JP7462184B2 - α-グルコシダーゼ阻害剤、インベルターゼ阻害剤、及び糖吸収阻害剤 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、下記のα-グルコシダーゼ阻害剤又はインベルターゼ阻害剤を提供する。
以下、本発明が実施例を用いて詳細に説明されるが、本発明は下記の実施例に限定されないことは言うまでもない。
以下、化合物(I)についてα-グルコシダーゼ阻害の効果を評価した。
化合物(I)は、カエデ科カエデ属樹木の樹液及びメープルシロップ(BASCOM MAPLE FARMS INC.:以下、単に「樹液等」とも称する。)から得た。具体的には、50μLの0.3mol/L水酸化ナトリウム、及び50μLの0.5mol/L 1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン(以下「PMP」とも称する:キシダ化学社製)メタノール溶液を200μL相当の樹液の乾燥試料(メープルシロップ10μLまたはメープルシュガー10mg)に添加して、70℃、30分間加熱した。加熱後の混合液に、0.3mol/L塩酸を50μL加えて中和し、ついで、100μLの蒸留水で希釈し、200μLのクロロホルムで3回抽出して過剰のPMP試薬を除去することにより、キャピラリー電気泳動用のPMP誘導体を得た。
樹液等を10kDaフィルターで限外濾過してタンパク質を除去し、得られた濾液を更に分子量分画するためにゲル濾過した。長さ1000mm×内径28mmのセファデックスG-15を用いて水を移動相としてゲル濾過を行い、画分をフラクションコレクター(バイオラッド社製model2110)により集めた。得られた画分を高速液体クロマトグラフィー(以下「HPLC」とも称する。)により精製した。化合物(I)に対応するピークは、32-33分に観察され、ピークを示標として高純度で化合物(I)を含む画分を回収した。得られた溶液を凍結乾燥して、標準物質とした。100μgの化合物(I)を100μLの水に溶解し、HPLCを行った。
ダイオードアレイUV検出器を備えたAgilent3Dキャピラリー電気泳動システム(Waldbronn社製モデルG1600A)を使用した。試料は、50ミリバールの圧力で4秒間注入した。分離は、内面未処理の溶融シリカキャピラリーカラム(GLサイエンス社製、全長58.5cm、有効長さ50cm、内径50μm)で行った。泳動液(BGE)の200mmol/Lのホウ酸緩衝液は、200mmol/Lより僅かに高い濃度のホウ酸水溶液にペレット及び0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を添加して、pHメータを用いてpH10.5に調整し、メスフラスコを用いて200mmol/Lに調整した。キャピラリーの両端に15kVの電圧を印加した。各サンプルを注入する前に、システムのフラッシュモードを使用して、0.5mol/L水酸化ナトリウムで1分間、BGEで5分間連続してリンスすることによってキャピラリーをコンディショニングした。検出は、245nmのUV吸収をモニターすることにより行った。測定は、25±1℃で行った。
HPLCシステムは、ポンプ(シマズ社製モデルLC-10AD)、脱気装置(シマズ社製モデルDGU-12A)、コロナVeo検出器(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)から構成される。アサヒパックNH2P-50 4Eカラム(5μm、内径4.6mm×250mm、昭和電工社製)を使用し、移動相は、アセトニトリル/水(3:1;v/v)を用いた。室温(約23℃)にて1ml/分の流速で溶出を行った。20μLの試料を注入した。精製及び分取において、アサヒパックNH2P-50カラム(5μm、内径10.0mm×250mm、昭和電工社製)を用いて、流速を2mL/分とした。調整可能スプリッタ(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を使用し、スプリット比を1:20として、低流量で検出、高流量で分取を行った。
LC-ESI-MS/MS分析は、ESイオン源、パラダイムMS4ポンプ(マイクロバイオソース社製)及びオートサンプラー(HTCPAL、CTCアナリティックス)を備えたFinniganLTQ線形イオントラップ質量分析計(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて行った。イオン化の条件は以下のとおりである。
イオン源電圧:4.5kV
キャピラリー温度:275℃
キャピラリー電圧:25V
シースガス(N2ガス):流量50
補助ガス(N2ガス):流量5
チューブレンズオフセット電圧:90V
衝突誘起溶解(CID:collision induced dissolution)分析のために、ヘリウムガスを衝突ガスとして用いた。正規化衝突エネルギー(normalized collision energy)及び活性化Q値(activation Q value)は、35%、0.18に設定した。LCカラムは、TSKゲルODS-100S(東ソー社製、5μm、150mm×内径2.0mm)を用いた。1H及び13C-NMRは、800MHz及び200MHzのJNM-ECA800装置を用いて得た。NMR測定試料は重水に溶解させた。
酵素反応は、pH4.5の5mmol/L酢酸緩衝液40μL、及び100U/mLインベルターゼ5μLをメープルシロップ10mgに加え、37℃で30分間インキュベートした。反応混合物は、水浴中で1分間加熱して酵素を失活させた。室温で蒸発乾固した後、未消化試料と同条件で、インベルターゼ消化物をPMP誘導体化した。また、50μLのPMP誘導体を蒸発乾固し、pH4.5の5mmol/L酢酸緩衝液45μLに再溶解させて5分間プレインキュベーションを行ったのち、100U/mLインベルターゼ溶液5μLを加えて、15分間インキュベートした。反応液を、水浴中で1分間加熱して酵素を失活させ、キャピラリー電気泳動により分析した。
インベルターゼ阻害分析は、基質のスクロース100μgおよびインベルターゼ阻害剤である化合物(I)1μg、10μgまたは100μgを100mmol/L酢酸緩衝液50μLに加えて、37℃、5分間プレインキュベートした。その後、0.2U/mLインベルターゼ溶液50μLを加え、15分間インキュベートした後、10μLの反応混合物を水浴中で加熱して酵素を失活させ蒸発乾固させた後、PMP誘導体化した。阻害剤を添加せずに同条件で酵素反応を行ったものをブランクとした。各試料において、化合物(I)が酵素の50%を阻害するに要する濃度をIC50とした。化合物(I)の阻害率は、以下の式を用いて計算した。
阻害率(%)=[D1-(D2-D3)/1]×100 ・・・(式1)
D1:ブランク試料のグルコースピーク面積
D2:酵素反応後の各試料のグルコースピーク面積
D3:阻害剤に不純物として含まれるグルコースピーク面積
IC50値は、阻害剤として用いた化合物(I)の用量反応曲線から算出した。
粗酵素混合物として、ラットの腸内アセトン粉末50mgを50mmol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)450μLに加えて、30秒間攪拌後、ホモジナイズした。その後、遠心分離(10000rpm、4℃、20分間)を行い、上清を精製酵素(50mg/450μL)とした。スクロース及び結合が異なる2種のグルコース二糖(マルトース、イソマルトース)を基質として使用した。2種の基質各3.4mgをリン酸緩衝液100μLにそれぞれ溶解し、この各溶液を基質溶液とした。競合阻害剤として化合物(I)3.4mgをリン酸緩衝液1mLに溶解し、100倍希釈した溶液を阻害溶液として用いた。基質溶液100μL及び阻害溶液10μLを混合した後、5分間プレインキュベートし、酵素溶液90μLを加えてインキュベートを開始した。5時間後、反応液のうち10μLを水浴中で10分間加熱して反応を停止し、PMP誘導体化してキャピラリー電気泳動を行った。ブランクは、阻害剤がない同条件の酵素反応液とした。阻害率は、インベルターゼ阻害分析と同じ式を用いて、各基質について計算した。
化合物(I)を用いてWistar系正常ラット及びOLETF糖尿病ラットの糖負荷実験を行った。なお、14時間絶食後に糖負荷を行い、これらのラット尾静脈から採血した血液の各種検査を行った。
メープルシロップについてPMP誘導化を行い、キャピラリー電気泳動により分析した結果を図1に示す。その結果、複数のピークが検出され、それぞれのピークを、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、リボースと同定した。また、*印で示される化合物(I)を同定した。
Claims (12)
- 請求項1に記載のα-グルコシダーゼ阻害剤を含むα-グルコシダーゼ阻害用食品組成物(但し、メープルシロップを除く。)。
- 請求項3に記載のマルターゼ阻害剤を含むマルターゼ阻害用食品組成物。
- 請求項5に記載のイソマルターゼ阻害剤を含むイソマルターゼ阻害用食品組成物。
- 請求項7に記載のスクラーゼ阻害剤を含むスクラーゼ阻害用食品組成物。
- 請求項9に記載のインベルターゼ阻害剤を含むインベルターゼ阻害用食品組成物。
- 請求項11に記載の糖吸収阻害剤を含む糖吸収阻害用食品組成物(但し、メープルシロップを除く。)。
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NAGAI, N. et al.,Changes in Plasma Glucose in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty Rats After Oral Administration of Map,Journal of Oleo Science,2015年,Vol.64, No.3,pp.331-335 |
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