JP7466875B2 - Sparcを発現する癌の治療用組成物 - Google Patents
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Description
グレード1:毛様細胞性星状細胞腫(pilocytic astrocytoma)
グレード2:びまん性星状細胞腫
グレード3:退形成性星状細胞腫(anaplastic astrocytoma)
グレード4:膠芽細胞腫(glioblastoma)
1.1.細胞株(cell lines)
ヒト神経膠腫細胞(U87MG)としては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection、ATCC;Manassas、VA、USA)および低SPARC発現U87MG細胞であるU87MG-shSPARCを用いた。
ヒト血清アルブミン(MP biomedicals、Irvine、CA、USA)を22mg/mLの濃度でPBSに溶解した。CDDP(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、USA)をPBSに1mg/mLの濃度に溶解した。
HSA及びHSA-CDDPをFNR648蛍光染料と結合した。HSA-CDDPは、ジベンゾシクロオクチン(DBCO、Dibenzocyclooctyne)-NHSを用いて修飾した。DBCO-HSA-CDDPは、37℃で30分間1:1のモル比でFRN648染料と反応させた。蛍光標識されたHSA-CDDPは、PD-10カラム(GE Healthcare、Buckinghamshire、イギリス)を用いて精製し、PBSで溶出させた。
蛍光標識されたHSAまたはHSA-CDDPを細胞取り込みさせた。37℃で2時間、FNR648-HSAまたはFNR648-HSA-CDDPで細胞を培養した。外因性SPARC処理群では、ヒトSPARC(5μg/mL)および各化合物(FNR648-HSAまたはFNR648-HSA-CDDP)を37℃で2時間共同培養した。細胞によるFNR648-HSAまたはFNR648-HSA-CDDPの取り込みを定量化するために、全てのテストにおいて5つのランダム画像を得た。各群におけるFNR648-HSAまたはFNR648-HSA-CDDPの平均シグナル強度をDAPI陽性細胞の数で割った。これは画像における生存可能な細胞の数を示す。この割合は、各群の細胞取り込みと見なされ、各物質の細胞取り込みを定量化するのに使用した。
U87MGおよびU87MG-shSPARC細胞を96ウェルプレート(4000細胞/ウェル)に添加した。一晩培養した後、細胞をCDDPまたはHSA-CDDPと共に互いに異なる濃度で72時間培養した。細胞生存率は、メーカーのプロトコルに従って細胞計数キット-8(CCK-8、Dojindo Molecular Technologies、Tokyo、Japan)を用いて分析した。
U87MGおよびU87MG-shSPARC細胞を6ウェルプレート(1.2×105細胞/ウェル)に配置した。一晩培養した後、細胞をCDDPまたはHSA-CDDPで72時間処理した。次に、細胞を回収し、アネキシン(Annexin)V-FITC細胞死検出キット(BD、San Jose、CA、USA)を用いてPIおよびアネキシンVで共同染色した。細胞の細胞死は、フローサイトメトリーで分析した。
すべての動物研究は、ソウル大学の動物実験および使用委員会(IACUC No.18-0231、2018.11.01)の承認を得て行った。BALB/cヌードマウス(5週齢、オス)はオリエントバイオ社(Orient Bio Inc.(韓国、ソンナム))から購入した。U87MGまたはU87MG-shSPARC細胞(2×106個の細胞/部位)を右下脇腹に皮下注射した。
正常マウスを2つの群に分けて(各群に対してn=4)、抗腫瘍効果の検査と同じ容量および時間スケジュールでCDDPまたはHSA-CDDPをIV投与した(3mg/kgのCDDPおよびHSA-CDDPのCDDP等価容量、隔日、7回)。最後のIV投与72時間後(初回のIV投与15日後)にマウスを安楽死させ、臓器(脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓及び肺)および血液を取得して重量を測定した。
マウスに対して、PBS、CDDPまたはHSA-CDDP(各群に対してn=4)を療法治療(the therapy treatment)(隔日、7回)で処理し、マウスの血液サンプル(murine blood samples)を最終投与72時間後(初回のtreatmentから15日後)に採取した。4℃で20分間遠心分離した後、血液生化学分析のために血漿を収集した。AST、ALT、BUN及びクレアチニンの濃度は、DKKorea(ソウル、韓国)で分析された。
薬物処理されたマウスの腎臓、肝臓および脾臓を取得し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。組織をパラフィン(paraffin)に包埋し、ヘマトキシリン&エオシン(H&E)で染色した。H&E染色画像は、光学顕微鏡(Olympus BX43、Tokyo、Japan)を用いて撮影した。
血清中のHSA-CDDPのCDDP安定性を測定した。血清アルブミン/HSA-CDDP溶液を37℃で培養し、血清中の遊離CDDPは、培養0.5、1、2、4、8、16、24、48、72及び120時間後に測定した。血清から遊離CDDPを得るために、アミコン・ウルトラ遠心分離フィルター装置(公称分子量の制限30kDa; Millipore、Burlington、MA、USA)を用いた。上清液(チューブの底部、30KDa未満)で測定されたCDDP濃度は遊離CDDPのレベルに相当する。上清液のCDDP濃度は、NCIRFに設置された誘導結合プラズマ質量分析計(Inductively coupled plasma-mass spectrometry、ICP-MS;NexION 350;PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用いて分析した。
Nano SPECT/CT plus(Mediso medical imaging system、Budapest、Hungary)を用いて、腫瘍を有するマウスの小動物用SPECT画像を撮影した。マウスに尾静脈を介して18.5MBqの177Lu-HSAまたは177Lu-HSA-CDDPを注入した。SPECT画像は、注入10分、4時間、24時間、48時間および72時間後に撮影した。SPECT画像を得るために、マウスを2%イソフルランで麻酔した。SPECTスキャンは、フレーム当たり30秒、18゜角度ステップ(angular step)の40個のプロジェクション(フレーム)から収集した。177Luのエネルギーピークは56.1keV 10%、112.9keV 10%、および208.4keV 10%に設定した。SPECTで再構成されたデータは、InVivoScope(Bioscan、Washington、DC、USA)を用いて可視化した。
腫瘍および腎臓を4%パラホルムアルデヒドで固定してパラフィンに挿入し、4μmの切片に切った。腎臓における細胞死を評価するために、メーカーのプロトコルに従ってTUNELアッセイキット-HRP-DAB(ab206386;abcam、イギリスのケンブリッジ)を用いて腎臓切片を染色した。
全ての統計分析は、グラフパッド・プリズム(GraphPad Prism)を用いて行った。スチューデントのt検定(Student's t-test)を用いて、HSA-CDDPの細胞取り込み、異種移植の腫瘍モデルにおけるHSA-CDDPの抗腫瘍効果、およびマウスにおけるHSA-CDDPの生体分布の統計的有意性を決定した。0.05未満のPの値は統計的有意性を有するものとみなした。
2.1.HSA-CDDPの特性
HSA-CDDPの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight、MALDI-TOF)で分析した。測定されたHSA-CDDPの分子量は67,522±129Daであった。HSAの1モル当たりのCDDPの割合は、HSA-CDDPとHSAとの間の分子量の差から計算した。HSAの1モルに結合したCDDPの平均分子数は4.07であった。CDDPをHSAに結合した後、MALDI-TOFを用いてHSA-CDDPの分子量を測定した。
癌細胞の生存力に対するHSA-CDDPの効果を調査した。
HSA-CDDPの細胞毒性は、細胞計数キット(cell counting kit-8、CCK-8)アッセイを用いて、U87MGおよびU87MG-shSPAR細胞を用いて研究した。
HSA-CDDPの治療効果は、U87MGおよびU87MG-shSPARC細胞を使用する異種移植腫瘍マウスモデルで調べた。薬物投与は、腫瘍サイズが50mm3に達したときに開始し、腫瘍体積が2000mm3に達するまで腫瘍成長を観察した。マウスにPBS(Phosphate buffered saline)、CDDPまたはHSA-CDDPを隔日で合計7回静脈注射で投与した。
HSA-CDDPの生体分布は、最後のHSA-CDDP処理72時間後、正常マウスおよび腫瘍保持マウスにおける抗腫瘍効果(2日に1回ずつ7回投与、最初のHSA-CDDP処理15日後に開始)を分析した。
抗腫瘍効果に関する結果から、CCDPで処理したマウスは、PBSで処理したマウスと比較して相当な体重減少を示した。この結果は、インビボ・システムのCDDPにネガティブな影響を及ぼす可能性があることを示す。
Claims (7)
- アルブミン及びそれに結合した1つ以上のシスプラチンを含むSPARC(Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine)を発現する癌の治療用組成物であって、
前記シスプラチンは、前記アルブミンの表面に配位結合しており、前記アルブミン1分子当たりに前記シスプラチンが1~5個結合し、前記癌は神経膠腫であり、前記シスプラチンの腎毒性を減少させた、癌の治療用組成物。 - 前記アルブミンに4つの前記シスプラチンが結合して結合体を形成した場合、前記結合体の分子量は65,000~70,000Daである、請求項1に記載の癌の治療用組成物。
- 前記アルブミンに4つの前記シスプラチンが結合して結合体を形成した場合、前記結合体の大きさは5nm~100nmである、請求項1に記載の癌の治療用組成物。
- 前記シスプラチンは、前記アルブミン表面のHis側鎖残基またはMet側鎖残基に結合したものである、請求項1に記載の癌の治療用組成物。
- 前記シスプラチンに前記アルブミン表面のHis105またはHis288が結合したものである、請求項4に記載の癌の治療用組成物。
- 前記シスプラチンに前記アルブミン表面のMet298、Met329またはMet548が結合したものである、請求項4に記載の癌の治療用組成物。
- 前記神経膠腫は、星状細胞腫、膠芽細胞腫、および乏突起膠腫からなる群より選択される1つ以上である、請求項1に記載の癌の治療用組成物。
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