JP7440879B2 - Cell culture substrate, cell culture method, and cell culture device - Google Patents
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、細胞培養基材、細胞培養方法、及び、細胞培養器に関する。 The present invention relates to a cell culture substrate, a cell culture method, and a cell culture device.
流動性を有する細胞培養基材は、その粘弾性を制御することにより細胞の生長形態を制御することができる特長を有し、開発が進められている。なかでも、細胞を接着させて生長させる「二次元培養」が可能な流動性細胞培養基材として、フッ素含有有機液体が知られている。
非特許文献１には、パーフルオロカーボンと液体培地との界面で細胞を培養する方法が記載されている。
Flowable cell culture substrates have the advantage of being able to control the growth form of cells by controlling their viscoelasticity, and are being developed. Among these, fluorine-containing organic liquids are known as fluid cell culture substrates that enable "two-dimensional culture" in which cells adhere and grow.
Non-Patent Document 1 describes a method of culturing cells at the interface between perfluorocarbon and a liquid medium.
フッ素含有有機液体は、水系の培地と共に用いた場合、その界面において細胞培養が可能であるものの、使用後のフッ素含有有機液体を再利用しようとすると、不純物の分離、及び、蒸留による沸点の近い成分の分離等が必要であり、多くのエネルギー及びコストを要し、効率的なではないという課題があった。
本発明は、上記課題に鑑みて、二次元培養が可能であって、かつ、容易に再利用可能な細胞培養基材を提供することを課題とする。
When a fluorine-containing organic liquid is used with an aqueous medium, it is possible to culture cells at the interface. The problem is that it requires separation of components, requires a lot of energy and cost, and is not efficient.
In view of the above problems, it is an object of the present invention to provide a cell culture substrate that allows two-dimensional culture and is easily reusable.
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。 As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have found that the above-mentioned problems can be achieved by the following configuration.
［１］ 融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有する細胞培養基材。 試験：上記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、上記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、上記混合物を遠心分離して、水相と上記塩の濃厚相とに分離し、上記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。
［２］ 動物細胞、及び、植物細胞からなる群より選択される少なくとも１種の接着培養に用いられる、［１］に記載の細胞培養基材。
［３］ 上記塩がイオン液体である、［１］又は［２］に記載の細胞培養基材。
［４］ 上記塩を構成するカチオンが、有機カチオン、及び、金属錯体カチオンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［５］ 上記塩を構成するカチオンが、アンモニウムイオン、ピリジニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、オキサゾリウムイオン、オキサゾリニウムイオン、イミダゾリウムイオン、チアゾリウムイオン、及び、ホスホニウムイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［６］ 上記塩を構成するアニオンが、後述する式７で表されるアニオンである、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［７］ 更に、高分子化合物を含有する、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［８］ 更に、界面活性剤を含有する、［１］～［７］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［９］ ［１］～［８］のいずれかに記載の細胞培養基材に細胞を接着させて培養する、細胞培養方法。
［１０］ 容器と、［１］～［８］のいずれかに記載の細胞培養基材と、を有する細胞培養器。
[1] A cell culture substrate containing a salt having a melting point of 150°C or less and a saturated water content of 100,000 mass ppm or less as measured by the following test method. Test: Add 5 times the amount of water by volume to the above salt to obtain a mixture, stir the above mixture and leave it at 25°C for 10 hours, then centrifuge the above mixture to remove water. It is separated into a phase and a concentrated phase of the salt, and the saturated water content of the concentrated phase is measured using the Karl Fischer titration method.
[2] The cell culture substrate according to [1], which is used for adhesive culture of at least one type selected from the group consisting of animal cells and plant cells.
[3] The cell culture substrate according to [1] or [2], wherein the salt is an ionic liquid.
[4] The cell culture substrate according to any one of [1] to [3], wherein the cation constituting the salt is at least one selected from the group consisting of organic cations and metal complex cations.
[5] The cation constituting the above salt is selected from the group consisting of ammonium ion, pyridinium ion, pyrrolidinium ion, piperidinium ion, oxazolium ion, oxazolinium ion, imidazolium ion, thiazolium ion, and phosphonium ion. The cell culture substrate according to any one of [1] to [3], which is at least one selected type.
[6] The cell culture substrate according to any one of [1] to [5], wherein the anion constituting the salt is an anion represented by formula 7 described below.
[7] The cell culture substrate according to any one of [1] to [6], further containing a polymer compound.
[8] The cell culture substrate according to any one of [1] to [7], further containing a surfactant.
[9] A cell culture method, which comprises culturing cells by adhering them to the cell culture substrate according to any one of [1] to [8].
[10] A cell culture device comprising a container and the cell culture substrate according to any one of [1] to [8].
本発明によれば、二次元培養が可能であって、かつ、容易に再利用可能な細胞培養基材を提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a cell culture substrate that allows two-dimensional culture and is easily reusable.
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
The present invention will be explained in detail below.
Although the description of the constituent elements described below may be made based on typical embodiments of the present invention, the present invention is not limited to such embodiments.
In this specification, a numerical range expressed using "~" means a range that includes the numerical values written before and after "~" as the lower limit and upper limit.
また、本明細書における基（原子群）の表記において、置換、及び、無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。 In addition, in the description of groups (atomic groups) in this specification, descriptions that do not indicate substituted or unsubstituted include those that do not have a substituent and those that have a substituent, to the extent that the effects of the present invention are not impaired. It also includes things. For example, the term "alkyl group" includes not only an alkyl group having no substituent (unsubstituted alkyl group) but also an alkyl group having a substituent (substituted alkyl group). This also applies to each compound.
また、本明細書において、「（メタ）アクリレート」はアクリレート及びメタクリレートの双方、又は、いずれかを表し、「（メタ）アクリル」はアクリル、及び、メタクリルの双方、又は、いずれかを表す。
また、本明細書において、「（メタ）アクリルアミド」は、メタクリルアミド、及び、アクリルアミドの双方、又は、いずれかを表す。
また、本明細書において、本明細書におけるモノマーは、オリゴマー、及び、ポリマーと区別され、特に断らない限り、重量平均分子量が２，０００以下の化合物をいう。
また、本明細書において「準備」というときには、特定の材料を合成ないし調合等して備えることのほか、購入等により所定の物を調達することを含む意味である。
Moreover, in this specification, "(meth)acrylate" represents both or either of acrylate and methacrylate, and "(meth)acrylic" represents both or either of acrylic and methacrylic.
Moreover, in this specification, "(meth)acrylamide" represents both methacrylamide and/or acrylamide.
Moreover, in this specification, the monomer in this specification is distinguished from an oligomer and a polymer, and unless otherwise specified, refers to a compound having a weight average molecular weight of 2,000 or less.
Further, in this specification, the term "preparation" includes not only preparing by synthesizing or blending specific materials, but also procuring predetermined materials by purchasing or the like.
［細胞培養基材］
本発明の実施形態に係る細胞培養基材（以下、「本細胞培養基材」ともいう。）は、融点が１５０℃以下であり、かつ、後述する試験方法（以下、「飽和水分量測定試験」ともいう。）により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ（１００，０００質量ｐｐｍ）以下である塩（以下、「特定塩」ともいう。）を含有する細胞培養基材である。
[Cell culture substrate]
The cell culture substrate according to the embodiment of the present invention (hereinafter also referred to as "the present cell culture substrate") has a melting point of 150°C or less, and the test method described below (hereinafter referred to as "saturated water content measurement test") This is a cell culture substrate containing a salt (hereinafter also referred to as "specific salt") whose saturated water content is 100,000 mass ppm (100,000 mass ppm) or less as measured by the method (hereinafter also referred to as "specific salt").
本細胞培養基材によって本発明の課題が解決される機序としては必ずしも明らかではないが、本発明者らは以下のとおり推測している。なお、以下の機序は推測であり、以下の機序以外の機序により本発明の課題が解決される場合であっても本発明の範囲に含まれるものとする。 Although the mechanism by which the present cell culture substrate solves the problems of the present invention is not necessarily clear, the present inventors speculate as follows. Note that the following mechanisms are speculations, and even if the problem of the present invention is solved by a mechanism other than the following mechanisms, the scope of the present invention shall still fall within the scope of the present invention.
本細胞培養基材は後述する特定塩を含有する。上記特定塩は、後述する試験方法で測定した飽和水分量が所定の範囲内であり、一般的な細胞培養液との間により明確な界面を形成しやすいものと推測される。更に、培養液と混合しにくいため、使用後の再利用が容易である。
また、特定塩の融点は１５０℃以下であるため、細胞培養基材が適度な粘弾性を有し、種々の細胞が接着しやすいという特徴を有するものと推測される。
以下では、本細胞培養基材が含有する各成分について詳述する。
This cell culture substrate contains a specific salt described below. The specific salt has a saturated water content within a predetermined range as measured by the test method described below, and is presumed to be likely to form a clearer interface with a general cell culture solution. Furthermore, since it is difficult to mix with the culture solution, it is easy to recycle after use.
Furthermore, since the melting point of the specific salt is 150° C. or lower, it is presumed that the cell culture substrate has appropriate viscoelasticity and is characterized by easy adhesion of various cells.
Below, each component contained in this cell culture substrate will be explained in detail.
〔特定塩〕
本細胞培養基材は特定塩を含有する。本明細書において、特定塩は、カチオンとアニオンとの組み合わせにより形成される物質を意味する。
本細胞培養基材における特定塩の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、一般に細胞培養基材の全質量に対して、１～１００質量％が好ましく、２０～１００質量％がより好ましく、３０～１００質量％が更に好ましく、５０質量％を超えて、１００質量％以下が特に好ましい。
なお、本細胞培養基材は、特定塩の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。本細胞培養基材が、２種以上の特定塩を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
[Specified salt]
This cell culture substrate contains specific salts. In this specification, a specific salt means a substance formed by a combination of a cation and an anion.
The content of the specific salt in the present cell culture substrate is not particularly limited, but in general, the content of the specific salt relative to the total mass of the cell culture substrate is 1 ~100% by mass is preferred, 20-100% by mass is more preferred, 30-100% by mass is even more preferred, and more than 50% by mass and no more than 100% by mass are particularly preferred.
In addition, this cell culture substrate may contain one kind of specific salt independently, and may contain two or more kinds. When the present cell culture substrate contains two or more types of specific salts, it is preferable that the total content is within the above numerical range.
特定塩の融点は１５０℃以下であれば特に制限されないが、得られる細胞培養基材の流動性がより制御しやすい点で、１００℃以下がより好ましく、２５℃以下が更に好ましい。なお、本明細書において、融点とは、大気圧下における融点を意味し、融点が２５℃以下の不揮発性の塩をイオン液体ともいう。 The melting point of the specific salt is not particularly limited as long as it is 150°C or lower, but it is more preferably 100°C or lower, and even more preferably 25°C or lower, since the fluidity of the resulting cell culture substrate can be more easily controlled. Note that in this specification, the melting point means the melting point under atmospheric pressure, and a nonvolatile salt having a melting point of 25° C. or lower is also referred to as an ionic liquid.
イオン液体は、不揮発性のため精製及び再利用がより容易であり、より好ましい。本細胞培養基材の再利用方法としては特に制限されないが、本細胞培養基材を水、及び／又は、有機溶剤で洗浄した後、活性炭処理し、次に、減圧濃縮する方法が挙げられる。上述のとおり、本細胞培養基材は、蒸留を経ずにより簡便な方法により精製、再利用が可能である。 Ionic liquids are more preferred because they are nonvolatile and therefore easier to purify and reuse. Methods for reusing the cell culture substrate are not particularly limited, but include a method in which the cell culture substrate is washed with water and/or an organic solvent, treated with activated carbon, and then concentrated under reduced pressure. As mentioned above, this cell culture substrate can be purified and reused by a simpler method without undergoing distillation.
特定塩は、以下の方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下（１０質量％以下）である。
（試験方法）
試験：上記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、上記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、上記混合物を遠心分離して、水相と上記塩の濃厚相とに分離し、上記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。
The specific salt has a saturated water content of 100,000 mass ppm or less (10 mass % or less) as measured by the following method.
(Test method)
Test: Add 5 times the amount of water by volume to the above salt to obtain a mixture, stir the above mixture and leave it at 25°C for 10 hours, then centrifuge the above mixture to remove water. It is separated into a phase and a concentrated phase of the salt, and the saturated water content of the concentrated phase is measured using the Karl Fischer titration method.
なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、上記方法により測定される飽和水分量としては、８００００質量ｐｐｍ以下が好ましく、５００００質量ｐｐｍ以下がより好ましく、２００００質量ｐｐｍ以下が更に好ましく、１７０００質量ｐｐｍ以下が特に好ましく、１２０００質量ｐｐｍ以下が最も好ましく、７５００質量ｐｐｍ以下がより最も好ましく、４０００質量ｐｐｍ以下が更に最も好ましい。なお、飽和水分量の下限値としては特に制限されないが、０質量ｐｐｍ以上であればよいが、一般に、１質量ｐｐｍ以上が好ましい。
飽和水分量が上記数値範囲内にあると、得られる細胞培養基材は水系の培養液との間でより明確な界面を形成しやすい。
なお、本明細書において飽和水分量は小数第１位まで求めて四捨五入して得られる値を意味する。
Among them, the saturated water content measured by the above method is preferably 80,000 mass ppm or less, more preferably 50,000 mass ppm or less, and more preferably 20,000 mass ppm or less, in that a cell culture substrate having better effects of the present invention can be obtained. It is more preferably at most 17,000 ppm by mass, most preferably at most 12,000 ppm by mass, most preferably at most 7,500 ppm by mass, and even most preferably at most 4,000 ppm by mass. The lower limit of the saturated water content is not particularly limited, but may be 0 mass ppm or more, but is generally preferably 1 mass ppm or more.
When the saturated water content is within the above numerical range, the resulting cell culture substrate tends to form a clearer interface with the aqueous culture medium.
In addition, in this specification, the saturated water content means the value obtained by rounding off to the first decimal place.
なお、カールフィッシャー滴定法は、アルコールの存在下でカールフィッシャー試薬により水分を滴定する公知の方法であり、例えば、電量滴定法が適用できる。本明細書において、「飽和水分量」とは、上記方法により測定される水分含有量を意味する。 Note that Karl Fischer titration is a known method of titrating water using a Karl Fischer reagent in the presence of alcohol, and for example, coulometric titration can be applied. As used herein, "saturated water content" means water content measured by the above method.
特定塩を構成するカチオンとしては特に制限されず、公知のカチオンが使用できる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、有機カチオン、及び、金属錯体カチオンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、有機カチオンを含有することが好ましく、有機カチオンからなることが好ましい。なお、本明細書において、有機カチオンとは、金属原子を含有せず、炭素原子を少なくとも１つ有するカチオンを意味する。 The cation constituting the specific salt is not particularly limited, and any known cation can be used. Among them, at least one kind selected from the group consisting of organic cations and metal complex cations is preferable in that a cell culture substrate having more excellent effects of the present invention can be obtained, and it is preferable to use at least one type selected from the group consisting of organic cations and metal complex cations. Preferably, it is composed of an organic cation. In addition, in this specification, an organic cation means a cation which does not contain a metal atom and has at least one carbon atom.
有機カチオンとしては特に制限されないが、例えば、オニウム等が挙げられる。より具体的には、アンモニウムイオン（例えば、ＲＡ ４Ｎ＋）、イミニウムイオン（例えば、ＲＢ ２Ｃ＝Ｎ＋Ｒ１ ２）、スルホニウムイオン（例えば、ＲＡ ３Ｓ＋）、オキソニウムイオン（例えば、ＲＡ ２Ｏ＋）、ホスホニウムイオン（代表構造：ＲＡ ４Ｐ＋）、ヨードニウムイオン（例えば、ＲＡ ２Ｉ＋）等が挙げられる。なお、上記各式中、ＲＡはアルキル基、アリール基、及び、ヘテロ環基等の置換基を表す。ＲＢは水素原子、又は、１価の置換基を表す。分子中の複数のＲ１、分子中の複数のＲＢ、又は、分子中のＲＡとＲＢは、互いに結合して環を形成してもよい。また、分子中の２つのＲＡ、又は、２つのＲＢが共同して二重結合の基（例えば、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲＢ）を形成してもよい。 The organic cation is not particularly limited, but includes, for example, onium. More specifically, ammonium ions (e.g., R A 4 N + ), iminium ions (e.g. , R B 2 C=N + R 12 ), sulfonium ions (e.g., R A 3 S + ), oxonium Examples include ions (for example, R A 2 O + ), phosphonium ions (representative structure: R A 4 P + ), iodonium ions (for example, R A 2 I + ), and the like. In addition, in each of the above formulas, R A represents a substituent such as an alkyl group, an aryl group, or a heterocyclic group. R B represents a hydrogen atom or a monovalent substituent. A plurality of R 1 in a molecule, a plurality of RB in a molecule, or RA and RB in a molecule may be bonded to each other to form a ring. Furthermore, two R A or two R B in the molecule may jointly form a double bond group (for example, =O, =S, =NR B ).
金属錯体カチオンとしては特に制限されないが、フェロセン系、コバルトセン系、ルテニウム系、並びに、リチウム、及び、ナトリウム等の高ルイス酸性をクラウンエーテル等の配位によって下げた溶媒和イオン等が挙げられる。 Examples of metal complex cations include, but are not particularly limited to, ferrocene-based, cobaltocene-based, ruthenium-based, and solvated ions in which the high Lewis acidity of lithium, sodium, etc. is lowered by coordination with crown ethers, etc.
特定塩をカチオンの他の形態としては、アンモニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、オキサゾリウムイオン、オキサゾリニウムイオン、イミダゾリウムイオン、チアゾリウムイオン、及び、ホスホニウムイオン等が好ましく、アンモニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、ピリジニウムイオン、及び、イミダゾリウムイオンがより好ましく、細胞に対する毒性がより低い点で、ホスホニウムイオンが更に好ましい。 Other preferred forms of the specific salt cation include ammonium ion, pyrrolidinium ion, pyridinium ion, piperidinium ion, oxazolium ion, oxazolinium ion, imidazolium ion, thiazolium ion, and phosphonium ion. Ammonium ions, pyrrolidinium ions, piperidinium ions, pyridinium ions, and imidazolium ions are more preferred, and phosphonium ions are even more preferred since they have lower toxicity to cells.
・アンモニウムイオン
アンモニウムイオンとしては、例えば、以下の式１で表されるカチオンが挙げられる。
式１中、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ１はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ１の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。 In Formula 1, R 1 each independently represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and a plurality of R 1 may be the same or different. The monovalent substituent for R 1 is not particularly limited, but includes, for example, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms and which may contain a hetero atom.
・ピロリジニウムイオン
ピロリジニウムイオンとしては、例えば、以下の式２で表されるカチオンが挙げられる。
式２中、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ２はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ２の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。 In Formula 2, R 2 each independently represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and a plurality of R 2 may be the same or different. The monovalent substituent for R 2 is not particularly limited, but includes, for example, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms and which may contain a hetero atom.
・ピペリジニウムイオン
ピペリジニウムイオンとしては、例えば、以下の式３で表されるカチオンが挙げられる。
式３中、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ３の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。 In Formula 3, R 3 each independently represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and a plurality of R 3 may be the same or different. The monovalent substituent for R 3 is not particularly limited, but includes, for example, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms and which may contain a hetero atom.
・ピリジニウムイオン
ピリジニウムイオンとしては、例えば、以下の式４で表されるカチオンが挙げられる。
式４中、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ４はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ４の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。 In Formula 4, R 4 each independently represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and a plurality of R 4 may be the same or different. The monovalent substituent for R 4 is not particularly limited, but includes, for example, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms and which may contain a hetero atom.
・イミダゾリウムイオン
イミダゾリウムイオンとしては、例えば、以下の式５で表されるカチオンが挙げられる。
式５中、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ５はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ５の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。 In Formula 5, R 5 each independently represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and a plurality of R 5 may be the same or different. The monovalent substituent for R 5 is not particularly limited, but includes, for example, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms and which may contain a hetero atom.
・ホスホニウムイオンとしては、例えば、以下の式６で表されるカチオンが挙げられる。
式６中、Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ６はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ６の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。 In Formula 6, each R 6 independently represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and a plurality of R 6 may be the same or different. The monovalent substituent for R 6 is not particularly limited, but includes, for example, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms and which may contain a hetero atom.
Ｒ６の炭化水素基としては特に制限されないが、炭素数が１～１５の直鎖状のアルキル基が好ましい。なかでも、より得られる細胞培養基材の毒性がより低い点で、炭素数が１～１４が好ましく、１～１２がより好ましく、１～１０が更に好ましく、１～８が特に好ましく、１～６が最も好ましい。 The hydrocarbon group for R 6 is not particularly limited, but a linear alkyl group having 1 to 15 carbon atoms is preferred. Among these, carbon numbers are preferably 1 to 14, more preferably 1 to 12, even more preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 8, and particularly preferably 1 to 14 carbon atoms, because the resulting cell culture substrate has lower toxicity. 6 is most preferred.
複数あるＲ６がそれぞれヘテロ原子を含有してもよい炭素数１～１５の置換又は無置換の炭化水素基である場合、Ｒ６はそれぞれ同一で異なっていてもよいが、得られる塩の融点がより低くなりやすい点で、Ｒ６の少なくとも１つが、他のＲ６とは異なることが好ましい。すなわち、ホスホニウムイオンの対称性がより低いと、得られる塩の融点がより低くなりやすい。
また、得られる塩の融点がより低くなりやすい点では、Ｒ６の炭化水素基の炭素数が５以上であることも好ましい。Ｒ６の炭素数がより多いと、得られる塩の融点がより低くなりやすい。
When each of the plurality of R 6 is a substituted or unsubstituted hydrocarbon group having 1 to 15 carbon atoms which may contain a hetero atom, each R 6 may be the same or different, but the melting point of the resulting salt It is preferable that at least one of R 6 is different from other R 6 in that R 6 tends to be lower. That is, the lower the symmetry of the phosphonium ion, the lower the melting point of the resulting salt tends to be.
It is also preferable that the hydrocarbon group of R 6 has 5 or more carbon atoms, since the melting point of the resulting salt tends to be lower. When the number of carbon atoms in R 6 is larger, the melting point of the obtained salt tends to be lower.
特定塩を構成するアニオンとしては特に制限されず、公知のアニオンが使用できる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、アニオンとしては、ハロゲン原子を含有するアニオンが好ましい。ハロゲン原子としては特に制限されないが、フッ素、又は、臭素が好ましく、フッ素がより好ましい。 The anion constituting the specific salt is not particularly limited, and any known anion can be used. Among these, as the anion, an anion containing a halogen atom is preferable since a cell culture substrate having better effects of the present invention can be obtained. The halogen atom is not particularly limited, but fluorine or bromine is preferable, and fluorine is more preferable.
ハロゲン原子を含有するアニオンとしては特に制限されないが、例えば、以下の式７で表されるアニオンが挙げられる。
式７中、Ｒ７はハロゲン原子、又は、ハロゲン化アルキル基を表し、フッ化アルキル基がより好ましい。複数あるＲ７は同一でも異なってもよい。また、Ｒ７は互いに連結して環を形成してもよい。
Ｒ７のフッ化アルキル基としては特に制限されないが、得られる細胞培養基材がより優れた疎水性を有する点で、Ｒ７はパーフルオロアルキル基であることが好ましい。
In formula 7, R 7 represents a halogen atom or a halogenated alkyl group, and a fluorinated alkyl group is more preferable. A plurality of R 7 's may be the same or different. Further, R 7 may be connected to each other to form a ring.
Although the fluorinated alkyl group of R 7 is not particularly limited, it is preferable that R 7 is a perfluoroalkyl group since the resulting cell culture substrate has better hydrophobicity.
上記アニオンの具体例としては、ビス(フルオロスルフォニル)イミド（ＦＳＩ）、ビス(トリフルオロメタンスルフォニル)イミド（ＴＦＳＩ）、ビス(ペンタフルオロエチルスルフォン)イミド（ＢＥＴＩ）、Ｎ，Ｎ－ビス（ノナフルオロブタンスルフォニル)イミド（ＮＦＳＩ）、及び、Ｎ，Ｎ－ヘキサフルオロプロパン－１，３－ジスルフォニルイミド（ｃＴＦＳＩ）等が挙げられる。 Specific examples of the above anions include bis(fluorosulfonyl)imide (FSI), bis(trifluoromethanesulfonyl)imide (TFSI), bis(pentafluoroethylsulfone)imide (BETI), and N,N-bis(nonafluorobutane). Sulfonyl)imide (NFSI), N,N-hexafluoropropane-1,3-disulfonylimide (cTFSI), and the like.
また、上記以外のアニオンとしては、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、ＢＦ４ －、ＢＦ３Ｃ２Ｆ５ －、ＰＦ６ －、ＮＯ３ －、ＣＦ３ＣＯ２ －、ＣＦ３ＳＯ３ －、及び、（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ－等も使用可能である。 In addition, anions other than the above include Cl − , Br − , I − , BF 4 − , BF 3 C 2 F 5 − , PF 6 − , NO 3 − , CF 3 CO 2 − , CF 3 SO 3 − , and (CF 3 SO 2 ) 3 C - , etc. can also be used.
（水分）
本細胞培養基材は後述する高分子化合物を含有しない場合、実質的に水分を含有しないことが好ましい。細胞培養基材が、実質的に水を含有しないとは、吸着水のように平衡的に存在し得る水分以外には、細胞培養基材の原料へ意図的に添加された水分、及び、細胞培養基材の調製時に意図的に添加された水分がないことを意味している。
細胞培養基材の水分含有量は、細胞培養基材が後述する高分子化合物を含有しない場合、すでに説明した特定塩の飽和水分量と同程度であることが好ましく、具体的には、細胞培養基材の全質量に対して１０質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１．２質量％以下が更に好ましく、０．７５質量％以下が特に好ましい。
(moisture)
When the present cell culture substrate does not contain the polymer compound described below, it is preferable that it does not substantially contain water. The cell culture substrate does not contain substantially any water, other than moisture that may exist in equilibrium such as adsorbed water, and water intentionally added to the raw material of the cell culture substrate and cells. This means that there is no water intentionally added during the preparation of the culture substrate.
The moisture content of the cell culture substrate is preferably about the same as the saturated moisture content of the specific salt described above, if the cell culture substrate does not contain the polymer compound described below. It is preferably 10% by mass or less, more preferably 2% by mass or less, even more preferably 1.2% by mass or less, particularly preferably 0.75% by mass or less, based on the total mass of the base material.
一方、本細胞培養基材が、後述する高分子化合物を含有する場合、本細胞培養基材中における水分含有量としては特に制限されないが、一実施形態として、８０質量％以下であるものが挙げられる。なお、本明細書における細胞培養基材中の水分含有量とはカールフィッシャー滴定法により測定される水分含有量を意味する。 On the other hand, when the present cell culture substrate contains a polymer compound described below, the water content in the present cell culture substrate is not particularly limited, but as one embodiment, it may be 80% by mass or less. It will be done. In addition, the water content in the cell culture substrate in this specification means the water content measured by Karl Fischer titration method.
本細胞培養基材は実質的に水分を含有しないことが好ましい。言い換えれば、本細胞培養基材は疎水性であることが好ましく、これにより、水分を含有する培養液、典型的には、細胞の培養に必要な栄養成分と、水と、を含有する液体とより混和、及び／又は、上記液体により溶解しにくく、結果として、上記液体と本細胞培養基材の界面が形成され、上記界面にて細胞を接着培養（二次元培養）できる。 Preferably, the present cell culture substrate contains substantially no water. In other words, the present cell culture substrate is preferably hydrophobic, so that it can be used in a culture medium containing water, typically a liquid containing water and nutritional components necessary for culturing the cells. As a result, an interface between the liquid and the cell culture substrate is formed, and cells can be cultured in an adhesive manner (two-dimensional culture) at the interface.
〔その他の成分〕
本細胞培養基材はすでに説明した特定塩を含有していれば、本発明の効果を奏する範囲内において他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例えば、高分子化合物、界面活性剤、色素、有機溶剤、有機/無機微粒子、カーボンナノチューブ、及び、グラフェン等の含炭素化合物、層状化合物、繊維、及び、コロイド微粒子等が挙げられる。
[Other ingredients]
As long as the present cell culture substrate contains the specific salt described above, it may contain other components within the range that achieves the effects of the present invention. Examples of other components include polymer compounds, surfactants, pigments, organic solvents, organic/inorganic fine particles, carbon nanotubes, carbon-containing compounds such as graphene, layered compounds, fibers, and colloidal fine particles. It will be done.
＜高分子化合物＞
本細胞培養基材は、高分子化合物を含有してもよい。細胞培養基材が高分子化合物を含有する場合、得られる細胞培養基材の粘弾性がより調整しやすい点で好ましい。また、高分子化合物の特性に対応した機能を細胞培養基材に付与できる。高分子化合物の特性としては、例えば、光、及び／又は、熱に対する応答性等が挙げられる。
<High molecular compound>
This cell culture substrate may contain a polymer compound. When the cell culture substrate contains a polymer compound, it is preferable because the viscoelasticity of the resulting cell culture substrate can be more easily adjusted. Furthermore, functions corresponding to the characteristics of the polymer compound can be imparted to the cell culture substrate. The characteristics of the polymer compound include, for example, responsiveness to light and/or heat.
本細胞培養基材中における高分子化合物の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、一般に、本細胞培養基材が含有する特定塩の１００質量部に対して、０．００１～５０質量部が好ましい。なお、本細胞培養基材は、高分子化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。本細胞培養基材が、２種以上の高分子化合物を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。 The content of the polymer compound in the present cell culture substrate is not particularly limited, but in general, the specific content contained in the present cell culture substrate It is preferably 0.001 to 50 parts by weight per 100 parts by weight of the salt. In addition, this cell culture substrate may contain one type of polymer compound independently, and may contain two or more types. When the present cell culture substrate contains two or more types of polymer compounds, it is preferable that the total content is within the above numerical range.
高分子化合物としては特に制限されず、公知の高分子化合物が使用できる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、ラジカル重合可能なエチレン性不飽和基を有するモノマーに基づく繰り返し単位（以下、単に、「単位１」ともいう。）を有する高分子化合物が好ましい。
エチレン性不飽和基としては特に制限されないが、例えば、（メタ）アクリロイル基、スチリル基、及び、アリル基等が挙げられる。
The polymer compound is not particularly limited, and any known polymer compound can be used. Among them, a repeating unit based on a monomer having a radically polymerizable ethylenically unsaturated group (hereinafter also simply referred to as "unit 1") has the advantage that a cell culture substrate having better effects of the present invention can be obtained. ) is preferred.
Examples of the ethylenically unsaturated group include, but are not particularly limited to, a (meth)acryloyl group, a styryl group, an allyl group, and the like.
単位１としては、特に制限されないが、例えば、下記式８ａ、及び、８ｂで表される繰り返し単位が挙げられる。
式８ａ中、Ｒ８１は、水素原子、又は、アルキル基を表し、Ｌ８は２価の連結基を表し、２価の連結基としては特に制限されないが、－Ｏ－、－Ｓ－又は、－ＮＲ－（Ｒは水素原子、又は、１価の置換基）が好ましく、－Ｏ－、又は、－ＮＲ－がより好ましい。 In formula 8a, R 81 represents a hydrogen atom or an alkyl group, and L 8 represents a divalent linking group, and the divalent linking group is not particularly limited, but may include -O-, -S-, or -NR- (R is a hydrogen atom or a monovalent substituent) is preferred, and -O- or -NR- is more preferred.
Ｒ８２は、水素原子、又は、１価の置換基を表し、１価の置換基としては、直鎖状、分岐鎖状、又は、環状のアルキル基、アルケニル基、又は、アルキニル基；フェニル基、ベンジル基、トリル基、及び、キシリル基等のアリール基；モルフォリノ基；等が挙げられる。Ｒ８２の１価の置換基が有する炭素数としては特に制限されないが、１～２０が好ましい。 R 82 represents a hydrogen atom or a monovalent substituent, and examples of the monovalent substituent include a linear, branched, or cyclic alkyl group, alkenyl group, or alkynyl group; phenyl group , aryl groups such as benzyl group, tolyl group, and xylyl group; morpholino group; and the like. The number of carbon atoms in the monovalent substituent R 82 is not particularly limited, but is preferably 1 to 20.
なかでも、特定塩とのより優れた相溶性を有し、より均一な細胞培養基材が得られる点で、Ｒ８２としては、直鎖状、又は、分岐鎖状のアルキル基が好ましく、アルキル基の炭素数としては特に制限されないが、より均一な細胞培養基材が得られる点で、１～６がより好ましく、１～５がより好ましい。 Among these, R82 is preferably a linear or branched alkyl group, since it has better compatibility with the specific salt and provides a more uniform cell culture substrate. The number of carbon atoms in the group is not particularly limited, but it is more preferably from 1 to 6, and more preferably from 1 to 5, since a more uniform cell culture substrate can be obtained.
また、特定塩とのより優れた相溶性を有し、より均一な細胞培養基材が得られる点で、Ｌ８が－ＮＲ－である場合、Ｒは１価の置換基が好ましく、更に、Ｒ８２が１価の置換基であることがより好ましい。上記Ｒの１価の置換基としては特に制限されないが、Ｒ８２の１価の置換基が挙げられる。
なかでも、Ｌ８が－ＮＲ－である場合、Ｒ及びＲ８２がそれぞれ直鎖状、又は、分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、アルキル基の炭素数としては特に制限されないが、１～６が好ましく、１～５がより好ましい。上記の理由としては必ずしも明らかではないが、Ｒ、及び、Ｒ８２が１価の置換基である場合、水素結合供与性がより低くなるため、特定塩（特に疎水性のイオン液体である特定塩）に対するより優れた相溶性が得られたものと推測される。
Furthermore, when L 8 is -NR-, R is preferably a monovalent substituent, since it has better compatibility with the specific salt and a more uniform cell culture substrate can be obtained; More preferably, R 82 is a monovalent substituent. The monovalent substituent for R is not particularly limited, but includes the monovalent substituent for R82 .
Among these, when L 8 is -NR-, it is preferable that R and R 82 are each a linear or branched alkyl group, and the number of carbon atoms in the alkyl group is not particularly limited, but 1 -6 is preferred, and 1-5 is more preferred. Although the reason for the above is not necessarily clear, when R and R82 are monovalent substituents, the hydrogen bond donating property becomes lower. ) is presumably obtained.
式８ｂ中、Ｒ８３は、水素原子、又は、アルキル基を表し、Ｒ８４はハロゲン原子、又は、１価の置換基を表し、ｎは０～５の整数を表す。
１価の置換基としては特に制限されず、例えば、式８ａのＲ８２の１価の置換基として説明した置換基が挙げられる。
In formula 8b, R 83 represents a hydrogen atom or an alkyl group, R 84 represents a halogen atom or a monovalent substituent, and n represents an integer of 0 to 5.
The monovalent substituent is not particularly limited, and includes, for example, the substituent described as the monovalent substituent for R 82 in Formula 8a.
より具体的には、単位１としては以下の式に示す単位が挙げられる。
高分子化合物の製造方法としては特に制限されず、公知の製造方法が適用可能である。なかでも、エチレン性不飽和基を有するモノマーと重合開始剤とを含有する重合性組成物にエネルギー（熱、及び／又は、光等）を照射して、重合させて得る方法が好ましい。 The method for producing the polymer compound is not particularly limited, and any known production method can be applied. Among these, preferred is a method in which a polymerizable composition containing a monomer having an ethylenically unsaturated group and a polymerization initiator is irradiated with energy (heat, light, etc.) and polymerized.
＜重合性組成物＞
重合性組成物は、モノマーと重合開始剤とを含有する。重合性組成物が含有するエチレン性不飽和基を有するモノマーとしては、単官能重合性化合物、及び、多官能重合性化合物が挙げられる。重合性組成物は、単官能重合性化合物、及び、多官能重合性化合物のいずれか一方を含有してればよいが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、重合性組成物は、単官能重合性化合物と、多官能重合性化合物とを含有することが好ましい。なお、重合性組成物は、単官能重合性化合物、及び／又は、多官能重合性化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。
なお、重合性組成物は上記以外の成分を含有してもよい。
<Polymerizable composition>
The polymerizable composition contains a monomer and a polymerization initiator. Examples of the monomer having an ethylenically unsaturated group contained in the polymerizable composition include monofunctional polymerizable compounds and polyfunctional polymerizable compounds. The polymerizable composition may contain either a monofunctional polymerizable compound or a polyfunctional polymerizable compound, but it is preferable that the composition contains either a monofunctional polymerizable compound or a polyfunctional polymerizable compound, but in that a cell culture substrate having better effects of the present invention can be obtained. The polymerizable composition preferably contains a monofunctional polymerizable compound and a polyfunctional polymerizable compound. In addition, the polymerizable composition may contain one kind of a monofunctional polymerizable compound and/or a polyfunctional polymerizable compound alone, or may contain two or more kinds thereof.
Note that the polymerizable composition may contain components other than those listed above.
重合性組成物が多官能重合性化合物を含有する場合、得られる高分子化合物が３次元網目構造を有しやすく、上記の特定塩によって膨潤したゲル状の細胞培養基材が得られやすい。 When the polymerizable composition contains a polyfunctional polymerizable compound, the resulting polymer compound tends to have a three-dimensional network structure, and a gel-like cell culture substrate swollen by the above-mentioned specific salt is likely to be obtained.
（単官能重合性化合物）
単官能重合性化合物としては、例えば、メチル（メタ）アクリレ－ト、エチル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート、ｎ－ヘキシル（メタ）アクリレート、シクロキシル（メタ）アクリレート、ｎ－デシル（メタ）アクリレート、ｎ－ドデシル（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、及び、ジメチルアミノメチルメタクリレート等の（メタ）アクリレ－ト化合物；
アリルグリシジルエ－テル等のアリル化合物；
スチレン、α－メチルスチレン、４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレン、ビニルトルエン、及び、４－（クロロメチル）スチレン等のスチレン化合物；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチル（メタ）アクリルアミド、及び、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド等のアクリルアミド系化合物；等が挙げられる。
(Monofunctional polymerizable compound)
Examples of monofunctional polymerizable compounds include methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, isopropyl (meth)acrylate, n-butyl (meth)acrylate, tert-butyl (meth)acrylate, n-hexyl ( meth)acrylate, cycloxyl(meth)acrylate, n-decyl(meth)acrylate, n-dodecyl(meth)acrylate, allyl(meth)acrylate, glycidyl(meth)acrylate, benzyl(meth)acrylate, and dimethylaminomethyl methacrylate (meth)acrylate compounds such as;
Allyl compounds such as allyl glycidyl ether;
Styrene compounds such as styrene, α-methylstyrene, 4-tert-butylstyrene, vinyltoluene, and 4-(chloromethyl)styrene;
Acrylamide-based compounds such as (meth)acrylamide, N,N-dimethyl(meth)acrylamide, N,N-diethyl(meth)acrylamide, and N-isopropyl(meth)acrylamide; and the like.
（多官能重合性化合物）
エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１－（アクリロイルオキシ）－３－（メタクリロイルオキシ）－２－プロパノール、１，３－ブチレングリコールジメタクリレート、ノナンジオールジアクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、１，１２－ドデカンジオールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、ジペンタエリスリトールテトラアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、オリゴエステルアクリレート、テトラメチロールメタントリアクリレート、ジメチロールトリシクロデカンジアクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、及び、２，２－ビス（４－メタクリロキシポリエトキシフェニル）プロパン等の（メタ）アクリレート化合物；メチレンビスアクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；等が挙げられる。
(Polyfunctional polymerizable compound)
Ethylene glycol di(meth)acrylate, polyethylene glycol di(meth)acrylate, tripropylene glycol di(meth)acrylate, 1-(acryloyloxy)-3-(methacryloyloxy)-2-propanol, 1,3-butylene glycol di(meth)acrylate Methacrylate, nonanediol diacrylate, diethylene glycol dimethacrylate, 1,12-dodecanediol dimethacrylate, polyethylene glycol diacrylate, polypropylene glycol diacrylate, dipentaerythritol tetraacrylate, trimethylolpropane triacrylate, oligoester acrylate, tetramethylolmethane triacrylate (meth)acrylate compounds such as acrylate, dimethylol tricyclodecane diacrylate, polypropylene glycol dimethacrylate, and 2,2-bis(4-methacryloxypolyethoxyphenyl)propane; (meth)acrylamide compounds such as methylenebisacrylamide ; etc.
重合性組成物が含有するモノマー中の単官能重合性化合物と多官能重合性化合物の比率としては特に制限されないが、重合性組成物中における単官能重合性化合物の含有量を１００質量部としたとき、多官能重合性化合物の含有量が０．００１～５０質量部であることが好ましい。 Although the ratio of the monofunctional polymerizable compound and the polyfunctional polymerizable compound in the monomer contained in the polymerizable composition is not particularly limited, the content of the monofunctional polymerizable compound in the polymerizable composition is 100 parts by mass. In this case, the content of the polyfunctional polymerizable compound is preferably 0.001 to 50 parts by mass.
（重合開始剤）
重合開始剤としては、特に制限されず、公知の熱重合開始剤、及び／又は、光重合開始剤が使用できる。
熱重合開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物、及び、過酸化ベンゾイル等の過酸化物等が挙げられる。
光重合開始剤としては、例えば、ベンゾフェノン、ミヒラーズケトン、キサントン、及び、チオキサントン等の芳香族ケトン化合物；２－エチルアントラキノン等のキノン化合物；アセトフェノン、トリクロロアセトフェノン、２－ヒドロキシ－２－メチルプロピオフェノン、１－ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、ベンゾインエーテル、２，２－ジエトキシアセトフェノン、及び、２，２－ジメトキシー２－フェニルアセトフェノン等のアセトフェノン化合物；メチルベンゾイルホルメート等のジケトン化合物；１－フェニル－１，２－プロパンジオン－２－（Ｏ－ベンゾイル）オキシム等のアシルオキシムエステル化合物；２，４，６－トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキシド等のアシルホスフィンオキシド化合物；テトラメチルチウラム、及び、ジチオカーバメート等のイオウ化合物；過酸化ベンゾイル等の有機化酸化物；アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物；有機スルフォニウム塩化合物；ヨードニウム塩化合物；フォスフォニウム化合物；等が挙げられる。
(Polymerization initiator)
The polymerization initiator is not particularly limited, and known thermal polymerization initiators and/or photopolymerization initiators can be used.
Examples of the thermal polymerization initiator include azo compounds such as azobisisobutyronitrile, and peroxides such as benzoyl peroxide.
Examples of the photopolymerization initiator include aromatic ketone compounds such as benzophenone, Michler's ketone, xanthone, and thioxanthone; quinone compounds such as 2-ethylanthraquinone; acetophenone, trichloroacetophenone, 2-hydroxy-2-methylpropiophenone, Acetophenone compounds such as 1-hydroxycyclohexylphenyl ketone, benzoin ether, 2,2-diethoxyacetophenone, and 2,2-dimethoxy2-phenylacetophenone; diketone compounds such as methylbenzoylformate; 1-phenyl-1,2 - Acyl oxime ester compounds such as propanedione-2-(O-benzoyl) oxime; acylphosphine oxide compounds such as 2,4,6-trimethylbenzoyldiphenylphosphine oxide; sulfur compounds such as tetramethylthiuram and dithiocarbamate; Examples include organic oxides such as benzoyl peroxide; azo compounds such as azobisisobutyronitrile; organic sulfonium salt compounds; iodonium salt compounds; and phosphonium compounds.
重合開始剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。重合性組成物中における重合開始剤の含有量は、重合性組成物の全質量に対して、０．００１～１０質量％が好ましい。 One type of polymerization initiator can be used alone or two or more types can be used in combination. The content of the polymerization initiator in the polymerizable composition is preferably 0.001 to 10% by mass based on the total mass of the polymerizable composition.
高分子化合物の調製方法としては特に制限されず、公知の調製方法が使用できる。なかでも、ゲル状の細胞培養基材が得られやすい点で、上記重合性組成物を特定塩（特にイオン液体が好ましい）に分散、及び／又は、溶解させた複合物を得て、上記複合物にエネルギー付与（加熱、及び／又は、光照射）することが好ましい。 The method for preparing the polymer compound is not particularly limited, and any known preparation method can be used. In particular, since it is easy to obtain a gel-like cell culture substrate, the above-mentioned polymerizable composition is dispersed and/or dissolved in a specific salt (especially preferably an ionic liquid) to obtain a composite. It is preferable to impart energy (heating and/or light irradiation) to the object.
＜界面活性剤＞
本細胞培養基材は、界面活性剤を含有していてもよい。細胞培養基材が界面活性剤を含有する場合、後述する培養液と本細胞培養基材とを混合して分散させて典型的にはｗ／ｏエマルジョンを形成させて、細胞培養基材の表面積をより増加させて、より集積的な培養が可能になる。
<Surfactant>
This cell culture substrate may contain a surfactant. If the cell culture substrate contains a surfactant, the culture solution described below and the cell culture substrate are mixed and dispersed, typically to form a w/o emulsion, and the surface area of the cell culture substrate is By increasing the number of cells, more intensive culture becomes possible.
本細胞培養基材における界面活性剤の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、一般に細胞培養基材の全質量に対して、０．０００１～１０質量％が好ましい。なお、細胞培養基材は、界面活性剤の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。細胞培養基材が、２種以上の界面活性剤を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。 The content of the surfactant in the present cell culture substrate is not particularly limited, but in general, the content of the surfactant relative to the total mass of the cell culture substrate is It is preferably 0.0001 to 10% by mass. In addition, the cell culture substrate may contain one type of surfactant alone, or may contain two or more types of surfactants. When the cell culture substrate contains two or more types of surfactants, it is preferable that the total content is within the above numerical range.
界面活性剤としては特に制限されず、公知の界面活性剤が使用できる。界面活性剤としては、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、及び、ノニオン系界面活性剤が挙げられる The surfactant is not particularly limited, and any known surfactant can be used. Examples of surfactants include anionic surfactants, cationic surfactants, and nonionic surfactants.
（形状）
本細胞培養基材の形状としては特に制限されない。本細胞培養基材が固体、又は、ゲル状であれば、フィルム状、皿状、ボトル状、チューブ状、太さ５ｎｍ～５ｍｍの糸又は棒状、袋状、ウェルプレート状、多孔質膜状、及び、粒径が１～２０００μｍの球状等が挙げられる。
(shape)
The shape of the present cell culture substrate is not particularly limited. If the cell culture substrate is solid or gel-like, it may be in the form of a film, a dish, a bottle, a tube, a thread or rod with a thickness of 5 nm to 5 mm, a bag, a well plate, a porous membrane, etc. and spherical particles with a particle size of 1 to 2000 μm.
なかでも、細胞培養基材が含有する特定塩がイオン液体である場合、培地中に本細胞培養基材が分散した形態（典型的にはｏ／ｗエマルジョン）が好ましい。本細胞培養基材が培地中に分散したパーティクル状である場合、培地と本細胞培養基材との界面の面積がより大きくなり、細胞を二次元培養可能な面積がより大きくなるため、好ましい。 Among these, when the specific salt contained in the cell culture substrate is an ionic liquid, a form in which the cell culture substrate is dispersed in a medium (typically an o/w emulsion) is preferable. When the present cell culture substrate is in the form of particles dispersed in the medium, the area of the interface between the medium and the present cell culture substrate becomes larger, and the area in which cells can be two-dimensionally cultured becomes larger, which is preferable.
〔細胞培養基材の製造方法〕
本細胞培養基材の製造方法としては特に制限されず、上記の各成分を混合すればよい。混合の方法としては特に制限されず、公知の混合方法が適用できる。
なかでも、より簡便に本細胞培養基材が得られる点で、本細胞培養基材の製造方法は、特定塩を合成する工程と、必要に応じてその他の成分を添加する工程と、を有することが好ましい。以下では、上記各工程について使用する特定塩がイオン液体である場合を例に説明するが、イオン液体以外である場合も同様である。
[Method for manufacturing cell culture substrate]
The method for producing the present cell culture substrate is not particularly limited, and the above-mentioned components may be mixed. The mixing method is not particularly limited, and any known mixing method can be applied.
Among these, the method for producing the cell culture substrate has the steps of synthesizing a specific salt and adding other components as necessary, since the cell culture substrate can be obtained more easily. It is preferable. In the following, a case where the specific salt used in each of the above steps is an ionic liquid will be described as an example, but the same applies to cases where the specific salt is other than an ionic liquid.
イオン液体を合成する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。イオン液体を合成する方法としては、例えば、特開２０１８－６２５１４号公報の０１０７～０１２５段落に記載の方法が挙げられ、上記内容は本明細書に組み込まれる。 The method for synthesizing the ionic liquid is not particularly limited, and any known method can be used. Examples of the method for synthesizing the ionic liquid include the method described in paragraphs 0107 to 0125 of JP-A No. 2018-62514, the contents of which are incorporated herein.
その他の成分を添加する工程としては特に制限されず、上記で得られたイオン液体に所定の成分を添加すればよい。なかでも、細胞培養基材が高分子化合物を含有する場合、イオン液体に重合性組成物（モノマー及び重合開始剤等）を分散、及び／又は、溶解させ、複合物を調製し、上記複合物にエネルギー付与（加熱、及び／又は、光照射）することが好ましい。 The step of adding other components is not particularly limited, and predetermined components may be added to the ionic liquid obtained above. In particular, when the cell culture substrate contains a polymer compound, a composite is prepared by dispersing and/or dissolving a polymerizable composition (monomer, polymerization initiator, etc.) in an ionic liquid, and the above-mentioned composite is It is preferable to apply energy (heating and/or light irradiation) to.
〔用途〕
本細胞培養基材によれば、細胞を二次元培養することができる。より具体的には、細胞培養基材と後述する培養液との界面において、細胞を細胞培養基材に接着、伸展させることができる。
[Application]
According to this cell culture substrate, cells can be two-dimensionally cultured. More specifically, cells can be adhered to and spread on the cell culture substrate at the interface between the cell culture substrate and the culture solution described below.
＜細胞＞
本細胞培養基材に適用可能な細胞としては特に制限されないが、動物細胞、及び、植物細胞からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、動物細胞がより好ましい。細胞は、生体から得られた細胞であってもよいし、公知の方法により得られた樹立細胞株であってもよい。
<Cell>
Cells applicable to the present cell culture substrate are not particularly limited, but at least one type selected from the group consisting of animal cells and plant cells is preferred, and animal cells are more preferred. The cells may be cells obtained from a living body, or may be established cell lines obtained by known methods.
動物細胞としては、由来は動物であればよく、動物としては特に制限されないが、ヒト、マウス、及び、サル等が挙げられる。細胞の種類としては特に制限されないが、ヒト由来であれば、ヒトＥＳ細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト組織細胞、及び、ヒト樹立細胞株等が挙げられる。 The animal cell may be of animal origin, and the animal is not particularly limited, but includes humans, mice, monkeys, and the like. The cell type is not particularly limited, but human-derived cells include human ES cells, human mesenchymal stem cells, human tissue cells, human established cell lines, and the like.
細胞種としては特に限定されないが、樹状細胞等の免疫細胞；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び、誘導多様性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞；生体から採取した組織等に由来する初代培養細胞；種々のがん細胞等が挙げられる。 Cell types include, but are not limited to, immune cells such as dendritic cells; stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced diversified stem cells (iPS cells); primary culture derived from tissues collected from living bodies, etc. Cells: Examples include various cancer cells.
また、細胞種としては、上皮細胞（角膜上皮細胞等）、内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞等）、線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞、及び、マウス線維芽細胞等）、血球細胞、収縮性細胞（骨格筋細胞、及び、心筋細胞等）、血液・免疫細胞（赤血球、及び、マクロファージ等）、神経細胞（ニューロン、及び、グリア細胞等）、色素細胞（網膜色素細胞等）、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、並びに、幹細胞（造血幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ）細胞、ＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ）細胞、及び、神経幹細胞等）等であってもよい。 Cell types include epithelial cells (corneal epithelial cells, etc.), endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells, etc.), fibroblasts (human dermal fibroblasts, mouse fibroblasts, etc.), blood cells, and contractile cells. Sex cells (skeletal muscle cells, cardiomyocytes, etc.), blood/immune cells (red blood cells, macrophages, etc.), nerve cells (neurons, glial cells, etc.), pigment cells (retinal pigment cells, etc.), liver cells , chondrocytes, osteoblasts, stem cells (hematopoietic stem cells, skin stem cells, reproductive stem cells, EC (embryonal carcinoma) cells, EG (embryonic germ) cells, neural stem cells, etc.).
また、植物細胞としては、特に制限されず、任意の組織に由来する植物細胞を使用でき、例えば、胚、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎、及び、組織培養物等に由来する植物細胞を使用できる。 Furthermore, the plant cells are not particularly limited, and plant cells derived from any tissue can be used, such as embryos, callus, pollen, leaves, anthers, roots, root tips, flowers, seeds, pods, stems, and Plant cells derived from , tissue culture, etc. can be used.
［細胞培養方法］
本発明の実施形態に係る細胞培養方法は、すでに説明した細胞培養基材に細胞を接着させて培養する細胞培養方法である。
[Cell culture method]
The cell culture method according to the embodiment of the present invention is a cell culture method in which cells are adhered to and cultured on the cell culture substrate described above.
〔細胞培養器〕
図１は本発明の実施形態に係る細胞培養器の一例を示す斜視図であり、図２は、上記細胞培養器のＡＡ′断面模式図である。細胞培養器１００は、支持体１０１と支持体上に配置された細胞培養基材１０２を有しており、更に、細胞培養基材１０２上には、培養液１０３が重層されている。
[Cell culture vessel]
FIG. 1 is a perspective view showing an example of a cell culture device according to an embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a schematic cross-sectional view along line AA' of the cell culture device. The cell culture device 100 has a support 101 and a cell culture substrate 102 placed on the support, and a culture solution 103 is further layered on the cell culture substrate 102.
支持体１０１は、細胞培養基材、及び、添加される培養液を支持する機能を有する部材であり、典型的には容器である。支持体１０１の材料としては特に制限されず、公知の材料が使用可能である。細胞培養基材の材料としては、有機材料、無機材料、及び、これらの複合物が挙げられる。
有機材料としては特に制限されないが、樹脂が挙げられる。樹脂としては、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂、パーフルオロカーボン系樹脂、及び、エポキシ樹脂等が挙げられる。
無機材料としては特に制限されないが、ガラス、及び、金属等が挙げられる。
The support 101 is a member having a function of supporting a cell culture substrate and a culture solution to be added, and is typically a container. The material for the support body 101 is not particularly limited, and known materials can be used. Materials for the cell culture substrate include organic materials, inorganic materials, and composites thereof.
Organic materials include, but are not limited to, resins. Examples of the resin include styrene resins such as polystyrene, polyolefin resins such as polypropylene, polyurethane resins, polyester resins such as polyethylene terephthalate, perfluorocarbon resins, and epoxy resins.
Inorganic materials include, but are not particularly limited to, glass, metals, and the like.
支持体１０１は皿状であるが、本発明の実施形態に係る細胞培養器に使用できる支持体としては上記に制限されず、フィルム状、膜状、板状、球状、多角形状、棒状、皿状、ボトル状、チューブ、針・糸状、繊維状、袋状、マルチウエルプレート状（例えば、２４穴マイクロプレート）、マイクロ流路状、多孔質膜状、及び、網状等が挙げられる。
また、支持体は、これらを組み合わせた形状でも良いし、特定の形状を有さない不定形状であってもよい。
Although the support 101 is dish-shaped, supports that can be used in the cell culture device according to the embodiment of the present invention are not limited to the above, and include a film shape, a membrane shape, a plate shape, a spherical shape, a polygonal shape, a rod shape, and a dish shape. Examples include shape, bottle shape, tube, needle/thread shape, fiber shape, bag shape, multiwell plate shape (for example, 24-well microplate), microchannel shape, porous membrane shape, and net shape.
Further, the support may have a shape that is a combination of these shapes, or may have an irregular shape that does not have a specific shape.
本細胞培養方法は、まず、細胞培養基材と培養液との界面を形成し、次に、上記培養液に対して、培養対象とする細胞を播種する方法が挙げられる。
細胞培養基材と培養液との界面を形成する方法としては特に制限されず、支持体上に細胞培養基材層を形成し、次に、上記細胞培養基材層上に培養液層を形成する方法であってもよいし、支持体上に培養液層を形成し、次に、上記培養液層上に細胞培養基材層を形成する方法であってもよいし、支持体に収容された培養液に細胞培養基材を分散せてもよいし、支持体に収容された細胞培養基材に培養液を分散させてもよい。
界面の形成方法としては、典型的には、培養液と細胞培養基材とを混合する方法が挙げられる。
The present cell culture method includes a method of first forming an interface between a cell culture substrate and a culture solution, and then seeding the culture solution with cells to be cultured.
The method for forming the interface between the cell culture substrate and the culture medium is not particularly limited, and includes forming a cell culture substrate layer on the support, and then forming a culture medium layer on the cell culture substrate layer. It may be a method of forming a culture solution layer on a support and then forming a cell culture substrate layer on the culture solution layer. The cell culture substrate may be dispersed in a culture solution that has been prepared, or the culture solution may be dispersed in a cell culture substrate housed in a support.
A typical method for forming the interface is a method of mixing a culture solution and a cell culture substrate.
なお、本細胞培養方法は上記以外にも、培養液と混合するまえの細胞培養基材を洗浄する工程、及び、細胞培養基材、及び／又は、培養液を紫外線滅菌する工程等を有していてもよい。 In addition to the above, the present cell culture method includes a step of washing the cell culture substrate before mixing with the culture solution, and a step of sterilizing the cell culture substrate and/or the culture solution with ultraviolet light. You can leave it there.
本細胞培養方法では、本細胞培養基材と培養液と細胞とを共存させ、培養に適した温度に保つことで培養を行うことができる。培養中、培養液は培養期間に応じて交換してもしなくても適宜選択すればよい。また、培養液は静置状態であっても潅流状態であってもよい。 In this cell culture method, culture can be performed by allowing the cell culture substrate, culture medium, and cells to coexist and maintaining the temperature at a temperature suitable for culture. During culture, the culture solution may be replaced or not, depending on the culture period, and may be appropriately selected. Moreover, the culture solution may be in a stationary state or in a perfused state.
＜培養液＞
本細胞培養基材を用いて細胞培養する場合に使用する培養液としては特に制限されないが、水を含有し、更に、糖類、アミノ酸、ビタミン又はその前駆体、無機塩、緩衝化剤、補因子、及び、核酸からなる群より選択される少なくとも１種（以下、基質ともいう。）を含有する培養液が挙げられる。
溶液中における基質の含有量としては特に制限されないが、典型的には培養液の全質量に対して、０．００１～１０質量％が好ましい。なお、培養液は、基質の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。培養液が２種以上の基質を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
また、培養液のｐＨとしては特に制限されないが、一般に６～８が好ましい。
<Culture solution>
The culture medium used when culturing cells using this cell culture substrate is not particularly limited, but may contain water, sugars, amino acids, vitamins or their precursors, inorganic salts, buffers, cofactors, etc. , and a culture solution containing at least one type selected from the group consisting of nucleic acids (hereinafter also referred to as substrate).
Although the content of the substrate in the solution is not particularly limited, it is typically preferably 0.001 to 10% by mass based on the total mass of the culture solution. In addition, the culture solution may contain one type of substrate alone, or may contain two or more types of substrates. When the culture solution contains two or more types of substrates, it is preferable that the total content is within the above numerical range.
Furthermore, the pH of the culture solution is not particularly limited, but is generally preferably 6 to 8.
糖類としては、特に制限されないが、例えば、グルコース、ガラクトース、リボース、及び、フルクトース等の単糖類；スクロース、ラクトース、及び、マルトース等の二糖類；等が挙げられる。 Examples of sugars include, but are not limited to, monosaccharides such as glucose, galactose, ribose, and fructose; disaccharides such as sucrose, lactose, and maltose; and the like.
アミノ酸としては、特に制限されないが、例えば、チロシン、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、及び、Ｄ－アミノ酸等が挙げられる。 Examples of amino acids include, but are not limited to, tyrosine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, and D-amino acids.
無機塩類としては、水溶性の無機塩が好ましく、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、鉛、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、バナジウム、及び、亜鉛等の無機カチオンと、重炭酸イオン、ハロゲン化物イオン、リン酸イオン、及び、硫酸イオン等の無機アニオンの組み合せからなる塩が挙げられる。 The inorganic salts are preferably water-soluble inorganic salts, such as inorganic cations such as calcium, magnesium, potassium, sodium, cobalt, copper, lead, iron, manganese, molybdenum, nickel, vanadium, and zinc, and bicarbonate. Examples include salts consisting of a combination of inorganic anions such as ions, halide ions, phosphate ions, and sulfate ions.
より具体的には、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、リン酸ナトリウム一塩基性無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、リン酸ナトリウム二塩基性無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、及び、硫酸亜鉛七水和物等が挙げられる。 More specifically, copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO 4.5H 2 O), sodium chloride (NaCl), calcium chloride (CaCl 2.2H 2 O), potassium chloride (KCl), iron sulfate ( II), sodium phosphate monobasic anhydride (NaH 2 PO 4 ), magnesium sulfate anhydride (MgSO 4 ), sodium phosphate dibasic anhydride (Na 2 HPO 4 ), magnesium chloride hexahydrate (MgCl 2.6H 2 O) and zinc sulfate heptahydrate.
緩衝化剤としては、例えば、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、及び、ＴＲＩＳ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）等が挙げられる。 Examples of the buffering agent include CO 2 /HCO 3 (carbonate), phosphate, HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonic acid), PIPES (Piperazine-1,4-bis(2- ethanesulfonic acid), ACES (N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid), BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid) d), TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2 -aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid), and TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethane).
補因子としては、例えば、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチド及びその誘導体、グルタチオン、並びに、ヘムヌクレオチドリン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅｓ）及び誘導体等が挙げられる。 Cofactors include, for example, thiamine derivatives, biotin, vitamin C, NAD/NADP, cobalamin, flavin mononucleotides and derivatives thereof, glutathione, and heme nucleotide phophates and derivatives.
核酸としては、例えば、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、及び、ウラシル等の核酸塩基；シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、及び、チミジン等のヌクレオシド；アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、及び、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド；等が挙げられる。 Nucleic acids include, for example, nucleobases such as cytosine, guanine, adenine, thymine, and uracil; nucleosides such as cytidine, uridine, adenosine, guanosine, and thymidine; adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, and adenosine. Nucleotides such as triphosphate; and the like.
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples unless the gist thereof is exceeded.
［実施例１：細胞培養試験］
〔細胞培養基材の準備〕
ビス（フルオロスルフォン）イミド（ＦＳＩ）、ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド（ＴＦＳＩ）、ビス（ペンタフルオロエチルスルフォン）イミド（ＢＥＴＩ）、ビス（ノナフルオロブチルスルフォン）イミド（ＮＦＳＩ）、Ｎ，Ｎ－ヘキサフルオロ－１，３－ジスルフォニルイミド（［ｃＴＦＳＩ］）をリチウム塩として準備した。これを各ハロアルキルホスフォニウムと混合し、を水、又は、エタノール中でイオン交換反応して、イオン液体（特定塩に該当する。）を準備した。また、その他のイオン液体は購入したものを水で３回洗浄した後に用いた。表１には、使用したアニオン、及び、カチオンの一覧を示した。下記表中の各アニオン、及び、各カチオンを組合せたイオン液体を使用して細胞培養基材を調製した。
[Example 1: Cell culture test]
[Preparation of cell culture substrate]
Bis(fluorosulfone)imide (FSI), bis(trifluoromethanesulfonyl)imide (TFSI), bis(pentafluoroethylsulfone)imide (BETI), bis(nonafluorobutylsulfone)imide (NFSI), N,N-hexane Fluoro-1,3-disulfonylimide ([cTFSI]) was prepared as a lithium salt. This was mixed with each haloalkylphosphonium and subjected to an ion exchange reaction in water or ethanol to prepare an ionic liquid (corresponding to a specific salt). In addition, other ionic liquids were purchased and used after washing them three times with water. Table 1 shows a list of the anions and cations used. Cell culture substrates were prepared using ionic liquids that were combinations of each anion and each cation in the table below.
〔飽和水分量測定試験〕
表２に記載したアニオン及びカチオンからなる塩１～１８を調製した。いずれの塩も室温、常圧下で液体であった。各試料の５００μＬに対して過剰量の精製水２５００μＬを添加し、激しく撹拌して、混合液を得た。上記混合液を一晩、室温（２５℃）に静置することで平衡状態に到達させた。次に、静置後の混合液について、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）により二相に完全に分離させた。下相（イオン液体濃厚相）を約３００μＬをピペットで取り出し、カールフィッシャー滴定法により飽和水分量を定量した。結果を表２に示した。
表２に示した結果から、塩１～塩１８の飽和水分量はいずれも所定の範囲内だった。
Salts 1 to 18 consisting of anions and cations listed in Table 2 were prepared. All salts were liquid at room temperature and normal pressure. An excess amount of 2500 μL of purified water was added to 500 μL of each sample, and the mixture was vigorously stirred to obtain a mixed solution. The mixture was allowed to stand at room temperature (25° C.) overnight to reach an equilibrium state. Next, the mixed solution after standing was completely separated into two phases by centrifugation (10,000 rpm, 20 min). Approximately 300 μL of the lower phase (ionic liquid concentrated phase) was taken out with a pipette, and the saturated water content was determined by Karl Fischer titration. The results are shown in Table 2.
From the results shown in Table 2, the saturated water content of Salts 1 to 18 was all within the predetermined range.
〔細胞培養試験〕
プラスチック製２４穴（ｗｅｌｌ）ディッシュに、各細胞培養基材を５００μＬずつ導入し、２５４ｎｍの紫外光を照射し滅菌処理した。次に、ヒト由来フィブロネクチンを１００μｇ／ｍＬの濃度で溶解させたリン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）１ｍＬで細胞培養基材を覆い、３７℃の条件で１５時間静置した。次に、リン酸緩衝液相を除去し、及び、洗浄した。次に、ｈＭＳＣｓ用増殖培地（培養液に該当する）を細胞培養基材上に導入しｈＭＳＣｓ（ヒト間葉系幹細胞）を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種した。
培地は２日に一度程度の頻度で交換し、以後、任意の時間において細胞培養基材と培地との界面上の細胞を観察した。
[Cell culture test]
500 μL of each cell culture substrate was introduced into a 24-well plastic dish, and sterilized by irradiation with 254 nm ultraviolet light. Next, the cell culture substrate was covered with 1 mL of phosphate buffer (pH 7.4) in which human-derived fibronectin was dissolved at a concentration of 100 μg/mL, and left standing at 37° C. for 15 hours. The phosphate buffer phase was then removed and washed. Next, a growth medium for hMSCs (corresponding to a culture solution) was introduced onto the cell culture substrate, and hMSCs (human mesenchymal stem cells) were seeded at 1×10 4 cells/well.
The medium was exchanged approximately once every two days, and cells on the interface between the cell culture substrate and the medium were observed at arbitrary times thereafter.
図３には、特定塩として、［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、１０日間経過後の細胞の光学顕微鏡像を示した。
また、図４には、特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、１０日間経過後の細胞の光学顕微鏡像を示した。なお、図４における黒線で囲った部分は、吸着、及び、伸展した細胞の存在を示している。
FIG. 3 shows an optical microscope image of cells cultured using a cell culture substrate containing [P 4441 ][TFSI] as a specific salt for 10 days.
Moreover, FIG. 4 shows an optical microscope image of cells cultured using a cell culture substrate containing [P 66614 ][TFSI] as a specific salt for 10 days. In addition, the part surrounded by the black line in FIG. 4 shows the presence of adsorbed and stretched cells.
同様に、図５には、特定塩として［Ｐ８８８８］［ＴＦＳＩ］を、図６には、特定塩として［Ｐ６６１４］［ｃＴＦＳＩ］を、図７には、特定塩として［Ｐ８８８８］［ＢＥＴＩ］を、図８には特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＢＥＴＩ］を用いて上記と同様にし７日間培養した細胞の光学顕微鏡写真を示した。
なお、図３～図８において使用した特定塩はいずれもイオン液体だった。
Similarly, FIG. 5 shows [P 8888 ][TFSI] as the specific salt, FIG. 6 shows [P 6614 ][cTFSI] as the specific salt, and FIG. 7 shows [P 8888 ][ as the specific salt. FIG. 8 shows an optical micrograph of cells cultured for 7 days in the same manner as above using [P 66614 ][BETI] as the specific salt.
Note that the specific salts used in FIGS. 3 to 8 were all ionic liquids.
図３～８の結果から、いずれの細胞培養基材を用いた場合であっても、培地（培養液）と細胞培養基材との界面において、細胞を二次元培養（接着培養）できることがわかった。
また、［Ｐ２２２５］［ＴＦＳＩ］、及び、［Ｐ８８８８］［ｃＴＦＳＩ］についても同様の結果が得られることを確認した。
また、上記の各細胞培養基材は、特定塩（イオン液体）が［Ｐ６６６１４］［ＮＦＳＩ］、及び、［Ｐ８８８８］［ＮＦＳＩ］である細胞培養基材と比較して、よりｈＭＳＣｓ細胞が進展しやすかった。
The results shown in Figures 3 to 8 indicate that cells can be two-dimensionally cultured (adherent culture) at the interface between the medium (culture solution) and the cell culture substrate, no matter which cell culture substrate is used. Ta.
Furthermore, it was confirmed that similar results were obtained for [P 2225 ][TFSI] and [P 8888 ][cTFSI].
In addition, each of the above cell culture substrates supports hMSCs cells more easily than the cell culture substrates in which the specific salt (ionic liquid) is [P 66614 ] [NFSI] and [P 8888 ] [NFSI]. It was easy to progress.
［実施例２：細胞培養試験（高分子化合物添加）］
〔溶解性試験〕
実施例１と同様の方法で塩を準備した。すなわち、ビス(トリフルオロメタンスルフォニル)イミドをリチウム塩として準備し、これを各ハロアルキルホスフォニウムと混合し、水、又は、エタノール中でイオン交換反応して、塩を得た。
[Example 2: Cell culture test (addition of polymer compound)]
[Solubility test]
A salt was prepared in the same manner as in Example 1. That is, bis(trifluoromethanesulfonyl)imide was prepared as a lithium salt, mixed with each haloalkylphosphonium, and subjected to an ion exchange reaction in water or ethanol to obtain a salt.
得られた塩に式で表される各高分子化合物を共溶媒留去法によって溶解させ、溶解性は目視によって判断した。結果は以下の基準により評価し、表３に示した。
ＡＡ：より優れた溶解性を有し、均一な溶液が得られた。
Ａ： 優れた溶解性を有し、一定の条件下で相分離した
Ｂ： 溶解性を有し、粘稠溶液が得られた。
Ｃ： 溶液の一部に白濁が見られた。
Each polymer compound represented by the formula was dissolved in the obtained salt by a cosolvent distillation method, and the solubility was determined visually. The results were evaluated according to the following criteria and are shown in Table 3.
AA: A homogeneous solution with better solubility was obtained.
A: Excellent solubility and phase separation under certain conditions B: Good solubility and a viscous solution was obtained.
C: White turbidity was observed in a part of the solution.
〔細胞培養基材の準備〕
（高分子化合物の合成）
・重合性組成物の作成
メタクリル酸ブチル（ｎ－ＢｕＭＡ）の０．５Ｍ（：～４ｗｔ％）～４Ｍ（：～６０ｗｔ％）に対して、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）を１～１０ｍｏｌ％になるよう加え、更に、重合開始剤として、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）をｎ－ＢｕＭＡに対して１ｍｏｌ％になるように加えて重合性組成物を調製した。この重合性組成物に、総体積が２ｍＬになるように塩（イオン液体）を加えてメスアップした。
[Preparation of cell culture substrate]
(Synthesis of polymer compounds)
・Creation of polymerizable composition Ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) is added to 1 to 10 mol% of butyl methacrylate (n-BuMA) from 0.5 M (: ~ 4 wt%) to 4 M (: ~ 60 wt%). Furthermore, as a polymerization initiator, azobisisobutyronitrile (AIBN) was added in an amount of 1 mol % based on n-BuMA to prepare a polymerizable composition. This polymerizable composition was diluted by adding salt (ionic liquid) so that the total volume was 2 mL.
・高分子化合物の合成
得られたイオン液体と重合性組成物との複合物を脱気し、アルゴン置換を数回繰り返した後、ガラス基板上に塗布して複合物層を形成し、得られた複合物層を６０℃に加温して保持（～１５ｈ）した。更に、未反応モノマーの重合、及び、乾熱滅菌のために、アルゴン雰囲気下、１２０℃にて３ｈ以上保持し、高分子化合物を含有するシート状の細胞培養基材を得た。得られた細胞培養基材は、使用時までデシケータ内で保存した。
・Synthesis of polymeric compound After degassing the obtained composite of ionic liquid and polymerizable composition and repeating argon substitution several times, it is coated on a glass substrate to form a composite layer. The composite layer was heated and held at 60°C (~15h). Furthermore, in order to polymerize unreacted monomers and dry heat sterilization, the mixture was maintained at 120° C. for 3 hours or more in an argon atmosphere to obtain a sheet-like cell culture substrate containing a polymer compound. The obtained cell culture substrate was stored in a desiccator until use.
〔細胞培養試験〕
シート状の細胞培養基材を約０．５ｃｍ角に裁断し、表面を紫外線滅菌（照射光強度１Ｗｃｍ－２、１５ｍｉｎ）した。次に細胞培養基材上にフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の２０ｍｇ／ｍＬを滴下し、３７℃にて２日以上静置後、アスピレーションし、その後、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの条件でｈＭＳＣｓ細胞を播種した（培養条件の詳細は実施例１と同様である）。結果を図９～１１に示した。
[Cell culture test]
The sheet-shaped cell culture substrate was cut into approximately 0.5 cm square pieces, and the surface was sterilized with ultraviolet light (irradiation light intensity: 1 Wcm −2 , 15 min). Next , 20 mg/mL of fibronectin was dropped onto the cell culture substrate, left at 37°C for 2 days or more, and then aspired. (The details of the culture conditions are the same as in Example 1). The results are shown in Figures 9-11.
図９～１１には、使用した塩、及び、高分子化合物が異なる６種類の細胞培養基材を用いてｈＭＳＣｓ細胞を培養し、１日間経過後の顕微鏡像を示した。
図９には塩として［Ｐ２２２５］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（下側）を用いた結果を示した。
Figures 9 to 11 show microscopic images after one day of culturing hMSCs cells using six types of cell culture substrates with different salts and polymer compounds.
Figure 9 shows a cell culture substrate (upper side) obtained using [P 2225 ][TFSI] as a salt, a monofunctional polymerizable compound of 2M, and a polyfunctional polymerizable compound of 1 mol%, and the monofunctional polymerizable material (upper side). The results are shown using a cell culture substrate (lower side) obtained with 4M of a functional compound and 5 mol% of a polyfunctional polymerizable compound.
図１０には特定塩として［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られ細胞培養基材（下側）を用いた結果を示した。
図１１には特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（下側）を用いた結果を示した。
Figure 10 shows a cell culture substrate (upper side) obtained using [ P4441 ][TFSI] as a specific salt, a monofunctional polymerizable compound of 2M, and a polyfunctional polymerizable compound of 1 mol%; The results are shown using a cell culture substrate (lower side) obtained with a polymerizable compound of 4M and a polyfunctional polymerizable compound of 5 mol%.
Figure 11 shows the cell culture substrate (upper side) obtained using [ P66614 ][TFSI] as a specific salt, 2M monofunctional polymerizable compound, and 1 mol% polyfunctional polymerizable compound, and the monofunctional The results are shown using a cell culture substrate (lower side) obtained with a polymerizable compound of 4M and a polyfunctional polymerizable compound of 5 mol%.
図９～図１１の結果から、細胞培養基材中の高分子化合物の含有量、及び／又は、架橋密度がより高いと、細胞形状はより伸展し、細胞培養基材中の高分子化合物の含有量、及び／又は、架橋密度がより低いと、細胞形状はより球状となることがわかった。
すなわち、高分子化合物を含有する細胞培養基材を用いるとより簡便に細胞形状を制御できることがわかった。
From the results shown in Figures 9 to 11, it can be seen that the higher the content of the polymer compound and/or the crosslinking density in the cell culture substrate, the more elongated the cell shape. It was found that the lower the content and/or the crosslinking density, the more spherical the cell shape.
That is, it was found that cell shape can be controlled more easily by using a cell culture substrate containing a polymer compound.
（形状観察）
上記で得られた培養細胞について、「ＩｍａｇｅＪ（商品名）」ソフトウェアを用いて画像処理し、円形度、及び、細胞面積を算出した。結果を表４に示した。なお、円形度とは式：４πＳ／Ｌ２（Ｓ：細胞の投影面積、Ｌ：細胞の周囲長）で計算される値を意味し、表４中、円形度とあるのは、各条件において５０個以上の細胞の算術平均値である。また、細胞面積は各条件において５０個以上の細胞の占める面積の算術平均値である。
(shape observation)
The cultured cells obtained above were image-processed using "ImageJ (trade name)" software, and the circularity and cell area were calculated. The results are shown in Table 4. In addition, circularity means a value calculated by the formula: 4πS/L 2 (S: projected area of cell, L: perimeter of cell), and in Table 4, circularity refers to Arithmetic mean value of 50 or more cells. Further, the cell area is the arithmetic mean value of the area occupied by 50 or more cells under each condition.
表４に示した結果から、細胞形状、及び、面積(伸展度)の点で、［Ｐ４４４１］を用いた細胞培養基材を用いた場合、［Ｐ２２２５］を用いた場合と比較して、より真円度が低く、より伸展することがわかった。また、［Ｐ６６６１４］を用いた細胞培養基材を用いた場合、[Ｐ２２２５]、及び、［Ｐ４４４１］を用いた場合と比較して、更に真円度が低く、更に伸展することがわかった。
また、［Ｐ６６６１４］を用いた細胞培養基材を用いて培養した細胞は、ＰＳｔ（ポリスチレン製）ディッシュ上で培養した細胞と形状が類似していた。
From the results shown in Table 4, in terms of cell shape and area (extensibility), when using a cell culture substrate using [P 4441 ], compared to when using [P 2225 ], , was found to be less round and more elongated. In addition, when a cell culture substrate using [P 66614 ] is used, the roundness is lower than when using [P 2225 ] and [P 4441 ], and it is difficult to expand further. Understood.
Furthermore, the cells cultured using the cell culture substrate using [P 66614 ] were similar in shape to the cells cultured on PSt (polystyrene) dishes.
［実施例３：ｈＭＳＣｓ細胞生死判定試験］
４８穴プラスティックディッシュそれぞれの穴（ｗｅｌｌ）に６ｍｍ角スライドガラスを導入し、３７℃に予備加温した培養液で満たした。次に、ｈＭＳＣｓ（ヒト間葉系幹細胞）を３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう播種し、ＣＯ２５％、３７℃の条件でインキュベートした。顕微鏡観察によりガラスプレート上の細胞がコンフルーエントな状態まで増殖することを確認した後、５００μＬの新鮮な培養液と入れ替え、２０μＬの塩（イオン液体）を、各ｗｅｌｌに滴下した。次にインキュベーションを開始し、１、４、２４時間後にガラスプレートを取り出し、生細胞と死細胞とをそれぞれ蛍光染色した。
染色操作後、ガラスプレートをｐＨ７．４リン酸緩衝液中にて洗浄、及び、上記に導入し蛍光顕微鏡用の評価サンプルとした。
[Example 3: hMSCs cell viability determination test]
A 6 mm square slide glass was introduced into each well of a 48-well plastic dish and filled with a culture medium pre-warmed to 37°C. Next, hMSCs (human mesenchymal stem cells) were seeded at 3.5×10 5 cells/well and incubated at 37° C. and 5% CO 2 . After confirming that the cells on the glass plate had grown to a confluent state by microscopic observation, the culture solution was replaced with 500 μL of fresh culture solution, and 20 μL of salt (ionic liquid) was dropped into each well. Next, incubation was started, and after 1, 4, and 24 hours, the glass plate was removed, and live cells and dead cells were each fluorescently stained.
After the staining operation, the glass plate was washed in a pH 7.4 phosphate buffer and introduced into the above solution to serve as an evaluation sample for fluorescence microscopy.
図１２は、［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］からなるイオン液体の存在下で培養したｈＭＳＣｓ細胞の培養開始から１、４、２４時間経過後における顕微鏡像、及び、蛍光画像である。図１２において、上段左側が、培養開始から１時間経過後の顕微鏡像、上段右側が同視野の蛍光画像であり、中段左側が、培養開始から４時間経過後の顕微鏡像、中段左側が同視野の蛍光画像であり、下段左側が培養開始から２４時間経過後の顕微鏡像、下段右側が同視野の蛍光画像である。 FIG. 12 shows microscopic images and fluorescence images of hMSCs cells cultured in the presence of an ionic liquid consisting of [P 4441 ][TFSI] 1, 4, and 24 hours after the start of culture. In Figure 12, the upper left side is a microscopic image 1 hour after the start of culture, the upper right side is a fluorescence image of the same field of view, and the middle left side is a microscope image 4 hours after the start of culture, and the middle left side is the same field of view. The lower left side is a microscopic image 24 hours after the start of culture, and the lower right side is a fluorescence image of the same field of view.
また、図１３は、［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］からなるイオン液体の存在下で培養したｈＭＳＣｓ細胞の培養開始から１、４、２４時間経過後における顕微鏡像、及び、蛍光画像である。上段左側が、培養開始から１時間経過後の顕微鏡像、上段右側が同視野の蛍光画像であり、中段左側が、培養開始から４時間経過後の顕微鏡像、中段左側が同視野の蛍光画像であり、下段左側が培養開始から２４時間経過後の顕微鏡像、下段右側が同視野の蛍光画像である。 Moreover, FIG. 13 shows microscopic images and fluorescence images of hMSCs cells cultured in the presence of an ionic liquid consisting of [P 66614 ][TFSI] 1, 4, and 24 hours after the start of culture. The left side of the top row is a microscope image after 1 hour from the start of culture, the right side of the top row is a fluorescence image of the same field of view, the left side of the middle row is a microscope image after 4 hours after the start of culture, and the left side of the middle row is a fluorescence image of the same field of view. The lower left side is a microscopic image 24 hours after the start of culture, and the lower right side is a fluorescence image of the same field of view.
図１２、及び、図１３から、ｈＭＳＣｓ細胞はいずれもほとんど生存していることが明らかであり、上記塩は、ｈＭＳＣｓ細胞の生存率に影響を与えにくいことがわかった。
次に、蛍光画像を二値化処理し、細胞生存量を求めた。なお、モノクロ二値化した蛍光画像における白色部分の面積が生細胞の存在量と正の相関があるため、これを細胞生存量と定義した。各塩の共存下における１、４、２４時間経過時における白色部分面積を、塩の非共存下（表５における例７に該当する）における、１、４、２４時間におけるそれぞれの白色部分面積で除した値を細胞生存率（％）と定義し、表５に示した。
From FIG. 12 and FIG. 13, it is clear that most of the hMSCs cells are alive, and it was found that the above salt hardly affects the survival rate of the hMSCs cells.
Next, the fluorescent images were binarized to determine the amount of viable cells. In addition, since the area of the white part in the monochrome binarized fluorescence image has a positive correlation with the amount of living cells, this was defined as the amount of viable cells. The white part area at 1, 4, and 24 hours in the presence of each salt is the white part area at 1, 4, and 24 hours in the absence of salt (corresponding to Example 7 in Table 5). The divided value was defined as the cell survival rate (%) and is shown in Table 5.
表５に示した結果から、例８～例１１ではいずれも高い細胞生存率を示した。 From the results shown in Table 5, Examples 8 to 11 all showed high cell survival rates.
１００ 細胞培養器
１０１ 支持体
１０２ 細胞培養基材
１０３ 培養液
100 Cell culture device 101 Support body 102 Cell culture substrate 103 Culture solution
Claims (21)
細胞培養基材と、
水系の培養液と、を含有し、
前記細胞培養基材と前記培養液との界面で細胞を培養するように構成されており、
前記細胞培養基材は、
融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有し、
前記塩はイオン液体であり、
前記細胞培養基材は流動性を有する、細胞培養用の組成物。
試験：前記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、前記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、前記混合物を遠心分離して、水相と前記塩の濃厚相とに分離し、前記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。 A composition for cell culture, comprising:
a cell culture substrate;
Containing an aqueous culture solution,
configured to culture cells at an interface between the cell culture substrate and the culture solution,
The cell culture substrate is
Contains a salt having a melting point of 150°C or less and a saturated water content of 100,000 mass ppm or less as measured by the following test method,
the salt is an ionic liquid,
A composition for cell culture, wherein the cell culture substrate has fluidity.
Test: Add 5 times the volume of water to the salt to obtain a mixture, stir the mixture, and leave it at 25°C for 10 hours. Then, centrifuge the mixture to remove water. It is separated into a phase and a concentrated phase of the salt, and the saturated water content of the concentrated phase is measured using the Karl Fischer titration method.
前記細胞培養基材は、融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有し、
前記塩はイオン液体であり、
前記細胞培養基材は流動性を有する、細胞培養方法。
試験：前記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、前記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、前記混合物を遠心分離して、水相と前記塩の濃厚相とに分離し、前記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。 A cell culture method that involves culturing cells by adhering them to a cell culture substrate.And,
The cell culture substrate contains a salt having a melting point of 150° C. or less and a saturated water content of 100,000 mass ppm or less as measured by the following test method,
the salt is an ionic liquid,
A cell culture method, wherein the cell culture substrate has fluidity.
Test: Add 5 times the volume of water to the salt to obtain a mixture, stir the mixture, and leave it at 25°C for 10 hours. Then, centrifuge the mixture to remove water. The mixture is separated into a phase and a concentrated phase of the salt, and the saturated water content of the concentrated phase is measured using Karl Fischer titration.
前記細胞培養基材は、融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有し、
前記塩はイオン液体であり、
前記細胞培養基材は流動性を有する、細胞培養器。
試験：前記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、前記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、前記混合物を遠心分離して、水相と前記塩の濃厚相とに分離し、前記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。 A cell culture device comprising a container and a cell culture substrate ,
The cell culture substrate contains a salt having a melting point of 150° C. or less and a saturated water content of 100,000 mass ppm or less as measured by the following test method,
the salt is an ionic liquid,
A cell culture device, wherein the cell culture substrate has fluidity.
Test: Add 5 times the volume of water to the salt to obtain a mixture, stir the mixture, and leave it at 25°C for 10 hours. Then, centrifuge the mixture to remove water. It is separated into a phase and a concentrated phase of the salt, and the saturated water content of the concentrated phase is measured using the Karl Fischer titration method.
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| JP2013161660A (en) | 2012-02-06 | 2013-08-19 | Sony Corp | Photoelectric conversion element, method for manufacturing photoelectric conversion element, electronic device, and building |
| WO2017034004A1 (en) | 2015-08-25 | 2017-03-02 | 国立大学法人九州大学 | Novel sugar derivative gelling agent |
| WO2017099232A1 (en) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 国立大学法人静岡大学 | Oil-gelling agent |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Electrochemistry，2007年，Vol. 75，p. 734-736 |
| Isr. J. Chem.，2019年，Vol. 59，p. 803-812，First published: 07 December 2018 |
| Toxicol. In Vitro.，2018年，Vol. 46，p. 194-202 |
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