JP7449558B2 - Method for producing novel xyloglucanase and xyloglucan oligosaccharide - Google Patents
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Description
本発明は、キシログルカナーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、キシログルカナーゼの製造方法、及びキシログルカンオリゴ糖の製造方法に関する。 The present invention relates to xyloglucanase, a polynucleotide encoding the same, an expression vector, a transformant, a method for producing xyloglucanase, and a method for producing xyloglucan oligosaccharide.
キシログルカンは、植物に由来する多糖であり、グルコースがβ－１，４結合で連なったセルロース主鎖と、主鎖にα－１，６結合で結合したキシロースの側鎖とを有する、ヘミセルロース多糖の一種である。側鎖には、ガラクトース、アラビノース、フコースなどの他の単糖がさらに含まれる場合もある。多糖類であるキシログルカンの用途を広げるためには、それをオリゴ糖まで分解することが望まれている。 Xyloglucan is a polysaccharide derived from plants, and is a hemicellulose polysaccharide that has a cellulose main chain in which glucose is linked through β-1,4 bonds and xylose side chains linked to the main chain through α-1,6 bonds. It is a type of The side chains may further include other monosaccharides such as galactose, arabinose, and fucose. In order to expand the uses of xyloglucan, a polysaccharide, it is desired to break it down to oligosaccharides.
キシログルカナーゼ（キシログルカン分解酵素とも呼ばれる）は、キシログルカンのセルロース主鎖を切断する酵素である。これまでに報告されているキシログルカナーゼは、主としてキシロース側鎖のないグルコースのβ－１，４結合のみを分解するものであり、そのため、キシログルカンから生産されるオリゴ糖の大部分が、７糖以上の比較的大きなオリゴ糖であった（特許文献１～５及び非特許文献１～３）。 Xyloglucanase (also called xyloglucan degrading enzyme) is an enzyme that cleaves the cellulose backbone of xyloglucan. The xyloglucanases that have been reported so far mainly degrade only the β-1,4 bond of glucose without xylose side chains, and therefore most of the oligosaccharides produced from xyloglucan are heptasaccharides. These were relatively large oligosaccharides as described above (Patent Documents 1 to 5 and Non-Patent Documents 1 to 3).
大きなキシログルカン分子より、低分子（すなわち、７糖未満）のキシログルカンオリゴ糖を生産するためには、キシログルカンのセルロース主鎖を分解する際に、キシロース側鎖のないグルコースのβ－１，４結合に加えて、キシロース側鎖を有するグルコースのβ－１，４結合や、側鎖の結合を分解する必要がある。現状では、キシログルカナーゼに加えて、又はキシログルカナーゼの代わりに、イソプリメベロース生成酵素や、ガラクトシダーゼといった他の糖分解酵素（特許文献６及び７、非特許文献４～６）を複数使用して、キシログルカンを処理する方法が実施されている。 In order to produce xyloglucan oligosaccharides with lower molecular weight (i.e. less than 7 sugars) than large xyloglucan molecules, when decomposing the cellulose backbone of xyloglucan, β-1, In addition to the 4-bond, it is necessary to break down the β-1,4 bond of glucose with a xylose side chain and the bond in the side chain. Currently, in addition to or instead of xyloglucanase, other glycolytic enzymes such as isoprimeverose-generating enzyme and galactosidase (Patent Documents 6 and 7, Non-Patent Documents 4 to 6) are used. , a method for processing xyloglucan has been implemented.
特許文献１～５及び非特許文献１～３に記載のキシログルカナーゼは、いずれもセルロース主鎖中の、キシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合を分解するものであり、側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合を分解することはできない。そのため、従来のキシログルカナーゼのみでは、キシログルカンから７糖未満の低分子オリゴ糖を生産することは難しかった。 The xyloglucanases described in Patent Documents 1 to 5 and Non-Patent Documents 1 to 3 all decompose the β-1,4 bond of glucose to which no xylose side chain is bonded in the cellulose main chain, The β-1,4 bond of glucose attached to the side chain cannot be broken down. Therefore, it has been difficult to produce low-molecular-weight oligosaccharides of less than 7 sugars from xyloglucan using conventional xyloglucanase alone.
また、特許文献６及び７や非特許文献４～６などに開示されているキシログルカナーゼ以外の糖分解酵素を用いる方法では、キシログルカンに対して作用させる酵素の組み合わせや順番などによって得られるオリゴ糖の構造が異なることから、酵素反応を複数回実施しなければならなかった。 In addition, in methods using glycolytic enzymes other than xyloglucanase, such as those disclosed in Patent Documents 6 and 7 and Non-Patent Documents 4 to 6, oligosaccharides obtained by changing the combination and order of enzymes that act on xyloglucan, etc. Because of the different structures, the enzymatic reaction had to be performed multiple times.
よって、１種の酵素を用いたキシログルカンの処理で長さが７糖未満の低分子オリゴ糖を生産するための、より簡便な方法が望まれていた。 Therefore, a simpler method for producing low molecular weight oligosaccharides having a length of less than 7 sugars by treating xyloglucan using one type of enzyme has been desired.
本発明者らはキシログルカンをオリゴ糖化することが可能は新規な酵素について探索した。キシログルカナーゼは糖質加水分解酵素の１つであるが、糖質加水分解酵素はそのアミノ酸配列に基づき、いくつかのグリコシドハイドロラーゼ（ＧＨ）ファミリーに分類されている。キシログルカンをオリゴ糖化する酵素は、主にＧＨ１２ファミリーや、ＧＨ７４ファミリーに分類されており、ＧＨ５ファミリーにも数例発見されている。 The present inventors searched for a novel enzyme capable of oligosaccharifying xyloglucan. Xyloglucanase is one type of carbohydrate hydrolase, and carbohydrate hydrolases are classified into several glycoside hydrolase (GH) families based on their amino acid sequences. Enzymes that oligosaccharide xyloglucan are mainly classified into the GH12 family and the GH74 family, and several examples have also been discovered in the GH5 family.
本発明者らは、麹菌（すなわちAspergillus oryzae）由来のアミノ酸配列の解析や、ＲＮＡ配列に基づくトランスクリプトーム解析によって糖質分解酵素と推定される分子を見出し、ｃＤＮＡを入手後に異種宿主であるPichia pastorisで発現させて酵素を生成し、酵素活性を調べた。その結果、キシログルカンをオリゴ糖化することが可能な酵素をＧＨ５ファミリーから見出し、「キシログルカナーゼＧＨ５－３４１」と命名した。ＧＨ５ファミリーは、主にセルロースを分解する酵素（セルラーゼ）であり、ＧＨ５ファミリーに属する公知の酵素も、上述したように、キシログルカンから７～９糖程度のオリゴ糖を生成するのみであった。よって、このファミリーの中から、アミノ酸配列のみに基づき、キシログルカンを低分子オリゴ糖に分解し得る酵素を見出すことは困難である。 The present inventors discovered a molecule presumed to be a carbohydrate degrading enzyme through analysis of the amino acid sequence derived from Aspergillus oryzae and transcriptome analysis based on the RNA sequence, and after obtaining the cDNA, the molecule was isolated from Pichia, a heterologous host. pastoris to produce the enzyme, and the enzymatic activity was examined. As a result, an enzyme capable of oligosaccharifying xyloglucan was discovered from the GH5 family and named "xyloglucanase GH5-341." The GH5 family is an enzyme (cellulase) that mainly decomposes cellulose, and as mentioned above, the known enzymes belonging to the GH5 family only produce oligosaccharides of about 7 to 9 sugars from xyloglucan. Therefore, it is difficult to find enzymes that can degrade xyloglucan into low-molecular oligosaccharides from this family based only on the amino acid sequence.
キシログルカナーゼＧＨ５－３４１は、既知のキシログルカナーゼとはアミノ酸配列レベルの同一性は３０％以下と低い。また、既報のＧＨ５ファミリーに属するキシログルカナーゼとは異なり、キシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合に加えて、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合をも分解し得る酵素であることを見出した。本発明のキシログルカナーゼＧＨ５－３４１でキシログルカンを処理することによって、他の酵素を使用することなく、キシログルカンから長さが７糖未満の低分子オリゴ糖を生産することを可能にし、本発明を完成するに至った。 Xyloglucanase GH5-341 has a low identity of 30% or less at the amino acid sequence level with known xyloglucanases. In addition, unlike previously reported xyloglucanases belonging to the GH5 family, in addition to the β-1,4 bond of glucose without a xylose side chain, it also has a β-1,4 bond of glucose with a xylose side chain. It was discovered that it is an enzyme that can be decomposed. By treating xyloglucan with xyloglucanase GH5-341 of the present invention, it is possible to produce low-molecular oligosaccharides with a length of less than 7 sugars from xyloglucan without using other enzymes, and the present invention I was able to complete it.
よって、本発明の一実施形態は、以下のキシログルカナーゼ及びそれをコードするポリヌクレオチドである。
［１］ 配列番号３に示すアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ
キシログルカンのセルロース主鎖中の、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合及びキシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合を分解し得る、
キシログルカナーゼ。
［２］ 配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、［１］に記載のキシログルカナーゼ。
［３］ ［１］又は［２］に記載のキシログルカナーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
［４］ 配列番号１に示すヌクレオチド配列、又は配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して８５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［３］に記載のポリヌクレオチド。
［５］ 配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む、［４］に記載のポリヌクレオチド。
［６］ シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、［４］又は［５］に記載のポリヌクレオチド。
［７］ 前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５に示すヌクレオチド配列である、［６］に記載のポリヌクレオチド。
Therefore, one embodiment of the present invention is the following xyloglucanase and a polynucleotide encoding the same.
[1] Contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and contains the xylose side chain in the cellulose main chain of xyloglucan. capable of degrading the bound glucose β-1,4 bond and the unbound glucose β-1,4 bond of the xylose side chain;
xyloglucanase.
[2] The xyloglucanase according to [1], which includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
[3] A polynucleotide encoding the xyloglucanase according to [1] or [2].
[4] The polynucleotide according to [3], comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[5] The polynucleotide according to [4], which includes the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[6] The polynucleotide according to [4] or [5], further comprising a nucleotide sequence encoding a signal peptide.
[7] The polynucleotide according to [6], wherein the nucleotide sequence encoding the signal peptide is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
本発明の他の一実施形態は、発現ベクター及びそれを有する形質転換体である。
［８］ ［３］～［７］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能に連結された、発現ベクター。
［９］ ［８］に記載の発現ベクターを有する、形質転換体。
［１０］ 前記形質転換体が酵母又は大腸菌である、［９］に記載の形質転換体。
Another embodiment of the present invention is an expression vector and a transformant having the same.
[8] An expression vector to which the polynucleotide according to any one of [3] to [7] is linked to enable expression.
[9] A transformant having the expression vector according to [8].
[10] The transformant according to [9], wherein the transformant is yeast or E. coli.
本発明のさらに他の一実施形態は、キシログルカナーゼの製造方法である。
［１１］ ［９］又は［１０］に記載の形質転換体を培養して培養物を得、
前記培養物からキシログルカナーゼを抽出することを含み、
前記キシログルカナーゼが、配列番号３に示すアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つキシログルカンのセルロース主鎖中の、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合及びキシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合を分解し得るキシログルカナーゼである、キシログルカナーゼの製造方法。
［１２］ 前記形質転換体が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを有し、前記培養物を培養菌体と培養上清とに分離し、前記培養上清から前記キシログルカナーゼを抽出する、［１１］に記載のキシログルカナーゼの製造方法。
Yet another embodiment of the present invention is a method for producing xyloglucanase.
[11] Cultivating the transformant according to [9] or [10] to obtain a culture,
extracting xyloglucanase from the culture;
The xyloglucanase comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the xyloglucanase contains the xylose side in the cellulose main chain of xyloglucan. A method for producing xyloglucanase, which is a xyloglucanase capable of degrading the β-1,4 bond of glucose with a chain attached and the β-1,4 bond of glucose without a xylose side chain.
[12] The transformant has an expression vector containing a nucleotide sequence encoding a signal peptide, the culture is separated into cultured cells and a culture supernatant, and the xyloglucanase is extracted from the culture supernatant. The method for producing xyloglucanase according to [11].
本発明の別の一実施形態は、キシログルカンオリゴ糖の製造方法である。
［１３］ ［１］又は［２］に記載のキシログルカナーゼでキシログルカンを分解することを含む、キシログルカンオリゴ糖の製造方法。
［１４］ 前記キシログルカナーゼが、［１１］又は［１２］に記載の方法で製造したキシログルカナーゼである、［１３］に記載のキシログルカンオリゴ糖の製造方法。
［１５］ 前記キシログルカンオリゴ糖が２糖以上６糖以下のキシログルカンオリゴ糖を含む、［１３］又は［１４］に記載のキシログルカンオリゴ糖の製造方法。
Another embodiment of the present invention is a method for producing xyloglucan oligosaccharides.
[13] A method for producing a xyloglucan oligosaccharide, which comprises decomposing xyloglucan with the xyloglucanase according to [1] or [2].
[14] The method for producing a xyloglucan oligosaccharide according to [13], wherein the xyloglucanase is a xyloglucanase produced by the method according to [11] or [12].
[15] The method for producing a xyloglucan oligosaccharide according to [13] or [14], wherein the xyloglucan oligosaccharide contains a xyloglucan oligosaccharide having from 2 to 6 sugars.
本発明のキシログルカナーゼＧＨ５－３４１によって、キシログルカンのセルロース主鎖中の、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合及びキシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合を分解し、１種の酵素のみで、キシログルカンから長さが７糖未満の低分子オリゴ糖を生産することが可能となる。また、本発明は、本発明のキシログルカナーゼを、夾雑物や類似の酵素の混入の少ない、高純度の状態で提供することができる。 By the xyloglucanase GH5-341 of the present invention, β-1,4 bonds of glucose with xylose side chains and β-1,4 bonds of glucose without xylose side chains in the cellulose main chain of xyloglucan It becomes possible to produce low-molecular-weight oligosaccharides with a length of less than 7 sugars from xyloglucan using only one type of enzyme. Further, the present invention can provide the xyloglucanase of the present invention in a highly pure state with less contamination by impurities and similar enzymes.
以下、本発明の各実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, each embodiment of the present invention will be described in detail.
本発明においては、「アミノ酸配列を有する」酵素、タンパク質、ポリペプチド等は、当該アミノ酸配列からなる酵素、タンパク質、ポリペプチドのみならず、当該アミノ酸配列と共に、他のアミノ酸配列を含有する酵素、タンパク質、ポリペプチド等を意味する。同様に、「ヌクレオチド配列を有する」ＤＮＡ、ポリヌクレオチド等は、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、ポリヌクレオチドのみならず、当該ヌクレオチド配列と共に、他のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ、ポリヌクレオチド等を意味する。 In the present invention, enzymes, proteins, polypeptides, etc. that "have an amino acid sequence" refer to not only enzymes, proteins, polypeptides, etc. consisting of the amino acid sequence, but also enzymes, proteins, etc. that contain other amino acid sequences in addition to the amino acid sequence. , polypeptide, etc. Similarly, DNA, polynucleotides, etc. that "have a nucleotide sequence" mean not only DNAs, polynucleotides, etc. consisting of the nucleotide sequence, but also DNAs, polynucleotides, etc. that contain other nucleotide sequences in addition to the nucleotide sequence.
１．キシログルカナーゼＧＨ５－３４１
本発明の一実施形態は、新規なキシログルカナーゼＧＨ５－３４１（以下、しばしば、「ＧＨ５－３４１」と略すこともある）に関する。ＧＨ５－３４１は、麹菌、すなわちAspergillus oryzae由来の酵素である。
1. Xyloglucanase GH5-341
One embodiment of the present invention relates to a novel xyloglucanase GH5-341 (hereinafter sometimes abbreviated as "GH5-341"). GH5-341 is an enzyme derived from Aspergillus oryzae.
本発明者らはＧＨ５－３４１のｃＤＮＡを入手後に異種宿主であるPichia pastorisで発現させて、組換え酵素を産生し、その酵素活性について検討した。その結果、至適ｐＨは４．０であり、至適温度は４０℃であり、キシログルカンを主として分解するが、セルロースもわずかにではあるが分解した。ＧＨ５－３４１で処理したキシログルカンのＨＰＬＣクロマトグラム（図２）には、Ｘ（Ｇｌｃ１Ｘｙｌ１）、ＸＸ（Ｇｌｃ２Ｘｙｌ２）、ＬＧ（Ｇｌｃ２Ｘｙｌ１Ｇａｌ１）といった、長さが７糖未満の低分子オリゴ糖に帰属されるピークが存在することから、ＧＨ５－３４１はキシログルカンの主鎖を構成するセルロース中の、キシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－グルコシド結合のみならず、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－グルコシド結合も分解することが判明した。 After obtaining the cDNA of GH5-341, the present inventors expressed it in a heterologous host, Pichia pastoris, to produce a recombinant enzyme, and examined its enzymatic activity. As a result, the optimum pH was 4.0 and the optimum temperature was 40° C., and xyloglucan was mainly decomposed, but cellulose was also slightly decomposed. The HPLC chromatogram of xyloglucan treated with GH5-341 (Fig. 2) shows 7 molecules of length such as X (Glc 1 Xyl 1 ), XX (Glc 2 Xyl 2 ), and LG (Glc 2 Xyl 1 Gal 1 ). Since there is a peak attributed to low-molecular-weight oligosaccharides that are less than sugar, GH5-341 is due to only the β-glucoside bond of glucose with no xylose side chain bonded in the cellulose that constitutes the main chain of xyloglucan. First, it was found that the β-glucoside bond of glucose with a xylose side chain is also broken down.
尚、本発明において酵素活性は、以下の方法で測定した。
基質としてMegazyme社製のタマリンド種子由来キシログルカンを使用する、下記組成の反応溶液を用意する。
０．８％のタマリンド種子由来キシログルカン ５０μＬ
０．５ｍｇ／ｍｌのＧＨ５－３４１ ５μＬ
５００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ４．０ １０μＬ
水 ３５μＬ
合計： １００μＬ
In the present invention, enzyme activity was measured by the following method.
A reaction solution with the following composition is prepared using tamarind seed-derived xyloglucan manufactured by Megazyme as a substrate.
0.8% tamarind seed-derived xyloglucan 50μL
5 μL of 0.5 mg/ml GH5-341
10 μL of 500 mM acetate buffer, pH 4.0
35μL water
Total: 100μL
反応溶液を４０℃で１時間インキュベートして反応を実施し、その後、９８℃で１０分間加熱することによって酵素反応を停止させて、反応産物を得る。得られた反応産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析する。ＨＰＬＣ用のカラムには、ＴＳＫｇｅｌアミド８０カラム（４．６×２５０ｍｍ）を用い、移動相には６０％アセトニトリルを用い、分析は、カラムを４０℃に保温して実施する。 The reaction is carried out by incubating the reaction solution at 40°C for 1 hour, and then the enzymatic reaction is stopped by heating at 98°C for 10 minutes to obtain the reaction product. The resulting reaction product is analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). A TSKgel amide 80 column (4.6 x 250 mm) is used as the column for HPLC, 60% acetonitrile is used as the mobile phase, and the analysis is performed while keeping the column at 40°C.
ＧＨ５－３４１は配列番号３に示すアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。また、ＧＨ５－３４１は配列番号３に示すアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものでもよい。本発明において「配列同一性」とは、２以上のアミノ酸配列（またはヌクレオチド配列）のアライメントによって決定される、配列間の配列不変性の程度を表すものである。さらに「配列番号３に示すアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるキシログルカナーゼと同じキシログルカン分解活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列であって、配列番号３のアミノ酸配列とのアライメントによって検出される、１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、及び／又は挿入を有するものである。当該酵素活性を保持する限り、配列番号３のアミノ酸配列との同一性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、同一性の下限値は、８５％、８７％、９０％、９２％以上、９５％、９７％、９９％、９９．５％など、どのような値でもかまわない。配列番号３に示すアミノ酸配列と、他のアミノ酸配列との同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴといった公知の同一性検索プログラムを使用して決定することができる。 GH5-341 contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. Furthermore, GH5-341 may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. In the present invention, "sequence identity" refers to the degree of sequence constancy between sequences, determined by alignment of two or more amino acid sequences (or nucleotide sequences). Furthermore, "an amino acid sequence having sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3" is an amino acid sequence of a polypeptide that exhibits the same xyloglucan degrading activity as xyloglucanase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. , has one or more amino acid residue substitutions, deletions, additions, and/or insertions detected by alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. There is no particular limitation on the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as long as the enzyme activity is maintained, but it is preferably 85% or more and less than 100%. Further, the lower limit value of identity may be any value such as 85%, 87%, 90%, 92% or more, 95%, 97%, 99%, 99.5%, etc. The identity between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and other amino acid sequences can be determined using, for example, a known identity search program such as BLAST.
さらにＧＨ５－３４１は分泌タンパク質であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むもの、またはからなるものでもよい。配列番号４に示されるアミノ酸配列においては、そのＣ末端側の１８残基がシグナル配列（配列番号６）と推定される部分である。成熟酵素は、シグナル配列と推定されるアミノ酸残基が除かれたものであり、成熟酵素のアミノ酸配列を配列番号３に示した。また、ＧＨ５－３４１のアミノ酸配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列（又はそれと配列同一性の高い（例えば、８５％以上の）配列）に他のシグナル配列が連結したものでもよい。いずれの場合も、スプライシングによりＧＨ５－３４１又は同じ酵素活性を有する、配列同一性の高いポリペプチドを産生可能なものであればよい。 Furthermore, GH5-341 is a secreted protein and may contain or consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the 18 residues on the C-terminal side are presumed to be a signal sequence (SEQ ID NO: 6). The mature enzyme has amino acid residues presumed to be signal sequences removed, and the amino acid sequence of the mature enzyme is shown in SEQ ID NO: 3. Furthermore, the amino acid sequence of GH5-341 may be one in which another signal sequence is linked to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (or a sequence with high sequence identity thereto (eg, 85% or more)). In either case, any material that can produce GH5-341 or a polypeptide with high sequence identity that has the same enzymatic activity by splicing may be used.
以下、本発明において「ＧＨ５－３４１」は、特に断りがない限り、キシログルカナーゼＧＨ５－３４１（配列番号３又は４）及びそのアミノ酸配列との配列同一性の高いポリペプチドの全てを含むものとする。 Hereinafter, in the present invention, "GH5-341" includes xyloglucanase GH5-341 (SEQ ID NO: 3 or 4) and all polypeptides having high sequence identity with its amino acid sequence, unless otherwise specified.
ＧＨ５－３４１は、後述するように、遺伝子組み換えによって産生することもできるが、Aspergillus oryzaeから抽出することもできる。ＧＨ５－３４１をコードする遺伝子の発現は、キシロース及びキシログルカンオリゴ糖の存在下で誘導される。さらにＧＨ５－３４１は分泌タンパク質であることから、キシロース及びキシログルカンオリゴ糖の存在下、公知の培養方法でAspergillus oryzaeを培養することで、ＧＨ５－３４１は菌体外に生産される。液体培地を用いてAspergillus oryzaeを培養した場合には、培養液から濾過或いは遠心分離によって菌体を分離した後の上澄液を、そして固体培養の場合は、培養後の培地から水又は適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液とすることができる。粗酵素液中には、ＧＨ５－３４１以外にも、キシログルカンを分解する種々の酵素活性が含まれるため、これを除去する必要がある。例えば、公知のクロマトグラフィーにより、ＧＨ５－３４１以外のグリコシダーゼ活性を示す酵素を除去することができる。 As described below, GH5-341 can be produced by genetic recombination, but it can also be extracted from Aspergillus oryzae. Expression of the gene encoding GH5-341 is induced in the presence of xylose and xyloglucan oligosaccharides. Furthermore, since GH5-341 is a secreted protein, GH5-341 is produced outside the bacterial cells by culturing Aspergillus oryzae using a known culture method in the presence of xylose and xyloglucan oligosaccharides. When Aspergillus oryzae is cultured using a liquid medium, the supernatant after separating the bacterial cells from the culture medium by filtration or centrifugation is used, and in the case of solid culture, water or an appropriate solution is collected from the medium after culturing. The solution extracted with inorganic salts can be used as a crude enzyme solution. In addition to GH5-341, the crude enzyme solution contains various enzyme activities that decompose xyloglucan, so it is necessary to remove them. For example, enzymes exhibiting glycosidase activity other than GH5-341 can be removed by known chromatography.
２．キシログルカナーゼＧＨ５－３４１をコードするポリヌクレオチド
本発明の一実施形態は、キシログルカナーゼＧＨ５－３４１をコードするポリヌクレオチド（以下、しばしば、「ＧＨ５－３４１ポリヌクレオチド」又は「ＧＨ５－３４１遺伝子」と称する）に関する。本発明のポリヌクレオチドは、上述したＧＨ５－３４１又はそのアミノ酸配列との配列同一性の高いポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
2. Polynucleotide encoding xyloglucanase GH5-341 One embodiment of the present invention is a polynucleotide encoding xyloglucanase GH5-341 (hereinafter often referred to as "GH5-341 polynucleotide" or "GH5-341 gene"). Regarding. The polynucleotide of the present invention has a nucleotide sequence encoding a polypeptide having high sequence identity with the above-mentioned GH5-341 or its amino acid sequence.
ＧＨ５－３４１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヌクレオチド配列、又は配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むものである。また、ＧＨ５－３４１ポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヌクレオチド配列、又は配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるものでもよい。このようなＧＨ５－３４１ポリヌクレオチドは、Aspergillus oryzaeからクローニングした遺伝子でもよいし、当該遺伝子に対して同一性を有する遺伝子でもよい。また、配列番号３や４のアミノ酸配列から遺伝暗号の縮重を鑑みて演繹したヌクレオチド配列でもよい。配列番号２に示したヌクレオチド配列は、シグナル配列を含む全長ＤＮＡのヌクレオチド配列であり、その５’末端の５４ヌクレオチド（配列番号５）がシグナル配列をコードし、残りの１６５６ヌクレオチドが、配列番号１に示したＧＨ５－３４１のコード配列である。尚、配列番号1及び３のヌクレオチド配列において、３’末端の３ヌクレオチド（ｔｇａ）は終止コドンである。 The GH5-341 polynucleotide includes the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Further, the GH5-341 polynucleotide may consist of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Such a GH5-341 polynucleotide may be a gene cloned from Aspergillus oryzae, or a gene having identity to the gene. Alternatively, it may be a nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4, taking into account the degeneracy of the genetic code. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the full-length DNA including a signal sequence, the 54 nucleotides at the 5' end (SEQ ID NO: 5) encode the signal sequence, and the remaining 1656 nucleotides code for the signal sequence. This is the coding sequence of GH5-341 shown in . In addition, in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3, the 3 nucleotides (tga) at the 3' end are stop codons.
本発明において「配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列」とは、ＧＨ５－３４１と同じキシログルカン分解活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１のヌクレオチド配列とのアライメントによって検出される、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加、及び／又は挿入を有するものである。また、配列同一性を有するポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示すヌクレオチド配列（又はそれと配列同一性の高い配列）に開始コドンが付加されたポリヌクレオチドが挙げられる。上述した酵素活性を保持するポリペプチドをコードする限り、配列番号１のヌクレオチド配列との同一性に特に限定はないが、８５％以上、１００％未満であることが好ましい。また、同一性の下限値は、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、９９．５％など、どのような値でもかまわない。尚、配列番号１に示すヌクレオチド配列と、他のヌクレオチド配列との同一性は、公知の方法で決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴＮといった公知の同一性検索プログラムを使用して、ポリヌクレオチドの同一性を決定することができる。 In the present invention, "a nucleotide sequence having sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1" refers to a polynucleotide encoding a polypeptide that exhibits the same xyloglucan degrading activity as GH5-341, and which is has one or more nucleotide substitutions, deletions, additions, and/or insertions detected by alignment with the nucleotide sequence of Further, examples of polynucleotides having sequence identity include polynucleotides in which a start codon is added to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or a sequence with high sequence identity thereto). There is no particular limitation on the identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, as long as it encodes a polypeptide that retains the above-mentioned enzyme activity, but it is preferably 85% or more and less than 100%. Further, the lower limit value of identity may be any value such as 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, 99.5%, etc. Note that the identity between the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and other nucleotide sequences can be determined by a known method. For example, known identity search programs such as BLASTN can be used to determine polynucleotide identity.
ＧＨ５－３４１ポリヌクレオチドは、配列番号２に示す、シグナル配列を有する前駆体ポリペプチドでも良いし、配列番号１に示すヌクレオチド配列（又はそれと配列同一性の高い（例えば、８５％以上の）配列）に他のシグナル配列が連結したものでもよい。いずれの場合も、スプライシング後に成熟タンパク質としてＧＨ５－３４１又は同じ酵素活性を有する、配列同一性の高いポリペプチドを発現可能なものであればよい。 The GH5-341 polynucleotide may be a precursor polypeptide having a signal sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or a sequence with high sequence identity (for example, 85% or more) thereto) may be linked to another signal sequence. In either case, any protein that can express GH5-341 as a mature protein after splicing or a polypeptide with high sequence identity that has the same enzymatic activity may be used.
また、「配列番号１に示すヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列」は、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＧＨ５－３４１と同じキシログルカン分解活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと定義することもできる。なお、ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Sambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）に記載の方法を用いることが可能であり、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００）及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ｍｏｌ／ｌ、０．０１５ｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。 Furthermore, "a nucleotide sequence having sequence identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1" hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and GH5- It can also be defined as a polynucleotide encoding a polypeptide that exhibits the same xyloglucan degrading activity as 341. For the hybridization method, for example, the method described in Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press (2001) can be used. ” means, for example, 6X containing 0.5% SDS, 5X Denhartz's solution (0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400) and 100 μg/ml salmon sperm DNA. In SSC (1×SSC: 0.15 mol/l, 0.015 mol/l sodium citrate, pH 7.0), the temperature is kept at 50° C. to 65° C. for 4 hours to overnight.
以下、本発明において「ＧＨ５－３４１遺伝子」及び「ＧＨ５－３４１ポリヌクレオチド」は、特に断りがない限り、ＧＨ５－３４１遺伝子（配列番号１又は２）及びそれと配列同一性の高い配列の全てを含むものとする。 Hereinafter, in the present invention, "GH5-341 gene" and "GH5-341 polynucleotide" include the GH5-341 gene (SEQ ID NO: 1 or 2) and all sequences with high sequence identity thereto, unless otherwise specified. shall be held.
本発明のＧＨ５－３４１をコードするポリヌクレオチドをAspergillus oryzae又は他の微生物から取得するためには、例えば、配列番号１又は２に記載のヌクレオチド配列の情報を元にして、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法を利用して、クローニングを行うことができる。ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法については、例えば、Sambrook and Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）の記載を参照することができる。 In order to obtain the polynucleotide encoding GH5-341 of the present invention from Aspergillus oryzae or other microorganisms, for example, PCR method or hybridization method can be used based on the information of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2. can be used to perform cloning. Regarding the PCR method and hybridization method, for example, the description in Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third edition, Cold Spring Habor Laboratory Press (2001) can be referred to.
ＰＣＲ法を利用する場合、配列番号１又は２に記載のヌクレオチド配列を基に設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子又はその断片を増幅することができる。プライマーの一例として、配列番号７及び８のヌクレオチド配列が挙げられる。増幅したＤＮＡが断片の場合、当該断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、５’－ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA ends）及び３’－ＲＡＣＥ法等を行うことによって、ＧＨ５－３４１の全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。 When using the PCR method, a gene of interest or a fragment thereof can be amplified by performing a PCR reaction using a synthetic oligonucleotide primer designed based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2. Examples of primers include the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8. If the amplified DNA is a fragment, the full length of GH5-341 can be encoded by performing a hybridization method using the fragment as a probe, 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends), 3'-RACE method, etc. Genes can be cloned.
また、配列番号３又は４に記載のアミノ酸配列や、配列番号１又は２に記載のヌクレオチド配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子やポリヌクレオチドを得ることもできる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。 Furthermore, a target gene or polynucleotide can also be obtained by chemical synthesis based on the information on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 or 4 or the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
さらに、本発明においては、新規なキシログルカナーゼであるＧＨ５－３４１遺伝子の塩基配列を用いて、他のキシログルカナーゼを産生する微生物のゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１又は２と配列同一性の高いＤＮＡを選別することができる。このような選別のためには、ＧＨ５－３４１のポリヌクレオチドに基づきプローブを設計し、ハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼーションは、上記に示したストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、キシログルカンオリゴ糖分解酵素を産生する微生物から得たゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作製し、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な配列同一性を示す遺伝子を得ることができる。 Furthermore, in the present invention, the base sequence of the GH5-341 gene, which is a novel xyloglucanase, is used to generate sequences with SEQ ID NO: 1 or 2 from a genomic DNA library or cDNA library of a microorganism that produces other xyloglucanases. DNAs with high identity can be selected. For such selection, a probe can be designed based on the GH5-341 polynucleotide and hybridization can be performed. Hybridization can be performed under stringent conditions as indicated above. For example, a nylon membrane on which a genomic DNA library or cDNA library obtained from a microorganism that produces xyloglucan oligosaccharide degrading enzyme is immobilized is prepared, and 6× SSC, 0.5% SDS, 5× Denhartz solution, 100 μg/ Block the nylon membrane at 65°C in prehybridization solution containing ml salmon sperm DNA. Thereafter, each probe labeled with 32 P is added and kept at 65°C overnight. The nylon membrane was coated in 6x SSC for 10 min at room temperature, in 2x SSC containing 0.1% SDS for 10 min at room temperature, and in 0.2x SSC containing 0.1% SDS for 30 min at 45°C. After washing, autoradiography can be performed to detect DNA that specifically hybridizes with the probe. Furthermore, by changing conditions such as washing, genes showing various sequence identities can be obtained.
一方、本発明のＧＨ５－３４１遺伝子の塩基配列からＰＣＲ反応用のプライマーを設計することもできる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、本発明の遺伝子に対して配列同一性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。 On the other hand, primers for PCR reactions can also be designed from the base sequence of the GH5-341 gene of the present invention. By performing a PCR reaction using these primers, it is possible to detect gene fragments with high sequence identity to the gene of the present invention, or even to obtain the entire gene.
得られた遺伝子が目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかは、決定された塩基配列を本発明のＧＨ５－３４１のアミノ酸配列又はそれをコードするヌクレオチド配列と比較し、その遺伝子構造及び配列同一性から推定することができる。また、得られた遺伝子のコードするポリペプチドを製造し、その酵素活性を測定することにより、目的の酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認することもできる。 Whether or not the obtained gene encodes a polypeptide having the desired enzymatic activity can be determined by comparing the determined base sequence with the amino acid sequence of GH5-341 of the present invention or the nucleotide sequence encoding it. It can be estimated from the gene structure and sequence identity. Furthermore, by producing a polypeptide encoded by the obtained gene and measuring its enzymatic activity, it can be confirmed whether the gene encodes a polypeptide having the desired enzymatic activity.
さらに、本発明によってＧＨ５－３４１の一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったため、本願に開示したヌクレオチド配列（配列番号１又は２）を用いて、変異体を遺伝子工学的に製造することも可能である。上述したキシログルカン分解活性を維持しながら、他の性質の改変された変異体も本発明の範囲内である。例えば、配列番号１のヌクレオチド配列にランダム変異あるいは部位特異的変異を導入し、ＧＨ５－３４１のアミノ酸配列中に、１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換を導入することができる。これにより、キシログルカナーゼの至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ、基質特異性等の性質を少しずつ変化させることもできる。 Furthermore, since the primary structure and gene structure of GH5-341 have been clarified by the present invention, it is also possible to produce mutants through genetic engineering using the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 or 2) disclosed in this application. be. Variants with other properties modified while maintaining the xyloglucanolytic activity described above are also within the scope of the present invention. For example, random mutations or site-specific mutations are introduced into the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and deletion, addition, insertion, or substitution of one or more amino acid residues is introduced into the amino acid sequence of GH5-341. be able to. Thereby, properties such as the optimum temperature, stable temperature, optimum pH, stable pH, and substrate specificity of xyloglucanase can be gradually changed.
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法である、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法［Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79, 1408－1412（1982）］、生化学的方法である、［α－Ｓ］ｄＮＴＰの存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法［Gene, 64, 313-319(1988)］、ＰＣＲを用いる方法である、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低くする方法［Analytical Biochemistry, 224, 347-353（1995）］等を用いることができる。 Methods for introducing random mutations include, for example, a method of chemically treating DNA, which involves the action of sodium bisulfite to cause transition mutations that convert cytosine bases to uracil bases [Proceedings of the National Academy of Sciences]. [Gene , 64, 313-319 (1988)], a method using PCR to reduce the accuracy of nucleotide incorporation by adding manganese to the reaction system and reducing the accuracy of nucleotide incorporation [Analytical Biochemistry, 224, 347-353 (1995) )] etc. can be used.
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）法、Nucleic Acids Research, 12(24), 9441-9456（1984）］、制限酵素の認識部位を利用する方法［Analytical Biochemistry, 200, 81-88（1992）、Gene, 102, 67-70（1991）］、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法［クンケル（Kunkel）法、Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America, 82, 488-492（1985）］、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法［オリゴヌクレオチド・ダイレクティッド・デュアル・アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber: ODA）法、Gene, 152, 271-275（1995）、特開平7-289262号公報］、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平8-70874号公報）、ＤＮＡ鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（US5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖ＤＮＡベクターと２種類のプライマーを用いたＰＣＲによる方法［Gene, 103, 73-77（1991）］、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法［国際公開第９８／０２５３５号］等を用いることができる。 Methods for introducing site-specific mutations include, for example, a method using amber mutation [gapped duplex method, Nucleic Acids Research, 12(24), 9441-9456 (1984)], restriction enzyme recognition. A method using mutations in dut (dUTPase) and ung (uracil DNA glycosylase) [Analytical Biochemistry, 200, 81-88 (1992), Gene, 102, 67-70 (1991)]; ) method, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82, 488-492 (1985)], method using amber mutation using DNA polymerase and DNA ligase [oligonucleotide directed dual amber (Oligonucleotide-directed Dual Amber: ODA) method, Gene, 152, 271-275 (1995), Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-289262], a method using a host in which a DNA repair system has been induced (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-70874) (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-140685), a method using a protein that catalyzes a DNA strand exchange reaction (Japanese Patent Application Laid-open No. 8-140685), a PCR method using two types of mutation introduction primers with restriction enzyme recognition sites added (US5, 512,463), PCR method using a double-stranded DNA vector containing an inactivated drug resistance gene and two types of primers [Gene, 103, 73-77 (1991)], PCR method using amber mutation [International Publication No. 98/02535], etc. can be used.
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド・デュプレックス法を用いたMutan（登録商標）-G、クンケル法を用いたMutan（登録商標）-K、ODA法を用いたMutan（登録商標）-Express Km（全てタカラバイオ株式会社製）、変異導入用プライマーとピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）由来DNAポリメラーゼを用いたQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit［ストラタジーン（STRATAGENE）社製］等を用いることができ、また、 PCR法を利用するキットとして、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（タカラバイオ株式会社製）、Mutan（登録商標）-Super Express Km（タカラバイオ株式会社製）等を用いることができる。 Furthermore, by using a commercially available kit, site-specific mutations can be easily introduced. Commercially available kits include, for example, Mutan (registered trademark)-G using the gapped duplex method, Mutan (registered trademark)-K using the Kunkel method, and Mutan (registered trademark)-Express Km (using the ODA method). (all manufactured by Takara Bio Inc.), QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE) using primers for mutagenesis and DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (STRATAGENE), etc. As a kit using the PCR method, TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), Mutan (registered trademark)-Super Express Km (manufactured by Takara Bio Inc.), etc. can be used.
３．発現ベクター
本発明の一実施形態は、キシログルカナーゼＧＨ５－３４１をコードするポリヌクレオチドが発現可能に連結された、発現ベクターに関する。
3. Expression Vector One embodiment of the present invention relates to an expression vector to which a polynucleotide encoding xyloglucanase GH5-341 is operably linked.
本明細書において「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドを発現可能に連結することが可能であり、選択した宿主細胞に導入されて、連結されたポリヌクレオチドの発現を可能せしめるベクターとを含む。ここで目的のポリペプチドとは、上述した本発明のＧＨ５－３４１であり、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、本発明のＧＨ５－３４１遺伝子である。すなわち、目的のポリペプチドは、配列番号３又は４に示したアミノ酸配列又はそれと配列同一性の高いポリペプチドであり、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１又は２に示したヌクレオチド配列又はそれと配列同一性の高いポリヌクレオチドである。 As used herein, the term "expression vector" refers to a polynucleotide encoding a polypeptide of interest, which can be linked to enable expression of the polynucleotide, and which can be introduced into a selected host cell and the linked polynucleotide and a vector that enables the expression of Here, the polypeptide of interest is the above-mentioned GH5-341 of the present invention, and the polynucleotide encoding the polypeptide is the GH5-341 gene of the present invention. That is, the polypeptide of interest is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 or a polypeptide with high sequence identity thereto, and the polynucleotide encoding the polypeptide has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. or a polynucleotide with high sequence identity thereto.
ベクターは、ポリヌクレオチドを発現可能に連結することが可能であり、選択した宿主細胞に導入されて、連結されたポリヌクレオチドの発現を可能せしめるものである限り特に限定はない。ベクターは、宿主内で複製可能であり、かつ長期にわたり維持されるものであることが好ましい。ベクターの一例として、ウイルス粒子、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、及びＳＶ４０の誘導体）、Ｐ１系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、並びに目的の特定宿主に特異的な他の任意のベクターが挙げられ、このようなベクターは当業者には広く知られており、市販もされている。市販のベクターとしては、細菌系のベクターである：ｐＱＥ（商標）ベクター（Qiagen社製）、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）プラスミド、ｐＮＨベクター、（ラムダ－ＺＡＰベクター（Stratagene社製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Pharmacia社製）等や、真核細胞系のベクターである、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Stratagene社製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Pharmacia社製）、ｐＧＡＰＺα－Ａ（Invitrogen社製）等が挙げられる。市販品以外にも、公的機関から入手したベクターや、公知の手順により細菌や細胞から単離したプラスミド等もベクターとして使用可能である。 The vector is not particularly limited as long as it is capable of linking polynucleotides in an expressible manner and allows expression of the linked polynucleotides when introduced into a selected host cell. Preferably, the vector is capable of replicating within the host and is maintained over a long period of time. Examples of vectors include viral particles, phages, plasmids, phagemids, cosmids, fosmids, bacterial artificial chromosomes, viral DNA (e.g., vaccinia, adenovirus, and SV40 derivatives), P1-based artificial chromosomes, yeast plasmids, yeast artificial chromosomes, as well as any other vectors specific for the particular host of interest, which are well known to those skilled in the art and are also commercially available. Commercially available vectors include bacterial vectors: pQE (trademark) vector (manufactured by Qiagen), pBLUESCRIPT (trademark) plasmid, pNH vector, (lambda-ZAP vector (manufactured by Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (manufactured by Pharmacia), etc., and eukaryotic vectors such as pXT1, pSG5 (manufactured by Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (manufactured by Pharmacia), pGAPZα-A (manufactured by Invitrogen) In addition to commercially available products, vectors obtained from public institutions and plasmids isolated from bacteria or cells by known procedures can also be used as vectors.
ベクターは、連結したポリヌクレオチドの発現を可能にするために、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーター等の調節配列を含むことができる。ベクターは、発現を増幅させるために、エンハンサー等の他の適切な配列を含んでもよい。これらの配列は、連結するポリヌクレオチド配列や、発現ベクターを導入する宿主細胞の種類等に応じて、適宜選択することができる。 The vector can contain regulatory sequences such as a promoter, a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription terminator to enable expression of the linked polynucleotides. The vector may contain other suitable sequences, such as enhancers, to amplify expression. These sequences can be appropriately selected depending on the polynucleotide sequence to be linked, the type of host cell into which the expression vector is introduced, and the like.
さらに発現ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を容易にする、１つ以上の選択マーカーを含んでもよい。そのような選択マーカーとしては、抗生物質などの薬剤に対する耐性を付与する遺伝子（薬剤マーカー）、栄養要求性を補う遺伝子（栄養要求性マーカー）等が挙げられる。薬剤マーカーとしては、E. coliにテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子や、S. cerevisiaeのＴＲＰ１遺伝子が挙げられる。 Additionally, the expression vector may include one or more selectable markers to facilitate selection of host cells containing the expression vector. Examples of such selection markers include genes that confer resistance to drugs such as antibiotics (drug markers), genes that compensate for auxotrophy (auxotrophic markers), and the like. Examples of drug markers include genes that confer tetracycline or ampicillin resistance to E. coli and the TRP1 gene of S. cerevisiae.
本発明の発現ベクターに連結されているＧＨ５－３４１遺伝子には、シグナルペプチドをコードする配列（シグナルコード配列）が含まれることが好ましい。ＧＨ５－３４１遺伝子にシグナルコード配列が含まれていると、シグナルペプチドの連結された前駆体タンパク質の産生後に、シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質が細胞外に分泌されることから、培養上清から容易にＧＨ５－３４１を回収することが可能になる。よって、発現ベクターに含まれるヌクレオチド配列としては、配列番号１のヌクレオチド配列又はそれと配列同一性の高いヌクレオチド配列が好ましい。あるいは宿主細胞の発現系に適したシグナル配列を、配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと配列同一性の高いヌクレオチド配列に連結して使用することもできる。 The GH5-341 gene linked to the expression vector of the present invention preferably contains a sequence encoding a signal peptide (signal code sequence). If the GH5-341 gene contains a signal code sequence, the mature protein excluding the signal peptide is secreted outside the cell after the production of the signal peptide-linked precursor protein, so it can be easily extracted from the culture supernatant. It becomes possible to recover GH5-341. Therefore, the nucleotide sequence contained in the expression vector is preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence with high sequence identity thereto. Alternatively, a signal sequence suitable for the expression system of the host cell can be used by linking it to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence with high sequence identity thereto.
さらに、形質転換体によって産生されたポリペプチドの検出及び回収を容易にするために、発現ベクター内で目的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にタグをコードするヌクレオチド配列を連結することができる。このようなタグとしては、複数のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンタグ、蛍光タンパク質、ｇＤタグ、ｃ－Ｍｙｃエピトープ等が挙げられる。このような公知のタグ配列の連結位置や連結方法については広く知られている。 Additionally, a nucleotide sequence encoding a tag can be ligated to a nucleotide sequence encoding a polypeptide of interest within an expression vector to facilitate detection and recovery of the polypeptide produced by the transformant. Such tags include polyhistidine tags consisting of multiple histidine residues, fluorescent proteins, gD tags, c-Myc epitopes, and the like. The linking positions and linking methods of such known tag sequences are widely known.
４．形質転換体
本発明の一実施形態は、上記発現ベクターを有する形質転換体である。本発明の形質転換体は、上述した発現ベクターを導入した宿主細胞であり、当該発現ベクター内の遺伝子の発現によって、ＧＨ５－３４１を産生するものである。
4. Transformant One embodiment of the present invention is a transformant having the above expression vector. The transformant of the present invention is a host cell into which the above-mentioned expression vector has been introduced, and produces GH5-341 by expressing the gene within the expression vector.
本発明の発現ベクターを導入する宿主細胞としては、微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。微生物としては、大腸菌、Bacillus属、Streptomyces属、Lactococcus属等の細菌、Saccharomyces属、Pichia属、Kluyveromyces属等の酵母、Aspergillus oryzae以外のAspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属等の糸状菌が挙げられる。動物細胞としては、バキュロウイルスの系統が挙げられる。ＧＨ５－３４１の回収を容易にする観点から、宿主細胞はＧＨ５－３４１以外のキシログルカナーゼやセルラーゼといった化学的性質／物理的性質の似たタンパク質を産生しない細胞が好ましい。例えば、Aspergillus属の糸状菌よりも酵母や大腸菌等の異種宿主が好ましい。 As host cells into which the expression vector of the present invention is introduced, microorganisms, animal cells, plant cells, etc. can be used. Examples of microorganisms include bacteria such as Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces, and Lactococcus, yeast such as Saccharomyces, Pichia, and Kluyveromyces, and filamentous fungi such as Aspergillus other than Aspergillus oryzae, Penicillium, and Trichoderma. Animal cells include strains of baculovirus. From the viewpoint of facilitating recovery of GH5-341, host cells are preferably cells that do not produce proteins with similar chemical/physical properties to those of GH5-341, such as xyloglucanase or cellulase. For example, a heterologous host such as yeast or Escherichia coli is preferable to a filamentous fungus of the genus Aspergillus.
発現ベクターを宿主細胞に導入する方法に特に限定はなく、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃等の公知の多様な遺伝子導入方法のいずれかを使用することができる。具体的な方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等が挙げられる。 There are no particular limitations on the method for introducing the expression vector into host cells, and any of a variety of known gene introduction methods such as transformation, transfection, transduction, virus infection, gene gun, etc. can be used. Specific methods include calcium phosphate transfection, DEAE dextran-mediated transfection, lipofection, electroporation, microinjection, and the like.
形質転換体によるＧＨ５－３４１遺伝子の発現やＧＨ５－３４１の産生は、ＧＨ５－３４１の酵素活性の検出によって確認することができる。また、ＧＨ５－３４１に特異的な抗体などの結合物質を用意し、結合の有無を検出することによっても確認することができる。 Expression of the GH5-341 gene and production of GH5-341 by the transformant can be confirmed by detecting the enzymatic activity of GH5-341. It can also be confirmed by preparing a binding substance such as an antibody specific to GH5-341 and detecting the presence or absence of binding.
５．キシログルカナーゼの製造方法
本発明の一実施形態は、ＧＨ５－３４１の製造方法である。ＧＨ５－３４１はAspergillus oryzaeから抽出することもできるが、上述した本発明の形質転換体を培養し、その培養物からＧＨ５－３４１を抽出する方が、より簡便にＧＨ５－３４１を容易に製造することができる。
5. Method for producing xyloglucanase One embodiment of the present invention is a method for producing GH5-341. Although GH5-341 can be extracted from Aspergillus oryzae, it is easier to produce GH5-341 by culturing the above-mentioned transformant of the present invention and extracting GH5-341 from the culture. be able to.
初めに、形質転換体を培養して培養物を得る。培養条件は、形質転換体が増殖し、且つ導入されている発現ベクター内の遺伝子が発現されて、当該遺伝子のコードするポリペプチドが細胞内で産生される条件である限り、特に限定はない。よって培養条件は、宿主細胞の種類及び導入した発現ベクターの構成等に基づき、適宜選択することができる。 First, the transformant is cultured to obtain a culture. The culture conditions are not particularly limited as long as the conditions are such that the transformant proliferates, the gene in the introduced expression vector is expressed, and the polypeptide encoded by the gene is produced within the cells. Therefore, culture conditions can be appropriately selected based on the type of host cell, the structure of the introduced expression vector, etc.
次に、形質転換体を培養して得た培養物からＧＨ５－３４１を抽出する。当該培養物は、増殖させた形質転換体又はその培養上清である。形質転換体を液体培地で培養した場合には、培養液を遠心分離、ろ過等によって、細胞と培養上清とに分離することができる。また、形質転換体を固体培地で培養した場合には、培地表面から細胞を回収し、培地を水や他の溶液に懸濁して、培地中の成分を抽出することができる。 Next, GH5-341 is extracted from the culture obtained by culturing the transformant. The culture is a grown transformant or a culture supernatant thereof. When the transformant is cultured in a liquid medium, the culture solution can be separated into cells and culture supernatant by centrifugation, filtration, or the like. Furthermore, when the transformant is cultured on a solid medium, the cells can be collected from the surface of the medium, the medium can be suspended in water or other solution, and the components in the medium can be extracted.
回収した細胞からＧＨ５－３４１を抽出する場合には、初めに細胞を物理的又は化学的手段により融解させる。このとき、ＧＨ５－３４１を破壊しない条件で細胞を融解させることが重要であり、そのような手段としては、凍結融解の繰り返し、超音波処理、細胞溶解剤の使用等が挙げられる。次に細胞融解物から公知のタンパク回収方法によってキシログルカナーゼを分離し、精製する。具体的な方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過などが挙げられる。また、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製することもできる。 When extracting GH5-341 from collected cells, the cells are first thawed by physical or chemical means. At this time, it is important to thaw the cells under conditions that do not destroy GH5-341, and such methods include repeated freezing and thawing, ultrasonication, use of a cell lysing agent, and the like. Next, xyloglucanase is separated from the cell lysate by a known protein recovery method and purified. Specific methods include ammonium sulfate precipitation, acid extraction, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration, and the like. Further purification can also be achieved by high performance liquid chromatography (HPLC).
形質転換体の有する発現ベクター内で、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列がＧＨ５－３４１遺伝子に連結されている場合には、培養上清又は固体培地の抽出物からＧＨ５－３４１を回収することができる。この場合は、細胞を融解させる工程は必要ではない。培養上清又は培地抽出物から公知のタンパク回収方法によってＧＨ５－３４１を分離し、精製することができる。 If the nucleotide sequence encoding the signal peptide is linked to the GH5-341 gene in the expression vector of the transformant, GH5-341 can be recovered from the culture supernatant or solid medium extract. . In this case, the step of thawing the cells is not necessary. GH5-341 can be separated and purified from the culture supernatant or medium extract by a known protein recovery method.
６．キシログルカンオリゴ糖の製造方法
本発明の一実施形態は、キシログルカンオリゴ糖の製造方法である。
6. Method for producing xyloglucan oligosaccharides One embodiment of the present invention is a method for producing xyloglucan oligosaccharides.
本発明のキシログルカンオリゴ糖の製造方法においては、キシログルカンを本発明のＧＨ５－３４１によって分解する。上述したように、ＧＨ５－３４１は、キシログルカンのセルロース主鎖中の、キシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合のみならず、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合も分解し得る酵素である。よって、本発明のキシログルカンオリゴ糖の製造方法において、１種の酵素のみを用いた処理でキシログルカンから長さが７糖未満の低分子オリゴ糖を含む、種々の分子量のオリゴ糖の混合物を得ることが可能となる。 In the method for producing xyloglucan oligosaccharides of the present invention, xyloglucan is degraded by GH5-341 of the present invention. As mentioned above, GH5-341 contains not only the β-1,4 bond of glucose without a xylose side chain in the cellulose main chain of xyloglucan, but also the β-1 bond of glucose with a xylose side chain. , 4 bonds can also be broken down. Therefore, in the method for producing xyloglucan oligosaccharides of the present invention, a mixture of oligosaccharides of various molecular weights, including low molecular weight oligosaccharides with a length of less than 7 sugars, is obtained from xyloglucan by treatment using only one type of enzyme. It becomes possible to obtain.
キシログルカンオリゴ糖の製造に使用するＧＨ５－３４１は、Aspergillus oryzaeから抽出した酵素でも、本発明のキシログルカナーゼの製造方法で得られた酵素（すなわち、遺伝子組換えにより製造した酵素）のいずれでもよい。しかし、他のキシログルカナーゼやセルラーゼなどの混入が少なく、キシログルカンの分解パターンの予測が容易であることから、遺伝子組換えにより製造した酵素が好ましい。 GH5-341 used in the production of xyloglucan oligosaccharides may be either an enzyme extracted from Aspergillus oryzae or an enzyme obtained by the method for producing xyloglucanase of the present invention (i.e., an enzyme produced by genetic recombination). . However, enzymes produced by genetic recombination are preferable because they are less likely to be contaminated with other xyloglucanases or cellulases, and the decomposition pattern of xyloglucan can be easily predicted.
ＧＨ５－３４１でキシログルカンを分解するための反応条件としては、当該酵素の至適ｐＨ及び至適温度を鑑みて、ｐＨ３～７、好ましくはｐＨ３．５～４．５、反応温度は３０～５０℃、好ましくは３５～４５℃が挙げられる。反応時間は基質であるキシログルカンの量及び使用するキシログルカナーゼの量によっても変化するが、通常、５分～２４０分、好ましくは１０分～１２０分、である。例えば、本願の実施例４においては酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を反応媒体とし、４０℃で１時間反応を実施した。 Considering the optimum pH and optimum temperature of the enzyme, the reaction conditions for decomposing xyloglucan with GH5-341 are pH 3 to 7, preferably pH 3.5 to 4.5, and reaction temperature 30 to 50. °C, preferably 35 to 45 °C. The reaction time varies depending on the amount of xyloglucan as a substrate and the amount of xyloglucanase used, but is usually 5 minutes to 240 minutes, preferably 10 minutes to 120 minutes. For example, in Example 4 of the present application, acetic acid buffer (pH 4.0) was used as the reaction medium, and the reaction was carried out at 40° C. for 1 hour.
キシログルカンの分解反応は、７０℃以上、好ましくは９８℃以上で、１０分以上、好ましくは１５分以上加熱することで、停止させることができる。 The decomposition reaction of xyloglucan can be stopped by heating at 70° C. or higher, preferably 98° C. or higher, for 10 minutes or more, preferably 15 minutes or more.
反応の停止後には、反応溶液に含まれるキシログルカンオリゴ糖を回収することができる。回収方法に特に限定はないが、例えば、反応溶液に含まれる酵素を除去し、その後、公知の糖の分離精製方法で回収することができる。一例として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、種類ごとにオリゴ糖を回収することができる。 After the reaction has stopped, the xyloglucan oligosaccharide contained in the reaction solution can be recovered. Although there is no particular limitation on the recovery method, for example, the enzyme contained in the reaction solution may be removed, and then the sugar may be recovered by a known sugar separation and purification method. As an example, oligosaccharides can be recovered by type by high performance liquid chromatography (HPLC).
本発明の製造方法によって製造したキシログルカンオリゴ糖には、２糖以上６糖以下の低分子のキシログルカンオリゴ糖が含まれる。自然界では、植物の細胞壁が再構成される過程でキシログルカンが様々な酵素による分解を受けてオリゴ糖が産生されることが確認されており、このようなオリゴ糖が植物において生理活性を有することが知られている。さらに植物以外の生物におけるキシログルカンオリゴ糖の生理活性についても研究されている。また、キシログルカンオリゴ糖は、新規なバイオ材料としての用途開発も進められている。 The xyloglucan oligosaccharides produced by the production method of the present invention include low-molecular xyloglucan oligosaccharides of 2 to 6 sugars. In nature, it has been confirmed that xyloglucan is degraded by various enzymes during the reconstitution process of plant cell walls to produce oligosaccharides, and it has been shown that such oligosaccharides have physiological activity in plants. It has been known. Furthermore, the physiological activities of xyloglucan oligosaccharides in organisms other than plants are also being studied. Furthermore, the development of applications for xyloglucan oligosaccharides as new biomaterials is also progressing.
なお、本明細書では種々の文献等を引用したが、これらはすべて参考として本明細書に組み込まれるものである。 In addition, although various documents have been cited in this specification, all of these are incorporated into this specification as reference.
以下、本発明を実施例を用いて詳述するが本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be explained in detail using Examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１
メタノール資化性酵母Pichia pastorisにおける発現系の構築
麹菌（酒類総合研究所から分譲されたAspergillus oryzaeRIB40株）から総ＲＮＡを抽出した。具体的には、麹菌を液体培養し、菌体をセルストレーナーで回収した。次に、回収した菌体をガラスビーズ（Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｃ、MP-Biomedicals社製）と破砕装置（ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４、MP-Biomedicals社製）とを用いて破砕し、ＲＮＡを抽出した。さらにＩＳＯＧＥＮ ｗｉｔｈ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ニッポンジーン社製）を使用して、ＲＮＡを精製した。抽出した総ＲＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを調製した。その際、逆転写反応は、オリゴｄＴプライマーを使用して行なった。
Example 1
Construction of expression system in methanol-assimilating yeast Pichia pastoris
Total RNA was extracted from Aspergillus aspergillus (Aspergillus oryzae RIB40 strain provided by the National Institute of Alcoholic Beverages). Specifically, Aspergillus oryzae was cultured in liquid, and the cells were collected using a cell strainer. Next, the collected bacterial cells were crushed using glass beads (Lysing Matrix C, manufactured by MP-Biomedicals) and a crusher (FastPrep-24, manufactured by MP-Biomedicals), and RNA was extracted. Furthermore, RNA was purified using ISOGEN with Spin Column (manufactured by Nippon Gene). Using the extracted total RNA as a template, cDNA was prepared by reverse transcription reaction using PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). At that time, the reverse transcription reaction was performed using an oligo dT primer.
上記で調製したｃＤＮＡを鋳型とし、下記に示す配列番号７及び８の塩基配列をＰＣＲプライマーとして使用してＰＣＲを実施し、麹菌ｃＤＮＡからキシログルカナーゼＧＨ５－３４１をコードするｃＤＮＡを得た。
配列番号７： ５’－ＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣ－３’
配列番号８： ５’－ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＴＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧ－３’
尚、ＰＣＲには、はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、標準的な条件で実施した。
Aspergillus oryzae由来のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２に示した。
PCR was performed using the cDNA prepared above as a template and the base sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 shown below as PCR primers to obtain cDNA encoding xyloglucanase GH5-341 from Aspergillus cDNA.
SEQ ID NO: 7: 5'-AGAGAGGCTGAAGCTCTCAGTGCCAATTGTACAGGGTCCTTTGAC-3'
SEQ ID NO: 8: 5'-ATGATGATGGTCGACAACAGTCAAAGTAAAGTTGACCGTATTTGTGG-3'
The PCR was performed using PrimeSTAR Max DNA polymerase (manufactured by Takara Bio) under standard conditions.
The nucleotide sequence of cDNA derived from Aspergillus oryzae is shown in SEQ ID NO: 2.
次に、ｐＧＡＰＺα－Ａプラスミドベクター（Invitrogen）を鋳型とし、下記に示す配列番号５及び６の塩基配列をＰＣＲプライマーとして使用してＰＣＲを実施し、ｐＧＡＰＺα－Ａ由来のクローニング用ＤＮＡ断片を得た。
配列番号９： ５’－ＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧ－３’
配列番号１０： ５’－ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧ－３’
尚、ＰＣＲには、はPrimeSTAR Max ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、標準的な条件で実施した。
Next, PCR was performed using the pGAPZα-A plasmid vector (Invitrogen) as a template and the base sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6 shown below as PCR primers to obtain a DNA fragment for cloning derived from pGAPZα-A. .
SEQ ID NO: 9: 5'-AGCTTCAGCCTCTCTTTTTCTCGAGAG-3'
SEQ ID NO: 10: 5'-GTCGACCATCATCATCATTGAG-3'
The PCR was performed using PrimeSTAR Max DNA polymerase (manufactured by Takara Bio) under standard conditions.
上記で増幅したＤＮＡ断片を、ｐＧＡＰＺα－Ａから増幅したＤＮＡ断片へ、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてクローニングし、キシログルカナーゼＧＨ５－３４１発現プラスミドベクターを得た。 The DNA fragment amplified above was cloned into the DNA fragment amplified from pGAPZα-A using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a xyloglucanase GH5-341 expression plasmid vector.
得られたプラスミドベクターを制限酵素ＡｖｒＩＩ（New England BioLabs社製）で処理した後、Pichia pastoris X-33株（Invitrogen社製）へエレクトロポレーションにて導入し、キシログルカナーゼＧＨ５－３４１発現P. pastoris X-33株を得た（以下、しばしば、「ＧＨ５－３４１発現株」とも称す）。エレクトロポレーションは、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（BioRad社製）を使用し、２．０ｋＶ、１パルスで０．２ｃｍキュベットを用いて実施した。 The obtained plasmid vector was treated with restriction enzyme AvrII (manufactured by New England BioLabs), and then introduced into Pichia pastoris strain X-33 (manufactured by Invitrogen) by electroporation to obtain P. pastoris expressing xyloglucanase GH5-341. The X-33 strain was obtained (hereinafter also often referred to as "GH5-341 expressing strain"). Electroporation was performed using MicroPulser Electroporation (manufactured by BioRad) at 2.0 kV and 1 pulse using a 0.2 cm cuvette.
実施例２
精製酵素の調製
実施例１で得たＧＨ５－３４１発現株を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含むＹＰＤ培地（２％のペプトン、１％の酵母エキス、２％のグルコースを含む培地）で、３０℃において１５０ｒｐｍで振盪しながら３日間培養し、培養液を得た。得られた培養液を５，０００ｇで３分間遠心分離し、培養菌体と培養上清とに分離した。分離した培養上清を回収し、そのｐＨを１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を用いてｐＨ７程度に調整した。
Example 2
Preparation of purified enzyme
The GH5-341 expression strain obtained in Example 1 was grown in YPD medium (medium containing 2% peptone, 1% yeast extract, 2% glucose) containing 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). The cells were cultured for 3 days at 30° C. with shaking at 150 rpm to obtain a culture solution. The obtained culture solution was centrifuged at 5,000g for 3 minutes to separate cultured cells and culture supernatant. The separated culture supernatant was collected, and its pH was adjusted to approximately pH 7 using 1M Tris-HCl (pH 8.5).
ｐＨを調整した培養上清をＨｉｓＴｒａｐ ＦＦの５ｍＬカラム（ＧＥヘルスケア社製）へロードし、培養上清に含まれるＧＨ５－３４１をカラムへ吸着させた。次いで当該カラムを洗浄緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、３００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液）で洗浄した。次に、洗浄したカラムに溶出緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、３００ｍＭの塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液）を流し、ＧＨ５－３４１をカラムから脱離させ、粗酵素液として回収した。 The pH-adjusted culture supernatant was loaded onto a 5 mL HisTrap FF column (manufactured by GE Healthcare), and GH5-341 contained in the culture supernatant was adsorbed onto the column. The column was then washed with a wash buffer (buffer containing 20mM sodium phosphate buffer (pH 7.2), 300mM sodium chloride, 20mM imidazole). Next, an elution buffer (buffer containing 20mM sodium phosphate buffer (pH 7.2), 300mM sodium chloride, and 500mM imidazole) was applied to the washed column to desorb GH5-341 from the column, and the crude It was recovered as an enzyme solution.
回収した粗酵素液を限外濾過膜（VivaSpin 10 k-cut、ＧＥヘルスケア社製）を用いて４，０００ｇで遠心分離することによって濃縮し、精製酵素溶液を得た。また、濃縮する際に、緩衝液を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）へ置換した。 The recovered crude enzyme solution was concentrated by centrifugation at 4,000 g using an ultrafiltration membrane (VivaSpin 10 k-cut, manufactured by GE Healthcare) to obtain a purified enzyme solution. Furthermore, during concentration, the buffer was replaced with 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.5).
ＧＨ５－３４１発現株の培養上清及び精製酵素溶液について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって酵素の存在及び精製を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、ゲルとしてｅ－ＰＡＧＥＬ ＨＲ １５％ゲル（ATTO社製）を使用し、泳動バッファーとして２１ｍＭのＥｚＲｕｎ ＭＯＰＳ（ATTO社製）を使用した。
電気泳動図を図１に示した。
The presence and purification of the enzyme was confirmed by SDS-PAGE for the culture supernatant and purified enzyme solution of the GH5-341 expressing strain. For SDS-PAGE,
The electropherogram is shown in Figure 1.
図１において、培養上清と精製酵素には、７５ｋＤａと１００ｋＤａの間のほぼ同じ位置に単一のバンドが存在する。これはＧＨ５－３４１発現株は培地中にＧＨ５－３４１を分泌しており、培養上清からＧＨ５－３４１を容易に精製することができたことを意味する。 In FIG. 1, a single band exists in the culture supernatant and the purified enzyme at approximately the same position between 75 kDa and 100 kDa. This means that the GH5-341-expressing strain secreted GH5-341 into the medium, and that GH5-341 could be easily purified from the culture supernatant.
実施例３
精製ＧＨ５－３４１の基質特異性試験
タマリンド種子由来のキシログルカン（Megazyme社製）及びカルボキシメチルセルロース（東京化成工業株式会社製）を基質として、実施例２で精製したＧＨ５－３４１の酵素活性を調べた。
Example 3
Substrate specificity test of purified GH5-341
The enzymatic activity of GH5-341 purified in Example 2 was examined using xyloglucan derived from tamarind seeds (manufactured by Megazyme) and carboxymethyl cellulose (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) as substrates.
精製酵素を１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で１μｇ／ｍｌ（０．００１ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。基質溶液としては、キシログルカン及びカルボキシメチルセルロースのそれぞれの０．８％水溶液を用意した。５μｌの基質溶液に５μｌの酵素溶液を添加し、４０℃で５分間、反応させた。次いで９８℃で１０分間の熱処理を行うことで、酵素反応を停止させた。 The purified enzyme was diluted to 1 μg/ml (0.001 mg/ml) with 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0). As substrate solutions, 0.8% aqueous solutions of xyloglucan and carboxymethylcellulose were prepared. 5 μl of enzyme solution was added to 5 μl of substrate solution and reacted at 40° C. for 5 minutes. The enzymatic reaction was then stopped by heat treatment at 98°C for 10 minutes.
得られた反応溶液について、ビシンコニン酸法によって還元糖の定量を行なった。ビシンコニン酸法はFox, J.D. and Robyt, J. F. (1991) Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader. Anal. Biochem. 195, 93-96の記載に基づき実施した。 The amount of reducing sugar in the resulting reaction solution was determined by the bicinchoninic acid method. The bicinchoninic acid method was carried out as described in Fox, J.D. and Robyt, J.F. (1991) Miniaturization of three carbohydrate analyzes using a microsample plate reader. Anal. Biochem. 195, 93-96.
得られた還元糖の量に基づき、酵素活性を算出した。酵素活性は、１ｍｇのタンパク質当たりのユニット数（Ｕ）で表し、１Ｕは、１分間に還元糖量で１μｍｏｌ相当のグルコースを生成する酵素活性と定義した。結果を表１に示した。 Enzyme activity was calculated based on the amount of reducing sugar obtained. The enzyme activity was expressed in units (U) per 1 mg of protein, and 1 U was defined as the enzyme activity that produced glucose equivalent to 1 μmol of reducing sugar per minute. The results are shown in Table 1.
表１の結果から明らかなように、精製ＧＨ５－３４１は、カルボキシメチルセルロースよりもキシログルカンに対して高い酵素活性を示した。 As is clear from the results in Table 1, purified GH5-341 showed higher enzymatic activity toward xyloglucan than carboxymethyl cellulose.
実施例４
精製ＧＨ５－３４１の分解生成物の同定
実施例２で精製したＧＨ５－３４１を用いてタマリンド種子由来キシログルカン（Megazyme社製）を分解し、分解生成物を同定した。酵素反応は下記組成の反応溶液で実施した。
０．８％のタマリンド種子由来キシログルカン ５０μＬ
０．５ｍｇ／ｍｌのＧＨ５－３４１ ５μＬ
５００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ４．０ １０μＬ
水 ３５μＬ
合計： １００μＬ
上記反応溶液を４０℃で１時間インキュベートし、その後、９８℃で１０分間加熱するとによって酵素反応を停止させて、反応産物を得た。
Example 4
Identification of decomposition products of purified GH5-341
Tamarind seed-derived xyloglucan (manufactured by Megazyme) was degraded using GH5-341 purified in Example 2, and the degradation products were identified. The enzyme reaction was carried out using a reaction solution having the following composition.
0.8% tamarind seed-derived xyloglucan 50μL
5 μL of 0.5 mg/ml GH5-341
10 μL of 500 mM acetate buffer, pH 4.0
35μL water
Total: 100μL
The reaction solution was incubated at 40° C. for 1 hour, and then heated at 98° C. for 10 minutes to stop the enzyme reaction to obtain a reaction product.
得られた反応産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。ＨＰＬＣ用のカラムには、ＴＳＫｇｅｌアミド８０カラム（４．６×２５０ｍｍ）を用い、移動相には６０％アセトニトリルを用いた。分析は、カラムを４０℃に保温して実施した。得られたクロマトグラムを図２に示す。 The obtained reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). A TSKgel amide 80 column (4.6 x 250 mm) was used as the column for HPLC, and 60% acetonitrile was used as the mobile phase. The analysis was carried out with the column kept at 40°C. The obtained chromatogram is shown in FIG. 2.
図２のクロマトグラムに見られる主要なピークを、オリゴ糖スタンダードを用いてオリゴ糖に帰属させた。図２中において、Ｘ、ＸＸ、ＬＧ、ＸＸＸＧ、ＸＸＬＧ、及びＸＬＬＧは、下記のオリゴ糖を表す。
Ｘ ： Ｇｌｃ１Ｘｙｌ１
ＸＸ： Ｇｌｃ２Ｘｙｌ２
ＬＧ： Ｇｌｃ２Ｘｙｌ１Ｇａｌ１
ＸＸＸＧ： Ｇｌｃ４Ｘｙｌ３
ＸＸＬＧ： Ｇｌｃ４Ｘｙｌ３Ｇａｌ１
ＸＬＬＧ： Ｇｌｃ４Ｘｙｌ３Ｇａｌ２
The main peaks seen in the chromatogram in Figure 2 were assigned to oligosaccharides using an oligosaccharide standard. In FIG. 2, X, XX, LG, XXXG, XXXG, and XLLG represent the following oligosaccharides.
X: Glc 1 Xyl 1
XX : Glc2Xyl2
LG: Glc 2 Xyl 1 Gal 1
XXXG: Glc 4 Xyl 3
XXLG: Glc 4 Xyl 3 Gal 1
XLLG: Glc 4 Xyl 3 Gal 2
さらに反応産物にガラクトシダーゼＬａｃＡ（Matsuzawa T, Watanabe M, Kameda T, Kameyama A, Yaoi K (2019a) Cooperation between beta-galactosidase and an isoprimeverose-producing oligoxyloglucan hydrolase is key for xyloglucan degradation in Aspergillus oryzae. FEBS J 286:3182-3193）及びイソプリメベロース生成酵素ＩｐｅＡ（Matsuzawa T, Mitsuishi Y, Kameyama A, Yaoi K (2016) Identification of the gene encoding isoprimeverose-producing oligoxyloglucan hydrolase in Aspergillus oryzae. J Biol Chem 291:5080-5087）を作用させて、ピークの消失や出現を確認することで、ＸＸＸＧとＸＸＬＧの間のピークは、ＬＬＧ（Ｇｌｃ３Ｘｙｌ２Ｇａｌ２）であると推定した。 Furthermore, the reaction product contains galactosidase LacA (Matsuzawa T, Watanabe M, Kameda T, Kameyama A, Yaoi K (2019a) Cooperation between beta-galactosidase and an isoprimeverose-producing oligoxyloglucan hydrolase is key for xyloglucan degradation in Aspergillus oryzae. FEBS J 286:3182 -3193) and the isoprimeverose-producing enzyme IpeA (Matsuzawa T, Mitsuishi Y, Kameyama A, Yaoi K (2016) Identification of the gene encoding isoprimeverose-producing oligoxyloglucan hydrolase in Aspergillus oryzae. J Biol Chem 291:5080-5087). The peak between XXXG and XXXG was estimated to be LLG (Glc 3 Xyl 2 Gal 2 ) by confirming the disappearance or appearance of peaks.
図２から明らかなように、ＧＨ５－３４１でキシログルカンを分解したところ、Ｘ、ＸＸ、ＬＧ、ＸＸＸＧ、ＸＸＬＧ、及びＸＬＬＧに帰属されるピークを含む、複数のピークが検出された。特にＸ、ＸＸ、ＬＧは長さが７糖未満の低分子オリゴ糖である。これらピークは、ＧＨ５－３４１がキシログルカンを分解する際に、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合ならびにキシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合を分解して、キシログルカンから低分子オリゴ糖を生成可能であることを示している。 As is clear from FIG. 2, when xyloglucan was decomposed with GH5-341, multiple peaks were detected, including peaks assigned to X, XX, LG, XXXG, XXLG, and XLLG. In particular, X, XX, and LG are low molecular oligosaccharides having a length of less than 7 sugars. These peaks indicate that when GH5-341 decomposes xyloglucan, it decomposes the β-1,4 bond of glucose with a xylose side chain and the β-1,4 bond of glucose without a xylose side chain. This shows that it is possible to produce low-molecular-weight oligosaccharides from xyloglucan.
本発明によって、１種の酵素のみによる処理で、キシログルカンから長さが７糖未満の低分子オリゴ糖を含む種々の分子量のオリゴ糖を生産することが可能となる。よって本発明は、キシログルカンオリゴ糖の新たな用途開発に寄与し得る。 The present invention makes it possible to produce oligosaccharides of various molecular weights, including low-molecular-weight oligosaccharides with a length of less than 7 sugars, from xyloglucan by treatment with only one type of enzyme. Therefore, the present invention can contribute to the development of new uses for xyloglucan oligosaccharides.
配列番号７： ＧＨ５－３４１増幅用のＰＣＲプライマー
配列番号８： ＧＨ５－３４１増幅用のＰＣＲプライマー
配列番号９： ベクター増幅用ＰＣＲプライマー
配列番号１０： ベクター増幅用ＰＣＲプライマー
SEQ ID NO: 7: PCR primer for GH5-341 amplification SEQ ID NO: 8: PCR primer for GH5-341 amplification SEQ ID NO: 9: PCR primer for vector amplification SEQ ID NO: 10: PCR primer for vector amplification
Claims (8)
前記キシログルカナーゼが、配列番号３に示すアミノ酸配列、又は配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つキシログルカンのセルロース主鎖中の、キシロース側鎖の結合したグルコースのβ－１，４結合及びキシロース側鎖の結合していないグルコースのβ－１，４結合を分解し得るキシログルカナーゼである、
キシログルカンオリゴ糖の製造方法。 A method for producing xyloglucan oligosaccharides, the method comprising decomposing xyloglucan with xyloglucanase,
The xyloglucanase contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the xyloglucanase contains the xylose side in the cellulose main chain of xyloglucan. is a xyloglucanase capable of degrading the β-1,4 bond of glucose attached to the chain and the β-1,4 bond of glucose not attached to the xylose side chain;
A method for producing xyloglucan oligosaccharides.
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