JP7488175B2

JP7488175B2 - 超音波処理装置

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Publication number: JP7488175B2
Application number: JP2020190806A
Authority: JP
Inventors: 研太郎上杉; 将策元原; 貴光岡山; 利征大西
Original assignee: Teijin Pharma Ltd
Current assignee: Teijin Pharma Ltd
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2024-05-21
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: JP2022079929A

Description

本発明は細胞やタンパク質、ＤＮＡ、化合物などのサンプルを含む溶液に対して超音波処理を行うための装置に関する。

超音波は液中照射に伴って発生する音響流やキャビテーションなどの現象を利用して、化学分析時の前処理や分注に使用されるノズルの洗浄など、生化学分野でも広く用いられている。

また、超音波はその熱的作用や機械的作用により、細胞やタンパク質、ＤＮＡ、化合物などを含むサンプル自身に様々な影響をもたらす。この影響を利用し、超音波は医療分野においても診断や治療目的で多くの研究開発が進められている。

生化学、医療分野においてｉｎｖｉｔｒｏ系で研究を進める際、研究の効率化を図るためにマイクロプレートを使用して、各ウェルに同一サンプルを加え、異なる条件の刺激を与えることで刺激の条件検討を行うことや、各ウェルに異なるサンプルを加え、同一条件の刺激を与えることでサンプル間の影響の違いを評価することが良く行われる。

同一条件で刺激を与える場合、与える刺激はウェル間で均一にする必要があるが、刺激に超音波を用いる場合、振動子から発振される超音波音圧分布の不均一性や複数振動子を使用する場合の振動子間の個体差、マイクロプレートの形状や材質、振動子とマイクロプレート間の媒質の状態など様々な要因によりウェル内に伝播する超音波音場のばらつきが生じる。

例えば、特許文献１に開示されたシステムでは、凹みをもった単一の超音波振動子から複数のチューブに同時に超音波処理を行うことで試験の効率化を図っているが、上記の通り、振動子から発振される超音波の音圧分布は均一ではないため、それぞれのチューブ内の音場にはばらつきが生じる可能性が高い。

このような事例への対策として、特許文献２に開示されたシステムでは２つの振動子から発振される超音波が直行するように振動子を配置し、直行する領域にマイクロプレートを設置、さらに超音波処理中にプレートを周回移動することで各ウェルに処理される超音波エネルギーの平均化を図っている。このような手法をとることで、各ウェル内の音場のばらつきは低減できるが、プレート全体に同時に超音波を処理する構造であるため、ウェル個々に対して超音波処理することはできない。

さらに特許文献３に開示されたシステムではマイクロプレートの個々のウェルに対応する数の振動子を配置し、個々のウェルに個々の振動子から超音波処理を行う機構であり、各振動子は個別に制御することが可能であるため、ウェルごとに超音波処理条件を変更することも可能である。さらにプレート上部からシーリング膜を介して超音波処理を行うことからプレートの形状や材質の影響も受けにくい。ただし、プレート上部から超音波処理を行う場合、ウェル内に空気層が存在すると超音波を反射してしまうため、ウェル内を溶液で満たす必要があり、液量が必要である。また、液量を抑えるためにプレート下部から超音波処理を行う場合は、プレートの底面形状や材質の影響を受けるため、ウェル内音場にばらつきが生じる可能性がある。

国際公開第２０１４／１３９６３０号国際公開第２０１２／０１７７３９号国際公開第２０１９／００３６０１号

本発明は上記の状況を鑑みてなされたものであって、少液量のサンプルを含む溶液が加えられたマイクロプレート内の個々のウェルに超音波処理が行えるシステムにおいて、各ウェルに処理される超音波エネルギーが均質になる機構を備えたものに関する。

本発明に係る超音波処理装置は、マイクロプレートの１つのウェル内に収まる集束幅をもった１つまたは複数の集束超音波振動子と、１つまたは複数の超音波振動子を駆動させるための駆動電源と、前記集束超音波振動子の上部にマイクロプレートを設置するためのプレート設置部と、マイクロプレートを固定するためのプレート固定部と、超音波を伝播させるための媒体が入った処理槽とを備える装置であって、前記集束超音波振動子に対して水平方向に前記マイクロプレートを移動させる機構と、超音波処理中に前記マイクロプレートに対して前記集束超音波振動子を垂直方向に上下動させる機構を備えることを特徴とする超音波処理装置である。

また本発明は、測定試料を充填した試料容器内に収まる集束幅をもった集束超音波振動子を備え、試料容器の底面から容器内の測定試料に超音波を照射する装置であり、超音波処理中に前記試料容器中の超音波集束位置を上下動させる振動子上下動機構を備えた超音波処理装置、特にマイクロプレートの１つのウェル内に収まる集束幅をもった１つまたは複数の集束超音波振動子を備え、マイクロウェルプレートマイクロプレートの底面からウェル内の測定試料に対してウェル毎に超音波を照射する装置であり、超音波処理中に前記ウェル中の超音波集束位置を上下動させる振動子上下動機構を備えた超音波処理装置を提供する。

更に本発明は、測定試料を充填した試料容器内に収まる集束幅をもった集束超音波振動子を備え、試料容器の底面から容器内の測定試料に超音波を照射すると共に、超音波処理中に前記試料容器中の超音波集束位置を上下動させることを特徴とする超音波処理方法、特に、マイクロウェルプレートの１つのウェル内に収まる集束幅をもった集束超音波を、マイクロウェルプレートの底面からウェル内の測定試料に対してウェル毎に超音波を照射すると共に、超音波処理中に前記ウェル中の超音波集束位置を上下動させることを特徴とする超音波処理方法を提供する。

本発明によれば、マイクロプレートの１つのウェル内に収まる集束幅をもった集束超音波振動子を有し、さらに前記マイクロプレートを前記集束超音波振動子に対して水平方向に移動させることで、単一の振動子で複数のウェルに対し超音波処理を行える。また、複数の振動子を備えることで、同時に複数ウェルの超音波処理が行えるため、評価の効率化につながる。さらに、各振動子を駆動させるための電気的パラメータを制御することで、各振動子を別々の超音波条件で駆動させる、あるいはマイクロプレートの超音波処理中に振動子を駆動させるための電気的パラメータを変化させることで、ウェル毎に異なる条件の超音波処理を行うことが可能である。加えて、超音波処理中に集束超音波振動子を上下動させることで、ウェル内の超音波集束領域も上下動するため、ウェル内音場が平均化され、振動子間の製造誤差、および／またはマイクロプレートの形状や材質によるウェル内に発生する音場のばらつきを軽減することができる。

本発明の超音波処理装置の断面概略図。本発明の超音波処理装置の上面概略図。本発明の超音波処理装置におけるマイクロプレート底面の空気除去機構を示す断面概略図。マイクロプレートに対する集束超音波の照射状態を示す模式図。本発明の超音波処理装置を用いた実験結果。本発明の超音波処理装置を用いた処理方法を示すステップ図。

以下、本発明の実施の形態に係る好ましい実施例である超音波処理装置を、図面を参照して説明する。

［超音波処理装置］
図１～３を用いて、本発明の実施の形態に係る超音波処理装置の概略を説明する。本実施の形態に係る超音波処理装置１は、細胞やタンパク質、ＤＮＡ、化合物などのサンプルを含む溶液に超音波処理を行うために用いられる。

本実施の形態に係る超音波処理装置１は、マイクロプレート２の１つのウェル内に収まる集束幅をもった１つまたは複数の集束超音波振動子３と、１つまたは複数の超音波振動子を駆動させるための駆動電源４と、前記集束超音波振動子の上部にマイクロプレート２を設置するためのプレート設置部５と、マイクロプレート２を固定するためのプレート固定部６と、超音波を伝播させるための媒体が入った処理槽７と、前記集束超音波振動子に対して水平方向に前記マイクロプレート２を移動させるプレート移動機構８と、超音波処理中に前記マイクロプレート２に対して前記集束超音波振動子を垂直方向に上下動させる上下動機構９と、を備える。

また、上記に加え、処理槽内の媒体の温度を任意の温度に保持する恒温機構１０を備えても良く、前記マイクロプレート２の底面に混入した空気を排除するための空気除去機構１１を備えても良い。

本実施の形態において、マイクロプレート２は例えばポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のようなプラスチック材料から作られる標準的なマイクロプレートのことを言う。本超音波処理装置で使用されるマイクロプレート２は、好ましくは、円筒平底のウェルで、９６個のウェルが１２行８列に配列されたマイクロプレートを使用すると良いが、ウェル数、配置、容量などはこれに限定されるものではない。マイクロプレートの底面には、超音波伝搬の障害となる空気層ができないように、ウェル全体を覆う底板を備えるのが好ましい。

ウェル内には成分や濃度などが同一のサンプル溶液が入れられても良いし、異なる溶液が入れられても良い。また、溶液が超音波照射によりマイクロプレート２のウェルに含まれるサンプル溶液が飛散しないようにマイクロプレート２の上面にＰＰやＰＥＴのようなプラスチック材料、またはアルミニウムやシリコン、ポリオレフィン等で作られるシーリング膜を貼ると良い。

本実施の形態において、集束超音波振動子３とは、例えば超音波処理面が凹面形状である圧電素子であり、図４に示すようにマイクロプレート２の１つのウェル内に照射した超音波が集束するように設計されている。超音波処理装置に備える集束超音波振動子３の数
は１つでも良いし、複数でも良い。複数本備えることで、複数のウェルに対して同時に超音波処理を行えるため、総超音波処理時間の削減につながり、評価の効率が向上する。

照射する超音波がウェル底面から垂直方向にあたるようにマイクロプレート２はプレート設置部５に水平に設置し、プレート固定部６で固定すると共に、集束超音波振動子３は超音波処理面がプレート設置部５に対して水平になるように振動子固定部１２に固定されている。

本実施の形態において、超音波を駆動させるための駆動電源４とは超音波振動子に任意の電力を供給し、超音波振動子を発振させるためのものである。当該駆動電源は単一の振動子に電力を供給しても良いし、複数の振動子に同時に電力を供給しても良い。また、振動子に供給する電気的パラメータ（例えば、電圧、パルス幅、周波数など）は振動子毎に任意の値に制御することができ、１つのウェルへの超音波処理を行う度に変更しても良い。振動子に供給する電気的パラメータの制御により、振動子から処理される超音波の条件（音圧、周波数、パルス幅、繰り返し周波数、デューティサイクルなど）を制御できる。好ましくは、発振される超音波の周波数は１００ｋＨｚから１０ＭＨｚである。

本実施の形態において処理槽７は集束超音波振動子３から発振される超音波のウェル内への伝播を妨げないよう媒質で満たされている。媒質とは例えば水であり、好ましくは脱気水であるが、これに限定されるものではない。脱気することで水の中に存在する溶存気体による超音波処理中の媒質中における気泡発生や、超音波エネルギーの減衰を低減することができるため、効率よくウェル内へ超音波を伝播させることができる。また、脱気状態を実験毎に合わせることでウェル内に伝播する超音波エネルギーのばらつきを低減できる。

本実施の形態においてプレート固定部６は使用するマイクロプレート２に嵌合するように設計されており、プレート設置部５から垂直に伸びている位置決めピン１３にはめ込むことで、プレート設置部５に水平にマイクロプレート２を設置することができる。マイクロプレート２の位置は処理層の水面以下になる位置とし、さらに、マイクロプレート設置後にマイクロプレート２が動かないように、プレート設置部５に対してプレート固定部６を押し付けるための押し付け力を付与する固定手段１４を備えても良い。

図１に示すように、プレート設置部５はプレート移動機構８に接続されている。プレート移動機構８とは、例えばステッピングモーターにより移動距離を制御できる自動ＸＹステージである。ステッピングモーターコントローラによりモーターの回転数を制御することで、プレート設置部を水平面内の任意の位置に移動させることができる。プレート設置部の移動距離および待機時間を制御することで、マイクロプレート２の任意のウェルに任意の時間、超音波処理を行うことができる。例えば、プレート設置部５を一定の時間間隔でウェル間距離移動させると、各ウェルに同一時間の超音波処理を行うことができる。

図２に示すように、振動子固定部１２は振動子上下動機構９に接続されている。振動子上下動機構９は、例えばモーターの回転を上下方向の運動に変換できるようなカム機構である。超音波処理中にモーターに電力を供給することで、振動子固定部１２が任意の距離を繰り返し上下動する。前記振動子上下機構は自動Ｚステージでも良い。また、振動子固定部またはプレート設置部は取り付ける振動子の集束距離に合わせて振動子とプレート間の距離を調整できる上下位置調整機構を備えても良い。さらに、複数の振動子を取り付ける場合、個々の振動子の集束距離に合わせて、振動子毎に上下方向の振動子取り付け位置が異なっていても良い。

超音波を溶液中に照射すると液面で反射して照射波と反射波が重なり合い、定在波が発
生する。この定在波は波長の４分の１および４分の３でキャビテーションが発生する負圧が強くなるポイントが来ることから、溶液中でこのキャビテーション発生ポイントの数がそろうように、振動子の上下動範囲は波長の４分の１以上が望ましいが、これに限るものではない。例えば、照射する超音波の周波数が１ＭＨｚの場合、水中における波長は約１．５ｍｍとなり、ウェル底面から６ｍｍの高さまでサンプルを入れた場合、超音波の集束位置を３ｍｍとし、±１．５ｍｍの上下動するように設定することができる。９６穴プレートのウェルの高さは一般に１０ｍｍ程度であり、上下動の幅は固定値でも良いが、測定サンプルの液量によりウェル中のサンプルの高さが変わることから、液量高さに応じて上下動の幅を変更することが出来るのが望ましい。

かかる上下動機構９により超音波処理中に集束超音波振動子３を上下動させることで、超音波の集束点（音圧が最も高い点）がウェル内の溶液内で上下動することで全体に行き渡り、かつサンプルに照射される超音波エネルギーは時間的に平均化されるため、溶液中に分散するサンプルが受ける超音波エネルギーのばらつきは低減される。

本実施の形態においては、恒温機構１０として、例えば温度制御機能を搭載したヒーターを搭載することが出来る。媒体温度はサンプルの状態（例えば、細胞活性など）やキャビテーションの発生に影響を受けるため、媒体温度を毎実験一定にすることで、実験間誤差を低減することができる。

マイクロプレート２をプレート設置部５に固定する時、プレート底面に空気層が生じた場合には、媒体と空気の境界面で超音波が反射し、ウェル内に到達できる超音波エネルギーが非常に小さくなる。本願発明の超音波処理装置の態様では、図３に示すように、空気除去機構１１として、排気ポンプを備える。排気ポンプは、例えばマイクロプレート底面の周囲にある溝１５から空気除去ピン１６を介してプレート底面に混入した空気を吸引除去することができる。

また、空気除去機構１１には空気除去ピン１６を介してマイクロプレート底面に空気を送る給気ポンプを備えても良い。空気除去ピン１６はプレート底面の周囲に配置されているため、例えばプレート底面中央部のみに空気が混入している場合は、その空気を除去することができない。そのような場合、給気ポンプによりマイクロプレート底面に空気を送ることで、一度プレート底面全面を空気で満たすことで、プレート底面の周囲に配置されている空気除去ピンから排気ポンプによりプレート底面の空気を除去することができるようになる。

図５に各ウェルに同一条件の活性酸素検出試薬（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）を含む溶液を入れた９６穴プレートに本発明の実施の形態に係る超音波処理装置を使用して、超音波処理を行った結果を示す。Ｈ２ＤＣＦＤＡを使用することで、溶液への超音波処理に伴うキャビテーションにより発生する活性酸素を検出できるため、各ウェルに対するキャビテーション発生量を間接的に示すことができる。図５に示す通り、上下動機構を使用することで、エラーバーが示すウェル間およびプレート間の活性酸素発生量のばらつきが低減できることを示唆している。

上述のとおり、図１から図３には、試料容器としてマイクロプレートを用い、超音波振動子に対して水平方向にマイクロプレートを移動させるプレート移動機構、振動子上下動機構を備え、超音波処理中に各ウェル中での超音波集束位置を上下動させる超音波処理装置の態様例を示したが、本発明は、かかる水平方向のプレート移動機構を備えない超音波処理装置にも適用可能である。

また、マイクロプレート以外の他の試料容器を用いることができ、測定試料を充填した
試料容器内に収まる集束幅をもった集束超音波振動子を備え、試料容器の底面から容器内の測定試料に超音波を照射すると共に、超音波処理中に前記試料容器中の超音波集束位置を上下動させる振動子上下動機構を備えた超音波処理装置にも適用可能である。

［サンプル溶液の超音波処理方法］
以下、図６を参照して本発明によるサンプル溶液の超音波処理方法の実施形態を説明する。

まず、ステップＳ１に示すように、複数のウェルにサンプル溶液が入れられたマイクロプレートを用意する。サンプル溶液が入れられたマイクロプレート上部には超音波照射中にサンプル溶液が飛散しないよう、シーリング膜を貼付すると良い。

次いで、ステップＳ２、ステップＳ３に示すように、サンプル溶液が入れられたマイクロプレートを超音波処理装置に設置すると共に、マイクロプレート底面に空気が混入した場合には、混入した空気を空気除去機構により除去する。

そして、ステップＳ４に示すように、サンプル溶液の入ったマイクロプレートに対して、超音波処理を開始する。使用する超音波振動子によっては、照射される超音波の音圧が安定するまでに時間を要するものもあるため、そのような場合は、サンプル溶液の入っていないウェル、あるいはマイクロプレートの外側に対して予備照射を行い、音圧の安定化待ちの時間を設けても良い。超音波照射を開始するタイミングで、超音波振動子の上下動を開始する。予備照射を設ける場合は予備照射中に上下動を開始しても良い。

超音波照射開始後は、マイクロプレートがプレート移動機構により移動することで、ウェルごとに超音波処理を行うことができる。この際、ウェルごとに照射される超音波条件は試験条件により決定し、同一でも良いし、異なっても良い。プレートの移動距離は任意に設定することができるため、例えば１ウェルごとに移動させることもできるし、１ウェルおきに移動させることで超音波処理をしないウェルを設定することも可能である。

本発明によれば、細胞やＤＮＡ、タンパク質、化合物を含む様々なサンプル溶液にばらつきの少ない超音波処理を行うことができるため、超音波により細胞等におこる現象の解明や超音波により活性化する化合物のスクリーニングなどに利用できる。

１超音波処理装置
２マイクロプレート
３集束超音波振動子
４駆動電源
５プレート設置部
６プレート固定部
７処理槽
８プレート移動機構
９上下動機構
１０恒温機構
１１空気除去機構
１２振動子固定部
１３位置決めピン
１４固定手段
１５溝
１６空気除去ピン

Claims

マイクロプレートの１つのウェル内に収まる集束幅をもった集束超音波振動子と、集束超音波振動子を駆動させるための駆動電源と、前記集束超音波振動子の上部にマイクロプレートを設置するためのプレート設置部と、マイクロプレートをプレート設置部に固定するためのプレート固定部と、マイクロプレートに対して超音波を伝播させるための媒体が入った処理槽とを備える装置であって、前記集束超音波振動子に対して水平方向に前記マイクロプレートを移動させるプレート移動機構と、超音波処理中に前記マイクロプレートに対して前記集束超音波振動子を垂直方向に上下動させる振動子上下動機構を備え、前記振動子上下動機構が、照射する超音波の４分の１波長以上の上下動を行うことを特徴とする超音波処理装置。
前記プレート移動機構が、マイクロプレートのウェル毎に超音波照射位置を移動可能な自動ＸＹステージであることを特徴とする請求項１記載の超音波処理装置。
前記マイクロプレート底面に存在する空気を除去する空気除去機構を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の超音波処理装置。
前記空気除去機構が、マイクロプレートの底面に対して空気を送る送気用ポンプと、マイクロプレートの底面から空気を除去する排気用ポンプであることを特徴とする請求項３に記載の超音波処理装置。
前記処理槽内の媒体の温度を一定にするための恒温機構を備えることを特徴とする請求項１に記載の超音波処理装置。
前記マイクロプレートは９６ウェルプレートであることを特徴とする請求項１に記載の超音波処理装置。
前記集束超音波振動子から発生させる超音波の周波数は１００ｋＨｚ～１０ＭＨｚであることを特徴とする請求項１に記載の超音波処理装置。
マイクロプレートの１つのウェル内に収まる集束幅をもった集束超音波振動子と、集束超音波振動子を駆動させるための駆動電源と、前記集束超音波振動子の上部にマイクロプレートを設置するためのプレート設置部と、マイクロプレートをプレート設置部に固定するためのプレート固定部と、マイクロプレートに対して超音波を伝播させるための媒体が入った処理槽とを備える装置であって、前記集束超音波振動子に対して水平方向に前記マイクロプレートを移動させるプレート移動機構と、超音波処理中に前記マイクロプレートに対して前記集束超音波振動子を垂直方向に上下動させる振動子上下動機構を備えると共に、前記マイクロプレート底面に存在する空気を除去する空気除去機構を備え、前記空気除去機構が、マイクロプレートの底面に対して空気を送る送気用ポンプと、マイクロプレートの底面から空気を除去する排気用ポンプであることを特徴とする超音波処理装置。