorganism or isolated strain is a microorganism or strain isolated from a natural sample. Examples of natural samples include seawater, marine organisms, seaweed, brackish water, brackish organisms, rocks, soil, and sand. The natural sample can be cultured in any medium, such as ZoBell 2216E seawater medium, MS medium, Daigo IMK medium, etc., at 10°C to 42°C for 24 to 72 hours at a pH of 5 to 10, and a colony can be isolated. Before culturing using ZoBell 2216E seawater medium, MS medium, etc., the colony can be pre-cultured in filtered seawater. The isolated colony can be cultured in an alginic acid-containing medium, and a colony that shows growth in the alginic acid-containing medium and is judged to be synthesizing PHA can be selected. Nile Red is a hydrophobic dye that turns red when it reacts with hydrophobic substances such as neutral lipids and PHA in the body, so it can be used to screen for microorganisms capable of synthesizing PHA.
さらに、PHA合成について、PHAを微生物乾燥菌体からクロロホルムなどの有機溶媒で抽出し、メタノールやヘキサン等の有機溶媒を加えてPHAを析出させ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、NMR、IRなどの分析手法を用いて、スクリーニングすることができる。さらに、場合により、単離されたコロニーの菌株について、16S rDNA配列または菌学的性質をもとに、同定をすることができる。 Furthermore, for PHA synthesis, PHA can be extracted from dried microbial cells with an organic solvent such as chloroform, and then PHA can be precipitated by adding an organic solvent such as methanol or hexane, and then screened using analytical techniques such as gas chromatography, liquid chromatography, NMR, and IR. In some cases, the strains of isolated colonies can be identified based on the 16S rDNA sequence or bacteriological properties.
寄託微生物または寄託菌株は、微生物の寄託物について、単離微生物について記載したものと同様の手法を用いて、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を選抜することによって得ることができる。例えば、ハロモナス科に属する海洋細菌の寄託物について、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を選抜することができる。更には、コベティア属に属する微生物の寄託物について、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物を選抜することができる。
遺伝子改変微生物または遺伝子改変菌株は、例えばアルギン酸分解酵素遺伝子、PHA合成酵素遺伝子および／またはそれらに関連する遺伝子が改変された微生物または菌株であることができる。
The deposited microorganisms or strains can be obtained by selecting microorganisms capable of alginic acid assimilation and PHA synthesis using the same techniques as those described for isolated microorganisms. For example, microorganisms capable of alginic acid assimilation and PHA synthesis can be selected from the deposited marine bacteria belonging to the family Halomonadaceae. Furthermore, microorganisms capable of alginic acid assimilation and PHA synthesis can be selected from the deposited microorganisms belonging to the genus Covetia.
The genetically modified microorganism or strain can be, for example, a microorganism or strain in which the alginate decomposition enzyme gene, the PHA synthase gene and/or genes related thereto have been modified.
（PHA）
本発明により製造方法が提供されるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）は、ある種の微生物が体内に蓄積することが知られているポリエステルであり、以下の化学式：
PHAの具体例には、以下の化学式：
Polyhydroxyalkanoic acid (PHA), the production method of which is provided by the present invention, is a polyester known to accumulate in the bodies of certain microorganisms and has the following chemical formula:
Specific examples of PHAs include those having the following formula:
PHAのうちP(3HB)の生合成経路は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）においてよく研究されており、2分子のアセチルCoAがβ-ケトチオラーゼ（PhaA）によってアセトアセチルCoAに縮合され、NADPH-依存性アセトアセチルCoAレダクターゼ（PhaB）によって(R)-3-ヒドロキシブチリルCoAに還元されたのち、PHAシンターゼ（PhaC）によって重合されることが報告されている（図6）（山田美和ら, オレオサイエンス, 5 (11), 523-532 (2005); K. Sudesh et al., Prog. Polym. Sci. 25 (2000) 1503-1555）。また炭素数が6-14の中鎖長の3HA生合成はシュードモナス（Pseudomonas）属細菌やエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）において研究されており、脂肪酸のβ酸化と生合成経路が関わっていることが報告されている（図6）（松崎弘美ら，日本油化学会誌, 48(12), 1353-1363, 1999; T. Fukui et al., J. Bacteriol, 180(3), 667-673, 1998; T. Fukui et al., J. Bacteriol, 179(15), 4821-4830, 1997）。 The biosynthetic pathway of PHA, P(3HB), has been well studied in Ralstonia eutropha, and it has been reported that two molecules of acetyl-CoA are condensed to acetoacetyl-CoA by β-ketothiolase (PhaA), which is reduced to (R)-3-hydroxybutyryl-CoA by NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase (PhaB), and then polymerized by PHA synthase (PhaC) (Figure 6) (Yamada, Miwa et al., Oleoscience, 5 (11), 523-532 (2005); K. Sudesh et al., Prog. Polym. Sci. 25 (2000) 1503-1555). In addition, the biosynthesis of 3HA with a medium chain length of 6-14 carbon atoms has been studied in Pseudomonas bacteria and Aeromonas caviae, and it has been reported that the β-oxidation of fatty acids and the biosynthetic pathway are involved (Figure 6) (Hiromi Matsuzaki et al., Journal of the Japanese Oil Chemists' Society, 48(12), 1353-1363, 1999; T. Fukui et al., J. Bacteriol, 180(3), 667-673, 1998; T. Fukui et al., J. Bacteriol, 179(15), 4821-4830, 1997).
本発明により製造方法が提供されるPHAは、２０万～２００万の分子量を有することができる。本発明により製造方法が提供されるPHAは、3-ヒドロキシブタン酸モノマー単位を含むものであることができる。3-ヒドロキシブタン酸モノマー単位を含むものとしては、例えば、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキプロピオン酸）[P(3HB-co-3HP)]、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシ吉草酸）[P(3HB-co-3HV)]、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸-co-3-ヒドロキシカプロン酸）[P(3HB-co-3HHx)]、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸-co-4-ヒドロキシブタン酸）[P(3HB-co-4HB)]、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸-co-乳酸）[P(3HB-co-LA)]、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸-co-グリコール酸）[P(3HB-co-GL)]などを挙げることができる。
本発明により製造方法が提供されるPHAは、ポリ（3-ヒドロキシブタン酸）であることができる。
The PHA for which the production method of the present invention provides can have a molecular weight of 200,000 to 2,000,000. The PHA for which the production method of the present invention provides can be one that contains a 3-hydroxybutanoic acid monomer unit. Examples of PHAs containing a 3-hydroxybutanoic acid monomer unit include poly(3-hydroxybutanoic acid-co-3-hydroxypropionic acid) [P(3HB-co-3HP)], poly(3-hydroxybutanoic acid-co-3-hydroxyvaleric acid) [P(3HB-co-3HV)], poly(3-hydroxybutanoic acid-co-3-hydroxycaproic acid) [P(3HB-co-3HHx)], poly(3-hydroxybutanoic acid-co-4-hydroxybutanoic acid) [P(3HB-co-4HB)], poly(3-hydroxybutanoic acid-co-lactic acid) [P(3HB-co-LA)], and poly(3-hydroxybutanoic acid-co-glycolic acid) [P(3HB-co-GL)].
The PHA for which the present invention provides a method for producing the same can be poly(3-hydroxybutanoic acid).
（培養条件）
本発明の製造方法においてPHA生合成のための培養は、温度：約２０℃～４０℃の範囲、ｐＨ：約３～９の範囲で行うことができる。培養温度およびｐＨは、培養する微生物に合わせて、適宜調整することができる。例えば、上記微生物のうち、受託番号NITE P-03085（受領番号NITE AP-03085）、受託番号NITE P-02758およびNITE P-02759として寄託されたコベティア属細菌は酸性条件下で、スクリーニングにより単離された微生物であるので、これらを使用するPHA合成のための培養は、酸性の培地で実施することができる。
(Culture conditions)
In the production method of the present invention, the culture for PHA biosynthesis can be carried out at a temperature in the range of about 20°C to 40°C and a pH in the range of about 3 to 9. The culture temperature and pH can be appropriately adjusted according to the microorganism to be cultured. For example, among the above-mentioned microorganisms, the Covetia bacteria deposited under Accession No. NITE P-03085 ( Accession No. NITE AP-03085 ) , Accession No. NITE P-02758, and NITE P-02759 are microorganisms isolated by screening under acidic conditions, and therefore, the culture for PHA synthesis using these can be carried out in an acidic medium.
アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する微生物として、海洋細菌を利用する場合、塩化ナトリウムの培地中濃度は、海洋細菌の種類などにより適宜設定することができるが、０．５質量％～２０質量％の範囲に調製することが好ましく、１質量％～１０質量％の範囲に調整することがより好ましく、１質量％～８質量％の範囲に調整することが特に好ましい。 When marine bacteria are used as microorganisms capable of alginate utilization and PHA synthesis, the concentration of sodium chloride in the medium can be set appropriately depending on the type of marine bacteria, etc., but it is preferable to adjust it to a range of 0.5% to 20% by mass, more preferably to a range of 1% to 10% by mass, and particularly preferably to a range of 1% to 8% by mass.
本発明の製造方法においてPHA合成のための培養は、好気的条件で行い、通気撹拌型培養槽や気泡塔型培養槽などを使用することができる。培養槽のサイズは、例えば、１５０ミリリットル以上とすることができる。また、工業的規模で培養を実施する場合には、培養槽のサイズは、例えば３０リットル以上、５０リットル以上、１００リットル以上とすることができる。連続的にまたは間欠的に炭素源や他の栄養源を供給しながら培養を行うことができる。培地中の炭素源濃度は、約０．５質量％～約５．０質量％の範囲に設定することができる。撹拌速度は、例えば１００～１２０ｒｐｍとすることができる。培養日数は、１日～７日の範囲に設定することができるが、これに限定されない。温度、ｐＨ、海藻含有量、通気量、撹拌速度、培養時間などの条件を制御しながら、培養を行うことができる。 In the production method of the present invention, the culture for PHA synthesis is carried out under aerobic conditions, and an aeration stirring type culture tank or a bubble column type culture tank can be used. The size of the culture tank can be, for example, 150 milliliters or more. When culturing is carried out on an industrial scale, the size of the culture tank can be, for example, 30 liters or more, 50 liters or more, or 100 liters or more. The culture can be carried out while continuously or intermittently supplying a carbon source or other nutrient sources. The carbon source concentration in the medium can be set in the range of about 0.5% by mass to about 5.0% by mass. The stirring speed can be, for example, 100 to 120 rpm. The number of days for culture can be set in the range of 1 to 7 days, but is not limited thereto. The culture can be carried out while controlling conditions such as temperature, pH, seaweed content, aeration amount, stirring speed, and culture time.
培地に接種する菌体は、予め種培養または前培養しておいてもよい。種培養または前培養に用いられる培地には、アルギン酸を添加してもよい。その他、無機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素）、ミネラルや微量元素、例えばリン（P）、イオウ（S）、カリウム（K）、カルシウム（Ca）、マグネシウム（Mg）、鉄（Fe）、ナトリウム（Na）、コバルト（Co）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）、ニッケル（Ni）等の塩を含むことができる。ミネラルや微量元素を含む物質の具体例として、例えば、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化カルシウム、塩化コバルト、硫酸銅（ＩＩ）、塩化ニッケル（ＩＩ）、塩化クロム（ＩＩＩ）を含むことができる。 The fungus cells to be inoculated into the medium may be previously seed cultured or pre-cultured. The medium used for seed culture or pre-culture may contain alginic acid. In addition, inorganic nitrogen sources (e.g., ammonium sulfate, ammonium nitrate, urea), minerals and trace elements, such as salts of phosphorus (P), sulfur (S), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg), iron (Fe), sodium (Na), cobalt (Co), copper (Cu), zinc (Zn), nickel (Ni), etc., may be contained. Specific examples of substances containing minerals and trace elements include calcium chloride, magnesium sulfate, potassium nitrate, sodium chloride, iron (III) chloride, calcium chloride, cobalt chloride, copper (II) sulfate, nickel (II) chloride, and chromium (III) chloride.
（PHA回収）
微生物菌体内に蓄積されたPHAは、公知の方法によって回収することができる（例えば、特許文献３）。例えば、培養物から遠心分離機等の分離手段を用いて菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノール、ヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収することができる。本発明では、培地は海藻を含有するので、菌体の遠心分離の前に、任意のろ過手段を用いて、培地から海藻を除去してもよい。
(PHA recovery)
The PHA accumulated in the microbial cells can be collected by known methods (for example, Patent Document 3). For example, the cells are separated from the culture using a separation means such as a centrifuge, and the cells are washed with distilled water, methanol, etc., and dried. PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform. Cell components are removed from the organic solvent solution containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate PHA. Furthermore, the supernatant is removed by filtration or centrifugation, and the PHA can be collected by drying. In the present invention, since the medium contains seaweed, any filtration means may be used to remove the seaweed from the medium before centrifugation of the cells.
本発明は、上記の製造方法を実施してポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を得る工程、および前の工程で得られたPHAを含むプラスチック製品を得る工程を含む、バイオプラスチック製品の製造方法を提供する。PHAは生分解性プラスチックであり、これを用いてバイオプラスチック製品を製造すれば、近年海洋汚染の原因として懸念されるマイクロプラスチックの環境残留問題を解決できると期待される。 The present invention provides a method for producing a bioplastic product, which includes the steps of obtaining polyhydroxyalkanoic acid (PHA) by carrying out the above-mentioned production method, and obtaining a plastic product containing the PHA obtained in the previous step. PHA is a biodegradable plastic, and it is expected that the use of PHA to produce a bioplastic product will resolve the problem of microplastics remaining in the environment, which has become a concern in recent years as a cause of marine pollution.
本発明の一実施態様では、PHAを25質量％以上含むプラスチック製品を製造することができる。日本バイオプラスチック協会は、バイオマスプラ識別表示基準に適合する製品の条件として、バイオプラスチック度が25重量%以上の製品であることを挙げている。バイオプラスチック度は、バイオマスプラスチック製品中のバイオマスプラスチックの成分質量の全質量に対する割合である。 In one embodiment of the present invention, a plastic product containing 25% by weight or more of PHA can be produced. The Japan Bioplastics Association lists a bioplastic content of 25% by weight or more as a condition for a product to comply with the Biomass Plastic Identification and Labeling Standards. The bioplastic content is the ratio of the mass of the biomass plastic component in a biomass plastic product to the total mass.
本発明の製造方法により製造されたPHAは、各種プラスチック製品の原料として用いることができる。PHAを含むプラスチック製品の例としては、冷凍品用包装、緩衝材などとして利用できるフィルムやシート、ボールペンなどの文房具、ストロー、フォーク、スプーンや皿などの使い捨て食器、土木・建築用資材、農業水産用資材としての多目的フィルム、苗ポット、釣り糸、漁網などを挙げることができる。 The PHA produced by the production method of the present invention can be used as a raw material for various plastic products. Examples of plastic products containing PHA include films and sheets that can be used as packaging for frozen foods and cushioning materials, stationery such as ballpoint pens, disposable tableware such as straws, forks, spoons and plates, civil engineering and construction materials, multipurpose films for agricultural and fishery materials, seedling pots, fishing lines, fishing nets, etc.
（コベティア属細菌）
本発明者らは、岩手県大船渡市、大船渡湾の碁石海岸で採取した自然サンプルから微生物5-25-4-2株、5-11-6-3株および5-28-6-1株を単離した。微生物5-25-4-2株、5-11-6-3株および5-28-6-1株は、それぞれ順に配列番号１、２および３に記載の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有する。16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づく、相同性検索プログラムBLAST（Altschul S. F. et al., 1990 Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. Vol. 215, pp. 403-410）を用いたシークエンスデータベースの解析により、3株はコベティア属に属する可能性が示唆されている。
(Covetia bacteria)
The present inventors isolated the microorganisms 5-25-4-2, 5-11-6-3 and 5-28-6-1 from natural samples collected at Goishi Beach in Ofunato Bay, Ofunato City, Iwate Prefecture. The microorganisms 5-25-4-2, 5-11-6-3 and 5-28-6-1 have 16S rRNA genes containing the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively. Analysis of a sequence database using the homology search program BLAST (Altschul SF et al., 1990 Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. Vol. 215, pp. 403-410) based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene suggests that the three strains may belong to the genus Covetia.
コベティア属細菌は、好気性を有し、温度4～42℃、pH4～11で生育すると報告されている（Romanenko LA et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63, 288-297, (2013)。また、グルコースを炭素源として細胞内にP(3HB)を蓄積することが報告されているが（Romanenko LA et al. 2013; Arahal DR et al., Appl. Microbiol. 25, 207-211, 2002）、海藻を炭素源とするPHA蓄積の報告は、本出願以前には無かった。 Covetia bacteria are aerobic and have been reported to grow at temperatures between 4 and 42°C and pH between 4 and 11 (Romanenko LA et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63, 288-297, (2013)). They have also been reported to accumulate P(3HB) intracellularly using glucose as a carbon source (Romanenko LA et al. 2013; Arahal DR et al., Appl. Microbiol. 25, 207-211, 2002), but there have been no reports of PHA accumulation using seaweed as a carbon source prior to this application.
5-25-4-2株についてコベティア・マリナ（Cobetia marina）の基準株であるDSM4741株（Arahal DR et al, 2002、上掲）と表現性状を比較した結果、生育可能なNaCl濃度について、コベティア・マリナはNaCl濃度0%の培地で生育できるのに対して、5-25-4-2株細菌はNaCl濃度0%の培地では生育できないこと、L-アラビノースやD-マンノースの資化性が異なること（実施例２の表21）から、5-25-4-2株はコベティア属細菌であり、コベティア・マリナとは近縁であるものの、異なる種である可能性がある。 The phenotypic characteristics of the 5-25-4-2 strain were compared with those of the DSM4741 strain (Arahal DR et al., 2002, supra), which is the type strain of Cobetia marina. As a result, it was found that while Cobetia marina can grow in a medium with a NaCl concentration of 0%, the 5-25-4-2 strain cannot grow in a medium with a NaCl concentration of 0%. In addition, the assimilation of L-arabinose and D-mannose is different (Table 21 in Example 2). Therefore, the 5-25-4-2 strain is a Cobetia bacterium, and although it is closely related to Cobetia marina, it may be a different species.
本発明は、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有する、コベティア属細菌を提供する。
本発明は、下記(ａ)または(ｂ)の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有する、コベティア属細菌を提供する。
(ａ) 配列番号１に記載の塩基配列、
(ｂ) 配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の塩基配列同一性を有する塩基配列。
The present invention provides a bacterium of the genus Covetia having the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA.
The present invention provides a Covetia bacterium having a 16S rRNA gene comprising the following base sequence (a) or (b):
(a) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1;
(b) A nucleotide sequence having 90% or more nucleotide sequence identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1.
本発明は、下記(ａ)または(ｂ)の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有し、且つアルギン酸資化能およびPHA合成能を有する、コベティア属細菌を提供する。
(ａ) 配列番号１に記載の塩基配列、
(ｂ) 配列番号１に記載の塩基配列に対して９０％以上の塩基配列同一性を有する塩基配列。
The present invention provides a bacterium of the genus Covetia having a 16S rRNA gene containing the following base sequence (a) or (b) and having the ability to utilize alginate and synthesize PHA:
(a) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1;
(b) A nucleotide sequence having 90% or more nucleotide sequence identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1.
塩基配列および塩基配列同一性については、上述の方法により、解析することができる。また、細菌がアルギン酸資化能および／またはPHA合成能を有するかどうかについては、上述の方法により、判断することができる。
本発明のコベティア属細菌は、アルギン酸資化能およびPHA合成能を有するため、海藻類を原料とするバイオプラスチックの製造方法に利用することができる。
The nucleotide sequence and nucleotide sequence identity can be analyzed by the methods described above. Whether or not the bacterium has the ability to utilize alginic acid and/or synthesize PHA can be determined by the methods described above.
The Covetia bacterium of the present invention has the ability to utilize alginic acid and synthesize PHA, and therefore can be used in a method for producing bioplastics using seaweed as a raw material.
（P(3HB)蓄積率）
海藻を含む培地でコベティア属細菌を培養することにより、コベティア属細菌（例えば5-25-4-2株、5-11-6-3株および5-28-6-1株）は効率よくP(3HB)を合成し蓄積することができる。P(3HB)蓄積率は、例えば、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）法で、P(3HB)量を3HBエチルを標準物質として用いた検量線から求め、更にP(3HB)量を乾燥菌体重量で割ることにより算出することができる。本発明の一実施態様において、海藻を含む培地でコベティア属細菌を培養することにより、コベティア属細菌（例えば5-25-4-2株、5-11-6-3株および5-28-6-1株）は、5質量%、10質量%、15質量%、20質量%、25質量%、30質量%、35質量%、40質量%、45質量%、50質量%以上のP(3HB)蓄積率で、P(3HB)を合成し蓄積することができる。
(P(3HB) accumulation rate)
By culturing Covetia bacteria in a medium containing seaweed, Covetia bacteria (e.g., 5-25-4-2, 5-11-6-3, and 5-28-6-1 strains) can efficiently synthesize and accumulate P(3HB). The P(3HB) accumulation rate can be calculated, for example, by determining the amount of P(3HB) from a calibration curve using 3HB ethyl as a standard substance using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and then dividing the amount of P(3HB) by the dry cell weight. In one embodiment of the present invention, by culturing Covetia bacteria in a medium containing seaweed, Covetia bacteria (e.g., strains 5-25-4-2, 5-11-6-3, and 5-28-6-1) can synthesize and accumulate P(3HB) at a P(3HB) accumulation rate of 5% by mass, 10% by mass, 15% by mass, 20% by mass, 25% by mass, 30% by mass, 35% by mass, 40% by mass, 45% by mass, or 50% by mass or more.
後記の実施例において、乾燥コンブを5質量%添加した培地でコベティア属5-11-6-3株細菌を24時間培養した場合に、P(3HB)蓄積率が48％であることが示されている。濃度3%のアルギン酸ナトリウムを含む培地では、コベティア属5-11-6-3株細菌を24時間培養した場合のP(3HB)蓄積率が約46％であった（特願2019-142249）。すなわち、海藻を原料としても、アルギン酸ナトリウムを用いた場合と同等以上の効率で、コベティア属細菌によりP(3HB)が合成され蓄積されることが明らかとなった。 In the examples described below, it has been shown that when Covetia genus strain 5-11-6-3 bacteria was cultured for 24 hours in a medium containing 5% by mass of dried kelp, the P(3HB) accumulation rate was 48%. In a medium containing a 3% concentration of sodium alginate, the P(3HB) accumulation rate when Covetia genus strain 5-11-6-3 bacteria was cultured for 24 hours was approximately 46% (Patent Application No. 2019-142249). In other words, it has been revealed that even when seaweed is used as a raw material, Covetia genus bacteria synthesize and accumulate P(3HB) with efficiency equal to or greater than that when sodium alginate is used.
（微生物寄託）
5-25-4-2菌株は、国立大学法人岩手大学（住所：岩手県盛岡市上田三丁目１８番８号）により、以下のとおり、寄託機関へ寄託申請を行った。5-25-4-2菌株の16S rRNA遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列をする。
(i) 受領機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NITE-NPMD) （住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122室）
(ii) 受領日：2019年11月29日
(iii) 受託番号NITE P-03085（受領番号NITE AP-03085）（Cobetia sp. IU190790JP01(5-25-4-2)株）
(Microorganism Deposit)
The 5-25-4-2 strain was applied for deposit with the depository institution by Iwate University (Address: 3-18-8 Ueda, Morioka City, Iwate Prefecture) as follows. The 16S rRNA gene of the 5-25-4-2 strain has the base sequence shown in SEQ ID NO:1.
(i) Recipient: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Deposit Center (NITE-NPMD) (Address: Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu, Chiba, Japan)
(ii) Date of receipt: November 29, 2019
(iii) Accession No. NITE P-03085 ( Accession No. NITE AP-03085 ) (Cobetia sp. IU190790JP01(5-25-4-2) strain)
5-11-6-3菌株は、国立大学法人岩手大学（住所：岩手県盛岡市上田三丁目１８番８号）により、以下のとおり、寄託機関へ寄託されている。5-11-6-3菌株の16S rRNA遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列をする。
(i)寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NITE-NPMD)
（住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122室）
(ii) 受託日（寄託日）：2018年8月8日
(iii) 受託番号NITE P-02758（Cobetia sp. IU180733JP01 (5-11-6-3)株）
The 5-11-6-3 strain has been deposited with the depository institution by Iwate University (Address: 3-18-8 Ueda, Morioka City, Iwate Prefecture) as follows. The 16S rRNA gene of the 5-11-6-3 strain has the base sequence shown in SEQ ID NO:2.
(i) Depository institution: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depository Center (NITE-NPMD)
(Address: Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan)
(ii) Date of deposit: August 8, 2018
(iii) Accession number NITE P-02758 (Cobetia sp. IU180733JP01 (5-11-6-3) strain)
5-28-6-1菌株は、国立大学法人岩手大学（住所：岩手県盛岡市上田三丁目１８番８号）により、以下のとおり、寄託機関へ寄託されている。5-28-6-1菌株の16S rRNA遺伝子は配列番号３に記載の塩基配列をする。
(i)寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NITE-NPMD)
（住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122室）
(ii) 受託日（寄託日）：2018年8月8日
(iii) 受託番号NITE P-02759（Cobetia sp. IU180733JP01 (5-28-6-1)株）
The 5-28-6-1 strain has been deposited with the depository institution by Iwate University (Address: 3-18-8 Ueda, Morioka City, Iwate Prefecture) as follows. The 16S rRNA gene of the 5-28-6-1 strain has the base sequence shown in SEQ ID NO:3.
(i) Depository institution: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depository Center (NITE-NPMD)
(Address: Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan)
(ii) Date of deposit: August 8, 2018
(iii) Accession number NITE P-02759 (Cobetia sp. IU180733JP01 (5-28-6-1) strain)
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. In this specification, unless otherwise specified, "%" is based on mass, and numerical ranges are described as including their endpoints.
試薬および装置
実施例に使用した試薬および装置は以下のとおりである。
実施例１
＜コベティア属細菌の単離＞
コベティア属細菌は、以下の手順で自然サンプルから単離同定した。
自然サンプルは2017年6月20日岩手県大船渡市碁石海岸近郊から採取した海水、海藻類、貝殻、ウミウシである。採取した自然サンプルは、2～3日間培養した（スケール：5mL試験管、温度：30℃、撹拌数：111rpm、培地：ZoBell 2216E 海水培地、pH:5）。
Example 1
<Isolation of Covetia bacteria>
Covetia bacteria were isolated and identified from natural samples by the following procedure.
The natural samples were seawater, seaweed, shells, and sea slugs collected from the Goishi Coast area of Ofunato City, Iwate Prefecture on June 20, 2017. The collected natural samples were cultured for 2 to 3 days (scale: 5 mL test tube, temperature: 30°C, stirring speed: 111 rpm, medium: ZoBell 2216E seawater medium, pH: 5).
自然サンプルを加えて培養した海水培地から、単コロニーを取得するために単菌分離を、表７の培地を用い、培養温度30℃、培養時間3日間の条件で行った。色、形態および大きさが異なるコロニーが複数得られた。 In order to obtain single colonies from the seawater medium cultured with the natural sample, single bacterial isolation was performed using the medium in Table 7 at a culture temperature of 30°C for a culture time of 3 days. Multiple colonies with different colors, morphologies, and sizes were obtained.
次に一次スクリーニングとして、単菌分離によって得られた株をNile Redを含む培地で培養することで、PHA合成候補株の選抜を行った。Nile Redは疎水性色素で、細胞内の中性脂質と反応し赤く呈色することから、目視で候補株の取得が可能である。Nile Redを含む培地と含まない培地２種類を用意し、両方のプレートに植菌することで色の変化を肉眼で観察した。赤く呈色したコロニーに関しては次の実験まで４℃で保存した。 Next, as a primary screening step, the strains obtained by single-cell isolation were cultured in a medium containing Nile Red to select candidate strains for PHA synthesis. Nile Red is a hydrophobic dye that reacts with neutral lipids within cells to produce a red color, making it possible to visually select candidate strains. Two types of medium, one containing Nile Red and one not, were prepared, and the color change was observed with the naked eye by inoculating both plates. Colonies that turned red were stored at 4°C until the next experiment.
Nile Redを含む培地の組成を、表8に記載する。培地は加圧滅菌(121℃、15min)を行い、Trace Elementはフィルター殺菌(Minisart(登録商標)-RC25、sartorius、RC、pore size 0.45μm)を行い、アルギン酸ナトリウムは培地と別に加圧滅菌(121℃、15min)を行った。Nile Redはジメチルスルホキシドに溶解させ滅菌せずに使用した。培地中のアルギン酸ナトリウムの終濃度は１％とした。ZoBell 2216E 海水プレートから色および形態の異なるコロニーを選抜し、爪楊枝で採り、２プレートに植菌した。プレートは30℃で5日間培養し、Nile Red含有プレートは遮光して培養した。プレートの観察は毎日肉眼で行い、赤く呈色した株を複数取得した。 The composition of the medium containing Nile Red is shown in Table 8. The medium was autoclaved (121°C, 15 min), Trace Element was filter sterilized (Minisart (registered trademark)-RC25, sartorius, RC, pore size 0.45 μm), and sodium alginate was autoclaved (121°C, 15 min) separately from the medium. Nile Red was dissolved in dimethyl sulfoxide and used without sterilization. The final concentration of sodium alginate in the medium was 1%. Colonies with different colors and morphologies were selected from the ZoBell 2216E seawater plate, picked with a toothpick, and inoculated onto two plates. The plates were incubated at 30°C for 5 days, and the Nile Red-containing plate was incubated in the dark. The plates were observed with the naked eye every day, and multiple red-colored strains were obtained.
次に二次スクリーニングとして、GC-MS法による選抜を行った。一次スクリーニングで選抜した菌株を培養後、PHAポリマーを抽出し、抽出物をエタノリシス化したものについて、GC-MS法PHAのモノマーの検出を行い、更なる選抜を行った。
（培養）一次スクリーニングで得たPHA合成候補株の培養を試験管（10mL）で行った。培地は、表9に記載の培地を加圧滅菌（121℃、15min）し、Trace Elementとアルギン酸ナトリウムは上記と同様の方法で別に殺菌後に培地に添加して調整した。一次スクリーニングで得たPHA合成候補株のコロニーを爪楊枝で分取し、爪楊枝ごと培地にいれ、振盪培養を行った。炭素源としてアルギン酸ナトリウムを使用し、終濃度は１％とした。培養は、温度30℃、撹拌数111rpmで、72時間行い、生育が遅いサンプルはさらに培養時間を延長した。
（PHA抽出）培養終了後、培養液のpHとOD660を測定し、ＲＯ水（逆浸透膜処理した水）による２回の懸濁と３回の遠心によって菌体を回収した。遠心は８，４９０×ｇ、または７，６７０×ｇによって行った。回収した菌体は－３０℃で予備凍結を行った。その後、菌体の入ったチューブをパラフィルムによって蓋をし、そこへ穴を開け、凍結乾燥機によって最低２４時間凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、乾燥菌体重量を測定し細かく砕いた後、菌体をねじ口試験管に移し、クロロホルムを菌体２００～３００ｍｇ当たり５ｍＬ添加した。ボルテックス後７０℃で二日間加熱した。この際、適宜ボルテックスした。加熱後は、フィルターに通すことで菌体を除き、ろ液をドラフト内で加熱し乾固させた。抽出物重量はろ過前後のねじ口試験管の重量を測定することで求めた。乾固したサンプルは常温で保存した。 (PHA extraction) After the culture was completed, the pH and OD 660 of the culture solution were measured, and the cells were collected by suspending twice in RO water (water treated with a reverse osmosis membrane) and centrifuging three times. Centrifugation was performed at 8,490 x g or 7,670 x g. The collected cells were pre-frozen at -30°C. Then, the tube containing the cells was covered with parafilm, a hole was made in it, and the cells were freeze-dried for at least 24 hours using a freeze dryer. After freeze-drying, the dried cells were weighed and crushed finely, then transferred to a screw-top test tube, and 5 mL of chloroform was added per 200 to 300 mg of cells. After vortexing, the mixture was heated at 70°C for two days. At this time, vortexing was performed appropriately. After heating, the cells were removed by passing through a filter, and the filtrate was heated in a draft to dryness. The weight of the extract was determined by measuring the weight of the screw-top test tube before and after filtration. The dried sample was stored at room temperature.
（GC-MS法試料の調製）抽出物にクロロホルム１ｍＬを添加後、加熱によって溶解させた。そこに９９．５％エタノールを３．４ｍＬとＨＣｌ（原液）４００μＬを加え、１分間ボルテックスにより撹拌し、１００℃で４時間ヒートブロックを使用して加熱した（エタノリシス処理）（Y. Arai, et al., Plant Cell Physiol. 43(5), 555-562, (2002)）。なお、加熱時は３０分毎に１分間ボルテックスした。氷中で一旦冷却し、０．６５Ｍ ＮａＯＨ＋０．９Ｍ ＮａＣｌ混合液を４ｍＬと０．２５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4を２ｍＬ添加後、１分間ボルテックスし、ｐＨ試験紙でクロロホルム層が中性であることを確認した。次いでこの溶液を８００×ｇで５分間遠心し、クロロホルム層を下層に集めた。パスツールピペットにガラスウールとＮａ2ＳＯ4を詰めて作製したカラムにクロロホルム層を通し、予め１８０℃で２時間乾熱したMolecular sievesを入れたねじ口試験管にクロロホルム層を移すことで脱水した。これをサンプルとし、分析まで－３０℃で保存した。 (Preparation of GC-MS sample) 1 mL of chloroform was added to the extract, and then it was dissolved by heating. 3.4 mL of 99.5% ethanol and 400 μL of HCl (stock solution) were added thereto, and the mixture was stirred by vortexing for 1 minute, and heated at 100°C for 4 hours using a heat block (ethanolysis treatment) (Y. Arai, et al., Plant Cell Physiol. 43(5), 555-562, (2002)). During heating, the mixture was vortexed for 1 minute every 30 minutes. The mixture was cooled once in ice, and 4 mL of a 0.65 M NaOH + 0.9 M NaCl mixture and 2 mL of 0.25 M Na2HPO4 were added, followed by vortexing for 1 minute, and the chloroform layer was confirmed to be neutral using pH test paper. The solution was then centrifuged at 800 × g for 5 minutes, and the chloroform layer was collected at the bottom. The chloroform layer was passed through a column made by packing glass wool and Na2SO4 in a Pasteur pipette, and the chloroform layer was transferred to a screw-top test tube containing molecular sieves that had been preheated at 180°C for 2 hours to dehydrate it. This was used as a sample and was stored at -30°C until analysis.
合成されたPHA量を測定するため、最もメジャーなPHAの1つであるP(3HB)をエタノリシス処理し、3HBエチルの標準物質として検量線を作成した。検量線の作成には、P(3HB)をクロロホルムで希釈して、濃度が１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍＬのものを用意し、それぞれエタノリシス処理した試料を用いた。 To measure the amount of synthesized PHA, P(3HB), one of the most common PHAs, was subjected to ethanolysis and a calibration curve was created using 3HB ethyl as a standard substance. To create the calibration curve, P(3HB) was diluted with chloroform to prepare concentrations of 10, 50, 100, 500, and 1000 μg/mL, and each of these was used as a sample subjected to ethanolysis.
（GC-MS法条件）
HP-5カラム（長さ30 m、膜厚0,25μm、内径0.25 mm）を使用した。分析条件は表10に記載のとおりである。
An HP-5 column (length 30 m, film thickness 0.25 μm, inner diameter 0.25 mm) was used. The analytical conditions are as shown in Table 10.
3HBエチル標準物質のマススペクトルのピークは、保持時間4.7付近で確認された。P(3HB)に由来すると考えられる3HBエチルのマススペクトルを示すピークが複数のサンプルで検出された。保持時間4.76～5.00のピークを示したサンプルをPHA合成候補株として選抜した。複数株で、最もメジャーなPHAのひとつであるP(3HB)のエタノリシス産物である3HBエチルが検出された。保持時間4.76～5.00のピークを示した複数株のうち、5-25-4-2株の分析結果を図1に示す。 The mass spectrum peak of the 3HB ethyl standard substance was confirmed at a retention time of around 4.7. A peak showing the mass spectrum of 3HB ethyl, thought to be derived from P(3HB), was detected in multiple samples. Samples that showed a peak at a retention time of 4.76-5.00 were selected as candidate strains for PHA synthesis. 3HB ethyl, an ethanolysis product of P(3HB), one of the most common PHAs, was detected in multiple strains. Of the multiple strains that showed a peak at a retention time of 4.76-5.00, the analysis results for strain 5-25-4-2 are shown in Figure 1.
P(3HB)量は3HBエチルを標準物質として用いた検量線から求め、P(3HB)蓄積率は、P(3HB)量を乾燥菌体重量で割ることで求めた（表11）。
次に、ポリマーの合成を確認するために1H-Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) 分析を行った。5-25-4-2株について、坂口フラスコによるスケールアップ培養を行い、培養物から、クロロホルム抽出物を得た。これを少量のクロロホルムで溶解させ、そこに過剰量（10倍以上）のヘキサンを加えることで、ポリマーを析出させ、ポリマーの精製を行った。精製したポリマーに1 vol% TMS含有重クロロホルム（富士フィルム和光純薬株式会社）2mLを添加し、加熱することで溶解させた。
1H-NMR分析の結果、P(3HB)ホモポリマーに特異的なピーク（1.26-1.28, 2.44-2.64, 5.24-5.28 ppm）が観察され、モノマーである3HBのピークは検出されなかった。図2に5-25-4-2株の分析結果を示す。なお、3HBのピークは、1.20-1.21, 2.30-2.43, 4.13-4.19 ppm に観察されるため、P(3HB)ホモポリマーは、3HBから区別することができる。また1.5 ppm付近に検出されたピークは残存した水であり、7.26 ppm付近のピークは重クロロホルムであると考えられる。
Next, 1H -Nuclear Magnetic Resonance ( 1H -NMR) analysis was performed to confirm the synthesis of the polymer. The 5-25-4-2 strain was cultured in a Sakaguchi flask for scale-up, and a chloroform extract was obtained from the culture. This was dissolved in a small amount of chloroform, and an excess amount (10 times or more) of hexane was added to precipitate the polymer, and the polymer was purified. 2mL of 1vol% TMS-containing deuterated chloroform (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the purified polymer, and it was dissolved by heating.
1H -NMR analysis showed peaks specific to P(3HB) homopolymer (1.26-1.28, 2.44-2.64, 5.24-5.28 ppm), but no peaks for the monomer 3HB were detected. Figure 2 shows the analysis results for strain 5-25-4-2. Note that the 3HB peaks are observed at 1.20-1.21, 2.30-2.43, and 4.13-4.19 ppm, so P(3HB) homopolymer can be distinguished from 3HB. The peak detected around 1.5 ppm is believed to be residual water, and the peak around 7.26 ppm is believed to be deuterochloroform.
実施例２
＜5-25-4-2株の同定＞
種同定：16S rRNA塩基配列の決定
5-25-4-2株の菌体から核酸を抽出し、エタノール沈殿後、核酸の濃度測定とアガロースゲル電気泳動を行った。DNA抽出が確認できたことから次の操作に供した。DNA抽出物について16S rDNAまたは18S rDNAのPCR増幅を行った。本菌株は細菌か真菌か判明していないため16S rRNA用プライマーと18S rRNA用プライマーの両方を使用した。
<Identification of strain 5-25-4-2>
Species identification: Determination of 16S rRNA base sequence
Nucleic acid was extracted from the 5-25-4-2 strain, and after ethanol precipitation, the nucleic acid concentration was measured and agarose gel electrophoresis was performed. Since DNA extraction was confirmed, the next procedure was performed. PCR amplification of 16S rDNA or 18S rDNA was performed on the DNA extract. Since it was not clear whether this strain was a bacterium or a fungus, both 16S rRNA primers and 18S rRNA primers were used.
PCRは、TaKaRa Ex Taq を用いて、反応液組成（TaKaRa Ex Taq (5U/μL) 0.25μL; 10×Ex Taq Buffer 5μL; dNTP Mixture (each 2.5 mM) 4 μL; Primer (10μM) 各3μL; Template (<500 ng) 3-5μL; 滅菌MQ水 up to 50μL）を使用して、98℃10秒→55℃30秒を30サイクル→72℃90秒の反応条件で行った。結果、16S rRNAに相当する約1.5 kbpのバンドが確認された。PCR産物をシークエンス解析に供し、16SrDNA配列の一部を決定した。その後得られた配列を用いてBLASTデータベースにおける相同性検索を行った。 PCR was performed using TaKaRa Ex Taq with the following reaction mixture composition (0.25μL of TaKaRa Ex Taq (5U/μL); 5μL of 10×Ex Taq Buffer; 4μL of dNTP Mixture (each 2.5 mM); 3μL of primer (10μM); 3-5μL of template (<500 ng); up to 50μL of sterile MQ water) under the following reaction conditions: 98℃ for 10 seconds, 30 cycles of 55℃ for 30 seconds, and 72℃ for 90 seconds. As a result, a band of approximately 1.5 kbp corresponding to 16S rRNA was confirmed. The PCR product was subjected to sequence analysis to determine a portion of the 16S rDNA sequence. The obtained sequence was then used to perform a homology search in the BLAST database.
種同定：5-25-4-2株の表現性状
オキシダーゼ試験
チトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙「ニッスイ」（日水製薬）をシャーレに入れ、数滴のMQ水を試験紙に滴下して全体を湿らせ、ここに白金耳で菌体を塗布した。これを放置して1分以内に深青色を示せば陽性、呈色が確認されなければ陰性と判断した。試験には、PHA合成寒天培地（表14）で48時間 培養した5-25-4-2株のコロニーを使用した。
栄養性試験
培地はVentosaらの培地組成に従い調製した(表15)(Anotonio Ventosa, Emilia Q uesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto R amos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram- negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968.)。炭素源はL-アラビノース、D-グルコース、グリセロール、myo-イノシトール、D-マンニトール、D-マンノース、D-ソルビトール、スクロースを使用し、濃度を10%に調整しフィルター滅菌（Minisart(登録商標)-RC25、sartorius、RC、pore size 0.45μm）を行った。それ以外の培地成分はオートクレーブ滅菌を行った。培地のpHはKOHを用いて7.5に調整した。菌体は4℃で保存していた菌体を使用した。培養液 5 mLにコロニーを爪楊枝ごといれ培養（30℃、振盪数120 rpm）を行った。その後、生育が確認できたものに関しては再度新鮮な培地に菌液100μLを添加することで、炭素源を資化できるかどうか判断した。
Nutritional test The medium was prepared according to the medium composition of Ventosa et al. (Table 15) (Anotonio Ventosa, Emilia Q uesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram- negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968.). The carbon sources used were L-arabinose, D-glucose, glycerol, myo-inositol, D-mannitol, D-mannose, D-sorbitol, and sucrose, and the concentrations were adjusted to 10% and filter sterilized (Minisart (registered trademark)-RC25, sartorius, RC, pore size 0.45 μm). The other medium components were sterilized by autoclave. The pH of the medium was adjusted to 7.5 using KOH. The cells were stored at 4 ° C. A colony was placed on a toothpick and cultured in 5 mL of culture medium (30°C, shaking at 120 rpm). After that, for those colonies where growth was confirmed, 100 μL of the bacterial liquid was added to fresh medium again to determine whether the colony could utilize the carbon source.
運動性試験
OF培地はRudolphらの培地組成(Rudolph Hugh, Einar Leifson, The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria, J Bacteriol. 1953 Jul;66(1):24-26.）を改変し、NaCl濃度を2%に調製した(表16)。使用するマンニトールおよびグルコースはフィルター滅菌（Minisart(登録商標）-RC25、sartorius、RC、pore size 0.45μm）を行い、アルギン酸ナトリウムおよびそれ以外の培地成分はオートクレーブ滅菌を行った。クリーンベンチ内で炭素源と培地成分を混ぜ合わせ、培地を試験管に約5cm分注した。菌体は4℃で保存していたプレート培地から白金耳で植菌した。
Motility Test
OF medium was prepared by modifying the medium composition of Rudolph et al. (Rudolph Hugh, Einar Leifson, The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria, J Bacteriol. 1953 Jul;66(1):24-26.) and adjusting the NaCl concentration to 2% (Table 16). The mannitol and glucose used were filter sterilized (Minisart (registered trademark)-RC25, sartorius, RC, pore size 0.45 μm), and sodium alginate and other medium components were sterilized by autoclave. The carbon source and medium components were mixed in a clean bench, and the medium was dispensed into test tubes to a depth of about 5 cm. The bacterial cells were inoculated with a platinum loop from a plate medium stored at 4°C.
顕微鏡での観察はSW5液体培地、PHA合成液体培地、PHA合成寒天培地(表17)で培養したものを用いた。また、コントロールとしてCobetia sp. 5-11-6-3株を用いた。SW5液体培地はAntonioらの方法に従い表20に示す組成で作成した(Anotonio Ventosa, Emilia Quesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968.)。ただし、Yeast extract(Difco)が既に販売終了してしまっていたために、代替としてYeast extract(Bacto)を用いた。30% Marine salts(表21)は調製後、終濃度5%となるよう培地に添加した。KOHとHClでpHは7.5に調製した。SW5液体培地およびPHA合成液体培地試料は10 mLの培地に植菌し30℃、120 rpm、48時間で振盪培養したものを用いた。PHA合成寒天培地試料は4℃で保存していたプレートの菌体を100μLのPHA合成液体培地で懸濁して作成した。 For microscopic observation, the specimens were cultured in SW5 liquid medium, PHA synthetic liquid medium, and PHA synthetic agar medium (Table 17). Cobetia sp. 5-11-6-3 strain was used as a control. SW5 liquid medium was prepared according to the method of Antonio et al. with the composition shown in Table 20 (Anotonio Ventosa, Emilia Quesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968.). However, since Yeast extract (Difco) was no longer available for sale, Yeast extract (Bacto) was used instead. After preparation, 30% Marine salts (Table 21) was added to the medium to a final concentration of 5%. The pH was adjusted to 7.5 with KOH and HCl. SW5 liquid medium and PHA synthetic liquid medium samples were inoculated into 10 mL of medium and cultured with shaking at 30°C, 120 rpm, and 48 hours. PHA synthetic agar medium samples were prepared by suspending the bacteria from a plate stored at 4°C in 100 μL of PHA synthetic liquid medium.
温度条件
温度条件はSW5培地を用いて実験を行った。培地組成はAntonioらの方法に従い調製した(Anotonio Ventosa, Emilia Quesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968)。ただし、Yeast extract(Difco)が既に販売終了してしまっていたために、代替としてYeast extract(Bacto)を用いた。30% Marine saltsは調製後、フィルター滅菌（Minisart(登録商標）-RC25、sartorius、RC、pore size 0.45μm）を行い、終濃度5%となるよう培地に添加した。KOHとNaClでpHは7.5に調製した。まず4℃で保存していた菌体を爪楊枝でかきとり、SW5液体培地で培養した（48時間、30℃、振盪数120 rpm）。その後、培養液をSW5培地で1/10に希釈し、100μL添加した。温度条件は4, 15, 25, 37, 42, 45℃で行った。4℃で生育させるプレートはクリーンベンチ内の操作を氷上で行い、培養はチャンバー内で行った。それ以外の温度は常温で操作し、培養は恒温器を使用して行った。
Temperature conditions Experiments were performed using SW5 medium. The medium composition was prepared according to the method of Antonio et al. (Anotonio Ventosa, Emilia Quesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968). However, since Yeast extract (Difco) was no longer available, Yeast extract (Bacto) was used instead. After preparation, 30% Marine salts was filter sterilized (Minisart (registered trademark)-RC25, sartorius, RC, pore size 0.45 μm) and added to the medium to a final concentration of 5%. The pH was adjusted to 7.5 with KOH and NaCl. First, the bacteria stored at 4°C were scraped off with a toothpick and cultured in SW5 liquid medium (48 hours, 30°C, shaking at 120 rpm). The culture medium was then diluted 1/10 with SW5 medium and 100 μL was added. Temperature conditions were 4, 15, 25, 37, 42, and 45°C. For plates grown at 4°C, operations were performed on ice in a clean bench, and culture was performed in a chamber. For other temperatures, operations were performed at room temperature, and culture was performed in an incubator.
生育可能NaCl濃度
生育可能NaCl濃度試験のためにSW5寒天培地で生育試験を行った。SW培地は以下SW-NaCl濃度(%)という表記とする(例:SW5 =NaCl濃度5%SW培地)。培地組成はAntonioらの方法に従い調製した(Anotonio Ventosa, Emilia Quesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968)。SW5液体培地は表19に示す組成で作成した。各NaCl濃度のSW寒天培地は表20に示す組成で作成した。また30% Marine saltsは調製後、各終濃度となるよう培地に添加した。KOHとHClでpHは7.5に調製した。
まず4℃で保存していた菌体を爪楊枝でかきとり、SW5液体培地で培養した（48時間、30℃、振盪数120 rpm）。その後、培養液をSW5培地で1/10に希釈し、100μL添加した。NaCl条件は0、0.5、3、5、10、15、20、25%で行った。培養温度は37℃で行い、生育の有無は1週間培養して判断した。
Growth-enhancing NaCl concentration Growth tests were performed on SW5 agar medium to test the growth-enhancing NaCl concentration. SW medium is hereafter referred to as SW-NaCl concentration (%) (e.g. SW5 = SW medium with 5% NaCl concentration). The medium composition was prepared according to the method of Antonio et al. (Anotonio Ventosa, Emilia Quesada, Francisco Rodoriguez-Valera, Francisco Ruiz-Berraquero & Alberto Ramos-cormenzana. (1982). Numerical taxonomy of moderately halophilic Gram-negative rods. J. Gen. Microbiol. 128, 1959-1968). SW5 liquid medium was prepared with the composition shown in Table 19. SW agar medium with each NaCl concentration was prepared with the composition shown in Table 20. After preparation, 30% Marine salts was added to the medium to achieve each final concentration. The pH was adjusted to 7.5 with KOH and HCl.
First, the bacteria stored at 4°C were scraped off with a toothpick and cultured in SW5 liquid medium (48 hours, 30°C, shaking at 120 rpm). The culture medium was then diluted 1/10 with SW5 medium and 100 μL was added. The NaCl conditions were 0, 0.5, 3, 5, 10, 15, 20, and 25%. The culture temperature was 37°C, and the presence or absence of growth was determined after one week of culture.
5-25-4-2株について16S rRNA遺伝子増幅用プライマーに挟まれた領域の一部である1434bpの塩基配列を決定した（図3B）。BLASTによる相同性検索を行った。その結果、Cobetia marinanaなどの16S rRNAと99%の相同性を示した。よって、5-25-4-2株微生物はCobetia属細菌である可能性が示唆された(表13)。また、Cobetia sp. 5-11-6-3株(特願2018-159148で同定した株)と5-25-4-2株の16SrDNA配列は、4塩基異なっていた。
また、形態学的な特徴や生理・生化学的な性状を調べた結果を表21にまとめた。5-25-4-2株は、Cobetia marinaと比較すると、栄養性試験においてL-Arabinoseを資化することがでない点が一致しなかった。一方で、Cobetia sp. 5-11-6-3株とは形態学的な特徴や生理・生化学的な性状が全て一致した。よって、16SrDNA配列の結果と同様に、5-25-4-2株微生物はCobetia属細菌であると結論付けた。
The 1434 bp base sequence of the 5-25-4-2 strain, which is part of the region flanked by the primers for amplifying the 16S rRNA gene, was determined (Figure 3B). A homology search was performed using BLAST. As a result, it showed 99% homology with 16S rRNA of Cobetia marinana and other species. Therefore, it was suggested that the 5-25-4-2 strain may be a Cobetia bacterium (Table 13). In addition, the 16S rDNA sequences of Cobetia sp. 5-11-6-3 strain (strain identified in Patent Application 2018-159148) and 5-25-4-2 strain differed by four bases.
In addition, the results of the investigation of morphological characteristics and physiological and biochemical properties are summarized in Table 21. Compared with Cobetia marina, the 5-25-4-2 strain did not match the Cobetia marina in terms of its inability to assimilate L-arabinose in the nutritional test. On the other hand, the morphological characteristics and physiological and biochemical properties were all the same as those of Cobetia sp. 5-11-6-3 strain. Therefore, as with the results of the 16SrDNA sequence, it was concluded that the 5-25-4-2 strain microorganism belongs to the genus Cobetia.
・Lyudmila A. Romanenko, Naoto Tanaka, Vassilii I. Svetashev & Enevold Falsen. (2013). Description of Cobetia amphilecti sp. nov., Cobetia litoralis sp. nov. and Cobetia pacifica sp. nov., classification of Halomonas halodurans as a later heterotypic synonym of Cobetia marina and emended descriptions of the genus Cobetia and Cobetia marina
Lyudmila A. Romanenko, Naoto Tanaka, Vassilii I. Svetashev & Enevold Falsen. (2013). Description of Cobetia amphilecti sp. nov., Cobetia litoralis sp. nov. and Cobetia pacifica sp. nov., classification of Halomonas halodurans as a later heterotypic synonym of Cobetia marina and emended descriptions of the genus Cobetia and Cobetia marina.
実施例３
＜ワカメを原料としたPHA合成実験＞
実験方法:
培養
Cobetia sp. 5-11-6-3株またはCobetia sp. 5-25-4-2 株をPHA合成用培地で培養した菌体を掻き取り、10 mLのPHA合成用液体培地（表22）に植菌し、30℃で2日間120 rpmで振盪培養し、種培養を行った。続いて、粉砕した凍結乾燥ワカメを2 wt%添加したPHA合成用液体培地（表23）を坂口フラスコに150 mL作成し、種培養液を3 mLずつ植菌した。これを30℃で1～2日間120 rpmで振盪培養し、本培養した。培地に添加した粉砕した凍結乾燥ワカメは、密閉していないビニール袋に入れ、-80℃で一晩予備凍結した後に凍結乾燥を行い、凍結乾燥後、粉状になるまで乳鉢と乳棒で摩砕したものを使用した。
本培養後の培養液をキムワイプを用いてろ過し、海藻を分離した。その後菌液を遠沈管に移し、7,700×gで15分間遠心分離後、上清をデカンテーションで捨てた。この後、RO水で菌体を懸濁し、7,700×gで10分間遠心分離、上清をデカンテーションで捨てる作業を2回行い、菌体を洗浄した。得られた菌体を-80℃で一晩以上凍結し、凍結乾燥機（EYELA FDS-1000型、東京理化器械(株)）で凍結乾燥した。実験は2連で行った。
Example 3
<PHA synthesis experiment using wakame seaweed as raw material>
experimental method:
culture
The cells of Cobetia sp. 5-11-6-3 or Cobetia sp. 5-25-4-2 cultured in a PHA synthesis medium were scraped off and inoculated into 10 mL of PHA synthesis liquid medium (Table 22), and cultured at 30°C for 2 days with shaking at 120 rpm to perform seed culture. Next, 150 mL of PHA synthesis liquid medium (Table 23) containing 2 wt% crushed freeze-dried wakame was prepared in a Sakaguchi flask, and 3 mL of the seed culture was inoculated into each flask. This was cultured at 30°C for 1 to 2 days with shaking at 120 rpm to perform main culture. The crushed freeze-dried wakame added to the medium was placed in an unsealed plastic bag, pre-frozen overnight at -80°C, freeze-dried, and then ground with a mortar and pestle until powdery.
After the main culture, the culture solution was filtered using Kimwipes to separate the seaweed. The bacterial solution was then transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 7,700 x g for 15 minutes, after which the supernatant was discarded by decantation. The bacterial cells were then suspended in RO water, centrifuged at 7,700 x g for 10 minutes, and the supernatant was discarded by decantation, and this process was repeated twice to wash the bacterial cells. The resulting bacterial cells were frozen at -80°C for at least one night, and then freeze-dried using a freeze dryer (EYELA FDS-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd.). The experiment was performed in duplicate.
ポリマー抽出
乾燥菌体を乳鉢によって破砕し、重量を測定した。乾燥菌体200-300 mgあたり5 mL程度のクロロホルムを添加し、ヒートブロックを用いて70℃で48時間抽出を行った。抽出後、フィルター(DISMIC(登録商標）-25HP、Advantec、PTFE、pore size 45μm)を用いて菌体を濾過し、ヒートブロックを用いて70℃で加熱し抽出液を乾固させた。抽出物が汚い場合は少量のクロロホルムで溶かした後、過剰量（約10倍以上）のヘキサンを加え、ポリマーを析出させた後ヘキサンを除き乾固させた。析出したポリマー重量を実験前後の試験管重量から算出し、乾燥菌体重量からポリマーの蓄積率を算出した。
Polymer extraction The dried cells were crushed in a mortar and the weight was measured. About 5 mL of chloroform was added per 200-300 mg of dried cells, and extraction was performed at 70°C for 48 hours using a heat block. After extraction, the cells were filtered using a filter (DISMIC (registered trademark)-25HP, Advantec, PTFE, pore size 45 μm), and the extract was dried by heating at 70°C using a heat block. If the extract was dirty, it was dissolved in a small amount of chloroform, and then an excess amount (about 10 times or more) of hexane was added to precipitate the polymer, and the hexane was removed and the extract was dried. The weight of the precipitated polymer was calculated from the weight of the test tube before and after the experiment, and the polymer accumulation rate was calculated from the weight of the dried cells.
1H-NMR分析
試料濃度が5 mg/mLになるように、精製したポリマーを精密天秤で10 mg分採取し、0.05 vol% TMS含有重クロロホルム（富士フィルム和光純薬株式会社）約2 mLに添加した後、70℃で加熱しながら溶解させた。この分析サンプルをNMR専用試料管に規定量になるように入れ、JNM-AL400 (400 MHz)を用いて1H-NMR分析を行った。内部標準にはテトラメチルシラン(TMS)を用い、積算回数は20回で行なった。
1H -NMR analysis 10 mg of the purified polymer was taken on a precision balance so that the sample concentration was 5 mg/mL, and added to approximately 2 mL of deuterated chloroform containing 0.05 vol% TMS (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then dissolved by heating at 70°C. This analysis sample was placed in a specified amount in an NMR sample tube, and 1H -NMR analysis was performed using a JNM-AL400 (400 MHz). Tetramethylsilane (TMS) was used as the internal standard, and 20 accumulations were performed.
粉砕した凍結乾燥ワカメを2 wt%添加した培地でCobetia sp. 5-11-6-3株およびCobetia sp. 5-25-4-2 株の培養を行った結果、どちらもわずかにポリマー様白色固体が確認された。そこで、得られたポリマー様固体を1H-NMR分析に供した結果、典型的なPHAであるポリ-３-ヒドロキシブタン酸 [P(3HB)]であることが確認された(図4)。この際のP(3HB)蓄積率は、5-11-6-3株で4.9 wt%、5-25-4-2 株で4.5 wt%であり同程度であった（表24）。以上の結果より、5-11-6-3株と5-25-4-2 株は、乾燥ワカメを主原料としてP(3HB)を合成可能であることが示された。 When Cobetia sp. 5-11-6-3 and 5-25-4-2 were cultured in a medium containing 2 wt% of crushed freeze-dried wakame, a small amount of polymer-like white solid was observed in both strains. The polymer-like solid was then subjected to 1H -NMR analysis and confirmed to be poly-3-hydroxybutanoic acid [P(3HB)], a typical PHA (Figure 4). The P(3HB) accumulation rates were similar, 4.9 wt% for 5-11-6-3 and 4.5 wt% for 5-25-4-2 (Table 24). These results indicate that 5-11-6-3 and 5-25-4-2 strains can synthesize P(3HB) using dried wakame as the main raw material.
実施例４
＜コンブを原料としたPHA合成実験：培地への乾燥コンブ添加量の検討＞
実験方法
培養
Cobetia sp. 5-11-6-3株またはCobetia sp. 5-25-4-2株をPHA合成用寒天培地で培養し、その後培養した菌体を掻き取り、10 mLのPHA合成用液体培地（表22）に植菌して、30℃で2日間120 rpmで振盪培養し、種培養を行った。続いて、粉砕した乾燥コンブを2または5 wt%添加したPHA合成用液体培地（表25）を坂口フラスコに150 mL作成し、種培養液を3 mLずつ植菌した。これを30℃で１～2日間120 rpmで振盪培養し、本培養した。培地に添加した粉砕した乾燥コンブは、水道水およびRO水で洗浄後、約3×3 cmに細断し、密閉していないビニール袋に入れ、-80℃で一晩予備凍結した後に凍結乾燥を行い、凍結乾燥後、粉砕機（New Power MILL PM-2005m、大阪ケミカル株式会社）を用い、約6,000 rpmで2,3 mm四方のサイズになるように粉砕して準備した。
本培養後の培養液をキムワイプを用いてろ過し、海藻を分離した。その後菌液を遠沈管に移し、7,700×gで15分間遠心分離後、上清をデカンテーションで捨てた。この後、RO水で菌体を懸濁し、7,700×gで10分間遠心分離、上清をデカンテーションで捨てる作業を2回行い、菌体を洗浄した。得られた菌体を-80℃で一晩以上凍結し、凍結乾燥機（EYELA FDS-1000型、東京理化器械(株)）で凍結乾燥した。実験は2連で行った。
Example 4
<PHA synthesis experiment using kelp as raw material: Examination of the amount of dried kelp added to the medium>
Experimental method Culture
Cobetia sp. 5-11-6-3 or 5-25-4-2 was cultured on an agar medium for PHA synthesis, and then the cultured cells were scraped off and inoculated into 10 mL of liquid medium for PHA synthesis (Table 22), and cultured at 30°C for 2 days with shaking at 120 rpm to perform seed culture. Next, 150 mL of liquid medium for PHA synthesis (Table 25) containing 2 or 5 wt% of crushed dried kelp was prepared in a Sakaguchi flask, and 3 mL of the seed culture was inoculated into each flask. This was cultured at 30°C for 1 to 2 days with shaking at 120 rpm to perform main culture. The crushed dried kelp added to the medium was washed with tap water and RO water, then chopped into pieces of approximately 3 x 3 cm, placed in an unsealed plastic bag, pre-frozen overnight at -80°C, and freeze-dried. After freeze-drying, the pieces were crushed at approximately 6,000 rpm using a grinder (New Power MILL PM-2005m, Osaka Chemical Co., Ltd.) to a size of 2.3 mm square.
After the main culture, the culture solution was filtered using Kimwipes to separate the seaweed. The bacterial solution was then transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 7,700 x g for 15 minutes, after which the supernatant was discarded by decantation. The bacterial cells were then suspended in RO water, centrifuged at 7,700 x g for 10 minutes, and the supernatant was discarded by decantation, and this process was repeated twice to wash the bacterial cells. The resulting bacterial cells were frozen at -80°C for at least one night, and then freeze-dried using a freeze dryer (EYELA FDS-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd.). The experiment was performed in duplicate.
ポリマー抽出
乾燥菌体を乳鉢によって破砕し、重量を測定した。乾燥菌体200-300 mgあたり5 mL程度のクロロホルムを添加し、ヒートブロックを用いて70℃で48時間抽出を行った。抽出後、フィルター(DISMIC(登録商標）-25HP、Advantec、PTFE、pore size 45μm)を用いて菌体を濾過し、ヒートブロックを用いて70℃で加熱し抽出液を乾固させた。抽出物が汚い場合は少量のクロロホルムで溶かした後、過剰量（約10倍以上）のヘキサンを加え、ポリマーを析出させた後ヘキサンを除き乾固させた。析出したポリマーの重量を実験前後の試験管重量から算出し、乾燥菌体重量からポリマーの蓄積率を算出した。
Polymer extraction The dried cells were crushed in a mortar and the weight was measured. About 5 mL of chloroform was added per 200-300 mg of dried cells, and extraction was performed at 70°C for 48 hours using a heat block. After extraction, the cells were filtered using a filter (DISMIC (registered trademark)-25HP, Advantec, PTFE, pore size 45 μm), and the extract was dried by heating at 70°C using a heat block. If the extract was dirty, it was dissolved in a small amount of chloroform, and then an excess amount (about 10 times or more) of hexane was added to precipitate the polymer, and the hexane was removed and the extract was dried. The weight of the precipitated polymer was calculated from the weight of the test tube before and after the experiment, and the polymer accumulation rate was calculated from the weight of the dried cells.
1H-NMR分析
試料濃度が5 mg/mLになるように、精製したポリマーを精密天秤で10 mg分採取し、0.05 vol% TMS含有重クロロホルム（富士フィルム和光純薬株式会社）約2 mLに添加した後、70 ℃で加熱しながら溶解させた。この分析サンプルをNMR専用試料管に規定量になるように入れ、JNM-AL400 (400 MHz)を用いて1H-NMR分析を行った。内部標準にはテトラメチルシラン(TMS)を用い、積算回数は20回で行なった。
1H -NMR analysis 10 mg of the purified polymer was taken on a precision balance so that the sample concentration was 5 mg/mL, and added to approximately 2 mL of deuterated chloroform containing 0.05 vol% TMS (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then dissolved by heating at 70 °C. This analysis sample was placed in a specified amount in an NMR sample tube, and 1H -NMR analysis was performed using a JNM-AL400 (400 MHz). Tetramethylsilane (TMS) was used as the internal standard, and 20 accumulations were performed.
粉砕した凍結乾燥コンブを2 wt%添加した培地でCobetia sp. 5-11-6-3株およびCobetia sp. 5-25-4-2株の培養を行った結果、どちらもポリマー様白色固体が確認された。そこで、得られたポリマー様固体を1H-NMR分析に供した結果、両菌株でP(3HB)を合成していると確認された(図5)。 When Cobetia sp. 5-11-6-3 and Cobetia sp. 5-25-4-2 were cultured in a medium containing 2 wt% of crushed freeze-dried kelp, a polymer-like white solid was observed in both strains. The polymer-like solid was then subjected to 1H -NMR analysis, which confirmed that both strains synthesized P(3HB) (Figure 5).
この際のP(3HB)蓄積率は、5-11-6-3株で17.5 wt%、5-25-4-2株で28.3 wt%であった（表26）。また、培地に添加する乾燥コンブ量を2 wt%から5 wt%とした際、5-11-6-3株ではP(3HB)蓄積率が27.7 wt%と増加したが、5-25-4-2株では5.3 wt%へと減少した。培地に添加する乾燥コンブ量を増加させたにも関わらず、P(3HB)蓄積量が低下した原因として、乾燥コンブ添加量が増加すると植菌前の培地のpHが低下してしまう現象が一因と考えられたため、続いて培地のpHが乾燥コンブ添加培地でのP(3HB)合成量に与える影響について検討することとした。 The P(3HB) accumulation rate in this case was 17.5 wt% for the 5-11-6-3 strain and 28.3 wt% for the 5-25-4-2 strain (Table 26). When the amount of dried kelp added to the medium was increased from 2 wt% to 5 wt%, the P(3HB) accumulation rate increased to 27.7 wt% for the 5-11-6-3 strain, but decreased to 5.3 wt% for the 5-25-4-2 strain. One of the reasons for the decrease in P(3HB) accumulation despite the increase in the amount of dried kelp added to the medium was thought to be the phenomenon that the pH of the medium before inoculation decreases when the amount of dried kelp added increases. Therefore, we next investigated the effect of the pH of the medium on the amount of P(3HB) synthesis in the medium with added dried kelp.
実施例５
＜コンブを原料としたP(3HB)合成実験：培地pHの検討＞
実験方法
培養
Cobetia sp. 5-11-6-3株またはCobetia sp. 5-25-4-2株をPHA合成用培地で培養した菌体を掻き取り、10 mLのPHA合成用液体培地（表22）に植菌し、30℃で2日間120 rpmで振盪培養し、種培養を行った。続いて、粉砕した乾燥コンブを5 wt%添加したPHA合成用液体培地（表25）を坂口フラスコに150 mL作成し、種培養液を3 mLずつ植菌した。この際、培地の初発pHをpH 5.0, 5.5, 6.0とした。植菌後、30℃で1日間120 rpmで振盪培養し、本培養した。なお、初発pHとは、培地調整後、オートクレーブ処理前に測定したpHである。
Example 5
＜Experiment for synthesizing P(3HB) using kelp as a raw material: Examination of medium pH＞
Experimental method Culture
The cells of Cobetia sp. 5-11-6-3 or Cobetia sp. 5-25-4-2 cultured in a PHA synthesis medium were scraped off and inoculated into 10 mL of a PHA synthesis liquid medium (Table 22), and cultured at 30°C for 2 days with shaking at 120 rpm to perform seed culture. Next, 150 mL of a PHA synthesis liquid medium (Table 25) containing 5 wt% crushed dried kelp was prepared in a Sakaguchi flask, and 3 mL of the seed culture was inoculated into each flask. At this time, the initial pH of the medium was set to pH 5.0, 5.5, or 6.0. After inoculation, the medium was cultured at 30°C for 1 day with shaking at 120 rpm to perform main culture. The initial pH is the pH measured after the medium adjustment and before autoclaving.
本培養後の培養液をキムワイプを用いてろ過し、海藻を分離した。その後菌液を遠沈管に移し、6,500×gで15分間遠心分離後、上清をデカンテーションで捨てた。この後、RO水で菌体を懸濁し、6,500×gで10分間遠心分離、上清をデカンテーションで捨てる作業を2回行い、菌体を洗浄した。得られた菌体を-80℃で一晩以上凍結し、凍結乾燥機（EYELA FDS-1000型、東京理化器械(株)）で凍結乾燥した。実験は2連で行った。 After the main culture, the culture solution was filtered using Kimwipes to separate the seaweed. The bacterial solution was then transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 6,500 x g for 15 minutes, after which the supernatant was discarded by decantation. The bacterial cells were then suspended in RO water, centrifuged at 6,500 x g for 10 minutes, and the supernatant was discarded by decantation, a process that was repeated twice to wash the bacterial cells. The resulting bacterial cells were frozen at -80°C for at least one night, and lyophilized using a freeze dryer (EYELA FDS-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd.). The experiment was performed in duplicate.
ポリマー抽出
乾燥菌体を乳鉢によって破砕し、重量を測定した。乾燥菌体100 mgあたり5 mL程度のクロロホルムを添加し、ヒートブロックを用いて70℃で48時間抽出を行った。抽出後、フィルター(DISMIC(登録商標）-25HP、Advantec、PTFE、pore size 45μm)を用いて菌体を濾過し、ヒートブロックを用いて70℃で加熱し抽出液を乾固させた。抽出物が汚い場合は少量のクロロホルムで溶かした後、過剰量（約10倍以上）のヘキサンを加え、ポリマーを析出させた後ヘキサンを除き乾固させた。析出したポリマーの重量を実験前後の試験管重量から算出し、乾燥菌体重量からポリマーの蓄積率を算出した。
Polymer extraction The dried cells were crushed in a mortar and the weight was measured. About 5 mL of chloroform was added per 100 mg of dried cells, and extraction was performed at 70°C for 48 hours using a heat block. After extraction, the cells were filtered using a filter (DISMIC (registered trademark)-25HP, Advantec, PTFE, pore size 45 μm), and the extract was dried by heating at 70°C using a heat block. If the extract was dirty, it was dissolved in a small amount of chloroform, and then an excess amount (about 10 times or more) of hexane was added to precipitate the polymer, and the hexane was removed and dried. The weight of the precipitated polymer was calculated from the test tube weight before and after the experiment, and the polymer accumulation rate was calculated from the dry cell weight.
乾燥コンブを5wt%添加した培地の初発pHを変化させた結果、5-11-6-3株は、培地pHをpH 5.0とした際に最もP(3HB)蓄積率が高くなった(48.3 wt%)（表27）。また、5-25-4-2株では、pH 6.0でP(3HB)蓄積率が最大となった(50.0 wt%)。よって、5-11-6-3株と5-25-4-2株は、乾燥コンブを主原料としてもP(3HB)を合成可能であることが示された。
本発明はプラスチック工業分野において有用である。 The present invention is useful in the plastics industry.
配列番号１：微生物5-25-4-2株の16S rRNA遺伝子塩基配列
配列番号２：微生物5-11-6-3株の16S rRNA遺伝子塩基配列
配列番号３：微生物5-28-6-1株の16S rRNA遺伝子塩基配列
配列番号４：16S rRNA遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：16S rRNA遺伝子増幅用プライマー
配列番号６：18S rRNA遺伝子増幅用プライマー
配列番号７：18S rRNA遺伝子増幅用プライマー
SEQ ID NO: 1: 16S rRNA gene nucleotide sequence of microorganism 5-25-4-2 strain SEQ ID NO: 2: 16S rRNA gene nucleotide sequence of microorganism 5-11-6-3 strain SEQ ID NO: 3: 16S rRNA gene nucleotide sequence of microorganism 5-28-6-1 strain SEQ ID NO: 4: 16S rRNA gene amplification primer SEQ ID NO: 5: 16S rRNA gene amplification primer SEQ ID NO: 6: 18S rRNA gene amplification primer SEQ ID NO: 7: 18S rRNA gene amplification primer
Claims (10)
１）受託番号NITE P-02758またはNITE P-02759として寄託された微生物。
２）(ａ) 配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有する、微生物。
(ｂ) 配列番号１から３のいずれかに記載の塩基配列に対して90%以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含む16S rRNA遺伝子を有し、且つ海藻を唯一の炭素源としてPHA合成する、微生物。 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the microorganism is any one selected from the following 1) or 2) .
1) Microorganisms deposited under accession numbers NITE P-02758 or NITE P-02759.
2) (a) A microorganism having a 16S rRNA gene containing the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
(b) A microorganism having a 16S rRNA gene containing a base sequence having 90% or more identity to any of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3, and synthesizing PHA using seaweed as the sole carbon source.
前記工程で得られたPHAを含むプラスチック製品を得る工程を含む、バイオプラスチック製品の製造方法。 A method for producing a bioplastic product, comprising the steps of: carrying out the method according to any one of claims 1 to 9 to obtain a polyhydroxyalkanoic acid (PHA); and obtaining a plastic product comprising the PHA obtained in said step.
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| International Journal of Biological Macromolecules，2017年，Vol. 101，pp. 1029-1040 |
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