JP2015231362A - Bacterial flora analysis method and bacterial flora analysis device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、菌叢解析用デバイス及びそれを用いた菌叢の解析方法に関する。 The present invention relates to a device for analyzing a flora and a method for analyzing a flora using the device.
サンプル中に含まれる細菌の菌種の同定や定量結果は、環境や動植物の健康状態等を評価する指標として有用であり、感染症診断を含めて今日さまざまな応用例がある。
このような評価方法としては、実際に顕微鏡などでサンプル中に含まれる細菌を個々に観察し、形態等から細菌の菌種を同定し、各々の細菌について直接的に数を数える方法が挙げられる。場合によっては、選択培地等を用いて細菌をスクリーニングすることで同定効率を向上させることもある。
The identification and quantification results of the bacterial species contained in the sample are useful as an index for evaluating the environment, the health condition of animals and plants, etc., and there are various applications today including diagnosis of infectious diseases.
Examples of such an evaluation method include a method in which the bacteria contained in the sample are actually observed with a microscope or the like, the bacterial species is identified from the morphology, and the number is directly counted for each bacteria. . In some cases, identification efficiency may be improved by screening bacteria using a selective medium or the like.
また、細菌の合成するタンパク質を当該タンパク質に特異的な抗体を利用して検出する方法や、代謝産物を質量分析機器にて検出する方法がある。
最も迅速性に優れ、汎用的に使われている技術は、ＰＣＲやＬＡＭＰ法といった分子生物学的な核酸増幅技術や、インベーダー法等のシグナル増幅技術である。これらの手法により、検出対象細菌がもつ特異的な配列の核酸を選択的増幅し検出する方法は、広く利用されている（特許文献１、２）。
In addition, there are a method for detecting a protein synthesized by bacteria using an antibody specific to the protein, and a method for detecting a metabolite using a mass spectrometer.
The most rapid and versatile techniques are molecular biological nucleic acid amplification techniques such as PCR and LAMP, and signal amplification techniques such as invader. A method of selectively amplifying and detecting a nucleic acid having a specific sequence possessed by a bacterium to be detected by these techniques is widely used (Patent Documents 1 and 2).
一方で、サンプル中に含まれる細菌群、いわゆる菌叢を包括的に解析する技術についても環境評価や診断等の分野での応用を目指した研究が多くなされている。例えば、検出対象となる細菌に共通した核酸配列を基に当該核酸を非選択的に増幅し、その後制限酵素処理でフラグメント解析したり、クローニングしてシーケンサー等による配列決定をしたり、もしくは当該増幅配列内における特異的な配列とのハイブリダイゼーションによる同定したりすることなどが挙げられる。これらのために電気泳動装置や、ＤＮＡチップ等のハイスループットなデバイスを用いることもある（特許文献３、４）。 On the other hand, many researches aiming at application in fields such as environmental evaluation and diagnosis have also been made on technologies for comprehensive analysis of bacterial groups contained in samples, so-called flora. For example, the nucleic acid is amplified non-selectively based on the nucleic acid sequence common to the bacteria to be detected, and then fragment analysis is performed by restriction enzyme treatment, cloning and sequencing by a sequencer or the like, or the amplification And identification by hybridization with a specific sequence within the sequence. For these, high-throughput devices such as electrophoresis apparatuses and DNA chips are sometimes used (Patent Documents 3 and 4).
環境中に存在する細菌叢、例えば腸内細菌、皮膚の常在菌、口内細菌、土壌中に含まれる細菌、活性汚泥中に含まれる細菌などは、多種類の細菌が相互に影響しつつ、その存在する環境自体にも大きな影響を与えている。
これらの菌叢を解析する場合、培養を用いた方法では時間がかかるし、多種類の細菌から構成される一部の細菌のみしか検出できない恐れがある。また、培養前と培養後で菌叢が異なる可能性も考えられる。抗原抗体反応や質量分析を用いた方法は、特異的な抗体のない細菌や、事前に当該細菌に特徴的なタンパク質や代謝物等が明らかでない細菌が存在する場合は適用が困難なので、検出できる細菌の種類が限られる。
Bacterial flora present in the environment, such as intestinal bacteria, skin resident bacteria, oral bacteria, bacteria contained in soil, bacteria contained in activated sludge, etc. It also has a great influence on the environment itself.
When analyzing these bacterial flora, the method using culture takes time, and there is a possibility that only some of the bacteria composed of many types of bacteria can be detected. It is also possible that the bacterial flora is different before and after culture. The method using antigen-antibody reaction and mass spectrometry can be detected because it is difficult to apply if there are bacteria that do not have specific antibodies, or bacteria that do not clearly reveal proteins or metabolites that are characteristic of the bacteria in advance. There are limited types of bacteria.
例えば、菌叢に含まれる多種類の細菌を一括評価するために、PCR等の増幅手段によって菌叢中に含まれる核酸を一括増幅し、ＤＮＡチップ等によってプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を基に個々の細菌を選別し、定性的に評価することは可能であるが、網羅的なアレイであったとしても、菌叢の中に未知の細菌が存在する可能性を考慮する
と、全体としての菌の量を定量的に評価する評価することは困難であった。また、プローブのハイブリダイゼーション効率も個々に異なることから、定量的に評価することは困難であった。
For example, in order to collectively evaluate many types of bacteria contained in the flora, nucleic acids contained in the flora are collectively amplified by amplification means such as PCR, and the specificity of hybridization with the probe is determined based on a DNA chip or the like. It is possible to select individual bacteria and evaluate them qualitatively, but even with an exhaustive array, considering the possibility of unknown bacteria in the flora, It was difficult to evaluate the amount of bacteria quantitatively. In addition, since the hybridization efficiency of the probes is different, it has been difficult to evaluate quantitatively.
そこで本発明は、菌叢を定量的に評価するための菌叢解析方法及びその方法に用いるデバイスを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for analyzing a flora for quantitatively evaluating the flora and a device used for the method.
本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブと、総量指標プローブ及び/又は絶対量指標プローブとを使用することにより菌叢を解析し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor uses a probe composed of a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific to each bacterium and a total amount index probe and / or an absolute amount index probe. Thus, the present inventors have found that the flora can be analyzed, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したデバイスである。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
That is, the present invention is a device on which the following probe (a) and at least one of probes (b) and (c) are mounted.
(A) a probe comprising a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific to each of one or more bacteria to be detected; (b) a total quantity index probe; and (c) one or more types of absolute quantity index probes.
本発明のデバイスにおいて、プローブ（ｂ）は、前述した検出の対象となる１種又は２種以上の細菌が共通に有する塩基配列を含むものであることが好ましい。また、プローブ（ｃ）は、所定の外部添加コントロール１と、当該外部添加コントロール１とは異なる少なくとも１種類の外部コントロール２との混合物であって、前記外部添加コントロール１に対し外部添加コントロール２が２のｎ乗倍（ｎは任意の整数）の濃度比で混合されている混合物中に含まれるものであることが好ましい。 In the device of the present invention, the probe (b) preferably contains a base sequence that is common to one or more bacteria to be detected as described above. The probe (c) is a mixture of a predetermined external addition control 1 and at least one external control 2 different from the external addition control 1, and the external addition control 2 is different from the external addition control 1. It is preferable that it is contained in the mixture mixed by the density | concentration ratio of 2 n times (n is arbitrary integers).
ここで、検出の対象となる細菌は、例えば、腸内細菌、皮膚の常在菌、及び口内細菌などが挙げられる。
腸内細菌としては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｅｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌のうちの少なくとも１種が挙げられる。
皮膚の常在菌としては、例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のうちの少なくとも１種が挙げられる。
口内細菌としては、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、及びＣａｎｄｉｄａ属の細菌うちの少なくとも１種が挙げられる。
また、口内細菌としては、より具体的には、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ ＩＩ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｎｏｘｉａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓのうちの少なくとも１種が挙げられる。
Here, examples of bacteria to be detected include intestinal bacteria, skin resident bacteria, and oral bacteria.
Examples of enterobacteria include at least one of bacteria belonging to the genus Lactobacillus, Streptococcus, Veionella, Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, and Clostridium.
Examples of the skin resident bacteria include at least one of bacteria belonging to the genus Propionibacterium and Staphylococcus.
The oral bacteria, e.g., Porphyromonas spp, Tannerella spp, Treponema spp, Campylobacter spp, Fusobacterium spp, Parvimonas spp, Streptococcus spp, Aggregatibacter genus, Capnocytophaga spp, Eikenella spp, Actinomyces spp, Veillonella spp, Selenomonas sp, Lactobacillus spp, Pseudomonas Examples include at least one of the genus, Haemophilus, Klebsiella, Serratia, Moraxella, and Candida.
In addition, specific examples of oral bacteria include, for example, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Campylobacter gracilis, Campylobacter rodus, Campylobacter strain. Vincentii, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Parvimonas micra, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus constellatus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Eikenella corrodens, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococc Us mitis, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula, Actinomyces naeslundii II, Selenomonas noxia, and Streptococcus.
また本発明のデバイスにおいて、プローブ（ａ）は、好ましくは以下のいずれかの配列が挙げられる。
（ア）配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列
（イ）（ア）の相補配列
（ウ）（ア）又は（イ）の配列と実質的に同一の配列
また、本発明のデバイスは、繊維型マイクロアレイとすることができる。
In the device of the present invention, the probe (a) is preferably any one of the following sequences.
(A) at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59 (a) (a) complementary sequence (c) (a) or a sequence substantially identical to the sequence of (a) The device of the present invention may be a fiber type microarray.
さらに、本発明は、以下の工程を含む、検出対象菌種の絶対量を推定する方法である。
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
Furthermore, the present invention is a method for estimating the absolute amount of the species to be detected, including the following steps.
(1) For each of the detection target bacteria isolated in advance, a step of calculating a coefficient from the signal intensity ratio of the probe for detecting the detection target bacteria (2) The calculated value calculated in the step (1) above Step of calculating the number of copies of each detection target bacterial species of data obtained from the test sample using the hybridization efficiency factor of the probe (3) After the calculation calculated in the step (2) Comparing the signal intensity of the signal with the signal intensity of the absolute quantity indicator probe
増幅産物の配列中に、菌種特異的なプローブと、総量指標プローブもしくは絶対量指標プローブのいずれか一方、もしくは両方を搭載したデバイスを用いることで、菌叢中の複数の菌を一括に絶対定量が可能となる。また、サンプル中に含まれる菌の総量も定量可能である。 By using a device equipped with a species-specific probe and either a total amount indicator probe or an absolute amount indicator probe or both in the sequence of the amplification product, multiple bacteria in the flora are Quantification is possible. In addition, the total amount of bacteria contained in the sample can be quantified.
以下本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１４−０９８７１９号（２０１４年５月１２日出願）の明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。 The present invention will be described in detail below. The scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention. In addition, this specification includes the whole specification of Japanese Patent Application No. 2014-098719 (filed on May 12, 2014), which is the basis for claiming priority of the present application. In addition, all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, and publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.
本発明の検出対象菌種の絶対量を推定する方法（絶対量推定方法）は、以下の工程を含む。
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
The method (absolute amount estimation method) for estimating the absolute amount of the species to be detected of the present invention includes the following steps.
(1) For each of the detection target bacteria isolated in advance, a step of calculating a coefficient from the signal intensity ratio of the probe for detecting the detection target bacteria (2) The calculated value calculated in the step (1) above Step of calculating the number of copies of each detection target bacterial species of data obtained from the test sample using the hybridization efficiency factor of the probe (3) After the calculation calculated in the step (2) Comparing the signal intensity of the signal with the signal intensity of the absolute quantity indicator probe
ここで本発明の絶対量推定方法に使用することができるデバイスは、
以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したデバイスである。
（ａ）検出の対象となる複数種類の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
Here, a device that can be used in the absolute quantity estimation method of the present invention is:
A device including the following probe (a) and at least one of probes (b) and (c).
(A) a probe comprising a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific to each of a plurality of types of bacteria to be detected; (b) a total amount index probe; and (c) one or more types of absolute amount index probes.
デバイス
プローブが独立にかつ位置を特定できるように固定化されているアレイタイプのデバイスであればどのような種類のデバイスであっても使用可能である。アレイのタイプも特に限定されないが、後述の総量指標プローブでのシグナルを安定的に取得する目的からすると、単に平面基板上にプローブを固定化しているものよりも、プローブ固定化量の多いアレイが適している。このようなアレイとしては、ＤＮＡマイクロアレイ好ましい。特に、ゲルを介して三次元的にプローブを固定化する繊維型ＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。デバイスについて、その支持体の形態は特には限定されず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４６７−４７０（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１， ７６７−７７３（１９９１）等参照）。
Any type of device can be used as long as it is an array type device in which the device probe is fixed so that the position can be determined independently. The type of the array is not particularly limited, but for the purpose of stably acquiring a signal with the total amount index probe described later, an array having a larger amount of probe immobilized than a probe simply immobilized on a flat substrate. Is suitable. Such an array is preferably a DNA microarray. In particular, a fiber-type DNA microarray in which probes are immobilized three-dimensionally through a gel can be mentioned. Regarding the device, the form of the support is not particularly limited, and any form such as a flat plate, a rod, or a bead can be used. When a flat plate is used as the support, a predetermined probe can be fixed on the flat plate with a predetermined interval for each type (spotting method, etc .; see Science 270, 467-470 (1995)). . It is also possible to sequentially synthesize a predetermined probe for each type at a specific position on the flat plate (see, for example, photolithography method; Science 251, 767-773 (1991)).
他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、オリゴヌクレオチドプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるデバイスが好ましく例示できる。このデバイスは、貫通孔基板にオリゴヌクレオチドプローブを固定化したタイプのものと説明することができる（特許第３５１０８８２号公報等を参照、図１）。 Other preferred support forms include those using hollow fibers. When using hollow fibers as the support, there is a device obtained by fixing oligonucleotide probes to each hollow fiber for each type, converging and fixing all hollow fibers, and then repeatedly cutting in the longitudinal direction of the fibers. Preferred examples can be given. This device can be described as a type in which an oligonucleotide probe is immobilized on a through-hole substrate (see Japanese Patent No. 3510882, FIG. 1).
支持体へのプローブの固定化方法は特には限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定化することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定化することもできる。 The method for immobilizing the probe to the support is not particularly limited, and any binding mode may be used. Moreover, it is not limited to immobilizing directly to a support body, For example, a support body can be previously coated with polymers, such as polylysine, and a probe can also be fixed to the support body after a process. Furthermore, when a tubular body such as a hollow fiber is used as the support, the tubular body can hold a gel-like material, and the probe can be immobilized on the gel-like material.
プローブ
本明細書では、細菌由来の核酸をハイブリダイゼーション反応により捕捉し、捕捉された核酸を蛍光や化学発光、着色、ＲＩ等で測定し、細菌の有無を判別することや量を測定することを検出と呼ぶ。
プローブは検出対象となる細菌の持つ核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉するものであり、当該捕捉対象核酸に特異的な配列の相補配列から構成されるオリゴＤＮＡが用いられることが多いが、捕捉対象核酸に特異的な配列とハイブリダイゼーションするものであれば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＰＮＡやＬＮＡなどを含んでいてもよい。用途に応じてｃＤＮＡを固定化する場合もある。
Probe In this specification, it is intended to capture bacterial nucleic acids by a hybridization reaction, measure the captured nucleic acids by fluorescence, chemiluminescence, coloring, RI, etc., and determine the presence or absence of bacteria. This is called detection.
The probe captures the nucleic acid of the bacterium to be detected by hybridization, and an oligo DNA composed of a complementary sequence of a sequence specific to the capture target nucleic acid is often used. As long as it hybridizes with a specific sequence, it may be DNA or RNA. PNA, LNA, etc. may be included. Depending on the application, cDNA may be immobilized.
一般的に多種類のプローブを一括搭載しているデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を使用する場合、多種類のプローブを同一条件下でハイブリダイゼーション反応に供するため、プローブ間のハイブリダイゼーション効率を揃えることが重要となる。このような目的のため、プローブは設計時にＧＣ含量や配列長を調整し、Ｔｍ値を可能な範囲で一定に揃える必要がある。デバイスに搭載されるプローブの種類や数は特に限定されない。 In general, when using a device (for example, a DNA microarray) that has multiple types of probes loaded at once, the hybridization efficiency between the probes must be uniform because multiple types of probes are subjected to the hybridization reaction under the same conditions. Is important. For this purpose, it is necessary to adjust the GC content and sequence length at the time of designing the probe so that the Tm values are made uniform within a possible range. The type and number of probes mounted on the device are not particularly limited.
細菌特異的プローブ（前記プローブ（ａ））は、鋳型となる塩基配列又はプローブの塩基配列中に、細菌の種類によって特異的な塩基配列を含むものである。 The bacteria-specific probe (the probe (a)) includes a specific base sequence depending on the type of bacteria in the base sequence serving as a template or the base sequence of the probe.
デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に対してサンプルをハイブリダイゼーションさせる際、多くの場合は検出感度を向上させ、検出可能な標識を付加するために、ＰＣＲやＬＡＭＰ法などの核酸増幅手法を適用する。増幅反応においては、後の工程におけるデバイスとのハイブリダイゼーションに必要な範囲を増幅させることが重要であり、ハイブリダイゼーションに必要でない部分は試薬コスト等の観点からなるべく増幅させないことが望ましい。 When a sample is hybridized to a device (for example, a DNA microarray), in many cases, a nucleic acid amplification technique such as PCR or LAMP is applied in order to improve detection sensitivity and add a detectable label. In the amplification reaction, it is important to amplify a range necessary for hybridization with a device in a later step, and it is desirable that portions not required for hybridization are not amplified as much as possible from the viewpoint of reagent cost and the like.
上述のＰＣＲ法では、プライマー対で挟まれた範囲のみを増幅するため、ハイブリダイゼーションに不必要な配列を除外した上で増幅反応を行うのに適している。ここで「対」とは、増幅反応に最低限必要なプライマーのセットであり、その種類は増幅反応の方法によって異なる場合がある。一般的なＰＣＲの場合は、プライマー対はフォワードプライマーとリバースプライマーの２種類のオリゴＤＮＡから構成される。 The above-described PCR method amplifies only the region sandwiched between primer pairs, and is therefore suitable for performing an amplification reaction after excluding sequences unnecessary for hybridization. Here, the “pair” is a minimum primer set necessary for the amplification reaction, and the kind thereof may differ depending on the method of the amplification reaction. In the case of general PCR, a primer pair is composed of two types of oligo DNAs, a forward primer and a reverse primer.
特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて2対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。例えば、細菌増幅用プライマー対（配列番号１、２）や、外部添加コントロール用プライマー対（配列番号９１、９２）を利用することが可能である。 The specific primer means that the sequence to be amplified is limited, and the primer pair is not necessarily one pair. A multiplex method using two or more primer pairs can be applied as necessary. For example, a primer pair for bacterial amplification (SEQ ID NOs: 1 and 2) and a primer pair for external addition control (SEQ ID NOs: 91 and 92) can be used.
上記のようなデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて菌叢解析を行うに際しては、用途は特に限定されない。健康状態の検査・診断的な用途であれば、腸内細菌叢、口内細菌叢、皮膚の常在菌などが考えられる。また、環境検査的な用途であれば土壌中の細菌叢、水処理における活性汚泥等に活用が可能である。 When performing the flora analysis using the device as described above (for example, DNA microarray), the application is not particularly limited. For health examination and diagnostic purposes, intestinal flora, oral flora, skin resident bacteria, etc. are considered. In addition, it can be used for bacterial flora in soil, activated sludge in water treatment, etc., for environmental testing purposes.
これらの中で、腸内細菌叢の評価を行う場合は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｅｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌などを、検出対象菌種とすることができる。 Among these, when evaluating the gut microbiota, for example, bacteria of the genus Lactobacillus, Streptococcus, Veionella, Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium, etc. be able to.
皮膚の常在菌の評価を行う場合は、例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌などを、検出対象菌種とすることができる。 When evaluating skin resident bacteria, for example, Propionibacterium bacteria (for example, Propionibacterium acnes), Staphylococcus bacteria, and the like can be used as detection target bacterial species.
口内細菌叢の評価を行う場合は、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、及びＣａｎｄｉｄａ属の細菌などを、検出対象菌種とすることができる。より具体的には、例えば、現在歯周病や虫歯や日和見感染に関連していると考えられる、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ ＩＩ、及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｎｏｘｉａなどの細菌を検出対象菌種とすることが好ましく、より好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａであり、特に好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓである。 When evaluating the oral flora, for example, Porphyromonas genus, Tannerella genus, Treponema genus, Campylobacter genus, Fusobacterium genus, Parvimonas genus, Streptococcus spp, , Lactobacillus genus, Pseudomonas genus, Haemophilus genus, Klebsiella genus, Serratia genus, Moraxella genus, Candida genus bacteria and the like can be used as detection target bacterial species. More specifically, for example, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponemabentrumida, Prevocterbacterbium terbicumata, Aggregabacterbacteria, Aggregabactibacterium, Aggregabacterbium Vincentii, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus miris, Actinomyces viscosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus phage, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Serratia macescens, Moraxella catarrhalis, Candida albicans, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Fusobacterium periodonticum, Parvimonas micra, Pr votella nigrescens, Streptococcus constellatus, Campylobacter concisus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Eikenella corrodens, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis bv 2, Actinomyces odontolyticus, Veillonella parvula, Actinomyces naeslundii II, and detecting bacteria such Selenomonas Noxia versus Preferably to species, more preferably, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and a Treponema denticola, particularly preferably Porphyromonas gingivalis.
これらについては、例えば、後述の表１に示すプライマー（配列番号１、２）を用いて増幅する場合、配列番号３〜５９に記載の配列をプローブとすることが可能である。配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列を用いることが好ましい。配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列であってもよく、配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列と実質的に同一の配列又は配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。 For example, when amplification is performed using primers (SEQ ID NOs: 1 and 2) shown in Table 1 described later, the sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 59 can be used as probes. It is preferable to use at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59. It may be a complementary sequence of at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59, and is substantially the same as at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59 Alternatively, it may be a sequence that is substantially identical to a complementary sequence of at least two sequences selected from the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59.
ここで、実質的に同一とは、配列番号３〜５９に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
プローブの長さとしては、例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性（相同性又は同一性が９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
Here, “substantially the same” means a length sufficient to specifically hybridize under stringent conditions to the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59 or complementary sequences.
The length of the probe is, for example, a sequence of 15 bases or more, preferably 17 bases or more, more preferably 20 bases or more. Here, the stringent condition means a condition in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. That is, a pair of polynucleotides having high homology (homology or identity is 95% or more, preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more). The conditions for hybridization. More specifically, such conditions are employed in conventional techniques well known in the art, such as Northern blotting, dot blot, colony hybridization, plaque hybridization, or Southern blot hybridization. Conditions can be set. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1 M NaCl using a membrane on which a polynucleotide was immobilized, and then 0.1 to 2 times the concentration of SSC (Saline Sodium Citrate; 150mM sodium chloride, 15mM sodium citrate) solution and washing the membrane at 65 ° C.
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. .
総量指標プローブ（前記プローブ（ｂ））
デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載するプローブの種類がどれだけ多くても、被検試料の中には、未同定の細菌が混在する可能性が高く、増幅される核酸の中には、特異的なプローブが搭載されていない検出対象ではない細菌（「非検出対象細菌」という）由来の核酸が存在する。
従って、すべての細菌を検出対象細菌として検出することは困難であり、菌叢を解析する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌叢の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそもサンプル中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を評価することもきわめて重要となる。
Total amount index probe (the probe (b))
Regardless of the number of probes mounted on a device (for example, a DNA microarray), there is a high possibility that unidentified bacteria are mixed in the test sample, and the amplified nucleic acid has a specific There is a nucleic acid derived from a bacterium that is not a detection target (referred to as “non-detection target bacterium”) without a typical probe.
Therefore, it is difficult to detect all bacteria as detection target bacteria, and in analyzing the bacterial flora, what percentage of the total bacterial flora including non-detection target bacteria is the detection target bacteria It is also extremely important to evaluate the total amount of bacteria from the viewpoint of how much bacteria are present in the sample in the first place.
非検出対象細菌は、(i)正体は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び(ii)存在や種類が不明である細菌の和として理解できる。その一方で、(ii)については存在も不可知で特異的な配列も不明であるため、必ずしも実際に検出できるとは限らない。このため、(ii)の中でも、増幅できた菌については非検出対象細菌を含むすべての検出対象細菌とする。増幅できた菌については必ずプライマー配列に対する相補配列を持っているので、プライマーと同じ配列をもつプローブに対してハイブリすることができる。 Non-detection target bacteria can be understood as the sum of (i) bacteria whose identity is known but not required to be detected, and (ii) bacteria whose existence and type are unknown. On the other hand, with regard to (ii), the existence, ignorance, and the specific sequence are unknown, so it cannot always be detected actually. Therefore, among (ii), the amplified bacteria are all detection target bacteria including non-detection target bacteria. Since the amplified bacteria always have a complementary sequence to the primer sequence, they can hybridize to a probe having the same sequence as the primer.
従って、本発明において全ての検出対象細菌とは特定のプライマー対で増幅できた細菌を意味する。
このような細菌の総量を評価するに際しては、例えば、デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）とは独立に細菌数を測定することも可能である。この場合、デバイス中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことが操作の簡便性を向上させる観点から有利となる。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、被検試料に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。
Therefore, in the present invention, all detection target bacteria mean bacteria that can be amplified with a specific primer pair.
In evaluating the total amount of such bacteria, for example, the number of bacteria can be measured independently of the device (DNA microarray). In this case, it is advantageous from the viewpoint of improving the ease of operation to mount a probe that is an indicator of the total amount of bacteria in the device. For the probe, a base sequence common to many types of bacteria may be used from among the base sequences amplified by the primer pair. When such a sequence is not found, a plurality of relatively common sequences may be designed, and the total amount index probe may be determined by comprehensively judging them. The total amount index probe is preferably a probe that hybridizes to a nucleic acid derived from a bacterium contained in a test sample, and more specifically, a plurality of types of base sequences amplified by the specific primer pair to be detected. This probe contains a base sequence shared by bacteria.
総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、シグナル強度が頭打ち（検出できるシグナル強度の許容範囲を超えるシグナルが出てしまうこと）になりやすい。 Since the total amount index represents the total amount of amplification products specific to each species, the amount generally increases, so that the signal intensity reaches its peak (a signal exceeding the allowable range of detectable signal intensity will be output). ).
そのような状況を防ぐためには、個々の菌種特異的な増幅産物を捕捉するプローブに比較して、ハイブリダイゼーション効率を落とすことで対応が可能である。ＰＣＲを実施するに際しては、二種類のオリゴＤＮＡを一つのプライマー対とし、そのうちの一方を蛍光標識し、他方を基本的に無標識として使用する。例えば無標識の方のオリゴＤＮＡと同じものをプローブとして用いると、増幅された全ＰＣＲ産物がハイブリダイゼーションすることになるので、このハイブリダイゼーションシグナルを測定する。プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。 In order to prevent such a situation, it is possible to cope with this by reducing the hybridization efficiency as compared with a probe that captures an amplification product specific for each bacterium species. When performing PCR, two kinds of oligo DNAs are used as one primer pair, one of which is fluorescently labeled and the other is basically used without labeling. For example, if the same unlabeled oligo DNA is used as a probe, the entire amplified PCR product will hybridize, so this hybridization signal is measured. When designing a probe, for example, the Tm value of the probe is lowered. Specifically, a method of reducing the GC content or shortening the probe sequence length itself can be considered.
また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと（部分的に）同じ配列を有する核酸、あるいは総量指標プローブの相補配列を（部分的に）有する核酸などが挙げられる。 Further, at the time of hybridization, it is possible to reduce the signal intensity by adding a nucleic acid that acts competitively on the hybridization between the amplified nucleic acid and the total amount index probe. Examples of such a nucleic acid include a nucleic acid having (partially) the same sequence as the total amount indicator probe, or a nucleic acid having (partially) a complementary sequence of the total amount indicator probe.
一方で、プライマー対と同じもしくは一部同じ配列を総量指標プローブとすることも可能である。例えば、フォワードプライマーに蛍光標識がなされている場合、リバースプライマーを構成する配列の全部もしくは一部を含むプローブを使用することで、増幅産物の総量を評価することが可能となる。 On the other hand, the same or a part of the same sequence as the primer pair can be used as the total amount index probe. For example, when the forward primer is fluorescently labeled, the total amount of the amplification product can be evaluated by using a probe including all or part of the sequence constituting the reverse primer.
フォワードプライマーに蛍光標識がなされている場合、フォワードプライマーから伸長した側の鎖をハイブリダイゼーションに供してシグナル検出する。この場合、上記同様、当該プローブの捕捉対象となる増幅産物の多さから、シグナル強度が頭打ちすることが懸念されるが、上記と同様にプローブの長さやＧＣ含量を調整することでその影響を抑えることが可能である。 When the forward primer is fluorescently labeled, the signal is detected by subjecting the strand extended from the forward primer to hybridization. In this case, as described above, there is a concern that the signal intensity may reach its peak due to the large number of amplification products to be captured by the probe. However, by adjusting the length of the probe and the GC content in the same manner as described above, the effect may be reduced. It is possible to suppress.
ハイブリダイゼーション効率係数
本明細書において、ハイブリダイゼーション効率係数とは、各菌種におけるプローブのシグナル強度から、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率係数を算出する。複数の細菌に対してハイブリダイゼーションを形成するプローブについてはその平均値をハイブリダイゼーション効率係数とする。
Hybridization efficiency coefficient In this specification, the hybridization efficiency coefficient is calculated from the signal intensity of the probe in each bacterial species. The average value of probes that form hybridization with a plurality of bacteria is defined as a hybridization efficiency coefficient.
外部添加コントロール
本明細書において、外部添加コントロールとは、被検サンプル中に含まれる細菌のＤＮＡが増幅されないように人工的に設計された核酸を意味する。増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、サンプル中に一定量添加する核酸である。外部添加コントロールは、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。従って、外部添加コントロールに特異的なプローブをデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを評価することができる。
External addition control In the present specification, the external addition control means a nucleic acid that is artificially designed so that bacterial DNA contained in a test sample is not amplified. A nucleic acid to be added to a sample in a certain amount before an amplification reaction or a hybridization reaction. The external addition control is a nucleic acid that can be surely amplified by performing a normal amplification reaction, and serves as a so-called positive control. Therefore, if a probe specific to external addition control is mounted on a device (for example, a DNA microarray), it can be evaluated from the detection result whether the amplification reaction, hybridization, etc. have been properly performed.
また、外部添加コントロールを複数設計し、それぞれについて濃度を変えた混合物を使用すれば、当該濃度に対する検出結果、例えば蛍光強度との対応付けにより、サンプル中に含まれる細菌やその総量を定量することが可能である。
外部添加コントロールを増幅反応前に添加するのであれば、上記特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
In addition, if you design multiple external addition controls and use a mixture with varying concentrations for each, you can quantify bacteria and their total amount in the sample by associating with detection results for that concentration, for example, fluorescence intensity Is possible.
If an external addition control is added before the amplification reaction, it is detected by hybridization that it is a nucleic acid amplified by the above specific primer pair, that is, possesses a base sequence complementary to the primer pair. In order to do this, it is necessary to possess a nucleotide sequence that is not possessed by either the detection target bacteria or the non-detection target bacteria.
外部添加コントロールの設計
例えば、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社のソフトウェアー「ＥＸＣＥＬ」のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くすることも可能である。外部添加コントロールを複数用いて検出対象細菌等を定量する場合、増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、外部添加コントロールの増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、外部添加コントロール由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
Design of external addition control For example, by using the RNDBETWEEN function of the software “EXCEL” of MICROSOFT, X integers from 1 to 4 are randomly generated (X is an arbitrary number), and connected to generate 1 to 4 By replacing 1 with A, 2 with T, 3 with C, and 4 with G, it is possible to obtain many random sequences of ATGC with X bases. For these sequences, only those sequences in which the sum of G and T is the same as the sum of A and T are extracted, and the extracted sequences are subjected to a Blast search against databases such as GenBank of NCBI, and the number of similar sequences is small. Can be designed by adding a primer sequence to both ends of the sequence. Moreover, the designed arrangement | sequence can be lengthened by connecting suitably, and it can also be partially removed and shortened. When quantifying detection target bacteria, etc. using multiple externally added controls, in order to keep the reaction efficiency during amplification reaction as constant as possible, it is necessary to make sure that there is no great difference from the base length amplified in the detection target bacteria. desirable. For example, if the amplification product of the detection target bacteria is about 500 bp, the amplification product of the external addition control is preferably about 300 bp to 1000 bp. On the other hand, when the amplification chain length is confirmed by electrophoresis etc. after amplification, the amplification product derived from the externally added control is designed to be an amplification product having a length different from that of the detection target bacteria. It is also possible to detect at a position different from that of the band and confirm the success or failure of the amplification reaction before hybridization.
また、外部添加コントロールを複数使用する場合においては、各外部添加コントロール間においては、プローブによって捕捉される配列やその付近以外は同じ塩基配列で構成されることが望ましい。 When a plurality of external addition controls are used, it is desirable that each external addition control is composed of the same base sequence except for the sequence captured by the probe and its vicinity.
外部添加コントロールを添加したうえで増幅反応をＰＣＲ等で実施する場合
１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ（前記プローブ（ｃ））は、特定のプライマー対を用いて増幅されたプローブであって被検試料に含まれる細菌に由来する核酸にはいずれもハイブリダイズせず、コントロールとして作製した外部添加コントロール核酸にハイブリダイズするプローブである。
絶対量指標プローブは、所定の外部添加コントロール１と、当該外部添加コントロール１とは異なる少なくとも１種類の外部添加コントロール２との混合物に含まれている。この場合、外部添加コントロール２は、外部添加コントロール１に対し２のｎ乗（ｎは任意の整数）の濃度比で混合されている。これはＰＣＲ自体がnサイクル後に２n倍の増幅産物量となるためである。外部添加コントロールの種類は２種類以上であるが、５０種類以下であることが好ましい。
When an amplification reaction is performed by PCR or the like after adding an external addition control One or more types of absolute quantity index probes (the probe (c)) are probes amplified using a specific primer pair. None of the nucleic acids derived from bacteria contained in the test sample hybridize to the probe added to the externally added control nucleic acid prepared as a control.
The absolute amount index probe is contained in a mixture of a predetermined external addition control 1 and at least one external addition control 2 different from the external addition control 1. In this case, the external addition control 2 is mixed with the external addition control 1 at a concentration ratio of 2 to the nth power (n is an arbitrary integer). This is because the PCR itself has an amplification product amount of 2n times after n cycles. There are two or more types of external addition controls, but 50 or less types are preferable.
またデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）のダイナミックレンジが１０４程度で
あることを考慮すると、濃度段階を２ｎ倍のステップで１５種類用意すれば２１５＞１０４であるため、デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）のダイナミックレンジ内においては十分な指標とすることができる。ただし、各１５種類の濃度ステップにおける外部添加コントロールを複数用意する場合においては、より多種類の外部添加コントロールを用意することも可能であるため、例えば各濃度段階において３種類の外部添加コントロールを作製する場合などを考慮すると４５種類程度の外部添加コントロールを、２のｎ乗の濃度ステップにて混合することが望ましい。
Considering that the dynamic range of a device (for example, a DNA microarray) is about 10 4 , if 15 types of concentration steps are prepared in 2 n- fold steps, 2 15 > 10 4 , so that the device (for example, a DNA microarray) It can be a sufficient index within the dynamic range of the microarray. However, when preparing a plurality of external addition controls for each of the 15 types of concentration steps, it is possible to prepare more types of external addition controls. For example, three types of external addition controls are prepared at each concentration stage. In consideration of such cases, it is desirable to mix about 45 types of external addition controls in 2 n density steps.
本発明において、複数種類の絶対量指標プローブを用いる場合、複数種類の外部添加コントロール核酸が増幅されてそれぞれのプローブで複数種類の外部添加コントロールを検出する。ｋ種類（第１番〜第ｋ番）の外部添加コントロールを使用する場合、第１番からみた第ｋ−１番の濃度比と、第１番からみた第ｋ番の濃度比を２のｎ乗（ｎは任意の整数）で表すことができる。 In the present invention, when a plurality of types of absolute amount index probes are used, a plurality of types of externally added control nucleic acids are amplified, and a plurality of types of externally added controls are detected by each probe. When k types (No. 1 to No. k) of external addition controls are used, the concentration ratio of the (k−1) th viewed from the 1st and the concentration ratio of the kth viewed from the 1st are n of 2. It can be expressed by a power (n is an arbitrary integer).
例えば、第１番からみた第２番のときのｎを３とし、第１番からみた第３番のときのｎも３とすると、第１番からみた第２番の濃度比も、第１番からみた第３番の濃度比も、２の３乗＝８倍となって同じ濃度比にすることができる。また、第１番からみた第２番のときのｎを２とし第１番からみた第３番のときのｎを３として、別の濃度比にすることもできる。
すなわち、複数種類の絶対量指標プローブを、同一濃度で使用してもよく、異なる濃度で使用してもよい。
For example, if n is 3 when viewed from the 1st and 3 is 3 when viewed from the 1st, the concentration ratio of the 2nd when viewed from the 1st is also 1st. The density ratio of No. 3 as viewed from the number can also be set to the same density ratio as 2 to the third power = 8 times. In addition, another density ratio can be obtained by setting n in the case of No. 2 as viewed from No. 1 and 3 in case of No. 3 as viewed from No. 1.
That is, a plurality of types of absolute quantity index probes may be used at the same concentration or at different concentrations.
基本的には、複数種類の絶対量指標プローブはどのような組み合わせで入れてもよい。１５種類の場合に、濃度１のものを７種類、濃度２のもの（濃度１に対する濃度比が２のもの、以下同様）を８種類入れてもよく、濃度１のものを７種類、濃度４のものを８種類入れてもよい。濃度１のものを２種類、濃度４のものを３種類、濃度８のものを１種類・・・でもよい。後述する実施例のように、濃度１のものを１種類、濃度２のものを１種類、濃度４のものを１種類、濃度８のものを１種類、・・・濃度１５のものを１種類でもよい。 Basically, a plurality of types of absolute quantity indicator probes may be inserted in any combination. In the case of 15 types, 7 types of concentration 1 and 8 types of concentration 2 (concentration ratio with respect to concentration 1 being 2; the same shall apply hereinafter) may be included. You may put eight kinds of things. There may be two types of one having a concentration of 1, three types having a concentration of 4, one having a concentration of 8, and so on. As in the examples described later, one type with a concentration of 1, one type with a concentration of 2, one type with a concentration of 4, one with a concentration of 8, one type with a concentration of 15 But you can.
検量線を引くために、濃度が２段階以上あることが必要であるが、その２段階が、２のｎ乗（ｎは整数）の濃度比になっていればよい。
一方で、サンプル中に含まれる外部添加コントロールはあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
In order to draw a calibration curve, it is necessary that the concentration has two or more levels, and it is sufficient that the two levels have a concentration ratio of 2 to the nth power (n is an integer).
On the other hand, if the concentration of the externally added control contained in the sample is too high, competition in the amplification reaction with the detection target bacteria becomes intense, and it may be impossible to detect the detection target bacteria that should originally be detected. It is necessary to adjust the concentration appropriately according to the conditions.
複数の外部添加コントロールをハイブリダイゼーションによって検出するために、複数の外部添加コントロールそれぞれに特異的な配列の相補配列をプローブとして個別にデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載する必要がある。
上記デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて実際に未知サンプル（実サンプル）の細菌叢に含まれる検出対象菌種の有無や量を解析する場合、上記のデバイスに含まれる検出対象菌種に対するプローブそれぞれについて、絶対量指標プローブのシグナルと、総量指標プローブのシグナル強度を基に補正する係数で処理することで、検出対象細菌由来の核酸を絶対定量することが可能となる。
In order to detect a plurality of external addition controls by hybridization, it is necessary to individually mount a complementary sequence of a sequence specific to each of the plurality of external addition controls as a probe on a device (for example, a DNA microarray).
When analyzing the presence / absence and amount of the target bacterial species contained in the bacterial flora of the unknown sample (actual sample) using the device (DNA microarray), for each probe for the target bacterial species contained in the device By treating with the coefficient corrected based on the signal of the absolute quantity index probe and the signal intensity of the total quantity index probe, the nucleic acid derived from the detection target bacteria can be absolute quantified.
検出対象菌種の絶対量推定方法
検出対象細菌
菌叢の中に未知の細菌がいる可能性は否定できない。このため、デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて全ての細菌種を検出対象とすることは困難である。過去に同定済みの細菌の中からある現象を評価するに際して、検出するにふさわしい細菌が対象となる。例えば、口内細菌は数百種類存在し、同定されている菌も多い。しかし、歯周病を評価するに際しては、これらの同定される菌が必ずしも検出対象として適しているとは限らない。
Method for estimating the absolute amount of the bacterial species to be detected The possibility of unknown bacteria in the bacterial flora to be detected cannot be denied. For this reason, it is difficult to detect all bacterial species using a device (for example, a DNA microarray). When evaluating a phenomenon among bacteria identified in the past, bacteria suitable for detection are targeted. For example, there are hundreds of types of oral bacteria, and many have been identified. However, when evaluating periodontal disease, these identified bacteria are not necessarily suitable as detection targets.
従って、歯周病を評価する場合は、歯周ポケットの中に存在する、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍなどが歯周病を評価することに適している菌であると言える。さらに好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａが、特に好ましくはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが歯周病を評価することに適している。 Therefore, when assessing periodontal disease, it is present in the periodontal pocket, for example, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermediate, Aggregatibacterbacterbactemactibacterium. Vincentii, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Fusobacterium nucleatum subsp. animalis, Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum can be said to be a suitable bacterium for evaluating periodontal disease. More preferably, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, and particularly preferably Porphyromonas gingivalis are suitable for evaluating periodontal disease.
これらの細菌の個々について、上記特定のプライマー対で増幅される塩基配列の中から、当該細菌に特異的な配列をプローブとして選抜する。すなわち、特定のプライマー対で増幅された塩基配列の中には、プローブとして使用できるものと使用できないものが含まれているので、そのうち使用できるプローブを選別する。基本的には一種類のプライマー対で多種類の菌を増幅し、増幅配列内で、菌種によって配列の多様性が認められる部分でプローブを作製する。 For each of these bacteria, a sequence specific to the bacteria is selected from the base sequences amplified by the specific primer pair as a probe. That is, the base sequences amplified by a specific primer pair include those that can be used as probes and those that cannot be used, so that probes that can be used are selected. Basically, various types of bacteria are amplified with one kind of primer pair, and probes are prepared in the amplified sequence where the diversity of the sequence is recognized depending on the species.
本来のプローブとして使用できる配列と同じ作用効果を有するプローブも実質的に同一の配列であるプローブとして使用できる。
従って、これらの検出対象細菌は上記特定のプライマー対によって増幅される核酸配列を持っている必要があり、また、これらの核酸を基に当該細菌を検出するために、増幅された配列内に、他の細菌とは異なる菌種特異的な配列を含んでいる必要がある。
A probe having the same action and effect as a sequence that can be used as an original probe can also be used as a probe having substantially the same sequence.
Therefore, these bacteria to be detected need to have a nucleic acid sequence amplified by the specific primer pair, and in order to detect the bacteria based on these nucleic acids, It must contain a species-specific sequence that is different from other bacteria.
一方でその特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、菌叢解析の目的に応じて当適宜判断が可能である。
複数の細菌を一括に増幅し、さらに特異的な配列を基にして検出するに際しては、プライマー対については菌種間で保存された配列から設計する必要があり、鋳型（プライマーによって増幅される範囲）として細菌特異的な配列を持っている遺伝子を使用する必要がある。このような鋳型となる遺伝子としては１６ＳｒＲＮＡが挙げられる。本発明においては、１６ＳｒＲＮＡそのものを検出対象としてもよいし、転写もととなるゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡを検出対象とすることも可能である。
On the other hand, the specificity may be one that collectively detects bacteria of the same genus based on specificity at the genus level, or may be specificity that can be detected at the level of individual species. This determination can be made as appropriate according to the purpose of the analysis.
When amplifying multiple bacteria at once and detecting them based on specific sequences, it is necessary to design primer pairs from sequences conserved among bacterial species. Templates (ranges amplified by primers) ) Need to use a gene that has a bacterial specific sequence. An example of such a template gene is 16S rRNA. In the present invention, 16SrRNA itself may be the detection target, or 16SrRNA in the genomic DNA that is the transcription source may be the detection target.
例えば、まず検出対象細菌を単離する。このとき、すでに菌株として販売されているものを使用してもよい。また、細菌は生きていても死んでいてもよく、さらに細菌そのものではなく細菌から抽出されたゲノムＤＮＡであってもよい。 For example, first, the detection target bacteria are isolated. At this time, those already sold as strains may be used. Further, the bacterium may be alive or dead, and may be genomic DNA extracted from the bacterium instead of the bacterium itself.
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
これら単離された細菌もしくは核酸の１種類について、本発明のデバイスによって処理を行う。その結果、当該細菌特異的なプローブで検出されるシグナルＡと、総量指標プローブで検出されるシグナルＢが得られる。
(1) A step of calculating a coefficient from the signal intensity ratio of a probe for detecting the detection target bacterium for each of the detection target bacteria isolated in advance. Process by the device. As a result, a signal A detected by the bacteria-specific probe and a signal B detected by the total amount index probe are obtained.
また別途、上記とは異なる単離された細菌もしくは核酸を用いて同様に本発明のデバイスによる処理を行う。その結果、当該細菌特異的なプローブで検出されるシグナルＣと、総量指標プローブで検出されるシグナルＤが得られるとする。 Separately, treatment with the device of the present invention is similarly performed using an isolated bacterium or nucleic acid different from the above. As a result, it is assumed that a signal C detected by the bacteria-specific probe and a signal D detected by the total amount index probe are obtained.
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
ここで、シグナルＢおよびシグナルＤについては、同じ配列の総量指標プローブから得られるシグナルであるため、理論上ハイブリダイゼーションの効率は同じといえる。一方で、シグナルＡとシグナルＢにおいてはプローブ配列自体が異なるが、検出対象とする核酸は同じであり、ハイブリダイゼーションに供された量や実験条件も同一である。このことは、シグナルＣとシグナルＤについても同様のことが言える。
(2) The calculated value calculated in the step (1) above is used as the hybridization efficiency coefficient of the probe, and the number of copies of each detection target bacterial species in the data obtained from the test sample is calculated using the hybridization efficiency coefficient. Step Here, since signal B and signal D are signals obtained from the total amount index probe of the same sequence, it can be said that the efficiency of hybridization is theoretically the same. On the other hand, the probe sequences themselves are different between signal A and signal B, but the nucleic acids to be detected are the same, and the amount and experimental conditions used for hybridization are also the same. The same can be said for signal C and signal D.
従って、シグナルＢとシグナルＤの値が一致する場合のシグナルＡとシグナルＣの強度比が、それぞれのプローブのハイブリダイゼーション効率の違いとなる。従って、Ａ／Ｂの値とＣ／Ｄの値は、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率の違いを補正したうえで比較が可能な値となる。例えば実サンプルを用いてＤＮＡマイクロアレイでデータを取得した際に、あらかじめ取得しておいたこれらの個々の値の逆数を、それぞれのプローブのシグナル強度に乗算することで、各プローブ間のハイブリダイゼーション効率を補正したうえで、シグナル強度を比較することが可能となる。 Therefore, the intensity ratio between signal A and signal C when the values of signal B and signal D match is the difference in hybridization efficiency of each probe. Therefore, the values of A / B and C / D are values that can be compared after correcting the difference in hybridization efficiency of each probe. For example, when data is acquired with a DNA microarray using an actual sample, the signal intensity of each probe is multiplied by the reciprocal of these individual values acquired in advance, so that the hybridization efficiency between the probes is increased. It is possible to compare signal intensities after correcting.
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
これらのシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較することで、各菌種の絶対量を評価することが可能となる。
この工程では、検出対象の分子数が既知である外部添加コントロールともハイブリダイゼーション効率の違いを補正したうえでシグナル強度の比較を行うと、より正確な絶対量の値を算出することが可能となる。すなわち、外部コントロールの分子数が既知であるので、それらのシグナル強度と添加した外部コントロールの分子数の対応で作成できる検量線により、各菌種特異的なプローブのシグナル強度をより正確に分子量に変換することが可能となる。
(3) Step of comparing the calculated signal intensity calculated in the step (2) with the signal intensity of the absolute quantity index probe By comparing these signal intensity with the signal intensity of the absolute quantity index probe, It is possible to evaluate the absolute amount of the bacterial species.
In this step, it is possible to calculate a more accurate absolute amount value by comparing the signal intensity after correcting the difference in hybridization efficiency with an external addition control in which the number of molecules to be detected is known. . In other words, since the number of molecules of the external control is known, the signal intensity of each bacterial species-specific probe can be more accurately adjusted to the molecular weight by using a calibration curve that can be created based on the correspondence between the signal intensity and the number of external control molecules added It becomes possible to convert.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
＜デバイスとプライマーの作製＞
ＮＣＢＩより１６ＳｒＲＮＡの配列データをダウンロードし、菌種間において高度に保存された二つの配列を表１に示すフォワードプライマー（配列番号１）およびリバースプライマー（配列番号２）としてオリゴＤＮＡの合成（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）行った。またこのとき、フォワードプライマーについてはＣｙ５による蛍光標識を行った。これらのプライマーについて、フォワードプライマーは５０ｐｍｏｌ／μＬ、リバースプライマーは１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度にそれぞれ調製した。
<Production of devices and primers>
The 16S rRNA sequence data was downloaded from NCBI, and two DNA sequences highly conserved among the bacterial species were used as the forward primer (SEQ ID NO: 1) and reverse primer (SEQ ID NO: 2) shown in Table 1 to synthesize oligo DNA (Life Technologies) )went. At this time, the forward primer was fluorescently labeled with Cy5. About these primers, the forward primer was prepared at a concentration of 50 pmol / μL, and the reverse primer was prepared at a concentration of 10 pmol / μL.
検出対象とする口内細菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ．）、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ（Ｔ．ｆ．）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔ．ｄ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｇｒａｃｉｌｉｓ（Ｃ．ｇｒ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ（Ｃ．ｒ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｏｗａｅ（Ｃ．ｓｈ．）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ（Ｆ．ｎ．ｖ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ（Ｆ．ｎ．ｐ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ａｎｉｍａｌｉｓ（Ｆ．ｎ．ａ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｆ．ｎ．ａ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ（Ｆ．ｐ．）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ（Ｐ．ｍ．）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（Ｐ．ｉ．）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｎ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ（Ｓ．ｃ．）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａ．ａ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｎｃｉｓｕｓ（Ｃ．ｃ．）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｃ．ｇｉ．）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ（Ｃ．ｏ．）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ（Ｃ．ｓｐ．）、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ（Ｅ．ｃ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（Ｓ．ｇ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（Ｓ．ｉ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ（Ｓ．ｍ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ ２（Ｓ．ｍｂ．）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ａ．ｏ．）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ（Ｖ．ｐ．）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ ＩＩ（Ａ．ｎ．）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｎｏｘｉａ（Ｓ．ｎ．））それぞれのゲノムＤＮＡを基にして、上記プライマーで増幅される範囲を１塩基ずつずらしながら２０塩基の配列を設計した。 Oral bacteria (Porphyromonas gingivalis (P.g.), Tannerella forsythia (T.f.), Treponema denticola (T.d.), Campylobacter gracilis (C. gr.), Campylobacter (C. ), Campylobacter showa (C. sh.), Fusobacterium nucleatum subsp. Vincentii (Fn. V), Fusobacterium nucleatum subp. Um. Cerium, F. n.p. Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum (F. a.), Fusobacterium periodonticum (F. p.), Parvimonas micra (P. m.), Prevotella intermedia (P. i. s. Prevocre, Prevocre. (S.c.), Aggregatacteractinomycetemcomitans (A.a.), Campylobacter concisus (C.c.), Capinocytophaga gingivalis (C.gi.), Capnocytophaga. gena (C.sp.), Eikenella corrodens (E.c.), Streptococcus gordonii (S.g.), Streptococcus intermedius (S.i.), Streptococcus mitis (S.m.), Streptocos stritto sco. .Mb.), Actinomyces odontolyticus (A.o.), Veillonella parvula (V.p.), Actinomyces naeslundii II (A.n.), and Selenomonas noxia (S.n.) The sequence of 20 bases was designed while shifting the range amplified by the above primers by one base at a time.
次に、上記設計した塩基配列の中から、おおよそのＧＣ含量が５０％前後となるものを抽出し、それらの配列すべてをＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを用い、全菌種に対する１６ＳｒＲＮＡ配列をマスキングデータベースとして相同性検索を行い、配列特異性の最も高かった配列を二つ抽出した。抽出された配列を菌種間で比較し、他に比べてＧＣ含量の高いものについてはその配列の前後を１塩基から２塩基を追加し、低いものについては１塩基から２塩基削除した。 Next, from the designed base sequences, those having an approximate GC content of about 50% are extracted, and all of these sequences are homologous using NCBI's BLAST program and the 16S rRNA sequences for all bacterial species as masking databases. A sex search was performed and two sequences with the highest sequence specificity were extracted. The extracted sequences were compared between bacterial species, and those having a high GC content compared to others were added from 1 to 2 bases before and after the sequence, and those having a low GC content were deleted from 1 to 2 bases.
得られた配列をプローブとするために、５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した（配列番号３〜５９）。別途、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出の対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列の、５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した（配列番号６０）。
さらに、１６ＳｒＲＮＡ中には含まれない配列からなるプローブを１５種類（配列番号６１〜７５）用意し、これらについても５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した。
In order to use the obtained sequence as a probe, 5-terminal vinylated oligo DNA was synthesized (SEQ ID NOs: 3 to 59). Separately, among the base sequences amplified by the specific primer pair, a 5-terminal vinylated oligo DNA having a base sequence shared by a plurality of types of bacteria to be detected was synthesized (SEQ ID NO: 60).
Furthermore, 15 types of probes (SEQ ID NOs: 61 to 75) having sequences not included in 16S rRNA were prepared, and 5-terminal vinylated oligo DNA was synthesized for these probes.
これらすべての種類の５末端ビニル化オリゴＤＮＡを用い、プローブを三菱レイヨン性ＤＮＡチップジェノパールのプラットフォームを用いてアレイ化した。設計したすべてのプローブ配列を表２に示す。 All these types of 5-terminal vinylated oligo DNAs were used, and probes were arrayed using a platform of Mitsubishi Rayon DNA chip Genopearl. All designed probe sequences are shown in Table 2.
＜検体の調製＞
次に、サーマルサイクラーの電源を入れ、表３に示す通りプログラムを設定した。
<Sample preparation>
Next, the thermal cycler was turned on and the program was set as shown in Table 3.
消毒用エタノールとキムワイプ／キムタオル等でゴム手袋、実験台の上、ピペットマン、チューブラック等をきれいに清掃し、氷の上にチューブラックを置いた。チューブラックの上に、評価用サンプル、プライマー（２本）、Ｅｘ Ｔａｑ、外部添加コントロール、ヌクレアーゼフリーの水を置いた。必要に応じて試薬を溶解、ボルテックス、スピンダウンした。プレミックス作製用エッペンチューブ、プライマー希釈用エッペンチューブ、外部添加コントロール希釈用チューブ、反応実施用エッペンチューブ（０．２ｍＬ，サンプル数分）をチューブラックに置いた。プライマー希釈用エッペンチューブにプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬとなるように希釈して入れた。 Rubber gloves, laboratory bench, pipetman, tube rack, etc. were cleanly cleaned with disinfecting ethanol and Kimwipe / Kim towel, etc., and the tube rack was placed on ice. An evaluation sample, primers (2), Ex Taq, external addition control, and nuclease-free water were placed on the tube rack. Reagents were dissolved, vortexed, and spun down as needed. The premix preparation Eppendorf tube, the primer dilution Eppendorf tube, the external addition control dilution tube, and the reaction execution Eppendorf tube (0.2 mL, number of samples) were placed in a tube rack. The primer was diluted into a primer dilution Eppendorf tube so as to be 10 pmol / μL.
＜ＰＣＲ用Ｐｒｅｍｉｘの作製＞
エッペンチューブに水をサンプル数×６μＬ入れた。１０万倍希釈外部添加コントロールをサンプル数×１μＬ入れた。１０ｐｍｏｌ／μＬプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ） サンプル数×１μＬを入れた。５０ｐｍｏｌ／μＬプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ） サンプル数×１μＬを入れた。２ｘ Ｔａｑをサンプル数×１０μＬ入れた。ボルテックスで撹拌し、スピンダウンしたものを、Ｐｒｅｍｉｘとした。
<Preparation of PCR Premix>
Water was put in the Eppendorf tube by the number of samples × 6 μL. A sample number × 1 μL was added as a 100,000-fold diluted external addition control. 10 pmol / μL primer (reverse) Sample number × 1 μL was added. 50 pmol / μL primer (forward) Sample number × 1 μL was added. 2 × Taq was added to the sample number × 10 μL. What was vortexed and spun down was designated as Premix.
＜反応液の作製＞
Ｐｒｅｍｉｘを１９μＬ、反応用エッペンチューブ（０．２ｍＬ）に小分け分注し、反応用エッペンチューブに、下表に示すサンプルを１μＬ入れた。ボルテックスで撹拌し、スピンダウンし、反応液とした。
サンプルは凍結乾燥された菌株もしくはゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから購入したものを使用した。使用したサンプルを表４に示した。ゲノムＤＮＡについては１０ｎｇ／μＬに調整したもの、菌株については、３００μＬの水で溶解したものから、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＤＮＡを抽出した。濃度は０．０１から１０ｐｇまで、それぞれ必要な範囲を測定した。
<Preparation of reaction solution>
Premix was dispensed in 19 μL portions into a reaction Eppendorf tube (0.2 mL), and 1 μL of the sample shown in the table below was placed in the reaction Eppendorf tube. The mixture was vortexed and spun down to obtain a reaction solution.
Samples used were freeze-dried strains or genomic DNA purchased from ATCC. The samples used are shown in Table 4. From genomic DNA adjusted to 10 ng / μL and strains dissolved from 300 μL water, DNA was extracted using Dneasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). The concentration was measured in the necessary range from 0.01 to 10 pg.
＜ＰＣＲ＞
反応液をサーマルサイクラーにセットし、サーマルサイクラーの蓋をしっかり閉じ、スタートボタンを押して反応を開始した。
<PCR>
The reaction solution was set in a thermal cycler, the thermal cycler lid was closed tightly, and the start button was pressed to start the reaction.
＜ハイブリダイゼーションの準備＞
サーマルサイクラーのスイッチを入れて、プログラム［９５℃５ｍｉｎ（必要に応じて４℃で任意の時間放置）反応液量：１００μＬ、ＲａｍｐＳｐｅｅｄ：Ｍａｘ］を設定した。小さめの容器（９６ ｗｅｌｌｐｌａｔｅが入る大きさ）に氷を入れ、氷の隙間に水がいきわたるくらい純水を入れた。
<Preparation for hybridization>
The thermal cycler was turned on, and the program [95 ° C., 5 min (optionally left at 4 ° C. for an arbitrary time) reaction volume: 100 μL, RampSpeed: Max] was set. Ice was put into a small container (size that can accommodate 96 wellplates), and pure water was put into the ice so that the water could flow through the gap.
＜ハイブリダイゼーション用Ｐｒｅｍｉｘの作製＞
１．５ｍＬのエッペンチューブもしくは８ｍＬのコニカルチューブを用意した。チューブにきれいな水をサンプル数×１．１×６４μＬ入れた。チューブに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌをサンプル数×１．１×４８μＬ入れた。チューブに１Ｍ ＮａＣｌをサンプル数×１．１×４８μＬ入れた。チューブに０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０をサンプル数×１．１×２０μＬ入れた。ボルテックスでよく混ぜて、必要に応じてスピンダウンし、ハイブリダイゼーション用Ｐｒｅｍｉｘとした。
<Preparation of Hybrid Premix>
A 1.5 mL Eppendorf tube or an 8 mL conical tube was prepared. Clean water was added to the tube by the number of samples × 1.1 × 64 μL. 1M Tris-HCl was added to the tube. Sample number × 1.1 × 48 μL. 1M NaCl was added to the tube by the number of samples × 1.1 × 48 μL. 0.5% Tween 20 was added to the tube. Sample number × 1.1 × 20 μL. Mix well by vortexing, spin down if necessary, and premix for hybridization.
＜ハイブリダイゼーション溶液の作製＞
サンプル溶液（ＰＣＲ産物の入った０．２ｍＬのエッペンチューブ）に対してハイブリダイゼーション用Ｐｒｅｍｉｘ１８０μＬを小分け分注した。ボルテックスして、スピンダウンし、ハイブリダイゼーション溶液とした。
<Preparation of hybridization solution>
Premix 180 μL for hybridization was dispensed in small portions into the sample solution (0.2 mL Eppendorf tube containing the PCR product). Vortex and spin down to make the hybridization solution.
＜ハイブリダイゼーション前処理＞
ハイブリダイゼーション溶液をサーマルサイクラーにセットして、蓋をしっかりしめて加温を開始した。９５℃５分の加熱が終了後、即座に蓋をあけ、中に入っているサンプルチューブをプラスチックのラックごと取り出し、氷水の入った小さめの容器に漬け込み、２分放置した。その後、サンプルチューブを氷水から取り出し、氷上のラックにおいた。
<Hybridization pretreatment>
The hybridization solution was set on a thermal cycler, and the lid was tightly closed to start heating. After heating at 95 ° C. for 5 minutes, the lid was immediately opened, the sample tube contained therein was taken out together with the plastic rack, immersed in a small container containing ice water, and left for 2 minutes. The sample tube was then removed from the ice water and placed in a rack on ice.
＜ハイブリダイゼーション＞
エアインキュベーターが５０℃になっていることを確認し、ハイブリチャンバーに全量（２００μｌ）のハイブリダイゼーション溶液を入れた。上記で作製したジェノパールハイブリチャンバー内に浸漬した。ハイブリチャンバーに蓋をし、密閉した状態でエアインキュベーター内に入れ、そのままの状態で２時間遮光放置した。
<Hybridization>
After confirming that the air incubator was at 50 ° C., the entire amount (200 μl) of the hybridization solution was placed in the hybridization chamber. It was immersed in the genopearl hybrid chamber produced above. The hybrid chamber was covered, placed in an air incubator in a sealed state, and left undisturbed for 2 hours.
＜洗浄＞
２時間経過後、ハイブリチャンバーをエアインキュベーターから取り出し、蓋を開けた。０．２４Ｍ ＴＮＴバッファーの入ったコニカルチューブをウォーターインキュベーターから取り出し、蓋についた結露を落とすために、一旦コニカルチューブの蓋をしたまま回転し、その後、蓋を開けた。ハイブリチャンバーからピンセットでチップを取り出し、底面をキムワイプ等に接触させ、過剰なハイブリ溶液を吸収除去した。チップをコニカルチューブに入れ、再度蓋をして、ウォーターインキュベーターに浸漬し、そのまま２０分間加温した。２０分経過後、上記と同様の方法で、チップを同一バッファーの入った別のコニカルチューブに移し、さらに２０分間加温した。２０分経過後、上記と同様の方法で、チップを今度は０．２４Ｍ ＴＮバッファーの入ったコニカルチューブに移し、さらに１０分間加温した。１０分経過後、上記と同様の方法で、チップを同一バッファーの入った８ｍＬのコニカルチューブに移し、回転架台を用いて１０分以上回転撹拌した。
<Washing>
After 2 hours, the hybrid chamber was removed from the air incubator and the lid was opened. The conical tube containing 0.24M TNT buffer was taken out of the water incubator, and in order to remove the condensation on the lid, the conical tube was once rotated with the lid on the conical tube, and then the lid was opened. The chip was taken out of the hybrid chamber with tweezers, the bottom surface was brought into contact with Kimwipe or the like, and the excess hybrid solution was absorbed and removed. The chip was placed in a conical tube, covered again, immersed in a water incubator, and allowed to warm for 20 minutes. After 20 minutes, the chip was transferred to another conical tube containing the same buffer by the same method as described above, and further heated for 20 minutes. After 20 minutes, the chip was transferred to a conical tube containing 0.24M TN buffer in the same manner as described above, and further heated for 10 minutes. After 10 minutes, the chip was transferred to an 8 mL conical tube containing the same buffer in the same manner as described above, and rotated and stirred for 10 minutes or more using a rotating stand.
＜検出操作＞
チップをコニカルチューブから取り出し、Ｇｅｎｏｐａｌ Ｒｅａｄｅｒ用検出ケース（三菱レイヨン製）にセットした。
Ｇｅｎｏｐａｌ Ｒｅａｄｅｒ（三菱レイヨン製）を用い、装置取扱い説明書に従って以下の露光時間を４０秒、４秒、１秒、０．１秒の各条件にてＤＮＡマイクロアレイの撮像を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
<Detection operation>
The chip was taken out from the conical tube and set in a detection case for Genopal Reader (manufactured by Mitsubishi Rayon).
Fluorescence signal detected by using DNA reader (manufactured by Mitsubishi Rayon) and imaging DNA microarray under the following exposure time of 40 seconds, 4 seconds, 1 second and 0.1 seconds according to the instruction manual of the device. The numerical data converted based on was used for the analysis.
＜解析＞
市販の表計算ソフトを用い、パソコン上でサンプル名称他、サンプルやチップ、実験条件に関する情報とシグナル強度の数値を貼り付けた。
外れ値を除外した複数のバックグラウンドスポット（プローブが搭載されていないスポット）の平均値をバックグラウンド値とした。またその時の標準偏差の値を最小シグナル値とした。
プローブスポットのシグナル値から、バックグラウンド値を減算し、正味シグナル値を算出した。
<Analysis>
Using commercially available spreadsheet software, the sample name, information on samples, chips, experimental conditions, and signal intensity values were pasted on a personal computer.
The average value of a plurality of background spots excluding outliers (spots where no probe was mounted) was used as the background value. The standard deviation value at that time was defined as the minimum signal value.
The background value was subtracted from the probe spot signal value to calculate the net signal value.
正味シグナル値が最小シグナル値よりも低い場合はそれらを最小シグナル値に置き換えた。
結果を表５（表５−１〜５−５；表５−１の左端側に表５−２〜５−５が順に繋がったもの全体で表５である。）に示した。データ中の細囲いは、細菌種特異的なハイブリダイゼーション由来のシグナルを示している。部分的にクロスハイブリダイゼーションは散見されるものの、およそのサンプルにおいては当該菌種を検出するプローブと総量指標プローブに強いシグナルが検出された。
If the net signal value was lower than the minimum signal value, they were replaced with the minimum signal value.
The results are shown in Table 5 (Tables 5-1 to 5-5; Table 5-2 in which Tables 5-2 to 5-5 are sequentially connected to the left end side of Table 5-1). Boxes in the data indicate signals from bacterial species-specific hybridization. Although some cross-hybridization was observed, a strong signal was detected in the probe for detecting the bacterial species and the total amount index probe in approximately samples.
次に、各菌種におけるプローブのシグナル強度から、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率係数を算出した。複数の細菌に対してハイブリダイゼーションを形成するプローブについてはその平均値をハイブリダイゼーション効率係数とし、結果を表６に示した。なお、値の記載のない部分は、単離された菌または核酸が無いため、ハイブリダイゼーション効率係数が算出できなかったものである。 Next, the hybridization efficiency coefficient for each probe was calculated from the signal intensity of the probe for each bacterial species. The average value of the probes that form hybridization with a plurality of bacteria was defined as the hybridization efficiency coefficient, and the results are shown in Table 6. In addition, since there is no isolated microbe or nucleic acid, the part without a value description is a thing in which the hybridization efficiency coefficient was not able to be calculated.
＜外部添加コントロールの作製＞
フォワードプライマーとリバースプライマーで増幅可能で、かつ配列番号６１〜７５のプローブを用いてそれぞれ独立にハイブリダイゼーションが可能である、配列番号７６〜９０に記載の２本鎖ＤＮＡを合成した。合成した配列を表７に示す。
<Preparation of external addition control>
Double-stranded DNAs described in SEQ ID NOs: 76 to 90, which can be amplified with a forward primer and a reverse primer and can be independently hybridized using the probes of SEQ ID NOs: 61 to 75, were synthesized. The synthesized sequences are shown in Table 7.
＜ＰＣＲからデータ取得まで＞
菌株やゲノムＤＮＡ溶液の代わりに社内で公募した検査対象人１名の唾液５００μＬから、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＤＮＡを抽出した。その濃度は、１４．８ｎｇ／μＬであり、３０００倍希釈した溶液１μＬを実サンプルとし、１０万倍希釈した外部添加コントロールを１μＬ添加した。その他は反応溶液中の水の量を１サンプルあたり１μＬ減らす以外、実施例１の手順と同じ方法によりＰＣＲを行い、続いてＤＮＡマイクロアレイによるハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光シグナルデータを取得した。検出限界以上のシグナルが検出されたプローブについて結果を表８にまとめた。
<From PCR to data acquisition>
DNA was extracted from 500 μL of saliva of one test subject who was solicited in-house in place of the strain and genomic DNA solution, using Dneasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). The concentration was 14.8 ng / μL, 1 μL of a 3000-fold diluted solution was used as a real sample, and 1 μL of an external addition control diluted 100,000-fold was added. Other than that, PCR was performed by the same method as in Example 1 except that the amount of water in the reaction solution was reduced by 1 μL per sample, followed by hybridization with a DNA microarray to obtain fluorescence signal data for each probe. . Table 8 summarizes the results for probes in which a signal exceeding the detection limit was detected.
表８の結果は、実施例１にて算出したハイブリダイゼーション効率係数を利用し、各プローブにおけるコピー数を算出したものである。
表８においては、「コピー数」の欄に記載の数字が、実際の細菌の個数を意味している。
The results in Table 8 are obtained by calculating the number of copies in each probe using the hybridization efficiency coefficient calculated in Example 1.
In Table 8, the numbers described in the “copy number” column mean the actual number of bacteria.
絶対量指標プローブの定量範囲内（検出限界以下であったプローブとシグナル強度が頭打ちになったプローブのデータを除外したデータ）にて作成された検量線の傾きの値を算出した。結果を表９に示す。 The value of the slope of the calibration curve prepared within the quantification range of the absolute quantity index probe (data excluding the data of the probe that was below the detection limit and the probe whose signal intensity peaked) was calculated. The results are shown in Table 9.
以上より、検査対象人の唾液サンプル中に含まれる検出対象細菌を絶対定量することが可能となった。 From the above, it has become possible to absolute quantitate the detection target bacteria contained in the saliva sample of the test subject.
本発明によれば、環境中に含まれる複数の細菌の個々を一括に定量可能とし、かつ全体の量の増減を評価できる。従って、本発明のデバイスは、例えば腸内、皮膚、口内等の健康状態の評価、土壌、海水、河川の環境評価、活性汚泥の性能評価等に利用可能である。 According to the present invention, each of a plurality of bacteria contained in the environment can be quantified at a time, and an increase or decrease in the total amount can be evaluated. Therefore, the device of the present invention can be used for, for example, evaluation of health conditions such as intestine, skin, and mouth, soil, seawater, river environment, activated sludge performance, and the like.
配列番号１〜９２：合成核酸 SEQ ID NOs: 1-92: synthetic nucleic acids
Claims (11)
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ A device on which the following probe (a) and at least one of probes (b) and (c) are mounted.
(A) a probe comprising a nucleic acid that hybridizes to 16S rRNA specific to each of one or more bacteria to be detected; (b) a total quantity index probe; and (c) one or more types of absolute quantity index probes.
（ア）配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列
（イ）（ア）の相補配列
（ウ）（ア）又は（イ）の配列と実質的に同一の配列 The device according to any one of claims 1 to 8, wherein the probe (a) has any one of the following sequences.
(A) At least two sequences selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 59 (a) (a) complementary sequence (c) (a) or a sequence substantially identical to the sequence of (a)
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
A method for estimating an absolute amount of a species to be detected, including the following steps.
(1) For each of the detection target bacteria isolated in advance, a step of calculating a coefficient from the signal intensity ratio of the probe for detecting the detection target bacteria (2) The calculated value calculated in the step (1) above Step of calculating the number of copies of each detection target bacterial species of data obtained from the test sample using the hybridization efficiency factor of the probe (3) After the calculation calculated in the step (2) Comparing the signal intensity of the signal with the signal intensity of the absolute quantity indicator probe
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