JP7476171B2 - 免疫チェックポイント阻害のための組成物および方法 - Google Patents

Description

優先権の主張
この出願は、２０１８年９月７日に出願された米国特許出願第６２／７２８，４５９号、および２０１９年１月１０日に出願された米国特許出願第６２／７９０，９５３号の恩典を主張し、それらの特許出願の全内容は参照により本明細書に組み入れられている。

連邦支援による研究または開発
この発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＣＡ１６３４６１による政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

技術分野
免疫チェックポイント分子、例えば、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的化する阻害性核酸、例えば、ｓｉＲＮＡに連結されたナノ粒子を用いる、癌、例えば、膵癌を処置するための治療的組成物および方法が本明細書に記載される。

近年、免疫療法を用いる様々な悪性腫瘍の処置において目覚ましい進歩が見られる。最も有望なアプローチの一つは、免疫チェックポイント阻害剤を含む。

癌免疫療法についてのチェックポイント阻害の有望さにも関わらず、その応答は、一般的に変動し、多数の患者が応答することができない。ＦＤＡ認可のＰＤ－Ｌ１阻害剤の注目すべき例には、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）^２１についてのアテゾリズマブ、および局所進行性または転移性尿路上皮癌腫についてのデュルバルマブ^２２が挙げられる。しかしながら、膀胱癌についてのアテゾリズマブの最初の励まされる結果および迅速な認可にも関わらず^{２３、２４}、確認試験は、それの全生存の主要評価項目を達成することができなかった^２５。同様に、非小細胞肺癌の一次処置としてのトレメリムマブと併用したデュルバルマブの第ＩＩＩ相試験は、それの無進行生存の主要評価項目を満たすことができなかった^２６。

ゲムシタビンなどの化学療法剤と、免疫チェックポイント分子阻害剤、例えば、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１と名づけられたプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤を組み合わせることを含む、癌を処置するためのストラテジーが本明細書に記載される。例として、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１は、磁性ナノ担体（ＭＮ）にコンジュゲートされた、ＰＤ－Ｌ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＰＤＬ１）を組み入れている。本明細書に示されているように、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の腫瘍への送達は、非侵襲性磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により半定量的にモニターすることができ、ＭＮ担体は超常磁性であるからである。同系マウス膵癌モデルにおけるゲムシタビンなどの化学療法剤およびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１からなる併用療法は、腫瘍成長の有意な低下および生存率の増加を生じた。用量最適化後、腫瘍容積の９０％低下が、処置の開始から３週間後に達成された。対照動物の１００％が、処置の開始後の６週間目までに彼らの腫瘍で死んだが、５週間目まで実験群における死亡はなく、実験動物の６７％が１２週間、生存した。これらの方法は、有効な処置がない難治性疾患、およびほんの１％の５年生存率によって特徴づけられる難治性疾患における治療効果のために用いることができる。

したがって、治療用ナノ粒子が本明細書に提供され、前記ナノ粒子が、１０ｎｍ～３０ｎｍの間の直径を有し、かつ、好ましくは、酸化鉄コア、ポリマーコーティング、および前記ナノ粒子へ共有結合性に連結されている、免疫チェックポイント分子、例えば、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的化する阻害性核酸を含む。

いくつかの実施形態において、前記核酸は、配列番号１に相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記核酸は、少なくとも１個の改変ヌクレオチド、例えば、ロックドヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、ポリマーコーティングは、デキストランを含む。

いくつかの実施形態において、前記核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。

いくつかの実施形態において、前記核酸は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を含む化学的部分を通して、ナノ粒子へ共有結合性に連結されている。

いくつかの実施形態において、ナノ粒子は磁性である。

本明細書に記載された治療用ナノ粒子、および任意で、化学療法剤を含む薬学的組成物もまた提供される。

さらに、癌を有する対象を処置するための方法が提供される。その方法は、本明細書に記載されているような治療用ナノ粒子の治療的有効量を、好ましくは化学療法剤と併用して、癌を有する対象に投与することを含む。対象において癌を処置することにおける使用のための、好ましくは化学療法剤と併用した、本明細書に記載されているような治療用ナノ粒子もまた提供される。

いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、および子宮癌からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、方法は、対象における癌細胞の位置もしくは数、または対象における治療用ナノ粒子の位置を決定するために対象の組織を画像化することを含む。

いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、対象に２回以上の用量で投与される。いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも週１回、対象に投与される。

いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、または腹腔内投与により対象に投与される。

いくつかの実施形態において、対象は膵癌を有する。

いくつかの実施形態において、化学療法剤はゲムシタビンである。

本明細書に記載された磁性粒子のいずれかを含有する薬学的組成物もまた提供される。

癌を有する対象に治療用ナノ粒子（本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）を投与することを含む、癌（例えば、膵癌）を有する対象において腫瘍成長を減少させるための方法であって、前記治療用ナノ粒子が、前記対象において腫瘍成長を減少させるために十分な量で投与される、方法もまた提供される。いくつかの実施形態において、癌細胞は、乳癌細胞、結腸癌細胞、腎癌細胞、肺癌細胞、皮膚癌細胞、卵巣癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、直腸癌細胞、胃癌細胞、甲状腺癌細胞、および子宮癌細胞からなる群から選択される。これらの方法のいくつかの実施形態は、対象における癌細胞の位置もしくは数、または対象における治療用ナノ粒子の位置（例えば、治療用磁性ナノ粒子または共有結合性に連結されたフルオロフォアを含有する治療用ナノ粒子の位置）を決定するために対象の組織を画像化することをさらに含む。

別の態様において、本開示は、対象において転移性癌を処置する方法を記載する。これらの方法は、転移性癌を有する対象に治療用ナノ粒子（本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）を投与するステップであって、前記治療用ナノ粒子が、対象において転移性進行を阻害するのに十分な量で投与される、ステップを含む。いくつかの実施形態において、転移性癌は、原発性膵癌に起因する。いくつかの実施形態において、投与するステップは、対象における、原発性もしくは転移性腫瘍サイズの減少（例えば、有意な、検出可能な、または観察可能な減少）もしくは安定化、または原発性もしくは転移性腫瘍成長の速度の減少（例えば、有意な、検出可能な、または観察可能な減少）を生じる。

本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、治療用ナノ粒子は、対象に複数回の用量で投与することができる。本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、対象に少なくとも週１回、投与される。本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、または腹腔内投与により対象に投与される。本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、対象は、化学療法剤をさらに投与される。

用語「磁性」は、磁場に応答性である組成物を記載するために用いられる。磁性組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）の非限定的例は、常磁性、超常磁性、強磁性、または反磁性である材料を含有し得る。磁性組成物の非限定的例は、マグネタイト、フェライト（例えば、マンガン、コバルト、およびニッケルのフェライト）、酸化Ｆｅ（ＩＩ）、およびヘマタイト、ならびにそれらの金属合金の群から選択される酸化金属を含有する。追加の磁性材料は、本明細書に記載され、かつ当技術分野において知られている。

用語「反磁性の」は、１以下である相対的透磁率を有し、かつ磁場によって反発される組成物を記載するために用いられる。

用語「常磁性の」は、外部から印加された磁場の存在下でのみ磁気モーメントを発生する組成物を記載するために用いられる。

用語「強磁性の」または「強磁性の」は、磁場に対して感受性が高く、かつ外部から印加された磁場が除去された後、磁気的性質（磁気モーメント）を保持する能力がある組成物を記載するために用いられる。

用語「ナノ粒子」とは、約２ｎｍ～約２００ｎｍの間（例えば、１０ｎｍから２００ｎｍの間、２ｎｍから１００ｎｍの間、２ｎｍから４０ｎｍの間、２ｎｍから３０ｎｍの間、２ｎｍから２０ｎｍの間、２ｎｍから１５ｎｍの間、１００ｎｍから２００ｎｍ、および１５０ｎｍから２００ｎｍの間）の直径を有する物体を意味する。ナノ粒子の非限定的例には、本明細書に記載された治療用ナノ粒子が挙げられる。

用語「磁性ナノ粒子」とは、（本明細書に定義されているように）磁性があるナノ粒子（本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）を意味する。磁性ナノ粒子の非限定的例は本明細書に記載されている。追加の磁性ナノ粒子は当技術分野において知られている。

用語「ポリマーコーティング」とは、３次元物体（例えば、酸化金属などの磁性材料を含有する３次元物体）の表面に塗布された少なくとも１つのポリマー（例えば、デキストラン）の少なくとも１つの（例えば、均一なまたは不均一な）分子層を意味する。ポリマーコーティングを生成するために用いることができるポリマーの非限定的例は、本明細書に記載されている。ポリマーコーティングを生成するために用いることができるポリマーの追加の例は、当技術分野において知られている。物体（例えば、磁性材料を含有する３次元物体）にポリマーコーティングを適用するための方法は、本明細書に記載され、当技術分野においても知られている。

用語「核酸」とは、任意の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源）を意味する。核酸という用語は、少なくとも１個の改変ヌクレオチド（例えば、塩基における改変および／または糖における改変を含有する）、および／または２個のヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合における改変を含有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１個のロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）を含有することができる。核酸の非限定的例は本明細書に記載されている。核酸の追加の例は当技術分野に知られている。

用語「改変ヌクレオチド」とは、それの塩基における少なくとも１つの改変、および／またはそれの糖（リボースまたはデオキシリボース）における少なくとも１つの改変を含有するＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを意味する。改変ヌクレオチドはまた、核酸配列における２個の隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を形成する原子における改変を含有し得る。

用語「フルオロフォア」とは、第１の波長での光を吸収し、かつ第２の波長での光を放射する分子であって、前記第１の波長が前記第２の波長より短い（より高いエネルギー）、分子を意味する。いくつかの実施形態において、フルオロフォアによって吸収される第１の波長は、近赤外範囲にあり得る。フルオロフォアの非限定的例は本明細書に記載されている。フルオロフォアの追加の例は当技術分野において知られている。

用語「近赤外光」とは、約６００ｎｍから約３，０００ｎｍの間の波長を有する光を意味する。

用語「ターゲティングペプチド」とは、標的細胞（例えば、癌細胞）の形質膜の中または上に存在する分子（例えば、タンパク質、糖、もしくは脂質、またはそれらの組合せ）により結合されるペプチドを意味する。本明細書に記載されているように、ターゲティングペプチドは、第２の分子または組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）へ共有結合性に連結されて、その第２の分子または組成物を標的細胞（例えば、癌細胞）へ標的化することができる。いくつかの実施形態において、第２の分子または組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）へ共有結合性に連結されているターゲティングペプチドは、標的化された細胞による第２の分子または組成物の取り込み（例えば、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスによる細胞取り込み）を生じる。ターゲティングペプチドの非限定的例は本明細書に記載されている。ターゲティングペプチドの追加の例は当技術分野において知られている。

用語「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、細胞においてＲＮＡ干渉を媒介する能力がある二本鎖核酸分子を意味する。ＲＮＡ干渉の過程は、Ｅｂａｌｓｈｉｒら（Nature 411:494-498, 2001）に記載されている。ｓｉＲＮＡの各鎖は、１９ヌクレオチド長から２３ヌクレオチド長の間であり得る。本明細書で用いられる場合、ｓｉＲＮＡ分子は、天然または内因性ＲＮＡヌクレオチドのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学修飾ヌクレオチドをさらに包含することができる。ｓｉＲＮＡの非限定的例は、本明細書に記載されている。ｓｉＲＮＡの追加の例は、当技術分野において知られている。

句「腫瘍成長」とは、対象における腫瘍量の増大を意味する。腫瘍成長の非限定的例には、新しい腫瘍細胞の形成、既存腫瘍細胞の増殖、既存腫瘍細胞におけるアポトーシスに対する抵抗性が挙げられる。腫瘍成長を検出および決定するための例示的な方法は、本明細書に記載されている。腫瘍成長を検出および決定するための追加の方法は、当技術分野において知られている。

用語「転移」とは、対象における、原発性腫瘍に存在する癌細胞の二次の非隣接組織への遊走を意味する。転移の非限定的例には、原発性腫瘍からリンパ節（例えば、局所リンパ節）、骨組織、肺組織、肝臓組織、および／または脳組織への転移が挙げられる。転移という用語はまた、リンパ節に見出される転移性癌細胞の二次組織（例えば、骨組織、肝臓組織、または脳組織）へ遊走もまた含む。いくつかの非限定的実施形態において、原発性腫瘍に存在する癌細胞は、乳癌細胞、結腸癌細胞、腎癌細胞、肺癌細胞、皮膚癌細胞、卵巣癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、直腸癌細胞、胃癌細胞、甲状腺癌細胞、または子宮癌細胞である。転移の追加の態様および例は、当技術分野において知られ、または本明細書に記載されている。

用語「原発性腫瘍」とは、腫瘍進行が始まって、癌性塊の生成へと進む解剖学的部位に存在する腫瘍を意味する。いくつかの実施形態において、医師は、対象における原発性腫瘍の部位をはっきりと同定することができない場合がある。

用語「転移性腫瘍」とは、対象において原発性腫瘍から転移した腫瘍細胞から生じた対象における腫瘍を意味する。いくつかの実施形態において、医師は、対象における原発性腫瘍の部位をはっきりと同定することができない場合がある。

用語「リンパ節」とは、リンパ管によりリンパ系に接続されている、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、およびマクロファージを含む様々な細胞を含有する免疫系の小さい球状または楕円形の器官を意味する。様々なリンパ節が哺乳動物に存在し、そのリンパ節には、腋窩リンパ節（例えば、側腺、前腺もしくは胸部腺、後腺もしくは肩甲下腺、中心腺もしくは中間腺、または内側腺もしくは鎖骨上腺）、センチネルリンパ節、顎下リンパ節、前頚部リンパ節、後頚部リンパ節、鎖骨上リンパ節、オトガイ下リンパ節、大腿リンパ節、腸間膜リンパ節、縦隔リンパ節、鼠径リンパ節、亜区域（subsegmental）リンパ節、区域（segmental）リンパ節、大葉（lobar）リンパ節、葉間（interlobar）リンパ節、肺門リンパ節、滑車上腺、三角筋胸筋腺、浅鼠径リンパ節、深鼠径リンパ節、上腕リンパ節、および膝窩リンパ節が挙げられるが、それらに限定されない。

用語「画像化」とは、生物物理学的技術（例えば、電磁エネルギー吸収および／または放射）を用いる対象の少なくとも１つの組織の可視化を意味する。画像化の非限定的実施形態には、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、および光学的画像法が挙げられる。

句「腫瘍サイズの安定化」とは、時間が経って対象において腫瘍の総容積または近似容積のわずかなまたは検出不可能な変化のみがある状態に腫瘍が達していることを意味する。

句「腫瘍成長の速度」とは、対象における、時間経過による腫瘍の総容積もしくは近似容積の変化、または腫瘍に存在する細胞の総数もしくは近似数の変化を意味する。腫瘍成長の速度は、本明細書に記載された例示的な方法を用いて決定することができる。腫瘍成長の速度を決定するための追加の方法は、当技術分野において知られている。

他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている；当技術分野において知られた他の適切な方法および材料もまた用いることができる。材料、方法、および例は、例証となるのみであり、限定することを意図されない。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、支配する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

図１Ａ～Ｂは、例示的なＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の構造、合成、および特徴づけを示す図である。Ａ． ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１は、２０ｎｍアミノ化デキストランコーティング化超常磁性酸化鉄ナノ粒子のヘテロ二官能性不安定性リンカーＳＰＤＰおよびＰＤ－Ｌ１に対するｓｉＲＮＡへの連続的コンジュゲーションにより合成された。Ｂ． ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１特徴づけ。 図２Ａ～Ｃは、画像ガイドのＭＮ－ｓｉＲＮＡの腫瘍への送達を示す図である。Ａ． 腫瘍保有動物のＴ２マップ。腫瘍組織におけるＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の局在は、Ｔ２緩和時間の短縮を引き起こし、造影剤投与前の画像と比較して、陰性コントラストを生じた。Ｂ． 処置の最初の３週間の間の実験動物および対照動物における腫瘍関心領域（ＲＯＩ）に渡るＭＮ－ｓｉＰＤＬ１濃度測定。ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の蓄積は、処置の最初の３週間の間、ＭＮ－ｓｉＳＣＲの蓄積より１．５倍速かった。Ｃ． 処置の３週間目～１２週間目の間の実験動物および対照動物における腫瘍関心領域（ＲＯＩ）に渡るＭＮ－ｓｉＰＤＬ１濃度測定。ＭＮ－ｓｉＳＣＲで処置された対照群におけるその作用物質の濃度は、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１で処置された実験群においてより、５．１倍速く、減少した。 図３Ａ～Ｄは、ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１での併用処置を示す図である。Ａ． 処置の過程の間における代表的な色分けされたＴ２強調ＭＲ画像。Ｂ． 処置中の腫瘍容積の変化。ゲムシタビンと組み合わせた、高用量活性ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１治療用物質と不活性ＭＮ－ｓｉＳＣＲ治療用物質との間で、応答が、早くも２週間目から、有意に異なった。低用量ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１群において、この差は、６週間目後に明らかだった。Ｃ． ＭＮ－ｓｉＳＣＲ＋ゲムシタビンに対する、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１＋ゲムシタビンで処置された動物における生存の向上を示す、カプラン・マイアー生存分析。Ｄ． 対照腫瘍における壊死および潰瘍化を示す、６週間目における腫瘍保有マウスの写真。 上記と同様。 図４Ａ～Ｂは、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１およびゲムシタビンで処置されたマウス由来の腫瘍の免疫蛍光を示す図である。効率的なＰＤ－Ｌ１阻害、ＴＩＬ動員および活性化、Ｔｒｅｇ減弱、ならびに腫瘍細胞増殖の阻害を示す、Ａ：代表的な顕微鏡写真およびＢ：蛍光シグナル強度の定量的分析。ＴＬ：Ｔリンパ球；ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球；Ｔｒｅｇ：制御性Ｔ細胞；Ｋｉ－６７：増殖。 上記と同様。 図５Ａ～Ｄは、ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１での併用処置を示す図である。処置群のそれぞれについての処置中の腫瘍容積の変化。Ａ：ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１高用量レスポンダー；Ｂ：ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１高用量ノンレスポンダー；Ｃ：ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１低用量；Ｄ：ＭＮ－ｓｉＳＣＲ（スクランブル対照）。本研究についての試料サイズは６であった。高用量群において、応答しなかった、すなわち、腫瘍容積が退縮しなかった、２匹のマウスがあった；それらの結果は図５Ｂに示されている。 上記と同様。 癌細胞におけるＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの阻害についての例示的なナノドラッグ（ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１）の調製の追加の詳細に関する概略を示す図である。

大いに期待できるとは言え、チェックポイント阻害剤に関する臨床結果は、応答のばらつきを示している。特に、膵癌は、最初の免疫療法アプローチに対する抵抗性が判明している。

膵癌は、米国において癌関連死の４番目に多い原因であり、全体の５年生存率はたった８％である^１。外科的切除は、依然として、切除可能な疾患を有する患者についての最適な処置である。しかしながら、診断された患者の２０％未満が治癒的切除に適しており^２、患者の３０％が局所疾患を示し、５０％が遠隔転移を示し^３、それぞれ、１１％および２％の生存率である^１。そのような予後不良の背後にある理由は、診断時点においての進行期^２および標準化学療法に対する抵抗性^４を含むと仮定されている。化学抵抗性を与えると想像される以下の複数の因子がある：線維形成性間質の形成が薬物送達を制限すること、反応性酸素種、サイトカイン、および／または成長因子による膵臓星状細胞の活性化、ならびに活性化星状細胞の免疫抑制性シグナル伝達分子の分泌^４、５。膵癌の複雑な腫瘍生物学によって、複数の併用化学療法が登場している。そのようなものとして、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（５－フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、およびオキサリプラチンからなる組合せ）、およびゲムシタビン／ｎａｂ－パクリタキセルが、標準ゲムシタビン単剤療法処置と比較して全生存の向上を示している^６、７。しかしながら、これらの併用療法は、患者の全体的な健康に大きく依存し、最近の細胞傷害性併用療法についての全体の延命効果は、たった約２～５カ月である。

膵癌において、チェックポイント阻害剤に基づいた治療の進歩は、期待外れの臨床結果を示している。第ＩＩ相試験において、抗ＣＴＬＡ－４、イピリムマブ単剤療法は、無効であり、その試験からレスポンダーは生じなかった^２７。同様に、多施設第Ｉ相試験において、抗ＰＤＬ－１抗体が、様々な進行癌患者において静脈内に投与された。募集された１４人の膵癌患者のうち、客観的応答は報告されなかった^２８。

この疾患により引き起こされる甚だしい苦痛およびこれまで細胞傷害性処置で達成されたささやかな進展を踏まえると、複数の角度からその疾患を攻撃する治療への抜本的、変革的なアプローチを探索する必要があることは明らかである。

この１０年間、癌免疫療法の分野においてとてつもない進歩が見られた。実際、免疫療法は、１９４０年代の最初の化学療法の開発以来、最も有望な新しい癌処置アプローチを表している。チェックポイント阻害剤は、黒色腫およびいくつかの肺癌などの致死性癌に対して奏効しており（時には、劇的な成功を生じることがある）、数十の他の癌型において試験されつつある^８、９。しかし、膵癌は、通常の薬物で処置することは難しいことが判明しており、最初の免疫療法アプローチに対して抵抗性を示している。一つには、これについての理由は、膵臓腺癌を特徴づける複雑な腫瘍微小環境である。主に、本来の免疫抑制性と、抗体およびＴリンパ球浸潤についての物理的バリアとの両方である線維形成性腫瘍形質の存在^１０。それゆえに、以下を組み合わせる代替アプローチを設計することが重要である：腫瘍細胞および腫瘍常在性マクロファージへ効率的に送達することができる革新的チェックポイント阻害剤、ならびにＴリンパ球による腫瘍の透過を増強するストラテジー。

化学療法剤、例えば、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）、５－フルオロウラシル、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、およびインビボで腫瘍細胞へ高効率で送達されるナノ粒子担体を組み入れる新規の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１と名づけられた）^{１１～１９}を組み合わせることに頼る代替ストラテジーであって、それが、転写後、ＲＮＡ干渉機構によって腫瘍細胞上の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１、の発現を阻害する、代替ストラテジーが本明細書に提示される。そのアプローチは、小分子または抗体を上回って有利であり、そのｓｉＲＮＡ成分が、標的抗原を転写後レベルで阻害し、タンパク質レベルではないからである。また、ＲＮＡｉ機構は触媒作用であり、標的抗原の消滅のために腫瘍細胞へたったピコモル量のｓｉＲＮＡの送達を必要とするだけである。対照的に、小分子または抗体は、抗原対治療用分子の少なくとも１：１モル比の達成を必要とし、腫瘍細胞による標的抗原の発現の代償性増加の存在下では無効であり得る。

現在の研究において、ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１からなる７週間の併用療法が、同系マウス膵癌モデルにおいて投与された。このアプローチは、有意により低い死亡率および毒性を生じ、腫瘍退縮、および生存率の劇的な向上をもたらした。特に、用量最適化後、腫瘍容積の９０％低下が、処置の開始から３週間後に達成された。対照動物の１００％が、処置の開始後６週間目までに彼らの腫瘍で死亡したが、５週間目まで実験群において死亡はなく、実験動物の６７％が１２週間、生存した。

記載された方法論は、薬物送達、送達過程の画像ガイダンス、および治療的応答の同調的バイオマーカーのための統合ツールを表す。

組成物
約２ｎｍ～約２００ｎｍの間（例えば、約１０ｎｍ～約３０ｎｍの間、約５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約２０ｎｍから約２５ｎｍの間、約２５ｎｍ～約５０ｎｍの間、約５０ｎｍから約２００ｎｍの間、約７０ｎｍから約２００ｎｍの間、約８０ｎｍから約２００ｎｍの間、約１００ｎｍから約２００ｎｍの間、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍ、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの間）の直径を有し、かつポリマーコーティングと、ヒト免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein-4）；ＣＤ１５２）；ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３（Lymphocyte Activation Gene 3）；ＣＤ２２３）；ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3）；ＨＡＶＣＲ２）；ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（T-cell Immunoreceptor with Ig and ITIM domains））；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＶＳＩＲ（Ｖ－ｓｅｔ免疫調節性受容体（V-set immunoregulatory receptor）、ａｋａ ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ５、Ｃ１０ｏｒｆ５４）；ＢＴＬＡ（Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエータ（B- and T-Lymphocyte Attenuator）、ＣＤ２７２）；ＧＡＲＰ（Glycoprotein A Repetitions Predominant；ＰＶＲＩＧ（PVR related immunoglobulin domain containing）；またはＶＴＣＮ１（V-set domain containing T cell activation inhibitor 1、ａｋａ Ｂ７－Ｈ４）に相補的である、配列内に少なくとも１０個（例えば、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２１個）の連続したヌクレオチドを含有する核酸とを含有する、治療用ナノ粒子が本明細書に提供される。

ＰＤ－Ｌ１
ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ；Ｂ７Ｈ１；ＰＤＬ１；ＰＤＣＤ１Ｌ１；およびＰＤＣＤ１ＬＧ１としても知られている。ヒトＰＤ－Ｌ１についての例示的な配列は、表Ａに示されたＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号において提供されている。

ＮＣＢＩ参照注釈により、バリアント１は、最も長い転写産物であり、最長アイソフォーム（アイソフォームａ前駆体）をコードする。バリアント２は、バリアント１と比較して５’コード領域において選択的インフレームエクソンを欠損し、結果として、より短いタンパク質アイソフォームｂを生じる。バリアント４は、いくつかのエクソンを欠損し、それの３’末端エクソンは、バリアント１に用いられるスプライス部位を過ぎて伸長し、結果として、バリアント１と比較して、新規の３’コード領域および新規の３’ＵＴＲを生じ、アイソフォームｃ（アイソフォームａより短く、かつアイソフォームａと比較して異なるＣ末端を有する）をコードする。

本方法および組成物において、上記のいずれかまたは全部を標的化する（例えば、上記の３つ全部に共通である領域を標的化する）ｓｉＲＮＡを用いることができる。ヒトバリアント１ ｍＲＮＡの配列は以下の通りである：

本方法は、ヒト対象を例示するが、他の哺乳動物対象、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、およびヒツジなどの獣医学的対象もまた本方法を用いて処置することができる。好ましい実施態様において、核酸は、処置されるべき対象と同じ種由来の配列を標的化する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供される治療用ナノ粒子は、球状もしくは楕円形であり得、または無定形であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される治療用ナノ粒子は、約２ｎｍ～約２００ｎｍの間（例えば、約１０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約２ｎｍ～約３０ｎｍの間、約５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約２０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約７０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約８０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約１００ｎｍ～約２００ｎｍの間、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍの間、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの間）の直径（治療用ナノ粒子の外面上の任意の２点の間）を有し得る。いくつかの実施形態において、約２ｎｍ～約３０ｎｍの間の直径を有する治療用ナノ粒子は、対象においてリンパ節に局在する。いくつかの実施形態において、約４０ｎｍ～約２００ｎｍの間の直径を有する治療用ナノ粒子は、肝臓に局在する。

いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載された異なる治療用ナノ粒子の２つ以上の混合物を含有することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ナノ粒子へ共有結合性に連結された、標的配列内の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含有する少なくとも１つの治療用ナノ粒子（標的細胞においてｍｉＲ－１０ｂレベルを減少させるためのナノ粒子）、および配列内に存在する少なくとも１０個の他の連続したヌクレオチドの配列と相補的である配列を含有する少なくとも１つの治療用ナノ粒子を含有する。

いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、磁性であり得る（例えば、磁性材料のコアを含有する）。

ナノ粒子
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれかは、磁性材料のコアを含有することができる（例えば、治療用磁性ナノ粒子）。いくつかの実施形態において、磁性材料または粒子は、磁場に対して応答性である反磁性、常磁性、超常磁性、または強磁性材料を含有することができる。治療用磁性ナノ粒子の非限定的例は、マグネタイト、フェライト（例えば、マンガン、コバルト、およびニッケルのフェライト）、酸化Ｆｅ（ＩＩ）、およびヘマタイト、ならびにそれらの金属合金の群から選択される酸化金属を含有する磁性材料のコアを含有する。磁性材料のコアは、当技術分野において知られた方法を用いて金属塩を酸化金属へ変換することにより形成することができる（例えば、Kieslich et al., Inorg. Chem. 2011）。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、シクロデキストリン金または量子ドットを含有する。治療用磁性ナノ粒子を作製するために用いることができる方法の非限定的例は、Medarova et al., Methods Mol. Biol. 555:1-13, 2009;および Medarova et al., Nature Protocols 1:429-431, 2006に記載されている。追加の磁性材料、および磁性材料を作製する方法は、当技術分野において知られている。本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、治療用磁性ナノ粒子の場所または局在性は、対象において画像化することができる（例えば、１回または複数の用量の治療用磁性ナノ粒子の投与後、対象において画像化される）。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された治療用ナノ粒子は、磁性材料を含有しない。いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、一部では、ポリマー（例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸））を含有するコアを含有することができる。当技術分野において知られた材料のいくつでもナノ粒子を調製するために用いることができることを熟練実践者は認識しており、その材料には、ゴム（例えば、アカシア、グアー）、キトサン、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、およびアルブミンが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に記載された治療用ナノ粒子を作製するために用いることができる追加のポリマーは、当技術分野において知られている。例えば、治療用ナノ粒子を作製するために用いることができるポリマーには、セルロース誘導体、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、およびポリカプロラクトンが挙げられるが、それらに限定されない。

ナノ粒子の組成物に用いられる材料、ナノ粒子を調製し、コーティングするための方法、およびナノ粒子のサイズを調節するための方法がかなり異なり得ることを熟練実践者は認識しているだろう。しかしながら、これらの方法は、当業者によく知られている。重要な点には、ナノ粒子の生分解性、毒性プロファイル、および薬物動態学／薬物動力学が挙げられる。ナノ粒子の組成物および／またはサイズは、それらの生物学的運命の重要な決定要因である。例えば、より大きいナノ粒子は、典型的には、肝臓によって取り上げられ、分解されるが、一方、より小さいナノ粒子（直径＜３０ｎｍ）は、典型的には、長時間（時には、ヒトにおいて２４時間を超える血中半減期）、循環し、リンパ節、および腫瘍などの過透過性脈管構造を有する器官の間質に蓄積する。

ポリマーコーティング
本明細書に記載された治療用ナノ粒子は、コアの磁性材料を覆う（例えば、磁性材料の表面を覆う）ポリマーコーティングを含有する。ポリマー材料は、１つまたは複数の生物学的作用物質（例えば、本明細書に記載された、核酸、フルオロフォア、またはターゲティングペプチドのいずれかなど）を付着し、または結合する（coupling）のに適し得る。１つまたは複数の生物学的作用物質（例えば、核酸、フルオロフォア、またはターゲティングペプチド）は、化学的結合（coupling）（共有結合）によりポリマーコーティングに固定することができる。

いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、磁性材料のコアを、水中で相対的に安定であるポリマーでコーティングすることを含む方法により形成される。いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、磁性材料をポリマーでコーティングすること、または磁性材料を、還元基を有する熱可塑性ポリマー樹脂の中へ吸収併合することを含む方法により形成される。コーティングはまた、米国特許第５，８３４，１２１号明細書、第５，３９５，６８８号明細書、第５，３５６，７１３号明細書、第５，３１８，７９７号明細書、第５，２８３，０７９号明細書、第５，２３２，７８９号明細書、第５，０９１，２０６号明細書、第４，９６５，００７号明細書、第４，７７４，２６５号明細書、第４，７７０，１８３号明細書、第４，６５４，２６７号明細書、第４，５５４，０８８号明細書、第４，４９０，４３６号明細書、第４，３３６，１７３号明細書、および第４，４２１，６６０号明細書；ならびに国際公開第１０／１１１０６６号パンフレット（それらの各開示は、参照により本明細書に組み入れられている）に記載された方法を用いて磁性材料に適用することができる。

酸化鉄ナノ粒子の合成のための方法には、例えば、物理的および化学的方法が挙げられる。例えば、酸化鉄は、水溶液中にＦｅ２＋およびＦｅ３＋塩の共沈殿により調製することができる。生じたコアは、マグネタイ（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（γ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはその２つの混合物からなる。水溶液中の、陰イオン塩含量（塩化物、硝酸塩、硫酸塩など）、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋の比、ｐＨ、およびイオン強度が全て、サイズを調節するのに役割を果たす。窒素またはアルゴンなどの不活性ガス下での無酸素環境においてその反応を行うことにより、合成されたナノ粒子の酸化を防止し、かつそれらの磁気的性質を保護することは重要である。コーティング材料は、酸化鉄ナノ粒子のマイクロ粒子への凝集を防止するために共沈殿過程中に加えることができる。当技術分野において知られた表面コーティング材料のいくつでも、酸化鉄ナノ粒子を安定化させるために用いることができることを熟練実践者は認識しており、その表面コーティング材料の中には、合成および天然ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、脂肪酸、ポリペプチド、キトサン、ゼラチンなどがある。

例えば、米国特許第４，４２１，６６０号明細書は、無機材料のポリマーコーティング化粒子が、通常、（１）無機固体を、酸、酸と塩基の組合せ、アルコール、またはポリマー溶液で処理し、（２）処理された無機固体の水性分散体中に付加重合可能モノマーを分散させ、および（３）生じた分散体をエマルション重合条件に供することにより、調製されることに言及している（１段落目、２１～２７行目）。米国特許第４，４２１，６６０号明細書はまた、（１）無機固体の別々の粒子の水性コロイド分散体中で疎水性のエマルション重合可能モノマーを乳化するステップ、および（２）生じたエマルションをエマルション重合条件に供して、疎水性モノマーの不水溶性ポリマーのマトリックス中に分散された無機固体粒子の安定な流体水性コロイド分散体を形成するステップを含む、無機ナノ粒子をポリマーでコーティングするための方法を開示している（１段目、４２～５０行目）。

あるいは、サイズの出発必要条件を満たすポリマーコーティング化磁性材料が、商業的に入手することができる。例えば、市販の超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子には、ＮＣ１００１５０ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｅａｌｔｈ）およびＦｅｒｕｍｏｘｙｔｏｌ（ＡＭＡＧ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）が挙げられる。

磁性材料のコアをコーティングするために用いることができる適切なポリマーには、非限定的に、以下が挙げられる：ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエーテルウレタン、ポリスルホン、フッ素化または塩素化ポリマー、例えばポリ塩化ビニル、ポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリカーボネート、ならびにポリエステル。磁性材料のコアをコーティングするために用いることができるポリマーの追加の例には、ポリオレフィン、例えば、ポリブタジエン、ポリジクロロブタジエン、ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポリビニリデンハライド、ポリビニリデンカーボネート、およびポリフッ素化エチレンが挙げられる。スチレン／ブタジエン、α－メチルスチレン／ジメチルシロキサン、または他のポリシロキサンを含む、いくつかのコポリマーもまた、磁性材料のコアをコーティングするために用いることができる（例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリフェニルエチルシロキサン、およびポリトリフルオロプロピルメチルシロキサン）。磁性材料のコアをコーティングするために用いることができる追加のポリマーには、ポリアクリロニトリルまたはアクリロニトリル含有ポリマー、例えば、ポリα－アクリロニトリルコポリマー、アルキドまたはテルペノイド樹脂、およびポリアルキレンポリスルホネートが挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリマーコーティングはデキストランである。

核酸
提供される治療用ナノ粒子は、ナノ粒子へ共有結合性に連結されている、免疫チェックポイント分子の配列、例えば、ＰＤ－Ｌ１配列、例えば、配列番号１内の少なくとも１０個（例えば、少なくとも１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、または２２個）の連続したヌクレオチドと相補的である配列を含む少なくとも１つの核酸を含有する。いくつかの実施形態において、共有結合性に連結された核酸分子は、免疫チェックポイントタンパク質（本明細書に記載された免疫チェックポイントタンパク質のいずれか）をコードするｍＲＮＡの全部または一部と相補的である配列を含有する。例えば、共有結合性に連結された核酸は、免疫チェックポイントタンパク質（本明細書に記載された免疫チェックポイントタンパク質のいずれか）をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全部または一部と相補的であり得る。非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、遺伝子においてコード領域に隣接する５’および３’配列であり、アミノ酸へ翻訳されない。いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子へ共有結合性に連結された核酸は、免疫チェックポイントタンパク質（本明細書に記載された免疫チェックポイントタンパク質のいずれか）の翻訳開始コドンまたはアミノ酸１～５をコードする配列と相補的である。

付着した核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、２３ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間（例えば、２３～３０ヌクレオチドの間、３０～４０ヌクレオチドの間、および４０～５０ヌクレオチドの間）の全長を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。

アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載された治療用ナノ粒子へ共有結合性に連結することができる。

本明細書に提供された配列（例えば、ヒト免疫チェックポイント分子、例えばＰＤ－Ｌ１についての配列、例えば、配列番号１、ならびに表ＡおよびＢにおける他の配列）に基づいて、当業者は、いくつかの適切なアンチセンス分子（例えば、免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的化するアンチセンス分子）のいずれかを容易に選択し、かつ合成することができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的化するアンチセンス核酸は、配列番号１、または当技術分野において知られたＰＤ－Ｌ１についての配列に存在する少なくとも１０個（例えば、少なくとも１５個または２０個）の連続したヌクレオチドと相補的な配列を含有することができる。

アンチセンス核酸は、当技術分野において知られた手順を用いる、化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて、構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された改変ヌクレオチド（例えば、本明細書に記載された改変ヌクレオチドのいずれか）を用いて、化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向にサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡが、関心対象となる標的核酸に対してアンチセンス配向であろう）発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたアンチセンス核酸分子は、通常のヌクレオチド相補性により標的核酸とハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができる。

アンチセンス核酸分子は、α－アノマー核酸分子であり得る。α－アノマー核酸分子は、通常のβ－ユニットに反して、鎖がお互いに平行している、相補性ＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al., Nucleic Acids Res. 15:6625-6641, 1987）。アンチセンス核酸分子はまた、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131-6148, 1987）またはキメラＲＮＡ－ＤＮＡアナログ（Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330, 1987）を含み得る。

いくつかの実施形態において、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＲＮＡｉは、宿主細胞においてＲＮＡが分解される過程である。ＲＮＡの発現を減少させるために、標的ＲＮＡ（例えば、免疫チェックポイント分子、例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）の一部分に対応する配列を含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞に導入される。ｄｓＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）と呼ばれる２１～２３ヌクレオチド長の二重鎖へ消化され、それが、ヌクレアーゼ複合体と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（またはＲＩＳＣ）として知られているものを形成する。ＲＩＳＣは、内因性標的ＲＮＡを、前記ｓｉＲＮＡの１つと前記内因性ＲＮＡとの間での塩基対形成相互作用により、標的化する。その後、それは、前記ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２ヌクレオチドの所で前記内因性ＲＮＡを切断する（Sharp et al., Genes Dev. 15:485-490, 2001, and Hammond et al., Nature Rev. Gen. 2:110-119, 2001参照）。

標準分子生物学技術を用いて、ｓｉＲＮＡを作製することができる。低分子干渉ＲＮＡは、化学合成され、例えばプラスミドなどの鋳型ＤＮＡからＲＮＡを発現することにより、組換え的に産生され、またはＤｈａｒｍａｃｏｎなどの商業的ベンダーから入手することができる。ＲＮＡｉを媒介するために用いられるＲＮＡは、ホスホロチオエートヌクレオチドなどの改変ヌクレオチド（本明細書に記載された改変ヌクレオチドのいずれか）を含むことができる。成熟ヒトｍｉＲ－１０ｂのレベルを減少させるために用いられるｓｉＲＮＡ分子は、いくつかの様式によって異なり得る。例えば、それらは、３’ヒドロキシル基、および２１個、２２個、または２３個の連続したヌクレオチドの鎖を含み得る。それらは、平滑末端化され、または３’末端、５’末端、もしくは両端のいずれかにおいてオーバーハンギング末端を含み得る。例えば、前記ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、（例えば、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチドに関わらず）長さが約１ヌクレオチドから約６ヌクレオチドまで、例えば、１～５、１～３、２～４、または３～５ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し得る。両方の鎖がオーバーハングを含む場合、オーバーハングの長さは、各鎖について同じまたは異なり得る。ＲＮＡ二重鎖の安定性をさらに増強するために、３’オーバーハングは、（例えば、アデノシンもしくはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含むこと、またはピリミジンヌクレオチドを改変ヌクレオチドに置き換えること（例えば、ウリジンの２ヌクレオチド３’オーバーハングの２’－デオキシチミジンによる置換が許容され、かつＲＮＡｉの効率に影響しない）により）分解に対して安定化され得る。関心対象となる標的と十分な相同性を有するという条件で、任意のｓｉＲＮＡを用いることができる。用いることができるｓｉＲＮＡの長さの上限はない（例えば、ｓｉＲＮＡは、約２１～５０個、５０～１００個、１００～２５０個、２５０～５００個、または５００～１０００個の塩基対の範囲であり得る）。

いくつかの実施形態において、核酸分子は、少なくとも１個の改変ヌクレオチド（改変塩基または糖を含有するヌクレオチド）を含有することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、リン酸（ホスホジエステル）バックボーン内に少なくとも１つの改変を含有することができる。これらの改変の導入は、核酸分子の安定性を増加させ、または核酸分子のハイブリダイゼーションもしくは溶解性を向上させることができる。

本明細書に記載された分子は、１個または複数（例えば、２個、３個、４個、または５個）の改変ヌクレオチドを含有することができる。改変ヌクレオチドは、改変塩基または改変糖を含有することができる。改変塩基の非限定的例には、８－オキソ－Ｎ^６－メチルアデニン、７－デアザキサンチン、７－デアザグアニン、Ｎ^４、Ｎ^４－エタノシトシン、Ｎ^６，Ｎ^６－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－（Ｃ^３～Ｃ^６）－アルキニル－シトシン、プソイドイソシトシン、２－ヒドロキシ－５－メチル－４－トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニ、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。

改変塩基の追加の非限定的例には、（参照により本明細書に組み入れられた）米国特許第５，４３２，２７２号明細書および第３，６８７，８０８号明細書、Freier et al., Nucleic Acid Res. 25:4429-4443, 1997；Sanghvi, Antisense Research and Application, Chapter 15, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993；Englisch, et al., Angewandte Chemie 30:613-722, 1991；Kroschwitz, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, John Wiley & Sons, pp. 858-859, 1990；ならびにCook, Anti-Cancer Drug Design 6:585-607, 1991に記載された核酸塩基が挙げられる。改変塩基の追加の非限定的例には、ユニバーサル塩基（例えば、３－ニトロピロールおよび５－ニトロイノドール）が挙げられる。他の改変塩基には、ピレンおよびピリジルオキサゾール誘導体、ピレニル、ピレニルメチルグリセロール誘導体などが挙げられる。他の好ましいユニバーサル塩基には、当技術分野において知られたユニバーサル塩基を含め、ピロロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が挙げられる。

いくつかの実施形態において、改変ヌクレオチドは、それの糖部分に改変を含有することができる。改変糖を含有する改変ヌクレオチドの非限定的例は、ロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）である。ＬＮＡモノマーは、（参照により本明細書に組み入れられた）国際公開第９９／１４２２６号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第２０１１００７６６７５号明細書、第２０１００２８６０４４号明細書、第２０１００２７９８９５号明細書、第２０１００２６７０１８号明細書、第２０１００２６１１７５号明細書、第２０１０００３５９６８号明細書、第２００９０２８６７５３号明細書、第２００９００２３５９４号明細書、第２００８００９６１９１号明細書、第２００３００９２９０５号明細書、第２００２０１２８３８１号明細書、および第２００２０１１５０８０号明細書に記載されている。ＬＮＡの追加の非限定的例は、（参照により本明細書に組み入れられた）米国特許第６，０４３，０６０号明細書、米国特許第６，２６８，４９０号明細書、国際公開第０１／０７４５５号パンフレット、第０１／００６４１号パンフレット、第９８／３９３５２号パンフレット、第００／５６７４６号パンフレット、第００／５６７４８号、および第００／６６６０４号パンフレット、加えて、Morita et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12(1):73-76, 2002；Hakansson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(7):935-938, 2001；Koshkin et al., J. Org. Chem. 66(25):8504-8512, 2001；Kvaerno et al., J. Org. Chem. 66(16):5498-5503, 2001；Hakansson et al., J. Org. Chem. 65(17):5161-5166, 2000；Kvaerno et al., J. Org. Chem. 65(17):5167-5176, 2000；Pfundheller et al., Nucleosides Nucleotides 18(9):2017-2030, 1999；およびKumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(16):2219-2222, 1998に開示されている。いくつかの実施形態において、改変ヌクレオチドは、オキシＬＮＡモノマー、例えば、国際公開第０３／０２０７３９号に記載されたものである。

改変ヌクレオチドはまた、アンタゴミル（２’－Ｏ－メチル－改変型、コレステロールコンジュゲート化一本鎖ＲＮＡアナログ）；ＡＬＮ（□－Ｌ－ＬＮＡ）；ＡＤＡ（２’－Ｎ－アダマンチルメチルカルボニル－２’－アミノ－ＬＮＡ）；ＰＹＲ（２’－Ｎ－ピレニル－１－メチル－２’－アミノ－ＬＮＡ）；ＯＸ（オキセタン－ＬＮＡ）；ＥＮＡ（２’－Ｏ，４”－Ｃ－エチレン架橋核酸）；ＡＥＮＡ（２’－デオキシ－２’－Ｎ，４’－Ｃ－エチレン－ＬＮＡ）；ＣＬＮＡ（２’，４’－炭素環式ＬＮＡ）；およびＣＥＮＡ（２’，４’－炭素環式ＥＮＡ）；ＨＭ－改変ＤＮＡ（４’－Ｃ－ヒドロキシメチル－ＤＮＡ）；２’－置換ＲＮＡ（２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－アミノエトキシメチル、２’－アミノプロポキシメチル、２’－アミノエチル、２’－グアニジノエチル、２’－シアノエチル、２’－アミノプロピルを有する）；ならびにリボース糖環の抜本的な改変を有するＲＮＡ、例えば、アンロックド核酸（Unlocked Nucleic Acid）（ＵＮＡ）、アルトリトール核酸（Altritol Nucleic Acid）（ＡＮＡ）、およびヘキシトール核酸（Hexitol Nucleic Acid）（ＨＮＡ）（Bramsen et al., Nucleic Acids Res. 37:2867-81, 2009参照）を挙げることができる。

本明細書に記載された分子はまた、ホスホジエステルバックボーン内に改変を含有することができる。例えば、前記分子内の任意の２個の連続した（隣接する）ヌクレオチド間の少なくとも１つの連結は、以下の群から選択される２～４個の基／原子を含有する部分によって接続され得る：－ＣＨ_２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ^Ｈ－、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲ^Ｈ、＞Ｃ＝Ｓ、－Ｓｉ（Ｒ’’）_２－、－ＳＯ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｐ（Ｏ）_２－、－ＰＯ（ＢＨ_３）－、－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－、－Ｐ（Ｓ）_２－、－ＰＯ（Ｒ’’）－、－ＰＯ（ＯＣＨ_３）－、および－ＰＯ（ＮＨＲ^Ｈ）－、ただし、Ｒ^Ｈは水素およびＣ_１～４－アルキルから選択され、Ｒ’’はＣ_１～６－アルキルおよびフェニルから選択される。そのような連結の実例は、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ＝（次のモノマーへの連結として用いられる場合、Ｒ^５を含む）、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＳ－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－Ｃ（＝ＮＲ^Ｈ）－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＨ＝Ｎ－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ＝（次のモノマーへの連結として用いられる場合、Ｒ^５を含む）、－ＣＨ_２－Ｏ－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－ＣＯ－、－Ｏ－ＮＲ^Ｈ－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＮＲ^Ｈ－、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－Ｏ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ＝（次のモノマーへの連結として用いられる場合、Ｒ^５を含む）、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＳＯ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＳＯ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－ＳＯ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ_Ｈ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ’’）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ_３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ－（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ_２Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ_３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－ＮＲ^Ｈ－、－ＮＲ^Ｈ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）２－Ｏ－、－ＣＨ_２－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－ＣＨ_２－、および－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ’’）_２－Ｏ－；それらの中で、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＲ^Ｈ－、－ＣＨ_２－ＮＲ^Ｈ－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）_２－Ｏ－、－ＮＲ^Ｈ－Ｐ（Ｏ）_２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ’’）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＣＨ_３）－Ｏ－、および－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）－Ｏ－であり、ただし、Ｒ^Ｈは、水素およびＣ_１～４－アルキルから選択され、Ｒ’’は、Ｃ_１～６－アルキルおよびフェニルから選択される。さらなる実例は、Mesmaeker et. al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355, 1995; and Freier et al., Nucleic Acids Research 25:4429-43, 1997に示されている。ヌクレオシド間の連結の左側は、３’位における置換基Ｐ^＊として５員環と結合しており、一方、右側は、次のモノマーの５’位と結合している。

いくつかの実施形態において、核酸のデオキシリボースリン酸バックボーンは、ペプチド核酸を作製するために改変することができる（Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chem. 4(1): 5-23, 1996参照）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、デオキシリボースリン酸バックボーンがプソイドペプチドバックボーンによって置き換えられ、４つの天然の核酸塩基のみが保持されている、核酸模倣体、例えば、ＤＮＡ模倣体である。ＰＮＡの中性バックボーンは、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。ＰＮＡオリゴマーの合成は、例えば、Hyrup et al., 1996, supra; Perry-O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670-675, 1996に記載されているような、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施することができる。

ＰＮＡは、例えばそれらの安定性または細胞取り込みを増強するために、親油性もしくは他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることにより、ＰＮＡ－ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームもしくは当技術分野において知られた送達の他の技術の使用により、改変することができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な性質を組み合わせ得るＰＮＡ－ＤＮＡキメラを、作製することができる。そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮアーゼＨがＤＮＡ部分と相互作用することを可能にし、一方、ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を与えるだろう。ＰＮＡ－ＤＮＡキメラは、塩基の積み重ね、核酸塩基間の結合の数、および配向の観点から選択された適切な長さのリンカーを用いて連結することができる（Hyrup,1996、上記）。ＰＮＡ－ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup,1996、上記、およびFinn et al., Nucleic Acids Res. 24:3357-63, 1996に記載されているように実施することができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準ホスホロアミダイトカップリング化学作用および改変ヌクレオシドアナログを用いて固体支持体上で合成することができる。５’－（４－メトキシトリチル）アミノ－５’－デオキシ－チミジンホスホロアミダイトなどの化合物を、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間の連結として用いることができる（Mag et al., Nucleic Acids Res., 17:5973-88, 1989）。その後、ＰＮＡモノマーは、段階的様式でカップリングされて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Finn et al., Nucleic Acids Res. 24:3357-63, 1996）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子を、合成することができる（Peterser et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124, 1975）。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された核酸のいずれかは、当技術分野において知られた任意の型の改変により、（その核酸がどのように治療用ナノ粒子へ共有結合性に連結されるかに依存して）３’末端かまたは５’末端のいずれかにおいて改変することができる。例えば、いずれかの末端は、基質表面（ポリマーコーティング）への付着を助けるために、保護基でキャップされ、可動性連結基に付着し、または反応基に付着し得る。３’または５’ブロッキング基の非限定的例には以下が挙げられる：２－アミノ－２－オキシエチル、２－アミノベンゾイル、４－アミノベンゾイル、アセチル、アセチルオキシ、（アセチルアミノ）メチル、３－（９－アクリジニル）、トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカ－１－イルオキシ、２－アミノエチル、プロペニル、（９－アントラセニルメトキシ）カルボニル、（１，１－ジメチルプロポキシ）カルボニル、（１，１－ジメチルプロポキシ）カルボニル、［１－メチル－１－［４－（フェニルアゾ）フェニル］エトキシ］カルボニル、ブロモアセチル、（ベンゾイルアミノ）メチル、（２－ブロモエトキシ）カルボニル、（ジフェニルメトキシ）カルボニル、１－メチル－３－オキソ－３－フェニル－１－プロペニル、（３－ブロモ－２－ニトロフェニル）チオ、（１，１－ジメチルエトキシ）カルボニル、［［（１，１－ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］エチル、２－（フェニルメトキシ）フェノキシ、（１＝［１，１’－ビフェニル］－４－イル－１－メチルエトキシ）カルボニル、ブロモ、（４－ブロモフェニル）スルホニル、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル、［（フェニルメチル）チオ］カルボニル、［（フェニルメチル）チオ］メチル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチル、ベンゾイル、ジフェニルメチル、フェニルメチル、カルボキシアセチル、アミノカルボニル、クロロジフルオロアセチル、トリフルオロメチル、シクロヘキシルカルボニル、シクロヘプチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルアセチル、クロロ、カルボキシメチル、シクロペンチルカルボニル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル、エトキシカルボニル、エチル、フルオロ、ホルミル、１－オキソヘキシル、ヨード、メチル、２－メトキシ－２－オキソエチル、ニトロ、アジド、フェニル、２－カルボキシベンゾイル、４－ピリジニルメチル、２－ピペリジニル、プロピル、１－メチルエチル、スルホ、およびエテニル。５’および３’ブロッキング基の追加の例は当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、５’または３’ブロッキング基は、その分子のヌクレアーゼ分解を防止する。

本明細書に記載された核酸は、核酸を合成するための、当技術分野において知られた任意の方法を用いて、合成することができる（例えば、Usman et al., J. Am. Chem. Soc. 109:7845, 1987；Scaringe et al., Nucleic Acid Res. 18:5433, 1990；Wincott et al., Methods Mol. Biol. 74:59, 1997；およびMilligan, Nucleic Acid Res. 21:8783, 1987参照）。これらは、典型的には、一般的な核酸保護基およびカップリング基を用いる。合成は、この目的のために設計された市販の装置、例えば、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．シンセサイザーで、その製造会社により供給されたプロトコールを用いて、実施することができる。本明細書に記載された分子を合成するための追加の方法は、当技術分野において知られている。あるいは、核酸は、オリゴヌクレオチドを合成する商業的ベンダーに特別に注文することができる。

いくつかの実施形態において、核酸は、それの５’末端で治療用ナノ粒子に付着している。いくつかの実施形態において、核酸は、それの３’末端で治療用ナノ粒子に付着している。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸に存在する塩基を通して治療用ナノ粒子に付着している。

いくつかの実施形態において、核酸（例えば、本明細書に記載された核酸のいずれか）は、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を含有する化学的部分を通して治療用ナノ粒子に（例えば、治療用ナノ粒子のポリマーコーティングに）付着している。いくつかの実施形態において、核酸は、アミド結合を含有する化学的部分を通して治療用ナノ粒子に付着している。核酸を治療用ナノ粒子へ共有結合性に連結するために用いることができる追加の化学的部分は当技術分野において知られている。

核酸を治療用ナノ粒子へ共有結合性に連結するために、様々な異なる方法を用いることができる。核酸を磁性粒子に連結するために用いることができる方法の非限定的例は、欧州特許出願公開第０９３７０９７号明細書；米国特許第ＲＥ４１００５号明細書；Lund et al., Nucleic Acid Res. 16:10861, 1998；Todt et al., Methods Mol. Biol. 529:81-100, 2009；Brody et al., J. Biotechnol. 74:5-13, 2000；Ghosh et al., Nucleic Acids Res. 15:5353-5372, 1987；米国特許第５，９００，４８１号明細書；米国特許第７，５６９，３４１号明細書；米国特許第６，９９５，２４８号明細書；米国特許第６，８１８，３９４号明細書；米国特許第６，８１１，９８０号明細書；米国特許第５，９００，４８１号明細書；および米国特許第４，８１８，６８１号明細書（それらのそれぞれは、全体として参照により組み入れられている）に記載されている。いくつかの実施形態において、核酸の治療用ナノ粒子への末端付着のためにカルボジイミドが用いられる。いくつかの実施形態において、核酸は、治療用ナノ粒子の表面上に存在する活性化部分とのそれの塩基のうちの１つの反応（例えば、治療用ナノ粒子の表面上の求核性部分との求電子性塩基の反応、または治療用ナノ粒子の表面上の求電子性残基との求核性塩基の反応）を通して、治療用ナノ粒子に付着している。いくつかの実施形態において、５’－ＮＨ_２改変核酸は、ＣＮＢｒ活性化ヒドロキシル基を含有する治療用ナノ粒子と付着している（例えば、Ｌｕｎｄら、上記参照）。アミノ改変核酸を治療用ナノ粒子に付着させるための追加の方法は下に記載されている。いくつかの実施形態において、５’－リン酸核酸は、カルボジイミドの存在下でヒドロキシル基を含有する治療用ナノ粒子に付着している（例えば、Ｌｕｎｄら、上記参照）。核酸を治療用ナノ粒子に付着させる他の方法には、治療用ナノ粒子上のＮＨ_２基への５’－リン酸核酸のカルボジイミド媒介性付着、およびカルボキシル基を有する治療用ナノ粒子への５’－ＮＨ_２核酸のカルボジイミド媒介性付着が挙げられる（例えば、Ｌｕｎｄら、上記参照）。

例示的な方法において、反応性アミンまたは反応性チオール基を含有する核酸を作製することができる。核酸におけるアミンまたはチオールは、別の反応基に連結することができる。この反応を実施するための２つの共通したストラテジーは、ホモ二官能性連結と呼ばれる、核酸を、類似した反応性部分へ（アミンからアミンへ、またはチオールからチオールへ）連結すること、またはヘテロ二官能性連結として知られた、核酸を逆の基へ（アミンからチオールへ、またはチオールからアミンへ）連結することである。両方の技術が、核酸を治療用ナノ粒子に付着させるために用いることができる（例えば、Misra et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:5217-5221, 2008；Mirsa et al., Anal. Biochem. 369:248-255, 2007；Mirsa et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:3749-3753, 2007；およびChoithani et al., Methods Mol Biol. 381:133-163, 2007参照）。

特にアミン基についての、伝統的な付着技術は、ホモ二官能性連結に頼っている。最も一般的な技術の一つは、グルタルアルデヒドなどのビスアルデヒドの使用である。合成核酸プローブ（ＳＮＡＰ）テクノロジーとしてＳｙｎｇｅｎｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）により商品化されたジスクシンイミジル基質（ＤＳＳ）、または試薬ｐ－フェニレンジイソチオシアネートもまた、核酸と治療用ナノ粒子との間の共有結合性連結を生じさせるために用いることができる。Ｎ，Ｎ’－ｏ－フェニレンジマレイミドがチオール基を架橋するために用いることができる。ホモ二官能性架橋剤の全部に関して、核酸は、最初に活性化され、その後、治療用ナノ粒子に付加される（例えば、Swami et al., Int. J. Pharm. 374:125-138, 2009, Todt et al., Methods Mol. Biol. 529:81-100, 2009；およびLimanskii, Biofizika 51:225-235, 2006参照）。

ヘテロ二官能性リンカーもまた、核酸を治療用ナノ粒子に付着させるために用いることができる。例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、最初に、一級アミンに連結して、ジチオール改変化合物を生じる。その後、これは、チオールと反応して、ピリジルチオールをその入ってきたチオールと交換することができる（例えば、Nostrum et al., J. Control Release 15;153(1):93-102, 2011、およびBerthold et al., Bioconjug. Chem. 21:1933-1938, 2010参照）。

チオール使用についての代替アプローチは、チオール交換反応である。チオール化核酸がジスルフィド治療用ナノ粒子へ導入された場合には、核酸がジスルフィド結合により治療用ナノ粒子と共有結合することをもたらす、ジスルフィド交換反応が起こり得る。多数の潜在的架橋化学作用が、アミンとチオールのヘテロ二官能性架橋に利用できる。一般的に、これらの手順は、チオール化ヌクレオチドと共に用いられている。典型的に利用されている試薬は、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＭＢＳ（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－スクシンイミドエステル）、およびＳＰＤＰ（ピリジルジスルフィド系）である。一般的に用いられるヘテロ二官能性リンカーは、アミノ化核酸に頼っている。核酸を治療用ナノ粒子へ共有結合性に連結するための追加の方法は、当技術分野において知られている。

ターゲティングペプチド
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子はさらに、例えば国際公開第２０１３／０１６１２６号パンフレットに記載されているような、共有結合性に連結されたターゲティングペプチドを含有する。用語「ターゲティングペプチド」とは、標的細胞（例えば、癌細胞）の形質膜中または形質膜上に存在する分子（例えば、タンパク質、糖、もしくは脂質、またはそれらの組合せ）によって結合されるペプチドを意味する。本明細書に記載されているように、ターゲティングペプチドは、第２の分子または組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）へ共有結合性に連結されて、その第２の分子または組成物を標的細胞（例えば、癌細胞）へ標的化することができる。いくつかの実施形態において、第２の分子または組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）へ共有結合性に連結されているターゲティングペプチドは、標的化された細胞による第２の分子または組成物の取り込み（例えば、エンドサイトーシスまたはピノサイトーシスによる細胞取り込み）を生じる。ターゲティングペプチドの非限定的例は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは、ＲＧＤペプチド、ＥＰＰＴペプチド、ＮＹＬＨＮＨＰＹＧＴＶＧ（配列番号２）、ＳＮＰＦＳＫＰＹＧＬＴＶ（配列番号３）、ＧＬＨＥＳＴＦＴＱＲＲＬ（配列番号４）、ＹＰＨＹＳＬＰＧＳＳＴＬ（配列番号５）、ＳＳＬＥＰＷＨＲＴＴＳＲ（配列番号６）、ＬＰＬＡＬＰＲＨＮＡＳＶ（配列番号７）、またはβＡｌａ－（Ａｒｇ）７－Ｃｙｓ（配列番号８）を含有する。いくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは、ジスルフィド結合を含有する化学的部分を通してナノ粒子へ共有結合性に連結されている。いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、磁性である。ターゲティングペプチド、およびそれらをナノ粒子に付着させるための方法の追加の例は、当技術分野において知られており、例えば、国際公開第２０１３／０１６１２６号パンフレットを参照されたい。

薬学的組成物
本明細書に記載されているような治療用ナノ粒子を含有する薬学的組成物もまた本明細書に提供される。本明細書に記載されたいずれかの型の治療用ナノ粒子の２つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）は、任意の組合せで薬学的組成物中に存在することができる。薬学的組成物は、当技術分野において知られた任意の様式で製剤化することができる。

薬学的組成物は、それらの意図された投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内）に適合するように製剤化される。前記組成物は、滅菌希釈剤（例えば、滅菌水または食塩水）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒、抗細菌もしくは抗真菌剤、例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、バッファー、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩、および等張剤、例えば、糖（例えば、デキストロース）、ポリアルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、または塩（例えば、塩化ナトリウム）、またはそれらの任意の組合せを含み得る。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書参照）。前記組成物の調製物は、製剤化され、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアル中に封入され得る。（例えば、注射製剤においてのように）必要な場合、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングまたは表面活性剤の使用により、維持することができる。治療用ナノ粒子の吸収は、吸収を遅らせる作用物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことにより延ばすことができる。あるいは、徐放は、生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸；Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を含むことができる植込錠およびマイクロカプセル化送達系により達成することができる。

本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれかの１つまたは複数を含有する組成物は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内）投与用に用量単位形（すなわち、投与の簡便さおよび用量の均一性のための予め決められた量の活性化合物を含有する、物理的に別々の単位）で製剤化することができる。

組成物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物（例えば、サル）において標準薬学的手順により決定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的有効な用量）：ＬＤ５０：ＥＤ５０の比である治療係数を決定することができる。高い治療係数を示す作用物質が好ましい。作用物質が望ましくない副作用を示す場合、潜在的損傷を最小限にする（すなわち、望まれない副作用を低下させる）ように気をつけるべきである。毒性および治療効果は、他の標準薬学的手順により決定することができる。

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、対象（例えば、ヒト）における使用のための任意の所定の作用物質の適切な用量を製剤化することにおいて用いることができる。１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の治療用ナノ粒子（本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）の治療的有効量は、（例えば、同じ疾患を有するが、処置を受けていない、もしくは異なる処置を受けた対照の対象、または処置前の同じ対象と比較して、）対象（例えば、ヒト）において、癌（例えば、乳癌）を有する対象における癌細胞浸潤もしくは転移を減少させ、対象においてリンパ節における転移性癌を処置し、対象においてリンパ節における転移性腫瘍サイズを減少もしくは安定化させ、対象においてリンパ節における転移性腫瘍成長の速度を減少させ、対象（例えば、ヒト）においてリンパ節における転移性癌の１つもしくは複数の症状の重症度、頻度、および／もしくは持続期間を減少させ、または対象においてリンパ節における転移性癌の症状の数を減少させる量である。

本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれかの有効性および投薬は、当技術分野において知られた方法を用いて、加えて、対象（例えば、ヒト）においてのリンパ節における転移性癌の１つまたは複数の症状の観察により、医療専門家によって決定することができる。ある特定の因子（例えば、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の一般的健康および／または年齢、ならびに他の疾患の存在）が、対象を効果的に処置するのに必要とされる用量およびタイミングに影響する場合がある。

例示的な用量には、対象の体重の１キログラムあたりの、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれかのミリグラムまたはマイクログラム量が挙げられる。これらの用量は幅広い範囲を網羅するが、本明細書に記載された治療用ナノ粒子を含む治療剤が、それらの効力によって異なることを当業者は理解しており、有効量は、当技術分野において知られた方法によって決定することができる。典型的には、相対的に低い用量が最初に投与され、担当医療専門家（治療適用の場合）または研究者（まだ開発段階で研究している時）は、続いて、かつ徐々に、適切な応答が得られるまで用量を増加させることができる。加えて、任意の特定の対象についての特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別、および食事、投与の時点、投与の経路、排泄速度、およびインビボでの治療用ナノ粒子の半減期を含む様々な因子に依存することは理解されている。

薬学的組成物は、投与についての使用説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー内に含まれ得る。

処置の方法
本明細書に記載された治療用ナノ粒子は、癌成長を減少させることが発見された。この発見を勘案して、対象において癌を処置する方法が本明細書に提供される。これらの方法の特定の実施形態および様々な態様が下に記載されている。

癌を処置する方法
方法は一般的に、腫瘍、例えば、癌を有する対象を同定することを含む。本明細書で用いられる場合、用語「癌」は、自律的成長の能力を有する細胞、すなわち、急速に増殖する細胞成長により特徴づけられる異常な状態または状況、を指す。過剰増殖性および腫瘍性疾患状態は、病的、すなわち、疾患状態を特徴づけもしくは構成するものとして、分類され得、または非病的、すなわち、正常から逸脱しているが、疾患状態に関連づけられないものとして分類され得る。一般的に、癌は、１つまたは複数の腫瘍、すなわち、異常な細胞塊の存在と関連づけられる。用語「腫瘍」は、組織病理学的型や浸潤性の段階とは関係なく、全ての型の、癌性成長もしくは発癌過程、転移性組織、または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを意図される。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長により特徴づけられる疾患状態で起こる。本研究は、膵癌に、それの憂うつな予後およびそれの転移型に対する進行の欠如を理由に、焦点をおいているが、本組成物および本方法は、固形悪性腫瘍に幅広く適用できる。したがって、癌は、任意の型の固形腫瘍であり得、その固形腫瘍には、乳癌、結腸癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、または子宮癌が挙げられるが、それらに限定されない。

腫瘍には、様々な器官系の悪性腫瘍、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸管、および尿生殖路を冒す悪性腫瘍、加えて、たいていの結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌、ならびに食道の癌などの悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。用語「癌腫」は、当技術分野において認められており、呼吸器系癌腫、胃腸管系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。いくつかの実施形態において、疾患は、腎臓癌腫または黒色腫である。例示的な癌腫には、子宮頚部、肺、前立腺、乳房、頭頚部、結腸、および卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。その用語はまた、癌肉腫も含み、それには、例えば、癌性および肉腫組織で構成される悪性腫瘍が挙げられる。「腺癌」は、腺組織に由来した癌腫、または腫瘍細胞が、認識できる腺状構造を形成している癌腫を指す。用語「肉腫」は、当技術分野において認められており、間葉系誘導の悪性腫瘍を指す。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法により評価または処置される癌には、上皮癌、例えば、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳癌、結腸直腸癌、腎癌、頭頚部癌、前立腺癌、膵癌（例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、または卵巣癌が挙げられる。上皮悪性腫瘍は、上皮組織を冒す癌である。

癌は、医療専門家（例えば、医師、医師の助手、看護師、検査技師）によって、当技術分野において知られた方法を用いて対象において診断することができる。例えば、転移性癌は、一つには、当技術分野において知られているような対象における癌の少なくとも１つの症状の観察または検出によって、対象において診断することができる。癌はまた、様々な画像化技術を（例えば、単独で、または対象における癌の１つもしくは複数の症状の観察と組み合わせて）用いて対象において診断することができる。例えば、癌の存在は、コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放射型断層撮影法、およびＸ線法を用いて、対象において検出することができる。癌はまた、対象由来の組織の生検を実施することにより診断することができる。癌はまた、ＣＡ１９．９、ＣＥＡ、ＰＳＡなどの血清バイオマーカーから診断することができる。

いくつかの実施形態において、方法は、癌が免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現または過剰発現するかどうかを決定することを含み得る。癌において、例えば、癌由来の細胞を含む生検または他の試料において、免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１の発現を検出するための方法は、当技術分野において知られており、それには、例えば、市販の、または研究室で開発された免疫組織化学法（ＩＨＣ）が挙げられ、例えば、Udall et al., Diagn Pathol. 2018; 13: 12を参照されたい。そのレベルは、閾値または参照レベルと比較することができ、閾値または参照レベルより上の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１の発現のレベルが見られる場合には、その対象は、本明細書に記載されているような処置に選択され得る。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、Kawakami et al., Curr Treat Options Oncol. 2015 Jul;16(7):30；Zeinalian et al., Adv Biomed Res. 2018; 7: 28に記載されているように、癌が、高レベルのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を有するかどうかを決定し、ＭＳＩが高い、または閾値もしくは参照レベルより上のＭＳＩのレベルを有する癌を処置のために選択することを含み得る。

本明細書に記載された治療用ナノ粒子の任意の１つまたは複数は、癌を有する対象に投与することができる。１つまたは複数の治療用ナノ粒子は、医療施設（例えば、病院または診療所）において、またはケア支援施設において対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、対象は、以前、癌を有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象はすでに、癌についての治療的処置を受けている。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の腫瘍は、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のうちの１つでの処置の前に、外科的に除去されている。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療用ナノ粒子の投与は、結果として、腫瘍のサイズの減少（例えば、有意なまたは観察可能な減少）、腫瘍のサイズの安定化（例えば、サイズの有意なまたは観察可能な変化がない）、または対象に存在する腫瘍の成長の速度の減少（例えば、検出可能または観察可能な減少）を生じる。医療専門家は、様々な異なる画像化技術を用いて対象における腫瘍のサイズおよび／またはサイズの変化をモニターすることができ、その画像化技術には、コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像法、ポジトロン放射型断層撮影法、およびＸ線法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、治療に応答した、対象における腫瘍のサイズの減少または安定化があるかどうかを決定するために、対象の腫瘍のサイズは、治療前および後に決定することができる。腫瘍の成長の速度は、処置を受けていないまたは異なる処置を受けた別の対象または対象集団における腫瘍の成長の速度と比較することができる。腫瘍の成長の速度の減少はまた、治療的処置（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれかでの処置）の前と後の両方の腫瘍の成長の速度を比較することにより決定することができる。いくつかの実施形態において、腫瘍の可視化は、腫瘍における癌細胞と特異的に結合する標識プローブまたは分子（例えば、癌細胞の表面上に存在するエピトープと選択的に結合する標識抗体）を利用する画像化技術を用いて実施することができる。

いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子を対象に投与することは、原発性癌（例えば、原発性乳癌）を有する（例えば、有すると診断された）対象において転移性癌（例えば、リンパ節における転移性癌）を発症するリスクを（例えば、類似した原発性癌を有するが、処置を受けていないまたは代替処置を受けた対象において転移性癌を発症する率と比較して）減少させる。原発性癌を有する対象において転移性腫瘍を発症するリスクの減少はまた、治療を受けていないまたは代替型の癌治療を受けた対象集団における転移性癌形成の率を比較することができる。

医療専門家はまた、癌の治療的処置の有効性を、対象における癌の症状の数の減少を観察することにより、または対象における癌の１つもしくは複数の症状の重症度、頻度、および／もしくは持続期間の減少を観察することにより、評価することができる。癌の様々な症状は、当技術分野において知られており、本明細書に記載されている。

いくつかの実施形態において、投与は、結果として、（例えば、類似した癌を有するが、異なる治療的処置を受け、または治療的処置を受けていない対象集団と比較して）対象における寿命または生存の可能性の増加（例えば、有意な増加）を生じ得る。いくつかの実施形態において、投与は、結果として、（例えば、類似した癌を有するが、異なる治療的処置を受け、または治療的処置を受けていない対象集団と比較して）癌を有する対象についての予後の改善を生じ得る。

投薬、投与、および組成物
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、治療用ナノ粒子は、医療専門家（例えば、医師、医師の助手、看護師、または検査室もしくは診療所従業員）、対象（すなわち、自己投与）、または対象の友人もしくは家族メンバーによって投与することができる。投与は、臨床設定（例えば、診療所または病院）において、介護施設において、または薬局で実施することができる。

本明細書に記載された方法のいずれかのいくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、癌を有すると診断されている対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、乳癌または膵癌と診断されている。いくつかの非限定的実施形態において、対象は、男性もしくは女性、成人、若者、または子どもである。対象は、癌または転移性癌（例えば、リンパ節における転移性癌）の１つまたは複数の症状を経験したことがあり得る。対象はまた、重度または進行期の癌（例えば、原発性または転移性癌）を有すると診断され得る。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１つのリンパ節に存在する転移性腫瘍を有すると同定された可能性がある。いくつかの実施形態において、対象は、外科的切除、例えば、部分的なまたは全体の膵切除、リンパ節切除、および／または乳腺切除をすでに受けた可能性がある。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象は、本明細書に記載された、磁性粒子または薬学的組成物のいずれかの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）を含有する組成物の少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、または３０回）の用量を投与される。本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、少なくとも１つの磁性粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された磁性粒子または薬学的組成物のいずれか）は、対象へ静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内に投与することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの磁性粒子または薬学的組成物は、対象におけるリンパ節へ直接投与（注射）される。

いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１つの治療用ナノ粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子または薬学的組成物のいずれか）および少なくとも１つの追加の治療剤を投与される。少なくとも１つの追加の治療剤は、化学療法剤であり得る。用語「化学療法剤」とは、対象（例えば、ヒト）において、癌細胞成長の速度を低下させるために、または癌細胞の死（例えば、壊死またはアポトーシス）を誘導もしくは媒介するために用いることができる分子を意味する。非限定的例において、化学療法剤は、小分子、タンパク質（例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、またはそれらの誘導体もしくはコンジュゲート）、核酸、またはそれらの任意の組合せであり得る。化学療法剤の非限定的例には、１つもしくは複数のアルキル化剤；アントラサイクリン；細胞骨格破壊物質（タキサン）；エポシロン；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；トポイソメラーゼＩの阻害剤；トポイソメラーゼＩＩの阻害剤；キナーゼ阻害剤；ヌクレオチドアナログおよび前駆体アナログ；ペプチド抗生物質；白金製剤；レチノイド；ならびに／もしくはビンカアルカロイドおよび誘導体；またはそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、ヌクレオチドアナログまたは前駆体アナログ、例えば、アザシチジン；アザチオプリン；カペシタビン；シタラビン；ドキシフルリジン；フルオロウラシル；ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；メルカプトプリン；メトトレキサート；またはチオグアニンである。他の例には、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、タフルポシド、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、オールトランスレチノール酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびベバシズマブ（またはその抗原結合断片）が挙げられる。化学療法剤の追加の例は当技術分野において知られている。

いくつかの実施形態において、化学療法剤は、癌型に基づいて、または癌の遺伝子解析に基づいて、選択され、例えば、膵癌について、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（アルブミン結合パクリタキセル）、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン）、カペシタビン、５－ＦＵ（フルオロウラシル）およびＯＮＩＶＹＤＥ（イリノテカンリポソーム注射）、またはそれらの組合せ、例えば、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、３つの化学療法薬（５－ＦＵ／ロイコボリン、イリノテカン、およびオキサリプラチン）の組合せ、もしくは改変ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（ｍＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ）のうちの１つまたは複数を投与することができる。補完的機構により相乗的に働き得る標的のさらなる組合せを用いることができる。例えば、組換えヒトヒアルロニダーゼ（ＰＥＧＰＨ２０）^{３０，３１}による酵素分解、または他の代替化学療法剤、および／またはＴ細胞を活性化することにおいて相乗効果を促進し得る代替チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１および／または抗ＣＴＬＡ－４）により、腫瘍微小環境を物理的に変化させる併用療法を用いることができる。

方法および組成物はまた、鎮痛剤（例えば、アセトアミノフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナム酸塩（meclofenamate）、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、ブプレノルフィン、ブトルファノール、コデイン、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、モルフィン、ナルブフィン、オキシコドン、オキシモルホン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、およびトラマドール）の投与を含み得る。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤および少なくとも１つの治療用ナノ粒子（本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）が、同じ組成物（例えば、同じ薬学的組成物）において投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤および少なくとも１つの治療用ナノ粒子は、異なる投与経路を用いて対象に投与される（例えば、少なくとも１つの追加の治療剤が経口投与により送達され、少なくとも１つの治療用ナノ粒子が静脈内投与により送達される）。

本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、少なくとも１つの治療用ナノ粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子または薬学的組成物のいずれか）、および任意で、少なくとも１つの追加の治療剤は、対象に少なくとも週１回（例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、１日１回、１日２回、または１日３回）、投与することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なる治療用ナノ粒子が、同じ組成物（例えば、液体組成物）において投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療用ナノ粒子および少なくとも１つの追加の治療剤が、同じ組成物（例えば、液体組成物）において投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療用ナノ粒子および少なくとも１つの追加の治療剤が、２つの異なる組成物（例えば、少なくとも１つの治療用ナノ粒子を含有する液体組成物、および少なくとも１つの追加の治療剤を含有する固体経口組成物）において投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、丸剤、錠剤、またはカプセルとして投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、徐放性経口製剤において投与される。

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の追加の治療剤は、少なくとも１つの治療用ナノ粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子または薬学的組成物のいずれか）を投与する前に対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の追加の治療剤は、少なくとも１つの治療用ナノ粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された磁性粒子または薬学的組成物のいずれか）を投与した後に対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、１つもしくは複数の追加の治療剤および少なくとも１つの治療用ナノ粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子または薬学的組成物のいずれか）は、対象において前記１つまたは複数の追加の治療剤と前記少なくとも１つの治療用ナノ粒子（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子のいずれか）の生物活性期間の重複があるように、対象に投与される。

いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも１つの治療用ナノ粒子または薬学的組成物（例えば、本明細書に記載された治療用ナノ粒子または薬学的組成物のいずれか）を長期間に渡って（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、または１０年間に渡って）投与され得る。熟練した医学専門家は、処置の有効性を診断または追跡するための本明細書に記載された方法のいずれかを用いて（例えば、上記の方法および当技術分野において知られた方法を用いて）、処置期間の長さを決定し得る。本明細書に記載されているように、熟練した医学専門家はまた、対象に投与される治療用ナノ粒子（および／または１つまたは複数の追加の治療剤）のアイデンティティおよび数（例えば、増加または減少させる）を変化させることができ、（例えば、本明細書に記載された方法および当技術分野において知られた方法のいずれかを用いた）処置の有効性の評価に基づいて、対象への少なくとも１つの治療用ナノ粒子（および／または１つまたは複数の追加の治療剤）の投与の用量または頻度も調整する（例えば、増加または減少させる）こともできる。熟練した医学専門家はさらに、いつ処置を中断するべきか（例えば、対象の症状が有意に減少した時）を決定することができる。

治療のモニタリング
本発明者らの治療アプローチの追加の重要な利点は、それが、標的組織における薬物生物学的利用率についての知識と治療結果とを組み合わせる、臨床的に意義のある画像ガイド処置プロトコールを開発するまたとない機会を提示するという事実に由来する。この能力は、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１が２０ｎｍ超常磁性ナノ粒子担体と合体して、そのことが、腫瘍細胞への高効率的な送達を保証し、かつ組織におけるその蓄積が、定量的非侵襲性ＭＲＩによりモニターされ得るという事実によって、可能になる。この能力は、処置の間に薬物生物学的利用率を非侵襲性に測定する可能性を示さない全ての他の利用可能な治療アプローチの状況においては、独特である。

本研究に例証されているように、ΔＲ２パラメータによる組織におけるＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の相対的濃度についての知識は、恒久的腫瘍退縮に関連した治療プロトコールの開発および最適化を可能にする。同時に、解剖学的ＭＲＩは、応答の形態学的バイオマーカーとして腫瘍容積の客観的測定を可能にする。しかしながら、動力学的ＭＲ画像化プロトコールの適用は、腫瘍血流および微小血管透過性に関連した生理的変数も測定するために容易に用いることができる。

したがって、本方法は、磁性ナノ粒子を検出する画像化モダリティの使用を含み得る。

本発明は、以下の実施例にさらに記載されており、その実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。

方法
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴ
ｐｄ－ｌ１に対するｓｉＲＮＡオリゴ（ｓｉＰＤＬ１；ＭＷ＝１３，７８８．９ｇ／ｍｏｌ）の配列は、５’－ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／ＧＧＵＣＡＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＡＵＵＵ－３’（センス配列；配列番号２）および５’－ＰＡＵＵＣＧＣＵＧＵＧＧＣＧＵＵＧＡＣＣＵＵ－３’（アンチセンス配列；配列番号３）からなった。スクランブルｓｉＲＮＡオリゴ（ｓｉＳＣＲ；ＭＷ＝１３，７２８．８ｇ／ｍｏｌ）の配列は、５’－ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡＵＵ－３’（センス配列；配列番号４）および５’－ＰＵＵＡＧＵＣＧＡＣＡＵＧＵＡＡＡＣＣＡＵＵ－３’（アンチセンス配列；配列番号５）であった。両方のｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）によって設計および合成された。５’－チオール修飾因子Ｃ６ジスルフィド（５’－ＴｈｉｏＭＣ６）を、磁性ナノ粒子にコンジュゲートするためにセンス配列中に導入した。

デキストランコーティング化磁性ナノ粒子（ＭＮ）の合成
ＭＮを、以前に発表されたプロトコール^２０に従って合成した。簡単に述べれば、アルゴンガスを１時間、流しながら、３０ｍｌのＤｅｘｔａｎ－Ｔ１０（０．３ｇ ｍｌ^－１、Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ Ａ／Ｓ、Ｈｏｌｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、１ｍｌのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ（０．６５ｇ ｍｌ^－１、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と混合した。１ｍｌのＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ（０．４ｇ ｍｌ^－１、Ｓｉｇｍａ）を、その混合物へ加え、１５ｍｌの冷たいＮＨ_４ＯＨ（２８％、Ｓｉｇｍａ）を、その撹拌される混合物へ滴下した。温度を、ナノ粒子分散の形成を開始させるために８５℃まで１時間、上昇させ、その後、室温まで冷却した。磁性ナノ粒子を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心ユニット（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２０ｍｌへ濃縮した。生じたデキストランコーティング化磁性ナノ粒子を、エピクロロヒドリン（１４ｍｌ、８ｈ、Ｓｉｇｍａ）により架橋し、その後のＮＨ_４ＯＨ（２８％、６０ｍｌ）の添加でアミノ化した。アミノ化磁性ナノ粒子（ＭＮ）を、透析により精製し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心ユニットを用いて濃縮した。ＭＮの性質は以下の通りであった：濃度、Ｆｅとして１０．９４ｍｇ ｍｌ^－１；ＭＮあたりのアミン基の数、６４；緩和能（Ｒ２）、８２．５ｍＭ^－１秒^－１；ＭＮのサイズ、２０．３±０．６ｎｍ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ－１０システムおよびナノ粒子追跡分析ソフトウェア（Ｖｅｒ．３．２）、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）。

ナノドラッグ合成および特徴づけ
ナノドラッグ合成を、以前に発表されたプロトコール^２０に従って行った。図１Ａおよび図６も参照。簡単に述べれば、ＭＮにヘテロ二官能性リンカー Ｎ－スクシンイミジル３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をコンジュゲートし、それを、活性化ｓｉＲＮＡオリゴの連結のために利用した。ＳＰＤＰを無水ＤＭＳＯ中に溶解し、ＭＮとインキュベートし、それは、ｓｉＲＮＡオリゴとの還元不安定性ジスルフィド連結を形成するためのピリジルジチオ基を有する。ｓｉＲＮＡオリゴの５’－ＴｈｉｏＭＣ６を、ヌクレアーゼフリーのＰＢＳ中、３％ＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）処理により活性化して、チオールを遊離させた。そのｓｉＲＮＡオリゴを、酢酸アンモニウム／エタノール沈殿法を用いて精製した。ＴＣＥＰ活性化および精製後、各オリゴ（ｓｉＰＤＬ１およびｓｉＳＣＲ）を水中に溶解し、ＳＰＤＰ修飾ＭＮと一晩、インキュベートして、ナノドラッグ（ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１およびＭＮ－ｓｉＳＣＲ）を調製した。オリゴを、２つの異なる比率でＭＮに加えて、電気泳動分析法^２０により定量化した場合、ＭＮあたり２．１±０．４（低用量）または４．８±０．７（高用量）ｓｉＲＮＡオリゴを組み入れるナノドラッグを得た。ナノドラッグを、毎週、新鮮に調製した。最終ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１／ＳＣＲのサイズは、２３．２±０．９ｎｍであった。

細胞株
マウス膵管腺腫ＰＡＮ ０２細胞株（ＮＣＩ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１％抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で、供給会社の使用説明書通り、培養した。培地を、週３回、交換し、週１回、継代培養のためにトリプシン処理した。

免疫組織化学的組織染色および蛍光顕微鏡法
一次および二次抗体を、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入し、それには以下が含まれた：一次抗体として、抗ＣＤ３（カタログ番号：ＡＢ１６６６９）、抗ＣＤ８（カタログ番号：ＡＢ２５４７８）、抗ＦｏｘＰ３（カタログ番号：ＡＢ７５７６３）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（カタログ番号：ＡＢ４０６９）、抗Ｋｉ６７（カタログ番号：ＡＢ１６６６７）、および抗ＰＤＬ１（カタログ番号：ＡＢ８０２７６）、二次抗体として、ヤギ抗ラットＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８血清吸着済み、ＡＢ９８４２０）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８血清吸着済み、ＡＢ９６８９９）。

免疫組織化学的組織染色を、各バイオマーカーについてのプロトコールに従って実施した。簡単に述べれば、切除された腫瘍組織を、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）内に包埋し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織を、７μｍ切片へ切断し、４％ホルムアルデヒド中に１０分間、固定した。必要とされる場合、界面活性剤透過処理を、ＰＢＳ中０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて実施した。ＰＢＳ中０．５％ウシ血清アルブミンにおける５％ヤギ血清でのブロッキング後、各スライドを、対応する一次抗体（希釈度１／２００）と５℃で一晩、インキュベートした。各スライドを、二次抗体（希釈度１／２００）と６０分間、インキュベートし、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ． Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でマウントした。スライドを、必要なフィルターセット（ＭＶＩ Ｉｎｃ．、Ａｖｏｎ、ＭＡ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅ４００蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて分析した。画像を、近赤外感度を有する電荷結合素子カメラ（ＳＰＯＴ ７．４ Ｓｌｉｄｅｒ ＲＴＫＥ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）を用いて取得した。画像を、ＳＰＯＴ ４．０ Ａｄｖａｎｃｅバージョンソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＩｍａｇｅＪ（Ｖｅｒ．１．５１ｃ、ＮＩＨ）を用いて分析した。

インビトロＭＲ画像化
ＭＲ画像化を、それぞれの毎週のＭＮ－ｓｉＰＤＬ１／ＳＣＲでの処置の前および後に、傾斜インサートを有し、かつＰａｒａＶｉｓｉｏｎ ５．１ソフトウェアを用いて操作されるＢｒｕｋｅｒ ９．４Ｔ水平ボアマグネット（Ｍａｇｎｅｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。接種から２週間後、マウスは、腫瘍を形成し、腫瘍容積の定量的測定のために、緩和促進での高速収集（rapid acquisition with relaxation enhancement）（ＲＡＲＥ）Ｔ_１強調プロトコール（ＴＥ＝８．５ミリ秒、ＴＲ＝２５００ミリ秒、平均の数＝４、ＲＡＲＥファクター＝４、ＦＯＶ＝４×４ｃｍ^２、マトリックスサイズ＝１２８×１２８ピクセル、スライスの数＝５０、スライス厚さ＝０．５ｍｍ、およびスライス間厚さ＝０．５ｍｍ）およびＴ_２強調プロトコール（ＴＥ＝８．５ミリ秒、ＴＲ＝７５００ミリ秒、平均の数＝４、ＲＡＲＥファクター＝１６、ＦＯＶ＝４×４ｃｍ^２、マトリックスサイズ＝１２８×１２８ピクセル、スライスの数＝５０、スライス厚さ＝０．５ｍｍ、およびスライス間厚さ＝０．５ｍｍ、フリップ角＝１６２度）を利用するＭＲ画像化によりモニターした。マルチスライスマルチエコー（ＭＳＭＥ）Ｔ２強調マップを、以下のパラメータを用いて収集した：ＴＥ＝８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、および８０ミリ秒、ＴＲ＝４５００ミリ秒、スライスの数＝５、スライス配向＝軸方向、平均の数＝１、ＲＡＲＥファクター＝１、撮影視野（field of view）＝４×４ｃｍ^２、マトリックスサイズ＝１２８×１２８ピクセル、スライス厚さ＝０．５ｍｍ、スライス間厚さ＝０．５ｍｍ、フリップ角＝１２８度）。腫瘍容積の測定およびＴ２マップの再構築は、関心領域（ＲＯＩ）選択の変動性の原因となる試料アイデンティティを知らされていない２人の独立した研究者によって実施された。腫瘍におけるＴ２マップおよびＴ２緩和時間を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖｅｒ．１．５０ｃ、ＮＩＨ）を用いて計算した。緩和率Ｒ２を、緩和時間の逆数として得た。結果として、緩和率の変化（ΔＲ２）は、ＭＮにおける酸化鉄の濃度に比例する。ΔＲ２は、以下の方程式：Ｓ＝Ｓ_０ Ｅｘｐ（ＴＥ／Ｔ_２）、△Ｒ２＝１／Ｔ_２，１－１／Ｔ_２，２＝（１／ＴＥ）＊ｌｎ（Ｓ_１／Ｓ_２）を用いて計算され、方程式：△Ｒ２＝ｒ２・△［Ｃ］に従って、ＭＮの濃度に相関した。全てのΔＲ２値は、０週間目に対して計算された。

動物モデル
週齢６週間の雌マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６、ｎ＝１２）に、マウス膵癌細胞株、Ｐａｎ０２細胞（０．２５×１０^６細胞）を右側腹部に移植した。細胞注射から１週間後、腫瘍サイズを、ノギス測定によりモニターした。腫瘍容積を、以下の方程式に従って計算した：容積＝０．５×Ｌ×Ｗ^２、式中、Ｌは長さ、Ｗは幅である。ノギスを用いて見積もられた場合、腫瘍体積が５０ｍｍ^３に達するとすぐに、処置を開始した。その後、腫瘍容積を、マウスを本研究に登録した時点、ならびにそれぞれの毎週の処置の前および後にＭＲＩにより測定した。全ての動物実験は、施設内ガイドラインに従って実施され、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）により承認された。

治療
マウス（ｎ＝６）を、実験群（ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１＋ゲムシタビンで処置される）または対照群（ＭＮ－ｓｉＳＣＲ＋ゲムシタビンで処置される）へランダムに割り当てた。実験群におけるマウスを、ゲムシタビン（３３３．３ｍｇ／ｋｇ）を含む溶液中低用量ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１（鉄として１０ｍｇ ｋｇ^－１；５２０ナノモル／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）、またはゲムシタビン（３３３．３ｍｇ／ｋｇ）を含む溶液中高用量ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１（鉄として１０ｍｇ ｋｇ^－１；９３７ナノモル／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）で処置した。対照群におけるマウスは、同じ用量でＭＮ－ｓｉＳＣＲおよびゲムシタビンを受けた。どちらの場合も、薬物を、ナノドラッグとゲムシタビンの混合物として尾静脈を通して（ｉ．ｖ．注射）週１回の頻度で投与した。７週間目の後、ゲムシタビンの同時投与を、最大耐容量を超えることを避けるために中断し、ナノドラッグのみを、研究の終わりまで投与した。全てのマウスは、最初の処置後最大１２週間、または動物が瀕死状態になるまで、腫瘍容積の変化の記録をつけるために磁気共鳴画像法により毎週、モニターした。

統計解析
データは、示されている場合、平均±ｓ．ｄ．またはｓ．ｅ．ｍ．として表された。統計比較は、両側ｔ検定（ＳｉｇｍａＳｔａｔ ３．０；Ｓｙｓｔａｔソフトウェア、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて引き出された。Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であると見なされた。

[実施例１]
膵癌免疫療法のためのＲＮＡｉ媒介性ＰＤ－Ｌ１阻害
ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１は、原発性腫瘍へインビボで送達することができ、その送達は、非侵襲性ＭＲＩによりモニターすることができる。

静脈内注射後、治療的量のｓｉＲＮＡを腫瘍細胞へ成功裏に送達するために、本発明者らは、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の設計を、水力学的サイズ、コンジュゲーション方法、およびナノ粒子あたりのｓｉＲＮＡオリゴの数に関して最適化する必要があった。ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の例示的な合成スキームは図１Ａに図示されている。長い循環時間（＞４時間）および血管内皮を通って、かつ腫瘍間質に渡る効率的な拡散を保証するために、本発明者らは、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１を、ＳＰＤＰリンカーおよびそのオリゴへの連続的コンジュゲーション後のそれの最終サイズが２３．２±０．９ｎｍであるように、設計した。ナノ粒子あたりのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの数は、生体共役反応への立体干渉を最小限にすることを目的として４．８±０．７以下へ調整された。この設計は、血管透過性－貯留性亢進（Enhanced Permeation-Retention）（ＥＰＲ）効果を通して腫瘍組織によるナノドラッグの取り込みを亢進するように最適化される。加えて、ＳＰＤＰリンカーは、それの還元可能な性質により選択され、その性質は、癌細胞におけるナノ粒子からのオリゴの解離、およびＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）への効率的な移行を保証する。最後に、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の磁気共鳴画像法による検出を可能にするために、最終調製物の緩和能（Ｒ２）を、８２．５ｍＭ^－１秒^－１のＲ２を達成するように［Ｆｅ^３＋］／［Ｆｅ^２＋］の比率を変化させることにより調整した（図１Ｂ）。

効果的な治療プロトコールを確立するために、本発明者らは、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の膵臓腫瘍組織への送達を確認すること、およびＭＲＩが、腫瘍におけるＭＮ－ｓｉＰＤＬ１生物学的利用率を半定量的に測定する能力を実証することを必要とした。本発明者らは、本発明者らの仮説を、ＰＡＮ０２同系膵癌モデルを用いて試験した。これらの動物は、接種から２週間後、腫瘍を形成し、シングルエコーおよびマルチエコーＴ_２強調プロトコールを用いるＭＲ画像化によりモニターされた。緩和率の差（ΔＲ_２）は、以下の方程式を用いて計算された：Ｓ＝Ｓ０ Ｅｘｐ（ＴＥ／Ｔ２）、△Ｒ_２＝１／Ｔ２，１－１／Ｔ２，２＝（１／ＴＥ）＊Ｌｎ（Ｓ１／Ｓ２）、および△Ｒ_２＝ｒ_２・△［Ｃ］。腫瘍組織におけるＭＮ－ｓｉＰＤＬ１分布の可視化のために、Ｔ２マップを、マルチエコーＴ_２強調画像セットから再構築した。

図２Ａに示されているように、腫瘍組織におけるＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の局在は、Ｔ２緩和時間の短縮を引き起こし、造影剤投与前の画像と比較して、陰性コントラストを生じた。ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１のΔＲ２由来濃度は、最初の３週間の間、線形増加を示した。ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の蓄積速度は、その期間の間、ＭＮ－ｓｉＳＣＲの蓄積速度より１．５倍速かった（図２Ｂ）。腫瘍細胞におけるナノドラッグの濃度は、ほとんど、細胞分化による希釈を反映し、ＭＮ－ｓｉＳＣＲで処置された対照腫瘍のより速い成長速度が、この群において観察された、時間経過による濃度のより遅い増加をもたらした可能性が高い。この差は、腫瘍成長のより後期においてより顕著であり、この仮説をさらに裏付けている。ＭＮ－ｓｉＳＣＲで処置された対照群における腫瘍細胞分化による迅速なナノドラッグ希釈を反映した、濃度減少の速度は、ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１で処置された実験群における濃度減少速度の５．１倍であり、対照動物における腫瘍のより迅速な成長を示している（図２Ｃ）。

ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１での併用処置は、同系膵癌のモデルにおいて有効である。

本発明者らの治療研究は、膵癌におけるゲムシタビンとＭＮ－ｓｉＰＤＬ１の併用処置の潜在能力を例証した。これらの研究において、膵癌の同系モデルは、週齢６週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部にマウス膵癌細胞株ＰＡＮ０２を移植することにより作製された。

ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１と組み合わせたゲムシタビンでの処置が、腫瘍成長を阻害することができるかどうかを決定するために、マウスを、尾静脈を通して静脈内に（ｉ．ｖ．）送達される低用量のＭＮ－ｓｉＰＤＬ１もしくはｓｉＳＣＲ（両方の群において１０ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ；５２０ナノモル／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）または高用量のＭＮ－ｓｉＰＤＬ１もしくはｓｉＳＣＲ（両方の群において１０ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ、９３７ナノモル／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）を含む溶液中のゲムシタビンで処置した。併用処置を、解剖学的ＭＲ画像化により測定された場合、腫瘍サイズが＞５０ｍｍ^３に達した時に開始し、１２週間、継続した。治療研究の全てにおいて、腫瘍容積の変化を、それぞれの毎週の処置の投与前に解剖学的ＭＲ画像化によりモニターした（図３Ａ）。

ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１およびゲムシタビンでの同時処置されたマウスは、非活性ＭＮ－ｓｉＳＣＲ対照と比べて、腫瘍成長の有意な阻害を示した（Ｐ＜０．０５）。この差は、腫瘍容積が０週間目における５２．８±６．７ｍｍ^３から２週間目における５．３±０．８ｍｍ^３へ減少した時の、処置の開始から２週間目において明らかであった（ｐ＝０．０１２）。その差は、本研究の期間中、持続した（ｐ＜０．０５）。低用量群における腫瘍容積は、６週間目までＭＮ－ｓｉＳＣＲ対照と異ならなかった（図３Ａ～Ｂおよび図５Ａ～Ｄ）。

高用量ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１群において、マウスの６７％が、腫瘍成長の阻害として定義される処置に対する客観的応答を示した。マウスの３３％が、応答することができず、６週間後に死亡し、応答のばらつきを示している。応答によって実験動物を層別化する腫瘍成長の時定数は表１に提示されている。

最後に、動物生存率を評価した時、併用処置の優位性が明らかに見られた（図３Ｃ）。ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１（高用量）で処置されたマウスの６７％が１２週間目まで生存した。ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＰＤＬ１（低用量）で処置されたマウスの６７％が、８週間目まで生存した。ＭＮ－ｓｉＳＣＲおよびゲムシタビンで処置された対照マウスの全部は、６週間目までに死亡した。

興味深いことに、ゲムシタビンおよびＭＮ－ｓｉＳＣＲで処置された群におけるマウスの全部が、おそらく高速の腫瘍成長のせいで、大きな壊死性腫瘍を生じた。腫瘍壊死および潰瘍化は、実験動物において見られなかった（図３Ｄ）。

併用処置は、細胞傷害性Ｔ細胞の不活性化を防止した
抗腫瘍免疫応答への処置の効果を評価するために、本発明者らは、処置されたマウスの腫瘍における免疫細胞の動員および活性化の組織バイオマーカーを分析した。ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１およびゲムシタビンでの併用処置後、ＰＤ－Ｌ１発現は有意に低下した。ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の動員、およびグランザイムＢのより高いレベルにより証明されているように、細胞媒介性細胞傷害の増加の証拠があった。免疫抑制性Ｆｏｘｐ３＋ 制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による腫瘍浸潤もまた、有意に低下した。最後に、腫瘍細胞増殖が阻害された（図４Ａ～Ｂ）。興味深いことに、高用量ＭＮ－ｓｉＰＤＬ１およびゲムシタビンで処置された非応答性動物におけるこれらのバイオマーカーの発現は、対照動物と退行する実験動物との中間であり、肉眼的応答を観察するために必要とされるＰＤ－Ｌ１阻害の臨界レベルがあることを示唆している（図４Ａ～Ｂ）。これらの結果は、観察された治療効果が、抗腫瘍免疫応答の誘導の成功の結果であることを示唆した。

参考文献

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、例証することを意図され、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることは、理解されているはずである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
治療用ナノ粒子であって、前記ナノ粒子が
１０ｎｍ～３０ｎｍの間の直径を有し、ならびに
酸化鉄コア、ポリマーコーティング、および前記ナノ粒子へ共有結合性に連結されている、免疫チェックポイント分子を標的化する阻害性核酸を含み、
好ましくは、前記チェックポイント分子がプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）である、治療用ナノ粒子。
［発明２］
前記核酸が、配列番号１と相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む、発明１に記載の治療用ナノ粒子。
［発明３］
前記核酸が、少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、発明１に記載の治療用ナノ粒子。
［発明４］
前記少なくとも１個の改変ヌクレオチドがロックドヌクレオチドである、発明３に記載の治療用ナノ粒子。
［発明５］
前記ポリマーコーティングがデキストランを含む、発明１に記載の治療用ナノ粒子。
［発明６］
前記核酸が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、発明１に記載の治療用ナノ粒子。
［発明７］
前記核酸が、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を含む化学的部分を通してナノ粒子へ共有結合性に連結されている、発明１に記載の治療用ナノ粒子。
［発明８］
前記ナノ粒子が磁性である、発明１に記載の治療用ナノ粒子。
［発明９］
発明１～８のいずれか一つに記載の治療用ナノ粒子および、任意で、化学療法剤を含む薬学的組成物。
［発明１０］
治療的有効量の、発明１～８のいずれか一つに記載の治療用ナノ粒子および化学療法剤を、癌を有する対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置するための方法。
［発明１１］
対象において癌を処置することにおける使用のための、発明１～８のいずれか一つに記載の治療用ナノ粒子および化学療法剤。
［発明１２］
前記癌が、乳癌、結腸癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、および子宮癌からなる群から選択される、発明１０に記載の方法または発明１１に記載の使用。
［発明１３］
対象における癌細胞の位置もしくは数、または対象における治療用ナノ粒子の位置を決定するために、対象の組織を画像化することをさらに含む、発明１０に記載の方法または発明１１に記載の使用。
［発明１４］
前記治療用ナノ粒子が、対象に２回以上の用量で投与される、発明１０に記載の方法または発明１１に記載の使用。
［発明１５］
前記治療用ナノ粒子が対象に少なくとも週１回、投与される、発明１４に記載の方法または使用。
［発明１６］
前記治療用ナノ粒子が、対象に静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、または腹腔内投与により投与される、発明１０に記載の方法または発明１１に記載の使用。
［発明１７］
前記対象が膵癌を有する、発明１０に記載の方法または発明１１に記載の使用。
［発明１８］
前記化学療法剤がゲムシタビンである、発明１０もしくは１６に記載の方法または発明１１に記載の使用。
［発明１９］
前記化学療法剤がゲムシタビンである、発明９に記載の薬学的組成物。

Claims (17)

1. 治療用ナノ粒子であって、前記ナノ粒子が、
   １０ｎｍ～３０ｎｍの間の直径を有し、ならびに
   酸化鉄コア、デキストランポリマーコーティング、および、前記ナノ粒子へ共有結合性に連結されている、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的化する阻害性核酸を含み、かつ、
   前記ナノ粒子が、ターゲティングペプチドを含まない、
   前記治療用ナノ粒子。
2. 前記ナノ粒子が、
   １０ｎｍ～３０ｎｍの間の直径を有し、ならびに
   酸化鉄コア、デキストランポリマーコーティング、および、前記ナノ粒子へ共有結合性に連結されている、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的化する阻害性核酸からなり、かつ、
   前記ナノ粒子が、ターゲティングペプチドを含まない、
   請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
3. 前記核酸が、配列番号１と相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む、請求項１又は２に記載の治療用ナノ粒子。
4. 前記核酸が、少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の治療用ナノ粒子。
5. 前記少なくとも１個の改変ヌクレオチドがロックドヌクレオチドである、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
6. 前記核酸が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１又は２に記載の治療用ナノ粒子。
7. 前記核酸が、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合を含む化学的部分を通してナノ粒子へ共有結合性に連結されている、請求項１又は２に記載の治療用ナノ粒子。
8. 前記ナノ粒子が磁性である、請求項１又は２に記載の治療用ナノ粒子。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子を含む薬学的組成物。
10. 癌を有する対象を処置するために用いられる、請求項９に記載の薬学的組成物。
11. 対象において癌を処置する方法における使用のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。
12. 前記癌が、転移性癌である、請求項１０に記載の薬学的組成物または請求項１１に記載の治療用ナノ粒子。
13. 前記癌が、乳癌、結腸癌、腎癌、肺癌、皮膚癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、および子宮癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の薬学的組成物または請求項１１に記載の治療用ナノ粒子。
14. 前記処置する方法が、対象における癌細胞の位置もしくは数、または対象における治療用ナノ粒子の位置を決定するために、対象の組織を画像化することを含む、請求項１１に記載の治療用ナノ粒子。
15. 前記治療用ナノ粒子が、対象に２回以上の用量で投与されるように用いられる、請求項１０に記載の薬学的組成物または請求項１１に記載の治療用ナノ粒子。
16. 前記治療用ナノ粒子が、対象に少なくとも週１回、投与されるように用いられる、請求項１５に記載の薬学的組成物または治療用ナノ粒子。
17. 前記治療用ナノ粒子が、対象に静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、または腹腔内投与により投与されるように用いられる、請求項１０に記載の薬学的組成物または請求項１１に記載の治療用ナノ粒子。