JP7462411B2 - 歯周病様状態に誘導された三次元歯肉上皮モデルの製造方法 - Google Patents
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Description
歯周病の予防、治療法を評価するにあたり、歯周病原性細菌に対する抗菌試験や、歯肉由来細胞を用いた試験法に関する研究が進められている。しかしながら、これら試験では、歯周病原性細菌に対する独立した抗菌試験や、歯肉由来細胞の応答を評価する試験が一般的であり、歯周病原性細菌と歯周組織をin vitro系で組み合わせて試験している例は少ない。
オーラルケア分野では、動物実験が一般的であった背景もあり、歯肉上皮細胞を立体構築した三次元組織モデルについては十分に研究されていない。三次元組織モデルは個体差が少ないこともあり、抗菌剤を含む製剤および薬剤評価試験への活用が期待できる。さらに動物愛護の観点からも、今後は三次元組織モデルの活用が望まれている。
三次元歯肉モデルに歯周病菌を接種し、歯周病原性細菌を歯肉組織内に侵入させる状態を作り出すことができれば、これまでの独立した菌または細胞の試験のレベルからより生体環境に近い状態を模すことができる。
しかしながら、歯周病原性細菌自体を歯肉組織に感染させることにより歯周病様状態を誘導する方法については報告がない。
対象とする歯周病原性細菌は、一般的に嫌気性条件を好む菌が多く、三次元歯肉モデルの培養条件下では生育しにくいことが考えられる。また、口腔粘膜モデルと異なり、歯肉上皮モデルは角化した層、すなわち、角化組織を有していることから容易に歯周病原性細菌を進入させることは困難であると考えられた。
そこで、三次元歯肉上皮モデルを用いて、歯周病原性細菌を感染させた歯周病様状態のモデルを作製する方法を考案した。歯周病原性細菌が感染した歯周病様状態により近いモデルを作製することができれば、歯周病の予防・治療研究に有用である。
代表的な歯周病原性細菌は、嫌気性菌に属するが、三次元歯肉上皮モデルは嫌気環境下で培養しないため、嫌気性を好む歯周病原性細菌の感染は困難であると考えられた。
本発明は、歯周病原性細菌を感染させた三次元歯肉上皮モデルの製造方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の一形態によれば、三次元歯肉上皮モデルの組織内に嫌気性の歯周病原性細菌を進入させた歯周病様状態に誘導された三次元歯肉上皮モデルの製造方法が提供される。
本発明の一形態は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルの角化組織側もしくは培地側に、歯周病原性細菌を、又は歯周病原性細菌及び病原因子を添加し、嫌気性条件下にて培養する、三次元歯肉上皮モデルの組織内に歯周病原性細菌を感染させた歯周病様状態に誘導された三次元歯肉上皮モデルの製造方法である。
三次元歯肉上皮モデルとは、ヒト歯肉上皮にきわめて類似した組織学的形態を有する人工再生組織モデルであり、角化組織を有する。
本発明に係る製造方法では、上記正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、歯周病原性細菌及び病原因子を角層側、すなわち、角化組織側から添加もしくはこれらを含む培地で、嫌気条件下にて培養することを有する。これにより、効果的に歯周病原性細菌を歯肉上皮細胞に感染させ、歯周病様状態へと誘導することができる。感染とは、組織内に侵入し組織が脆弱になる意味合いを含む。
培地に含まれる歯周病原性細菌の量は、歯周病様状態を誘導することができれば特に制限されないが、例えば1.0×104~1.0.×109CFU/モデルであり、好ましくは1.0×106~1.0×108CFU/モデルである。
病原因子は、ヒト口腔内から採取された口腔内細菌やヒト体内から採取された病原細菌、これらの細菌由来の成分などを超音波処理により微細化する方法で調製することができる。また、市販品を用いることもでき、例えばLipopolysaccharide,from E.coli O111(富士フイルム和光純薬株式会社)、LPS-PG(LPS P.gingivalis由来)(ナカライテスク株式会社)などが挙げられる。
培地に含まれる病原因子の量は、特に制限されないが、例えば0.01~1000μg/mLであり、好ましくは10~500μg/mLであり、より好ましくは50~200μg/mLである。
嫌気性条件にする方法としては、酸素がない環境であれば、特に制限されないが、例えば嫌気性のグローブボックス、嫌気性チャンバー、密閉容器に脱酸素剤を入れる方法や、真空ポンプにて空気を吸引する方法などが挙げられる。
したがって、本発明に係る製造方法においては、上記誘導工程後、歯周病原性細菌の感染を免疫染色法などにより観察する工程を有する。さらに、歯肉細胞の組織学的な変化を測定または観察する工程を含む場合もある。
1.試験概要
三次元歯肉上皮モデルをP.gingivalisおよびLPSを含む培地で嫌気性条件下にて培養し、組織内にP.gingivalisを感染させた三次元歯肉上皮モデルを作製し、組織学上の変化を確認した。
三次元歯肉上皮モデル:SkinEthic(登録商標) HGE(株式会社ニコダームリサーチ)
歯周病原性細菌:P.gingivalis JCM12257
細菌内毒素:Lipopolysaccharide, from E.coli O111(富士フイルム和光純薬株式会社)
PBS(-):リン酸緩衝生理食塩水。
SkinEthic(登録商標) HGE(以下、「HGE」とも称す)を製造会社のプロトコルに従って、維持培地(MAINTENANCE MEDIUM)を添加したプレートにて馴化した。培地として、維持培地(コントロール)もしくは、200μg/mLのLipopolysaccharide, from E.coli O111(以下、「E.coli LPS」とも称す)を含有する維持培地を別のプレートに2mL添加して、馴化したHGEを設置した。設置後、150μLのP.gingivalis懸濁液をHGE上部に添加して、37?Cの嫌気性条件下にて培養を開始した。嫌気性条件は、培養プレートを嫌気チャンバーに入れたのち、脱酸素剤を封入して設定した。
6時間培養後、PBS(-)でHGEの上部を洗浄し、P.gingivalisを除去した後、新しい維持培地を150μL添加し、37?Cの嫌気性条件下で培養した。
48時間培養後、HGEから凍結切片を作成してP.gingivalisに対する抗体を用いて免疫染色し、組織切片像を顕微鏡(カールツァイス社製、倍率:100)で観察した。
免疫染色後の組織切片像を図1に示す。好気性条件下で、LPSを含む培地で培養した場合P.gingivalisは組織の上部で検出され組織内部ではほとんど検出されなかった。一方、嫌気性条件下で培養した場合では、P.gingivalisの組織内への侵入が観察された。さらに、嫌気性条件下でかつ、LPSを含む培地で培養した場合には、P.gingivalisの組織内部への侵入が観察された。組織切片像においても、組織の厚さが薄く脆弱に変化している様子も確認された(図1)。
P.gingivalisの接種6時間に比較して、P.gingivalis除去後の48時間培養後においてP.gingivalisのHGE組織内での増殖が観察された。このことから、組織内に感染したP.gingivalisが組織内で増殖していることが確認される(図1)。
48時間培養後のHGEの細胞生存率をアラマブルー法にて評価したところ、細胞生存率への影響は認められなかった。
2 三次元歯肉上皮モデルのウェル
3 培地ウェル(プレート)
4 培地
5 脱酸素剤を封入した嫌気チャンバー
6 脱酸素剤
Claims (2)
- 正常状態の三次元歯肉上皮モデルの角化組織側もしくは培地側に、歯周病原性細菌を添加し、嫌気条件下にて培養する、三次元歯肉上皮モデルの組織内に歯周病原性細菌を感染させた歯周病様状態に誘導された三次元ヒト歯肉上皮モデルの製造方法。
- 正常状態の三次元歯肉上皮モデルの角化組織側もしくは培地側に、歯周病原性細菌及び病原因子を添加し、嫌気条件下にて培養する、三次元ヒト歯肉上皮モデルの組織内に歯周病原性細菌を感染させた歯周病様状態に誘導された三次元ヒト歯肉上皮モデルの製造方法。
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