JP7440882B2 - Molecular identification technology for thrips - Google Patents
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Description
本発明は、例えばアザミウマ類の種識別法に関する。 The present invention relates to a method for identifying species of, for example, thrips.
アザミウマ類は微小な食植性昆虫であり、農作物に対する食害や植物ウイルス病の媒介による品質低下により、大きな農業被害をもたらす種が少なくない。 Thrips are microscopic plant-feeding insects, and many species cause major agricultural damage by feeding on agricultural crops and deteriorating their quality by transmitting plant virus diseases.
アザミウマ類は種類によって殺虫剤や防虫ネットなどの防除効果が異なり、その種類に応じて対策を講じる必要があるため、圃場に発生する種を正確に判定・識別する必要がある。しかしながら、アザミウマ類の体長は約1～2mm程度以下のものが多く、肉眼による種の識別が不可能な場合が多い。 The control effects of insecticides and insect nets vary depending on the type of thrips, and countermeasures need to be taken depending on the type, so it is necessary to accurately determine and identify the species occurring in the field. However, most thrips have a body length of approximately 1 to 2 mm or less, and it is often impossible to identify the species with the naked eye.
従来の方法では、アザミウマ類を正確に識別・同定するためには、成虫のプレパラート標本を作製し、顕微鏡下において微細な形態を詳細に観察する必要がある。しかしながら、顕微鏡によるアザミウマ成虫の外部形態の観察結果を適切に判断するためには、昆虫形態に関する知識と形態観察に関する熟練が必要である。さらに、アザミウマ幼虫では、形態的特性により種を識別することは不可能とされている。 With conventional methods, in order to accurately identify and identify thrips, it is necessary to prepare prepared specimens of adult insects and observe their minute morphology in detail under a microscope. However, in order to appropriately judge the results of observing the external morphology of adult thrips using a microscope, knowledge of insect morphology and skill in morphological observation are required. Furthermore, it is impossible to identify the species of thrips larvae based on morphological characteristics.
このような状況下、初心者にも利用可能で、発育ステージや雌雄に関わらず、害虫防除の現場で容易にアザミウマ類の識別ができる新しい手法の開発が求められている。 Under these circumstances, there is a need to develop a new method that can be used even by beginners and that can easily identify thrips in the field of pest control, regardless of developmental stage or sex.
DNAを用いたアザミウマ類の識別法として、PCR-RFLPによる方法、LAMP法による方法等が報告されている。しかしながら、いずれも識別対象が少なく適用範囲が限られること、特に前者では、標本からのDNA抽出に加え制限酵素による増幅産物の処理や電気泳動など煩雑な操作が必要であり、識別・同定に時間を要するなどの難点がある。また、これら既報の方法を、DNAが劣化したアザミウマ類の標本等に適用したり、天敵など他生物に捕食されたアザミウマ類の検出や同定に適用することは困難である。 As methods for identifying thrips using DNA, methods such as PCR-RFLP and LAMP have been reported. However, in both cases, the scope of application is limited due to the small number of objects to be identified.In particular, the former requires complicated operations such as DNA extraction from the specimen, treatment of amplification products with restriction enzymes, and electrophoresis, which takes time for identification and identification. There are some drawbacks, such as the need for Furthermore, it is difficult to apply these previously reported methods to specimens of thrips whose DNA has deteriorated, or to detect and identify thrips that have been preyed on by other organisms such as natural enemies.
近年捕食性の天敵昆虫等を用いたアザミウマ類の防除に期待が寄せられているが、有望天敵の探索や防除効果の確認のためには、天敵昆虫等が実際に捕食したアザミウマ種を同定する必要がある。このような目的のために、アザミウマ類を捕食した天敵昆虫の腸内に残存するアザミウマ類のミトコンドリアDNAの一部をネステッドPCRで増幅し、DNAシークエンサーを用いて塩基配列を解析することでアザミウマ類の種同定を試みた例もあるが、多くの労力と高価な解析機器が必要であり、害虫防除の現場など一般に広く普及することはできない。 In recent years, expectations have been placed on the control of thrips using predatory natural enemy insects, etc., but in order to search for promising natural enemies and confirm the control effect, it is necessary to identify the thrips species actually preyed on by natural enemy insects. There is a need. For this purpose, we amplified part of the mitochondrial DNA of thrips that remained in the intestines of natural enemy insects that preyed on thrips using nested PCR, and analyzed the base sequence using a DNA sequencer. There have been attempts to identify the species, but this requires a lot of labor and expensive analysis equipment, and cannot be widely used in pest control fields.
ところで、STH(Single-stranded Tag Hybridization)-PAS(Printed-Array Strip)法は、株式会社TBAの技術である。株式会社TBAのホームページに説明されるように、STH法は、ビオチン標識プライマーとシングルタグDNA付プライマーにより標的DNAをPCR増幅し、その増幅液をアビジンコートラテックス(青)と混合してメンブレンストリップに展開することで、ライン状に固相化された相補タグDNAとタグDNAの強いハイブリダイゼーション反応によりPCR増幅産物をトラップし、トラップされたPCR増幅産物を結合したアビジンコートラテックスによる青色ラインとして検出することで、検体中の標的DNAの有無や種類を目視判別する遺伝子検査方法である。また、PASは、STH法で使用されるメンブレンストリップで、数種類のシングルタグDNAに相補的なオリゴヌクレオチドが異なった位置にライン状に固相化されており、異なったシングルタグDNA付きプライマーを複数用いたPCR（マルチプレックスPCR）において、被験DNAがいずれのシングルタグDNA付きプライマーと反応しPCR増幅が起きたかをラインの位置によって判別することができる。 By the way, the STH (Single-stranded Tag Hybridization)-PAS (Printed-Array Strip) method is a technology of TBA Corporation. As explained on the TBA Co., Ltd. website, the STH method involves PCR amplification of target DNA using a biotin-labeled primer and a single-tagged DNA primer, and the amplified solution is mixed with avidin-coated latex (blue) and applied to a membrane strip. By unfolding, PCR amplification products are trapped due to the strong hybridization reaction between the complementary tag DNA immobilized in a line and the tag DNA, and the trapped PCR amplification products are detected as a blue line due to the bound avidin coated latex. This is a genetic testing method that visually determines the presence and type of target DNA in a sample. In addition, PAS is a membrane strip used in the STH method, in which oligonucleotides complementary to several types of single-tagged DNA are immobilized in a line at different positions, and multiple primers with different single-tagged DNA can be used. In the PCR (multiplex PCR) used, it is possible to determine with which primer with a single tag DNA the test DNA reacted and PCR amplification occurred by the position of the line.
STH-PAS法は、研究インフラの整備が困難な検査の現場や途上国などにおいて、簡便且つ高精度にPCR産物中のDNAを識別できる新しいDNA検査法として注目されているが、上記のDNAを用いたアザミウマ類の識別法であるPCR-RFLPによる方法やLAMP法による方法をこれに適用することはできない。 The STH-PAS method is attracting attention as a new DNA testing method that can easily and accurately identify DNA in PCR products in testing sites where research infrastructure is difficult to develop and in developing countries. The thrips identification methods used, such as the PCR-RFLP method and the LAMP method, cannot be applied to this.
本発明は、上述の実情に鑑み、アザミウマ類の種識別を迅速、且つ高精度、且つ簡便に行うことができる、アザミウマ類の種識別法を提供することを目的とする。 In view of the above-mentioned circumstances, it is an object of the present invention to provide a method for identifying species of thrips that can be performed quickly, accurately, and easily.
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アザミウマ類のミトコンドリアDNA塩基配列上に種特異的な領域と塩基配列を見出した。詳細に解析した結果、これらはDNAの塩基置換だけでなく、欠失変異や挿入変異を含んでおり、アザミウマ類の各種に固有の塩基配列を用いて、アザミウマ類を高い精度で識別できることを見出した。さらにこれらの塩基配列をSTH-PAS法等のDNA検査法に適用することで、迅速で簡便な種同定技術として本発明を完成するに至った。 As a result of intensive research to solve the above problems, we discovered species-specific regions and base sequences in the mitochondrial DNA base sequences of thrips. As a result of detailed analysis, we found that these genes contain not only DNA base substitutions, but also deletion mutations and insertion mutations, and that it is possible to identify thrips with high accuracy using the unique base sequences of each type of thrips. Ta. Furthermore, by applying these base sequences to DNA testing methods such as the STH-PAS method, we have completed the present invention as a rapid and simple species identification technique.
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）被験DNAにおいて、配列番号１～３１に示される塩基配列から成る群より選択されるアザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとシトクロムcオキシダーゼサブユニット1(CO1)遺伝子との間の領域の種特異的な塩基配列を検出する工程を含む、アザミウマ類の種を識別する方法であって、
配列番号１又は２に示される塩基配列の存在が、マメハナアザミウマを示し、
配列番号３又は４に示される塩基配列の存在が、ネギアザミウマを示し、
配列番号５又は６に示される塩基配列の存在が、クワアザミウマを示し、
配列番号７又は８に示される塩基配列の存在が、コスモスアザミウマを示し、
配列番号９又は１０に示される塩基配列の存在が、ハナアザミウマを示し、
配列番号１１又は１２に示される塩基配列の存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
配列番号１３に示される塩基配列の存在が、クサキイロアザミウマを示し、
配列番号１４又は１５に示される塩基配列の存在が、ダイズアザミウマを示し、
配列番号１６又は１７に示される塩基配列の存在が、クロトンアザミウマを示し、
配列番号１８又は１９に示される塩基配列の存在が、ビワハナアザミウマを示し、
配列番号２０又は２１に示される塩基配列の存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
配列番号２２又は２３に示される塩基配列の存在が、第１の未同定種を示し、
配列番号２４又は２５に示される塩基配列の存在が、第２の未同定種を示し、
配列番号２６又は２７に示される塩基配列の存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
配列番号２８又は２９に示される塩基配列の存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
配列番号３０又は３１に示される塩基配列の存在が、ヒラズハナアザミウマを示す、
前記方法。
（２）被験DNAを鋳型として、配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つのプライマーとを用いて、アザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとCO1遺伝子との間の領域を増幅する工程と、
前記増幅工程で得られる増幅産物を指標に、アザミウマ類の種を識別する工程と、
を含む、アザミウマ類の種を識別する方法であって、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３３に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３４に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、コスモスアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３５に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ビワハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３６に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３７に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３８に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ネギアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３９に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、マメハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４０に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クワアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４１に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４２に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クサキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４３に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４４に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ヒラズハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４５に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ダイズアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４６に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クロトンアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４７に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、第１の未同定種を示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４８に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、第２の未同定種を示す、
前記方法。
上記では、それぞれのアザミウマ種に特異的なプライマーとして配列番号３３から配列番号４８に示される塩基配列からなるものについて述べているが、これらは配列番号１から配列番号３１に示される塩基配列にもとづき設計したものであり、各アザミウマ種に特異的なプライマーとしては配列番号３３から配列番号４８に示される塩基配列に限定されることはなく、その近傍ややや離れた位置であっても種特異的な塩基配列を示す部位があればその部分を種特異的プライマーとして使用することもできる。
（３）被験DNAを鋳型として、5'末端をビオチン修飾した配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと、5'末端にそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグを有する配列番号３３～４８に示される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか１つ以上のプライマーを用いて、アザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとCO1遺伝子との間の領域を増幅する工程と、
前記増幅工程で得られる増幅産物をSTH-PAS法に供し、アザミウマ類の種を識別する工程と、
を含む、アザミウマ類の種を識別する方法であって、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３３に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３３に示すDNAの存在が、ハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３４に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３４に示すDNAの存在が、コスモスアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３５に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３５に示すDNAの存在が、ビワハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３６に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３６に示すDNAの存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３７に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３７に示すDNAの存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３８に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３８に示すDNAの存在が、ネギアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３９に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３９に示すDNAの存在が、マメハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４０に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上の成るプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４０に示すDNAの存在が、クワアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４１に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４１に示すDNAの存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４２に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４２に示すDNAの存在が、クサキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４３に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４３に示すDNAの存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４４に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４４に示すDNAの存在が、ヒラズハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４５に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４５に示すDNAの存在が、ダイズアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４６に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４６に示すDNAの存在が、クロトンアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４７に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４７に示すDNAの存在が、第１の未同定種を示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４８に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４８に示すDNAの存在が、第２の未同定種を示す、
前記方法。
上記では、それぞれのアザミウマ種に特異的なプライマーとして配列番号３３から配列番号４８に示される塩基配列からなるものについて述べているが、これらは配列番号１から配列番号３１に示される塩基配列にもとづき設計したものであり、各アザミウマ種に特異的なプライマーとしては配列番号３３から配列番号４８に示される塩基配列に限定されることはなく、その近傍ややや離れた位置であっても種特異的な塩基配列を示す部位があればその部分を種特異的プライマーとして使用することもできる。
（４）被験DNAが、アザミウマ類以外の生物のDNA中にアザミウマ類のDNAが混在する可能性があるDNAである、（１）～（３）のいずれか１記載の方法。
（５）アザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとCO1遺伝子との間の領域に対して配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーとがアニーリングする位置の外側の領域に対応するプライマーセットを用いて、サンプル中のDNAをPCRに供する工程をさらに含み、得られた増幅産物を被験DNAとして使用する、（１）～（４）のいずれか１記載の方法。
（６）外側の領域に対応するプライマーセットが、配列番号４９に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号５０～５４に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つ又は2つのプライマーとから成る、（５）記載の方法。
（７）（１）～（６）のいずれか１記載の方法に使用するための、アザミウマ類の種を識別するためのプライマーセット。
（８）配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つのプライマーとを含む、（７）記載のプライマーセット。
（９）5'末端をビオチン修飾した配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと、5'末端にそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグを有する配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか１つ以上のプライマーとを含む、（７）記載のプライマーセット。
（１０）アザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとCO1遺伝子との間の領域に対して配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーとがアニーリングする位置の外側の領域に対応するプライマーセットをさらに含む、（８）又は（９）記載のプライマーセット。
（１１）外側の領域に対応するプライマーセットが、配列番号４９に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号５０～５４に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つ又は2つのプライマーとから成る、（１０）記載のプライマーセット。
（１２）（７）～（１１）のいずれか１記載のプライマーセットを含む、アザミウマ類の種を識別するためのキット。
That is, the present invention includes the following.
(1) In the test DNA, the region between the 16S rDNA and the cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) gene on the mitochondrial DNA of thrips selected from the group consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 31. A method for identifying a species of thrips, the method comprising the step of detecting a species-specific base sequence,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 indicates thrips,
The presence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 indicates thrips,
The presence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 indicates a plant thrips;
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 indicates Cosmos thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10 indicates Hana thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 indicates black thrips,
The presence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 indicates thrips thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 15 indicates soybean thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 17 indicates Croton thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 19 indicates Biwahana thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21 indicates southern thrips;
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 or 23 indicates a first unidentified species,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 25 indicates a second unidentified species,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 or 27 indicates Tea thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 or 29 indicates Thrips occidentalis,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 or 31 indicates thrips
Said method.
(2) Using the test DNA as a template, use one of the primers consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and the primer consisting of the base sequence selected from the group consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOS: 33 to 48. a step of amplifying a region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of the thrips using a primer;
A step of identifying the species of thrips using the amplification product obtained in the amplification step as an indicator;
A method for identifying a species of thrips, comprising:
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 indicates thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 indicates Cosmos thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 indicates A. thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 indicates thrips
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 indicates southern thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 38 indicates thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 indicates thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40 indicates a plant thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 indicates Tea thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 indicates thrips thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 indicates Occidentalis thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 44 indicates Thrips thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 indicates soybean thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 indicates Croton thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 indicates a first unidentified species,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48 indicates a second unidentified species.
Said method.
The above describes primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48 as specific primers for each thrips species, but these are based on the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 31. The primers specific to each thrips species are not limited to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48, and the primers specific to each thrips species are species-specific even if the base sequences are located near or a little further away. If there is a site that shows a specific base sequence, that portion can also be used as a species-specific primer.
(3) Using the test DNA as a template, a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 with the 5' end modified with biotin and the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 33 to 48, each having a different oligonucleotide tag at the 5' end. amplifying a region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of the thrips using one or more of the primers consisting of;
a step of subjecting the amplification product obtained in the amplification step to the STH-PAS method to identify the thrips species;
A method for identifying a species of thrips, comprising:
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 33 in the amplified product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 34 in the amplified product indicates that Cosmos shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 35 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end Shows a thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 36 in the amplified product indicates that Shows a thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 37 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end showing yellow thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 38 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 38 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 39 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end Shows a thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 40 in the amplified product when one or more primers including the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end. Shows a plant thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 41 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end Shows white thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 42 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end showing yellow thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 43 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end showing yellow thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 44 in the amplified product indicates that shows,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 45 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 46 in the amplified product indicates that croton shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 47 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5'
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 48 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 48 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end. Indicating 2 unidentified species,
Said method.
The above describes primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48 as specific primers for each thrips species, but these are based on the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 31. The primers specific to each thrips species are not limited to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48, and the primers specific to each thrips species are species-specific even if the base sequences are located near or a little further away. If there is a site that shows a specific base sequence, that portion can also be used as a species-specific primer.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the test DNA is DNA of an organism other than thrips, in which thrips DNA may be mixed.
(5) A primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 33 to 48 for the region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of thrips. The method further includes the step of subjecting the DNA in the sample to PCR using a primer set corresponding to a region outside the position where the primer consisting of the selected base sequence anneals, and the resulting amplification product is used as test DNA. , the method according to any one of (1) to (4).
(6) The primer set corresponding to the outer region is a primer consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 50 to 54. and one or two primers, the method according to (5).
(7) A primer set for identifying thrips species for use in the method according to any one of (1) to (6).
(8) a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and any one of the primers consisting of a base sequence selected from the group consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 33 to 48; 7) Primer set described.
(9) A primer selected from the group consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 with a biotin-modified 5' end and a nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs 33 to 48 each having a different oligonucleotide tag at the 5' end. (7) The primer set described in (7), comprising any one or more of the primers consisting of a base sequence.
(10) A primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a group consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 33 to 48 for the region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of thrips. The primer set according to (8) or (9), further comprising a primer set corresponding to a region outside the position where the primer consisting of the selected base sequence anneals.
(11) The primer set corresponding to the outer region is a primer consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 50 to 54. The primer set according to (10), comprising any one or two primers.
(12) A kit for identifying thrips species, comprising the primer set according to any one of (7) to (11).
本発明によれば、アザミウマ類の種識別を、既存の方法に比べて、より迅速且つ高精度、且つ簡便に行うことができる。 According to the present invention, species identification of thrips can be performed more quickly, with higher precision, and more easily than with existing methods.
以下、本発明を詳細に説明する。 The present invention will be explained in detail below.
第一実施形態において、本発明に係るアザミウマ類の種識別方法(以下、「本方法」と称する)は、図１に示すアザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとCO1遺伝子との間の種特異的な塩基配列を指標とし、アザミウマ類の種を識別することを特徴とする。アザミウマ類とは異なり、他の多くの昆虫のミトコンドリアDNAでは、「16S rDNA」と「CO1」の二つの遺伝子は隣接しないため、これら遺伝子の境界領域を増幅対象とするアザミウマ類用のプライマーセットを使用したPCRによって、それら遺伝子が隣接しない昆虫等のミトコンドリアDNAを増幅することはできないため、アザミウマ類と他生物のDNAが混合したサンプルからも、効率よくアザミウマ類のDNAのみを増幅し、種識別に利用することができる。 In the first embodiment, the thrips species identification method according to the present invention (hereinafter referred to as "this method") is based on the species-specific identification between the 16S rDNA and CO1 gene on the thrips mitochondrial DNA shown in FIG. It is characterized by identifying the species of thrips using the nucleotide sequence as an indicator. Unlike thrips, in the mitochondrial DNA of many other insects, the two genes "16S rDNA" and "CO1" are not adjacent, so we created a primer set for thrips that targets the border region of these genes. The PCR used cannot amplify the mitochondrial DNA of insects, etc., where these genes are not adjacent, so even from a sample containing a mixture of DNA from thrips and other organisms, only the DNA of thrips can be efficiently amplified to identify the species. It can be used for.
16種のアザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNA後半～CO1遺伝子前半の塩基配列(約1,100塩基対の塩基配列)の比較から種特異的で種の識別に利用できる塩基配列を見出した。 By comparing the nucleotide sequences (approximately 1,100 base pairs) of the mitochondrial DNA of 16 species of thrips from the latter half of the 16S rDNA to the first half of the CO1 gene, we found a nucleotide sequence that is species-specific and can be used for species identification.
具体的には、本方法は、被験DNAにおいて、配列番号１～３１に示される塩基配列から成る群より選択されるアザミウマ類のミトコンドリアDNA上の16S rDNAとCO1遺伝子との間の領域における種特異的塩基配列を検出する工程を含む。以下に示す種特異的塩基配列(各配列番号に示される塩基配列)の存在が、各アザミウマ類の種を示す：
配列番号１又は２に示される塩基配列：マメハナアザミウマ；
配列番号３又は４に示される塩基配列：ネギアザミウマ；
配列番号５又は６に示される塩基配列：クワアザミウマ；
配列番号７又は８に示される塩基配列：コスモスアザミウマ；
配列番号９又は１０に示される塩基配列：ハナアザミウマ；
配列番号１１又は１２に示される塩基配列：クロゲハナアザミウマ；
配列番号１３に示される塩基配列：クサキイロアザミウマ；
配列番号１４又は１５に示される塩基配列：ダイズアザミウマ；
配列番号１６又は１７に示される塩基配列：クロトンアザミウマ；
配列番号１８又は１９に示される塩基配列：ビワハナアザミウマ；
配列番号２０又は２１に示される塩基配列：ミナミキイロアザミウマ；
配列番号２２又は２３に示される塩基配列：第１の未同定種；
配列番号２４又は２５に示される塩基配列：第２の未同定種；
配列番号２６又は２７に示される塩基配列：チャノキイロアザミウマ；
配列番号２８又は２９に示される塩基配列：ミカンキイロアザミウマ；
配列番号３０又は３１に示される塩基配列：ヒラズハナアザミウマ。
Specifically, this method uses a species-specific protein in the region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of thrips selected from the group consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 31 in the test DNA. The method includes a step of detecting a target base sequence. The presence of the species-specific nucleotide sequences shown below (the nucleotide sequences shown in each sequence number) indicates the species of each thrips:
Base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2: Thrips japonica;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4: Thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6: Quercus thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8: Cosmos thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10: Thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12: Black thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 13: Thrips oleracea;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 15: soybean thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 17: Croton thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 19: Biwahana thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21: southern thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 22 or 23: first unidentified species;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 25: second unidentified species;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 26 or 27: Tea thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 28 or 29: Occidental thrips;
Base sequence shown in SEQ ID NO: 30 or 31: Thrips chinensis.
ここで、第１および第２の未同定種は、分子系統学的には明らかに他種とは異なるが、外見による識別が困難であって、しかもDDBJなどの塩基配列データベースにCO1遺伝子等の塩基配列が登録されていない種である。 Here, the first and second unidentified species are clearly different from other species in terms of molecular phylogeny, but they are difficult to identify based on appearance, and moreover, they do not contain genes such as the CO1 gene in nucleotide sequence databases such as DDBJ. This is a species for which the nucleotide sequence has not been registered.
本方法において、被験DNAは、アザミウマ類のミトコンドリアDNAが含まれるか又は含まれる可能性があるDNAであり、例えば、アザミウマの全体または虫体の一部のほか、アザミウマを捕食したヒメハナカメムシなどの天敵の全体または腹部や腸など等のサンプルから得られる。本方法においては、このようなサンプルから常法によって被験DNAを抽出する工程を含んでもよい。 In this method, the test DNA is DNA that contains or may contain the mitochondrial DNA of thrips, such as the whole thrips or a part of the insect body, as well as the red stink bug that preyed on the thrips. can be obtained from the whole body or from samples of the abdomen, intestines, etc. of natural enemies. This method may include a step of extracting test DNA from such a sample by a conventional method.
また、アザミウマ類のミトコンドリアDNAでは、「16S rDNA」と「CO1」の遺伝子が隣接しているが、一般的な昆虫での両遺伝子の配置はこれとは異なっており、「16S rDNA」と「CO1」の2遺伝子の境界領域は存在しない。すなわち、本発明における種特異的塩基配列は、アザミウマ類以外の「16S rDNA」と「CO1」が隣接しないミトコンドリアDNAをもつ昆虫には存在しない。従って、本発明における種特異的塩基配列に対するプライマーセットを用いたPCR増幅では、このような昆虫のミトコンドリアDNAから増幅産物は得られない。このような特性を利用して、被験DNAとして、アザミウマ類以外の生物のDNA中にアザミウマ類のDNAが混在する可能性があるDNA(例えば、捕食性カメムシ類やテントウムシ類等の昆虫の他、クモ類等の捕食性生物由来の全ゲノム、又はこれら生物の消化管残存物のDNA)を適用することができる。このようなDNAを被験DNAとして用いることで、本方法では、アザミウマ類以外の生物の体内に残存する微量のアザミウマ類のミトコンドリアDNAを検出し、種の識別を行うことができる。 In addition, in the mitochondrial DNA of thrips, the "16S rDNA" and "CO1" genes are adjacent to each other, but the arrangement of both genes in common insects is different from this, and the "16S rDNA" and "CO1" genes are adjacent to each other. There is no boundary region between the two genes of ``CO1''. That is, the species-specific base sequence in the present invention does not exist in insects other than thrips that have mitochondrial DNA in which "16S rDNA" and "CO1" are not adjacent. Therefore, PCR amplification using a primer set for a species-specific base sequence according to the present invention does not yield an amplification product from the mitochondrial DNA of such insects. Taking advantage of these characteristics, test DNA can be selected from DNA of organisms other than thrips that may contain thrips DNA (e.g., insects such as predatory stink bugs and ladybugs, etc.). Entire genomes derived from predatory organisms such as arachnids, or DNA from the gastrointestinal remains of these organisms) can be applied. By using such DNA as test DNA, this method can detect trace amounts of mitochondrial DNA of thrips remaining in the body of organisms other than thrips, and identify the species.
検出工程では、先ず、上述の種特異的塩基配列に対して、当該塩基配列を増幅できるような一対のプライマーを設計し、被験DNAを鋳型として当該一対のプライマーを用いたPCRを行う。 In the detection step, first, a pair of primers that can amplify the above-mentioned species-specific base sequence is designed, and PCR is performed using the pair of primers using the test DNA as a template.
プライマーは、上述の種特異的塩基配列の両末端付近の各々の配列とその両末端の各々から外側方向の配列とを考慮して、常法により設計することができる。 Primers can be designed by a conventional method, taking into consideration the sequences near both ends of the above-mentioned species-specific base sequence and the sequences outward from each end.
第一実施形態において使用される一対のプライマーとしては、例えば、以下の表３及び図２に示す配列番号４９に示される塩基配列から成るプライマー(フォワードプライマーとしての「FCMTF1」)と、それぞれ配列番号５０～５２に示される塩基配列から成るプライマー(それぞれ、リバースプライマーとしての「FCMTR4」、「FCMTR2」又は「FCMTR1」)のうちいずれか1つのプライマーとから成る一対のプライマーが挙げられる。また、配列番号５０～５２に示される塩基配列から成るプライマー(リバースプライマー)に代えて、Ogino et al. (2016)(Ogino T, Uehara T, Muraji M, Yamaguchi T, Ichihashi T, Suzuki T, Kainoh Y, Shimoda M （2016）Violet LED light enhances the recruitment of a thrip predator in open fields. Scientific Reports volume 6, Article number: 32302)に記載のプライマー(5'-CATTATAGCGTAAATTATTCCT-3'(配列番号５３) 又は5'-AACTGTTCATCCTGTTCCTGC-3'(配列番号５４))を使用してもよい。 The pair of primers used in the first embodiment includes, for example, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 shown in Table 3 and FIG. 2 below (“FCMTF1” as a forward primer), and A pair of primers consisting of any one of the primers consisting of the base sequences shown in 50 to 52 (respectively "FCMTR4", "FCMTR2" or "FCMTR1" as a reverse primer) can be mentioned. In addition, instead of the primer (reverse primer) consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 50 to 52, Ogino et al. (2016) (Ogino T, Uehara T, Muraji M, Yamaguchi T, Ichihashi T, Suzuki T, Y, Shimoda M (2016) Violet LED light enhances the recruitment of a trip predator in open fields. Primer (5'-CATTATAGCGTAAATTATTCCT-3' (SEQ ID NO: 53) or 5 described in Scientific Reports volume 6, Article number: 32302) '-AACTGTTCATCCTGTTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 54) may be used.
本方法において、PCRは、例えば増幅産物の長さやGC含量等を考慮し、PCR反応液組成(例えばPCRバッファー、ポリメラーゼ、dNTPミックス、プライマー等を含む)、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。 In this method, PCR takes into account the length of the amplified product, the GC content, etc., the composition of the PCR reaction solution (including, for example, PCR buffer, polymerase, dNTP mix, primers, etc.), the temperature during heat denaturation, annealing, extension reaction, etc. The settings and number of cycles can be appropriately determined and carried out.
PCR増幅後、増幅産物をシークエンシングに供し、増幅産物の塩基配列を決定し、増幅産物の塩基配列を種特異的塩基配列と比較することで、種特異的塩基配列の存在を決定することができる。このようにして、被験DNAが由来するサンプル中に存在するアザミウマ類の種を識別することができる。 After PCR amplification, the presence of a species-specific base sequence can be determined by subjecting the amplification product to sequencing, determining the base sequence of the amplification product, and comparing the base sequence of the amplification product with the species-specific base sequence. can. In this way, the species of thrips present in the sample from which the test DNA is derived can be identified.
第二実施形態において、本方法は、被験DNAを鋳型として、以下の表１に示す第一実施形態における種特異的塩基配列のそれぞれに対して特異的なプライマー(配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つのプライマー；以下、「種特異的プライマー」と称する)と、全種に共通するプライマー(配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマー；以下、「全種共通プライマー」と称する)とから成るプライマーセットを使用して、種特異的塩基配列を増幅する工程と、当該増幅工程で得られる増幅産物を指標に、アザミウマ類の種を識別する工程とを含むものである。 In the second embodiment, this method uses test DNA as a template and uses specific primers (shown in SEQ ID NOs: 33 to 48) for each of the species-specific base sequences in the first embodiment shown in Table 1 below. Any one of the primers consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences (hereinafter referred to as "species-specific primer"), and a primer common to all species (the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32). A step of amplifying a species-specific base sequence using a primer set consisting of a primer set consisting of a primer set consisting of a primer set consisting of a primer set consisting of a and identifying the species.
全種共通プライマー(配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマー；名称「FCMTF2」)は、16S rDNA遺伝子内で全ての種に共通する塩基配列を見出し、当該共通塩基配列に対して設計したものである。 The all-species common primer (primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32; name "FCMTF2") is a nucleotide sequence common to all species found in the 16S rDNA gene, and designed for the common nucleotide sequence. It is.
PCR増幅後、増幅産物を電気泳動に供することで、バンドとして増幅産物の有無を視覚的に観察することができ、被験DNAと反応した種特異的プライマーを特定することで、被験DNAが由来するサンプル中に存在するアザミウマ類の種を識別することができる。 After PCR amplification, by subjecting the amplified product to electrophoresis, the presence or absence of the amplified product can be visually observed as a band, and by identifying the species-specific primer that reacted with the test DNA, it is possible to determine the origin of the test DNA. The thrips species present in the sample can be identified.
具体的には、配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマー(全種共通プライマー)と配列番号３３に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ハナアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号３４に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、コスモスアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号３５に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ビワハナアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号３６に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号３７に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号３８に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ネギアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号３９に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、マメハナアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４０に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、クワアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４１に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４２に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、クサキイロアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４３に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４４に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ヒラズハナアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４５に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、ダイズアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４６に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、クロトンアザミウマを示し、
全種共通プライマーと配列番号４７に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、第１の未同定種を示し、
全種共通プライマーと配列番号４８に示される塩基配列から成るプライマー(種特異的プライマー)とを用いたときの増幅産物の存在が、第２の未同定種を示す。
Specifically, the presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 (common primer for all species) and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 (species-specific primer) shows a thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 (species-specific primer) indicates Cosmos thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 (species-specific primer) indicates Thrips chinensis;
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 (species-specific primer) indicates thrips
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 (species-specific primer) indicates southern thrips;
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38 (species-specific primer) indicates thrips
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 (species-specific primer) indicates Thrips chinensis;
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 (species-specific primer) indicates that it is a plant thrips;
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 (species-specific primer) indicates Tea thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 (species-specific primer) indicates thrips thrips;
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 (species-specific primer) indicates Occidental thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 44 (species-specific primer) indicates Thrips thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 (species-specific primer) indicates soybean thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 (species-specific primer) indicates Croton thrips,
The presence of an amplification product when using a primer common to all species and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 (species-specific primer) indicates a first unidentified species,
The presence of an amplification product when using the all-species common primer and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48 (species-specific primer) indicates the second unidentified species.
上述の16種の種特異的プライマーのうちのいずれか1つと全種共通プライマーとから成るプライマーセットを使用してPCRを実施し、被験DNAが由来するサンプル中に存在するアザミウマ類が、使用した種特異的プライマーに対応する種であるかどうかを判定することができる。また、上述の16種の種特異的プライマーのうちの1つのプライマーと全種共通プライマーとを含む合計16種のプライマーセットを使用して、合計16の個別のPCRを実施し、どのプライマーセットによってDNAが増幅されるかを調べることで、被験DNAが由来するサンプル中に存在するアザミウマ類がいずれの種であるかを判定することができる。 PCR was performed using a primer set consisting of any one of the 16 species-specific primers mentioned above and a primer common to all species, and the thrips present in the sample from which the test DNA was derived was used. It can be determined whether the species corresponds to the species-specific primer. In addition, a total of 16 individual PCRs were performed using a total of 16 primer sets, including one of the 16 species-specific primers mentioned above and a primer common to all species. By examining whether DNA is amplified, it is possible to determine which species of thrips is present in the sample from which the test DNA is derived.
第三実施形態において、本方法は、核酸クロマトグラフィーの一種であるSTH-PAS法を活用したものである。具体的には、被験DNAを鋳型として、第二実施形態で使用する全種共通プライマーと16種の種特異的プライマーのうちいずれか1つ以上のプライマーとを含むプライマーセットを用いて、種特異的塩基配列を増幅するPCRを実施し、増幅産物をSTH-PAS法により検出し、被験DNAが由来するサンプル中に存在するアザミウマ類がいずれの種であるかを識別する。一つのPCR反応に多数のプライマーを投入する方法は一般にマルチプレックスPCRと呼ばれる。当該実施形態の本方法では、被験DNAが、一つのPCR反応中に含まれる種特異的プライマーのうちのいずれと反応したか(すなわち、増幅産物中にどの種特異的プライマーを取り込んだDNAが存在するのか)を調べることで種を判定することができる。 In the third embodiment, the method utilizes the STH-PAS method, which is a type of nucleic acid chromatography. Specifically, using the test DNA as a template, a species-specific Perform PCR to amplify the target nucleotide sequence, detect the amplified product by STH-PAS method, and identify which species of thrips is present in the sample from which the test DNA is derived. A method in which multiple primers are used in one PCR reaction is generally called multiplex PCR. In this method of this embodiment, it is possible to determine which species-specific primers the test DNA has reacted with in one PCR reaction (i.e., which species-specific primers are present in the amplified product). The species can be determined by examining the
STH-PAS法を活用し、メンブレンストリップ(PAS)のいずれの位置にラインが出現するかを見ることで、アザミウマ類のDNAと反応した種特異的プライマーを判定し、これによりアザミウマ類の種を判定する。 Utilizing the STH-PAS method, we can determine which species-specific primers have reacted with the thrips DNA by observing where a line appears on the membrane strip (PAS), and thereby identify the thrips species. judge.
当該実施形態の本方法では、STH-PAS法を適用するために、それぞれの種特異的プライマーの5'末端にそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグ(塩基配列の異なるシングルDNAタグ)を結合させ、検出には当該オリゴヌクレオチドタグと相補的なオリゴヌクレオチドを異なった位置にライン状にプリントしたPASを用いる。一方、種特異的プライマーと同時に使用するリバース側の全種共通プライマーは、5'末端においてビオチンでラベルする(修飾する)。検出時にはアビジンコートラテックス着色ビーズ等試薬を用いることが必要となる。 In this method of this embodiment, in order to apply the STH-PAS method, different oligonucleotide tags (single DNA tags with different base sequences) are attached to the 5' end of each species-specific primer, and for detection, PAS is used in which oligonucleotides complementary to the oligonucleotide tag are printed in lines at different positions. On the other hand, the reverse primer common to all species, which is used simultaneously with the species-specific primer, is labeled (modified) with biotin at its 5' end. During detection, it is necessary to use reagents such as avidin-coated latex colored beads.
STH-PAS法では、濾紙のような性質をもつ棒状のストリップの一端をPCR産物に浸すと、PCR産物中のDNA溶液がストリップの他の一端へ浸透していく過程で、増幅DNAに取り込まれた種特異的プライマーに付加されたシングルDNAタグが、ストラップ上にプリントされたシングルDNAタグと相補的なオリゴヌクレオチドと結合する。シングルDNAタグは種特異的プライマー毎に異なり、それぞれと相補的なオリゴヌクレオチドはストリップ上の異なった位置にプリントされている。どの位置に、シングルDNAタグが付加された種特異的プライマーを取り込んだ増幅DNAが結合するかを見ることで、そのPCR産物にどの種特異的プライマーが含まれるかが判断できる。ストリップに結合したPCR産物の検出には、シングルDNAタグを付加した種特異的プライマーと対向する全種共通プライマーに付加したビオチンに、アビジンコートラテックス着色ビーズを結合させることによって行う。これによりPCR産物はストリップ上の青色ラインとして検出される。 In the STH-PAS method, one end of a rod-shaped strip with properties similar to filter paper is immersed in a PCR product, and as the DNA solution in the PCR product permeates to the other end of the strip, it is incorporated into the amplified DNA. A single DNA tag attached to a species-specific primer binds to an oligonucleotide complementary to the single DNA tag printed on the strap. The single DNA tags are different for each species-specific primer, and the complementary oligonucleotides for each are printed at different positions on the strip. By looking at which position the amplified DNA that incorporates the species-specific primer to which a single DNA tag is attached binds, it is possible to determine which species-specific primer is included in the PCR product. Detection of PCR products bound to the strip is performed by binding avidin-coated latex colored beads to biotin attached to a common all-species primer that is opposed to a species-specific primer attached with a single DNA tag. This allows the PCR product to be detected as a blue line on the strip.
種特異的プライマーへのシングルDNAタグの結合は、株式会社TBAへの依頼により行うことができる。またPASも同じく株式会社TBAから購入することができる。PASには4、8または12種類の相補オリゴヌクレオチドがプリントされた3タイプのものがあり、必要に応じて使い分けることができる。検出用の着色ビーズ試薬等も同様に株式会社TBAから購入することができる。全種共通プライマーのビオチンラベルは、株式会社TBA、その他の企業への依頼により行うことができる。 Binding of a single DNA tag to a species-specific primer can be performed by requesting TBA Co., Ltd. PAS can also be purchased from TBA Co., Ltd. There are three types of PAS with 4, 8, or 12 types of complementary oligonucleotides printed on them, which can be used depending on your needs. Colored bead reagents for detection can also be purchased from TBA Co., Ltd. Biotin labeling of primers common to all species can be done by requesting TBA Co., Ltd. or other companies.
以下の表２では、プライマーの組み合わせの例示として、セット1とセット2の2セットを示す。必要によりこれ以外のプライマーの組み合わせを使用することも可能であり、またプライマーに付加するシングルDNAタグの種類も変更できる。 Table 2 below shows two sets, set 1 and set 2, as examples of primer combinations. It is also possible to use other combinations of primers if necessary, and the type of single DNA tag added to the primers can also be changed.
一方、アザミウマ類は極めて微小な昆虫であるため、抽出可能なDNA量が十分ではなくPCRによって増幅産物が得られない場合がある。特に、微小な幼虫や乾燥状態で時間経過しDNAが劣化したアザミウマ標本等でこの傾向が顕著である。 On the other hand, since thrips are extremely small insects, the amount of DNA that can be extracted may not be sufficient and an amplification product may not be obtained by PCR. This tendency is particularly noticeable in microscopic larvae and thrips specimens whose DNA has deteriorated over time in dry conditions.
このようなサンプルを用いた種の識別では、ネステッドPCRによって識別感度を向上させることができる。 When identifying species using such samples, nested PCR can improve identification sensitivity.
具体的には、全種共通プライマーと種特異的プライマーとがアニーリングする位置の外側の領域に対応するプライマーセットを用いて、サンプル中のDNAをPCRに供し、得られた増幅産物を被験DNAとして使用する。当該ネステッドPCRに使用されるプライマーセットは、種特異的塩基配列に対して全種共通プライマーと種特異的プライマーとがアニーリングする位置の外側の領域に対応し、当該外側の領域にアニーリングするように設計される。当該ネステッドPCRに使用されるプライマーは、これらプライマーのアニーリング位置が、種特異的塩基配列に対して全種共通プライマーと種特異的プライマーのアニーニング位置の外側にある限り、全種共通プライマー又は種特異的プライマーと一部重複していてもよい。 Specifically, the DNA in the sample is subjected to PCR using a primer set that corresponds to the region outside the position where the all-species common primer and the species-specific primer anneal, and the resulting amplification product is used as the test DNA. use. The primer set used for the nested PCR corresponds to the region outside the position where the common primer for all species and the species-specific primer anneal to the species-specific base sequence, and is designed to anneal to the region outside the region. Designed. The primers used in the nested PCR can be either the all-species common primer or the species-specific primer, as long as the annealing positions of these primers are outside the annealing positions of the all-species common primer and the species-specific primer with respect to the species-specific base sequence. It may partially overlap with the specific primer.
当該ネステッドPCRに使用されるプライマーセットとしては、例えば、以下の表３及び図２に示す配列番号４９に示される塩基配列から成るプライマー(フォワードプライマーとしての「FCMTF1」)と、それぞれ配列番号５０～５２に示される塩基配列から成るプライマー(それぞれ、リバースプライマーとしての「FCMTR4」、「FCMTR2」又は「FCMTR1」)のうちいずれか1つのプライマーとから成る一対のプライマーが挙げられる。また、配列番号５０～５２に示される塩基配列から成るプライマー(リバースプライマー)に代えて、Ogino et al. (2016)(Ogino T, Uehara T, Muraji M, Yamaguchi T, Ichihashi T, Suzuki T, Kainoh Y, Shimoda M （2016） Violet LED light enhances the recruitment of a thrip predator in open fields. Scientific Reports volume 6, Article number: 32302)に記載のプライマー(5'-CATTATAGCGTAAATTATTCCT-3'(配列番号５３)又は5'-AACTGTTCATCCTGTTCCTGC-3'(配列番号５４))を使用してもよい。さらに、当該ネステッドPCRに使用されるプライマーセットは、配列番号４９に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号５０～５４に示される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか2つのプライマーとから成るプライマーセットであってもよい。 The primer set used in the nested PCR includes, for example, a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 49 shown in Table 3 and FIG. 52 (respectively "FCMTR4," "FCMTR2," or "FCMTR1" as a reverse primer). In addition, instead of the primer (reverse primer) consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 50 to 52, Ogino et al. (2016) (Ogino T, Uehara T, Muraji M, Yamaguchi T, Ichihashi T, Suzuki T, Y, Shimoda M (2016) Violet LED light enhances the recruitment of a trip predator in open fields. Primer (5'-CATTATAGCGTAAATTATTCCT-3' (SEQ ID NO: 53) or 5 described in Scientific Reports volume 6, Article number: 32302) '-AACTGTTCATCCTGTTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 54) may be used. Furthermore, the primer set used in the nested PCR is a primer consisting of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 and a primer consisting of any two primers consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 50 to 54. It may be a set.
このように、ネステッドPCRを行い、種識別に用いるDNA領域(種特異的塩基配列)とその外側を含む長いDNAを増幅し、その増幅産物を被験DNAとして本方法に適用することで、大幅にPCRの増幅感度と種識別の精度を向上させることができる。 In this way, by performing nested PCR to amplify a long DNA including the DNA region used for species identification (species-specific base sequence) and the outside thereof, and applying the amplified product to this method as test DNA, it is possible to significantly improve The amplification sensitivity of PCR and the accuracy of species identification can be improved.
また、本発明は、本方法を実施するために用いるプライマーセット、及び当該プライマーセットを含むキットに関する。 The present invention also relates to a primer set used to carry out the present method, and a kit containing the primer set.
プライマーセットとしては、例えば上述した全種共通プライマー(配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマー)及び種特異的プライマー(配列番号３３～４８に示される塩基配列から成る群より選択される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つのプライマー)を含むプライマーセット；当該全種共通プライマー及び種特異的プライマーに加えて、種特異的塩基配列に対して全種共通プライマーと種特異的プライマーとがアニーリングする位置の外側の領域に対応する、ネステッドPCR用のプライマーセット(例えば、配列番号４９に示される塩基配列から成るプライマーと、配列番号５０～５４に示される塩基配列から成るプライマーのうちいずれか1つ又は2つのプライマー)を含むプライマーセットが挙げられる。また、STH-PAS法用に、それぞれの種特異的プライマーの5'末端にそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグ(塩基配列の異なるシングルDNAタグ)を結合させ、一方、全種共通プライマーは、5'末端においてビオチンでラベルすることができる。 As a primer set, for example, the above-mentioned all-species common primer (primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32) and species-specific primer (base sequence selected from the group consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 33 to 48) A primer set containing any one of the primers consisting of the following primers; in addition to the all-species common primer and the species-specific primer, the all-species common primer and the species-specific primer are annealed to the species-specific base sequence. A primer set for nested PCR corresponding to the region outside the position of (or two primers). In addition, for the STH-PAS method, different oligonucleotide tags (single DNA tags with different base sequences) are attached to the 5' end of each species-specific primer, while the common primer for all species is attached at the 5' end. Can be labeled with biotin.
キットでは、上記のプライマーセット（ネステッドPCR用のプライマーセットを含む）を、一般的な減圧遠心濃縮乾燥機等（例えば株式会社トミー精工の遠心濃縮機（遠心エバポレーター）など）を用いてPCR用のサンプリングチューブの底面に乾燥固定させた状態で一定期間保存することができる。１回ごとのPCR反応に必要とされる量のプライマーを個々のPCRチューブ底面に乾燥固定することができる。 The kit uses the above primer set (including the nested PCR primer set) for PCR using a general vacuum centrifugal concentration dryer (for example, Tomy Seiko's centrifugal concentrator (centrifugal evaporator), etc.). It can be stored for a certain period of time by drying and fixing it on the bottom of the sampling tube. The amount of primer required for each PCR reaction can be dry-fixed to the bottom of each PCR tube.
また、キットは、プライマーセットに加えて、本方法を行うための試薬を含むことができる。当該試薬としては、例えばサンプルから被験DNAを抽出するための試薬(界面活性剤等)、PCRのための反応液組成成分(PCRバッファー、ポリメラーゼ、dNTPミックス等)、電気泳動用のゲル成分(アクリルアミド等)、バッファー(TAEバッファー等)等が挙げられる。さらに、キットは、STH-PAS法を行うための試薬を含むことができ、このような試薬としては、例えばそれぞれの種特異的プライマーの5'末端に結合させたそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグ(塩基配列の異なるシングルDNAタグ)と相補的なオリゴヌクレオチドを異なった位置にライン状にプリントしたメンブレンストリップ(PAS)、アビジンコートラテックス着色ビーズ等が挙げられる。 In addition to the primer set, the kit can also include reagents for carrying out the method. Examples of such reagents include reagents for extracting test DNA from samples (surfactants, etc.), reaction solution components for PCR (PCR buffer, polymerase, dNTP mix, etc.), and gel components for electrophoresis (acrylamide, etc.). etc.), buffers (TAE buffer, etc.), and the like. Furthermore, the kit can include reagents for performing the STH-PAS method, such as, for example, different oligonucleotide tags (base sequence Examples include membrane strips (PAS) in which complementary oligonucleotides are printed in lines at different positions (different single DNA tags), avidin-coated latex colored beads, etc.
また、キットは、取扱い説明書、アザミウマ類の種の識別のための説明書(例えば、核酸増幅により得られる増幅産物の塩基配列情報を記載した塩基配列表)等を含むことができる。 Further, the kit can include an instruction manual, an instruction manual for identifying the species of thrips (for example, a nucleotide sequence list containing nucleotide sequence information of an amplification product obtained by nucleic acid amplification), and the like.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be explained in more detail using Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these Examples.
１．昆虫DNAの精製
鋳型DNAを抽出する昆虫としては、各種アザミウマ類の成虫や幼虫の生体やエタノールなどを用いた液浸標本、アザミウマ類の乾燥した死体であって乾燥後著しく長期間を経ていないものなどを使用することができる。また捕食等によって体内にアザミウマ類の組織またはDNAを保有する可能性がある捕食性カメムシ類（コヒメハナカメムシ、ナミヒメハナカメムシ、タイリクヒメハナカメムシ他のヒメハナカメムシ類など）、テントウムシ類（ナナホシテントウムシなど、）クモ類（主にカニグモ科など）なども使用できる。この場合も全虫体またはその一部の生体や液浸標本、乾燥後著しく長期間を経ていない乾燥標本などを用いることができる。
1. Purification of Insect DNA Insects from which template DNA can be extracted include live specimens of adult and larval thrips, specimens immersed in ethanol, etc., and dried carcasses of thrips that have not been dried for an extremely long time. etc. can be used. In addition, predatory stink bugs that may carry tissue or DNA of thrips in their bodies due to predation (e.g., the common stink bug, the common stink bug, the common stink bug, the common stink bug, and other stink bugs), and the ladybugs (the stink bugs Ladybugs, etc.) and arachnids (mainly members of the family Crabidae) can also be used. In this case as well, it is possible to use a whole insect or a part thereof, a living specimen, a liquid immersion specimen, a dried specimen that has not been dried for an extremely long period of time, and the like.
鋳型となる昆虫DNAの抽出には様々な方法を適用することができる。例えばQIAGEN社のDNeasy Blood & Tissue Kitなどシリカベースのカラムを用いた純度の高いDNA精製法が最も望ましいが、Promega社のNuclei Lysis SolutionやProtein Precipitation Solutionを用いた簡略なDNA抽出法、さらにはBiocosm Inc.のCellEase(登録商標) TissueIIを用いたごく簡略なDNA精製法も適用可能である。また昆虫試料が新鮮であれば、昆虫体を滅菌蒸留水等ですり潰した液をそのままPCRに用いることもできるが長期保存することはできない。 Various methods can be applied to extract the insect DNA that serves as the template. For example, a highly pure DNA purification method using a silica-based column such as QIAGEN's DNeasy Blood & Tissue Kit is most desirable, but a simple DNA extraction method using Promega's Nuclei Lysis Solution or Protein Precipitation Solution, or even Biocosm A very simple DNA purification method using CellEase® Tissue II from Inc. is also applicable. Furthermore, if the insect sample is fresh, a solution obtained by grinding the insect body with sterile distilled water or the like can be used as is for PCR, but it cannot be stored for a long period of time.
２．一般的なPCR
第一実施形態における塩基配列の解析や第二実施形態における増幅産物の解析、ネステッドPCRにおける初回PCRなどで実施する一般的なPCRでは、TaKaRa BioのTks GflexTM DNA Polymeraseなどの一般的なPCR酵素と通常合計2プライマーからなるプライマーセットを用いてDNA増幅を行う。この酵素を用いる場合は、PCR反応液は総量20μlとし、反応ごとに以下のものを含むものとする：
Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 units/μl）を0.4μl、
2× Gflex PCR Buffer（Mg2+, dNTP plus）を10μl、
鋳型DNAを1.0μl、
ひとつ目のプライマー（0.5pmole/μl）を1.0μl（終濃度0.2-0.5μM程度）、
ふたつ目のプライマー（0.5pmole/μl）を1.0μl（終濃度0.2-0.5μM程度）、
滅菌蒸留水を6.6μl。
ただし使用するPCR酵素によっては酵素量やBuffer量が異なる場合がある。
2. General PCR
In general PCR performed in base sequence analysis in the first embodiment, amplification product analysis in the second embodiment, initial PCR in nested PCR, general PCR enzymes such as TaKaRa Bio's Tks Gflex TM DNA Polymerase are used. DNA amplification is usually performed using a primer set consisting of a total of two primers. When using this enzyme, PCR reactions should have a total volume of 20 μl and each reaction should contain:
0.4 μl of Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 units/μl),
10 μl of 2× Gflex PCR Buffer (Mg2+, dNTP plus),
1.0 μl of template DNA,
1.0μl of the first primer (0.5pmole/μl) (final concentration around 0.2-0.5μM),
1.0μl of the second primer (0.5pmole/μl) (final concentration around 0.2-0.5μM),
6.6 μl of sterile distilled water.
However, the amount of enzyme and buffer may vary depending on the PCR enzyme used.
またPCRによる増幅反応は、TaKaRa BioのTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(登録商標) Touchなどの一般的なPCR装置を使用し、反応は94℃１分の初期変性のあと、変性98℃-10秒、アニーリング50℃-15秒、伸張68℃-30秒からなるサイクルを35回から40回繰り返すことによっておこなう。なおアニーリング温度は、プライマーのTm値にあわせて設定する。 In addition, PCR amplification reaction uses a general PCR device such as TaKaRa Bio's TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (registered trademark) Touch. After initial denaturation at 94℃ for 1 minute, denaturation at 98℃ for 10 seconds, followed by denaturation at 98℃ for 10 seconds. This is done by repeating a cycle consisting of annealing at 50°C for 15 seconds and elongation at 68°C for 30 seconds 35 to 40 times. Note that the annealing temperature is set according to the Tm value of the primer.
３．STH-PAS解析を行う場合のPCR
第三実施形態における増幅産物の解析では、それぞれに異なるオリゴヌクレオチドタグを結合させた16種の種特異的プライマーのうちの１つ以上のプライマーとビオチンラベルされた全種共通プライマーを用いてPCRを実施する。PCR酵素としてはTaKaRa BioのMultiplex PCR Assay Kit Ver.2などの多数のプライマーを同時使用するマルチプレックスPCR用に最適化されたPCR酵素を用いることが望ましいが、より一般的なTaKaRa BioのTks GflexTM DNA Polymeraseなども使用できる。この酵素を用いる場合は、PCR反応液は総量20μlとし、反応ごとに以下のものを含むものとする：
Tks Gflex DNA Polymeraseを0.5μl、
2× Gflex PCR Buffer（Mg2+, dNTP plus）を10.0μl、
鋳型DNAを1.0μl、
ビオチンラベル全種共通プライマー（10pmole/μl）を0.5μl、
オリゴヌクレオチドタグ結合種特異的プライマー（10pmole/μl）を各0.5μl、
滅菌蒸留水を必要量。
3. PCR when performing STH-PAS analysis
In the analysis of the amplified products in the third embodiment, PCR is performed using one or more of 16 species-specific primers, each of which has a different oligonucleotide tag attached to it, and a biotin-labeled primer common to all species. implement. It is preferable to use a PCR enzyme optimized for multiplex PCR that uses many primers simultaneously, such as TaKaRa Bio's Multiplex PCR Assay Kit Ver.2, but the more general TaKaRa Bio's Tks Gflex TM DNA Polymerase etc. can also be used. When using this enzyme, PCR reactions should have a total volume of 20 μl and each reaction should contain:
0.5 μl of Tks Gflex DNA Polymerase,
10.0 μl of 2× Gflex PCR Buffer (Mg2+, dNTP plus),
1.0 μl of template DNA,
0.5 μl of biotin-labeled common primer for all species (10 pmole/μl),
0.5 μl each of oligonucleotide tag-bound species-specific primers (10 pmole/μl),
Required amount of sterile distilled water.
滅菌蒸留水の量はPCR反応に使用する種特異的プライマーの数に合わせて反応総量が20μlとなるように調整する。なおオリゴヌクレオチドタグ結合種特異的プライマーの量は反応当たり0.1μl～0.5μlの間で調整することにより、検出結果が改善されることがある。 Adjust the amount of sterile distilled water according to the number of species-specific primers used in the PCR reaction so that the total reaction volume is 20 μl. Note that detection results may be improved by adjusting the amount of oligonucleotide tag-bound species-specific primer between 0.1 μl and 0.5 μl per reaction.
PCRによる増幅反応は、TaKaRa BioのTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(登録商標) Touchなどの一般的なPCR装置を使用し、反応は95℃-240秒の初期変性のあと、変性98℃-10秒、アニーリング54℃-5秒、伸張68℃-5秒からなるサイクルを35回から40回繰り返すことによっておこなう。なおアニーリング温度は、反応結果により適宜調整する。 The PCR amplification reaction uses a general PCR device such as TaKaRa Bio's TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (registered trademark) Touch. After initial denaturation at 95℃ for 240 seconds, denaturation at 98℃ for 10 seconds, This is done by repeating a cycle of annealing at 54°C for 5 seconds and elongation at 68°C for 5 seconds 35 to 40 times. Note that the annealing temperature is adjusted as appropriate depending on the reaction results.
ネステッドPCRによってSTH-PAS解析をおこなう場合は、一般的なPCR法による初回PCRで得られたPCR産物をそのまままたは必要により滅菌蒸留水で数十倍程度に希釈したものを鋳型DNAとして使用する。この場合のPCRによる増幅反応は、初回のPCRを20サイクル、第三実施形態によるPCRを20サイクルなどとする。 When performing STH-PAS analysis by nested PCR, use the PCR product obtained in the first PCR using a general PCR method as template DNA, either as it is or diluted several tens of times with sterile distilled water if necessary. In this case, the PCR amplification reaction includes 20 cycles of the first PCR, 20 cycles of PCR according to the third embodiment, and so on.
４．第一実施形態における塩基配列の解析
第一実施形態における塩基配列の解析では被験DNAを用いたPCRには様々なプライマーを使用することができるが、ここではFCMTF1(配列番号４９)およびFCMTR2(配列番号５１)(表３及び図２)を用いて前述の一般的なPCRをおこなった。得られたPCR産物はTAE緩衝液を用いた低融点アガロースゲル（1%）電気泳動によってDNAバンドとして分離し、エタノール沈殿等により精製したのち、上記2プライマーのうちの1プライマーとApplied Biosystems社のBigDye(登録商標) Terminator v1.1 Cycle Sequencing KitまたはBigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitでラベルしたうえでDNA塩基配列を調べた。
4. Base sequence analysis in the first embodiment In the base sequence analysis in the first embodiment, various primers can be used for PCR using test DNA, but here, FCMTF1 (SEQ ID NO: 49) and FCMTR2 (SEQ ID NO: 49) and No. 51) (Table 3 and FIG. 2) was used to perform the general PCR described above. The obtained PCR product was separated as a DNA band by low melting point agarose gel (1%) electrophoresis using TAE buffer, purified by ethanol precipitation, etc., and then combined with one of the above two primers and Applied Biosystems' The DNA base sequences were examined after labeling with BigDye (registered trademark) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit or BigDye (registered trademark) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.
このようにして第一実施形態による解析で得られた塩基配列のクラスタリングを図３に示す。 FIG. 3 shows the clustering of base sequences obtained in the analysis according to the first embodiment.
５．第二実施形態における増幅産物の解析
第二実施形態では、16種の種特異的プライマーのうちの1プライマーと全種共通プライマーの合計2プライマーを用いて一般的なPCRによりDNAを増幅し、TAE緩衝液を用いたアガロースゲル（1-2%）電気泳動によって増幅産物の有無を確認した。また必要により前記の第一実施形態による塩基配列の解析と同様にして増幅産物の塩基配列を調べた。この場合のPCR産物のラベルには全種共通プライマーを使用した。
5. Analysis of amplification products in the second embodiment In the second embodiment, DNA is amplified by general PCR using a total of two primers, one of 16 species-specific primers and a primer common to all species, and TAE The presence or absence of amplification products was confirmed by agarose gel (1-2%) electrophoresis using a buffer solution. Furthermore, if necessary, the base sequence of the amplified product was examined in the same manner as the base sequence analysis according to the first embodiment. In this case, primers common to all species were used to label the PCR products.
６．第三実施形態における増幅産物の解析
ビオチンラベルされた全種共通プライマーと異なるオリゴヌクレオチドタグを結合させた16種の種特異的プライマーのうちの１つ以上のプライマーとを用いたPCR産物の解析では、STH-PAS技術を用いてPCR産物の有無と増幅DNAに付加されたオリゴヌクレオチドタグの種類を調べることで被験DNAのもととなった試料に含まれるアザミウマの種を判別する。
6. Analysis of amplified products in the third embodiment In the analysis of PCR products using a biotin-labeled all-species common primer and one or more primers out of 16 species-specific primers bound to different oligonucleotide tags, Using STH-PAS technology, we determine the thrips species contained in the sample that is the source of the test DNA by examining the presence of PCR products and the type of oligonucleotide tag added to the amplified DNA.
ここでは表２に示す8つの種特異的プライマーからなる2組のプライマーセットを作製しテストした。それぞれのプライマーには「F-1」から「F-8」までの8種類の異なるオリゴヌクレオチドタグ(株式会社TBA製)のうち1タグが結合されている。実際のPCRでは各プライマーセットにビオチンラベルされた全種共通プライマー(FCMTF2：配列番号３２)を加えたそれぞれ9プライマーを用いてマルチプレックスPCR反応を実施した。ここではそれぞれ8種のアザミウマを識別するための2プライマーセットについて検討したが、ここに示した以外の組み合わせからなるプライマーセットを作製することも可能である。その際は同じプライマーセットの中に同じオリゴヌクレオチドタグが結合されたプライマーが含まれないようにする必要がある。また重要性の高い少数のアザミウマ種だけを対象とするプライマーセットやより多数の種を対象とするプライマーセットを作製することも可能である。 Here, two primer sets consisting of the eight species-specific primers shown in Table 2 were prepared and tested. One tag out of eight different oligonucleotide tags (manufactured by TBA Co., Ltd.) from "F-1" to "F-8" is bound to each primer. In the actual PCR, a multiplex PCR reaction was carried out using 9 primers each including a biotin-labeled all-species common primer (FCMTF2: SEQ ID NO: 32) added to each primer set. Here, we considered two primer sets for identifying eight types of thrips, but it is also possible to create primer sets consisting of combinations other than those shown here. In this case, it is necessary to ensure that primers to which the same oligonucleotide tag is bound are not included in the same primer set. It is also possible to create primer sets that target only a small number of highly important thrips species or primer sets that target a larger number of species.
なお、株式会社TBAではPCR産物の判別をおこなうためのC-PAS（メンブレンストリップ）としては、4産物識別用、8産物識別用、12産物識別用の3種類のものを提供しており、必要に応じて使い分けできる。 In addition, TBA Co., Ltd. provides three types of C-PAS (membrane strips) for differentiating PCR products: one for 4-product identification, one for 8-product identification, and one for 12-product identification. It can be used depending on the situation.
被験DNAと前記プライマーセットのうちのプライマーセット1を用いたマルチプレックスPCR産物について、STH-PAS技術を用いた解析を行った。被験DNAが由来するサンプルは、採集等によって入手した成虫であって、形態観察やミトコンドリアDNAの塩基配列などにより種同定したものであった。 Multiplex PCR products using the test DNA and primer set 1 of the primer sets described above were analyzed using STH-PAS technology. The sample from which the test DNA was derived was an adult insect obtained through collection, etc., and the species was identified by morphological observation and mitochondrial DNA nucleotide sequence.
まずPCR産物に展開液10μlとラテックス液1μlを加えピペッティングにより撹拌したのち、メンブレンストリップの下端をPCRチューブ内の上記混合液に浸した。この混合液はメンブレンストリップの上部へ浸透する過程で、ストリップ上の特定部分に青い一本のラインを形成した。メンブレンストリップ上の8か所の位置には、「F-1」から「F-8」までの8種類の異なるオリゴヌクレオチドタグと結合する8種類の相補的なオリゴヌクレオチドが印刷されており、PCR増幅DNAに含まれるオリゴヌクレオチドタグはそれらの相補的なオリゴヌクレオチドのいずれか1つと結合する。この結合位置はPCR増幅DNAに取り込まれた全種共通プライマーに修飾されたビオチンとアビジンコートラテックス着色ビーズが結合することで肉眼により青いラインとして確認することができる。すなわちストリップのどの位置にラインが出るかを見ることでPCR増幅DNA中に取り込まれたオリゴヌクレオチドタグの種類を見分けることができ、これによってそれぞれのタグに対応するアザミウマの種類を判定することができる。 First, 10 μl of developing solution and 1 μl of latex solution were added to the PCR product and stirred by pipetting, and then the lower end of the membrane strip was immersed in the above mixed solution in the PCR tube. As this liquid mixture permeated to the top of the membrane strip, a single blue line was formed in a specific area on the strip. The eight positions on the membrane strip are printed with eight complementary oligonucleotides that bind to eight different oligonucleotide tags from "F-1" to "F-8" and are used for PCR. The oligonucleotide tag contained in the amplified DNA binds to any one of these complementary oligonucleotides. This binding position can be confirmed with the naked eye as a blue line when the modified biotin and avidin-coated latex colored beads bind to the all-species common primer incorporated into the PCR-amplified DNA. In other words, by looking at where the line appears on the strip, it is possible to identify the type of oligonucleotide tag incorporated into the PCR-amplified DNA, and from this it is possible to determine the type of thrips that corresponds to each tag. .
このようにして得られた、STP-PAS技術による8種のアザミウマの識別結果を図４に示す。 Figure 4 shows the identification results of eight species of thrips obtained using the STP-PAS technology.
アザミウマ類の幼虫等はきわめて微小なため入手できる個体当たりのDNA量が少なく、実験操作によっては十分な量の被験DNAが得られないことがある。また乾燥したアザミウマ標本からも十分なDNAが得られない場合がある。さらにヒメハナカメムシ類などの捕食性昆虫の体内では捕食されたアザミウマ類の細胞やDNAは急速に消化される。これらのDNAを被験DNAとするSTH-PAS解析による種の同定をおこなう場合には、あらかじめ一般的PCRによって多型的DNA領域とその周辺域を含むDNAを増幅しておき、これを鋳型DNAとする第三実施形態による増幅DNAの解析が望まれる。この場合の初回PCRにはFCMTF1(配列番号４９)とFCMTR2(配列番号５１)を含むプライマーセットやFCMTF1と配列番号５３を含むプライマーを含むプライマーセットなどを使用するが、これまでの経験からはFCMTF1のほかにFCMTR2と配列番号５３を含むプライマーの合計3プライマーを用いることでより好適な結果が得られることが分かっている。3プライマーを用いる場合のPCR反応の組成は、総量20μlとし、TaKaRa BioのTks GflexTM DNA Polymeraseを用いる場合は反応ごとに以下のものを含むものとする：
Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 units/μl）を0.4μl、
2× Gflex PCR Buffer（Mg2+, dNTP plus）を10μl、
鋳型DNAを1.0μl、
FCMTF1プライマー（0.5pmole/μl）を1.0μl（終濃度0.2-0.5μM程度）、
FCMTR2プライマー（0.5pmole/μl）を1.0μl（終濃度0.2-0.5μM程度）、
配列番号５３を含むプライマー（0.5pmole/μl）を1.0μl（終濃度0.2-0.5μM程度）、
滅菌蒸留水を5.6μl。
Thrips larvae are extremely small, so the amount of DNA available per individual is small, and depending on the experimental procedure, it may not be possible to obtain a sufficient amount of test DNA. In addition, sufficient DNA may not be obtained from dried thrips specimens. In addition, the cells and DNA of thrips are rapidly digested in the bodies of predatory insects such as stink bugs. When identifying species by STH-PAS analysis using these DNAs as test DNA, first amplify the DNA containing the polymorphic DNA region and its surrounding region by general PCR, and use this as template DNA. Analysis of amplified DNA according to the third embodiment is desired. In this case, for the first PCR, a primer set containing FCMTF1 (SEQ ID NO: 49) and FCMTR2 (SEQ ID NO: 51) or a primer set containing FCMTF1 and a primer containing SEQ ID NO: 53 is used. It has been found that more suitable results can be obtained by using a total of three primers, including primers containing FCMTR2 and SEQ ID NO: 53 in addition to FCMTR2. The composition of the PCR reaction when using 3 primers is a total volume of 20 μl, and when using TaKaRa Bio's Tks Gflex TM DNA Polymerase, each reaction should contain:
0.4 μl of Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 units/μl),
10 μl of 2× Gflex PCR Buffer (Mg2+, dNTP plus),
1.0 μl of template DNA,
1.0μl of FCMTF1 primer (0.5pmole/μl) (final concentration approximately 0.2-0.5μM),
1.0 μl of FCMTR2 primer (0.5 pmole/μl) (final concentration approximately 0.2-0.5 μM),
1.0 μl of primer (0.5 pmole/μl) containing SEQ ID NO: 53 (final concentration approximately 0.2-0.5 μM),
5.6 μl of sterile distilled water.
図４に示すアザミウマの識別では、このようにして得られたPCR産物を10から20倍程度に希釈し、ビオチンラベルされた全種共通プライマーとオリゴヌクレオチドタグを結合させた種特異的プライマーを用いたマルチプレックスPCRに使用した。 In the thrips identification shown in Figure 4, the PCR product obtained in this way was diluted approximately 10 to 20 times, and a biotin-labeled common primer for all species and a species-specific primer conjugated with an oligonucleotide tag were used. used for multiplex PCR.
Claims (12)
配列番号１又は２に示される塩基配列の存在が、マメハナアザミウマを示し、
配列番号３又は４に示される塩基配列の存在が、ネギアザミウマを示し、
配列番号５又は６に示される塩基配列の存在が、クワアザミウマを示し、
配列番号７又は８に示される塩基配列の存在が、コスモスアザミウマを示し、
配列番号９又は１０に示される塩基配列の存在が、ハナアザミウマを示し、
配列番号１１又は１２に示される塩基配列の存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
配列番号１３に示される塩基配列の存在が、クサキイロアザミウマを示し、
配列番号１４又は１５に示される塩基配列の存在が、ダイズアザミウマを示し、
配列番号１６又は１７に示される塩基配列の存在が、クロトンアザミウマを示し、
配列番号１８又は１９に示される塩基配列の存在が、ビワハナアザミウマを示し、
配列番号２０又は２１に示される塩基配列の存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
配列番号２２又は２３に示される塩基配列の存在が、第１の未同定種を示し、
配列番号２４又は２５に示される塩基配列の存在が、第２の未同定種を示し、
配列番号２６又は２７に示される塩基配列の存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
配列番号２８又は２９に示される塩基配列の存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
配列番号３０又は３１に示される塩基配列の存在が、ヒラズハナアザミウマを示す、
前記方法。 In the test DNA , the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4, the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6, the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8, SEQ ID NO: The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 15, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 17. , the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 19, the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21, the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 or 23, the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 25, the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 or 27 16S rDNA and cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) on the mitochondrial DNA of thrips of the base sequence shown in , the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 or 29, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 or 31 . A method for identifying a species of thrips, the method comprising the step of detecting a species-specific base sequence in a region between the genes,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 indicates thrips,
The presence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 indicates thrips,
The presence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 indicates a plant thrips;
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8 indicates Cosmos thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10 indicates Hana thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 indicates black thrips,
The presence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 indicates thrips thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 15 indicates soybean thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 17 indicates Croton thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 or 19 indicates Biwahana thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 or 21 indicates southern thrips;
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 or 23 indicates a first unidentified species,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 25 indicates a second unidentified species,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 or 27 indicates Tea thrips,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 or 29 indicates Thrips occidentalis,
The presence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 or 31 indicates thrips
Said method.
前記増幅工程で得られる増幅産物を指標に、アザミウマ類の種を識別する工程と、
を含む、アザミウマ類の種を識別する方法であって、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３３に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３４に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、コスモスアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３５に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ビワハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３６に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３７に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３８に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ネギアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号３９に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、マメハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４０に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クワアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４１に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４２に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クサキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４３に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４４に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ヒラズハナアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４５に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、ダイズアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４６に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、クロトンアザミウマを示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４７に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、第１の未同定種を示し、
配列番号３２に示される塩基配列から成るプライマーと配列番号４８に示される塩基配列から成るプライマーとを用いたときの増幅産物の存在が、第２の未同定種を示す、
前記方法。 Using the test DNA as a template, 16 types of primer sets consisting of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and each primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 33 to 48 were used individually to detect thrips. a step of amplifying the region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of
A step of identifying the species of thrips using the amplification product obtained in the amplification step as an indicator;
A method for identifying a species of thrips, comprising:
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 indicates thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 indicates Cosmos thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 indicates A. thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 indicates thrips
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 indicates southern thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 38 indicates thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 indicates thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40 indicates a plant thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 indicates Tea thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 indicates thrips thrips;
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 indicates Occidentalis thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 44 indicates Thrips thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 indicates soybean thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 indicates Croton thrips,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 indicates a first unidentified species,
The presence of an amplification product when using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48 indicates a second unidentified species.
Said method.
前記増幅工程で得られる増幅産物をSTH-PAS法に供し、アザミウマ類の種を識別する工程と、
を含む、アザミウマ類の種を識別する方法であって、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３３に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３３に示すDNAの存在が、ハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３４に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３４に示すDNAの存在が、コスモスアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３５に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３５に示すDNAの存在が、ビワハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３６に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３６に示すDNAの存在が、クロゲハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３７に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３７に示すDNAの存在が、ミナミキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３８に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３８に示すDNAの存在が、ネギアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号３９に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号３９に示すDNAの存在が、マメハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４０に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４０に示すDNAの存在が、クワアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４１に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４１に示すDNAの存在が、チャノキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４２に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４２に示すDNAの存在が、クサキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４３に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４３に示すDNAの存在が、ミカンキイロアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４４に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４４に示すDNAの存在が、ヒラズハナアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４５に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４５に示すDNAの存在が、ダイズアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４６に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４６に示すDNAの存在が、クロトンアザミウマを示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４７に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４７に示すDNAの存在が、第１の未同定種を示し、
5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーとして、配列番号４８に示される塩基配列から成るものを含む1つ以上のプライマーを用いたときの増幅産物中における配列番号４８に示すDNAの存在が、第２の未同定種を示す、
前記方法。 Using the test DNA as a template , 16 types of primers were prepared, including a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 with the 5' end modified with biotin, and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 to 48 with an oligonucleotide tag at the 5' end. A step of amplifying a region between the 16S rDNA and the CO1 gene on the mitochondrial DNA of a thrips using individually one or more primer sets comprising one or more combinations of the respective primers , The one or more primer set includes a total of 16 types of primers, and the primers included in the primer set each have a different oligonucleotide tag at the 5' end. The step ;
A step of subjecting the amplification product obtained in the amplification step to the STH-PAS method to identify the thrips species;
A method for identifying a species of thrips, comprising:
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 33 in the amplified product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 34 in the amplified product indicates that Cosmos shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 35 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end Shows a thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 36 in the amplified product indicates that Shows a thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 37 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end showing yellow thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 38 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 38 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 39 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end Shows a thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 40 in the amplified product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 41 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end Shows white thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 42 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end showing yellow thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 43 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end showing yellow thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 44 in the amplified product indicates that shows,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 45 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end shows thrips,
When one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 are used as primers having an oligonucleotide tag at the 5' end, the presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 46 in the amplified product indicates that croton shows thrips,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 47 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end 1 unidentified species,
The presence of the DNA shown in SEQ ID NO: 48 in the amplification product when one or more primers containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 48 is used as a primer having an oligonucleotide tag at the 5' end. Indicating 2 unidentified species,
Said method.
前記1以上のプライマーセットは、合わせて16種の前記プライマーを含み、且つ、
前記プライマーセットに含まれる5'末端にオリゴヌクレオチドタグを有するプライマーは、5'末端にそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグを有する、
前記1以上のプライマーセットである、請求項７記載のプライマーセット。 One of the 16 types of primers consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 with a biotinylated 5' end and the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 to 48 with an oligonucleotide tag at the 5' end. one or more primer sets comprising one or more combinations,
The one or more primer set includes a total of 16 types of primers, and
The primers each having an oligonucleotide tag at the 5' end included in the primer set have different oligonucleotide tags at the 5' end,
The primer set according to claim 7, which is the one or more primer set.
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