JP7433744B2 - 抗デング熱ワクチン及び抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、デング熱ウイルス感染の治療及び予防の分野ならびに関連化合物及び方法に関する。
デング熱は、毎年ほぼ４億人に感染し１、軽度の疾患（デング熱の発熱）からデング出血熱等の重症例に及ぶ２５％の感染における症状を有する。病原因子は、フラビウイルス属からの４つの血清学的に関連したウイルスであり２、これらはデング熱ウイルス血清型１～４（ＤＥＮＶ１～４）と称される。１種の血清型による感染は、その血清型に対しては生涯にわたる保護をもたらすが、その他の血清型に対しては生涯にわたる保護をもたらさない。重症疾患は第１のまたは一次ＤＥＮＶ感染中よりも二次感染中に生じる可能性が高いという疫学的証拠がある３、４。二次感染時の疾患の高まり及び４種の種々の血清型に対する保護の必要性は、毎年生じると推定される４億の感染を防ぐことが緊急に必要とされるワクチンに対して高い基準を設けている１、５、６。
ウイルス中和抗体及びＤＥＮＶエンベロープを作り出すことを目的とする開発におけるほとんどのＤＥＮＶワクチンは、この労力が主な焦点であり８、９、このエンベロープタンパク質は、受容体結合、その後の受容体媒介性エンドサイトーシスに関与する。エンドソームの酸性環境において、エンベロープタンパク質は、ウイルスエンベロープとエンドソーム膜の間の膜融合反応を触媒し、それによって、ウイルスゲノムＲＮＡを細胞質に放出する。エンベロープタンパク質は、約５００のアミノ酸長であり、大型のＮ末端外部ドメイン及びＣ末端で２つの膜貫通（ＴＭ）らせんを有する。その全体構造は、すべてのフラビウイルスの中で保存され、デング熱群内の最も遠いウイルス間で約６５％のアミノ酸配列同一性を有し、これらのすべては、位置Ｎ６７及びＮ１５３で２つの保存Ｎ結合型グリコシル化部位を示す。エンベロープタンパク質（「可溶性Ｅ」については「ｓＥ」と称される）の外部ドメインの４００のアミノ末端残基はクラスＩＩのウイルス融合タンパク質に特有であるβシートリッチな３つのドメイン構造に折り畳み、成熟ビリオン８、９の表面をコーティングするヘッドトゥーテールホモ二量体５～７を形成する。
デング熱ウイルスの血清型２、３、及び４からのエンベロープ糖タンパク質外部ドメインの結晶構造は、デング熱ウイルスの血清型２については受入番号１ＯＡＮ、１ＯＫ８、デング熱ウイルスの血清型３については１ＵＺＧ、及びデング熱ウイルスの血清型４については３ＵＡＪの下で、ＰＤＢ（タンパク質データバンク）のデータベースで入手可能である。
しかしながら、ＤＥＮＶ粒子の抗体認識は、ウイルスライフサイクルの異なる段階で示されるウイルスカプシドの多くの著しく異なる組成及び立体構造によって複雑化される１１、１２。「未成熟」ウイルス粒子は、エンベロープ及びビリオンが１：１の会合で前駆膜タンパク質（ｐｒＭ）の完全相補体を有し、特徴的なとがった外観を採用し、それぞれのとがった部分はｐｒＭ／Ｅタンパク質の三量体で構成されている１１～１５。
フリン媒介性ｐｒＭ切断後、「成熟」ウイルス粒子は、対称の２、３、及び５倍軸の周りに配置されたエンベロープタンパク質の９０個近くパックされた二量体を有する平滑な外見を採用し、エンベロープタンパク質二量体が互いに対して再配置する、３４℃を超える温度まで曝露時に「凹凸な」形態へのこれらの成熟粒子の拡大はまた、近年記載されている１６、１７。早期エンドソームへの内面化後、酸性環境は、エンベロープタンパク質の主要な立体構造変化のきっかけとなり、これは、融合ループを曝露し、次いで、膜融合を誘発するように不可逆的に三量化する１８、１９。
重要かつさらなるレベルの複雑性は、ｐｒＭ切断がしばしば不完全であることであり、これにより切断の度合いを変化させながら、ウイルスの集団をもたらす１５、２０。高レベルのｐｒＭを含むウイルスは、感染ではないが、一方、低レベルのｐｒＭを有するウイルスは、依然として感染性であり、さらに、高いｐｒＭの非感染粒子が抗体依存性増強による感染に追い込まれ得ることを示した２１、２２。
エピトープは、最もヒト中和抗体の標的物であるかについては、これまでのところ明らかではなく、例えば、ｄｅ Ａｌｗｉｓ２７は、エピトープが形成のためにウイルスの組み立てを必要とすることを示唆しているが、一方、Ｒｅｙ８１は、エンベロープ二量体自体が標的物であると示唆している。
ＤＥＮＶ感染の抗体依存性（ＡＤＥ）の抗体依存性増強は、二次感染時に、疾患の重症度を増加することを前提とする機序のうちの１つである２３。一次感染に形成された抗体は、ウイルスを最適化するが、完全に中和せず、二次感染においてより高いウイルス負荷を推進する骨髄性細胞へのＦｃ受容体媒介性取り込みを促進することが提案されている。ＡＤＥは、ほぼすべての抗体の二次中和濃度で見られ得、その認識されるリスクは、ＤＥＮＶにおけるワクチン戦略を企図している。
臨床試験において現在試験されている主要なデング熱ワクチン候補は、弱毒生デング熱またはデング熱／黄色病キメラウイルスの四価製剤からなる２４、２５。許容されない反応原性のないバランスのとれた四価免疫力を作り出すことは、困難であることが確認されている。最も進歩したワクチン候補は、最近の第ＩＩ相臨床試験４において予想されたものよりもはるかに低いワクチンの有効性を示し、ＤＥＮＶ－２から保護しなかったが、一方、第ＩＩＩ相試験において、このワクチンは疾患の発生率を５６％低減し（ｈｔｔｐ：／／ｓａｎｏｆｉｐａｓｔｅｕｒ．ｃｏｍ／ｅｎ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｔｈｅｗｏｒｌｄ－ｓ－ｆｉｒｓｔ－ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ－ｄｅｎｇｕｅ－ｖａｃｃｉｎｅ－ｅｆｆｉｃａｃｙ－ｓｔｕｄｙ－ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ－ａｃｈｉｅｖｅｄ－ｉｔｓ－ｐｒｉｍａｒｙ－ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｅｎｄｐｏｉｎｔ．ａｓｐｘ）、Ｃａｐｅｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｌａｎｃｅｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｊｕｌｙ １１，２０１４ ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１４）６１０６０－６では、疾患に曝露された集団のほぼ半分にした。このずれは、天然デング熱感染におけるヒト抗体反応及びワクチン接種後を理解する、具体的には、ヒトにおいて発生した最も強力な交差反応性のある抗体によって認識されるエピトープを特定し、疾患からの保護との相関関係を理解する差し迫った必要性を生じる。したがって、ヒトにおいて発生した最も強力な交差反応性のある抗体によって認識されるエピトープを含むデング熱ワクチンを提供することは極めて重要である。
近年の証拠は、ヒトにおけるデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）に特異的な血清Ａｂ反応が、交差反応性のある中和不良のＡｂの大部分とほんのわずかの血清型に特異的な強力な阻害抗体とからなることを示し２７、これらは、エンベロープタンパク質がウイルス粒子上に組み立てられる場合にのみ発現する複合の四級構造エピトープに結合し、有効な免疫反応を刺激するために、無傷ウイルス粒子が必要とされることを意味する。
この近年の証拠とは対照的に、本発明の発明者らは、驚くべきことに、強力に中和する交差反応性のある抗体であることが見出されたデング熱ウイルスに感染した患者の分類した単一形質芽球から再配置された重鎖及び軽鎖遺伝子を単離することによって得られたヒト抗体を特定し、特徴付けた。さらに、これらの抗体が結合するエピトープが、エンベロープタンパク質二量体に限定され、完全なウイルスの組み立てを必要しなかったことを見出した。したがって、安定化可溶性タンパク質Ｅ二量体を含むサブユニットワクチンは、感染性ビリオンの表面で通常接近することができない不良な免疫原性領域に対して誘発する抗体を避ける、成功したデング熱ワクチンにおける良好な候補である。
以下に記載の本発明は、新たに特定された抗体及び抗原に関して、化合物、組成物、方法、使用、及びワクチンを提供する。
本発明者らは、デング熱感染に罹患している患者から１４５のヒトモノクローナル抗体を特徴付けた。急性ヒト抗体反応は、２つの主要なエピトープに焦点を置かれることが見出され、これらの１つは融合ループにおいて十分に記載されており、第２の新規のエピトープは無傷ビリオンまたはエンベロープタンパク質の二量体に見出されており、これらはドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの領域に包含する。このエピトープ、エンベロープ二量体エピトープ、またはＥＤＥと反応する抗体は、低いピコモル範囲において無傷ヒト細胞及び一次ヒト細胞の両方で作られるウイルスを完全に中和することができることが見出された。この新規のエピトープは、デング熱ウイルスによって生じる疾患の治療及び予防について様々な意味合いを持つ。
本発明は、本発明の異なる態様の様々な実施形態に関して以下に記載されよう。明確にするために、個別の実施形態の文脈に記載される本発明のある特定の特性はまた、１つ以上の実施形態または単一の実施形態において組み合わせても提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈に記載される本発明の様々な特性はまた、個別にまたは任意の適当なサブコンビネーションで提供されてもよい。これらの実施形態のすべての組み合わせは、あたかも各々及びすべての組み合わせが個別に及び明示的に開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書で開示されている。加えて、すべてのサブコンビネーションはまた、あたかも各々及びすべてのこのようなサブコンビネーションが個別に及び明示的に本明細書で開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書で開示されている。
それ故に、本発明の第１の態様では、１種を超える血清型のデング熱ウイルスのデング熱ウイルスを中和する化合物が提供される。
好ましくは、本化合物は、２種の血清型のデング熱ウイルス、より好ましくは３種のデング熱ウイルス、及び最も好ましくは４種の血清型のデング熱ウイルスのデング熱ウイルスを中和する、すなわち、すべての血清型のデング熱ウイルスは、例えば、ＤＥＮＶ－１、ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－３、及びＤＥＮＶ－４を含む一覧表からの２種以上の血清型のデング熱ウイルスを中和する。
化合物とは、１種を超える血清型のデング熱ウイルスを中和することができる任意の化合物を意味する。本化合物は、例えば、小分子、ポリペプチド、またはタンパク質（これらの用語は、本明細書で同義に使用される）であってもよく、これには、糖タンパク質、核酸、炭水化物、脂肪、原子、例えば、金属が含まれる。好ましい実施形態では、本化合物は、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分である。この抗原結合部分は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片）、またはドメイン抗体であってもよい。この抗原結合部分は、無傷抗体に存在する線状アミノ酸配列に由来し得るか、または一連の非連続的なアミノ酸を含み得るか、または一連の非連続的なアミノ酸を含み、任意に他のアミノ酸と散在され得、例えば、エピトープとの接触に必要とされる特定のアミノ酸を含み得るが、例えば、場合によっては、例えば異種骨格タンパク質によって置き換えられ得る、天然抗体のフレームワークに必要とされるアミノ酸を含み得ない。本発明に従う抗体は、当業者に公知であろう、ヒト、サル、ウサギ、またはマウス等の哺乳動物に免疫性を与えるステップを含む方法によって、及び／または例えば、ファージディスプレイ選択ステップを含む、インビトロ方法によって得られる。
抗体とは、実質的に無傷の抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体（少なくとも１つのアミノ酸が非ヒト抗体に対して突然変異である、例えば、天然非ヒト抗体または非ヒト抗体配列から組み立てられた抗体）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／または軽鎖のホモ二量体またはヘテロ二量体、ならびにその抗原結合部分及び誘導体の意味を含む。
本化合物がタンパク質である場合には、例えば、抗体またはその断片がヒト対象に投与され、この抗体がヒト抗体またはその断片ではない場合、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにヒト化され得る。ヒト化抗体またはその断片を産生するための方法は、当該技術分野で周知である（Ｖｉｎｃｋｌｅら、２００９）。
さらに、本発明に従う抗体またはその断片のバイオアベイラビリティは、中和抗体またはその断片をアルブミン（Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓら、２００６）または免疫グロブリン（Ｈａｒｍｓｅｎら、２００５）等の不活性担体に接合することによって改善され得る。
抗体という用語はまた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｄＤ、及びＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体も含む。抗体という用語はまた、任意の定義された抗体及びその抗原結合部分の変異体、融合体、及び誘導体も含む。
本化合物は、代替的には、例えば、ＭＩＬＬＷＡＲＤ ＳＴＥＶＥＮ Ｗ ＥＴ ＡＬ：“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ”，ＡＣＳ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．２，ｎｏ．９，１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００７（２００７－０１－０１），ｐａｇｅｓ ６２５－６３４，ＸＰ００２６１６２９２，ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ，ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ，ＤＣ，ＵＳ ＩＳＳＮ：１５５４－８９２９，ＤＯＩ：１０．１０２１／ＣＢ７００１１２６、ＨＥＩＮＩＳ ＣＨＲＩＳＴＩＡＮ ＥＴ ＡＬ：“Ｐｈａｇｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ” ＮＡＴＵＲＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ ２００９（２００９－０７），ｐａｇｅｓ ５０２－５０７，ＸＰ００７９１３１８１に記載されるように、環状ペプチド、例えば、多環状ペプチド、例えば、二環状ペプチドであり得る。例えば、第ＷＯ２００９０９８４５０号も参照されたい。必要とされる結合特性を有する二環状ペプチドは、例えば、ファージ提示法によって選択され得る。
中和するとは、今までに感染していない細胞を感染させるウイルスの能力を低減させることを意味する。
当業者は、化合物の能力を中和するウイルスを観察するために適当な技術を十分承知しているであろう。かかる方法の一例は、実施例３に詳述されており、１種以上の血清型のデング熱ウイルスが潜在性のある宿主細胞集団を感染させることができ、アッセイ下での化合物をウイルスと混合させ、次いで、混合物を潜在性のある宿主細胞でインキュベートする。化合物の中和能力、すなわち、感染を予防する化合物の能力の基準を得る、感染した細胞数がアッセイされる。ある特定の例では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分を中和する可能性は、感染した病巣の数の低減が対照（化合物なし）と比較する場合に、フォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）を用いて判定され得る２２。簡潔に言えば、本化合物をウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、混合物をベロ細胞（アフリカミドリザルからの腎臓上皮細胞株）に移し、３日間インキュベートする。フォーカス形成アッセイは、抗Ｅ ｍＡｂ（４Ｇ２）を用いて行われ、続いて、ＨＲＰ共役されたウサギ抗マウスＩｇＧを用いて行うことができる。この反応は、ＤＡＢ基質の添加によって可視化することができる。フォーカス低減の割合は、各化合物について計算される。５０％のＦＲＮＴ値は、ＳＰＳＳパッケージからのプロビットプログラムを用いて、低減率対化合物の濃度のグラフから決定され得る。典型的には、このアッセイは、試験化合物の不在下で、例えば、コンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を含む９６ウェルプレートウェル中で約１００の病巣が存在するように行われ得る。
。例えばフォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）、プラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ、ＷＨＯ文書ｈｔｔｐ：／／ｗｈｑｌｉｂｄｏｃ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｈｑ／２００７／ｗｈｏ＿ｉｖｂ＿０７．０７＿ｅｎｇ．ｐｄｆを参照、ＦＲＮＴ、フローサイトメトリーを用いたマウス及びサル等のインビボでの技術のような、他のかかる例は、当業者には周知であろう例えば、ＦＲＮＴ及びフローサイトメトリー方法の例については図３０を参照のこと。
一実施形態では、本化合物は、ウイルスを少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは１００％中和する。さらに好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のデング熱ウイルスを少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは９８％、９９％、または１００％中和する。このウイルスは、昆虫細胞によってまたはヒト癌細胞株（典型的には、以下にさらに論じられるように、高いｐｒ－Ｍ含有ウイルスを産生すると見なされる）において、またはあるいは、ヒト初代細胞、例えば初代ヒト樹状細胞において、またはフリンを過剰発現する細胞株（低ｐｒ－Ｍ含有ウイルスを作製すると見なされる）において産生され得る。
特定のレベルまで中和するとは、所与の濃度の化合物に対して特定のレベルまで中和することを意味することを含む。所与の化合物の適切な濃度は、実際の化合物に応じて異なり得ることが理解されよう。例えば、上記のアッセイにおいて使用される、例えば、所与の化合物の濃度は、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、もしくは１ｎＭ；または０．０１ｕｇ／ｍｌ、０．０２ｕｇ／ｍｌ、０．０４ｕｇ／ｍｌ、０．０５ｕｇ／ｍｌ、０．０６ｕｇ／ｍｌ、０．０７５ｕｇ／ｍｌ、０．１ｕｇ／ｍｌ、０．２５ｕｇ／ｍｌ、０．５ｕｇ／ｍｌ、０．７５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、１．２５ｕｇ／ｍｌ、１．５ｕｇ／ｍｌ、１．７５ｕｇ／ｍｌ、２ｕｇ／ｍｌ、２．２５ｕｇ／ｍｌ、２．５ｕｇ／ｍｌ、２．７５ｕｇ／ｍｌ、３ｕｇ／ｍｌ、３．２５ｕｇ／ｍｌ、３．５ｕｇ／ｍｌ、３．７５ｕｇ／ｍｌ、４ｕｇ／ｍｌ、４．２５ｕｇ／ｍｌ、４．５ｕｇ／ｍｌ、４．７５ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、５．２５ｕｇ／ｍｌ、５．５ｕｇ／ｍｌ、５．７５ｕｇ／ｍｌ、６ｕｇ／ｍｌ、６．５ｕｇ／ｍｌ、７ｕｇ／ｍｌ、７．５ｕｇ／ｍｌ、８ｕｇ／ｍｌ、８．５ｕｇ／ｍｌ、９ｕｇ／ｍｌ、９．５ｕｇ／ｍｌ、もしくは１０ｕｇ／ｍｌ以下、または０．０１ｕｇ／ｍｌ未満であり得る。典型的には、化合物、例えば抗体の濃度は、例えば、１ｕｇ／ｍｌ未満であり得る。
例えば、化合物（例えば抗体）は、０．１ｕｇ／ｍｌの化合物濃度で１種以上の血清型のウイルスを８０％中和させ得、１ｕｇ／ｍｌの化合物濃度で１種以上の血清型のウイルスを少なくとも９８％、例えば１００％中和させ得る。好ましくは、本化合物（例えば抗体）は、０．０５μｇ／ｍｌの濃度で１種以上の血清型のウイルスを８０％中和するか、または０．５μｇ／ｍｌの濃度で１種以上の血清型のウイルスを少なくとも９８％、例えば１００％中和する。
化合物の所与の濃度に対して観察された中和のレベルがアッセイにおけるウイルス粒子の数によって異なり得ることも理解されよう。例えば、化合物の所与の濃度については、アッセイにおけるウイルス粒子の数が２倍である場合、中和のレベルは、（所与の宿主細胞集団に対して）低減し得ることが予測され得る。アッセイにおけるウイルス粒子の数は、典型的には、試験化合物の不在下で、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、例えばコンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を用いておよそ１００フォーカスを提供するようなものであろう。
例えば、一実施形態では、本化合物は、ウイルス濃度が、試験化合物の不在下で、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、例えばコンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を用いておよそ１００フォーカスを提供するのに十分である場合に、１μｇ／ｍｌまたは０．０５ｕｇ／ｍｌもしくはそれ以下の濃度で１種以上の血清型のウイルスを少なくとも８０％のレベルまで、または１００％のレベルまで中和する。
ウイルスによって感染され得るアッセイにおける細胞の数はまた、見かけレベルの中和反応を影響し得る。例えば、少数の細胞は、大きな細胞集団よりも１細胞当たり表される、より大きな感染率を示し得る。したがって、化合物、ウイルス、及び宿主細胞数の比率はまた、重要であり得る。アッセイにおいて使用される細胞は、重要であり得る。アッセイは、マイクロタイタープレート中で、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート中で行われ得る。細胞は、マイクロタイタープレート中で、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート中で、容器中でコンフルエント、例えば、ちょうどコンフルエントであり得る。
好ましくは、本化合物は、昆虫細胞、例えばＣ６／３６昆虫細胞、またはヒト腫瘍細胞株（典型的には、高いｐｒ－Ｍ含有ウイルスを産生し得る）及びヒト細胞、例えば初代ヒト細胞、例えば初代ヒト樹状細胞、またはフリンを過剰発現する細胞（低いｐｒ－Ｍ含有ウイルスを作製すると見なされる）の両方において作られるウイルスを中和することができる。異なる細胞型におけるウイルス粒子、サブウイルス粒子、またはウイルス様粒子の産生は、当業者に公知であろう。例えば
化合物のウイルスを中和する能力は、上述のように、実施例において試験することができる。一実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞、例えば 初代ヒト樹状細胞、または昆虫細胞で作られるウイルスを中和することができる。別の実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞及び昆虫細胞で作られるウイルスを同じレベルまで中和することができる。同じレベルまでとは、所与の濃度の化合物及び／または所与の濃度のウイルス及び／または所与の数の宿主細胞については、本化合物に起因する中和反応のレベルは、昆虫細胞及び初代ヒト細胞の両方で作られるウイルスにとっては有意に異ならないか、または本化合物に起因する中和反応のレベルは、昆虫細胞及び初代ヒト細胞の両方からのウイルスにおいて、特定の閾値を超える、例えば８０％超、９０％、９５％、または９８％の中和反応であるという意味を含む。例えば、所与の濃度のウイルス粒子、及び所与の数の潜在性のある宿主細胞については、５０％ ＦＲＮＴは、昆虫細胞及び初代ヒト細胞で作られたウイルスについては同じであり（有意に異ならない）、例えば、０．０５μｇ／ｍｌ以下、または０．５μｇ／ｍｌ以下、または１μｇ／ｍｌ以下、または５μｇ／ｍｌ以下である。好ましい実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞及び昆虫細胞で作られた、好ましくは２種の血清型、好ましくは３種の血清型、より好ましくは４種の血清型、またはすべての血清型、１種を超える血清型のデング熱ウイルスを中和することができる。最も好ましい実施形態では、本化合物は、昆虫細胞及び初代ヒト細胞の両方で作られたすべての血清型のデング熱ウイルスを完全に（すなわち１００％）中和することができる。例えば、本化合物は、上で論じられるように、０．０５ｕｇ／ｍｌの化合物濃度で約１００フォーカスを得るのに十分なウイルス濃度で初代ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られるウイルスを１００％中和することができる。初代ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られるとは、初代ヒト細胞（例えば）中で独立して作られるウイルス、同じ手順で、初代ヒト細胞及び昆虫細胞の両方を用いて産生されているウイルス粒子の特定の集団よりも昆虫細胞中で独立して作られるウイルス及びを意味することを含む。
本発明において特定される交差反応性のある高度に中和する化合物は、ウイルス形成を独立して、エンベロープタンパク質の無傷ウイルス及び二量体の両方において見出され得る特定のエピトープに結合することが見出された。それ故に、本発明の化合物は、この特定のエピトープに結合するそれらの能力に関して定義され得る。
それ故に、本発明のさらなる態様では、デング熱ウイルスエンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）に結合する化合物が提供される。ＥＤＥとは、本明細書に定義される任意のＥＤＥという意味を含む。
エンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）に結合する化合物とは、１種以上の血清型のデング熱ウイルスのＥＤＥに結合することができる任意の化合物を意味する。本化合物は、小分子、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂肪、原子、例えば、金属であり得る。好ましい実施形態では、本化合物は、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分である。本化合物についての選好は、前述された通りである。
４種の血清型のデング熱ウイルスがある。それ故に、本化合物が１種の血清型のデング熱ウイルスのＥＤＥに結合し得ることが理解されよう。好ましい実施形態では、本化合物は、１種を超える血清型のデング熱ウイルスのＥＤＥに結合し、上記の、２種の血清型のデング熱ウイルス、または３種の血清型のデング熱ウイルス、または４種の血清型のデング熱ウイルスに結合する、すなわち、すべての血清型のデング熱ウイルスであると見なされるであろう。
「結合する」とは、本発明の化合物とエピトープまたは分子または巨大分子または化合物との間の非共有結合のあらゆる形態の意味を含み、当該技術分野で通例の方法によって評価されるＥＤＥへの結合のあらゆる有意な度合いの意味を含む。好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに選択的に結合する。ＥＤＥに選択的に結合するとは、本化合物がＥＤＥ以外のデング熱ウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合しない、またはそれらに有意に結合しないという意味を含む。また、本化合物が、あるもの以外の別の化合物または分子または巨大分子に結合しない、またはそれらに有意に結合しないという意味も含み、本化合物がＥＤＥに結合するかどうかを決定するＥＤＥを提示することは、十分に当業者の技量内にあるであろう。例えば、当業者に公知であるような、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイを使用してもよい。本化合物がＥＤＥと結合するかどうか判定するための方法のある非限定的な例は、デング熱ウイルスのうちの１種以上、好ましくはすべての血清型の無傷ウイルス、及び／またはデング熱ウイルスのうちの１種以上、好ましくはすべての血清型のエンベロープ二量体、及び／または本明細書に記載の定義のうちのいずれかに従うＥＤＥ、例えば安定化エンベロープ二量体、または異種骨格内に保持されるエンベロープタンパク質からの残基を含むＥＤＥであり、偽物の非感染の上清は、固体支持体、例えば、抗Ｅ Ａｂ（４Ｇ２）でコーティングしたＭＡＸＩＳＯＲＰ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上に別々に捕捉される。次いで、捕捉ウェルを、本化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ヒトモノクローナル抗体、例えば、１ｕｇ／ｍｌのヒトｍＡｂでインキュベートし、続いて、レポーターに共役した二次抗体（化合物と結合する）、例えばＡＬＰ共役抗ヒトＩｇＧでインキュベートした。この反応を、適切な基質、例えばＰＮＰＰ基質の添加によって可視化し、ＮａＯＨで停止する。ＡＬＰ／ＰＮＰＰについては、吸光度は、４０５ｎｍで測定する。
ＥＤＥに結合する化合物とは、感染していない上清を含むウェルに結合する背景のレベルを上回る任意の度合いまで、ウイルスまたはＥＤＥ、例えば安定化した可溶性タンパク質Ｅ二量体を含むウェルに結合する任意の化合物の意味を含む。好ましくは、ウイルスまたはＥＤＥ、例えば安定化した可溶性タンパク質Ｅ二量体に対して得られた結合のレベルは、感染していない上清ウェルへの結合の背景レベルの２倍、好ましくは４倍、好ましくは６倍、より好ましくは１０倍である。この化合物がＥＤＥ以外の部位でウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合するかどうか判定するために、変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合する化合物の能力を評価してもよい。この化合物が有意なレベルまで変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合する場合、ＥＤＥ以外の部位でウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合すると見なされる。この化合物が任意の他の分子または巨大分子または化合物以外のＥＤＥに選択的に結合するかどうかを判定するために、ＥＤＥに結合する化合物の能力は、上述の方法を用いて、分子または巨大分子または化合物に結合する化合物の能力と比較することができる。化合物は、別の分子または巨大分子または化合物、例えば、変性または単量体エンベロープタンパク質に結合するよりも有意に広い範囲までＥＤＥに結合する場合、例えば、この化合物が別の分子、巨大分子、または化合物、例えば、変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合するよりも少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍大きな親和性を有するＥＤＥに結合する場合、ＥＤＥに選択的に結合する。
ＥＤＥは、エンベロープタンパク質の二量体に広がる無傷ウイルス粒子上、または２つのポリペプチドに広がるエンベロープタンパク質の遊離二量体、例えば可溶性エンベロープタンパク質の遊離二量体上に形成されると見なされるエピトープである。エンベロープタンパク質配列は、図２９中、ならびに配列番号２９、３１、３３、及び３５に詳述されている。
好ましい実施形態では、本発明の化合物は、無傷ウイルスまたは遊離エンベロープ二量体（すなわち、エンベロープポリペプチド単量体の２倍の分子量を有する）、または上述及び以下にさらに論じられるような他の構造上のいずれかでＥＤＥに結合し、単量体エンベロープタンパク質または変性エンベロープタンパク質に結合しない。一実施形態では、本化合物が単量体エンベロープタンパク質または変性エンベロープタンパク質に結合する場合、それは有用な化合物と見なされず、本発明の化合物ではない。したがって、化合物が本発明のこの実施形態の化合物であるかどうかを特定する１つの非限定的な方法は、例えばウエスタンブロットでは変形エンベロープタンパク質、及び／または、例えばＥＬＩＳＡでは組換え（単量体）エンベロープタンパク質、ならびに例えばＥＬＩＳＡでは無傷ウイルス粒子、及び／または、エンベロープタンパク質の二量体（例えば可溶性エンベロープタンパク質の二量体）に結合するその能力について、例えば、化合物、例えば抗体またはその抗原結合部分をアッセイすることによるものである。本発明の好ましい化合物は、無傷ウイルスまたは非変性二量体に結合すると見なされるが、変性または単量体エンベロープタンパク質に結合しない（または有意により少ない程度に）と見なされる。結合の度合いは、上述のように評価され得る。
融合ループに結合するが、ＥＤＥに結合しない化合物は、本発明の化合物であると見なされない。融合ループは、上述のまたは古典的な融合ループエピトープ（ＦＬ）を定義する１０１Ｗの内外の制限的な残基セットである。融合ループでは、残基１０１－ＷＧＮＧ－１０４は、二量体界面の向かいにあるドメインＩＩＩに向かってＷ１０１側鎖を突出する歪んだαらせん回転を作る。化合物がエンベロープ単量体または変性エンベロープタンパク質に結合する（例えば上述のように判定される）場合、この抗体がエンベロープポリペプチドの異なる部分（融合ループ領域において突然変異されるエンベロープポリペプチドに結合することによって確認され得る）に代わりに結合し得ることが可能であるが、融合ループに結合すると見なされ得る。
別の実施形態では、融合ループに結合する化合物は、エンベロープタンパク質における以下の残基、特に、ＤＥＮＶ－１：Ｅ４９、Ｑ７７、Ｉ１６１、Ｔ２００、Ｗ３９１、またはＦ３９２のうちの任意の１つ以上で突然変異によって影響を受けない（または有意に影響を受けない）ものである。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、変性ＥＤＥ、または変性エンベロープタンパク質に結合しない。
一実施形態では、ＥＤＥは、デング熱ウイルスエンベロープポリペプチド二量体、例えば可溶性エンベロープポリペプチド二量体のポリペプチドに広がると見なされる。特定の一実施形態では、ＥＤＥは、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの領域のエンベロープポリペプチド二量体を含む。ＥＤＥが１種以上の血清型のデング熱ウイルスエンベロープタンパク質の二量体界面で四次構造依存性のエピトープを含むことが理解されよう。
異なるデング熱血清型からのエンベロープタンパク質がハイブリッド二量体を形成する、二量化し得ることが理解されよう。したがって、一実施形態では、本化合物が結合するＥＤＥは、異なるデング熱血清型由来のエンベロープ単量体で作られ、したがって、ＥＤＥは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含み得る。
エンベロープタンパク質の二量体が無傷ビリオンまたはウイルス様粒子に見出されるように、ＥＤＥが、ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子の一部として化合物に提示され得ることも理解されよう。ＥＤＥがビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子の一部として提示される場合に、本発明の化合物は、無傷ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合するが、単量体または変性エンベロープタンパク質に結合しないものである。
あるいは、ＥＤＥは、ビリオンの一部としてではない化合物に提示され得、例えば、２つのエンベロープタンパク質の二量体から形成されるＥＤＥは、遊離二量体として化合物に提示され得る。それ故に、一実施形態では、本発明の化合物は、ＥＤＥがエンベロープまたは可溶性エンベロープ（ｓＥ）タンパク質の遊離二量体である場合に、ＥＤＥに結合する化合物である。別の実施形態では、本発明の化合物は、ＥＤＥがエンベロープまたはｓＥタンパク質の安定化二量体である場合に、ＥＤＥに結合する化合物である。
遊離二量体は、タンパク質の二量化を安定化させる成分を含む組成物の一部として提示され得る。例えば、タンパク質会合を促進すると見なされる特定の緩衝液成分を、使用してもよい。あるいは、エンベロープタンパク質は、二量体形成を促進する高濃度で提示され得る（実施例７を参照のこと）。
エンベロープ二量体を安定化される外部薬剤に加えて、エンベロープタンパク質は、二量体配置において増加した安定性を有するように操作され得る。例えば、二量体は、
－２つのエンベロープまたはｓＥ単量体間での少なくとも１つの、任意に２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０もしくはそれ以上のジスルフィド鎖間結合によって共有結合的に安定化され得る、かつ／または、
－２つのｓＥ単量体間での少なくとも１つの、任意に２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０もしくはそれ以上のスルフヒドリル反応性架橋剤によって共有結合的に安定化され得る、かつ／または、
－改変糖類を介して２つのエンベロープまたはｓＥ単量体を結合することによって共有結合的に安定化され得る、及び／または、
－二量体界面でまたは各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、少なくとも１つのエンベロープまたはｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって、非共有結合的に安定化され得る。
デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（ｓＥ；可溶性エンベロープポリペプチド／糖タンパク質）は、デング熱ウイルスの血清型１、２、及び４のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１～３９５のアミノ酸断片、及びデング熱ウイルスの血清型３のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１～３９３のアミノ酸断片を指す。
好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、このＥＤＥはｓＥの安定化二量体であり、組換えデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（組換えｓＥ）単量体は、配列番号１３２のＤＥＮＶ－１ ｓＥ、配列番号１３３のＤＥＮＶ－２ ｓＥ、配列番号１３４のＤＥＮＶ－３ ｓＥ、配列番号１３５のＤＥＮＶ－４ ｓＥ、ならびにＨ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｌ１０７Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、Ｓ２５５Ｃ、Ａ２５９Ｃ、Ｔ／Ｓ２６２Ｃ、Ｔ／Ａ２６５Ｃ、Ｌ２７８Ｆ、Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎ、Ａ３１３Ｃ（ＤＥＮ３ではＳ３１３Ｃ）、及びＴ３１５Ｃの中から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）を有するその突然変異体ｓＥからなる群から選択される。これらの突然変異は、下述のように、二量体配置において増加した安定性に貢献すると見なされる。
任意に、その当該突然変異体ｓＥは、さらに、Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４Ｎ、及びＤ３２９Ｎの中から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）、好ましくは３つの突然変異Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４Ｎ、及びＤ３２９Ｎを有する。これらの突然変異は、適切でない免疫原性領域を覆い、対象において、本発明の安定化組換えｓＥ二量体が４種すべてのデング熱ウイルス血清型を対象とする中和抗体を優先的に引き起こすことが可能であると見なされる。
突然変異を誘発するｓＥ二量体の上述の変異誘発は、架橋によって安定化を提供するための二量体の接触でのシステイン突然変異を含む、その免疫原性を妨げないが、より高い二量体親和性を提供する突然変異を導入する、かつ／あるいはクリック化学によって、及び／または二量体界面でもしくは各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、空洞の形成を可能にするために、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって、二量体における隣接糖類間での化学的架橋を可能にする新しいグリコシル化を導入する。
特に特定されない限り、このアミノ酸残基位置は、図１５中に示されるｓＥアミノ酸配列アライメントに従って番号付けされる。
配列番号１３２のＤＥＮＶ－１ ｓＥ、配列番号１３３のＤＥＮＶ－２ ｓＥ、配列番号１３４のＤＥＮＶ－３ ｓＥ、配列番号１３５のＤＥＮＶ－４ ｓＥをコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号１３６、１３７、１３８、及び１３９として示される。
本明細書に使用される場合、「組換え」という用語は、本発明のデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン、抗体、またはその抗体断片を産生するための遺伝子操作方法（クローニング、増幅）の使用を指す。
二量体は、上に定義される２つの同一の組換えｓＥのホモ二量体、または上に定義される２つの異なる組換えｓＥのヘテロ二量体であり得、この二量体は、好ましくはホモ二量体である。
例として、それは、上に定義されるＤＥＮＶ－１ ｓＥとＤＥＮＶ－２ ｓＥとのヘテロ二量体であり得る。それはまた、上に定義されるＤＥＮＶ－１ ｓＥとＤＥＮＶ－１ ｓＥの突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり得る。
一実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、ｓＥの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えｓＥの安定化二量体は、２つのｓＥ単量体間での少なくとも１つ、２つ、または３つのジスルフィド鎖間結合によって共有結合的に安定化される。
有利には、当該安定化二量体は、単一鎖間ジスルフィド結合をもたらす、二量体の２倍の分子軸によって位置付けられる単一のシステイン突然変異体ｓＥ、または２倍の分子軸から離れて複数の（例えば、２つの）ジスルフィド結合を作製し得る複数の（例えば、二重の）システイン突然変異体ｓＥを含む。当該ジスルフィド結合は、酸性条件下で、例えば、ＤＭＳＯ溶液（Ｏ．Ｋｈａｋｓｈｏｏｒら、２００９）を用いてまたはＣｄＣｌ２もしくはＣｕＳＯ４等の酸化剤を用いて合成され得る。したがって、当該安定化二量体は、二量体の（ほぼ）２倍の分子軸によって各単量体の一方のアミノ酸残基がシステインと置換される、単量体から成り得る。当該安定化二量体はまた、二量体の２倍の分子軸から離れた各単量体の２つのアミノ酸残基がシステインと置換される、単量体からも成り得る。当該安定化二量体はまた、二量体の２倍の分子軸から離れた各単量体の３つのアミノ酸残基がシステインと置換される、単量体からも成り得る。
かかる配置が、ＦＬＥ領域への接近を制限し得、そのために、実施例１７においてさらに論じられるように、抗ＦＬＥ反応を作り出す分子の能力を低減するように、１種を超える鎖間ジスルフィド結合があり得ることが望ましいものであり得る。
別の好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、ｓＥの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えｓＥの安定化二量体は、上に定義される突然変異Ａ２５９ＣまたはＳ２５５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基２５９Ｃまたは２５５Ｃはジスルフィド鎖間結合によって一緒に結合している。
別の好ましい実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される突然変異Ａ２５９Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｓ２５５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５９Ｃ及び２５５Ｃはジスルフィド鎖間結合によって一緒に結合している。
別の好ましい実施形態では、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される突然変異Ｆ１０８Ｃ及びＴ３１５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、または上に定義される突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基１０８Ｃ及び３１５Ｃまたは残基１０７Ｃ及び３１３Ｃはジスルフィド鎖間結合によって一緒に結合している。
一実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、このＥＤＥは、ｓＥの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えｓＥの安定化二量体は、上に定義される突然変異Ｆ１０８Ｃ及びＡ３１３Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＴ３１５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基１０８Ｃ及び３１３Ｃは２つのｓＥ単量体間でのジスルフィド鎖間結合によって残基３１５Ｃ及び１０７Ｃにそれぞれ結合している。
別の好ましい実施形態では、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される、突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、突然変異Ｓ２５５Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、ならびに突然変異Ａ２５５Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体からなる群から選択され、残基２５９Ｃ、２５５Ｃ、１０８Ｃ、３１５Ｃ、１０７Ｃ、及び３１３Ｃが、ジスルフィド鎖間結合によって残基２５９Ｃ、２５５Ｃ、３１５Ｃ、１０８Ｃ、３１３Ｃ、及び１０７Ｃにそれぞれ結合している。
別の好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｓ２５５Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５９Ｃ、１０８Ｃ、及び３１５Ｃは、ジスルフィド鎖間結合によって残基２５５Ｃ、３１５Ｃ、及び１０８Ｃにそれぞれ結合している。
別の好ましい実施形態では、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される突然変異Ｓ２５５Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５５Ｃ、１０７Ｃ、及び３１３Ｃは、ジスルフィド鎖間結合によって残基２５９Ｃ、３１３Ｃ、及び１０７Ｃにそれぞれ結合している。
ジスルフィド結合による安定化と同様に、安定化はまた、スルフヒドリル反応性架橋剤によっても達成され得ることを理解されよう。それ故に、一実施形態では、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、本発明の安定化組換えｓＥ二量体は、ｓＥ単量体間での少なくとも１つ、２つ、または３つのスルフヒドリル反応性架橋剤（チオール反応性架橋剤とも呼ばれる）によって共有結合的に安定化される。
タンパク質の化学的架橋は、当該技術分野で公知である（概要については、Ｈｅｍａｐｒａｂｈａ，２０１２を参照のこと）。
当然ながら、ｓＥ二量体は、２つの異なる面を有し、一方は、抗体が結合する細胞外培地に曝露され、もう一方は、ウイルス膜に曝露される。
有利には、当該安定化組換えｓＥ二量体は、ウイルス膜に曝露されるｓＥの面に存在する候補アミノ酸残基を含み、それ故に、エピトープの部分ではない。各単量体の各候補アミノ酸残基の一方は、システインに突然変異（置換）され、適切な長さのスルフヒドリル反応性架橋剤の標的物である遊離スルフヒドリル基を産生する。
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ２６２及びＴｈｒ／Ａｌａ２６５は、候補残基である。二量体の文脈においてそれらの間の距離は、それぞれ、１２及び２２Åである。さらに、これらの残基（Ｔｈｒ／Ｓｅｒ２６２、Ｔｈｒ／Ａｌａ２６５）は、完全に保存されない。故に、それらは点突然変異に耐性があり得る。
好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される突然変異Ｔ／Ｓ２６２ＣまたはＴ／Ａ２６５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基２６２Ｃまたは２６５Ｃは、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に結合している。
ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む別の好ましい実施形態では、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される突然変異Ｔ／Ｓ２６２Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｔ／Ａ２６５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２６２Ｃ及び２６５Ｃは、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に結合している。
エピトープの一部であると見なされず、架橋され得る組換えｓＥの領域は、ｓＥの残基１～９から成る領域Ａ、ｓＥの残基２５～３０から成る領域Ｂ、ｓＥの残基２３８～２８２から成る領域Ｃ、ｓＥの残基９６～１１１から成る領域Ｄ、及びｓＥの残基３１１～３１８から成る領域Ｅである。単量体のこれらの５つの領域（Ａ～Ｅ）の残基のうちのいずれかは、組換えｓＥ二量体において他の単量体の他の残基の２５～３０Å未満であり、それ故に、これらの残基は架橋され得る。
有利には、各単量体のこれらの５つの領域における候補アミノ酸残基のうちの１つまたはいくつかは、システインに突然変異（置換）され、上に定義される適切な長さのスルフヒドリル反応性架橋剤の標的物である遊離スルフヒドリル基を産生する。
別の実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、突然変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、ｓＥのアミノ酸残基１～９、２５～３０、２３８～２８２、９６～１１１ ３１１～３１８のうちの少なくとも１つは、システインに突然変異（置換）され、突然変異したシステイン残基は、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に結合している。
スルフヒドリル反応性架橋剤は、好ましくは、同一または非同一の反応基を含むホモ二官能性試薬であり、２つの単量体間での分子間架橋の構築を可能にする。ホモ二官能性架橋剤は、スペーサーアームのいずれかの末端で同一の反応基を有し、一般に、それらは、１ステップの反応手順において使用され得る。本発明のスルフヒドリル反応性架橋剤は、マレイミド、ハロアセチル（好ましくは、ブロモ－またはヨード－アセチル）、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ハロゲン化アルキル、またはアジリジン化合物、アクリロイル誘導体、アリール化剤、またはチオール－ジスルフィド交換試薬（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２０１０、Ｈｅｍａｐｒａｂｈａ，２０１２）、例えばビス（メタンチオスフホネート）（Ｈａｂｅｒｚら、２００６）であり得る。
異なる長さのスペーサーを有する、本発明に従うマレイミドホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤の例としては、ＢＭＯＥ（１，２－ビス－マレイミドエタン）、ＢＭＢ（１，４－ビス－マレイミドブタン）、ＢＭＨ（１，６－ビス－マレイミドヘキサン）、ＴＭＥＡ（トリス－（２－マレイミドエチル）アミン）、ＢＭ（ＰＥＧ）２（１，８－ビスマレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ（ＰＥＧ）３（１，１１－ビスマレイミドトリエチレングリコール）、ＢＭＤＢ（１，４－ビスマレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン）、ＤＴＭＥ（ジチオ－ビス－マレイミドエタン）、ならびに好ましくはＢＭＨ、ＢＭ（ＰＥＧ）２、及びＢＭ（ＰＥＧ）３が挙げられる。
Figure 0007433744000001
スルフヒドリル基によるマレイミド基の特異的反応は、架橋反応による構造シフトの度合いを最小限に抑えるために、軽度の緩衝及びｐＨ条件下で行われる。好ましくは、反応混合物のｐＨは、６．５～７．５であり、可逆ではない安定したチオール－エーテル結合の形成をもたらす（この結合は、還元剤で切断され得ない）。
ジスルフィド結合及びスルフヒドリル反応性架橋剤を介した安定化に加えて、安定化は、改変糖類による２つの単量体の結合によって得られ得ることが理解されよう。この目的を達成するために、グリコシル化部位は、それらに挿入され、クリック化学によってそれらを連結するために、改変糖類と反応させる。
この実施形態に従って、本化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは、組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、突然変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、
－一方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの突然変異を有し、突然変異したアミノ酸残基が、Ｘ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、
－もう一方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの突然変異を有し、突然変異したアミノ酸残基が、Ｙ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、
両方の突然変異した残基が、具体的にはクリック化学によって、第１のｓＥ単量体の糖のＸ官能基をもう一方のｓＥ単量体の糖のＹ官能基と反応させることによって、改変糖類を介して一緒に結合している。
Ｘ官能基とは、Ｙ官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって運ばれる化学基を意味し、当該Ｙ官能基は、好ましくはアジド官能基である。
Ｙ官能基とは、Ｘ官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって運ばれる化学基を意味し、当該Ｘ官能基は、好ましくは末端アルキン官能基である。
改変糖類は、Ｌａｕｇｈｌｉｎら、２００７によって記載されるように、ｓＥ単量体において合成され、導入され、Ｓｐｅｅｒら、２００３によって記載されるように、一緒に結合され得る。
二量体を安定化させる上述の共有結合方法に加えて、非共有結合手段もまた使用してもよい。それ故に、ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む別の実施形態では、この二量体は、二量体界面で当該二量体の空洞を充填させることによって、１つまたは２つの単量体、好ましくは２つの単量体のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸を、かさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。この実施形態に従って、組換えｓＥ二量体の四元立体構造に特有の空洞は、単量体において操作された疎水性置換によって特定され、充填される。
この実施形態に従って、安定化組換えｓＥ二量体は、二量体界面でまたは各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、空洞を形成する領域内で、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。かかる置換は、２つのｓＥ単量体間での疎水性相互作用を増加させることができる。
ＥＤＥが組換えｓＥの安定化二量体を含む好ましい実施形態では、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される２つの組換えｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えｓＥのうちの１つまたは２つの組換えｓＥが、Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、及びＬ２７８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）を有する。突然変異Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、及びＬ２７８Ｆは、組換えｓＥ二量体のＦ２７９周辺の空洞を安定化させ、二量体界面を強化し、ビリオン中のＦ２７９の立体構造を模倣することを可能にする。
二量体を非共有結合的に安定化させる他の手段は、例えば、各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、１つまたは２つの、好ましくは２つの単量体のアミノ酸配列中のアミノ酸を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによる非共有結合性安定化を含む。
好ましい実施形態では、本化合物は、ＥＤＥに結合し、このＥＤＥは組換えｓＥの安定化二量体を含み、安定化組換えｓＥ二量体は、上に定義される２つの組換えｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えｓＥのうちの１つまたは２つの組換えｓＥが、Ｌ２９２Ｆ及びＬ２９４Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）を有する。この突然変異Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎは、ｓＥ二量体立体構造におけるＤ１～Ｄ３リンカーの安定化を可能にすると見なされる。
ＥＤＥが操作によって二量体配置において安定化される好ましい実施形態では、上述のような操作は、二量体の全体の３Ｄ構造の変化をもたらさないか、または全体の３Ｄ構造を実質的に変化せず、天然の二量体における残基は、操作された二量体に空間的に対応する。天然二量体が操作された二量体に空間的に対応する場合、このことは、操作された二量体（またはその部分、例えば、ＶＤＲを特徴付ける際の特に重要な残基、例えば、表２中に示される及び／または以下にさらに論じられる残基に反映させること）の３Ｄモデルが天然二量体の３Ｄモデルに重ね合わされる場合に、天然二量体における骨格原子の空間的位置を特徴付ける配位が、操作された二量体の類似した骨格原子を特徴付ける配位とは約１０オングストローム未満異なることを意味する。骨格原子は、ペプチド骨格を形成するアミノ酸の骨格原子であるか、または３Ｄ折り畳みパターンは、すなわち、側鎖原子のいくつかまたはすべての位置が同様に有意に変化しない場合があるが、側鎖原子を含まない。３Ｄ構造は、ＶＤＥの免疫原性であるかどうかの鍵であり、したがって、好ましい実施形態では、操作は、減少した免疫原性を有する二量体をもたらさない。一実施形態では、操作は、異なる３Ｄ立体構造を有する二量体をもたらさない。好ましくは、操作は、増加した免疫原性を有する二量体をもたらす。かかるアプローチは、参照８４において使用されている。それ故に、一実施形態では、本化合物は、上述のような操作されたＥＤＥに結合する。
天然二量体の３Ｄモデルは、例えば、上述の受入番号１ＯＡＮ、１ＯＫ８、１ＵＺＧ、及び３ＵＡＪの下で、タンパク質データバンクにおいて入手可能な、デング熱ウイルス血清型、例えば、血清型２、３、及び４からのエンベロープ糖タンパク質外部ドメインにおける結晶構造に関する情報を使用するために形成され得る。
特定の突然変異または修飾が３Ｄ構造を変化させるまたは実質的に変化させるかどうかは、ＶＤＥに結合することが知られている本明細書に記載の抗体が操作されたバージョンのＶＤＥに依然として結合することができるかどうかを観察することを含む、異なる技術によって評価され得る。
当業者は、例えば、潜在的な安定化させる修飾の特定に役立つようなコンピュータプログラムを使用することができる
ＥＤＥの免疫原性における操作の効果は、操作された及び操作されていないＥＤＥを投与される場合に対象における抗体反応を比較することによって、または既知の抗ＥＤＥ抗体への結合を比較することによって評価され得る。
あるいは、改変されたエンベロープタンパク質は、デング熱ウイルスにおいて発現され、ウイルスを中和する化合物の能力が評価され得る。
安定化したＥＤＥを提示するために、それぞれのＥＤＥ（骨格タンパク質と称される）に類似の三次元構造を有する非ＥＤＥ異種タンパク質は、改変タンパク質がＥＤＥを保持することができる適切な残基を含有するように改変することができる。それ故に、一実施形態では、本化合物はＥＤＥに結合し、このＥＤＥは、エピトープ骨格タンパク質の一部として提示される。エピトープ骨格タンパク質は、異種の「受容体」骨格タンパク質に融合されるエピトープ配列を含むキメラタンパク質である。エピトープ骨格の設計は、例えば、エピトープが異種骨格タンパク質に融合される場合に、エピトープの天然構造及び立体構造を保存する様式でコンピュータ的に行われる。かかる骨格タンパク質の使用は、当該技術分野で公知であり、かかる方法及び技術は、第ＷＯ ２０１１／０５０１６８号及び参照５４、８２、８３に記載されており、当業者はそこに記載の方法に従い、それらを本発明に適用することができる。
したがって、一実施形態では、ＥＤＥは、エピトープ骨格タンパク質の一部を含み、この骨格タンパク質は、エンベロープ二量体エピトープに共有結合している異種骨格タンパク質を含む。骨格タンパク質は、本化合物がタンパク質、任意に抗体またはその抗原結合部分である場合に、かかる残基と化合物の間、例えば化合物の接触残基間の相互作用を促進するために適切な空間的配向においてＥＤＥの接触残基を保持するという点で、本発明のＥＤＥを作製するのに有用である。接触残基は、別の分子のアミノ酸と直接または間接的に相互作用する（例えば、塩橋を通して直接的または間接的にイオン結合を形成する）分子に存在する任意のアミノ酸である。少なくともＤＥＮＶ－１において、ＥＤＥに結合する化合物において潜在的に重要であると見なされているエンベロープタンパク質の残基は、表２中に詳細されており、骨格タンパク質は、全二量体を示し得るか、または上の選択された残基のみ示し得る。天然二量体またはその一部の３Ｄモデルは、例えば、上述の受入番号１ＯＡＮ、１ＯＫ８、１ＵＺＧ、及び３ＵＡＪの下で、タンパク質データバンクにおいて入手可能な、デング熱ウイルス血清型、例えば、血清型２、３、及び４からのエンベロープ糖タンパク質外部ドメインにおける結晶構造に関する情報を使用するために形成され得る。
突然変異分析は、本発明において特定される抗体への結合において重要であるＤＥＮＶ１及びＤＥＮＶ２の特定の残基を示した。これらの残基は、
ＤＥＮＶ１：Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、
ＤＥＮＶ２：Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０である。
これらの残基のすべては、結合、及びＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０に重要であると見なされる。
したがって、一実施形態では、化合物は、ＥＤＥに結合し、ＥＤＥは骨格タンパク質の一部であり、この骨格タンパク質は、デング熱ウイルスエンベロープタンパク質のＥ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２のうちの１つ以上に対応する少なくとも残基、またはデング熱ウイルスエンベロープタンパク質、具体的にはＤＥＮＶ－１及びＤＥＮＶ－２に同等の残基を保持する。ある特定の残基は、より重要であると見なされ、したがって、ＥＤＥのさらなる実施形態は、デング熱ウイルスエンベロープタンパク質のＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０に対応する少なくとも１つ以上の残基、またはデング熱ウイルスエンベロープタンパク質、具体的にはＤＥＮＶ－１及びＤＥＮＶ－２に同等の残基を保持する骨格タンパク質を含む。
エピトープに接触するのに重要であると見なされるエンベロープタンパク質の残基は、図３１中に示され、例えば、
Ｂ７抗体は、残基Ｎ６７、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｌ８２、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｉ１１３、Ｇ１５２、Ｎ１５３、Ｄ１５４、Ｔ１５５、Ｇ１５６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９でＤＥＮＶ２ ＥＤＥに接触すると見なされており、
Ａ１１抗体は、残基Ｎ６７、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｅ８４、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｖ１１４、Ｎ１５３、Ｄ１５４、Ｔ１５５、Ｇ１５６、Ｈ１５８、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９、Ｖ２５０でＤＥＮＶ２ ＥＤＥに接触すると見なされており、
Ｃ１０抗体は、残基Ｒ２、Ｈ２７、Ｇ２８、Ｅ４４、Ｌ４５、Ｉ４６、Ｋ４７、Ｎ６７、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｓ８１、Ｌ８２、Ｎ８３、Ｅ８４、Ｖ９７、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｔ１１５、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｖ３０９、Ｋ３１０、Ｒ３２３、Ｑ３２５、Ｄ３６２でＤＥＮＶ２ ＥＤＥに接触すると見なされており、
Ｃ１０抗体は、残基Ｒ２、Ｈ２７、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｅ４４、Ｌ４５、Ｔ４６、Ｎ６７、Ｔ６９、Ｔ７０、Ａ７１、Ｔ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｖ９７、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｖ１１３、Ｒ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｍ２７８、Ｄ３０９、Ｋ３１０、Ｖ３２４、Ｋ３２３、Ｋ３２５、Ｔ３６１、Ｎ３６２でＤＥＮＶ４ ＥＤＥに接触すると見なされており、
Ｃ８抗体は、残基Ｎ６７、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｅ７１、Ｓ７２、Ｒ７３、Ｃ７４、Ｑ７７、Ｎ８３、Ｅ８４、Ｖ９７、Ｄ９８、Ｒ９９、Ｗ１０１、Ｇ１０２、Ｎ１０３、Ｇ１０４、Ｃ１０５、Ｇ１０６、Ｌ１１３、Ｅ１４８、Ｈ１５８、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｑ２４８、Ｄ２４９、Ｉ３０８、Ｋ３１０、Ｅ３１１、Ｒ３２３、Ｄ３６２、Ｇ３７４でＤＥＮＶ２ ＥＤＥに接触すると見なされている。
それ故に、化合物、具体的にはＤＥＮＶ２及びＤＥＮＶ４への結合において重要であると見なされているエンベロープタンパク質の残基は、
Ａ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３１０、Ｋ３２３、Ｋ３２５Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ１５３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｑ７７、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ１５５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９、Ｖ３２４、Ｖ９７、Ｗ１０１であるか、
またはデング熱ウイルスエンベロープタンパク質の同等残基である。
骨格タンパク質は、
デング熱ウイルスエンベロープタンパク質のＥ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、Ａ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３２３、Ｋ３２５Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９Ｖ３２４、Ｖ９７、またはその同等残基の、一連の残基の両方から選択される１つ以上の残基を示し得るか、またはこれらのうちの少なくとも１つ以上、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはそのすべてを示し得る。
加えて、骨格タンパク質は、前述のように、二量体配置の安定性を増加させると見なされている残基：Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｌ１０７Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、Ｓ２５５Ｃ、Ａ２５９Ｃ、Ｔ／Ｓ２６２Ｃ、Ｔ／Ａ２６５Ｃ、Ｌ２７８Ｆ、Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎ、Ａ３１３Ｃ、及びＴ３１５Ｃのセットのうちの任意の１つ以上またはそのすべてを示し得る。
骨格タンパク質は、二量体、または二量体の断片を保持し得、免疫原性に必須であると見なされている上記の改変のうちのいずれかを含み得、及び／または増加した二量体の安定性、例えば増加したジスルフィド結合をもたらし得る。
さらに、この骨格は、改善されたＥＤＥが示されるような骨格であり得る。一実施形態では、本化合物は、したがって、改善されたＥＤＥに結合する。例えば、以下及び実施例２及び５に記載されるように、デング熱感染を有する患者は、有用な抗体であると見なされるＶＤＥに向けて進められる抗体、または有用であると見なされない融合ループ（抗ＦＬ抗体）に向かって配向される抗体のいずれかを有する傾向がある。それ故に、骨格は、ＥＤＥのみが提示されるように、かつ、化合物、例えば、ＦＬに作り出される、抗体またはその抗原結合部分の可能性を排除するような方法で提示されるように操作され得る。したがって、ある好ましい実施形態では、ＥＤＥは、任意に骨格タンパク質に組み込むことによって、抗体をＦＬではなく、ＥＤＥに作り出すことができる。
骨格タンパク質とは無関係に、エンベロープタンパク質は、改善されたＥＤＥが生成されるように操作され得る。上述のように、抗ＦＬ抗体によって認識することができず、かかる抗体を作り出すことができないＥＤＥは、改善されたＥＤＥであると見なされる。これは、エンベロープタンパク質において１つ以上の突然変異、欠失、もしくは挿入によって、またハイブリッドタンパク質を生成することによって達成され得、特異的エピトープは、抗ＦＬ抗体を作り出し得るいかなる抗原も用いることなく、骨格タンパク質に融合される。
一実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＮまたはＯ結合型グリカン配列を添加することによって、（ウイルスの内側に突出する）二量体の内部表面を改変し、それをより少ない免疫原性にすることによって操作される。
二量体に新しい表面をつける広範囲の変異原性は、残基の突然変異及び／またはグリカンの添加によって非ＥＤ準最適反応の生成をさらに低減するのに有用であり得る。
一例として、Ｌ２７８Ｆ突然変異は、ｋｌループを再形成し、ビリオン様の立体構造を模倣すると見なされる。
コアＥＤＥエピトープのモデリング及び最適化はまた、所望のＥＤＥ反応を誘発するために最適な配列を生成し、結合抗体及び中和抗体を提供するためにも有用であり得る。
ＥＤＥが、増加した二量体の安定性に影響を及ぼす骨格内に保持される天然のエンベロープタンパク質であり得ることが理解されよう。ＥＤＥはまた、いかなる骨格とも無関係に二量体の安定性を増加するように操作され得る。この２つは、一実施形態では、ＥＤＥは、異種骨格タンパク質内に保持されたエンベロープタンパク質が二量体配置において改善された安定性を有するように操作される二量体を含むように組み合わせられ得る。あるいは、エンベロープタンパク質は、タンパク質の関連部分のみが存在するように操作され得、これが異種骨格タンパク質において保持され得る。
二量体立体構造は、例えば、２つのエンベロープポリペプチドドメインを含む単一のポリペプチド鎖として表される２つのエンベロープ単量体間に、長いリンカー、例えばグリシン－セリンリッチなライナーを作製することによって安定化させてもよい。あるいはまたは加えて、二量体構造は、二量体の内部に面する表面または二量体と関連するタグに結合する任意の抗体（例えば）によって安定化させてもよい。
エンベロープタンパク質、ｓＥ、ｓＥ二量体、またはエンベロープタンパク質二量体への任意の言及はまた、その範囲内に、骨格タンパク質または構造も含み、ＥＤＥを作製し、適当なＥＤＥを示すために、特定の立体構造において保持される特定の残基を含む。
エンベロープヌクレオチド配列は、このエンベロープタンパク質が突然変異、挿入、または欠失のうちのいずれか１つ以上を有するように操作され得る。ヌクレオチド配列は、特定のエンベロープタンパク質（またはその部分）の天然配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するようなものであり得る。
さらなる実施形態では、エンベロープタンパク質は、別の血清型のデング熱ウイルスからのエンベロープタンパク質（またはその部分（複数を含む）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するように操作され得る。好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、すべての血清型のデング熱ウイルスからの２つの異なるエンベロープタンパク質（またはその部分（複数を含む）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）、より好ましくは４つの異なるエンベロープタンパク質（またはその部分（複数を含む）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）、最も好ましくはすべてのエンベロープタンパク質（またはその部分（複数を含む）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するように操作され得る。
上記のように、エンベロープタンパク質は、実際には、天然エンベロープタンパク質に対して非常に低い相同性を有するように操作され得るが、ＥＤＥの完全性及び立体構造が維持されるか、またはＥＤＥが改善される、例えば、抗ＦＬ抗体を育てることができないような方法で改変される。それ故に、配列相同性のレベルは、必ずしも、３Ｄ構造相同性または機能的相同性を表示しない。例えば、ＥＤＥを含む構造をコードする特定の配列は、実際には、天然エンベロープタンパク質に対して非常に低いレベルの相同性を有し得るが、それでもなお、本発明の有用な化合物と見なされ得る。例えば、タンパク質は、天然エンベロープタンパク質に対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％相同性を有し得、この構造をコードするヌクレオチド配列は、天然エンベロープ配列に対応して低い配列同一性を有し得る。
好ましい実施形態では、ＥＤＥを含むエンベロープタンパク質または構造は、デング熱ウイルスエンベロープタンパク質（またはその部分（複数を含む）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性、またはすべての血清型のデング熱ウイルスからの２つの異なるエンベロープタンパク質（またはその部分（複数を含む）、例えば、少なくとも８、９、または１０の連続的なアミノ酸のうちの１つ以上の部分）、より好ましくは４つの異なるエンベロープタンパク質、最も好ましくはすべてのエンベロープタンパク質に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同性を有するか、またはＥＤＥを含むタンパク質または構造は、１種以上の血清型のデング熱ウイルスの天然エンベロープタンパク質に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％相同性を有し、このタンパク質は、Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、またはデング熱ウイルスエンベロープタンパク質の同等残基のうちの１つ以上、または任意にこれらのすべてを含む。
これらの残基のいくつかは、その他よりも重要であると見なされ、したがって、ＥＤＥのさらなる実施形態では、ＥＤＥを含むエンベロープタンパク質または構造は、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０、またはデング熱ウイルスエンベロープタンパク質の同等残基のうちの１つ以上、または任意にこれらのすべてを含む。
エンベロープタンパク質の残基Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、またはデング熱ウイルスタンパク質の同等残基は、ＥＤＥへの化合物の結合に必要とされると見なされる。それ故に、一実施形態では、ＥＤＥを含むエンベロープタンパク質または構造は、これらの残基のうちの１つ以上、またはこれらの全てを含む。
抗ＦＬ抗体は、ほとんどの場合、アラニン走査分析において突然変異した残基の中から残基Ｗ１０１のみを必要とするように思われ（実施例２）、他の残基のうちのいずれかの突然変異によって影響を受けないが、一方、抗ＥＤＥ抗体は、はるかに大きなエピトープを必要とし、抗ＦＬ抗体が必要とするように残基Ｗ１０１の存在を必要とするが、多くの他の残基での突然変異によって影響を受ける。したがって、一実施形態では、ＥＤＥは、エンベロープ二量体エピトープにおいて残基Ｗ１０１及び位置Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、または同等残基のうちの少なくとも１つ以上が本化合物の結合に必要である、エピトープとして定義される。
特定の一実施形態では、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインＩＩＩの残基Ｋ３１０を含む。
一実施形態では、ＥＤＥは、例えば、各エンベロープ、例えば、ｓＥ、単量体の位置６７（Ａｓｎ６７グリカン）で及び／または位置１５３（Ａｓｎ１５３グリカン）で、好ましくは各単量体の少なくとも位置６７（Ａｓｎ６７グリカン）でグリコシル化される。
ある実施形態に従って、本発明の化合物は、エンベロープタンパク質二量体のＮ６７グリカン鎖またはエンベロープタンパク質二量体のＮ１５３グリカン鎖に接触する。本化合物は、エンベロープタンパク質二量体のＮ６７及びＮ１５３グリカン鎖の両方に接触することができると理解されよう。
特定の例では、本化合物は、ＣＤＲ Ｈ２がエンベロープタンパク質のＮ６７グリカン鎖と相互作用する抗体である。
一実施形態では、本化合物は、１種以上の血清型のデング熱ウイルス、存在する場合、好ましくはすべての血清型のデング熱ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、ＤＥＮＶ－２またはＤＥＮＶ－４におけるＡ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３１０、Ｋ３２３、Ｋ３２５Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ１５３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｑ７７、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ１５５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９Ｖ３２４、Ｖ９７、Ｗ１０１のうちの任意の１つ以上でＥＤＥに接触する。
一実施形態では、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインＩＩ側上のｂストランド、及び（二量体界面の向かいにある）ドメインＩ側上の「１５０ループ」（例えば、図２９を参照のこと）によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、１５０ループが残基１４８～１５９に広がり、ドメインＩのｂストランドＥ０及びＦ０を接続し、Ｎ１５３グリカンを担持し、これは二量体におけるパートナーサブユニットの融合ループを覆う。１５０ループは、配列番号１４８の１５０ループのＤｅｎｖ－１ ＱＨＱＶＧＮＥＴＴＥＨＧ、配列番号１１４９の１５０ループのＤｅｎｖ ２ ＥＨＡＶＧＮＤＴＧＫＨＧ、配列番号１５０の１５０ループのＤｅｎｖ ３ ＱＨＱＶＧＮＥＴＱＧ、配列番号１５１の１５０ループのＤｅｎｖ ４ ＴＨＡＶＧＮＤＩＰＮＨＧを含むと見なされる。
場合によっては、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインＩＩのエンベロープタンパク質を含み、任意に、ドメインＩＩの以下の特性、ｂ鎖（残基６７～７４）、すぐ上流の融合ループ及び残基（残基９７～１０６）、ならびにｉｊループ（残基２４６～２４９）、ならびに残基２４３～２５１及び残基３０７～３１４のうちの任意の１つ以上をさらに含む。
一実施形態では、ＥＤＥは、残基６７～７４、残基９７～１０６、残基１４８～１５９、残基２４３～２５１、及び残基３０７～３１４からなる５つのポリペプチドセグメントのデング熱ウイルス糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（ｓＥ）を含む。
それ故に、一実施形態では、本発明はまた、化合物、例えば、上に定義される安定化組換えｓＥ二量体に対する単離中和抗体またはその抗原結合断片も提供し、当該抗体またはその断片は、残基６７～７４、残基９７～１０６、残基１４８－１５９、残基２４３～２５１、及び残基３０７～３１４からなる５つのポリペプチドセグメントのデング熱ウイルス糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（ｓＥ）に結合する。
ポリペプチドセグメントまたはアミノ酸残基に対する本発明に従うその抗体断片の結合の特徴付けは、例えば、以下の実施例に記載される結晶化試験によって行われ得る。
好ましくは、ＥＤＥへの結合に加えて、本化合物は、ウイルスを中和することができる。好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のデング熱ウイルスを、好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９８％、例えば１００％中和することができ、好ましくは昆虫細胞及びヒト細胞の両方で作られるすべての血清型のデング熱ウイルスを少なくとも９０％または少なくとも９８％、例えば１００％中和する。中和反応及び中和アッセイ技術についての選好は、前述された通りである。
一実施形態では、ＥＤＥは、完全長エンベロープタンパク質の二量体を含む。別の実施形態では、ＥＤＥは、エンベロープ外部ドメイン（ｓＥ）の二量体を含む。さらなる実施形態では、エンベロープタンパク質は、エンベロープタンパク質の外部ドメインの（上で論じられるように、約）４００のアミノ末端残基を含む。例えば、図２８を参照のこと。上記の完全長エンベロープタンパク質の二量体の安定性についての選好はまた、エンベロープタンパク質の切断型外部ドメインにも適用する。したがって、エンベロープタンパク質の外部ドメインの二量体は、操作を通して安定化され得るか、または骨格タンパク質に組み込むことによって安定化され得るか、またはハイブリッド二量体を含み得る。
さらなる実施形態では、本発明の化合物は、酸性ｐＨでインキュベートされる、デング熱ウイルスまたはビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しないであろうものである。酸性ｐＨは、エンベロープタンパク質が三量体配置を不可逆的に導入するようにする。本発明者らは、本発明の化合物が低いｐＨでウイルス粒子に結合しないことを見出した（実施例４を参照のこと）。したがって、一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分は、酸性ｐＨでインキュベートされる、デング熱ウイルスまたはビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しない。酸性ｐＨとは、７より低い任意のｐＨ、好ましくはｐＨ５．５を意味する。
したがって、当業者は、特定の化合物が本発明のこの実施形態に従う本発明の化合物であるかどうか、本化合物が、ａ）フリン活性を欠いている細胞で作られるビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、ｂ）高い割合のｐｒＭタンパク質を有するビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、及び／またはｃ）酸性条件下でインキュベートされるビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、のうちの１つ以上に結合することができないかどうかを単に特定することによってを容易に特定することができる。
上述のビリオン、サブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に対する本化合物の結合能力をアッセイするための方法は、ＥＤＥに結合する本化合物の能力をアッセイすることに関しては前述に提供され、実施例４に詳述されており、概して、本化合物が結合することができるかどうかをアッセイするために、特定のビリオンまたはウイルス様粒子に対してＥＬＩＳＡを単に含む。本化合物は、天然ＥＤＥまたはビリオンまたはウイルス様粒子に結合するか、または有意に結合する場合、ならびにａ）フリン活性を欠いている細胞で作られる、ｂ）高い割合のｐｒＭタンパク質を有する、及び／またはｃ）酸性条件下でインキュベートされる、ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しない場合、有用であると見なされる。
本発明は、特定の化合物をさらに含む。例えば、一実施形態では、本化合物は、重鎖配列番号１及び軽鎖配列番号３７、重鎖配列番号２及び軽鎖配列番号３８、重鎖配列番号３及び軽鎖配列番号３９、または重鎖配列番号４及び軽鎖配列番号４０の配列を含む抗体である。本発明はまた、これらの抗体の切断及び突然変異も含み、そのため、本化合物はその抗原結合部分であることが理解されよう。上記の配列に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％相同性の配列相同性を有する抗体は、本発明に含まれる。抗体の特定の配列である軽鎖及び重鎖は、配列番号１～４、３７～１４１、１４１～１４７、例えば、図２９に与えられる。
さらなる実施形態では、本化合物は抗体であり、重鎖配列番号１ と軽鎖配列番号３７、３８、３９、もしくは４０のいずれか、重鎖配列番号２と軽鎖配列番号３７、３８、３９、もしくは４０のいずれか、重鎖配列番号３と軽鎖配列番号３７、３８、３９、もしくは４０のいずれか、または重鎖配列番号４と軽鎖配列番号３７、３８、３９、もしくは４０のいずれかを含む。
具体的な重鎖及び軽鎖の特定の残基は、ＥＤＥに結合するために重要であると見なされる。それ故に、一実施形態では、配列相同性が上の配列に対して少なくとも９０％である場合、存在する場合、以下の残基は、
配列番号１ － Ｔ５２、Ｅ５４、Ｄ５６、Ｓ５７、Ａ５８、Ｋ６５、Ｇ６６、Ｔ６９、Ｅ８２、Ｎ８４、Ｓ８５、Ｙ１００、Ｎ１０２、Ｆ１０３、Ｙ１０４、Ｙ１０５、Ｙ１０６、
配列番号２ － Ｇ５５４、Ｎ５５、Ｎ５７、Ｋ５９、Ｑ６２、Ｑ６５、Ｇ６６、Ｒ９４、Ｒ９８、Ｆ９９、Ｙ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｐ１０８、Ｄ１０９、Ｓ１１０、Ｄ１１７、Ｖ１１８、
配列番号３ － Ｖ２、Ｓ２８、Ｎ３１、Ｄ５４、Ｓ５６、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｋ６５、Ｇ６６、Ｒ９４、Ｒ９８、Ｆ９９、Ｙ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｐ１０８、Ｄ１０９、Ｓ１１０、Ｄ１１７、Ｖ１１８、
配列番号４ － Ｖ２、Ｔ２８、Ｓ３１、Ｄ５４、Ｓ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｇ６６、Ｆ６８、Ｍ６９、Ｒ９４、Ｒ９８、Ｙ９９、Ｙ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｐ１０８、Ｄ１０９、Ｎ１１０、Ｄ１１７、Ｖ１１８、
配列番号３７ － Ｓ３０、Ｔ３１、Ｆ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｓ５２、Ｒ５４、Ｒ６６、Ｒ９１、Ｙ９２、Ｎ９３、Ｗ９４、
配列番号３８ － Ｓ２６、Ｓ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｆ３２、Ｎ３３、Ｙ３４、Ｄ５２、Ｔ５４、Ｓ５５、Ｒ５６、Ｓ６２、Ｓ９５、Ｒ９６、Ｇ９７、
配列番号３９ － Ｙ５１、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｇ５９、Ｓ９６、Ｒ９７、
配列番号４０ － Ｙ５１、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｋ９７である。
抗体は、軽鎖及び重鎖から成り、各軽鎖及び重鎖内には、３つの可変領域がある。これらの領域のそれぞれの最も可変の部分は、相補性決定領域であり、抗原結合及び認識には最も不可欠であると見なされる。したがって、一実施形態では、本化合物は、以下のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有さない、１つまたは２つアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する以下のアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む：
配列番号５もしくは配列番号８もしくは配列番号１１もしくは配列番号１４
及び／または
配列番号６もしく配列番号９もしく配列番号１２もしく配列番号１５
及び／または
配列番号７もしくは配列番号１０もしくは配列番号１３もしくは配列番号１６
及び／または
配列番号１７もしくは配列番号２０もしくは配列番号２３もしくは配列番号２６
及び／または
配列番号１８もしくは配列番号２１もしくは配列番号２４もしくは配列番号２７
及び／または
配列番号１９もしくは配列番号２２もしくは配列番号２５もしくは配列番号２８。
特定の化合物は、アミノ酸置換、挿入、または欠失を有さない、１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する以下の配列を含んでもよい。
重鎖：
配列番号５及び配列番号６及び配列番号７
または
配列番号８及び配列番号９及び配列番号１０
または
配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３
または
配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６
ならびに／あるいは
軽鎖：
配列番号１７及び配列番号１８及び配列番号１９
または
配列番号２０及び配列番号２１及び配列番号２２
または
配列番号２３及び配列番号２４及び配列番号２５
または
配列番号２６及び配列番号２７及び配列番号２８。
好ましい実施形態では、特定の化合物は、アミノ酸置換、挿入、または欠失を有さない、１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する以下の配列を含んでもよい。
重鎖配列番号５及び配列番号６及び配列番号７と軽鎖配列番号１７及び配列番号１８及び配列番号１９
または
重鎖配列番号８及び配列番号９及び配列番号１０と軽鎖配列番号２０及び配列番号２１及び配列番号２２
または
重鎖配列番号１１及び配列番号１２及び配列番号１３と軽鎖配列番号２３及び配列番号２４及び配列番号２５
または
重鎖配列番号１４及び配列番号１５及び配列番号１６と軽鎖配列番号２６及び配列番号２７及び配列番号２８
または
重鎖配列番号１１、１２、及び１３と、任意に軽鎖配列番号２５、任意にアミノ酸配列の配列番号２３及び２４
または
重鎖配列番号１４、１５、及び１６と、任意に軽鎖配列番号２８、任意にアミノ酸配列の配列番号２６及び２７
または
重鎖配列番号３と、任意に軽鎖配列番号２５、好ましくは配列番号１４０の軽鎖可変領域
または
配列番号４の重鎖可変領域と、任意に軽鎖配列番号２８、好ましくは配列番号１４１の軽鎖可変領域。
さらなる実施形態では、上の配列の特定の残基は、抗原結合に重要であると見なされる。したがって、この実施形態では、存在する場合、以下の残基は、
配列番号６の残基３がＴであり、残基５がＥであり、残基７がＤであり、残基８がＳであり、残基９がＡであり、残基１６がＫであり、残基１７がＧであり、
配列番号７の残基２がＹであり、残基４がＮであり、残基５がＦであり、残基６がＹであり、残基７がＹであり、残基８がＹであり、
配列番号９の残基５がＧであり、残基６がＮであり、残基１０がＫであり、残基１３がＱであり、残基１６がＱであり、残基１７がＤであり、
配列番号１０の残基５がＤであり、残基６がＹであり、残基８がＤであり、残基１０がＷであり、残基１１がＦであり、残基１２がＰであり、残基１４がＬであり、
配列番号１１の残基１がＮであり、
配列番号１２の残基５がＤであり、残基７がＳであり、残基８がＴであり、残基９がＲであり、残基１６がＫであり、残基１７がＧであり、
配列番号１３の残基４がＲであり、残基５がＦであり、残基６がＹであり、残基７がＹであり、残基８がＤであり、残基９がＳであり、残基１０がＴであり、残基１２がＹであり、残基１３がＹであり、残基１４がＰであり、残基１５がＤであり、残基１６がＳであり、
配列番号１４の残基１がＳであり、
配列番号１５の残基５がＤであり、残基７がＳであり、残基８がＳであり、残基９がＴであり、残基１７がＧまたはＨであり、
配列番号１６の残基４がＲであり、残基５がＹであり、残基６がＹであり、残基７がＹであり、残基８がＤであり、残基９がＳであり、残基１０がＴであり、残基１２がＹであり、残基１３がＹであり、残基１４がＰであり、残基１５がＤであり、残基１６がＮであり、
配列番号１７の残基７がＳであり、残基８がＴであり、残基９がＦであり、
配列番号１８の残基１がＤであり、残基３がＳであり、残基５がＲであり、
配列番号１９の残基３がＲであり、残基４がＹであり、残基５がＮであり、
配列番号２０の残基４がＳであり、残基５がＳであり、残基８がＧであり、残基９がＧであり、残基１０がＦであり、残基１１がＮであり、残基１２がＹであり、
配列番号２１の残基１がＤであり、残基３がＴであり、残基４がＳであり、残基５がＲであり、
配列番号２２の残基５がＳであり、残基６がＲであり、残基７がＧであり、
配列番号２４の残基５がＲであり、残基６がＰであり、残基７がＳであり、
配列番号２５の残基６がＳであり、残基７がＲであり、
配列番号２７の残基５がＲであり、残基６がＰであり、残基７がＳである。
タンパク質骨格における抗原性ＥＤＥの提示に関して上述のように、本化合物、例えばタンパク質、例えば抗体はまた、例えばタンパク質骨格内に保持される、より大きな構造の一部であってもよい。この骨格についての選好は、前述された通りである。例えば、一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、より大きなポリペプチド内にある。
好ましい実施形態では、上の実施形態のうちのいずれかに記載のＥＤＥに結合する化合物はまた、デング熱ウイルスを、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％または９８％、及び最も好ましくは１００％中和する。さらに好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のデング熱ウイルスを、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％または９８％、及び最も好ましくは１００％中和する。化合物、ウイルスまたはサブウイルスまたはウイルス様粒子、及び宿主細胞の濃度を含む、中和反応についての選好は、本発明の第１の態様では、前述された通りである。
本発明の第１の態様に関しては、ＥＤＥに結合することができる化合物が、昆虫細胞、例えばＣ６／３６昆虫細胞、及びヒト細胞、例えば初代ヒト細胞、例えば樹状細胞の両方で作られるウイルスを中和することができる場合、好ましい。好ましくは、本化合物は、上で論じられるように、昆虫細胞、例えばＣ６／３６昆虫細胞、及びヒト細胞、例えば初代ヒト細胞、例えば樹状細胞の両方で作られるデング熱ウイルスを、同じレベルまで中和する。化合物のウイルスを中和する能力は、上述のように、実施例において試験することができる。最も好ましい実施形態では、本化合物は、昆虫細胞及びヒト細胞の両方で作られるすべての血清型のデング熱ウイルスを完全に（すなわち１００％）中和することができる。
好ましい実施形態では、本化合物は、抗体またはその抗原結合部分である。抗原結合部分は、Ｆｖ部分、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片）、またはドメイン抗体であってもよい。
一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、モノクローナル抗体であるか、または、モノクローナル抗体由来である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ポリクローナル抗体であるか、または、ポリクローナル抗体由来である。さらなる実施形態では、本化合物は、
ａ）モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、
ｂ）ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
ｃ）モノクローナル及びポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、例えば、モノクローナル抗体対ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の比率は、１０：１、８：１、６：１、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、または１：１０である、抗体またはその抗原結合部分の混合物を含む組成物である。
本化合物は、組換えタンパク質、例えば、組換え抗体またはその抗原結合部分であってもよいことが理解されよう。本化合物はまた、合成的に作製されてもよい。本化合物は、組換え的及び合成的に産生された組み合わせであってもよい。
本発明はまた、かかる化合物、例えばタンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合部分を作製する手段も含む。
したがって、本化合物が組換え手段によって産生され得る、例えば本化合物、例えばポリペプチド、例えば、抗体またはその抗原結合部分が、
ａ）ヒト細胞株、任意にＣＨＯ細胞、または
ｂ）哺乳動物、任意にヒト、または
ｃ）微生物、または
ｄ）昆虫細胞株、を含む、様々な生物から産生及び単離または精製され得ることも理解されよう。
単離または精製されるとは、この薬剤は、その自然環境から除去され、この薬剤が精製される程度に反映しないことを意味する。
したがって、本発明は、ヒト細胞株、任意にＣＨＯ細胞、または哺乳動物、任意にヒト、または微生物、または昆虫細胞株を含む、様々な生物からの本発明の化合物の単離または精製を含む。
本化合物が、ポリペプチド、例えば、抗体またはその抗原結合部分であるか、または例えば、タンパク質骨格に含まれる場合には、この化合物は、核酸によってコードされてもよい。核酸とは、一本または二本鎖の及びすべてのそれらの様々な形態でＤＮＡ及びＲＮＡの両方の意味を含む。したがって、本発明は、本発明のタンパク質性化合物のうちのいずれかをコードする核酸を含む。具体的には、配列番号４１～４８が本発明に含まれる。前に言及した可能性のうちのいずれかを網羅する配列、例えば、以下のうちのいずれかをコードする一部分を含む核酸配列であるような、サイレント突然変異をもたらし得る突然変異由来のまたはそれを含む配列番号４１～４８を含む任意の配列が含まれる：
配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号２、または配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号３、または配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号４、または配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号３７、または配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号３８、または配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号３９、または配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号４０、または配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＴ５２、Ｅ５４、Ｄ５６、Ｓ５７、Ａ５８、Ｋ６５、Ｇ６６、Ｔ６９、Ｅ８２、Ｎ８４、Ｓ８５、Ｙ１００、Ｎ１０２、Ｆ１０３、Ｙ１０４、Ｙ１０５、Ｙ１０６である、配列番号１に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＧ５５４、Ｎ５５、Ｎ５７、Ｋ５９、Ｑ６２、Ｑ６５、Ｇ６６、Ｒ９４、Ｒ９８、Ｆ９９、Ｙ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｐ１０８、Ｄ１０９、Ｓ１１０、Ｄ１１７、Ｖ１１８である、配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＶ２、Ｓ２８、Ｎ３１、Ｄ５４、Ｓ５６、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｋ６５、Ｇ６６、Ｒ９４、Ｒ９８、Ｆ９９、Ｙ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｐ１０８、Ｄ１０９、Ｓ１１０、Ｄ１１７、Ｖ１１８である、配列番号３に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＶ２、Ｔ２８、Ｓ３１、Ｄ５４、Ｓ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｇ６６、Ｆ６８、Ｍ６９、Ｒ９４、Ｒ９８、Ｙ９９、Ｙ１００、Ｙ１０１、Ｄ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｙ１０６、Ｙ１０７、Ｐ１０８、Ｄ１０９、Ｎ１１０、Ｄ１１７、Ｖ１１８である、配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＳ３０、Ｔ３１、Ｆ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｓ５２、Ｒ５４、Ｒ６６、Ｒ９１、Ｙ９２、Ｎ９３、Ｗ９４である、配列番号３７に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＳ２６、Ｓ２７、Ｇ３０、Ｇ３１、Ｆ３２、Ｎ３３、Ｙ３４、Ｄ５２、Ｔ５４、Ｓ５５、Ｒ５６、Ｓ６２、Ｓ９５、Ｒ９６、Ｇ９７である、配列番号３８に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＹ５１、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｇ５９、Ｓ９６、Ｒ９７である、配列番号３９に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
残基がＹ５１、Ｒ５６、Ｐ５７、Ｓ５８、Ｋ９７である、配列番号４０に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列、
配列番号５、または配列番号５と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号６、または任意に、残基３がＴであり、残基５がＥであり、残基７がＤであり、残基８がＳであり、残基９がＡであり、残基１６がＫであり、残基１７がＧである、配列番号６と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号７、または任意に、残基２がＹであり、残基４がＮであり、残基５がＦであり、残基６がＹであり、残基７がＹであり、残基８がＹである、配列番号７と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号８、または配列番号８と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号９、または任意に、残基５がＧであり、残基６がＮであり、残基１０がＫであり、残基１３がＱであり、残基１６がＱであり、残基１７がＤである、配列番号９と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１０、または任意に、残基５がＤであり、残基６がＹであり、残基８がＤであり、残基１０がＷであり、残基１１がＦであり、残基１２がＰであり、残基１４がＬである、配列番号１０と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１１、または任意に、残基１がＮである、配列番号１１と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１２、または任意に、残基５がＤであり、残基７がＳであり、残基８がＴであり、残基９がＲであり、残基１６がＫであり、残基１７がＧである、配列番号１２と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１３、または任意に、残基４がＲであり、残基５がＦであり、残基６がＹであり、残基７がＹであり、残基８がＤであり、残基９がＳであり、残基１０がＴであり、残基１２がＹであり、残基１３がＹであり、残基１４がＰであり、残基１５がＤであり、残基１６がＳである、配列番号１３と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１４、または任意に、残基１がＳである、配列番号１４と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１５、または任意に、残基５がＤであり、残基７がＳであり、残基８がＳであり、残基９がＴであり、残基１７がＧまたはＨである、配列番号１５と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１６、または任意に、残基４がＲであり、残基５がＹであり、残基６がＹであり、残基７がＹであり、残基８がＤであり、残基９がＳであり、残基１０がＴであり、残基１２がＹであり、残基１３がＹであり、残基１４がＰであり、残基１５がＤであり、残基１６がＮである、配列番号１６と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１７、または任意に、残基７がＳであり、残基８がＴであり、残基９がＦである、配列番号１７と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１８、または任意に、残基１がＤであり、残基３がＳであり、残基５がＲである、配列番号１８と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号１９、または任意に、残基３がＲであり、残基４がＹであり、残基５がＮである、配列番号１９と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２０、または任意に、残基４がＳであり、残基５がＳであり、残基８がＧであり、残基９がＧであり、残基１０がＦであり、残基１１がＮであり、残基１２がＹである、配列番号２０と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２１、または任意に、残基１がＤであり、残基３がＴであり、残基４がＳであり、残基５がＲである、配列番号２１と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２２、または任意に、残基５がＳであり、残基６がＲであり、残基７がＧである、配列番号２２と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２３、または配列番号２３と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２４、または任意に、残基５がＲであり、残基６がＰであり、残基７がＳである、配列番号２４と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２５、または任意に、残基６がＳであり、残基７がＲである、配列番号２５と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２６、または配列番号２６と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
配列番号２７、または任意に、残基５がＲであり、残基６がＰであり、残基７がＳである、配列番号２７と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列、
ならびに
配列番号２８、または配列番号２８と比較して１つまたは２つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するポリペプチドをもたらす配列。
核酸は、イントロンを含んでも、含まなくてもよい。核酸はまた、その後の翻訳ポリペプチドの精製を可能にするために修飾されてもよく、例えば、目的とするポリペプチドのオープンリーディングフレームは、その後の精製を可能にするためにタグ、例えばｍｙｃタグまたはｈｉｓタグを組み込むように修飾されてもよい。
核酸はまた、例えば、最終ポリペプチド配列に影響を及ぼすことなく、翻訳されるべき生物によってより良好に翻訳されるように最適化されたコドンに修飾されてもよい。
本開示の核酸は、当業者に周知の多くの方法、例えば、古典的な変異誘発、化学的処理、制限消化、ライゲーション、及びＰＣＲを用いて産生または修飾され得る。
本発明の核酸は、ベクターに組み込まれてもよい。それ故に、本発明はまた、核酸を含むベクターを含んでもよい。ベクターとは、核酸の増幅のクローニングのための、または標的生物への挿入のためのビヒクルを意味し、例えば、ベクターは、標的生物に、例えば標的生物のゲノムに本発明の核酸を標的とするために使用される、プラスミドであっても、核酸であってもよい。ベクターは、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの発現のために必要とされるヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、例えば、プロモーター配列または終止配列は、本発明の核酸に動作可能に連結されてもよく、レポーター遺伝子、例えば抗生物質抵抗性カセットを含んでもよい。ベクターは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、線状であっても、環状であってもよい。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。
上述のＥＤＥに結合することができる化合物を提供することに加えて、本発明のさらなる態様はまた、以下に定義されるＥＤＥ化合物を提供する。本発明はまた、核酸またはベクターを含む宿主細胞に加えて、本発明のＥＤＥ化合物をコードする核酸またはベクターを提供する。例えば、上述の核酸及びベクターについての選好はまた、当業者には明らかであるような、本発明の本態様に関連してもよい。それ故に、本発明は、以下に定義されるＥＤＥ化合物、そのようなＥＤＥ化合物をコードする核酸、または当該核酸を含むベクター、または当該核酸もしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。
ＥＤＥ化合物は、エンベロープ依存性エピトープとして上述のエピトープを提供するよう意図されている。ＥＤＥ化合物は、本発明の１つ以上のＥＤＥに特異的な抗体、例えば、上で論じられるように、または実施例において例証されるように、好ましい中和抗体に特異的に結合してもよい。ＥＤＥ化合物は、典型的には、ポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの４００アミノ末端残基である。本明細書で使用される「４００アミノ末端残基」とは、約４００アミノ末端残基、例えば、上述の及び当業者には明らかであろう、３５０～４５０残基、３２０～４７０残基、または３３０～４８０残基（もしくはその組み合わせ）、例えば３８０～４２０残基、例えば３９０～４１０残基、例えば３９５または３９３残基が含まれる。エンベロープタンパク質は、ＤＥＮＶ－１、ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－３及びＤＥＮＶ－３、及びＤＥＮＶ－４、（配列番号２９、３１、３３、または３５）からのエンベロープタンパク質、または配列番号２９、３１、３３、または３５の配列に少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質のうちのいずれかであってもよい。この二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。好ましい実施形態では、この二量体は、無傷ウイルス粒子、またはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に組み込まれないが、むしろ、例えば、単量体エンベロープポリペプチドの分子量の２倍の分子量を有する遊離二量体である。例えば、タンパク質骨格の一部として、本明細書に記載のＥＤＥまたはＥＤＥ化合物、例えば、操作されたエンベロープタンパク質のうちのいずれかの形態が、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子の一部として潜在的に提示されてもよいことが理解されよう。
別の実施形態では、ＥＤＥ化合物は、二量体配置において増加した安定性を有するように操作されている、例えば、二量体間の共有及び／または非共有結合の増加したレベルを有するように操作されている、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基を含む。
好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、本発明の上述の態様に従って、安定化組換えデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（組換えｓＥ）二量体であり、例えば、安定化組換えデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（組換えｓＥ）二量体であり、この二量体は、
－２つのｓＥ単量体間での少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合によって共有結合的に安定化される、かつ／または
－２つのｓＥ単量体間での少なくとも１つのスルフヒドリル反応性架橋剤によって共有結合的に安定化される、かつ／または
－改変糖類を介して２つのｓＥ単量体を結合することによって共有結合的に安定化される、かつ／または
－二量体界面でまたは各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって、非共有結合的に安定化される。
デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（ｓＥ）は、デング熱ウイルスの血清型１、２、及び４のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１～３９５のアミノ酸断片、及びデング熱ウイルスの血清型３のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１～３９３のアミノ酸断片を指す。
それ故に、上述の、ＥＤＥ化合物は、安定化二量体であり、
ａ）単量体が、配列番号１３２のＤＥＮＶ－１ ｓＥ、配列番号１３３のＤＥＮＶ－２ ｓＥ 配列番号１３４のＤＥＮＶ－３ ｓＥ、配列番号１３５のＤＥＮＶ－４ ｓＥ、ならびにＨ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｌ１０７Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、Ｓ２５５Ｃ、Ａ２５９Ｃ、Ｔ／Ｓ２６２Ｃ、Ｔ／Ａ２６５Ｃ、Ｌ２７８Ｆ、Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎ、Ａ３１３Ｃ、及びＴ３１５Ｃの中から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）を有するその突然変異体ｓＥからなる群から選択され、任意に、その当該突然変異体ｓＥがＱ２２７Ｎ、Ｅ１７４Ｎ、及びＤ３２９Ｎの中から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）、好ましくは３つの突然変異Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４Ｎ、及びＤ３２９Ｎをさらに有する、二量体、
ｂ）二量体が、上に定義される２つの同一の組換えｓＥのホモ二量体、または上に定義される２つの異なる組換えｓＥのヘテロ二量体であり得、この二量体が好ましくは、ホモ二量体であり、例えば、上に定義されるＤＥＮＶ－１ ｓＥとＤＥＮＶ－２ ｓＥとのヘテロ二量体であり得る、二量体。それはまた、上に定義されるＤＥＮＶ－１ ｓＥのヘテロ二量体及びＤＥＮＶ－１ ｓＥの突然変異体ｓＥであり得、
ｃ）各ｓＥ単量体の６７位（Ａｓｎ６７グリカン）及び／または１５３位（Ａｓｎ１５３グリカン）で、好ましくは各単量体の少なくとも６７位（Ａｓｎ６７グリカン）でグリコシル化される、二量体、
ｄ）２つのｓＥ単量体間での少なくとも１つ、２つ、または３つのジスルフィド鎖間結合によって共有結合的に安定化される、二量体、
ｅ）上に定義される突然変異Ａ２５９ＣまたはＳ２５５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、これらの残基２５９Ｃまたは２５５Ｃがジスルフィド鎖間結合を介して一緒に結合している、二量体、
ｆ）上に定義される突然変異Ａ２５９Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｓ２５５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５９Ｃ及び２５５Ｃが、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に結合している、二量体、
ｇ）上に定義される突然変異Ｆ１０８Ｃ及びＴ３１５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、または上に定義される突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基１０８Ｃ及び３１５Ｃまたは残基１０７Ｃ及び３１３Ｃが、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に結合している、二量体、
ｈ）上に定義される突然変異Ｆ１０８Ｃ及びＡ３１３Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＴ３１５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基１０８Ｃ及び３１３Ｃが、それぞれ、２つのｓＥ単量体間でのジスルフィド鎖間結合を介して残基３１５Ｃ及び１０７Ｃに結合している、二量体、
ｉ）上に定義される、突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、突然変異Ｓ２５５Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体、ならびに突然変異Ａ２５５Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体からなる群から選択され、残基２５９Ｃ、２５５Ｃ、１０８Ｃ、３１５Ｃ、１０７Ｃ、及び３１３Ｃが、それぞれ、ジスルフィド鎖間結合を介して残基２５９Ｃ、２５５Ｃ、３１５Ｃ、１０８Ｃ、３１３Ｃ、及び１０７Ｃに結合している、二量体、
ｊ）上に定義される突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｓ２５５Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、及びＴ３１５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５９Ｃ、１０８Ｃ、及び３１５Ｃが、それぞれ、ジスルフィド鎖間結合を介して残基２５５Ｃ、３１５Ｃ、及び１０８Ｃに結合している、二量体、
ｋ）上に定義される突然変異Ｓ２５５Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ａ２５９Ｃ、Ｌ１０７Ｃ、及びＡ３１３Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２５５Ｃ、１０７Ｃ、及び３１３Ｃが、それぞれ、ジスルフィド鎖間結合を介して残基２５９Ｃ、３１３Ｃ、及び１０７Ｃに結合している、二量体、
ｌ）ｓＥ単量体間での少なくとも１つ、２つ、または３つのスルフヒドリル反応性架橋剤（チオール反応性架橋剤とも呼ばれる）によって共有結合的に安定化される、二量体、
ｍ）上に定義される突然変異Ｔ／Ｓ２６２ＣまたはＴ／Ａ２６５Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、残基２６２Ｃまたは２６５Ｃが、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に結合している、二量体、
ｎ）上に定義される突然変異Ｔ／Ｓ２６２Ｃを有する突然変異体ｓＥと、上に定義される突然変異Ｔ／Ａ２６５Ｃを有する突然変異体ｓＥとのヘテロ二量体であり、残基２６２Ｃ及び２６５Ｃが、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に結合している、二量体、
ｏ）突然変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、ｓＥのアミノ酸残基１～９、２５～３０、２３８～２８２、９６～１１１ ３１１～３１８のうちの少なくとも１つが、システインに突然変異し（置換され）、ｓＥのアミノ酸残基１～９、２５～３０、２３８～２８２、９６～１１１ ３１１～３１８のうちの少なくとも１つが、システインに突然変異し（置換され）、突然変異したシステイン残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に結合している、二量体、
ｐ）改変糖類を介して２つの単量体に結合することによって共有結合的に安定化される、二量体。
ｑ）突然変異体ｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、
－一方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの突然変異を有し、突然変異したアミノ酸残基が、Ｘ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、もう一方のｓＥ単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも１つの突然変異を有し、突然変異したアミノ酸残基が、Ｙ官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、両方の突然変異した残基が、具体的にはクリック化学によって、第１のｓＥ単量体の糖のＸ官能基をもう一方のｓＥ単量体の糖のＹ官能基と反応させることによって、改変糖類を介して一緒に結合している、二量体。Ｘ官能基とは、Ｙ官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって担持される化学基を意味し、当該Ｙ官能基は、好ましくはアジド官能基である。Ｙ官能基とは、Ｘ官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって担持される化学基を意味し、当該Ｘ官能基は、好ましくは末端アルキン官能基である。
ｒ）二量体界面で二量体の空洞を充填させることによって、１つまたは２つの単量体、好ましくは２つの単量体のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸を、かさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される、二量体、
ｓ）二量体界面でまたは各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、空洞を形成する領域内で、少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。かかる置換が、２つのｓＥ単量体間での疎水性相互作用を増加させることができる、二量体、
ｔ）上に定義される２つの組換えｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えｓＥのうちの１つまたは２つの組換えｓＥが、Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、及びＬ２７８Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）を有する、二量体、
ｕ）各単量体のドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカーにおいて、１つまたは２つの、好ましくは２つの単量体のアミノ酸配列中のアミノ酸を、少なくとも１つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される、二量体、
ｖ）上に定義される２つの組換えｓＥのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えｓＥのうちの１つまたは２つの組換えｓＥが、Ｌ２９２Ｆ及びＬ２９４Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異（置換）を有する、二量体、のうちの任意の１つ以上であり得る。
さらに別の実施形態では、ＥＤＥ化合物は、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子内の天然に存在するエンベロープ二量体を超える改善されたエピトープを提示する。改善されたエピトープとは、無傷ウイルス粒子に天然に提示された改善されてあらゆるエピトープを超えるという意味を含む。改善されたとは、天然無傷デング熱ウイルス粒子よりもより有益な免疫反応を引き起こすことができるという意味を含む。例えば、上のａ）～ｖ）に記載される修飾を介して、二量体配置において増加した安定性を有するＥＤＥ化合物は、改善されたエピトープであると見なされる。ＥＤＥは、他の方法により改善されてもよく、例えば、ＥＤＥ化合物は、ＦＬが、それ自体で、化合物、例えばポリペプチド、例えば抗体またはその抗原部分によって認識されることができないように操作されているか、または骨格に挿入されているＥＤＥであってもよく、例えば、ＥＤＥは、ＦＬが、融合ループの直接的隣接からの単離において抗体によって認識することができない、すなわち誘導ループは、四次組織から独立している文脈において認識することができないように操作される。
別の実施形態では、ＥＤＥ化合物は、例えば、上述の、二量体間での共有及び／または非共有結合のレベルを増加させることによって二量体配置を保存する異種タンパク質骨格に組み込まれる。さらに、ＶＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の一部にのみ提示し得る異種タンパク質骨格を含んでもよく、この一部は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の連続的な一部であるか、またはこの一部は、上述の、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の厳選した非連続的残基を含む。
例えば、一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、位置Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、Ａ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４ Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３１０、Ｋ３２３、Ｋ３２５ Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ１５３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｑ７７、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ１５５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９ Ｖ３２４、Ｖ９７、Ｗ１０１のうちの１つ以上、またはエンベロープタンパク質の天然二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基に採用する残基と実質的に同様の空間的配置にあるデング熱ウイルスエンベロープポリペプチドの等価残基を含む。これらの残基は、天然に存在するエンベロープタンパク質内にあってもよく、または代替の実施形態では、それらは、適切な配置において骨格タンパク質内に保持される。好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、上述の位置Ｗ１０１及び少なくとも１つの他の残基を含む。さらに好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、上記の残基のすべてを含む。一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、Ｎ１５３グリカンを含む。代替の実施形態では、ＥＤＥは、Ｎ１５３グリカンを含まない。
さらに好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、１種を超える血清型のデング熱ウイルスにわたってアミノ酸及び空間的位置の両方において観察される残基、好ましくは、すべての血清型のデング熱ウイルス、つまり、４種の血清型のデング熱ウイルスにわたってアミノ酸及び空間的位置の両方において観察される残基を含む。
ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基を含んでもよく、これは、二量体配置において増加した安定性を有し、また、上述のタンパク質骨格内に保持されるように操作される。
本発明者らは、エンベロープ二量体の特定の領域が本発明の化合物、例えば抗体またはその抗原結合部分との接触には重要であることが分かっている。したがって、いくつかの実施形態では、ＶＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの４００アミノ末端残基の特定の抗原部分を含む。
ＥＤＥ化合物は、抗原性には必要であると見なされる領域を含む、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の特定の残基を含む特定の断片であってもよい。この断片はまた、特定の立体構造を維持するように操作されてもよく、またはタンパク質骨格内に保持されてもく、または操作され、かつタンパク質骨格内に保持されてもよい。
例えば、一実施形態では、ＥＤＥ化合物は、ドメインＩＩ側上のｂストランド、及び（二量体界面の向かいにある）ドメインＩ側上の「１５０ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、１５０ループが残基１４８～１５９に広がり、ドメインＩのｂストランドＥ０及びＦ０を接続し、Ｎ１５３グリカンを担持し、これは二量体におけるパートナーサブユニットの融合ループを覆う。一実施形態では、この領域は、参照サブユニットのドメインＩＩの３つのポリペプチドセグメントを含み、これはエピトープへのＦＬに貢献するサブユニットとして定義される。これらの３つのセグメントは、ｂストランド（Ｎ６７グリカンを担持する残基６７～７４）、すぐ上流の融合ループ及び残基（残基９７～１０６）、ならびにｉｊループ（残基２４６～２４９）である。
別の実施形態では、上述の領域（参照サブユニットのドメインＩＩの３つのポリペプチドセグメントを含む領域）に加えて、ＥＤＥ化合物は、１５０ループ及び第２のサブユニットのＮ１５３グリカン鎖をさらに含む。
ＥＤＥ化合物のさらなる実施形態は、特定の残基Ｋ３１０において、上述の領域（参照サブユニットのドメインＩＩの３つのポリペプチドセグメントを含む領域）、ならびに１５０ループ及び第２のサブユニットのドメインＩＩＩのＡストランドを含む。本発明者らは、本明細書で定義される有用な化合物のサブユニットがＥＤＥに結合する際に、第２のサブユニットの１５０ループに障害を来たすことが分かっている。それ故に、一実施形態では、１５０ループは、エンベロープタンパク質の天然二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの４００アミノ末端残基において見出される天然配置にあってもよいか、または別の実施形態では、１５０ループは、１５０ループが本発明の化合物のうちの１つに結合する際に採用する不規則な配置にあってもよい。
Ｎ６７グリカンが樹状細胞のデング熱感染には特に重要であると見なされる。それ故に、本明細書に記載されるように、正しいエピトープ環境においてこの残基を含むＥＤＥ化合物は、好ましい実施形態であると見なされる。
好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、一旦対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すように、これらの抗体は、好ましくは、４種すべての血清型のデング熱ウイルスに結合することができ、任意に、４種すべての血清型のデング熱ウイルスを中和することができ、好ましくは、４種すべての血清型のデング熱ウイルスを１００％中和することができ、任意に、ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られる４種すべての血清型のデング熱ウイルスを１００％中和することができる。
ＶＤＥ化合物は、当業者に公知であるように、例えば、実施例において示されるように、本明細書で提供される高親和性／中和抗体のうちの１つ以上に対して開発された、抗イディオタイプ抗体（もしくはその断片、または上で論じられるように、結合特異性を共有する分子）であってもよい。
本発明はまた、本発明の安定化組換えｓＥ二量体であるＥＤＥの合成のための方法も提供し、この方法は、
ａ）上に定義される単一または複数のシステイン突然変異体ｓＥを、酸化条件下で接触させるステップ、及び／または
ｂ）２つのｓＥ単量体を、上に定義される少なくとも１つ、２つ、または３つのスルフヒドリル反応性架橋剤と接触させるステップ、及び／または
ｃ）上に定義されるグリコシル化部位を有する２つのｓＥ単量体を、クリック化学によって接触させるステップ、及び／または
ｄ）少なくとも１つのｓＥ単量体のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を、上に定義されるかさ高い側鎖アミノ酸と置換する２つのｓＥ単量体と接触させるステップ、のうちの少なくとも１つを含む。
本発明はまた、上に定義される方法によって得られる安定化組換えｓＥ二量体も提供する。
本発明に従って安定化組換えｓＥ二量体の適切な形成を確実にするために、以下に記載の抗体に対する親和性は、（共有結合的及び非共有結合的に安定化した二量体については）ＥＬＩＳＡによって、または（共有結合的に安定化した二量体については）表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
本発明はまた、本発明の核酸または本発明のベクター、例えば、ＥＤＥ化合物または本発明の化合物をコードする核酸の一部分を含む核酸またはベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞も含む。例えば、本発明は、ベクター、例えばプラスミドを含む、異種タンパク質の発現に有用であることが知られている任意の宿主細胞、例えば、Ｃ６／３６昆虫細胞、ヒト樹状細胞、ＣＨＯ細胞、または微生物、例えば、ピキア・パストリス細胞を含む。宿主細胞はまた、任意に、ゲノム、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターへの本発明の核酸を標的とするためのウイルスベクターの使用によって宿主細胞のゲノムに組み込まれている、本発明の核酸を含んでもよい。
本発明は、本発明の核酸または本発明のベクター、または本発明の宿主細胞によって、例えば、ＶＤＥ化合物または本発明の化合物をコードする核酸の一部分を含む核酸またはベクターによって形質転換される少なくとも１つの細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物をさらに含む。
本発明の化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくはその抗原結合部分、または本発明のＥＤＥ化合物の産生のためのプロセスが、本明細書に提供される。このプロセスは、以下の段階：
ｉｉ）本発明の宿主細胞の適切な培地における培養、
ｉｉ）当該化合物、好ましくは産生された抗体またはその抗原結合部分、または当該ＥＤＥ化合物の回収、を含み、当該回収は培養培地または当該培養細胞のいずれかからである。
ポリペプチドの精製または単離については、例えば、本化合物がポリペプチドである、またはＥＤＥ化合物がポリペプチドである場合に、当業者であれば、精製に役立つヌクレオチドを含む、例えば、エピトープタグの親和性タグを含むようにヌクレオチドコーディング配列を容易に操作し得ることを理解されよう。それ故に、一実施形態では、本発明の化合物またはＥＤＥ化合物の産生のためのプロセスは、本化合物もしくはＥＤＥ化合物をコードするヌクレオチド配列を含み、本化合物もしくはＥＤＥ化合物、または本化合物もしくはＥＤＥ化合物をコードするヌクレオチド配列を含むベクターの精製に有用な一部分をコードするヌクレオチドをさらに含み、本化合物もしくはＥＤＥ化合物の精製に有用な一部分をコードするヌクレオチドをさらに含む、宿主細胞の培養を含む。
本化合物が、ポリペプチド、例えば抗体またはその抗原結合部分であり、同様に、組換え手段によって作製される場合に、ポリペプチド産生は、対象への上の実施形態のいずれかに定義されるＥＤＥ、任意に上に定義されるＥＤＥ化合物の投与によって引き起こされ得ることが理解されよう。ＥＤＥ（任意にＥＤＥ化合物）の投与後、天然宿主反応は、対象の血液から回収され得る抗体を産生し得る。好ましくは、ＥＤＥは、無傷ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子の一部として提示されない。好ましくは、ＥＤＥは、上で論じられるエンベロープポリペプチド二量体、または上もしくは下で論じられるその他のＥＤＥ化合物である。
例えば、本発明は、本発明の化合物の産生方法を提供し、本化合物は本発明の抗体であり、この方法は、
ａ）哺乳動物を本発明の安定化組換えｓＥ二量体または本発明の免疫原性組成物と接触させるステップと、
ｂ）当該哺乳動物由来の１つ以上の血清試料中の当該ｓＥを対象とする抗体の存在を検出するステップと、
ｃ）哺乳動物から膵臓細胞を採取するステップと、
ｄ）ハイブリドーマ細胞を産生するために、膵臓細胞を骨髄腫細胞と融合させるステップと、
ｅ）抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を特定するステップと、
ｆ）抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を培養するステップと、
ｇ）任意に、当該抗体を単離するステップと、を含む。
本発明はまた、上に定義される方法のうちのいずれかによって得られる抗体も提供する。
本発明はまた、上に定義される方法によって得られるハイブリドーマ細胞も提供する。
本発明はまた、上に定義される当該二量体を対象とする中和抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞の調製のための本発明の安定化組換えｓＥ二量体の使用も提供する。
好ましい実施形態では、本ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、高度に交差反応性があり強力に中和する抗体を作り出すことができると既に判断されているようなものである。実施例（実施例１～６）において特定される抗体は、デング熱ウイルスの自然感染において無傷ウイルスに作り出された。より特異的かつ改善された抗体は、本発明のＥＤＥ化合物であり得る、特異的なＥＤＥ抗原の投与によって作り出すことができると見なされる。例えば、自然感染では、何人かの患者は、抗ＥＤＥ抗体を作り出さず、その代わりに、あまり有用でないと見なされ、あまり交差反応性がなく、あまり中和しない抗ＦＬ抗体を産生した。ＥＤＥ抗原の投与は、有用な抗ＥＤＥ抗体を作り出す可能性がより高いと見なされる。上述のように、いくつかの実施形態では、本ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、二量体配置において増加した安定性を有するように操作され、これは、対象内で作られる抗ＶＤＥ抗体の機会を増すと見なされる。加えて、いくつかの実施形態では、本ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、例えば、エンベロープタンパク質内でそれ自体が突然変異、または改善されたエピトープを提示するための骨格タンパク質の使用によって、例えば、抗ＦＬ抗体が作られる可能性が低いように融合ループを隠すことによって操作されている。すべての血清型のデング熱ウイルスに共通しているＥＤＥまたはＥＤＥ化合物の投与は、高度に交差反応性があり強力に中和する抗体を作り出す可能性が高い。これらの抗体は、対象から回収され、さらなる分析のために使用され得るか、またはデング熱の治療もしくはデング熱臨床試験において使用され得る。
したがって、一実施形態は、本化合物がポリペプチド、または抗体もしくはその抗原結合部分である、本発明に従う化合物の産生のためのプロセスを提供し、当該プロセスは以下の段階：
ａ．対象への、前述の実施形態のういちのいずれかにおいて定義されるエンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物の投与、
ｂ．対象の血液からの当該抗体またはその抗原結合部分の回収及び単離、を含む。
対象にＥＤＥまたはＥＤＥ化合物を投与することを含む、本発明の、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分を産生する上記の方法はまた、ワクチンのために適当な抗原を選択する方法の一部としても使用することができることを理解されよう。現行のワクチンは、弱毒化したバージョンの４種すべての血清型のデング熱を利用しており、特に効果的ではない。そのようなワクチンはまた、有用ではない抗ＦＬ抗体の産生を引き起こすこともできよう。好ましいワクチンは、すべての血清型のデング熱ウイルスに対して免疫反応を引き起こすことができる単一の抗原を含み得、この免疫反応は、すべての血清型のデング熱ウイルスを中和することができる、すなわち、４種の血清型のデング熱ウイルスであると見なされる。
本発明の発明者らは、高度に交差反応性があり強力に中和する抗体、ならびにそれらが結合する特定のエピトープ（ＥＤＥ）を初めて特定した。それ故に、ワクチンにおけるこのエピトープの使用は、現行のワクチン戦略より好ましい可能性が高い。
それ故に、本発明は、デング熱ウイルスに対するワクチンのために適当な抗原を選択する方法を提供し、当該方法が、当該抗原に応答する対象において作製された１つ以上の抗体の特徴付けを含み、任意に、当該抗原が、前述の実施形態のいずれかに定義されるエンベロープ二量体エピトープと結合することが知られている抗体のパネルに結合することがこれまでに見出されている。
デング熱抗原を投与されている対象における高度に交差反応性があり強力に中和する抗体の特定は、ワクチンに有用である可能性が高い抗原を示している。一実施形態では、この抗原は、無傷ウイルスの一部として提示されない。好ましい実施形態では、この抗原は、任意に骨格タンパク質の一部として、上述の実施形態のうちのいずれかに定義されるＥＤＥ化合物、好ましくはエンベロープタンパク質の二量体、好ましくは安定化した二量体である。好ましい実施形態では、この抗原は、例えば実施例において特定される、ＥＤＥに結合することができる高度に交差反応性があり強力に中和する抗体、例えば、本発明の抗体に結合することができることが既に判断されているようなものである。
高度に有用な抗体と結合することができることが知られているそのような抗原を投与することによって、対象において抗原に応答して作られる抗体が特徴付けられ得る。そのような抗原は、対象内にそのような有用な抗体の産生をもたらし、そのため、ワクチン組成物で用いるための適当な候補抗原である可能性が高い。特徴付けとは、これらの抗体が、例えば、線状または変性または組換えエンベロープタンパク質に結合する抗体の能力、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにおいてエンベロープタンパク質に結合する能力、及びエンベロープタンパク質の二量体、または前述の実施形態において上述のＥＤＥもしくはＥＤＥ化合物に結合する抗体の能力を判定することによって、融合ループと結合すると見なされるかどうかを判定するという意味を含む。４種すべての血清型のデング熱ウイルスに結合する抗体の能力はまた、４種すべてのデング熱ウイルスを中和する抗体の能力を評価し得るように、評価され得る。抗体の中和能力を判定するための方法は、前述されている。ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られたデング熱ウイルスを中和する抗体の能力はまた、上述の及び実施例において記載されるように、判定され得る。
一実施形態では、抗原が、主に抗ＦＬ抗体を作り出す場合、ワクチンとして有用であると見なされない。例えば、抗原は、ＦＬに対して作り出された抗体とＥＤＥに対して作り出された抗体の比率が、１：２、１：４、１：５、１：１０、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００以下である場合、有用であると見なされる。抗ＦＬ抗体及び抗ＥＤＥ抗体の相対量は、当業者に公知の方法、例えばＥＬＩＳＡに基づいた技術を用いることによって判定され得る。抗原は、１種を超える血清型のデング熱ウイルス、好ましくは４種すべてのデング熱ウイルスのＥＤＥと結合することができる抗体を作り出す場合、有用であると見なされる。抗原は、１種を超える血清型のデング熱ウイルスを中和することができる、好ましくは、４種すべてのデング熱ウイルスを、好ましくは１００％中和することができる抗体を作り出す場合、有用であると見なされる。また、抗原がヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られたデング熱ウイルスを中和することができる抗体を、好ましくは同じレベルまで（上で論じられるように）作り出す、好ましくはウイルスを少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和する場合、有用であると見なされる。抗原は、
ａ）抗ＦＬ抗体を作り出さない、または有意に作り出さない場合、及び
ｂ）４種すべての血清型のデング熱ウイルスとかなり有意な程度まで結合する場合、及び
ｃ）ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られた４種すべての血清型のデング熱ウイルスをかなり有意な程度まで１００％中和する場合、最も有用であると見なされる。
さらに、別の実施形態では、作り出された抗体が上述の実施形態において定義されるＥＤＥに結合することができる場合、この抗原は、ワクチン接種で用いるのに適していると見なされる。
さらなる実施形態では、対象に投与される抗原は、抗体が融合ループに作り出されるのを防ぐのに役立つようにさらなる薬剤を含んでもよい。
抗原に曝露される対象によって産生される抗体は、対象の分類された単一の形質細胞から得られてもよい。
初めてまたは高度に交差反応性がありデング熱ウイルスを強力に中和する抗体の特定は、このウイルス疾患を治療または予防することができる特有の機会を与えることが理解されよう。加えて、本発明まで、試験中に生じた感染を確実に治療する方法がなかったため、生デング熱ウイルスを含む臨床試験を行うことが可能であろう。したがって、本発明のさらなる態様は、対象におけるデング熱ウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。
この方法は、本発明に従う１つ以上の化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくはその断片の投与を含む。本発明はまた、デング熱ウイルス感染の予防または治療で用いるための本発明に従う１つ以上の化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくはその断片も提供する。本発明はまた、デング熱感染の治療または予防のための薬剤の製造における本発明の化合物の使用も提供する。
投与については、本発明の化合物は、組成物、例えば薬学的組成物の一部であってもよいことが理解されよう。この組成物は、感染を治療するのにそれ自体が有用であると見なされる１つ以上の治療剤、例えばさらなる抗ウイルス剤、または例えばデング熱感染の症状を治療するのに有用であると見なされる１つ以上の薬剤］をさらに含んでもよい。
「治療する」という用語は、本発明の化合物、例えば、本発明の化合物、ＥＤＥ化合物、ワクチン組成物、抗体、安定化組換えｓＥ二量体、または本発明の免疫原性組成物のうちのいずれかを、デング熱ウイルス感染またはデング熱ウイルス感染の症状を有する患者に、デング熱ウイルス感染及び／またはデング熱感染の症状を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、救済する、向上させる、改善する、または影響を及ぼすという目的で投与することを含む。デング熱感染の症状のうちのいずれか１つ以上を治療するを緩和するという意味を含む。治療はまた、新たな細胞が感染するのを防ぐという意味も含む。患者がうまく治療されているかどうかは、当業者には明らかであろう。例えば、ウイルス量は減少し得る。
「予防する」という用語は、デング熱ウイルス感染の進行が減速される及び／もしくは排除される、またはデング熱ウイルス感染の発症を遅らせるまたは排除されることを意味する。
デング熱ウイルス感染及びデング熱の症状は、例えば、ＷＨＯファクトシート１１７番で提示されている。そこに記述されるように、デング熱は、重症のインフルエンザ様疾患であり、乳児、幼児、及び成人が罹患するが、死亡することはめったにない。高熱（４０℃／１０４°Ｆ）が、激しい頭痛、眼の奥の痛み、筋痛と関節痛、悪心、嘔吐、腺の腫脹、または発疹のうち２つ以上の症状を伴う場合には、デング熱を疑うべきである。症状は、感染蚊に刺された後４～１０日の潜伏期間後、通常２～７日間持続する。重症型のデング熱は、血漿漏出、体液貯留、呼吸困難、重度の出血、臓器不全等による死に至る可能性のある合併症である。危険な兆候は、初発症状から３～７日後に起こり、同時に体温低下（３８℃／１００°Ｆ以下）と併せて、激しい腹痛、連続する嘔吐、呼吸促迫、歯肉の出血、倦怠感、不穏、吐血を含む。危篤状態の２４～４８時間後に死亡することがあり、合併症や死亡するリスクを避けるために適切な医学的治療が必要である。
本化合物または本化合物を含む組成物の投与は、本化合物が予防的に使用される場合に細胞の感染の阻害、あるいは、治療目的で使用される場合に細胞のさらなる感染の阻害をもたらす、及び／または疾患の兆候及び／もしくは症状を軽減する、ある量、例えば治療有効量の投与である。
治療有効量は、他の症状（複数を含む）の主観的軽減または臨床医もしくは資格のある観察者によって言及されるように客観的に識別できる改善をもたらす量である。
デング熱感染を予防するとは、任意の有意な程度まで感染のレベルを低減するという意味を含む。一実施形態では、本発明の化合物は、１種の血清型のデング熱ウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％予防する。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、２種の血清型のデング熱ウイルス、３種の血清型のデング熱ウイルス、４種すべての血清型のデング熱ウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％予防する。最も好ましい実施形態では、本発明の化合物は、４種すべての血清型のデング熱ウイルスによる感染を完全に予防する。これは、当業者に公知の技術によって、例えばウイルス量を測定することによって評価されてもよい。
本発明は、動物（非ヒト）、好ましくは哺乳動物、例えば、サル、ウサギ、マウス、またはラクダ科動物（例えば、ラマ）に免疫性を与えるための、ＥＤＥ、好ましくは安定化組換えｓＥ二量体、または本発明に従う免疫原性組成物の使用を提供する。
さらなる実施形態は、例えば、感染を終結させることを意図して、生デング熱ワクチン試験で用いるために、本発明に従う１つ以上の化合物、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくはその断片を提供する。
好ましくは、本発明の化合物は、昆虫細胞及びヒト細胞の両方で作られる４種すべての血清型のデング熱ウイルスを少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和することができるものである。ウイルスへの曝露前の化合物の事前投与は、ウイルス感染を予防するであろうと見なされている。
例えば、上述の４種すべての血清型のデング熱ウイルスを中和することができる、本発明に従う化合物、例えば、抗体もしくはその断片は、上述のウイルスへの曝露前に投与してもよく、例えば、旅行者または大発生または１人以上以上の感染した人々の発生または密接な接触、例えば、蚊に刺された可能性が高い人々の近隣もしくは住宅でのいずれかにおける予防薬として使用されてもよい。あるいはまたは加えて、本化合物は、患者が初めに発熱を示す場合、または症状が重症になる場合に投与されてもよい。
本化合物についてのすべての選好は、本発明の実施形態において上述される通りである。
本発明の化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分が、さらなる治療剤、例えば、１つ以上のＴ細胞ワクチン、または他の抗ウイルス剤とともに投与されてもよいことが理解されよう。これらは、本発明の化合物と同じ組成物の一部として投与されてもよく、または別々に投与されてもよい。例えば、Ｔ細胞ワクチンは、インフルエンザに対する保護のために提案されている８５。
本発明の化合物は、１回、２回、または数回投与されてもよい。投与は、１日、２日、１週間、２週間、１カ月、６カ月、１年間またはそれ以上にわたって行ってもよい。感染後の治療については、より短期間、例えば最長１カ月が、適切であり得る。予防については、より長期間、例えば１年のうちの６カ月またはそれ以上が、適切であり得る。
デング熱感染の予防または治療で用いるための本化合物、例えば抗体またはその抗原結合部分は、本発明の方法を用いて選択されてもよい。それ故に、本発明は、デング熱ウイルスの予防または治療で用いるための適当な抗体またはその断片を選択する方法を提供し、当該方法は、任意の上述の実施形態において定義されるエンベロープ二量体エピトープを含む抗原に応答して対象において作製された抗体またはその断片の特徴付けを含む。
上述の実施形態のうちのいずれかに記載のＥＤＥ化合物は、対象へのＥＤＥの投与後に適当な抗体を作り出すことができる可能性が高い。それ故に、かかる対象において作られた抗体は、デング熱感染の治療または予防で有用である可能性が高い。
好ましい実施形態では、ＥＤＥは、任意に骨格タンパク質の一部として、本発明のＥＤＥ化合物、例えば、エンベロープタンパク質の二量体、好ましくは安定化した二量体である。好ましい実施形態では、抗原／ＥＤＥ化合物は、ＥＤＥに結合することができる高度に交差反応性があり強力に中和する抗体、例えば、本発明の抗体に結合することができることが既に周知であるようなものである。好ましい実施形態では、この抗原は、例えば、交差反応性のある及び潜在的に中和する抗ＥＤＥ抗体を作り出すのに必要とされる特定の配置において残基を含むが、抗ＦＬ抗体を作り出す残基または特定の立体構造の残基を含まないことによって、天然エンベロープ二量体を上回って改善されると見なされる。
別の実施形態では、ＥＤＥ、任意にＥＤＥ化合物の投与と同様に、対象に、例えば、抗ＦＬ抗体の形成を遮断する化合物または薬剤を投与する。例えば、安定化したｓＥ二量体は、有用であり得る。
特徴付けとは、これらの抗体が、例えば、線状または変性または組換えエンベロープタンパク質に結合する抗体の能力、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにおいてエンベロープタンパク質に結合する能力、及びエンベロープタンパク質の二量体、または前述の実施形態において上述のＥＤＥもしくはＥＤＥ化合物に結合する抗体の能力を判定することによって、融合ループと結合すると見なされるかどうかを判定するという意味を含む。４種すべての血清型のデング熱ウイルスに結合する抗体の能力はまた、４種すべてのデング熱ウイルスを中和する抗体の能力を評価し得るように、評価され得る。抗体の中和能力を判定するための方法は、前述及び実施例において詳述されている。ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られたデング熱ウイルスを中和する抗体の能力もまた、判定され得る。
一実施形態では、抗体が、ＦＬに結合する場合、有用であると見なされない。この抗体が、１種を超える血清型のデング熱ウイルス、好ましくは４種の血清型のデング熱ウイルスに結合することができる場合、または前述の実施形態のうちのいずれかに記載の１種を超える血清型のＥＤＥに結合することができる場合、有用であると見なされる。この抗体が、１種を超える血清型のデング熱ウイルス、任意に２種の血清型のデング熱ウイルス、任意に３種の血清型のデング熱ウイルスを中和することができる場合、好ましくは４種の血清型のデング熱ウイルスを、好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和することができる場合、有用であると見なされる。また、この抗体が、ヒト細胞、任意に樹状細胞、及び昆虫細胞、任意にＣ６／３６細胞の両方で作られたデング熱ウイルスを、好ましくは同じレベルまで中和することができる場合、好ましくはウイルスを少なくとも９５％または少なくとも９８％、例えば１００％中和する場合、有用であると見なされる。この抗体が、
ａ）抗ＦＬ抗体を作り出さない、または有意に作り出さない場合、及び
ｂ）４種すべての血清型のデング熱ウイルスとかなり有意な程度まで結合する場合、及び
ｃ）ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られた４種すべての血清型のデング熱ウイルスをかなり有意な程度まで１００％中和する場合、最も有用であると見なされる。
本発明者らは、デング熱感染に罹患している患者が有用な抗ＥＤＥ抗体または有用でない抗ＦＬ抗体のいずれかを産生することを見出したため、デング熱感染を治療または予防するために有用であり得る抗体を特定するさらなる方法は、その変性型または線状型のエンベロープタンパク質に結合することができないそれらの抗体を単に特定することである。これらのエンベロープタンパク質に結合することができない任意の抗体は、本発明の有用な化合物である可能性が高い。
患者はまた、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分を発現する核酸、ベクター、または宿主細胞で治療してもよいことを理解すべきである。例えば、ポリペプチドを含む核酸は、本発明の化合物が治療される患者内に内因的に発現するように、適当な送達システム、例えばウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターに挿入されてもよい。
本発明はまた、本発明の１つ以上の化合物で治療または予防的治療を受けるような推定の必要性に従って患者を階層化するための方法も提供する。したがって、本明細書では、前述の実施形態のうちのいずれか１つに従って、本化合物または組成物による治療、または上昇する用量の本化合物または組成物を必要とする可能性が高いような、デング熱ウイルス感染を患っている患者を特定するための方法が提供され、この方法は、対象における抗エンベロープ二量体エピトープ抗体及び抗融合ループ抗体のレベルの判定を含み、このエンベロープ二量体エピトープは、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の通りである。
本発明者らによって特定されるように、デング熱感染に罹患している患者は、抗ＥＤＥ抗体または抗ＦＬ抗体を主に産生する。抗ＦＬ抗体は、有用であると見なされないが、一方、抗ＥＤＥ抗体は、有用であると見なされる。対象が抗ＥＤＥ抗体を有するが、一方、本発明の化合物によるいくつかのさらなる治療法を依然として必要とし得る場合、主に抗ＦＬ抗体を有する対象は、先天性の有用な抗体を有さないため、より高い用量を必要とする可能性が高い。それ故に、抗ＦＬ抗体のみを有する患者は、本発明の化合物による治療を必要とする可能性が高い患者であると見なされる。抗ＥＤＥ抗体を既に産生している患者は、治療を必要としないかもしれない。加えて、抗ＥＤＥ抗体を産生せず、抗ＦＬ抗体のみを産生する患者は、抗ＥＤＥ抗体を有する患者よりも高い用量の治療を必要とする可能性が高い。また、患者は、抗ＥＤＥ抗体を低いレベルのみ作り出し得、それ故に、より高い用量の化合物を必要とし得る。
より高い用量とは、この患者は、抗ＥＤＥ抗体を産生する患者が必要とするよりも２、３、４、５、１０、２０、５０倍の用量の本発明の化合物を必要とすることを意味する。
「抗ＶＤＥ抗体を低いレベルで作り出す」とは、抗ＥＤＥ抗体を作り出す他の患者と比較して、この患者が、平均よりも低いレベルの抗ＥＤＥ抗体を有することを意味する。
例えば、抗体が無傷デング熱ウイルスまたはＥＤＥに結合するが、変性もしくは線状エンベロープタンパク質に結合しないかどうかを判定する、これらの抗体がＥＤＥに結合するかどうかを特定するための手段は、前述及び実施例において記載される通りである。エンベロープタンパク質が増加した二量体の安定性を有するように操作されている場合、またはエンベロープタンパク質またはその残基が骨格の一部として提示されている場合に、そのタンパク質に結合する抗体の能力を評価することができる。
対象内の抗ＦＬ抗体及び抗ＥＤＥ抗体のレベルはまた、デング熱ウイルスワクチン接種のためのその対象の必要性を評価するために使用することもできる。それ故に、さらなる実施形態では、デング熱ウイルスワクチン接種のための患者の必要性を評価するための方法が提供され、当該方法は、抗エンベロープ二量体エピトープ抗体及び抗融合ループ抗体のレベルの特定を含み、このエンベロープ二量体エピトープは、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の通りである。本発明の化合物、またはより高い用量の本化合物による治療を必要とする患者の基準と同様に、患者が抗エンベロープ二量体エピトープ抗体を有すると判定される場合、ワクチン接種が必要でない可能性が高い。
さらに、この患者が抗エンベロープ二量体エピトープ抗体を有すると判定される場合、この患者に、ブースト投与が供され得る。
別の実施形態では、この患者が抗エンベロープ二量体エピトープ抗体を有さない場合、全ワクチン接種が必要とされる。
本発明はまた、感受性のある哺乳動物対象、例えばヒトにおけるデング熱ウイルス感染の予防及び／または治療を目的とする予防的または治療的免疫原性（またはワクチン）組成物を調製するための、上に定義される安定化組換えｓＥ二量体（抗原として使用される）の使用も提供する。
有意には、本発明者らは、上述のように、今まで知られていなかった高度に交差反応性があり強力に中和する抗体によって認識される特異的なエピトープを初めて特定した。このエピトープは、デング熱ウイルスに対するワクチン接種において特に効果的な抗原を提供すると見なされている。デング熱ウイルスに対するワクチン接種で用いるために適当な抗原を選択する方法は、前述の実施形態において記載されている。したがって、本発明は、感受性のある哺乳動物対象、例えばヒトにおけるデング熱ウイルス感染の予防及び／または治療を目的とする予防的または治療的免疫原性（またはワクチン）組成物を調製するために用いるための、デング熱ウイルスのエンベロープ二量体エピトープ、任意にＥＤＥ化合物を提示する組成物を提供し、エンベロープ二量体エピトープ及びＥＤＥ化合物は、前述の実施形態のうちのいずれかに定義され、前述の方法に従って特定される通りであり、例えば、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、ワクチンで用いるために適当な抗原を選択する方法を提示する前述の実施形態において、例えば、対象への潜在性のあるワクチン候補ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物の投与後に作られる抗体を特徴付けることによって特定され得る。これは、当業者の権限内で十分であり得る。あるいは、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、前述の実施形態において提示される通りであり得、例えば 一実施形態では、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基である。エンベロープタンパク質は、ＤＥＮＶ－１、ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－３及びＤＥＮＶ－３、及びＤＥＮＶ－４、（配列番号２９、３１、３３、または３５）からのエンベロープタンパク質、または配列番号２９、３１、３３、または３５の配列に少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質のうちのいずれかであってもよい。この二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。好ましい実施形態では、この二量体は、無傷ウイルス粒子、またはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に組み込まれないが、むしろ、遊離二量体である。例えば、タンパク質骨格の一部として、本明細書に記載のＥＤＥまたはＥＤＥ化合物、例えば、操作されたエンベロープタンパク質のうちのいずれかの形態が、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子の一部として提示されてもよいことが理解されよう。好ましい実施形態では、ＥＤＥ化合物は、前述の実施形態において記載される、安定化組換えｓＥ二量体である。
さらに別の実施形態では、ワクチン組成物で用いるためのＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、天然に存在するエンベロープ二量体を上回る改善されたエピトープを提示する。例えば、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、ＦＬが、それ自体で、化合物、例えばポリペプチド、例えば抗体またはその抗原部分によって認識されることができないように操作されているか、または骨格に挿入されており、例えば、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、ＦＬが、融合ループの直接的隣接からの単離において抗体によって認識することができない、すなわち誘導ループは、四次組織から独立している文脈において認識することができないように操作される。
別の実施形態では、ワクチン組成物で用いるためのＥＤＥまたはＥＤＥ化合物は、上述のように、二量体配置において増加した安定性を有するように操作されている、例えば、二量体間の共有及び／または非共有結合の増加したレベルを有するように操作されている、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基を含むか、あるいは、例えば、上述のように、二量体間の共有及び／または非共有結合のレベルを増加することによって、二量体配置を保存する異種タンパク質骨格に組み込まれている。さらに、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の一部にのみ提示し得る異種タンパク質骨格を含んでもよく、この一部は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の連続的な一部であるか、またはこの一部は、上述の、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の厳選した非連続的残基を含む。
例えば、一実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、位置Ｅ４９、Ｋ６４、Ｑ７７、Ｗ１０１、Ｖ１２２、Ｎ１３４、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｉ１６１、Ａ１６２、Ｐ１６９、Ｔ２００、Ｋ２０２、Ｅ２０３、Ｌ３０８、Ｋ３１０、Ｑ３２３、Ｗ３９１、Ｆ３９２、Ａ７１、Ｃ１０５、Ｃ７４、Ｄ１５４、Ｄ２４９、Ｄ２７１、Ｄ３０９、Ｄ３６２、Ｄ９８、Ｅ１４８、Ｅ３１１、Ｅ４４、Ｅ７１、Ｅ８４、Ｇ１０２、Ｇ１０４Ｇ１０６、Ｇ１５２、Ｇ１５６、Ｇ２８、Ｇ２９、Ｇ３７４、Ｈ１５８、Ｈ２７、Ｉ１１３、Ｉ３０８、Ｉ４６、Ｋ２４６、Ｋ２４７、Ｋ３１０、Ｋ３２３、Ｋ３２５ Ｋ４７、Ｌ１１３、Ｌ４５、Ｌ８２、Ｍ２７８、Ｎ１０３、Ｎ１５３、Ｎ３６２、Ｎ６７、Ｎ８３、Ｑ２４８、Ｑ２７１、Ｑ３２５、Ｑ７７、Ｒ２、Ｒ２４７、Ｒ３２３、Ｒ７３、Ｒ９９、Ｓ７２、Ｓ８１、Ｔ１１５、Ｔ１５５、Ｔ３６１、Ｔ４６、Ｔ６８、Ｔ６９、Ｔ７０、Ｔ７２、Ｖ１１３、Ｖ１１４、Ｖ２５０、Ｖ３０９ Ｖ３２４、Ｖ９７、Ｗ１０１のうちの１つ以上、または残基がエンベロープタンパク質の天然二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基を採用するために、実質的に同様の空間的配置におけるデング熱ウイルスエンベロープポリペプチドの等価残基を含む。これらの残基は、天然に存在するエンベロープタンパク質内にあってもよく、または代替の実施形態では、それらは、適切な配置において骨格タンパク質内に保持される。好ましい実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、上述の位置Ｗ１０１及び少なくとも１つの他の残基を含む。さらに好ましい実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、上記の残基のすべてを含む。一実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、Ｎ１５３グリカンを含む。代替の一実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、Ｎ１５３グリカンを含まない。
さらに好ましい実施形態では、ワクチン組成物で用いるためのＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、１種を超える血清型のデング熱ウイルスにわたってアミノ酸及び空間的位置の両方において観察される残基、好ましくは、すべての血清型のデング熱ウイルス、つまり、４種の血清型のデング熱ウイルスにわたってアミノ酸及び空間的位置の両方において観察される残基を含む。
ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基を含んでもよく、これは、二量体配置において増加した安定性を有し、また、上述のタンパク質骨格内に保持されるように操作される。
本発明者らは、エンベロープ二量体の特定の領域が本発明の化合物、例えば抗体またはその抗原結合部分との接触には重要であることが分かっている。したがって、いくつかの実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の特定の抗原部分を含む。
ワクチン組成物で用いるためのＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、抗原性には必要であると見なされる領域を含む、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ 外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基の特定の残基を含む特定の断片であってもよい。この断片はまた、特定の立体構造を維持するように操作されてもよく、またはタンパク質骨格内に保持されてもく、または操作され、かつタンパク質骨格内に保持されてもよい。
例えば、一実施形態では、ワクチン組成物で用いるためのＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、ドメインＩＩ側上のｂストランド、及び（二量体界面の向かいにある）ドメインＩ側上の「１５０ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、１５０ループが残基１４８～１５９に広がり、ドメインＩのｂストランドＥ０及びＦ０を接続し、Ｎ１５３グリカンを担持し、これは二量体におけるパートナーサブユニットの融合ループを覆う。一実施形態では、この領域は、参照サブユニットのドメインＩＩの３つのポリペプチドセグメントを含み、これはエピトープへのＦＬに貢献するサブユニットとして定義される。これらの３つのセグメントは、ｂストランド（Ｎ６７グリカンを担持する残基６７～７４）、すぐ上流の融合ループ及び残基（残基９７～１０６）、ならびにｉｊループ（残基２４６～２４９）である。
別の実施形態では、上述の領域（参照サブユニットのドメインＩＩの３つのポリペプチドセグメントを含む領域）に加えて、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、１５０ループ及び第２のサブユニットのＮ１５３グリカン鎖をさらに含む。
ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物のさらなる実施形態は、特定の残基Ｋ３１０において、上述の領域（参照サブユニットのドメインＩＩの３つのポリペプチドセグメントを含む領域）、ならびに１５０ループ及び第２のサブユニットのドメインＩＩＩのＡストランドを含む。本発明者らは、本明細書で定義される有用な化合物のサブユニットがＶＤＥに結合する際に、第２のサブユニットの１５０ループに障害を来たすことが分かっている。それ故に、一実施形態では、１５０ループは、エンベロープタンパク質の天然二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの（約）４００アミノ末端残基において見出される天然配置にあってもよいか、または別の実施形態では、１５０ループは、１５０ループが本発明の化合物のうちの１つに結合する際に採用する不規則な配置にあってもよい。
Ｎ６７グリカンが樹状細胞のデング熱感染には特に重要であると見なされる。それ故に、本明細書に記載されるように、正しいエピトープ環境においてこの残基を含むＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、好ましい実施形態であると見なされる。
好ましい実施形態では、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物は、一旦対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すように、これらの抗体は、好ましくは、４種すべての血清型のデング熱ウイルスに結合することができ、任意に、４種すべての血清型のデング熱ウイルスを中和することができ、好ましくは、４種すべての血清型のデング熱ウイルスを１００％中和することができ、任意に、ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞及び昆虫細胞の両方で作られる４種すべての血清型のデング熱ウイルスを１００％中和することができる。
上述の安定化組換えｓＥ二量体を含むＥＤＥを含む免疫原性組成物は、当該対象において、
－エンベロープ二量体エピトープ（ＥＤＥ）を単独に認識する（ＥＬＩＳＡ試験において組換えＥタンパク質単量体への結合を示さない）、
－交差反応性がある、及び
－４種の血清型（ＤＥＮＶ１－４）からのデング熱ウイルスを中和する、中和抗体を引き起こすのに特に適している。
本発明はまた、有効量の、上に定義される安定化組換えｓＥ二量体（抗原として使用される）を含むデング熱ウイルス免疫原性組成物も提供する。
本組成物は、ＥＤＥ／ＥＤＥ化合物それ自体を含んでもよいか、またはそれはワクチン接種される対象内にＥＤＥ／ＥＤＥ化合物を発現するための手段を含んでもよい。例えば、本発明は、デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種で用いるための、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸を含み、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物は、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の通りである。さらに、核酸は、ベクターの一部であってもよい。ベクター及びベクター成分についての選好は、上述された通りである。
例えば、ワクチン接種が、例えばプラスミドＤＮＡによる直接免疫を介して、特定の抗原をコードする核酸を用いて実行され得ることは当該技術分野で公知である。かかる核酸は、リポソーム及び免疫刺激構築物を介して送達され得る。あるいは、弱毒化したウイルス宿主またはベクターまたは細菌性ベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターを使用され得る。
デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種で用いるための組成物が核酸である場合に、核酸は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、または任意の他のＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターにおいて、患者に送達され得る。
デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種で用いるための、
ａ）エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物、
ｂ）ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸、
ｃ）核酸を含むベクター、
のうちのいずれか１つ以上を含む組成物はまた、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物が前述の実施形態のうちのいずれかに記載の通りである場合に、本発明の一部である。
一実施形態では、
ａ）エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物、
ｂ）ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸、
ｃ）核酸を含むベクター、
は、１種を超える、任意に２種、任意に３種、任意に４種の血清型のデング熱ウイルスであるか、またはそれらをコードする。
好ましい実施形態では、
ａ）エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥ化合物、
ｂ）ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物をコードする核酸、
ｃ）核酸を含むベクター、
は、４種すべての血清型のデング熱ウイルスを中和する、好ましくは４種すべての血清型のデング熱ウイルスを１００％中和することができる抗体を作り出すことができる単一エピトープであるか、または単一エピトープの産生をもたらす。
デング熱ウイルスに対するワクチン接種における本発明の組成物の使用は、デング熱ウイルスによる感染を低減または予防することを意図している。
デング熱感染を低減または予防するとは、あらゆる程度まで感染のレベルを低減するという意味を含む。一実施形態では、本発明の化合物は、１種の血清型のデング熱ウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％低減する。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、２種の血清型のデング熱ウイルス、３種の血清型のデング熱ウイルス、４種すべての血清型のデング熱ウイルスによる感染を３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは１００％低減する。最も好ましい実施形態では、本発明の化合物は、４種すべての血清型のデング熱ウイルスによる感染を完全に予防する。
デング熱ウイルス感染に対する中和抗体を誘発する、本発明の、ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体は、デング熱ウイルスによる感染の期間の範囲で、重症度を防ぐまたは弱毒化するのに十分な量で哺乳動物対象、好ましくはヒトに投与される。
治療有効量は、その他の要因の中で、治療される対象、治療される対象の年齢及び全身状態、抗体を合成するための対象の免疫反応の容量、所望の保護の度合い、治療される状態の重症度、特定のＶＤＥ化合物、例えば選択された特定の安定化組換えｓＥ二量体及び投与の様式に応じて異なる。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。治療有効量は、定期的な試験を通して決定され得る比較的に広範な範囲に収まるであろう。
より具体的には、ＥＤＥ化合物、例えば本発明の安定化組換えｓＥ二量体は、１～１０００μｇの二量体、好ましくは１～５０μｇを含む治療有効量で投与される。
特定のワクチンに対する最適量は、対象における抗ｓＥ二量体の抗体力価を測定することを含む標準研究によって確かめられ得る。
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含むまたは含まずに投与されてもよい。アジュバントは、免疫原性組成物に直接添加され得るか、またはワクチンの投与と同時にまたは投与直後に、別々に投与され得る。かかるアジュバントとしては、アルミニウム塩（水酸化アルミニウム）、ムラミルペプチド等の特定の刺激剤を含むまたは含まない水中油型乳剤製剤、サポニンアジュバント、サイトカイン、コレラ毒素、百日咳毒素、もしくは大腸菌易熱性毒素等の細菌毒素の解毒された突然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の免疫原性組成物は、他の免疫原または免疫調節剤、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、及びケモカインと共に投与されてもよい。
ワクチン接種プログラムは、しばしば、ブースト戦略を含む。初期ワクチン接種後、対象は、当業者によって決定される適切な間隔で１つまたは２つのブースター注射を受けてもよい。一実施形態では、ワクチン接種は、プライム、続いて、１つまたは２つのブーストを含むことができる。抗原の発現をもたらす、抗原、組成物、核酸、またはベクターが、デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種のためのブースト戦略で用いるために、本発明において含まれ、任意に、この抗原、化合物、核酸、ベクター、または組成物は、デング熱ウイルス、任意に、弱毒化したデング熱ウイルス、及び／またはデング熱ウイルス様粒子の（プライム）投与前または（ブースト）投与後の投与のためのものであり、このデング熱ウイルスまたはデング熱ウイルス様粒子は、１種以上の血清型のデング熱ウイルスの一群であり得、ＥＤＥ、例えば、上述の非天然ＥＤＥまたはＥＤＥ化合物を含んでも、提示してもよい。さらなる例として、黄熱病を伴うキメリバックス等の異種フラビウイルスは、例えば、二量体、ＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルスのうちの１つ以上によって使用してもよく、当業者には明らかであるように、異なる抗原及び／または抗原をコードする核酸の投与の異なる順序及びタイミングが可能であってもよく、本発明は、投与のいかなる特定の組み合わせまたは順序に限定されない。
本発明はまた、デング熱ウイルスに対する保護を提供するためのワクチン接種戦略も含み、このワクチン接種戦略は、例えば、
ａ）前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、４種すべての血清型に対して抗体を作り出すことができるエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物、または前述の実施形態に従うワクチン組成物、またはワクチン接種で用いるための核酸、またはワクチン接種で用いるためのベクターの単回投与、任意に、続いて、弱毒化したデング熱ウイルスの投与、あるいは
ｂ）前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、２種の血清型からの２つのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、続いて、その他の２種の血清型からのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、任意に、続いて、弱毒化したデング熱ウイルスの投与、または
ｃ）弱毒化したデング熱ウイルスの投与、続いて、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、４種すべての血清型に対して抗体を作り出すことができるエンベロープ二量体エピトープの投与、あるいは
ｄ）弱毒化したデング熱ウイルスの投与、続いて、前述の実施形態のうちのいずれかに記載の、２種の血清型からの２つのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、続いて、その他の２種の血清型からのエンベロープ二量体エピトープもしくはＥＤＥ化合物の投与、を含む。
本発明に従ってワクチン接種を受けた患者が、デング熱感染を治療または予防するために用いるための本発明に従う化合物または組成物によるその後の治療を依然として必要とし得ることも想定される。
それ故に、本発明の化合物は、デング熱ワクチン接種をこれまでに受けたことがある患者、またはデング熱ワクチン接種をこれまでに受けたことがない患者において、デング熱感染を治療または予防するために用いるためのものである。
このワクチン接種が１種を超える血清型のデング熱ウイルスに対する保護を与える、好ましくは４種すべての血清型のデング熱ウイルスに対する保護を与えると見なされるため、ワクチン接種は、患者が既にデング熱感染に罹患している場合、依然として有用であると見なされるが、このワクチンは、好ましくは、デング熱感染の症状の前に、または患者がデング熱感染に罹患していることが分かる前に投与される。
それ故に、このワクチン接種は、デング熱にこれまでに感染したことがない患者、及びデング熱に今のところ感染していない、ワクチンの投与時に感染していない患者に用いるためのものである。あるいは、このワクチン接種は、１種以上の血清型のデング熱感染にこれまでに感染したことがあるが、ワクチンの投与時に感染していない患者に用いるためのものであるか、またはこのワクチン接種は、１種以上の血清型のデング熱感染にこれまでに感染したことがあり、１種以上の血清型のデング熱に今のところ感染していない、ワクチンの投与時に感染していない患者に用いるためのものである。
このワクチン接種はまた、本発明の化合物でこれまでに治療したことがあるが、本発明の化合物で現在治療していない患者に用いるためのものであり、これはまた、本発明の化合物でこれまでに治療したことがあり、本発明の化合物で現在治療している患者に用いるためのものである。このワクチン接種はまた、本発明の化合物で初めて治療する患者に用いるためのものである。
本発明はまた、薬剤用として、好ましくはデング熱ウイルス感染を予防及び／または治療するために、上に定義される、ＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体または免疫原性組成物も提供する。
本発明はまた、薬剤の、好ましくは、対象におけるデング熱ウイルス感染に対する予防もしくは治療ワクチンの製造のために、上に定義される、ＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体または免疫原性組成物も提供する。
本発明はまた、デング熱ウイルス感染を予防及び／または治療するための方法も提供し、この方法は、予防及び／または治療を必要とする対象に、上に定義される、ＥＤＥ化合物、例えば安定化組換えｓＥ二量体または免疫原性組成物を、感受性細胞のデング熱ウイルス感染を阻害するのに有効な量で投与し、それによって感染を予防または治療することを含む。
本発明はまた、本発明のＥＤＥ化合物、例えば、安定化組換えｓＥ二量体、または本発明の化合物、例えば、本発明に従う抗体もしくはその断片を含むか、またはそれらからなる診断用薬剤も提供する。
当該診断用薬剤の一実施形態では、この化合物、例えば、本発明に従う抗体もしくはその断片は、検出可能なマーカーに直接的もしくは間接的に、共有結合的もしくは非共有結合的に結合している。
検出可能なマーカーは、この化合物、例えば抗体もしくはその断片に、当該抗体もしくはその断片の末端（ＮまたはＣ末端）のうちの１つ、または当該抗体もしくはその断片のアミノ酸のうちの１つの側鎖のいずれかに、直接的に及び共有結合的に結合し得る。検出可能なマーカーはまた、当該抗体もしくはその断片に、接続アーム（すなわち、架橋結合試薬）を通して、当該抗体もしくはその断片の末端のうちの１つ、または当該抗体もしくはその断片のアミノ酸のうちの１つの側鎖のいずれかに、直接的に及び共有結合的に結合し得る。ペプチドまたは抗体への対象となる化合物の結合方法は、当該技術分野で公知である。
有利に、当該検出可能なマーカーは、
－ 西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、またはベータ－ガラクトシダーゼ等の酵素、
－ 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、スペクトルの紫外線（ＵＶ）部分での波長で励起された青色蛍光色素（例えば、ＡＭＣＡ（７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０）、青色光によって励起された緑色蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）、緑色光によって励起された赤色蛍光色素（例えば、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素５４６、５６４、及び５９４）、または電子検出器（ＣＣＤカメラ、光電子増倍管）で視覚化される遠赤外光によって励起された色素（例えば、Ｃｙ５）等の蛍光色素分子、
－ ユーロピアム、ランタン、またはイットリウム等の重金属キレート、
－ ［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース、１１Ｃ－、１２５Ｉ－、１３１Ｉ－、３Ｈ－、１４Ｃ－、３５Ｓ、または９９Ｔｃ－標識化化合物等の放射性同位体、からなる群から選択される。
本発明はまた、対象におけるデング熱ウイルス感染を診断または観察するために、本発明に従う、ＥＤＥ化合物、例えば、安定化組換えｓＥ二量体、抗体もしくはその断片、または診断用薬剤の使用も提供する。
本発明はまた、対象におけるデング熱ウイルス感染を診断するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、抗体もしくはその断片、または本発明に従う抗体もしくはその断片を含むまたはそれからなる診断薬剤とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）生体試料中のデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在または不在を判定するステップと、を含み、
デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在は、対象がデング熱ウイルス感染を有することを示す。
ステップｂ）は、抗体－抗原複合体（すなわち、デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ－デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ複合体に向けられた抗体）の存在または不在を判定することによって実行され得る。
本発明はまた、対象からの適切な生体試料中でデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在を決定するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの当該適切な生体試料を、抗体もしくはその断片、または本発明に従う抗体もしくはその断片を含むまたはそれからなる診断薬剤とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生体試料中のデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの存在または不在を判定するステップと、を含む。
本発明はまた、対象におけるデング熱ウイルス感染を診断するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）生体試料中の二量体を対象とする抗体の存在または不在を判定するステップと、を含み、
抗体の存在は、対象がデング熱ウイルス感染を有することを示す。
本発明はまた、対象からの適切な生体試料中でデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅを対象とする抗体の存在を決定するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの当該適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）当該生体試料中の当該二量体を対象とする抗体の存在または不在を判定するステップと、を含む。
本発明はまた、対象におけるデング熱ウイルス感染の進行または回帰を観察するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、抗体もしくはその断片、本発明に従う抗体もしくはその断片を含むまたはそれからなる診断薬剤とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）生体試料中のデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、対象において以前に得られたデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量と比較するステップと、を含み、
デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量の有意な増加がデング熱ウイルス感染の進行のマーカーを構成し、デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの有意な減少がデング熱ウイルス感染の回帰のマーカーを構成する。
本明細書に使用される場合、「有意な増加」及び「有意な減少」という用語は、当該からの適切な生体試料中のデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅの量と比較して、既に決定され、参照量として使用された、適切な生体試料中のそれぞれ、より高い量またはより低い量のデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅを指す。
ステップｂ）は、抗体－抗原複合体（すなわち、デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ－デング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ複合体に向けられた抗体）の存在または不在を判定することによって実行され得る。
本発明はまた、対象におけるデング熱ウイルス感染の憎悪の良好な予後を予測するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）生体試料中の二量体を対象とする抗体を中和する量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、対象において以前に得られた二量体を対象とする抗体の量と比較するステップと、を含み、
当該二量体を対象とする抗体を中和する量の有意な増加は当該デング熱ウイルス感染の憎悪の良好な予後のマーカーを構成する。
本発明はまた、デング熱ウイルスの予防注射を受けた対象におけるデング熱ウイルス感染のワクチン接種プロトコルの成功を観察するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、
ａ）当該対象からの適切な生体試料を、本発明に従う安定化組換えｓＥ二量体とインビトロで接触させるステップと、
ｂ）生体試料中の二量体を対象とする抗体を中和する量を判定するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において判定された量を、対象において以前に得られた二量体を対象とする抗体の量と比較するステップと、を含み、
当該二量体を対象とする抗体を中和する量の有意な増加が当該ワクチン接種プロトコルの成功のマーカーを構成する。
当該適切な生体試料は、血液、血清、尿、または肝生検、好ましくは血液であり得る。
タンパク質または抗体の量を検出及び決定するための免疫学的方法は、当該技術分野で公知である。例として、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または免疫蛍光試験は、使用することができる。
本発明はまた、上に定義される突然変異体ｓＥをコードする単離ポリヌクレオチド、または配列番号２８、１４２、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６、または１４７のポリペプチドも提供する。
本発明に従うポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術及び／または化学ＤＮＡ合成の公知の方法によって得られ得る。
本発明はまた、いくつかの部品のキットも提供する。ある実施形態は、安定化組換えｓＥ二量体、または本発明に従う抗体もしくはその断片、及び適切な診断用試薬を含む、対象におけるデング熱ウイルス感染を診断または観察するためのキットを提供する。
適切な診断用試薬は、対象におけるデング熱ウイルス感染を診断または観察するためのアッセイを行うために必要である。適切な診断用試薬は、溶媒、緩衝液、染料、抗凝固剤であり得る。
このキットはまた、マイクロタイタープレートも包含し得る。
一実施形態では、部品のキットは、本発明の化合物による治療を必要とする、または前述の実施形態に従う、より高い用量の本発明の化合物を必要とする患者を特定するための手段を含む。このキットは、抗ＥＤＥ抗体及び抗ＦＬ抗体の存在または不在を特定するための方法を提供してもよく、例えば、このキットは、マイクロタイタープレートを含んでもよく、任意に、マイクロタイタープレートは、線状もしくは変性エンベロープタンパク質でコーティングされ、前述の実施形態のうちのいずれかに従う、ＥＤＥエピトープでコーティングされ、かつ／またはＥＬＩＳＡ試験、任意に棒上の比色試験を実行するための試薬も含み得る。好ましくは、このキットは、好ましくは、固体支持体上の抗体の存在または不在を単に特定するための手段を包含する。このキットはまた、デング熱感染を治療または予防するために用いるための本発明の化合物または組成物をさらに含み得る。
ワクチン接種を必要とする患者を特定するための手段を含むさらなる部品のキットもまた、提供される。患者は、抗ＥＤＥ抗体及び抗ＦＬ抗体の存在及び不在、ならびにそれらのレベルに基づいて、ワクチン接種を必要すると見なされる。したがって、このキットは、抗ＥＤＥ抗体及び抗ＦＬ抗体の存在または不在を特定するための方法を提供してもよく、例えば、このキットは、マイクロタイタープレートを含んでもよく、任意に、マイクロタイタープレートは、線状もしくは変性エンベロープタンパク質でコーティングされ、前述の実施形態のうちのいずれかに従う、ＥＤＥエピトープでコーティングされ、かつ／またはＥＬＩＳＡ試験、任意に棒上の比色試験を実行するための試薬も含み得る。好ましくは、このキットは、好ましくは、固体支持体上の抗体の存在または不在を単に特定するための手段を包含する。このキットはまた、前述の実施形態に記載される、ワクチン接種で用いるための組成物をさらに含み得る。
さらなるキットは、デング熱感染を治療または予防する手段を包含し、ＥＤＥに結合する本発明の１つ以上の化合物、またはＥＤＥに結合する本発明の化合物を含む組成物を含み、任意に、さらなる治療剤、例えばさらなる抗ウイルス剤を含む。
本明細書に言及される任意の化合物または組成物または抗原または抗体は、組成物の一部であってもよいことが理解されよう。この組成物は、ＰＥＧ等の安定化剤を含んでもよい。ポリペプチド成分が、例えば、当該技術分野で公知のように、共有結合的に修飾または共役、例えばＰＥＧ化されてもよいことが理解されよう。
それ故に、例えば、デング熱感染を治療または予防で用いるための任意の化合物もしくは抗体、または任意のポリペプチドもしくは抗原、またはこの抗原もしくは抗体をコードする核酸もしくはベクターは、１つ以上のさらなる構成要素に共役してもよく、例えばレポーター部分に共役してもよく、または１つ以上のさらなる治療剤に共役してもよい。
あるそのようなさらなる治療剤は、Ｆｃ受容体結合を防ぐための薬剤である。デング熱ウイルスが抗体依存性増強を招くことは公知であり、このことが、このウイルスに結合するが、中和することができないある特定の抗体の産生が原因であると考えられている。このことにより、Ｆｃ受容体を介して抗原の内面化をもたらし、再感染時に増大した反応をもたらす。Ｆｃ受容体結合を遮断し得る薬剤が抗体依存性増強を防ぎ得ると考えられている。かかる薬剤かかる薬剤の例は、デング熱感染を治療または予防するために用いるための本発明の化合物、及びワクチン接種で用いるための抗原と共に（または別々に）投与する場合に有用であると見なされている。また、当業者に周知のように、Ｆｃ受容体との相互作用が軽減するような抗体分子を修飾または選択することにも有用であり得る。
本明細書に記載の任意の薬剤の投与が、典型的に、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、または担体と一緒に薬学的組成物の一部として投与される。それ故に、化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞に関する任意の言及、及びさらなる治療剤の任意の言及は、化合物、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、及び／またはさらなる治療剤（例えば、製剤）を含む薬学的に許容される組成物に同等に適用する。
この化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸は、ナノ粒子の一部であり得る。
投与の経路は、当業者に周知であろう。例えば、本発明の薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤）は、即時、遅延、または制御放出性の適用のために、香料剤または着色剤を含み得る錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液、または懸濁液の形態で、経口、口内、または舌下に投与することができる。本発明の化合物はまた、静脈内注射によって投与してもよい。本発明に従う化合物ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤は、哺乳動物対象、好ましくはヒトに経口投与することができる。それらはまた、当該対象に、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下注射等の注射によって投与することができる。
薬剤は、活性成分を含む薬学的薬剤の形態で、任意に非毒性有機または無機、酸または基、添加塩の形態で、薬学的に許容される剤形で、経口または何らかの非経口経路によって投与され得る。治療される疾患や患者及び投与の経路に応じて、薬剤は、異なる投薬量で投与され得る。
好ましくは、製剤は、１日用量または単位、１日サブ用量またはその適切な断片、週１回の用量、月１回の用量、または６カ月に１回の用量の薬剤または活性成分を含有する単位投薬量である。
ヒト治療法では、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤さらなる治療剤）は、単独で投与することができるが、一般に、意図される投与経路及び標準的な薬学的実践に関して選択される、適当な薬学的賦形剤希釈剤、または担体と混和して投与されるであろう。
錠剤は、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸水素カルシウム、及びグリシン等の賦形剤、デンプン（好ましくはコーン、ポテト、またはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム等の崩壊剤、ある種の錯体ケイ酸塩、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、サクロース、ゼラチン、及びアカシア等の顆粒結合剤を含有してもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルク等の潤滑剤が含まれてもよい。カプセルまたは錠剤はまた、胃の安定性を高めるためにコーティングされた腸溶性であってもよい。
同様の種類の固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。これに関して好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量のポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液及び／またはエリキシルについては、本発明の化合物は、様々な甘味剤または香味剤、着色剤または色素、乳化剤及び／または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン等の希釈剤、ならびにこれらの組み合わせと混合してもよい。
薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）はまた、非経口に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、または皮下に投与することができるか、またはそれらは、注入技術によって投与してもよい。それらは、無菌水溶液の形態で使用するのが最も良く、この無菌水溶液は、その他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有してもよい。この水溶液は、必要ならば適当に緩衝化（好ましくはｐＨ３から９に）しなくてはならない。無菌条件下の適当な非経口用製剤の調製は、当業者には公知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び製剤を対象とする受容者の血液と等張の状態にする溶質を含有してもよい水性及び非水性無菌注射液、ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含んでいてもよい水性及び非水性無菌注射液を含む。製剤は、単位用量または多用量容器、例えば密封されたアンプルやバイアルの中で提示されてもよく、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用蒸留水の添加だけを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即席の注射液及び懸濁液は、以前に記載した種類の無菌の散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製され得る。
ヒト対象への経口及び非経口投与のために、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）の１日投与量レベルは、通常、１成人につき１～５０００ｍｇであり、単回または分割した用量で投与されよう。
それ故に、例えば、本発明の化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンを含む錠剤またはカプセルは、必要に応じて、一度に、単回または２回もしくはそれ以上の投与のために、活性化合物の１ｍｇ～１０００ｍｇ（すなわち、約６０～１２０ｍｇ／ｍ２）を含有してもよい。いずれにしても、医師は、任意の個々の対象に最も適しているであろう実際の投与量を決定し、投与量は、特定の対象の年齢、体重、及び反応に応じて異なるであろう。上の投与量は、平均的な症例を例示するものである。当然ながら、より高いまたはより低い投与量の範囲が有利である個々の事例があり、このようなものは、本発明の範囲内である。
薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）はまた、鼻腔内または吸入により、投与することもでき、適当な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、またはその他の適当なガス、を使用する加圧容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器からの乾燥粉末吸入器、またはエアロゾルスプレー提供物の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合には、投与量単位は、計測量を送達するためのバルブを装備することによって決定してもよい。加圧容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器は、例えば溶媒としてエタノールと高圧ガスとの混合物を使用する、化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンの溶液または懸濁液を入れることができ、これは、潤滑剤、例えばソルビタントリオレエートをさらに含有してもよい。吸入器または注入器中で使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の化合物とラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、各計測された用量または「パフ」が、対象への送達のために、少なくとも１ｍｇの薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）を含有するように、好ましくは、準備される。エアロゾルを用いた全体の１日投与量が、対象毎に異なり、単回用量、またはより一般には、１日を通して分割された用量で投与され得ることが理解されよう。
あるいは、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、坐剤またはペッサリーの形態で投与することができるか、またはそれらは、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または散布剤の形態で局所適用されてもよい。本発明の化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンはまた、例えば、皮膚用パッチの使用により経皮的に投与されてもよい。それらはまた、具体的には、眼の疾患を治療するために、眼の経路によって投与されてもよい。
眼に使用するためには、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、等張の、ｐＨ調整した、無菌食塩水中の超微粉懸濁液として、または好ましくは等張の、ｐＨ調整した、無菌食塩水中の溶液として、場合により塩化ベンジルアルコニウム等の防腐剤と組み合わせて、製剤化することができる。あるいは、それらは、ワセリン等の軟膏中に製剤化してもよい。
皮膚に局所的に適用するためには、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、例えば、以下のもの：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウ、及び水、のうちの１つ以上との混合物中に懸濁または溶解させた活性化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチンを含有する適当な軟膏として製剤化することができる。あるいは、それらは、例えば、以下のもの：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルロウ、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水のうちの１つ以上の混合物中に懸濁または溶解させた適当なローションまたはクリームとして製剤化することができる。
口内での局所投与に適した製剤には、芳香基剤、通常スクロース及びアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むトローチ剤、ゼラチン及びグリセリン等の不活性基剤、またはスクロース及びアカシア中に活性成分を含む香錠、ならびに適当な液体担体中に活性成分を含む口内洗浄液が含まれる。
概して、ヒトにおける、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）の経口または局所投与は、最も都合がよい好ましい経路である。受容者が嚥下障害または経口投与後の薬物吸収の低下に苦しんでいる状況では、薬物は、非経口で、例えば、舌下または頬側に投与されてもよい。
家畜への使用のために、薬剤（化合物、ポリペプチド、抗体、その抗原結合部分、組成物、核酸、ベクター、抗原、宿主細胞、さらなる治療剤、ワクチン）は、通常の獣医学診療に従って適切に許容される製剤であり、獣医は、特定の動物に最も適切であろう投与の投与レジメン及び経路を決定するであろう。
便宜上、この製剤は、薬学的製剤である。この製剤は、獣医学製剤であってもよい。
投与という用語は、１回の投与に制限されないことが理解されよう。投与という用語は、単回投与、長期間にわたる複数回投与、長期間にわたる可変の投与量の投与、長期間にわたる投与の可変手段、１つ以上のさらなる治療剤と併せた投与のうちのすべてを網羅することを含むが、これらに限定されない。投与は、当該技術分野で周知の任意の手段によるものであり得、投与には、経口、静脈内、腫瘍に対して直接的に局所、舌下、または坐薬が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書における既報文書の列記または考察は、当該文書が最新技術の一部であり、共通の一般知識であることを確認するものと必ずしも理解すべきではない。
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータにおける選好及び選択肢は、特に文脈に示されない限り、本発明のすべての他の態様、特徴、及びパラメータにおける任意の及びすべての選好及び選択肢と組み合わせて開示されているよう見なされるべきである。例えば、ＶＤＥについての様々な定義は、本発明のすべての態様に関連しており、例えば、デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種で用いるためのＶＤＥを含むエピトープは、エピトープ骨格タンパク質のうちの任意の１つ以上を含み得、骨格タンパク質は、ビリオン依存性エピトープに共有結合的に結合する異種骨格タンパク質；少なくともＱ７７、Ｗ１０１、Ｎ１５３、Ｔ１５５、Ｋ３１０のエンベロープタンパク質；または任意に、ドメインＩＩの以下の特性、ｂ鎖（残基６７～７４）、すぐ上流の融合ループ及び残基（残基９７～１０６）、ならびにｉｊループ（残基２４６～２４９）のうちの任意の１つ以上をさらに含むドメインＩＩのエンベロープタンパク質のうちの任意の１つ以上を含み得る。
参考文献
１．Ｂｈａｔｔ，Ｓ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４９６：５０４－５０７
２．Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．５ｔｈ ｅｄｎ，Ｖｏｌ．１ １１０１－１１５２（ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）
３．Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０００．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｄｅｎｇｕｅ ｉｎ Ｓａｎｔｉａｇｏ ｄｅ Ｃｕｂａ，１９９７．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏ １１５２：７９３－７９９
４．Ｓａｎｇｋａｗｉｂｈａ ｅｔ ａｌ １９８４ Ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｄｅｎｇｕｅ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ ｉｎ Ｒａｙｏｎｇ，Ｔｈａｉｌａｎｄ．Ｉ．Ｔｈｅ １９８０ ｏｕｔｂｒｅａｋ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏ １１２０：６５３－６６９
５．Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｄｅｎｇｕｅ．Ｎ Ｅｎｇｌ ｊ Ｍｅｄ ３６６：１４２３－１４３２
６．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ．Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ ｎｏ．１１７．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔｉｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ１１７／ｅｎ／（２００９）．
７．Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｏｒｉｇｉｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：９２１－９２７
８．Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ ２００２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ １０８：７１７－７２５
９．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｔ ３．５－Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：１０５－１１０
１０．Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ ２００８ Ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ａｍｏｎｇ ｖｉｒｕｓ，ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｔ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８１：５８６５－５８７４
１１．Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ ２００２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １０８：７１７－７２５
１２．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ ２００５ Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ ３：１３－２２
１３．Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｔｈｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９：１８３０－１８３４
１４．Ｙｕ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｔ ｌｏｗ ｐＨ ｐｒｉｍｅｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９：１８３４－１８３７
１５．Ｊｕｎｊｈｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒ－Ｍ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｎ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４：８３５３－８３５８
１６．Ｆｉｂｒｉａｎｓａｈ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｗｈｅｎ Ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ａ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ３７Ｃ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７：７５８５－７５９２
１７．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｄｅｎｇｕｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｈｏｓｔｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：６７９５－６７９９
１８．Ｂｒｅｓｓａｎｅｌｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ ２００４ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｔｓ ｌｏｗ－ｐＨ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ ２３：７２８－７３８
１９．Ｍｏｄｉｓ ｅｔ ａｌ ２００４ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４２７：３１３－３１９
２０．Ｐｌｅｖｋａ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ ｓｔａｒｔｓ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌｌｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｅｓ．ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ １２：６０２－６０６
２１．Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ－Ｚｙｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ａ ｖｅｉｌｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ？ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ６：ｅ１０００７１８
２２．Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：７４５－７４８
２３．Ｈａｌｓｔｅａｄ ２００３ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：４２１－４６７
２４．Ｍａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：６６２９－６６３５
２５．Ｏｓｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：７２５１－７２６０
２６．Ｓｉｔｔｉｓｏｍｂｕｔ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｌａｃｋ ｏｆ ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ４５：４３－４９．
２７．ｄｅ Ａｌｗｉｓ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９：７４３９－７４４４
２８．Ｗｅｎｇｌｅｒ ＆ Ｒｅｙ １９９９ Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ Ｅ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５７：４７２－４８２
２９．Ｃｏｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｐｒｉｍａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ．Ｅｍｂｏ Ｊ ３１：７６７－７７９
３０．Ｗｕ ＆ Ｋａｂａｔ １９７０ Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｍａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３２：２１１－２５０
３１．Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ ２００９ ＩＭＧＴ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７：Ｄ１００６－１０１２
３２．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ａ ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４：３７２－３８４
３３．Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９：１１２－１２４
３４．Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ，ｎａｔｕｒａｌ ＩｇＧ Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２９４３０
３５．Ｗｒａｍｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｍａｓｓｉｖｅ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ Ｖｉｒｏｌ ８６：２９１１－２９１８
３６．Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ ６：ｅ１４４７
３７．Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈｌｙ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎｄｏｗｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ８：２７１－２８３
３８．Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｈｉｇｈ－ａｖｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８７：１２５６２－１２５７５
３９．Ｃｈｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ａ ｆｕｓｉｏｎ－ｌｏｏｐ ａｎｔｉｂｏｄｙ．ＥＭＢＯ Ｊ ２８：３２６９－３２７６
４０．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｃ１９ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｂｃ ｌｏｏｐ ｏｆ ｄｏｍａｉｎ ＩＩ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．ｍＢｉｏ ４：ｅ００８７３－００８１３
４１．Ｗｕ ｅｔ ａｌ ２０００ Ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：８１６－８２０
４２．Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ ａｃｉｄｉｃ ｐＨ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９：６９５－７００
４３．Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ４：ｅ１００００６０
４４．Ｂａｃｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３：１６９－１７４
４５．Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２５：５９－６６
４６．Ｙｕ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｔ ｌｏｗ ｐＨ ｐｒｉｍｅｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９：１８３４－１８３７
４７．Ｃｏｃｋｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｂｒｏａｄ ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０：３０３－３１４
４８．Ｌｏｋ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５：３１２－３１７
４９．Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＤＣ－ＳＩＧＮ．Ｃｅｌｌ １２４：４８５－４９３
５０．ｄｅ Ａｌｗｉｓ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９：７４３９－７４４４
５１．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｉｔｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＲ４３５４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７，１８９５０－１８９５５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１１０３６１０７（２０１０）．
５２．Ｆｉｂｒｉａｎｓａｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｗｈｅｎ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ３７°Ｃ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００７５７－１３（２０１３）．
５３．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｇｕｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｈｏｓｔｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、６７９５－６７９９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０４３００１１０（２０１３）．
５４．ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２、５９２－５９８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１ｆ６７２８３（２０１３）．
５５．Ａｒｉｃｅｓｃｕ，Ａ．Ｒ．，Ｌｕ，Ｗ．＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ａ ｔｉｍｅ－ ａｎｄ ｃｏｓｔ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６２，１２４３－１２５０（２００６）．
５６．Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ－Ｚｙｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ａ ｆｕｓｉｏｎ－ｌｏｏｐ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：１１８００－１１８０８
５７．ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＳＶ ｆｕｓｉｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ａ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４０：１１１３－１１１７
５８．Ｗｈｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：１４２１６－１４２２１
５９．Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｇｒｏｕｐ ２ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：８４３－８５０
６０．Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ＨＩＶ１ ｇｐ１２０．Ｎａｔｕｒｅ ４４：７３２－７３７
６１．Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＶＲＣ０１．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９：８１１－８１７
６２．Ｐａｐｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｏｎｅ ｄａｙ ｗｉｔｈ ＞８０％ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ９：３－４
６３．ＷＯ ２０１１／０５０１６８
６４．Ｓｉｔｔｉｓｏｍｂｕｔ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｌａｃｋ ｏｆ ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：４３－４９
６５．Ｋａｂｓｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６：１２５－１３２
６６．Ｅｖａｎｓ ＆ Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ ２０１３ Ｈｏｗ ｇｏｏｄ ａｒｅ ｍｙ ｄａｔａ ａｎｄ ｗｈａｔ ｉｓ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ？Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６９，１２０４－１２１４
６７．Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ ｓｕｉｔｅ ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７：２３５－２４２
６８．ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ ２００７Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４０，６５８６７４
６９．Ｎａｖａｚａ，２００１ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ＡＭｏＲｅ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５７：１３６７－１３７２
７０．Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ ２０１０．Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６ ４８６－５０１
７１．Ｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｉｎ ＢＵＳＴＥＲ－ＴＮＴ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０：２２１０－２２２１
７２．Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＴＬＳ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｉｎ ＲＥＦＭＡＣ ａｔ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３７４：３００－３２１
７３．Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｔｏｗａｒｄｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６８：３５２－３６７
７４．Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７－２９４８
７５．Ｇｏｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ａ ｎｅｗ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｔ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８：Ｗ６９５－６９９
７６．Ｋｌｕｎｇｔｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｇｅｎｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ １５４，１７５－１８１
７７．Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ＭＥＧＡ５：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ２８：２７３１－２７３９
７８．Ｇｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ １９９９ ＥＳＰｒｉｐｔ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｉｎ ＰｏｓｔＳｃｒｉｐｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：３０５－３０８
７９．Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ ｏｆ ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８：１００３７－１００４１
８０．Ｄｏｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ ２００４ ＰＤＢ２ＰＱＲ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｔｕｐ ｏｆ Ｐｏｉｓｓｏｎ－Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２，Ｗ６６５－６６７
８１．Ｒｅｙ ２０１３ Ｎａｔｕｒｅ ４９７：４４３－４４４
８２．Ｏｆｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１０ ＰＮＡＳ １０７：１７８８０－１７８８７
８３．Ｂｕｒｔｏｎ ２０１０ ＰＮＡＳ １０７：１７８５９－１７８６０
８４．Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ ２０１０ ＰＮＡＳ １３７０１－１３７０６
８５．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１４ ３：１２－２８
他の参考文献：
８６．Ｃｏｌｌｅｒ ＆ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ２０１１１ Ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：３９１－３９８
８７．Ｍｕｒｐｈｙ ＆ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ２０１１ Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ａ ｖａｃｃｉｎｅ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２９：５８７－６１９
８８．Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｌｉｖｅ－ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ＣＹＤ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｔｈａｉ ｓｃｈｏｏｌｃｈｉｌｄｒｅｎ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ ２ｂ ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３８０：１５５９－１５６７
８９．Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ ２００６ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉ ｒｏｔ ８０：１２１４９－１２１５９
９０．Ｓｕｋｕｐｏｌｖｉ－Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：９２２７－９２３９
９１．Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ ＆ Ｌａｉ ２００４ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓｅｓ ｍａｐ ｔｏ ｉｎｓｉｄｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｌｏｓｅ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｔｏ ｆｕｓｉｏｎ ｌｏｏｐ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉ ｒｏｔ ７８：１２９１９－１２９２８
９２．Ｌａｉ ｅｔ ａｌ ２００８ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｒｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｌｏｏｐ ｏｆ ｄｏｍａｉｎ ＩＩ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：６６３１－６６４３
９３．Ｃｏｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｒｏａｄｌｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ．Ｊ Ｖｉ ｒｏｔ ８７：５２－６６
９４．Ｔｅｏｈ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ ｂｙ ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１３９ｒａ８３
９５．Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＆ Ｃｏｌｍａｎ １９９３ Ｓｈａｐｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３４：９４６－９５０
９６．Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＨＩＶ－１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８：ｅ１００２７９７
９７．ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０ Ｖ１／Ｖ２ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＰＧ９．Ｎａｔｕｒｅ ４８０：３３６－３４３
９８．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１０ ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ－ａｔｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６：１２－２１
９９．Ｍｉｌｌｗａｒｄ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ”、ＡＣＳ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ、ｖｏｌ．２，ｎｏ．９，ｐａｇｅｓ ６２５－６３４，
１００．Ｈｅｉｎｉｓ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｐｈａｇｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ” ＮＡＴＵＲＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．７，ｐａｇｅｓ ５０２－５０７
１０１．ＷＯ２００９０９８４５０
参考文献
Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｐ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６８，３５２－３６７（２０１２）．
Ｂａｃｋｏｖｉｃ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３，１６９－１７４（２０１０）．
Ｂｈａｔｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９６，５０４－５０７（２０１３）．
Ｂｌａｎｃ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０，２２１０－２２２１（２００４）．
Ｃｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，（２０１０）．
Ｃｏｃｋｂｕｒｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０，３０３－３１４（２０１２ａ）．
Ｃｏｃｋｂｕｒｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ ３１，７６７－７７９（２０１２ｂ）．
Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５４，１８５６－６６（２００６）．
ｄｅ Ａｌｗｉｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，７４３９－７４４４（２０１２）．
Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８，７４５－７４８（２０１０）．
Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，４８６－５０１（２０１０）．
Ｅｖａｎｓ，Ｐ．Ｒ．＆ Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６９，１２０４－１２１４（２０１３）．
Ｆａｎ Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７，１１２７２－８１（２０１２）．
Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２５，５９－６６（２０１２）．
Ｇｏｕｊｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８，Ｗ６９５－６９９（２０１０）．
Ｈａｂｅｒｚ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００６，８，１２７５－１２７８．
Ｈｅｍａｐｒａｂｈａ Ｅ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ １，２２－２６（２０１２）．
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）．
Ｈａｒｍｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２３，４９２６－３４（２００５）．
Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ｘｄｓ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，１２５－１３２（２０１０）．
Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７，１８９５０－１８９５５（２０１０）．
Ｋｈａｋｓｈｏｏｒ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１１，３０００－３００３（２００９）．
Ｋｌｕｎｇｔｈｏｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ １５４，１７５－１８１（２００８）．
Ｋｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０８，７１７－７２５（２００２）．
Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２９３０－４４（２００７）．
Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３，２９４７－２９４８（２００７）．
Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｃ．＆ Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３４，９４６－９５０（１９９３）．
Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７，Ｄ１００６－１０１２（２００９）．
Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．，Ｔｈｉｅｌ，Ｈ．＆ Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．５ｔｈ ｅｄｎ，Ｖｏｌ．１ １１０１－１１５２（ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００７）．
Ｌｏｋ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５，３１２－３１７（２００８）．
ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４０，６５８－６７４（２００７）．
ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，５９２－５９８（２０１３）．
Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００，６９８６－６９９１（２００３）．
Ｎａｖａｚａ，Ｊ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５７，１３６７－１３７２（２００１）．
Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １２４，４８５－４９３（２００６）．
Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，２９１－２９８（１９９５）．
Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３８０，１５５９－１５６７（２０１２）．
Ｓｉｔｔｉｓｏｍｂｕｔ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５，４３－４９（１９９５）．
Ｓｐｅｅｒｓ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２５，４６８６－７（２００３）．
Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ２８，２７３１－２７３９（２０１１）．
Ｖｉｎｃｋｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４，３２７３－８４（２００９）．
Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３７４，３００－３２１（２００３）．
Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６７，２３５－２４２（２０１１）．
Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．＆ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３２，２１１－２５０（１９７０）．
Ｙｕ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１９，１８３４－１８３７（２００８）．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２，１６０７－１６１８（２００４）．
Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０，１０５－１１０（２０１３）．
ヒト抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体の特徴付け１４５個のＤＥＮＶ ｍＡｂのウェスタンブロット（ＷＢ）によるＤＥＮＶエンベロープタンパク質に対する血清型特異性及び反応（ｂ）ＷＢ陽性及びＥＤＥ（ＷＢ陰性）抗体の血清型特異性。（ｃ）突然変異体ＶＬＰのパネルを用いたエピトープマッピングの概略図。突然変異の位置をデング熱エンベロープタンパク質のドメイン構造に対して示し、このうち赤色、黄色、及び青色が、それぞれドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを表す。Ｗ１０１の周りの融合ループを表し、Ｎ１５３グリコシル化モチーフを妨害する突然変異の位置を示す。 中和アッセイにおいて、ＥＤＥ抗体は、強力かつ高度に交差反応性がある。 中和アッセイは、Ｃ６／３６昆虫細胞（それぞれ３つのＦＬ、ＥＤＥ１、及びＥＤＥ２）において産生された４種すべてのＤＥＮＶ血清型に対する９つの代表的なｍＡｂについてベロ細胞に行われた。データは３つの独立した実験からのものであった。 ＥＤＥ特異抗体は、優れた中和活性を有する。 標的細胞としてベロを用いた中和アッセイは、Ｃ６／３６昆虫細胞Ｃ６／３６－ＤＥＮＶ（ａ）または樹状細胞ＤＣ－ＤＥＮＶ（ｂ）から作製されたＤＥＮＶ２に行われた。赤色、青色、及び緑色の棒は、それぞれ、０．０５、０．５、及び５ｕｇ／ｍｌ（最終濃度）のｍＡｂにおけるＦＲＮＴ（低減率（％））を表した。添付論文で使用されたＥＤＥ ｍＡｂは、ヒストグラムより下に印を付けられる。抗体は、ＦＬ及びＥＤＥに分類されるが、一方、ＶＬＰ上にマッピングしないＷＢが陽性である抗体は、非ＦＬと称される。ＶＬＰマッピングの結果に基づいて、５つのサブグループのＥＤＥが特定され、ＥＤＥ１５と称された。（ｃ）捕捉ＥＬＩＳＡによって測定された結合についての力価曲線、及びＦＬならびにＥＤＥ１及び２群からの２つの代表的な抗体を有するウイルスを産生されたＤＣ及びＣ６／３６の中和反応。このデータは２つの独立した実験からのものであり、それぞれ９つの抗ＦＬ抗体及び抗ＥＤＥ１抗体、ならびに７つの抗ＥＤＥ２抗体からの結果を代表する。 異なる成熟状態でのウイルス粒子への抗体結合。（ａ）抗ｐｒＭ及び抗Ｅ ＥＬＩＳＡは、様々なウイルス粒子におけるｐｒＭ：Ｅの比率を計算するために使用され、１００％のｐｒＭ含量として定義されるＬｏＶｏ細胞からのウイルスと比較した。（ｂ）Ｃ６／３６、ＤＣ、２９３Ｔ、フリンでトランスフェクトされた２９３Ｔ、ＬｏＶｏ細胞から産生したＤＥＮＶ２、または酸処理したＤＥＮＶ２への代表的なｍＡｂの結合は、捕捉ＥＬＩＳＡによって測定された。それぞれ２つのＦＬ、ＶＤＥ１、及びＶＤＥ２ ｍＡｂを、酸処理したウイルスに対して感受性があるＶＤＥ４ ｍＡｂと一緒に示す。このデータは２つの独立した実験からのものであり、８つの抗ＦＬ、１０の抗ＶＤＥ１抗体、及び８つの抗ＶＤＥ２抗体からの結果を代表する。 個々の患者からのＦＬ対ＥＤＥ ｍＡｂ。（ａ）患者間のＦＬ及びＥＤＥ反応の分布を、ＦＬ－青色及びＥＤＥ－赤色で示す。中央にある数字は、各患者からのＡｂの数を示し、同一のアミノ酸配列を有する患者７５２からの３つの複製抗体（１ ＥＤＥ１及び２ ＥＤＥ２）のうちの１つの写しをこれ及びすべてのその他の分析から排除した。（ｂ）ＡＤＥ、Ｕ９３７細胞は、ＦＬまたはＥＤＥに反応する抗Ｅ ｍＡｂの力価の存在下で、Ｃ６／３６細胞またはＤＣのいずれかで成長させたＤＥＮＶ２に感染した。これらの結果は、２つの独立した実験からの中央値のピーク増強（倍）として表される。紫色、青色、緑色、及び赤色の記号は、それぞれ、添付論文（ｃ）ＦＬとＥＤＥ ｍＡｂとの間のＮＴ５０及びＮＴ９０力価に使用される、７５２－２Ｃ８、７５３（３）Ｃ１０、７４７（４）Ａ１１、及び７４７（４）Ｂ７ ｍＡｂを示し、これらはＣ６／３６及びＤＣウイルスについて比較される。 突然変異体ＶＬＰのパネルを用いたエピトープマッピングの概略図。突然変異の位置をデング熱エンベロープタンパク質のドメイン構造に対して示し、このうち赤色、黄色、及び青色が、それぞれドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを表す。Ｗ１０１の周りの融合ループを表し、Ｎ１５３グリコシル化モチーフを妨害する突然変異の位置を示す。 ＥＤＥ１及びＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体の生殖細胞分析。 組換えＥ二量体は、ＥＤＥ１抗体及びＥＤＥ２抗体の両方に結合する。ａ）ＢＮＡ（広域中和抗体）Ｆａｂ断片との複合体としての、または複合体でない、４種のデング熱血清型からの組換えｓＥタンパク質のＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析。ＭＡＬＳは、ｓＥタンパク質のＳＥＣクロマトグラム（緑色の曲線）が単量体画分にのみ対応し、二量体が検出されないことを示した。ｓＥ 血清型１、３、及び４について観察された２つのピークは、単量体に対応する。最も有力な説明は、二量体の親和性が十分高くなく、二量体－単量体の平衡がゲル濾過カラムにおいて乱されて、その結果、二量体が解離するというものである。Ｆａｂ断片との複合体は、二量体形態を明らかに安定させ、これは２つのＦａｂ断片と複合したｓＥ二量体（赤色の曲線）の溶出を可能にする。遅く溶出するｓＥ単量体画分にみが複合体に変換され、一方、その他のピークは変化がないことに注目した（このことは、ＤＥＮＶ－３ ｓＥで最も明らかであったが、それはその他の血清型についても当てはまる）。ＤＥＮＶ－２ ｓＥについては、小分子量に向かってテールを有する単一のｓＥピークがあり、これは複合体形成時に消失する。この挙動についての説明は、アルファウイルス融合タンパク質Ｅｌに関する我々の以前の情報と同様に２８、二量体を形成するｓＥコンピテントを含有する画分の露出した融合ループが、支持体と相互作用する傾向があり、このため溶出画これほどまでに遅くなるというものである。ｂ）ＥＤＥ２すべて、ＥＤＥ２ Ｂ７、ＥＤＥ１ Ｃ８、ＥＤＥ１ Ｃ１０のテザーＦａｂ断片を有するｓＥの相互作用に対応するリアルタイムＳＰＲプロファイル。ＤＥＮＶ－４に特異的であるＦａｂ ５Ｈ２の結合は、そのよく特徴付けられたエピトープ２９が二量体界面にはなく、結合のために二量体形成を必要としないことを考慮して、陽性対照として示される。Ｆａｂ断片がＰｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６チップ上の同様の密度に固定化された。４種の血清型（示されるような）からのＤＥＮＶ ｓＥタンパク質の２μＭ 溶液を、すべてのＦａｂにわたって同時に注射した（Ｏｎｌｉｎｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓの項を参照）。ＳＰＲシグナルは、秒（秒）単位の時間の関数として反応単位（ＲＵ）で提示される。結合のレベルは、パネル（ａ）における対応する抗体のＳＥＣ／ＭＡＬＳプロットに概ね一致していることに留意されたい。 結晶学的統計学 非連結型ＤＥＮＶ－２ ＦＧＡ０２ ｓＥ二量体の結晶構造。ａ）ｓＥの利用可能な構造との比較。ｓＥのその事前有効形態での３つの利用可能な構造（ＰＤＢコード１０ＡＮ、１０ＫＥ、１ＴＧ８）のうち、ＰＤＢコード１０ＡＮを有する１つは、非連結型ＦＧＡ０２ ｓＥ構造でより小さい標準偏差を示した。ｂ）構造によって示された２つの遺伝子型のＤＥＮＶ－２を位置付ける系統樹。 ４種のＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体と複合したＤＥＮＶ２ ｓＥ。ａ）ＥＤＥ２ Ａ１１ Ｆａｂ断片との複合体。ｓＥ二量体は、垂直な２倍の分子軸とウイルス膜に面している側面の下に配向している。ｓＥプロモーターを、ドメイン（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩをそれぞれ、赤色、黄色、及び青色）により着色された表面として、ならびに融合ループを紫色（ｂでは、あるプロモーターに対して標示された）として示す。前景及び背景ｓＥサブユニットは、鮮やかな色及び淡い色で区別される。２つのＮ結合型グリカン鎖（表面には含まれない）を、原子の種類により着色された球棒として示し（炭素を白色、酸素を赤色、窒素を青色）、標示した（Ｎ６７及びＮ１５３）。Ａ１１ Ｆａｂを、重鎖及び軽鎖をそれぞれ、緑色及び灰色でリボンでの表現で示す。ｂ）２倍軸（中央に「２」と標示された）の下に見られる非連結型ＤＥＮＶ２ ＦＧＡ０２ ｓＥ二量体。緑色及び灰色の空の楕円（ＶＨ及びＶＬと標示された）は、それぞれ、２倍分子軸により近接したＶＨを有する、重鎖及び軽鎖の接触部位をおおむね示す。エピトープの説明に関連するポリペプチド部分及びループをｃ）と標示する。２つの頂上部間で覆われた融合ループ「くぼみ」、一方のサブユニット上にｂストランド、及びもう一方に１５０ループを強調する、（ｂ）中に示される白抜き矢印の下の方の図。ｄ～ｆ）ｃにあるものと同じ図であって、抗ＥＤＥ抗体ＥＤＥ２ Ｂ７（ｄ）、ＥＤＥ１ Ｃ８（ｅ）、及びＥＤＥ１ Ｃ１０（ｆ）を有する複合体を示す（可変ドメインのみを示す）。（ｅ）及び（ｆ）中の白色星は、これらの複合体において不規則である、１５０ループの領域に印を付ける。Ｂ７及びＡ１１複合体では、Ｃ８及びＣ１０複合体と比較して、軽鎖がドメインＩＩＩから離れすぎて、それと相互作用できないことに留意されたい。 抗ＥＤＥ抗体及びｓＥ二量体の全体的な複合体及びインプリント。各行は、異なるｓＥ／ＢＮＡ（広域中和抗体）複合体（非連結型ｓＥ二量体を示す初めのものを除く）に対応し、各列は、標示されるように、同じ配向を示す。初めの２カラムでは、ｓＥ二量体をリボンとして、ＢＮＡ可変ドメインを図１１中にあるように色付けされた表面として示す。側面図（左カラム）では、ウイルス膜は、下部にあり得、一方、底面図（中央カラム）はウイルス膜から見られるｓＥ二量体に対応し、これらの抗体は、ｓＥリボン全域に可視的である。上面図（右カラム）は、ウイルス粒子上の免疫系に提示されるｓＥ表面を示し、白色奥行手がかりフォグで抗体（緑色）のインプリントを示す。明確にするために、白色輪郭線は、ドメインＩＩＩの青色表面上に緑色インプリントの範囲を定める。参考のために、左上のパネルでは、前景及び背景サブユニットのグリカン鎖は、それぞれ、赤色及び黒色で標示される。融合ループは、そのループが上中央のパネルにおいて標示される場合、抗ＥＤＥ抗体と接触して他の行において見られ得る。行ｃ～ｅの左パネルでは、赤色星は、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体との複合体において不規則である、１５０ループの位置に印を付ける。このループは、行ｂの左パネル（赤色に色付けられた炭素を有する棒として示されるグリカン）おいて見られるように、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体によって認識されるＮ１５３グリカンを担持する。対照的に、すべての抗ＥＤＥ抗体は、Ｎ６７グリカンを、最も多い接触を示すＣ８（行ｃの左パネル、炭素原子（黄色）を有する棒としてＮ６７グリカン）と接触させるように見られる。行ｃ中の青色星は、ドメインＩＩＩにおける不規則なループを示す。ＥＤＥ２ Ｃ１０（行ｄ及びｅ）は、他の抗ＥＤＥ抗体よりも深くｓＥ二量体に挿入することに留意されたい。 様々なＢＮＡ複合体における埋没表面面積 ＤＥＮＶ－２ ｓＥ複合体、エピトープ、及びパラトープの静電気の可能性。陰性及び陽性の可能性を有する複合体の見開き提示が示され、下にある棒に従って色付けされた。ある種の領域が複合体において不規則であるため、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｔｈｏｄｓの項において記載されるように作製されたＤＥＮＶ－２ ｓＥ二量体モデルを使用して、ｓＥ二量体の表面での静電気の可能性を計算した。接触して対応する領域は、同じ色付けされた楕円形によって示されている。 ＢＮＡ／抗原の相互作用に関連する残基。ａ）血清型全域において、それぞれ、同一性及び類似性を強調する黒色または薄青色背景において残基を有する、４種のＤＥＮＶ血清型からのｓＥのアミノ酸配列アライメント。二次構造要素が示され、アライメントの下に標示され、図１１中にあるように色別で示された三次構造を有する。様々な抗ＥＤＥ抗体によって接触されたＤＥＮＶ２ ｓＥ残基がアライメントの上に示され、これは要所において提供されたコード別に接触したＢＮＡ領域を示す。全シンボルは、参照サブユニット（融合ループをエピトープに寄与するものとして定義される）における接触に対応し、空のシンボルは、二量体界面全域において接触に対応する。配列上の色付けされた箱は、エピトープを作り上げるｓＥの５つの異なる領域を強調する。図２４は、各ＢＮＡとの複合体においてｓＥ残基毎の原子接触の数を有するヒストグラムを提供する。 ＥＤＥ２ Ｂ７及びＡ１１接触はとても類似しているため、Ｂ７接触のみをここでは示す。１５０ループ上の疑問符は、これらの残基がＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体に接触する可能性が高いが、このループが不規則であるため、構造において可視的ではないことを示す。 ４種の抗ＥＤＥ抗体のアライメントが結晶化され、Ｋａｂａｔ定義に従って番号付けされ３０、灰色及び白色背景において、それぞれ、ＦＲＷ及びＣＤＲ領域を有する。ＩＭＧＴ変換３１に対応するＣＤＲを、配列上に青色線で印を付け、標示する。体細胞の突然変異は、赤色であり、生殖細胞系において対応する残基は下により小さいフォントで書かれている。ＶＤＪ（またはＶＪ）組換えプロセスから生じる残基は、緑色である。接触されたｓＥ部分（図１５ａ中の色付けされた箱に対応する）は、各配列の上に示され、要所において支持されるようにコードされている。ＥＤＥ２ Ｃ８ Ｉｇ β－バーレルの二次構造要素は、参考のために、各配列の上に示される。各結晶化複合体におけるＢＮＡ残基毎の接触の数のヒストグラムを図２６に提供する。 ＤＥＮＶ－２ ｓＥとの様々なＢＮＡの相互作用の比較。ａ）同じ立体構造がｓＥ／Ｆａｂ断片複合体において保持されることを示すために、ＤＥＮＶ－２ ｓＥ（黄色、３．８Ａ解像度）との複合体におけるＦａｂすべての可変ドメインに重ね合わせられた非連結型ＥＤＥ２のすべてのｓｃＦｖ（赤色、非結合、１．７Ａ解像度）の構造。ｂ）対応するＦａｂ／ＤＥＮＶ－２ ｓＥ複合体の構造から抽出された１５０ループと一緒に、重ね合わせられたＢ７（緑色）及びＡ１１（黄色）の可変ドメインを示す立体図。１５０ループの主鎖は、主にＢ７のＣＤＲ Ｈ３におけるＹ９９側鎖のヒドロキシル基がｓＥ Ｔ１５５で水素結合するため、２つの複合体において異なる立体構造を採用することに留意されたい。すべてが、この位置でフェニルアラニンを有し、そのため、ヒドロキシル基を欠失している。Ａ１１との複合体においてｓＥタンパク質は、非連結型ｓＥ（示されず）と同じ立体構造を示す。ｃ）Ｂ７（ｓＥ配列の上）及びＡ１１（この配列の下）の原子接触のヒストグラム。ｄ）ｃ）と同様であるが、ｓＥタンパク質一次構造におけるＢＮＡ Ｃ１０（この配列の上）及びＣ８（下）によって作られる接触のパターンを示す。ｅ）ｃ）と同様であるが、Ｅタンパク質配列に従ってＣ１０（ＥＤＥ１）及びＢ７（ＥＤＥ２）を比較する。 ＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体及び抗ＨＩＶを広域中和抗体ＰＧ９におけるＨ３ループ。ＦａｂまたはｓｃＦｖ断片は、同様に配向され、灰色では軽鎖、緑色では重鎖を有し、赤色で強調されたＨ３ループを有する。比較のために、広い範囲までグリカン鎖を認識し、非常に長いＨ３ループ（ＩＭＧＴによって計算される３０ａａ）を有する、強力な抗ＨＩＶ－１ ＢＮＡ ＰＧ９５１のＦａｂ断片が、同じ方法で示される。 ｓＥ二量体界面でのＢＮＡ ＣＤＲの相互作用。ａ）右パネルは、リボンとしてｓＥ二量体を示し、左パネルには、エピトープが拡大され、主な特徴が標示される。行ｂ～ｄは、リボンが透けて見える半透明の表示でｓＥ表面を示す。グリカン残基は、棒として示された（これらは表面の計算には含まれなかった）。抗ＥＤＥ抗体の関連ＣＤＲループは、図１１にあるように色付けされた、ｓＥタンパク質の上部にある棒として側鎖を有するリボンとして示される。行ｂ～ｄにおける左パネルの配向は、行ａの左パネルに対応し、右パネルは、図１１ｂ中の矢印に従う図である。水素結合が、点線として示される。 グリカン鎖との相互作用。ａ）ＥＤＥ１ Ｃ８ ／ ＤＥＮＶ－２ ｓＥ複合体がリボンとして示され、選択された側鎖が棒として、ｓＥ表面が半透明の表示で示され、Ｎ６７グリカンとの相互作用を強調する。少数の水素結合が、点線として示される。１５０ループは不規則である（密度中断で標示される）。（ａ）及び（ｂ）の両方では、右パネルは、グリカン鎖に沿った、左パネルの矢印の先の図である。ｂ）ＥＤＥ１及びＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体が同様の方法で結合することを強調するために、（ａ）ではＣ８と同じ配向でＢ７で示されるＥＤＥ２ Ｂ７ ＢＮＡ／ＤＥＮＶ－２ ｓＥ複合体。ＥＤＥ２ Ｂ７は、融合ループのくぼみにその長いＣＤＲ Ｈ３を挿入し、一方、その側は、左パネルに見られるように、２つのグリカン鎖に接触する。Ｈ３ α－らせんは、Ｎ１５３グリカンに対して梱包する。図２１ｃ）中に列挙される、抗ＥＤＥ抗体とｓＥとの間に多数の水素結合も示される。テキストならびにパネル（ａ）及び（ｂ）において使用される糖接続性及び命名法への要所。ｄ）要所に従ってコードされる、抗体と糖残基の接触（図２４中と同様）。ｅ）Ｎ１５３グリカンを欠失しているデング熱変異体は、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体によってより容易に認識されているが、一方、それらは、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体による中和反応により耐性を示す。平均及びｓ．ｅ．ｍ．値は、３つの独立した実験から推定された。 グリカン鎖についての実験的電子密度。図１１にあるように色付けされた、ＤＥＮＶ２ ｓＥと複合体形成された、ａ）ＥＤＥ２すべてのＦａｂ及びｂ）ＥＤＥ２ Ｃ８ ＥＤＥ１ Ｆａｂのリボンの表示。１シグマ（青緑色）または０．６シグマ（金色）で輪郭された模擬アニーリングオミットマップは、Ｎ１５３（ａでは）及びＮ６７グリカン（ａ及びｂでは）（それぞれ、赤色及び黄色の矢印）に対する明らかな密度を示す。不偏マップを作製するために、すべてのグリカン原子は、構造から除去し、すべてのＢ因子を２０Ａ２に初期化し、構造を、ねじり動的学の模擬アニーリングを用いて再精密化した。抗体足跡が二量体界面全域で２つのグリカンを広げることに留意されたい（図１１中にも示される）。ｃ）ＤＥＮＶ－２／Ｂ７（左パネル）及びＤＥＮＶ－２／Ｃ８（右パネル）に対して、それぞれ、パネルａ）及びｂ）の赤色（左パネル）及び黄色（右パネル）の矢印の下に見られる複合体の拡大表示。重及び軽鎖は、表面として示され、グリカン（対応するアスパラギンと一緒に）は、各残基について平均Ｂ因子で標示される。また、グリカンは、青色（冷）から赤色（熱）にランプで色付けされる。３つの複合体においてグリカンについてオミットマップを示すために、（ｃ）では、（ａ）にあるようなＤＥＮＶ－２／Ａ１１の代わりにＤＥＮＶ－２／Ｂ７について電子密度を示したことに留意されたい。 抗体と抗原との間の極性相互作用。 デング熱血清型２及び４のｓＥ二量体におけるＣ１０ ＢＮＡインプリント。ａ）ビリオンの外から見られるＤＥＮＶ－２ ｓＥの表面の表示、曝露された主鎖原子橙色（上パネル）、または主鎖原子＋厳密に保存された側鎖（橙色）、及び高度に保存された側鎖（黄色）（下パネル）。ＥＤＥ１ ＢＮＡ Ｃ１０（黒色輪郭）及びＥＤＥ２ ＢＮＡ Ｂ７（緑色輪郭）のエピトープを示す。ｂ）図１１にあるようなドメインによって色コードされる、Ｃ１０との複合体から抽出された、ＤＥＮＶ－２（上パネル）及びＤＥＮＶ－４（下）のｓＥ二量体の表面。各症例におけるＣ１０足跡を示す。立体構造における非対称に留意されたい。二量体の右手側（両パネルにおける）にある大きな「穴」は不規則なｉｊループによるものであり、左（下パネル、ＤＥＮＶ－４ ｓＥ／Ｃ１０）にある小さな穴は不規則なｋｌループによるものである。 ＤＥＮＶ－２及びＤＥＮＶ－４ ｓＥとのＣ１０の相互作用の比較。 ａ）Ｃ１０と複合体形成されたＤＥＮＶ－２（赤色）及びＤＥＮＶ－４（緑色）のｓＥ二量体の構造は、Ｃ１０部分に重ね合わせられた。ｓＥ二量体の軸は、適宜に色付けされた中央に引かれている。明確にするために、重ね合わせが行われたＣ１０ ｓｃＦｖのみが、複合体毎に示される。抗体を重ね合わせる際に、ｓＥ二量体は局所的にのみ一致し、描かれているように、二量体軸の若干異なる配向をもたらす。ｓＥ二量体は、青色で引かれている軸（灰色／赤色の湾曲した矢印で標示される）周辺に互いに約６度回転し、重ね合わせが右（エピトープＢ）にあるｓｃＦｖで行われるよりも、左（エピトープＡに結合する）にあるｓｃＦｖで行われる場合に著しく異なる配向を有し、ｓＥ二量体に結合するＣ１０の非対称を強調する。ｂ）Ｃ１０接触は、ＤＥＮＶ－２（上）及びＤＥＮＶ－４ ｓＥ（下）のアラインメントに表示され、２つの複合体において非常に類似した接触のパターンがあることを示す。配列の背景は、主なテキストにおける図１５の背景に対応し、４種の血清型における保存を示す。 ｓＥ二量体に結合するＢＮＡの検出された非対称。この図は、パネル（ａ）～（ｅ）：ａ）ＥＤＥ１ Ｃ８／ＤＥＮＶ－２ ｓＥ、ｂ）ＥＤＥ１ Ｃｌ０／ＤＥＮＶ－２ ｓＥ、ｃ）ＥＤＥ２ Ａ１１／ＤＥＮＶ－２ ｓＥ、ｄ）ＥＤＥ２ Ｂ７／ＤＥＮＶ－２ ｓＥ、ｅ）ＥＤＥ１ Ｃｌ０／ＤＥＮＶ－４ ｓＥ中の、ここに分析された独立したすべての複合体の構造におけるｓＥ残基毎の接触の数のヒストグラムを提供する。 各パネルは、２つの部分に分割され、部分（Ｉ）は、エピトープを示すために、左（明確にするために、Ｆａｂ断片の接触ドメインは除去された）、及び完全に除去された抗体を有する右にあるｓＥ二量体の２倍軸の下に見られる免疫複合体を示す。この部分はまた、ＩＩ中で使用されたエピトープＡ及びＢも定義する。部分（ＩＩ）は、接触に関与する抗体領域をマッピングするために（括弧では、対応する接触に印を付けるために、図１５ａ中で使用された記号がある）、ヒストグラム棒は要所に示されるように色コードされた、二量体におけるＡ及びＢエピトープに対応する接触のヒストグラムを示す。接触パターンは同じ状態のままであるが、接触の数がｓＥ二量体の２つのエピトープにおいて同一ではないことを留意されたい。ＤＥＮＶ－２ ｓＥ／ＥＤＥ２ Ｃ１０の結晶が非対称単位で２つの複合体を有し（すなわち、２つのｓＥ二量体、それぞれ、２つのＣ１０ ｓｃＦｖを有し）、そのため、合計で、（ｂ）に記載される、Ａ～Ｄで標示された４つの独立したエピトープの図がある。 ＥＤＥ１ Ｃ１０残基Ｙ１００（ＣＤＲ Ｈ３）は、成熟デング熱ビリオンにおいてＦ２７９と相互作用する可能性が高い。 ａ）成熟ＤＥＮＶ－２粒子を含む９０Ｅ／Ｍヘテロ四量体のうちの１つは、３．５Å低温ＥＭ再構成から抽出され９、灰色及び黄色で２つのＥサブユニット、ならびに赤色及びサーモン色で２つのＭサブユニットを有する側面図（「２」と標示された白色棒として引かれる、２倍軸垂直）で表示される。２つの黒色矢印は、αらせん形の膜相互作用領域（水平の「幹」αらせん及び垂直なＴＭ αらせん）を有する、Ｅ外部ドメイン（ｓＥに対応する）間の接続を示す。ＭのＮ末端部分は、Ｅ二量体の下で相互作用するように見られる（ピンク色矢印）。ｂ）（ｃ）で拡大された領域が囲まれた、２倍軸の下の方の図。ｃ）この図は、ビリオンＥに重ね合わされたＣ１０複合体の両方（ＤＥＮＶ－２及び－４ ｓＥ）の構造を有する（ｂ）中の図に関して、明確にするために若干傾斜している。これらの標示は、対応する構造の色（ＤＥＮＶ－２ ｓＥ／Ｃ１０ 緑色／からし色、ＤＥＮＶ－４ ｓＥ／Ｃ１０ 青色／ベージュ色の色、ならびにパネル（ａ）及び（ｂ）にあるようなビリオンＥに一致している。Ｍタンパク質を、サーモン色の表面として示す（白色で標示される）。Ｍタンパク質は、Ｅ二量体の下にあり、二量体界面全域において、ｋｌヘアピン（矢印間に含まれ、標示された））、また、ｉｊヘアピンの基部を強調し、ｋｌヘアピンの異なる立体構造を誘発し、そのため、Ｆ２７９（標示された）はＥプロトマーの疎水性コア（濃灰色棒）から離れて指し示すが、一方、ｓＥタンパク質構造（非連結型ｓＥを含む、示さず）では、それは疎水性コア（緑色及び青色棒、標示された）の一部である。Ｃ１０のＣＤＲ Ｈ３におけるＹ１００（標示された）の側鎖は、ｓＥにおいてそのパートナーを見出さないため、代替の立体構造を有する（Ｙ１００はまた、図１８ｄ、左パネルにおいても例示される）。ＣＤＲ Ｈ３ループは、Ｙ１００がビリオンに観察された立体構造において、Ｆ２７９（血清型全域において保存されている、図１５ａを参照のこと）との積み重ね相互作用を行い得るのに十分な柔軟性がある。 抗体残基における接触のヒストグラム。この図は、図２４に反映し、この時、抗体側での接触を示す。（ａ）Ｃ８、ｂ）Ｃ１０（ＤＥＮＶ－２ ｓＥとの複合体から）ｃ）すべて、ｄ）Ｂ７、ｅ）Ｃ１０（ＤＥＮＶ－４ ｓＥとの複合体から）。各パネルでは、パートＩは、体細胞突然変異を赤色で、組み合わせから生じる接合残基を緑色で、灰色（ＶＨ濃灰色、ＶＬ薄灰色）で色付けされた、対応する複合体から抽出されたＢＮＡ可変ドメインを示す。接触に関与する側鎖は、球及び棒で表し、標示される。パートＩＩは、接触するｓＥの領域を示すために（括弧では、対応する接触に印を付けるために、図１５ｂ中で使用された記号がある）、要所に従って色コードされた、残基毎の原子接触の数のヒストグラムを示す。配列番号付け及び背景は、Ｋａｂａｔ変換（図１５ｂにあるような）に対応する。ＩＭＧＴ変換に対応するＣＤＲを、配列上に橙色の点線で表示する。体細胞突然変異は赤色で、ＶＤＪ（またはＶＩ）組み合わせから生じる残基は、緑色である。 他のウイルスを標的にする強力な抗ＥＤＥ抗体の結合特性との比較。 血清型１～４からのデング熱エンベロープタンパク質の配列 実施例１中に特定されるＥＤＥ１及びＥＤＥ２型抗体の配列。 中和試験を行う方法。 結晶構造由来のエンベロープタンパク質における接触残基。 共有結合的な架橋ＤＶ２ Ｅ二量体 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ａ２５９ＣへのＥＤＥ１の結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ａ２５９ＣへのＥＤＥ２の結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ａ２５９ＣへのＦＬＥの結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ａ２５９Ｃへの非ＦＬＥの結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ｌ１０７Ｃ、Ａ３１３ＣへのＥＤＥ１の結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ｌ１０７Ｃ、Ａ３１３ＣへのＥＤＥ２の結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ｌ１０７Ｃ、Ａ３１３ＣへのＦＬＥの結合 ｒＥ ＤＥＮＶ２ ＷＴ対ＭＴ Ｌ１０７Ｃ、Ａ３１３Ｃへの非ＦＬＥの結合 Ｃ６／３６ ＤＥＮＶ２における抗体力価 群１ 単量体／単量体 Ｅ ＷＴを用いたプライム及びブーストＥ ＷＴ 群２ 二量体／二量体 Ｅ Ａ２５９Ｃ 突然変異体を用いたプライム及びブースト 群３ ＶＬＰ／ＶＬＰ ｐｒＭ／Ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いたプライム及びブースト 群４ 二量体／ＶＬＰ Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたプライム、続いて、ＶＬＰを用いたブースト 群５ ＶＬＰ／二量体 ＶＬＰを用いたプライム、続いて、Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたブースト 群６ 偽物 非予防接種 交差反応：生ウイルス（プールした血清）への結合 群１ 単量体／単量体 Ｅ ＷＴを用いたプライム及びブーストＥ ＷＴ 群２ 二量体／二量体 Ｅ Ａ２５９Ｃ 突然変異体を用いたプライム及びブースト 群３ ＶＬＰ／ＶＬＰ ｐｒＭ／Ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いたプライム及びブースト 群４ 二量体／ＶＬＰ Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたプライム、続いて、ＶＬＰを用いたブースト 群５ ＶＬＰ／二量体 ＶＬＰを用いたプライム、続いて、Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたブースト 群６ 偽物 非予防接種 マウス血清：Ｃ６／３６ ＤＥＮＶ２の中和反応 群１ 単量体／単量体 Ｅ ＷＴを用いたプライム及びブースト 群２ 二量体／二量体 Ｅ Ａ２５９Ｃ 突然変異体を用いたプライム及びブースト 群３ ＶＬＰ／ＶＬＰ ｐｒＭ／Ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いたプライム及びブースト 群４ 二量体／ＶＬＰ Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたプライム、続いて、ＶＬＰを用いたブースト 群５ ＶＬＰ／二量体 ＶＬＰを用いたプライム、続いて、Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたブースト 群６ 偽物 非予防接種 マウス血清：ＤＣ ＤＥＮＶ２の中和反応 群１ 単量体／単量体 Ｅ ＷＴを用いたプライム及びブーストＥ ＷＴ 群２ 単量体／単量体 Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体（二量体／二量体）を用いたプライム及びブースト 群３ ＶＬＰ／ＶＬＰ ｐｒＭ／Ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いたプライム及びブースト 群４ 二量体／ＶＬＰ Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたプライム、続いて、ＶＬＰを用いたブースト 群５ ＶＬＰ／二量体 ＶＬＰを用いたプライム、続いて、Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたブースト 群６ 偽物 非予防接種 ＡＤＥ：プールしたマウス血清：Ｕ９３７ 群１ 単量体／単量体 Ｅ ＷＴを用いたプライム及びブーストＥ ＷＴ 群２ 単量体／単量体 Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体（二量体／二量体）を用いたプライム及びブースト 群３ ＶＬＰ／ＶＬＰ ｐｒＭ／Ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いたプライム及びブースト 群４ 二量体／ＶＬＰ Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたプライム、続いて、ＶＬＰを用いたブースト 群５ ＶＬＰ／二量体 ＶＬＰを用いたプライム、続いて、Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたブースト 群６ 偽物 非予防接種実施例実施例１－ヒトＤＥＮＶ抗体は、ウエスタンブロットにおいて、デング熱エンベロープタンパク質に結合するそれらの能力に基づいて２つの異なる群を形成する。
７人の患者からの試料（表１）を使用して、ＤＥＮＶエンベロープタンパク質に反応する１４５のヒトモノクローナル抗体を産生した３２、３３。形質芽球（ＣＤ３－、ＣＤ２０ｌｏ／－、ＣＤ１９＋、ＣＤ２７ｈｉ、ＣＤ３８ｈｉ）は、末梢血から分類され、Ｅｌｉｓｐｏｔは、抗ＤＥＮＶ抗体に分泌されたこれらの細胞の５０９０％を示し、これはその他で報告される頻度と一致した３４、３５。これらの抗体のうちの８４％は、４種すべてのＤＥＮＶ血清型に対して反応し、１３％は２または３種の血清型に対して反応し、わずか３％が単一の血清型に対して反応した（図１ａ）。
Figure 0007433744000002
 表１．この研究に登録されたＤＥＮＶに感染した患者の概略
初期抗体スクリーニングは、抗体の完全に代表的なパネルを得たことを確認するために、組換えタンパク質または固定細胞よりもむしろ、捕捉された全ビリオンを用いたＥＬＩＳＡによって行われた。抗体のうちのわずか５７％が、ウエスタンブロットによってＤＥＮＶエンベロープに対して反応し（図１ａ）、ＷＢ陰性ｍＡｂはまた、ＥＬＩＳＡによって組換えＥに対して反応することができなかった。これは、ＷＢ反応性及び無傷ビリオンに存在するエピトープのみを認識するものである２つの広範な群に抗体をグループ化させ、ここより、ビリオン依存性エピトープまたはエンベロープ二量体エピトープ（ＶＤＥもしくはＥＤＥ）への反応性としてこれらの抗体を指す。ＷＢ陽性抗体の大部分は、４種のウイルス血清型の間で完全に交差反応性があり、一方、ＥＤＥＥＤＥ ｍＡｂについては、６２のうちの４１が完全に交差反応性があり、さらに、６２のうちの１７がＤＥＮＶ－１、２、及び３に対して反応する（図１ｂ）。各群からの３つの抗体については、Ｃ６／３６昆虫細胞において産生されたウイルスにおける中和アッセイを図２中に示す。融合ループ及びＥＤＥＥＤＥ抗体は、４種すべてのウイルス血清型に対して広く中和した。ＥＤＥ２ ７４７（４）Ａ１１及び７４７（４）Ｂ７については、Ｄｅｎ４に対してより低い活性があり、このことは、Ｄｅｎ４株Ｈ２４１における位置Ｎ１５３でＮ結合型グリカンの欠失に関連する。
この実施例及びその他の実施例に関連する方法
試料。血液試料は、書面によるインフォームド・コンセントに従って入院患者から回収された。研究プロトコルは、英国では、熱帯病病院の科学的倫理委員会、Ｏｘｆｏｒｄ熱帯研究倫理委員会、及びＲｉｖｅｒｓｉｄｅ倫理委員会によって承認された。デング熱感染の実験室での確認は、ＤＥＮＶ核酸（感染する血清型も確認した）のＲＴ－ＰＣＲ検出、ＮＳ１抗原側方流動試験、またはＩｇＭ ＥＬＩＳＡ試験におけるセロコンバージョンによって決定された。疾患重症度は、１９９７年の世界保健機関の基準に従って分類された。この研究に登録された患者のうち、２人の患者が軽度の症状のデング熱（ＤＦ）として分類され、５人の患者が血漿漏出及びデング出血熱（ＤＨＦ）の出血を有する重度の症状として分類された（表１）。二次感染は、１．８未満のデング熱特異的ＩｇＭのＩｇＧに対する比に基づいて定義された７。Ｂ細胞選別のための血液試料は、血液形質芽球集団が明白であった時点の入院期間中に回収された。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって全血から単離し、直接の使用のために、１０％ ＦＣＳ／ＲＰＭＩ中に再懸濁した。
細胞及び抗体。蚊アエデスアルボピクタス由来のＣ６／３６細胞株を、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５中で２８℃で培養した。ベロ、Ｕ９３７、及び２９３Ｔまたはフリンでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、それぞれ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、及びＤＭＥＭ中で、３７℃で成長させた。すべての培地に、１０％加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充された。フリン欠失ＬｏＶｏ細胞株を、ＡＴＣＣから購入し、推奨されるように、Ｆ－１２中で維持した。単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を、上述のように調製した１０。
ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７、及びＣＤ３８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ヒトＩｇＧ－ＡＬＰ（Ｓｉｇｍａ）、及び抗ヒトもしくはマウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）に対する抗体をこれらの実験において使用した。抗ＤＥＮＶエンベロープ、４Ｇ２、及び抗ＤＥＮＶ ｐｒＭ、１Ｈ１０、マウスモノクローナルＡｂは、Ｄｒ Ｃ．Ｐｕｔｔｉｋｈｕｎｔ及びＤｒ Ｗ．Ｋａｓｉｎｒｅｒｋ（Ｐｕｔｔｉｋｈｕｎｔ，２００３）からの贈呈物であった。抗ＤＥＮＶ ＮＳ３、Ｅ１Ｄ８は、Ｅｖａ Ｈａｒｒｉｓ博士からの贈呈物であった。
ウイルス資源。デング熱ウイルス血清型１（Ｈａｗａｉｉ）、血清型２（１６６８１）、血清型３（Ｈ８７）、及び血清型４（Ｈ２４１）を、Ｃ６／３６細胞中で成長させた。さらに、ＤＥＮＶ２を、ＤＣ、ＬｏＶｏ、２９３Ｔ、及びフリンでトランスフェクトされた２９３Ｔ中で繁殖させ、無細胞の上清を回収し、－８０℃で保存した。ウイルス力価は、ベロ細胞におけるフォーカス形成によって決定され、１ｍｌ当たりのフォーカス形成単位（ＦＦＵ）として表された２６
ＤＥＮＶ特異的ヒトモノクローナルＡｂｓの作製。ＤＥＮＶ特異的ヒトｍＡｂｓは、活性化したＢ細胞／形質芽球から作製された３２、３３。簡潔に言えば、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７、及びＣＤ３８で染色した。次いで、活性化した抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を、ＣＤ１９＋、ＣＤ３－、ＣＤ２０低／－、ＣＤ２７高、ＣＤ３８高としてゲート化した。単一のＡＳＣを、ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェル中に分類した。プレートを短時間遠心分離を行い、－８０℃で保存する前にドライアイス上で凍結させた。次いで、ＲＴ－ＰＣＲ及び入れ子ＰＣＲを、ＩｇＧに特異的なプライマーのカクテルを用いてガンマ、ラムダ、及びカッパ遺伝子を増幅させるように行った。次いで、重鎖及び軽鎖のＰＣＲ産物は、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させ、ＩｇＧ１、Ｉｇκ、またはＩｇλ発現ベクターにクローン化し、Ｈｅｄｄａ Ｗａｒｄｅｍａｎｎ博士からの贈呈物であった。抗体を発現するために、重鎖及び軽鎖プラスミドは、ポリエチレンイミン法によって２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、抗体上清をさらなる特徴付けのために収穫した。
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。Ｅｌｉｓｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、抗ヒトＩｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または紫外線で不活性化したＤＥＮＶ１～４のいずれかでコーティングした。プレートをＲＰＭＩで洗浄し、１％ ＢＳＡ／ＲＰＭＩで１時間遮断した。選別されたＡＳＣを、５００個の細胞で抗Ｉｇ及びＤＥＮＶでコーティングしたウェルに添加し、３７℃で５％ ＣＯ２中で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化した抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）で室温で２時間インキュベートし、続いて、ストレプトアビジン－ＡＬＰ（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。反応物を開発し、スポットをＡＩＤ Ｅｌｉｓｐｏｔプレートリーダーを用いて計数した。
ＥＬＩＳＡによるＤＥＮＶ－特異度及び血清型の交差反応性の検出。ＤＥＮＶ１～４及び偽物の非感染上清を、抗Ｅ Ａｂｓ（４Ｇ２）でコーティングされたＭＡＸＩＳＯＲＰ免疫プレート（ＮＵＮＣ）上に別々に捕捉した。次いで、ＤＥＮＶ捕捉ウェルを、１ｕｇ／ｍｌのヒトｍＡｂでインキュベートし、続いて、ＡＬＰ共役抗ヒトＩｇＧでインキュベートした。この反応を、ＰＮＰＰ基質の添加によって可視化し、ＮａＯＨで停止した。吸光度は、４０５ｎｍで測定した。
組換え可溶性ＤＥＮＶエンベロープタンパク質ＥＬＩＳＡ。プレートを、１５０ｎｇの組換え可溶性Ｅで直接コーティングし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照抗原として使用した。次いで、タンパク質でコーティングされたウェルを、１ｕｇ／ｍｌのヒトモノクローナルＡｂｓでインキュベートし、続いて、ＡＬＰ共役抗ヒトＩｇＧでインキュベートした。ＰＮＰＰ基質を最後に添加し、この反応は、４０５ｎＭで測定した。
ウエスタンブロット分析。ウエスタンブロット分析のために、Ｃ６／３６細胞からのＤＥＮＶ上清を、非加熱及び非還元条件下で調製し、１２％ ＳＤＳポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｒａｍｉｄｅ）ゲルで泳動し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に電気泳動した。次いで、膜を、５％ スキムミルクで遮断し、ＤＥＮＶ特異的ヒトｍＡｂｓでプローブ化し、続いて、ＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧ Ａｂｓでプローブ化し、膜を増強した化学発光基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で成長させた。
実施例２－突然変異分析は、ＥＤＥ抗体及びＷＢ反応性抗体が異なるエピトープに結合することを示す。
ｍＡｂｓによって認識されるエピトープのより洞察力を得るために、ビリオン表面上にあると予測される溶媒曝露された溶媒曝露された残基でアラニン置換を含有する６５個のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製した。これらは、成熟ウイルス粒子の３Ｄ構造から得られた４、７、８。これらの突然変異体ＶＬＰは、ＥＬＩＳＡによって１４５個のモノクローナル抗体に対してスクリーニングされた２２、３６。抗体結合の８０％超の低減をもたらした突然変異は、有意であると見なされた。このパネルを用いて、１４５個のうちの１１２個のｍＡｂを、エンベロープタンパク質におけるエピトープに割り当てた。３３個の抗体は、これらのすべてがＷＢによってＥに反応し、突然変異体ＶＬＰパネルを用いてマッピングされないままであった。エピトープマッピングの結果を図１ｃ中に示し、さらに詳細には図６中に示す。これらのエピトープは、２つの群に広くクラスタ化され得る：
群１：融合ループ、上述のまたは古典的な融合ループエピトープ（ＦＬ）を定義する１０１Ｗの内外の制限的な残基セット。ＷＢにおいてエンベロープに結合する、８３個のうちの４６個の抗体は、位置１０１Ｗで突然変異に対して感受性があり、多くの抗ＤＥＮＶ ｍＡｂの結合に対して主要な残基であることがこれまでに示されている３７、３８。ＦＬ特異的ｍＡｂのうち、４６個のうちの４０個は、Ｗ１０１突然変異のみに対して感受性があるが、一方、その他のエピトープは、残基Ｗ１０１、Ｇ１０６、及びＬ１０７の組み合わせを含有した。ウエストナイルウイルスからのエンベロープタンパク質に結合するＦＬ ｍＡｂ Ｅ５３の結晶構造は、ｂｃループにおいて、残基１０４～１１０との接触を示すが、１０１Ｗとの接触を示さず、残基７４～７９との接触を示す３９。１Ｃ１９ ｍＡｂと同様に、ＦＬ特異的ｍＡｂのうちの２つのみが、アミノ酸７６～７９をアラニンに変化した場合に、結合が欠失したｂｃ－ｌｏｏｐループにおける変化に対して感受性があった４０。
群２：ＥＤＥ抗体；これらは、ＶＬＰ突然変異体への反応性のパターンに基づいて、５つの異なる亜群に細分類され得る（図１ｃ及び図６）。ＥＤＥ抗体の大部分は、融合ループ残基１０１の変化に対して感受性があったが、エピトープがさらにより広範であり、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩにおいてさらなる決定基を有する場合に、上述の古典的な「融合ループ」特異的抗体と混同するべきではない。ＥＤＥ抗体の大部分は、ＥＤＥ２において残基１５３及び１５５での変化に対する感受性によって分化される、２つの異なる亜群であるＥＤＥ１及びＥＤＥ２の間で分割され得、これは、Ｎ結合型グリコシル化部位を妨害するであろう。１２個の抗体は、異なるエピトープ及び機能を有する３つのさらなる亜群を構成し、ＥＤＥ３ ｍＡｂは、ＥＤＥ１ ｍＡｂと同様であったが、１０７Ｌ及び２９５Ｋでの変化に対しても感受性があった。ＥＤＥ４は、１０１Ｗでの変化に対して感受性がなく、酸性化したウイルス粒子に最良に反応した（図４ｂ）。最後に、ＥＤＥ５ ｍＡｂは、一群の５ ｍＡｂを構成し、これらは融合ループ１０１Ｗのみに結合するが、このエピトープは、無傷ビリオンにおいてのみ反復し、ＥＤＥ３、４、及び５はすべて、不完全に中和する抗体である 図３ａ及びｂ。
ＶＬＰ変異誘発実験は、ＥＤＥが１つを超えるエンベローププロトマーを含む複合四級エピトープであることを示唆している。
方法
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）突然変異体を用いた抗体エピトープマッピング。ＤＥＮＶ１の完全長ｐｒＭ／Ｅを、ＶＬＰ（Ａｌｅｋｓａｎｄｒａ Ｆｌａｎａｇａｎ博士によって構成された）を作製するために、発現ベクターｐＨＬｓｅｃにクローン化した５５。ＶＬＰ突然変異を、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発法によって生成した６２。変異原性ＰＣＲは、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｅタンパク質における選択したアミノ酸残基をアラニンと置換するために行われ、すでにアラニンである場合、突然変異はグリシンになされた。ＤｐｎＩ（ＮＥＢ）処置後、ＰＣＲ産物を大腸菌に形質転換した。すべての突然変異は、配列決定によって確認された。プラスミドは、ポリエチレンイミン法によって２９３Ｔ細胞株にトランスフェクションし、培養上清をエピトープマッピングのために収穫した。
エピトープ特異的Ａｂを特定するために、ＷＴ及び突然変異体ＶＬＰをマウス抗ｐｒＭ（１Ｈ１０）で捕捉した。次いで、ＤＥＮＶ特異的抗Ｅ Ａｂを１～５ｕｇ／ｍｌで添加し、続いて、抗ヒトＩｇＧ－ＡＬＰを添加した。最後に、ＰＮＰＰ基質を添加し、反応をＮａＯＨで停止し、吸光度を４０５ｎｍで測定した。相対的認識指数を、［突然変異体ＶＬＰの吸光度／ＷＴ ＶＬＰの吸光度］（試験ｍＡｂによって認識される）／［突然変異体 ＶＬＰの吸光度／ＷＴ ＶＬＰの吸光度］（一連の４種混合ｍＡｂによって認識される）として計算した。
実施例３－ＷＢ反応性抗体は、ＥＤＥ抗体とは異なり、ヒト樹状細胞で作製されたウイルスを完全に中和することができない。
ＤＥＮＶ感染中、宿主は、２つの形態のウイルスで存在し、初期曝露は、昆虫細胞において産生したウイルスによるものであり、一方、ヒト細胞において産生したウイルスは、その後の感染周期を促し、感染中に引き起こされる莫大な量のウイルスを示す。これらの２つの異なるウイルス形態を見るために、蚊に刺されたあとから皮膚へのウイルスの注入後に感染し、感染したヒト宿主におけるウイルス複製の部位であると考えられる、Ｃ６／３６昆虫細胞（Ｃ６／３６－ＤＥＮＶ）または単球由来の樹状細胞（ＤＣ－ＤＥＮＶ）において産生したＤＥＮＶ－２ウイルスを比較した２０。
８３個のＷＢ陽性ｍＡｂのうち、４６個がＦＬにマッピングされ、３７個がまだマッピングされていない結合部位であることが認識された。驚くべきことには、８３個すべてのＷＢ陽性抗体が、高濃度であっても、ＤＣ－ＤＥＮＶを完全に中和することができず、１個のみが、５ｕｇ／ｍｌで８０％超まで中和した（図３ａ及びｂ）。一方、ＥＤＥ１及び２抗体の大部分は、ＤＣ－ＤＥＮＶを８０％超まで中和することができ、多くが１００％中和に達した。代表的なｍＡｂについての完全結合及び中和曲線（図３ｃ）は、抗ＦＬ ｍＡｂがＥＬＩＳＡによるＤＣ－ＤＥＮＶ（青色×印）への結合を低減したことを示し、ＤＣウイルス感染（青色丸印）を完全に中和することができず、一方、ＥＤＥ ｍＡｂにおける中和反応及び結合曲線は、より密接にＣ６／３６及びＤＣ－ＤＥＮＶとは反対である。
方法
中和及び増強アッセイ。ｍＡｂの中和の可能性は、感染した病巣の数の低減が対照（抗体なし）と比較する場合に、フォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）を用いて判定した２２。簡潔に言えば、連続希釈したＡｂをウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物をベロ細胞に移し、３日間インキュベートした。次いで、フォーカス形成アッセイは、抗Ｅ ｍＡｂ（４Ｇ２）を用いて行い、続いて、ＨＲＰ共役されたウサギ抗マウスＩｇＧを用いて行った。この反応は、ＤＡＢ基質の添加によって可視化した。フォーカス低減の割合は、各抗体希釈について計算された。５０％のＦＲＮＴ値は、ＳＰＳＳパッケージからのプロビットプログラムを用いて、低減率対Ａｂの濃度のグラフから決定された。
実施例４－抗ＥＤＥ抗体は、高比率のｐｒＭで、またはエンベロープタンパク質が三量体立体構造を採用した場合にウイルスと結合することができない。
これらの異なるウイルス形態を提示するために、６つのＤＥＮＶ－２の調製物と結合する抗体を比較した。ｐｒＭ切断の度合いを評価するために、ＥＬＩＳＡによってｐｒＭ：Ｅの比率を測定し、これを、フリン活性を欠き、ほぼ完全に非完成成熟ウイルス粒子を完全な成分のｐｒＭで産生するＬｏＶｏ細胞において産生したＤＥＮＶに正規化した１７（図４ａ）。ウイルス調製物は、１）５６％の比較的高いｐｒＭ含量を有するＣ６／３６－ＤＥＮＶ、２）１３％のｐｒＭ含量を有するＤＣ－ＤＥＮＶ、３）１００％に近いｐｒＭ含量を有するフリン欠失ＬｏＶｏ細胞（ＬｏＶｏ－ＤＥＮＶ）において産生したウイルス２２、４）５％のｐｒＭ含量を有するフリン（フリン－２９３Ｔ－ＤＥＮＶ）を過剰発現する２９３Ｔ細胞において産生したウイルス、５）６０％のｐｒＭを有する天然２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－ＤＥＮＶ）において産生したウイルス、及び６）Ｅ三量体立体構造を不可逆的に採用するｐＨ５．５でインキュベートされたウイルス（酸性ＤＥＮＶ）であった４２。
ＥＤＥ１及び２ ｍＡｂは、恐らく、三量化が立体構造エピトープを妨害するため、酸性ＤＥＮＶと結合することができなかったか、または恐らく、ｐｒＭの完全相補体がｐｒＭ／Ｅスパイクを支持するため、ＬｏＶｏ－ＤＥＮＶと結合することができず、これらは、成熟エンベロープ二量体エピトープを再度妨害し得るか、またはＥＤＥへの接近を立体的に妨げ得る（図４ｂ）。抗ＦＬ ｍＡｂは、低ｐｒＭ含量のウイルスへの低減した結合を示し、ＤＣ－ＤＥＮＶ及び２９３Ｔ－フリン－ＤＥＮＶに対する結合曲線を、ＤＥＮＶを産生したＣ６／３６の右側に１．５～２ログシフトした。さらに、ＬｏＶｏ－ＤＥＮＶへの結合は、Ｃ６／３６ＤＥＮＶよりもさらになお効率的であり、融合ループ抗体の曝露及び有効な結合におけるｐｒＭの重要性を強調した３９、４３。３人の別々の個体から単離した４種のＥＤＥ４抗体は、酸処理したウイルスに対して最も有効に結合したが、これらは無視することができる中和反応を示した（図４ｂ）。
方法
ＤＥＮＶ結合ＥＬＩＳＡ。異なる細胞型から生成したＤＥＮＶへのＡｂの結合親和性を決定するために、偽物、Ｃ６／３６、ＤＣ、２９３Ｔ、フリンでトランスフェクトされた２９３ＴもしくはＬｏＶｏ細胞から産生したＤＥＮＶ２、及び酸処理したＣ６／３６ ＤＥＮＶ２を、４Ｇ２でコーティングされたプレートに捕捉し、次いで、連続希釈のＤＥＮＶ特異的ヒトモノクローナルＡｂでインキュベートし、続いて、ＡＬＰ共役抗ヒトＩｇＧでインキュベートした。この反応を、ＰＮＰＰ基質の添加によって引き起こし、ＮａＯＨで停止した。吸光度は、４０５ｎｍで測定した。異なるウイルス形態の抗原負荷及び実験の間のＯＤ読み出しの日間の変動は、ドメインＩＩＩのＤＥＮＶ２に特異的であるヒト化バージョンの十分に説明された３Ｈ５ ｍＡｂを用いて対照ＥＬＩＳＡによって正規化された。
実施例５－特定の患者内の抗体は、免疫優勢を示す
本明細書に記載される抗ＤＥＮＶ ｍＡｂは、ＥＤＥがＦＬ抗体のより制限されたエピトープで重複する場合に、重複特異性のある複合体アンサンブルである。個々の患者内のこれらの抗体群（ＦＬ対ＥＤＥ）を比較した場合に、ＦＬエピトープまたはＥＤＥエピトープのいずれかの選択への選好を示す非対称のレパートリー（ｓｋｅｗｅｄ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ）を見出した（図５ａ）。個体内の認識のこの免疫優勢は、驚くべきことであった。エピトープが重複する場合に、最も結合力のある抗体が、他の抗体を競合除去し、親和性成熟し得ることが可能であり、それ故に、ＦＬとＥＤＥとの間に確率的選択をもたらす反応に優勢である。しかしながら、ＥＤＥまたはＦＬへの反応は、個体内でポリクローナル（異なるＶＤＪの組換え）であり、このことは、説明としてはあまり可能性が高くない。
実施例６－抗ＥＤＥ抗体は、低減したレベルの感染の抗体依存性増強をもたらす
Ｕ９３７細胞を発現するＦｃ受容体におけるＤＥＮＶ感染を増強する抗体の能力を試験した。試験したすべての抗体は、ＡＤＥを引き起こしたが、ＦＬ群と比較した場合に、ＥＤＥ群において約４～８倍低く、ＦＬ群対ＥＤＥ群における平均ピーク増強は、Ｃ６／３６－ＤＥＮＶにおいて３７４５：５４５であり、ＤＣ－ＤＥＮＶにおいて２０７０：４８０であった（図５ｂ）。
方法
ＡＤＥアッセイについては、連続的に希釈されたＡｂを、３７℃で１時間ウイルスで予めインキュベートし、Ｕ９３７細胞（Ｆｃ受容体を担持するヒト単球細胞株）に移し、４日間インキュベートした。上清を収穫し、フォーカス形成アッセイによってベロ細胞に滴定した。ウイルス力価は、１ｍｌ当たりのフォーカス形成単位（ＦＦＵ）として表し、増強倍率は、抗体の不在下でウイルス力価と比較することによって計算された。
実施例７－抗ＥＤＥ抗体は組換えｓＥ二量体に結合する
構造研究のために、Ａ１１、Ｂ７、Ｃ８、及びＣ１０と称されるここから、特定された４種の最も強力な抗ＥＤＥ抗体：７４７（４）Ａ１１及び７４７ Ｂ７（ＥＤＥ２）及び７５２－２ Ｃ８及び７５３（３）Ｃ１０（ＥＤＥ１）を選択した。ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体の両方を、同じ患者（ＤＥＮＶ－２による二次感染があった）から単離し、ＩＧＨＶ３－７４及びＩＧＬＶ２－２３生殖細胞系由来の体細胞変異の同じＩｇＧクローンである。重鎖は、非常に長い（２６アミノ酸）相補性決定領域３（ＣＤＲ Ｈ３）を有する。ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体を、異なる患者から単離し、対応する生殖細胞系は、ＶＨ及びＶＬ遺伝子ＩＧＨＶ３－６４及びＩＧＫＶ３－１１（ＥＤＥ１ Ｃ８、この患者は、不確定の血清型の一次感染を有した）及びＩＧＨＶ１－３＊及びＩＧＬＶ２－１４（ＥＤＥ１ Ｃ１０、二次ＤＥＮＶ－１感染を有する患者から）に由来する。これらの抗体における遺伝子の分析を、図７中に要約する。
組換えｓＥタンパク質（エンベロープタンパク質の外部ドメインの４００アミノ末端残基、「可溶性Ｅ」については「ｓＥ」と称される）及び抗原結合部分（Ｆａｂ）、ならびに側鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）の抗ＥＤＥ抗体を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞において産生した４４、４５。抗ＥＤＥ抗体が標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて組換えｓＥタンパク質と反応しなかったため、二量体形成を好むように、高濃度で溶液中の精製した組換えＤＥＮＶ ｓＥとの抗体断片の相互作用を試験した。多角度光散乱（ＭＡＬＳ）実験と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、組換えＤＥＮＶ－１、－２、－３、及び－４ ｓＥの二量体／単量体平衡が、図８ａ中に示されるように、様々な種の分離時のサイズ排除を誘発した解離効果にもかかわらず、ほとんどの場合、２つの抗体断片でｓＥ二量体に対応する複合体として溶出する抗体断片によって二量体にシフトしたことを示した。このことは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によってさらに確認した（図８ｂ）。
実施例８－結晶構造
交差反応性の決定基を確認するために、４つの選択された抗ＥＤＥ抗体の断片と複合体形成されたＤＥＮＶ－２ ｓＥ二量体、及びＥＤＥ１ Ｃ１０と複合体形成されたＤＥＮＶ－４ ｓＥを含む、合計７つの結晶構造において決定した。使用したＤＥＮＶ－２ ｓＥ二量体が構造がすでに利用可能であるものとは異なる株に属するため、抗体によって誘発される立体構造の可能な変化を検出するために、非連結型ｓＥ二量体を結晶化した。さらに、非連結型Ａ１１ ｓｃＦｖの長いＣＤＲ Ｈ３が抗原の不在下で同じ立体構造を維持したかどうか明らかでなかったため、非連結型Ａ１１ ｓｃＦｖの構造を決定した。結晶化手順を、実施例１５に記載し、結晶学的統計を図９中に列挙する。
ＤＥＮＶ－２ ｓＥ株ＦＧＡ０２、遺伝子型ＩＩＩ
血清型２のアジア／アメリカ遺伝子型ＩＩＩ１１に属する、ＤＥＮＶ－２野外株ＦＧＡ０２（仏領ギアナにおいて２００２年に単離された）からの組換えｓＥを用いて、構造研究の大部分を行った。ＦＧＡ０２ ｓＥは、外部ドメインの３９４残基（３％）にわたって散乱した、予め結晶化したＤＥＮＶ－２ ｓＥ５、７と比較して、１３アミノ酸差異を示す。予想通りに、３Å分解能構造のＦＧＡ０２ ｓＥは、ＰＤＢ（受入番号１ＯＡＮ、１ＯＫＥ、１ＴＧ８）に沈着する様々な構造において観察された立体構造の範囲内に収まる、そのプレ融合型におけるＤＥＮＶ－２ ｓＥの既に利用可能な構造を有する小さな差異のみを示す（図１０）。非連結型ＦＧＡ０２ ｓＥの構造が、この株のＥタンパク質の特異的なアミノ酸配列によるものではないことを示すことによって、抗体結合が疾患を誘発する領域、具体的には、１５０ループ（以下を参照のこと）を評価する際に有用であった。
実施例９－エンベロープ二量体エピトープ
抗ＥＤＥ抗体は、ｓＥ二量体界面で結合する
ＦＧＡ０２ ｓＥ免疫複合体の結晶構造は、二量体（ｓＥ二量体における各抗ＥＤＥ抗体のインプリントを提供する、図１２のＥＤも参照のこと）の両サブユニットと相互作用する、４種の抗ＥＤＥ抗体が同様の方法で結合することを示す（図１１）。重鎖は、２倍軸（すなわち、二量体の中心）により近接して結合するが、一方、軽鎖は、末梢に位置付けられる。エピトープは、低ｐＨ４６に曝露される未成熟ＤＥＮＶ粒子においてＥ二量体上にｐｒＭタンパク質のインプリントで大きく重複する。それらは、ドメインＩＩ側上のｂストランド、及び（二量体界面の向かいにある、図１１ｃ）ドメインＩ側上の「１５０ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれている。１５０ループは残基１４８１５９に広がり、ドメインＩのβストランドＥ０及びＦ０に接続し、二量体におけるパートナーサブユニットの融合ループの上にあるＮ１５３グリカンを担持する。重鎖は、二量体界面を横断する、２つのグリカン鎖、Ｎ６７とＮ１５３との間の距離を広げる（図１１ｃ～ｆ）。１エピトープ当たりの全埋没表面は１０５０Å２～１４００Å２の範囲に及び、表面相補係数１３は、０．６７～０．７４であり、これらは抗体／抗原複合体に典型的な値である（図１３）。エピトープ及びパラトープの表面静電電位は、軽く荷電され、比較的相補的な電荷分布を有する（図１４）。
保存された残基はエピトープを作り上げる
抗ＥＤＥ抗体は、４種の血清型を横断する高度に保存された残基において本質的にクラスタと接触し（図１５）、これはそれらの交差反応性を説明する。Ｂ７及びＡ１１の２６残基長ＣＤＲ Ｈ３は、エピトープを形成する両方のｓＥサブユニットにおいてＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体接触の大部分を占める。Ｈ３ループは、抗原の凹面に相補的な凸形状を採用する、パラトープにおいて突出を作る（図１１ｄ）。Ｈ３突出は、非連結型ＥＤＥ２ Ａ１１ ｓｃＦｖの１．７Å分解構造によって示されるように、抗体において予め形成され、これは結合に対してエントロピー消費がないことを示す（図９、１６、及び１７）。エピトープへの融合ループに貢献するものとして定義される参照サブユニットにおいて、ＥＤＥ１及びＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体は両方とも、ドメインＩＩの３つの主なポリペプチドセグメント（図１５ａ中において囲まれた）、つまり、ｂストランド（Ｎ６７グリカンを担持する残基６７～７４）、すぐ上流の融合ループ及び残基（ａａ９７～１０６）、ならびにｉｊループ（ａａ２４６～２４９）に群がる同じ血清型の不変残基を標的とする。ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体の軽鎖及び重鎖の両方が３つすべてのＣＤＲを介して参照サブユニットと相互作用するのに対して、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体は、本質的には、重鎖と相互作用し、ＣＤＲ Ｌ３から少数の軽鎖のみと接触する（図１８）。界面の向かいにある、反対側のサブユニットにおいて、標的とされるｓＥセグメントは、２つのＥＤＥ基とは異なる。ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体は、１５０ループ及びＮ１５３グリカン鎖と相互作用するが（以下を参照されたい）、一方、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体は、結合時、１５０ループの障害を誘発する。これは、マウスＤＥＮＶ交差反応性抗体４７、４８に対してこれまでに構造的に特徴付けられている「Ａストランド」エピトープの領域において、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体における軽鎖をｓＥにより接近させ、ドメインＩＩＩと相互作用することが可能である。これらのドメインＩＩＩ接触面は、保存されたｓＥ残基Ｋ３１０の中心に置かれ、重要な安定化ｓＥ二量体接触面において、側鎖は融合ループのＷ１０１のインドール環を覆う蓋を作製する（図１８）。軽鎖は異なるＶＬ遺伝子に由来するが（図７）、ＥＤＥ１ Ｃ１０及びＣ８の両方は、ドメインＩＩＩと接触するために、ＣＤＲ Ｌ１及びＬ２残基を使用する（図１５及び図１８）。ドメインＩにおいて、ＥＤＥ１ Ｃ１０は、（Ｅタンパク質のＮ末端５０アミノ酸に散乱した、図１５ａ、または図１８ｄ、左パネルにおいて丸く囲まれた箇所を参照されたい）１５０ループの下の保存された残基と相互作用するようにその比較的長いＣＤＲ Ｈ３（２１ａａ、図７）を挿入するが、一方、ＥＤＥ１ Ｃ８のより短いＨ３ループはこの領域に達することができない。
実施例１０－グリカン鎖の抗体認識
抗ＥＤＥ抗体は、Ｅの位置Ｎ６７及びＮ１５３の両方でグリカン鎖との広範な接触面を作る（図１９及び図２０）。４種すべての抗ＥＤＥ抗体は、ＣＤＲ Ｈ２接触面を介してＮ６７グリカンと相互作用し、したがって、Ｎ６７グリカン４９と特異的に相互作用することが示された樹状細胞のＤＣ－ＳＩＧＮ受容体への結合を妨げるであろう。ＤＥＮＶ－２ ｓＥ／ＥＤＥ１ Ｃ８複合体は、重鎖のフレームワーク領域３（ＦＲＷ Ｈ３、図１５ｂ及び図１８ｃ）と接触する遠位マンノース残基を有する最高位のＮ６７グリカン構造を示す。ＥＤＥ１ Ｃ１０（その生殖細胞系に非常に近接している、図７）を除いて、多くのＦＲＷ Ｈ３残基は、変化し（図１５ｂ）、このことは糖を認識する親和性成熟を示唆している。さらなるグリカン残基が構造において可視的であった場合、その他の抗ＥＤＥ抗体にも同じＦＲＷ Ｈ３残基の相互作用が見られ得る可能性がある。
Ｎ１５０ループ及びＮ１５３グリカンがＥＤＥ１複合体において不規則であるが、抗体とドメインＩとの間の限定された空間（図１９ａ、左パネル）は、このグリコペプチドセグメントが抗体（図１５Ａにおける１５０ループの上の疑問符によって示されるように）と接触するが、平均して結晶中に分解された電子密度がないようにするために、各複合体において可変の局所的な立体構造を採用することを示唆している。１５０ループが所定の位置に残存した場合、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体のＣＤＲ Ｈ３ループは、Ｎ１５３グリカン、例えば、ＤＥＮＶ－２ ｓＥ／ＥＤＥ１ Ｃ１０における第１のＧｌｃＮＡｃ残基（図１９中の糖１）と衝突し得る。
電子密度は、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体（図２０中に示される、省略マップを含む）との複合体の結晶におけるｓＥのＮ１５３グリカンのコア６糖残基において明らかである。ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体のＣＤＲ Ｈ３は、第１のＮ１５３ ＧｌｃＮＡｃ残基のＮ２原子によって提供される水素結合によって覆われているそのＣ末端終端のカルボニル基のうちの１つを用いて２回転α－らせん（Ｈ３らせんと称される、図１１ｄ）を作製する（図２１）。Ｈ３らせんは、Ｎ１５３グリカンの糖残基１、３、及び４を包むように、Ｙ９９（ＥＤＥ２ Ａ１１中のＦ９９）及びＹ１００の芳香族側鎖を横方向に突出する。グリカン、マンノース４、５、及び６の最も遠位の残基は、いくつかの水素結合を含む、ＣＤＲ Ｌ２からの残基を介して、軽鎖と接触させる（図１９及び図２１）。
ＥＤＥ１及びＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体が１５０ループ及びＮ１５３グリカンで生み出す異なる種類の相互作用は、それらの中和効率におけるグリカンの不在の対照的な効果に反映される。例えば、位置１５５にイソロイシンを有するＤＥＮＶ－４単離体（すなわち、１５３－ＮＤＴ－１５５グリコシル化モチーフを欠いている天然グリコシル化突然変異体）は、グリカン鎖によるＣＤＲ Ｈ３の衝突がないため、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体による中和反応に対してより感受性がある。対照的に、この変異体は、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体による中和反応に対してより耐性があり（図１９ｅ）、Ｎ１５３グリカンの観察された特異的認識の重要性を強調する。
実施例１１－結合決定基としての融合ループの主鎖立体構造
融合ループでは、残基１０１－ＷＧＮＧ－１０４は、二量体界面の向かいにあるドメインＩＩＩに向かってＷ１０１側鎖を突出する歪んだαらせん回転を作る。ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体との複合体において、融合ループのらせん回転は、２つのらせんのＣ末端側でカルボニル基が互いに向き合うように、Ｈ３らせん下である。さらに、ＣＤＲ Ｈ３のＳ１００Ｃは、複合ループにおいてＧ１０２のカルボニル基に主鎖及び側鎖の水素結合を作製することによってらせん回転を覆っている。ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体との複合体において、融合ループは、それに対してパッキングする重鎖及び軽鎖の両方のいくつかの芳香族残基の側鎖を有する、ＶＨ／ＶＬ界面の右下にある。具体的には、ＶＬ主鎖は、Ｇ１０４の主鎖カルボニル基に水素結合を提供することによって非常に近接してＥＤＥ１ Ｃ８において、主鎖アミドプロトンドナーは、ＣＤＲ Ｌ３からのＮ９３に属するが、一方、ＥＤＥ１ Ｃ１０において、それは、ＣＤＲ Ｌ１からのＮ３１に属する。Ｃ１０及びＣ８の両方のＣＤＲ Ｌ２における残基Ｄ５０は、Ｋ３１０（図１９ａ及び図１８ｄ）で塩橋を形成し、これは、この領域では極性相互作用の広範なネットワークの一部である（図２１中に列挙される）。
Ｅ二量体におけるグリシンリッチな融合ループの立体構造は、主鎖を本質的には曝露するが、一方、側鎖は、ほとんど埋没している。ｉｊループの主鎖と共に、主鎖原子は、ｂストランドの片方の端によって増大される大きな表面パッチを形成し、これは抗ＥＤＥ抗体によって認識される不変の曝露された表面をもたらす。Ｅ二量体表面（図２２ａ、下パネル）で曝露された主鎖と共に、この領域における不変の側鎖は、実質的には、周囲で非保存残基を有する、不変の血清型であるコア領域のエピトープをもたらす。この変換の理由は、粒子成熟時のｐｒＭとの相互作用に関連する可能性が高い４６。最小の保存領域は、ＥＤＥ１エピトープ内のドメインＩＩＩの表面である。
実施例１２－ＥＤＥ１ Ｃ１０と複合体形成されたＤＥＮＶ－４ ｓＥの構造
抗ＥＤＥ抗体がいかに複数のウイルス血清型を効果的に認識することができるかを詳細に理解するために、アミノ酸配列において他のデング熱血清型とは最も異なり（図１５ａ）、また、ＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体によって強力に中和される（図１９ｅ）ため、我々はＤＥＮＶ－４に戻った。Ｃ１０ ｓｃＦｖと複合体形成された２．７Å分解能結晶構造のＤＥＮＶ－４ ｓＥは、不規則な１５０ループを有する、ＤＥＮＶ－２ ｓＥ（図２２ｂ及び図２３）との複合体において観察された一般的なパターンを確認した。予想通りに、抗ＥＤＥ抗体は、主鎖と、エピトープの保存された側鎖と同じ相互作用を示す。ドメインＩＩＩにおけるＥＤＥ１エピトープのより可変な横方向領域において（図２２ａ）、接触部位は、ＤＥＮＶ－４においてはアスパラギン酸であるが、ＤＥＮＶ－２においてはバリンである残基３０９の側鎖を含む（図１５ａ）。後者の複合体では、ＣＤＲ Ｌ２の側鎖Ｖ３０９とＴ５２のＶａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓパッキングがあるが、一方、前者の複合体では、Ｄ３０９がＴ５２側鎖からの水素結合を受容する極性相互作用がある（図２３ｂ及び図２１）。ドメインＩＩＩとの他の接触はまた、具体的には、主鎖カルボニルへの水素結合を含む、位置３６２のものも維持される（図２１）。
ＥＤＥ１ Ｃ１０は、ＤＥＮＶ－２ ｓＥにおいて１５０ループの不規則性を誘発するが、ＤＥＮＶ－４ ｓＥの場合に、このループは、５Ｈ２と称される非関連チンパンジー抗体のＦａｂ断片と複合体形成されたその結晶構造によって示唆されているように、固有のより高い移動性を示すように思われる（参照１７）。実際には、５Ｈ２エピトープはまた、ドメインＩにもあるが、ｓＥ二量体の側面にあり、本明細書に記載される抗ＥＤＥ抗体エピトープで重複しないが、１５０ループは、その構造において不規則であった。さらに、ＤＥＮＶ－４ ｓＥ／ＥＤＥ１ Ｃ１０複合体の構造は、二量体の２つのエピトープによる抗ＥＤＥ抗体の接触での無視することができない非対称の度合いを強調した（図２３、図１３、及び図２１）。この非対称性はまた、図２４中に示されるように、ＤＥＮＶ－２ ｓＥとの複合体において検出可能であった。確率的に、第１の抗体断片の結合は、ｓＥ二量体の非対称の立体構造の調節を誘導し、第２の抗体断片が結合する場合に、第２のエピトープの利用可能な立体構造に適応するように、第２の部位に影響を及ぼす可能性が高い。総合すれば、これらの観察は、ＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体の結合決定基が、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体で共有される領域において、エピトープの保存されたコアにあり、いずれかの端での接触が、結合に支障を来たさない各血清型に存在する特定の側鎖に適応することを強く示唆している。Ｅ二量体のこの観察された柔軟性は、抗体との相互作用における通常隠れたエピトープを曝露する、ビリオンにおけるＥ二量体の立体構造の呼吸の報告と一致している。
実施例１３－成熟ビリオンにおける推定上のさらなるＥＤＥ１ Ｃ１０／Ｅ二量体の相互作用
構造の精密な検査は、ＥＤＥ１
Ｃ１０のＣＤＲ Ｈ３の先端がｓＥ二量体（図１８ｄ、左パネルにおいて丸く囲まれており、また、図１５ａ及び図１２ｄ～ｅも参照されたい）の「底部」に達し、無傷ビリオンの文脈において、領域は、下の方のタンパク質Ｍによって強化されることを示す（図２５）。ＤＥＮＶ－２の無傷成熟粒子の３．５Å分解能の低温ＥＭ構造（参照９）は、Ｍとの相互作用が、ドメインＩＩの疎水性コアにおいて埋没される代わりに、二量体界面で曝露されるように（図２５ｃ）、Ｅのｋｌヘアピンの底部に保存された残基Ｆ２７９をもたらす（図１５ａ）ことを示す。ＤＥＮＶ－２ ｓＥ／Ｃ１０構造による重ね合わせは、ビリオンの文脈において、曝露されたＦ２７９側鎖がＨ３ループにおいてＹ１００と相互作用し得ることを示す。Ｙ１００が、ＤＥＮＶ－４と比較して、ＤＥＮＶ－２ ｓＥとの異なる相互作用をすると見られ（図２５Ｃ；ＥＤ 図２６においてパネルｂ及びｅも比較する）、このことはその正確なパートナーを見出さないことを示唆している。それ故に、成熟ビリオンにおけるＥ二量体上のＥＤＥ１ Ｃ１０結合部位は、組換えｓＥ二量体によって完全には反復しないと思われる。この観察は、ｓＥ二量体へのＥＤＥ１ Ｃ１０の弱い結合の間の明らかな相違（図８）、ならびに４種のデング熱血清型（低いｎＭ範囲におけるＮＴ５０、添付の原稿を参照されたい）からのウイルスの強力な結合及び中和反応を恐らく説明している。重要なことは、成熟ビリオンにおけるＦ２７９の立体構造が疎水性リガンドに結合するｓＥで観察されたものと同様であり４、このことは免疫原として組換えｓＥ二量体のこの領域の正確な立体構造を誘導することが可能であることを示唆している。
実施例１４
デング熱に感染した患者において引き起こされたヒトモノクローナル抗体によって標的とされる主要な新しいエピトープと相互作用する抗ＥＤＥ抗体のスナップショットを提供した。これらの抗体は、ＥＤＥ２の例にあるように相互作用のほとんどを行う非常に長いＣＤＲ Ｈ３を有する重鎖を必要とするか、または主鎖の接触を、ここで分析されたＥＤＥ１抗ＥＤＥ抗体については融合ループ及びドメインＩＩＩへの主鎖の接触を有する軽鎖及び重鎖の微調整された組み合わせを得る、全く異なる進化経路を介して同じ特異性に向かって集中していると思われる。ＥＤＥ１及びＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体は、付随する研究におけるデング熱患者から単離された抗体のほぼ３分の１の抗体を含み、ビリオン表面で立体構造に特異的な四級エピトープを認識するものの大部分を構成する。アラニン走査実験（添付の原稿）からのそれらの一般的な特徴は、それらがすべて、本明細書に記載される同じ四級エピトープを標的とすることを強く示唆している。
重要なことには、ＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体の結合決定基は、全体的にＥ二量体に対して限局性であり、異なるフラビウイルス、西ナイルウイルス５１における研究に基づいて、ＤＥＮＶ粒子５０上の四級エピトープについて最近示唆されているように、ビリオン表面で高次配置の二量体に応じて異ならない。ＤＥＮＶ－２粒子の最近の低温ＥＭ分析は、杉綾模様パターンが、互いに再配向し、対称性配置を弛緩し、及び／または異なる表面パターンを表す二量体で、ヒトにおいて生理的温度で妨げられ得ることを示唆している５２、５３。したがって、本明細書に記載されるエピトープは、膨張に独立して、または粒子に独立しない、Ｅ二量体に接近可能であり、次世代のワクチンに対して好ましい標的物であり得る。当然の結果として、我々の結果は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）５４に対して最近提案されているように、Ｅ二量体のみが免疫系に提示されるような方法で、二量体の接触を安定化し、それ故に、感染性ビリオンの表面で通常接近可能ではない不良な免疫原性領域に対して抗体を誘発することを避けることによって、強力な免疫原を設計するのに適したものであることを示す。
ＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体の主な結合決定基は、無傷Ｅ二量体の文脈において、融合ループ及びその隣近所の主鎖の立体構造であると見られる。これは、添付の原稿においてヒトから単離された、その他の主要なクラスの抗体との著しい対照であり、これは、四級組織から独立する文脈において、融合ループ配列を認識する。後者の抗体は、交差反応性があるが、不良に中和し、潜在的に強力な感染増強を有する５６。本明細書に記載されるエピトープの注目に値すべき特徴は、曝露された主鎖原子の数であり、ＥＤＥ１の場合において、複合体に埋没された全表面面積の約３０％を占め、ＥＤＥ２抗ＥＤＥ抗体については２０％を占めるが（このより低いＥＤＥ２の割合は、概して、不変のグリカン組成物の４０％で補正される）（図１３）、一方、一般の主鎖原子において、分析されるほとんどの免疫複合体については、５％～１５％貢献する。例えば、立体構造５７という点において、ＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体がそうであるように、安定化させる、プレ融合形態のＲＳＶ融合タンパク質のみに提示する「抗原部位０」に結合する、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するＤ２５抗体等のある種の非常に強力な中和抗体もまた、抗原において高い割合（約３０％）の主鎖原子も認識する（図２７）。血球凝集素（ＨＡ）５８の受容体結合ポケットに結合することによって広範囲のＨ１インフルエンザウイルス単離体を中和する、ＢＮＡ ＣＨ６５、またはＨ１５９の幹の基部に結合することによって、Ｈ３、Ｈ７、及びＨ１０単離体に対して中和活性のある強力な群２の反応性のある抗インフルエンザヒトＢＮＡであるＣＲ８０２０を有する、同様のパターンが、見出される。ＣＲ８０２０はまた、本明細書に記載されるＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体と同様に、プレ融合三量体立体構造において、四級構造の文脈ないに融合ペプチドの主鎖立体構造も認識する。最後に、非常に広範な抗ＨＩＶ－１抗ＥＤＥ抗体のうちの２つのＢ１２（参照６０）及びＶＲＣ０１（参照６１）は、エンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質におけるＣＤ４結合部位を認識し、エピトープにおいて３６％及び３３％の主鎖原子を示し（図２７）、このことは主鎖立体構造の認識が多くの（すべてではないが）抗ＥＤＥ抗体によって共有される重要な態様であることを示唆している。これらの抗ＨＩＶ－１広域中和抗体は、有効な結合２９のためにＥＮＶ三量体の正確な四級構造も必要とし、長い親和性成熟プロセスを受け、生殖細胞系からの２０％超の相違を示すが、一方、デング熱に対するＥＤＥ抗ＥＤＥ抗体は、生殖細胞系からの最大９％の相違であり（図２７）、このことは、適切な免疫原がワクチン接種用に使用される場合、個体内に比較的容易に発生することを示す。
結論として、デング熱ウイルスに対する強力な高度に交差反応性のある抗体における高度に保存された結合部位を説明した。最近の弱毒生多価デング熱ワクチンの不良な有効性は、ヒトにおける防御反応をよりよく理解し、次世代の有効なワクチンを設計するために、差し迫った必要性を生み出す。血清型特異的免疫は、しばしば、それらの四価製剤を要求するデング熱ワクチンの目標である。我々の結果は、安定化Ｅ二量体を含むサブユニットワクチンが評価されるべきであり、単一の最適化された普遍的な免疫原が可能であり得、抗ＥＤＥ抗体の誘出が成功したデング熱ワクチンにおける実現可能な目標として見なされるべきであることを示唆している。
実施例１５－さらなる方法
ＤＥＮＶ血清型１～４からの組換えｓＥタンパク質、ならびにＦａｂ及びｓｃＦｖ ＢＮＡ断片は、上述のプロトコル４４、４５、２９を用いて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２において産出された。ｓＥタンパク質へのＢＮＡ断片の結合は、ＳＥＣ／ＭＡＬＳ及びＳＰＲによってモニタリングされた（図８）。ｓＥ／ＢＮＡ複合体の結晶は、ＳＥＣによる混合物から複合体を単離することによって、またはＥＤＥ１ Ｃ１０の場合において、ｓＥ：抗体が１：２の二段燃焼率において２つを混合することによって得られた。結晶化試験は、ロボット環境下の施設を使用して行われた。回析データは、シンクロトロン源ＳＯＬＥＩＬ及びＥＳＲＦで回収され、構造は、関連の結晶学的統計学も提供する、図９中に列挙される検索モデルを用いた分子置換によって決定された。ＤＥＮＶ－４変異体における中和試験は、添付の書類に概説されたものと同じ手順を用いて行われた。
組換えｓＥタンパク質に産生
組換えＤＥＮＶ－１ ＦＧＡ／８９ ｓＥ（１－３９５）、ＤＥＮＶ－２ ＦＧＡ０２ ｓＥ（１－３９５）、及びＤＥＮＶ－３ ＰＡＨ８８１ ｓＥ（１－３９３）を、いくつかの修飾を用いて、ＤＥＮＶ－４ ｓＥ（Ｄｅｎ４＿Ｂｕｒｍａ／６３６３２／１９７６）のために上述されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞において、本質的に産生した２９。簡潔に言えば、ｓＥ発現は、メタロチオネインプロモーターによって起動し、昆虫ＸＰＲＥＳＳ培地（Ｌｏｎｚａ）における５μＭのＣｄＣｌ２によって誘導した。この構築物は、トランスフェクトされたＳ２細胞のＥＲへの効果的な転座のためにｐｒＭ－ｓＥ構築物のＮ末端終端で融合されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＢｉＰシグナル配列を有した。ｐｒＭは、ＤＥＮＶポリタンパク質前駆体等の場合、ｐｒＭのＮ末端を有するｓＥ、及びＥＲにおけるシグナラーゼ切断によって生成されたｓＥへのＮ末端を提示し、ｐｒＭ（膜に固定された状態である）がｓＥの融合ループを覆うことによってシャペロンの役割を果たす。ｐｒＭ／ｓＥ複合体は、ｐｒＭがｐｒ（ｓＥに結合するＮ末端の半分）及びＭ（膜に固定されたＣ末端の半分）にフリンによって切断される場合に、酸性分画を横断して運搬される。外部環境、ｓＥ、及びｐｒ解離物に達する際に、ｓＥ成分を、細胞の上清流体からの親和性クロマトグラフィーによって精製する。ＤＥＮＶ－３及び－４ ｓＥ構築物がｔｗｉｎ－ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（ＩＢＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂａ－ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｔｗｉｎ－ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ．ｈｔｍｌ）によるＣ末端融合を有するが、一方、ＤＥＮＶ－１及び２ ｓＥは、６ｘＨｉｓ Ｃ末端タグを有した。浄化した細胞上清を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ接線濾過カセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カットオフ１０ｋＤａ）を用いて２０倍に濃縮し、構築物に応じて、二価イオンを除去するために、緩衝液交換後、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ親和性精製またはＨｉｓＴｒａｐ－ＨＰクロマトグラフィーのいずれかを用いたＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステムでの精製前に、０．５Ｍ ＮａＣｌまで調節した。Ｈｉｓタグタンパク質（ＤＥＮＶ－１及び－２ ｓＥ）を、ＨｉｓＴｒａｐカラムの溶出後に脱塩し、ＭｏｎｏＱにおけるイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ中で平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラムを用いた最終精製ＳＥＣステップを、すべての構築物で行った。
Ｆａｂ及びＳｃＦｖの産生
ＢＮＡ断片を、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞において、Ｆａｂ６２及びｓｃＦｖ６３としての発現のためにプラスミドにクローン化した。構築物は、親和性精製のために、Ｃ末端（Ｆａｂの場合において、重鎖のみの）で融合されたｔｗｉｎ ｓｔｒｅｐ ｔａｇを含む。精製プロトコルは、ｓｔｒｅｐタグｓＥタンパク質のために上述と同じステップを含み、同じ緩衝液を使用した。
免疫複合体の形成及び単離
精製したＤＥＮＶ ｓＥタンパク質を、標準的な緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ８．０緩衝液）中でＦａｂまたはＳｃＦｖ（約２倍のモル過剰において）と混合した。この体積を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ １０ｋＤａカットオフでの遠心分離によって０．２ｍｌにして、４℃で３０分間のインキュベーション後、この複合体を、複合体において明らかなピークが得られなかった場合を除いて、ＳＥＣによって過剰なＦａｂまたはｓｃＦｖから分離した（ＢＮＡ Ｃ１０と同様に、図８を参照されたい）。この場合において、抗原：抗体のモル比が１：２の混合物（すなわち、過剰な抗体を有する）を、結晶化のために直接使用した。すべての場合において、緩衝液を、結晶化試験のために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に交換した。２８０ｎｍで光学密度を測定し、アミノ酸配列から推定される減衰係数を用いることによって決定される、結晶化のために使用されるタンパク質濃度を、図９に列挙する。
ＭＡＬＳ分析
１５０μｇの精製したＤＥＮＶ－１、－２、－３、及び－４ ｓＥを、３００μｇのＡ１１、Ｂ７、Ｃ８、及びＣ１０ Ｆａｂ断片と混合し、全容積を１００μｌに調節した。個々のタンパク質
（ＤＥＮＶ ｓＥまたはＦａｂ）はまた、同じ濃度で対照として別々に泳動させた。
試料を室温で１５分間インキュベートし、流速０．４ｍｌ／分でＳＤＸ２００ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム泳動から溶出した場合に、ＭＡＬＳによって分析した。この溶出は、続いて、屈折率測定法及びＤＡＷＮ Ｈｅｌｅｏｓ－Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ設定（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのＭＡＬＳ検出を行った。
表面プラズモン共鳴
抗ＥＤＥ抗体の捕捉Ｆａｂ断片へのｓＥ二量体の結合のリアルタイムＳＰＲ測定は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行われた。
ＤＥＮＶ－４特異的中和抗体５Ｈ２のＦａｂ断片は、対照として使用された。ビオチン化した抗ヒトＣＨ１特異的抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ ＰｒｏｔｅＯｎ ＮＬＣセンサチップ上に固定化し、異なるＦａｂ断片の同様の密度（４００～５００ＲＵ）を捕捉するために使用した。この抗ＣＨ１抗体は、軽鎖サブクラス（カッパ／ラムダ）とは無関係にすべてのＩｇＧサブクラス（１、２、３、及び４）を認識する。この抗ＣＨ１抗体はまた、より低い親和性を有するが、チンパンジー抗体の５Ｈ２と交差反応することも見出した。抗ＨＣＶ Ｅ２抗体のＦａｂ断片は、陰性対照として使用した。このチップは、Ｆａｂ捕捉後、９０°回転させ、４種のＤＥＮＶ血清型のｓＥを、２μＭの濃度で注射した。泳動緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた空注射を二重参照のために使用した。ＳＰＲシグナルは、捕捉したＦａｂの量に正規化した。すべてのＦａｂにわたって同様の濃度で風疹ウイルスＥ１糖タンパク質の外部ドメインの対照注射は、明らかな結合がないことを示した（データ示さず）。
ＤＥＮＶ－４グリコシル化変異体を用いた中和アッセイ
抗ＥＤＥ抗体の中和の可能性は、感染した病巣の数の低減が対照（抗体なし）と比較する場合に、フォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）を用いて判定した２２。ＤＥＮＶ－４株Ｈ２４１（位置１５５でＩｌｅを有する）、１－００９３、及び１－０５５４（両方とも、位置１５５でＴｈｒを有し、それ故に、Ａｓｎ１５３でグリコシル化を復元する）を、Ｃ６／３６細胞中で成長させた。ウイルス力価は、ベロ細胞におけるフォーカス形成によって決定された６４。簡潔に言えば、連続希釈した抗ＥＤＥ抗体をウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物をベロ細胞に移し、３日間インキュベートした。次いで、フォーカス形成アッセイは、マウスモノクローナル４Ｇ２抗体（すべてのフラビウイルスからのＥタンパク質と交差反応する）、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼで共役されたウサギ抗マウスＩｇＧを用いて行った。この反応は、ジアミノベンジジン基質の添加によって可視化した。フォーカス低減の割合は、各抗体希釈について計算された。５０％のＦＲＮＴは、統計的パッケージＳＰＳＳを用いた「プロビット」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｂｉｔｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．ｈｔｍ）を用いて、低減率対Ａｂの濃度のグラフから決定された。
結晶化及び３Ｄ構造決定
結晶化試験は、４００ｎｌの滴の固定において行われた。滴下は、９６ Ｇｒｅｉｎｅｒプレートの形式で等体積のタンパク質及びリザーバー溶液を、Ｍｏｓｑｕｉｔｏロボットを用いて混合することによって形成し、Ｒｏｃｋ－Ｉｍａｇｅｒによってモニタリングした。結晶は、４００ｎｌの滴の固定において、ロボット化したＭａｔｒｉｘ Ｍａｋｅｒ及びＭｏｓｑｕｉｔｏ設定で、または２～３μｌの懸滴を用いて２４ウェルプレート中で手動で最適化した（図９）。回析データ収集における結晶化及び冷凍冷却条件を図９中に列挙する。
Ｘ線回析データを、ＳＯＬＥＩＬシンクロトロン（Ｓｔ Ａｕｂｉｎ、Ｆｒａｎｃｅ）でビームラインＰＲＯＸＩＭＡ－１及びＰＲＯＸＩＭＡ－２、ならびにＥｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）でＩＤ２３－２及びＩＤ２９で回収した（図９）。回析データを、ＸＤＳ パッケージ６５を用いて処理し、ＣＣＰ４パッケージソフト６７の他のプログラムと組み合わせて、ＳＣＡＬＡまたはＡＩＭＬＥＳＳ６６で計測した。構造は、図９中に列挙された検索モデルを用いて、ＰＨＡＳＥＲ６８及び／またはＡＭｏＲｅ６９との分子置換によって決定した。
続いて、ＣＯＯＴ７０との慎重なモデル構築、プログラムＢＵＳＴＥＲ／ＴＮＴ７１との結晶学的精密化のサイクルを交互に行い、最終モデルをもたらした。精密化は、非結晶学的対称性を尊重するように抑制し、結晶の分解能に応じて、標的拘束（高分解能構造の複合体の部分を有する）及びＴＬＳ精密化７２を使用した（図９を参照のこと）。最終省略マップは、Ｐｈｅｎｉｘ．Ｒｅｆｉｎｅ７３を用いて計算した。
原子モデルの分析及び説明
各複合体は、プログラムのＣＣＰ４パッケージソフト６７を用いて分析した。分子間相互作用のために、相互作用のために使用した最大カットオフ距離は、４．７５Åであった。次いで、Ｆａｂ／ＳｃＦｖまたはＤＥＮＶ ｓＥタンパク質の各残基の接触を計数し、対応する残基を上回る比例棒としてプロットした。
Ａｂ配列は、Ｋａｂａｔ３０及びＩＭＧＴ３１変換に従ってＣＤＲ／ＦＷＲ領域をマッピングするために、Ａｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）３１によってそれぞれ分析した。推定上の生殖細胞系列及び体細胞成熟事象の分析を、ＩＭＧＴウェブサイト（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）で行った。
複数の配列アライメント及び系統樹は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸのバージョン２（参照７４）を用いて、ＥＢＩサーバー７５上で計算した。この系統樹は、この研究において使用されたｓＥタンパク質、ＤＥＮＶ－１ ＦＧＡ／８９（１－３９５）、ＤＥＮＶ－２ ＦＧＡ０２、ＤＥＮＶ－３ ＰＡＨ８８１（１－３９３）、及びＤＥＮＶ－４（ＤＥＮ＿Ｂｕｒｍａ／６３６３２／１９７６）のアミノ酸配列を用いて計算した。ＤＥＮＶ－２遺伝子型をマッピングするために、７６からのデータベースを、ｓＥ外部ドメインのアミノ酸配列を抽出するために使用し、ＤＥＮＶ２ ＦＧＡ０２ ｓＥ及びＤＥＮＶ－２ １０ＡＮ ｓＥを含むように延長した。標示を簡単にするために、サブルートは、ＤＥＮＶ－２のための個々の遺伝子型のレベルに折り畳んだ。次いで、この系統樹を、ＤＥＮＶ－４ ｓＥ配列でルート構成し、ＭＥＧＡ５ソフトウェアパッケージ７７を用いて計測するように導いた。
図２２ａ及び図１４のため、ならびに分析目的のために、配列においてギャップのないＤＥＮＶ－２ ｓＥ二量体のモデルを使用した。このモデルは、ＤＥＮＶ－２ ｓＥ／Ｂ７複合体の完全プロトマーＡを用いて構築した。
図は、Ｐｒｏｇｒａｍ ＥＳＰｒｉｐｔ７８及びＡＰＢＳ７９及びＰＤＢ２ＰＱＲツール８０を含む、ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍのバージョン１．５．０．４ Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ（ｐｙｍｏｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を用いて準備した。
最後に、現行のワクチン戦略は、４種すべての血清型に対してバランスのとれたタイプの特異的反応を作り出す目的で四価製剤を採用する。そのような強力かつ交差反応性のある抗体のここでの説明は、自然の連続的な感染に見られる反応を繰り返すような、所望のエピトープ及び場合により、異種のプライムブースト戦略を含むサブユニットワクチンへの方法を示す。
実施例１６：配列情報
配列番号
配列番号１
抗体Ｃ８重鎖の完全配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＴＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＴＧＥＧＤＳＡＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＦＥＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＧＧＹＳＮＦＹＹＹＹＴＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ
配列番号２
抗体Ｃ１０重鎖の完全配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＤＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＤＫＶＤＤＹＧＤＹＷＦＰＴＬＷＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ
配列番号３
抗体Ａ１１重の完全配列

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＹＳＮＨＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＲＩＮＳＤＧＳＴＲＮＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＴＡＤＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＧＶＲＦＹＹＤＳＴＧＹＹＰＤＳＦＦＫＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ配列番号４
抗体Ｂ７重鎖の完全配列

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＨＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＲＴＮＳＤＧＳＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＭＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＨＭＮＧＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＤＧＶＲＹＹＹＤＳＴＧＹＹＰＤＮＦＦＱＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴ配列番号５
Ｃ８ ＣＤＲ Ｈ１
ＴＹＳＭＨ
配列番号６
Ｃ８ ＣＤＲ Ｈ２
ＡＩＴＧＥＧＤＳＡＦＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号７
Ｃ８ ＣＤＲ Ｈ３
ＧＹＳＮＦＹＹＹ
配列番号８
Ｃ１０ ＣＤＲ Ｈ１
ＳＹＡＭＨ
配列番号９
Ｃ１０ ＣＤＲ Ｈ２
ＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＤ
配列番号１０
Ｃ１０ ＣＤＲ Ｈ３
ＤＫＶＤＤＹＧＤＹＷＦＰＴＬＷ
配列番号１１
Ａ１１ ＣＤＲ Ｈ１
ＮＨＷＭＨ
配列番号１２
Ａ１１ ＣＤＲ Ｈ２
ＲＩＮＳＤＧＳＴＲＮＹＡＤＦＶＫＧ
配列番号１３
Ａ１１ ＣＤＲ Ｈ３
ＤＧＶＲＦＹＹＤＳＴＧＹＹＰＤＳＦＦＫＹ
配列番号１４
Ｂ７ ＣＤＲ Ｈ１
ＳＨＷＭＨ
配列番号１５
Ｂ７ ＣＤＲ Ｈ２
ＲＴＮＳＤＧＳＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１６
Ｂ７ ＣＤＲ Ｈ３
ＤＧＶＲＹＹＹＤＳＴＧＹＹＰＤＮＦＦＱＹ
配列番号１７
Ｃ８－ＣＤＲ Ｌ１
ＲＡＳＱＳＩＳＴＦＬＡ
配列番号１８
Ｃ８ ＣＤＲ Ｌ２
ＤＡＳＴＲＡＴ
配列番号１９
Ｃ８ ＣＤＲ Ｌ３
ＱＱＲＹＮＷＰＰＹＴ
配列番号２０
Ｃ１０ ＣＤＲ Ｌ１
ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＦＮＹＶＳ
配列番号２１
Ｃ１０ ＣＤＲ Ｌ２
ＤＶＴＳＲＰＳ
配列番号２２
ＳＳＨＴＳＲＧＴＷＶＦ
配列番号２３
Ａ１１ ＣＤＲ Ｌ１
ＴＧＴＳＳＮＡＤＴＹＮＬＶＳ
配列番号２４
Ａ１１ ＣＤＲ Ｌ２
ＥＧＴＫＲＰＳ
配列番号２５
Ａ１１ ＣＤＲ Ｌ３
ＣＳＹＡＴＳＲＴＬＶＦ
配列番号２６
Ｂ７ ＣＤＲ Ｌ１
ＴＧＩＳＳＤＶＥＴＹＮＬＶＳ
配列番号２７
Ｂ７ ＣＤＲ Ｌ２
ＥＡＳＫＲＰＳ
配列番号２８
Ｂ７ ＣＤＲ Ｌ３
ＣＳＹＡＧＧＫＳＬＶ
配列番号２９
完全長エンベロープタンパク質配列ＤＥＮＶ１
＞ＤＥＮＶ１株Ｈａｗａｉｉ
ＭＲＣＶＧＩＧＮＲＤＦＶＥＧＬＳＧＧＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＳＣＶＴＴＭＡＫＤＫＰＴＬＤＩＥＬＬＫＴＥＶＴＮＰＡＶＬＲＫＬＣＩＥＡＫＩＳＮＴＴＴＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＴＬＶＥＥＱＤＡＮＦＶＣＲＲＴＦＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＩＴＣＡＫＦＫＣＶＴＫＬＥＧＫＩＶＱＹＥＮＬＫＹＳＶＩＶＴＶＨＴＧＤＱＨＱＶＧＮＥＴＴＥＨＧＴＩＡＴＩＴＰＱＡＰＴＳＥＩＱＬＴＤＹＧＡＬＴＬＤＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＶＬＬＴＭＫＥＫＳＷＬＶＨＫＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＴＳＧＡＳＴＰＱＥＴＷＮＲＥＤＬＬＶＴＦＫＴＡＨＡＫＫＱＥＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＴＳＧＴＴＫＩＦＡＧＨＬＫＣＲＬＫＭＤＫＬＴＬＫＧＭＳＹＶＭＣＴＧＳＦＫＬＥＫＥＶＡＥＴＱＨＧＴＶＬＶＱＶＫＹＥＧＴＤＡＰＣＫＩＰＦＳＴＱＤＥＫＧＶＴＱＮＧＲＬＩＴＡＮＰＩＶＴＤＫＥＫＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＥＳＹＩＶＶＧＡＧＥＫＡＬＫＬＳＷＦＫＫＧＳＳＩＧＫＭＬＥＡＴＡＲＧＡＲＲＭＡＩＬＧＤＴＡＷＤＦＧＳＩＧＧＶＦＴＳＶＧＫＬＶＨＱＩＦＧＴＡＹＧＶＬＦＳＧＶＳＷＴＭＫＩＧＩＧＩＬＬＴＷＬＧＬＮＳＲＳＴＳＬＳＭＴＣＩＡＶＧＭＶＴＬＹＬＧＶＭＶＱＡ
配列番号３０
完全長エンベロープヌクレオチド配列ＤＥＮＶ１
配列番号３１
完全長エンベロープタンパク質配列ＤＥＮＶ２
＞ＤＥＮＶ２株１６６８１
ＭＲＣＩＧＭＳＮＲＤＦＶＥＧＶＳＧＧＳＷＶＤＩＶＬＥＨＧＳＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＦＥＬＩＫＴＥＡＫＱＰＡＴＬＲＫＹＣＩＥＡＫＬＴＮＴＴＴＥＳＲＣＰＴＱＧＥＰＳＬＮＥＥＱＤＫＲＦＶＣＫＨＳＭＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＧＩＶＴＣＡＭＦＲＣＫＫＮＭＥＧＫＶＶＱＰＥＮＬＥＹＴＩＶＩＴＰＨＳＧＥＥＨＡＶＧＮＤＴＧＫＨＧＫＥＩＫＩＴＰＱＳＳＩＴＥＡＥＬＴＧＹＧＴＶＴＭＥＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＶＬＬＱＭＥＮＫＡＷＬＶＨＲＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＬＰＧＡＤＴＱＧＳＮＷＩＱＫＥＴＬＶＴＦＫＮＰＨＡＫＫＱＤＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＭＳＳＧＮＬＬＦＴＧＨＬＫＣＲＬＲＭＤＫＬＱＬＫＧＭＳＹＳＭＣＴＧＫＦＫＶＶＫＥＩＡＥＴＱＨＧＴＩＶＩＲＶＱＹＥＧＤＧＳＰＣＫＩＰＦＥＩＭＤＬＥＫＲＨＶＬＧＲＬＩＴＶＮＰＩＶＴＥＫＤＳＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＤＳＹＩＩＩＧＶＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＫＧＳＳＩＧＱＭＦＥＴＴＭＲＧＡＫＲＭＡＩＬＧＤＴＡＷＤＦＧＳＬＧＧＶＦＴＳＩＧＫＡＬＨＱＶＦＧＡＩＹＧＡＡＦＳＧＶＳＷＴＭＫＩＬＩＧＶＩＩＴＷＩＧＭＮＳＲＳＴＳＬＳＶＴＬＶＬＶＧＩＶＴＬＹＬＧＶＭＶＱＡ
配列番号３２
完全長エンベロープヌクレオチド配列ＤＥＮＶ２
配列番号３３
完全長エンベロープタンパク質配列ＤＥＮＶ３
＞ＤＥＮＶ３株Ｈ８７
ＭＲＣＶＧＶＧＮＲＤＦＶＥＧＬＳＧＡＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＧＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＩＥＬＱＫＴＥＡＴＱＬＡＴＬＲＫＬＣＩＥＧＫＩＴＮＩＴＴＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＩＬＰＥＥＱＤＱＮＹＶＣＫＨＴＹＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＱＣＬＥＳＩＥＧＫＶＶＱＨＥＮＬＫＹＴＶＩＩＴＶＨＴＧＤＱＨＱＶＧＮＥＴＱＧＶＴＡＥＩＴＳＱＡＳＴＡＥＡＩＬＰＧＹＧＴＬＧＬＥＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＩＬＬＴＭＫＮＫＡＷＭＶＨＲＱＷＦＦＤＬＰＬＰＷＴＳＧＡＴＴＥＴＰＴＷＮＲＲＥＬＬＶＴＦＫＮＡＨＡＫＫＱＥＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＴＳＧＧＴＳＩＦＡＧＨＬＫＣＲＬＫＭＤＫＬＥＬＫＧＭＳＹＡＭＣＬＮＴＦＶＬＫＫＥＶＳＥＴＱＨＧＴＩＬＩＫＶＥＹＫＧＥＤＡＰＣＫＩＰＦＳＴＥＤＧＱＧＫＡＨＮＧＲＬＩＴＡＮＰＶＶＴＫＫＥＥＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＥＳＮＩＶＩＧＩＧＤＫＡＬＫＩＮＷＹＲＫＧＳＳＩＧＫＭＦＥＡＴＡＲＧＡＲＲＭＡＩＬＧＤＴＡＷＤＦＧＳＶＧＧＶＬＮＳＬＧＫＭＶＨＱＩＦＧＳＡＹＴＡＬＦＳＧＶＳＷＩＭＫＩＧＩＧＶＬＬＴＷＩＧＬＮＳＫＮＴＳＭＳＦＳＣＩＡＩＧＩＩＴＬＹＬＧＶＶＶＱＡ
配列番号３４
完全長エンベロープヌクレオチド配列ＤＥＮＶ３
配列番号３５
完全長エンベロープタンパク質配列ＤＥＮＶ４
＞ＤＥＮＶ４株２４１
ＭＲＣＶＧＶＧＮＲＤＦＶＥＧＶＳＧＧＡＷＶＤＬＶＬＥＨＧＧＣＶＴＴＭＡＱＧＫＰＴＬＤＦＥＬＩＫＴＴＡＫＥＶＡＬＬＲＴＹＣＩＥＡＳＩＳＮＩＴＴＡＴＲＣＰＴＱＧＥＰＹＬＫＥＥＱＤＱＱＹＩＣＲＲＤＶＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＧＶＶＴＣＡＫＦＳＣＳＧＫＩＴＧＮＬＶＱＩＥＮＬＥＹＴＶＶＶＴＶＨＮＧＤＴＨＡＶＧＮＤＩＰＮＨＧＶＴＡＴＩＴＰＲＳＰＳＶＥＶＫＬＰＤＹＧＥＬＴＬＤＣＥＰＲＳＧＩＤＦＮＥＭＩＬＭＫＭＫＫＫＴＷＬＶＨＫＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＡＡＧＡＤＴＳＥＶＨＷＮＹＫＥＲＭＶＴＦＫＶＰＨＡＫＲＱＤＶＩＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＳＡＬＴＧＡＴＥＶＤＳＧＤＧＮＨＭＦＡＧＨＬＫＣＫＶＲＭＥＫＬＲＩＫＧＭＳＹＴＭＣＳＧＫＦＳＩＤＫＥＭＡＥＴＱＨＧＴＴＶＶＫＶＫＹＥＧＡＧＡＰＣＫＶＰＩＥＩＲＤＶＮＫＥＫＶＶＧＲＩＩＳＳＴＰＦＡＥＹＴＮＳＶＴＮＩＥＬＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＩＧＶＧＤＳＡＬＴＬＨＷＦＲＫＧＳＳＩＧＫＭＬＥＳＴＹＲＧＶＫＲＭＡＩＬＧＥＴＡＷＤＦＧＳＶＧＧＬＦＴＳＬＧＫＡＶＨＱＶＦＧＳＶＹＴＴＭＦＧＧＶＳＷＭＶＲＩＬＩＧＦＬＶＬＷＩＧＴＮＳＲＮＴＳＭＡＭＴＣＩＡＶＧＧＩＴＬＦＬＧＦＴＶＨＡ
配列番号３６－完全長エンベロープヌクレオチド配列ＤＥＮＶ４
配列番号３７
Ｃ８軽鎖－以下の表を参照
配列番号３８
抗体Ｃ１０軽鎖の完全配列－以下の表を参照
配列番号３９
抗体Ａ１１軽鎖の完全配列－以下の表を参照
配列番号４０
Ｂ７軽鎖 以下の表を参照
配列番号３７－－１３１ 以下の表からの抗体軽及び重鎖配列
Figure 0007433744000003
Figure 0007433744000004
Figure 0007433744000005
Figure 0007433744000006
Figure 0007433744000007
Figure 0007433744000008
Figure 0007433744000009
Figure 0007433744000010
Figure 0007433744000011
Figure 0007433744000012
Figure 0007433744000013
Figure 0007433744000014
Figure 0007433744000015
Figure 0007433744000016
Figure 0007433744000017
Figure 0007433744000018
Figure 0007433744000019
配列番号１３２
エンベロープ外部ドメインタンパク質配列ＤＥＮＶ１
ＦＨＬＴＴＲＧＧＥＰＨＭＩＶＳＫＱＥＲＧＫＳＬＬＦＫＴＳＡＧＶＮＭＣＴＬＩＡＭＤＬＧＥＬＣＥＤＴＭＴＹＫＣＰＲＩＴＥＡＥＰＤＤＶＤＣＷＣＮＡＴＤＴＷＶＴＹＧＴＣＳＱＴＧＥＨＲＲＤＫＲＳＶＡＬＡＰＨＶＧＬＧＬＥＴＲＴＥＴＷＭＳＳＥＧＡＷＫＱＩＱＫＶＥＴＷＡＬＲＨＰＧＦＴＶＩＡＬＦＬＡＨＡＩＧＴＳＩＴＱＫＧＩＩＦＩＬＬＭＬＶＴＰＳＭＡＭＲＣＶＧＩＧＮＲＤＦＶＥＧＬＳＧＡＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＳＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＩＥＬＬＫＴＥＶＴＮＰＡＶＬＲＫＬＣＩＥＡＫＩＳＮＴＴＴＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＴＬＶＥＥＱＤＡＮＦＶＣＲＲＴＶＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＬＴＣＡＫＦＫＣＶＴＫＬＥＧＫＩＶＱＹＥＮＬＫＹＳＶＩＶＴＶＨＴＧＤＱＨＱＶＧＮＥＴＴＥＨＧＴＩＡＴＩＴＰＱＡＰＴＳＥＩＱＬＴＤＹＧＴＬＴＬＤＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＶＶＬＬＴＭＫＥＫＳＷＬＶＨＫＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＴＳＧＡＳＴＳＱＥＴＷＮＲＱＤＬＬＶＴＦＫＴＡＨＡＫＫＱＥＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＴＳＧＴＴＴＩＦＡＧＨＬＫＣＲＬＫＭＤＫＬＴＬＫＧＭＳＹＶＭＣＴＧＳＦＫＬＥＫＥＶＡＥＴＱＨＧＴＶＬＶＱＶＫＹＥＧＴＤＡＰＣＫＩＰＦＳＴＱＤＥＫＧＶＴＱＮＧＲＬＩＴＡＮＰＩＶＴＤＫＥＫＰＩＮＩＥＴＥＰＰＦＧＥＳＹＩＩＶＧＡＧＥＫＡＬＫＬＳＷＦＫＫＧ
配列番号１３３
エンベロープ外部ドメインタンパク質配列ＤＥＮＶ２
ＭＲＣＩＧＩＳＮＲＤＦＶＥＧＶＳＧＧＳＷＶＤＩＶＬＥＨＧＳＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＦＥＬＩＫＴＥＡＫＱＰＡＴＬＲＫＹＣＩＥＡＫＬＴＮＴＴＴＥＳＲＣＰＴＱＧＥＰＳＬＮＥＥＱＤＫＲＦＩＣＫＨＳＭＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＧＩＶＴＣＡＫＦＴＣＫＫＮＭＥＧＫＩＶＱＰＥＮＬＥＹＴＩＶＩＴＰＨＳＧＥＥＨＡＶＧＮＤＴＧＫＨＧＫＥＩＫＩＴＰＱＳＳＴＴＥＡＥＬＴＧＹＧＴＶＴＭＥＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＶＬＬＱＭＥＤＫＡＷＬＶＨＲＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＬＰＧＡＤＴＱＧＳＮＷＩＱＫＥＴＬＶＴＦＫＮＰＨＡＫＫＱＤＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＭＳＳＧＮＬＬＦＴＧＨＬＫＣＲＬＲＭＤＫＬＱＬＫＧＭＳＹＳＭＣＴＧＫＦＫＩＶＫＥＩＡＥＴＱＨＧＴＩＶＩＲＶＱＹＥＧＤＧＳＰＣＫＩＰＦＥＩＴＤＬＥＫＲＨＶＬＧＲＬＩＴＶＮＰＩＶＴＥＫＤＳＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＤＳＹＩＩＶＧＶＥＰＧＱＬＫＬＮＷＦＫＲＧ
配列番号１３４
エンベロープ外部ドメインタンパク質配列ＤＥＮＶ３
ＦＨＬＴＳＲＤＧＥＰＲＭＩＶＧＫＮＥＲＧＫＳＬＬＦＫＴＡＳＧＩＮＭＣＴＬＩＡＭＤＬＧＥＭＣＤＤＴＶＴＹＫＣＰＨＩＴＥＶＥＰＥＤＩＤＣＷＣＮＬＴＳＴＷＶＴＹＧＴＣＮＱＡＧＥＨＲＲＤＫＲＳＶＡＬＡＰＨＶＧＭＧＬＤＴＲＴＱＴＷＭＳＡＥＧＡＷＲＱＶＥＫＶＥＴＷＡＬＲＨＰＧＦＴＩＬＡＬＦＬＡＨＹＩＧＴＳＬＴＱＫＶＶＩＦＩＬＬＭＬＶＴＰＳＭＴＭＲＣＶＧＶＧＮＲＤＦＶＥＧＬＳＧＡＴＷＶＤＶＶＬＥＨＧＧＣＶＴＴＭＡＫＮＫＰＴＬＤＩＥＬＱＫＴＥＡＴＱＬＡＴＬＲＫＬＣＩＥＧＫＩＴＮＩＴＴＤＳＲＣＰＴＱＧＥＡＩＬＰＥＥＱＤＱＮＹＶＣＫＨＴＹＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＱＣＬＥＳＩＥＧＫＶＶＱＨＥＮＬＫＹＴＶＩＩＴＶＨＴＧＤＱＨＱＶＧＮＥＴＱＧＶＴＡＥＩＴＳＱＡＳＴＡＥＡＩＬＰＥＹＧＴＬＧＬＥＣＳＰＲＴＧＬＤＦＮＥＭＩＬＬＴＭＫＮＫＡＷＭＶＨＲＱＷＦＦＤＬＰＬＰＷＴＳＧＡＴＴＫＴＰＴＷＮＲＫＥＬＬＶＴＦＫＮＡＨＡＫＫＱＥＶＶＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＴＡＬＴＧＡＴＥＩＱＴＳＧＧＴＳＩＦＡＧＨＬＫＣＲＬＫＭＤＫＬＫＬＫＧＭＳＹＡＭＣＬＮＴＦＶＬＫＫＥＶＳＥＴＱＨＧＴＩＬＩＫＶＥＹＫＧＥＤＡＰＣＫＩＰＦＳＴＥＤＧＱＧＫＡＨＮＧＲＬＩＴＡＮＰＶＶＴＫＫＥＥＰＶＮＩＥＡＥＰＰＦＧＥＳＮＩＶＩＧＩＧＤＫＡＬＫＩＮＷＹＲＫＧ
配列番号１３５
エンベロープ外部ドメインタンパク質配列ＤＥＮＶ４
ＦＳＬＳＴＲＤＧＥＰＬＭＩＶＡＫＨＥＲＧＲＰＬＬＦＫＴＴＥＧＩＮＫＣＴＬＩＡＭＤＬＧＥＭＣＥＤＴＶＴＹＫＣＰＬＬＶＮＴＥＰＥＤＩＤＣＷＣＮＬＴＳＴＷＶＭＹＧＴＣＴＱＳＧＥＲＲＲＥＫＲＳＶＡＬＴＰＨＳＧＭＧＬＥＴＲＡＥＴＷＭＳＳＥＧＡＷＫＨＡＱＲＶＥＳＷＩＬＲＮＰＧＦＡＬＬＡＧＦＭＡＹＭＩＧＱＴＧＩＱＲＴＶＦＦＶＬＭＭＬＶＡＰＳＹＧＭＲＣＶＧＶＧＮＲＤＦＶＥＧＶＳＧＧＡＷＶＤＬＶＬＥＨＧＧＣＶＴＴＭＡＱＧＫＰＴＬＤＦＥＬＴＫＴＴＡＫＥＶＡＬＬＲＴＹＣＩＥＡＳＩＳＮＩＴＴＡＴＲＣＰＴＱＧＥＰＹＬＫＥＥＱＤＱＱＹＩＣＲＲＤＶＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫＧＧＶＶＴＣＡＫＦＳＣＳＧＫＩＴＧＮＬＶＱＩＥＮＬＥＹＴＶＶＶＴＶＨＮＧＤＴＨＡＶＧＮＤＴＳＮＨＧＶＴＡＭＩＴＰＲＳＰＳＶＥＶＫＬＰＤＹＧＥＬＴＬＤＣＥＰＲＳＧＩＤＦＮＥＭＩＬＭＫＭＫＫＫＴＷＬＶＨＫＱＷＦＬＤＬＰＬＰＷＴＡＧＡＤＴＳＥＶＨＷＮＹＫＥＲＭＶＴＦＫＶＰＨＡＫＲＱＤＶＴＶＬＧＳＱＥＧＡＭＨＳＡＬＡＧＡＴＥＶＤＳＧＤＧＮＨＭＦＡＧＨＬＫＣＫＶＲＭＥＫＬＲＩＫＧＭＳＹＴＭＣＳＧＫＦＳＩＤＫＥＭＡＥＴＱＨＧＴＴＶＶＫＶＫＹＥＧＡＧＡＰＣＫＶＰＩＥＩＲＤＶＮＫＥＫＶＶＧＲＩＩＳＳＴＰＬＡＥＮＴＮＳＶＴＮＩＥＬＥＰＰＦＧＤＳＹＩＶＩＧＶＧＮＳＡＬＴＬＨＷＦＲＫＧ
配列番号１３６
エンベロープ 外部ドメイン ヌクレオチド配列 ＤＥＮＶ１
ｔｔｃｃａｔｔｔｇａ ｃｃａｃａｃｇａｇｇ ｇｇｇａｇａｇｃｃａ ｃａｃａｔｇａｔａｇ ｔｔａｇｔａａｇｃａ ｇｇａａａｇａｇｇａ
ａａｇｔｃａｃｔｃｔ ｔｇｔｔｃａａｇａｃ ｃｔｃｔｇｃａｇｇｔ ｇｔｃａａｔａｔｇｔ ｇｃａｃｔｃｔｃａｔ ｔｇｃｇａｔｇｇａｔ
ｔｔｇｇｇａｇａｇｔ ｔａｔｇｔｇａｇｇａ ｃａｃａａｔｇａｃｔ ｔａｃａａａｔｇｃｃ ｃｃｃｇｇａｔｃａｃ ｔｇａｇｇｃｇｇａａ
ｃｃａｇａｔｇａｃｇ ｔｔｇａｃｔｇｃｔｇ ｇｔｇｃａａｔｇｃｃ ａｃａｇａｃａｃａｔ ｇｇｇｔｇａｃｃｔａ ｔｇｇｇａｃｇｔｇｔ
ｔｃｔｃａａａｃｃｇ ｇｔｇａａｃａｃｃｇ ａｃｇａｇａｃａａａ ｃｇｔｔｃｃｇｔｇｇ ｃａｃｔｇｇｃｃｃｃ ａｃａｃｇｔｇｇｇａ
ｃｔｔｇｇｔｃｔａｇ ａａａｃａａｇａａｃ ｃｇａａａｃａｔｇｇ ａｔｇｔｃｃｔｃｔｇ ａａｇｇｃｇｃｃｔｇ ｇａａａｃａａａｔａ
ｃａａａａａｇｔｇｇ ａｇａｃｔｔｇｇｇｃ ｔｔｔｇａｇａｃａｃ ｃｃａｇｇａｔｔｃａ ｃｇｇｔｇａｔａｇｃ ｔｃｔｔｔｔｔｔｔａ
ｇｃａｃａｔｇｃｃａ ｔａｇｇａａｃａｔｃ ｃａｔｃａｃｔｃａｇ ａａａｇｇｇａｔｃａ ｔｔｔｔｃａｔｔｃｔ ｇｃｔｇａｔｇｃｔｇ
ｇｔａａｃａｃｃａｔ ｃａａｔｇｇｃｃａｔ ｇｃｇａｔｇｃｇｔｇ ｇｇａａｔａｇｇｃａ ａｃａｇａｇａｃｔｔ ｃｇｔｔｇａａｇｇａ
ｃｔｇｔｃａｇｇａｇ ｃａａｃｇｔｇｇｇｔ ｇｇａｃｇｔｇｇｔａ ｔｔｇｇａｇｃａｔｇ ｇａａｇｃｔｇｃｇｔ ｃａｃｃａｃｃａｔｇ
ｇｃａａａａａａｔａ ａａｃｃａａｃａｔｔ ｇｇａｃａｔｔｇａａ ｃｔｃｔｔｇａａｇａ ｃｇｇａｇｇｔｃａｃ ｇａａｃｃｃｔｇｃｃ
ｇｔｃｔｔｇｃｇｃａ ａａｔｔｇｔｇｃａｔ ｔｇａａｇｃｔａａａ ａｔａｔｃａａａｃａ ｃｃａｃｃａｃｃｇａ ｔｔｃａａｇａｔｇｔ
ｃｃａａｃａｃａａｇ ｇａｇａｇｇｃｔａｃ ａｃｔｇｇｔｇｇａａ ｇａａｃａａｇａｃｇ ｃｇａａｃｔｔｔｇｔ ｇｔｇｔｃｇａｃｇａ
ａｃｇｇｔｔｇｔｇｇ ａｃａｇａｇｇｃｔｇ ｇｇｇｃａａｔｇｇｃ ｔｇｃｇｇａｃｔａｔ ｔｔｇｇａａａａｇｇ ａａｇｃｃｔａｃｔｇ
ａｃｇｔｇｔｇｃｔａ ａｇｔｔｃａａｇｔｇ ｔｇｔｇａｃａａａａ ｃｔｇｇａａｇｇａａ ａｇａｔａｇｔｔｃａ ａｔａｔｇａａａａｃ
ｔｔａａａａｔａｔｔ ｃａｇｔｇａｔａｇｔ ｃａｃｔｇｔｃｃａｃ ａｃａｇｇｇｇａｃｃ ａｇｃａｃｃａｇｇｔ ｇｇｇａａａｃｇａｇ
ａｃｔａｃａｇａａｃ ａｔｇｇａａｃａａｔ ｔｇｃａａｃｃａｔａ ａｃａｃｃｔｃａａｇ ｃｔｃｃｔａｃｇｔｃ ｇｇａａａｔａｃａｇ
ｔｔｇａｃａｇａｃｔ ａｃｇｇａａｃｃｃｔ ｔａｃａｃｔｇｇａｃ ｔｇｃｔｃａｃｃｃａ ｇａａｃａｇｇｇｃｔ ｇｇａｃｔｔｔａａｔ
ｇａｇｇｔｇｇｔｇｃ ｔａｔｔｇａｃａａｔ ｇａａａｇａａａａａ ｔｃａｔｇｇｃｔｔｇ ｔｃｃａｃａａａｃａ ａｔｇｇｔｔｔｃｔａ
ｇａｃｔｔａｃｃａｃ ｔｇｃｃｔｔｇｇａｃ ｔｔｃｇｇｇｇｇｃｔ ｔｃａａｃａｔｃｃｃ ａａｇａｇａｃｔｔｇ ｇａａｃａｇａｃａａ
ｇａｔｔｔｇｃｔｇｇ ｔｃａｃａｔｔｃａａ ｇａｃａｇｃｔｃａｔ ｇｃａａａｇａａｇｃ ａｇｇａａｇｔａｇｔ ｃｇｔａｃｔｇｇｇａ
ｔｃａｃａｇｇａａｇ ｇａｇｃａａｔｇｃａ ｃａｃｔｇｃｇｔｔｇ ａｃｃｇｇｇｇｃｇａ ｃａｇａａａｔｃｃａ ｇａｃｇｔｃａｇｇａ
ａｃｇａｃａａｃａａ ｔｃｔｔｔｇｃａｇｇ ａｃａｃｃｔｇａａａ ｔｇｃａｇａｔｔａａ ａａａｔｇｇａｔａａ ａｃｔｇａｃｔｔｔａ
ａａａｇｇｇａｔｇｔ ｃａｔａｔｇｔｇａｔ ｇｔｇｃａｃａｇｇｃ ｔｃａｔｔｔａａｇｃ ｔａｇａｇａａｇｇａ ａｇｔｇｇｃｔｇａｇ
ａｃｃｃａｇｃａｔｇ ｇａａｃｔｇｔｃｃｔ ａｇｔｇｃａｇｇｔｔ ａａａｔａｃｇａａｇ ｇａａｃａｇａｔｇｃ ｇｃｃａｔｇｃａａｇ
ａｔｃｃｃｃｔｔｔｔ ｃｇａｃｃｃａａｇａ ｔｇａｇａａａｇｇａ ｇｔｇａｃｃｃａｇａ ａｔｇｇｇａｇａｔｔ ｇａｔａａｃａｇｃｃ
ａａｔｃｃｃａｔａｇ ｔｔａｃｔｇａｃａａ ａｇａａａａａｃｃａ ａｔｃａａｃａｔｔｇ ａｇａｃａｇａａｃｃ ａｃｃｔｔｔｔｇｇｔ
ｇａｇａｇｃｔａｃａ ｔｃａｔａｇｔａｇｇ ｇｇｃａｇｇｔｇａａ ａａａｇｃｔｔｔｇａ ａａｃｔａａｇｃｔｇ ｇｔｔｃａａｇａａａ
ｇｇａ
配列番号１３７
エンベロープ外部ドメイン ヌクレオチド配列ＤＥＮＶ２
ｔｔｃｃａｔｔｔａａ ｃｃａｃａｃｇｔａａ ｃｇｇａｇａａｃｃａ ｃａｃａｔｇａｔｃｇ ｔｃａｇｔａｇａｃａ ａｇａｇａａａｇｇｇ
ａａａａｇｔｃｔｔｃ ｔｇｔｔｔａａａａｃ ａｇａｇｇａｔｇｇｔ ｇｔｇａａｃａｔｇｔ ｇｔａｃｃｃｔｃａｔ ｇｇｃｃａｔｇｇａｃ
ｃｔｔｇｇｔｇａａｔ ｔｇｔｇｔｇａａｇａ ｔａｃａａｔｃａｃｇ ｔａｃａａｇｔｇｔｃ ｃｔｔｔｔｃｔｃａｇ ｇｃａｇａａｔｇａａ
ｃｃａｇａａｇａｃａ ｔａｇａｔｔｇｔｔｇ ｇｔｇｃａａｃｔｃｔ ａｃｇｔｃｃａｃａｔ ｇｇｇｔａａｃｔｔａ ｔｇｇｇａｃｇｔｇｔ
ａｃｃａｃｃａｃａｇ ｇａｇａａｃａｃａｇ ａａｇａｇａａａａａ ａｇａｔｃａｇｔｇｇ ｃａｃｔｃｇｔｔｃｃ ａｃａｔｇｔｇｇｇａ
ａｔｇｇｇａｃｔｇｇ ａｇａｃａｃｇａａｃ ｔｇａａａｃａｔｇｇ ａｔｇｔｃａｔｃａｇ ａａｇｇｇｇｃｃｔｇ ｇａａａｃａｔｇｃｃ
ｃａｇａｇａａｔｔｇ ａａａｃｔｔｇｇａｔ ｃｔｔｇａｇａｃａｔ ｃｃａｇｇｃｔｔｔａ ｃｃａｔａａｔｇｇｃ ａｇｃａａｔｃｃｔｇ
ｇｃａｔａｃａｃｃａ ｔａｇｇａａｃｇａｃ ａｃａｔｔｔｃｃａａ ａｇａｇｃｃｃｔｇａ ｔｔｔｔｃａｔｃｔｔ ａｃｔｇａｃａｇｃｔ
ｇｔｃｇｃｔｃｃｔｔ ｃａａｔｇａｃａａｔ ｇｃｇｔｔｇｃａｔａ ｇｇａａｔａｔｃａａ ａｔａｇａｇａｃｔｔ ｔｇｔａｇａａｇｇｇ
ｇｔｔｔｃａｇｇａｇ ｇａａｇｃｔｇｇｇｔ ｔｇａｃａｔａｇｔｃ ｔｔａｇａａｃａｔｇ ｇａａｇｃｔｇｔｇｔ ｇａｃｇａｃｇａｔｇ
ｇｃａａａａａａｃａ ａａｃｃａａｃａｔｔ ｇｇａｔｔｔｔｇａａ ｃｔｇａｔａａａａａ ｃａｇａａｇｃｃａａ ａｃａａｃｃｔｇｃｃ
ａｃｔｃｔａａｇｇａ ａｇｔａｃｔｇｔａｔ ａｇａｇｇｃａａａｇ ｃｔｇａｃｃａａｃａ ｃａａｃａａｃａｇａ ｔｔｃｔｃｇｃｔｇｃ
ｃｃａａｃａｃａａｇ ｇａｇａａｃｃｃａｇ ｃｃｔａａａｔｇａａ ｇａｇｃａｇｇａｃａ ａａａｇｇｔｔｃｇｔ ｃｔｇｃａａａｃａｃ
ｔｃｃａｔｇｇｔｇｇ ａｃａｇａｇｇａｔｇ ｇｇｇａａａｔｇｇａ ｔｇｔｇｇａｔｔａｔ ｔｔｇｇａａａａｇｇ ａｇｇｃａｔｔｇｔｇ
ａｃｃｔｇｔｇｃｔａ ｔｇｔｔｃａｃａｔｇ ｃａａａａａｇａａｃ ａｔｇａａａｇｇａａ ａａｇｔｃｇｔｇｃａ ａｃｃａｇａａａａｃ
ｔｔｇｇａａｔａｃａ ｃｃａｔｔｇｔｇａｔ ａａｃａｃｃｔｃａｃ ｔｃａｇｇｇｇａａｇ ａｇｃａｔｇｃａｇｔ ｃｇｇａａａｔｇａｃ
ａｃａｇｇａａａａｃ ａｔｇｇｃａａｇｇａ ａａｔｃａａａａｔａ ａｃａｃｃａｃａｇａ ｇｔｔｃｃａｔｃａｃ ａｇａａｇｃａｇａｇ
ｔｔｇａｃａｇｇｃｔ ａｔｇｇｃａｃｔｇｔ ｃａｃｇａｔｇｇａｇ ｔｇｃｔｃｔｃｃｇａ ｇａａｃｇｇｇｃｃｔ ｃｇａｃｔｔｃａａｔ
ｇａｇａｔｇｇｔｇｔ ｔｇｃｔｇｃａａａｔ ｇｇａａａａｔａａａ ｇｃｔｔｇｇｃｔｇｇ ｔｇｃａｃａｇｇｃａ ａｔｇｇｔｔｃｃｔａ
ｇａｃｃｔｇｃｃｇｔ ｔｇｃｃａｔｇｇｃｔ ｇｃｃｃｇｇａｇｃｇ ｇａｃａｃａｃａａｇ ｇａｔｃａａａｔｔｇ ｇａｔａｃａｇａａａ
ｇａｇａｃａｔｔｇｇ ｔｇａｃｔｔｔｃａａ ａａａｔｃｃｃｃａｔ ｇｃｇａａｇａａａｃ ａｇｇａｔｇｔｔｇｔ ｔｇｔｔｔｔｇｇｇａ
ｔｃｃｃａａｇａａｇ ｇｇｇｃｃａｔｇｃａ ｃａｃａｇｃａｃｔｃ ａｃａｇｇｇｇｃｃａ ｃａｇａａａｔｃｃａ ｇａｔｇｔｃａｔｃａ
ｇｇａａａｃｔｔａｃ ｔｇｔｔｃａｃａｇｇ ａｃａｔｃｔｃａａｇ ｔｇｃａｇｇｃｔｇａ ｇｇａｔｇｇａｃａａ ａｃｔａｃａｇｃｔｃ
ａａａｇｇａａｔｇｔ ｃａｔａｃｔｃｔａｔ ｇｔｇｃａｃａｇｇａ ａａｇｔｔｔａａａｇ ｔｔｇｔｇａａｇｇａ ａａｔａｇｃａｇａａ
ａｃａｃａａｃａｔｇ ｇａａｃａａｔａｇｔ ｔａｔｃａｇａｇｔａ ｃａａｔａｔｇａａｇ ｇｇｇａｃｇｇｔｔｃ ｔｃｃａｔｇｔａａｇ
ａｔｃｃｃｔｔｔｔｇ ａｇａｔａａｔｇｇａ ｔｔｔｇｇａａａａａ ａｇａｃａｔｇｔｔｔ ｔａｇｇｔｃｇｃｃｔ ｇａｔｔａｃａｇｔｃ
ａａｃｃｃａａｔｃｇ ｔａａｃａｇａａａａ ａｇａｔａｇｃｃｃａ ｇｔｃａａｃａｔａｇ ａａｇｃａｇａａｃｃ ｔｃｃａｔｔｃｇｇａ
ｇａｃａｇｃｔａｃａ ｔｃａｔｃａｔａｇｇ ａｇｔａｇａｇｃｃｇ ｇｇａｃａａｔｔｇａ ａｇｃｔｃａａｃｔｇ ｇｔｔｔａａｇａａａ
ｇｇａ
配列番号１３８
エンベロープ 外部ドメイン ヌクレオチド配列 ＤＥＮＶ３
ｔｔｃｃａｃｔｔａａ ｃｔｔｃａｃｇａｇａ ｔｇｇａｇａｇｃｃｇ ｃｇｃａｔｇａｔｔｇ ｔｇｇｇｇａａｇａａ ｔｇａａａｇａｇｇａ
ａａａｔｃｃｃｔａｃ ｔｔｔｔｔａａｇａｃ ａｇｃｃｔｃｔｇｇａ ａｔｃａａｃａｔｇｔ ｇｃａｃａｃｔｃａｔ ａｇｃｃａｔｇｇａｔ
ｔｔｇｇｇａｇａｇａ ｔｇｔｇｔｇａｔｇａ ｃａｃｇｇｔｃａｃｔ ｔａｃａａａｔｇｃｃ ｃｃｃａｃａｔｔａｃ ｃｇａａｇｔｇｇａｇ
ｃｃｔｇａａｇａｃａ ｔｔｇａｃｔｇｔｔｇ ｇｔｇｃａａｃｃｔｔ ａｃａｔｃｇａｃａｔ ｇｇｇｔｇａｃｔｔａ ｔｇｇａａｃａｔｇｃ
ａａｔｃａａｇｃｔｇ ｇａｇａｇｃａｔａｇ ａｃｇｃｇａｔａａｇ ａｇａｔｃａｇｔｇｇ ｃｇｔｔａｇｃｔｃｃ ｃｃａｔｇｔｃｇｇｃ
ａｔｇｇｇａｃｔｇｇ ａｃａｃａｃｇｃａｃ ｔｃａａａｃｃｔｇｇ ａｔｇｔｃｇｇｃｔｇ ａａｇｇａｇｃｔｔｇ ｇａｇａｃａａｇｔｃ
ｇａｇａａｇｇｔａｇ ａｇａｃａｔｇｇｇｃ ｃｃｔｔａｇｇｃａｃ ｃｃａｇｇｇｔｔｔａ ｃｃａｔａｃｔａｇｃ ｃｃｔａｔｔｔｃｔｔ
ｇｃｃｃａｔｔａｃａ ｔａｇｇｃａｃｔｔｃ ｃｔｔｇａｃｃｃａｇ ａａａｇｔｇｇｔｔａ ｔｔｔｔｔａｔａｃｔ ａｔｔａａｔｇｃｔｇ
ｇｔｔａｃｃｃｃａｔ ｃｃａｔｇａｃａａｔ ｇａｇａｔｇｔｇｔｇ ｇｇａｇｔａｇｇａａ ａｃａｇａｇａｔｔｔ ｔｇｔｇｇａａｇｇｃ
ｃｔａｔｃｇｇｇａｇ ｃｔａｃｇｔｇｇｇｔ ｔｇａｃｇｔｇｇｔｇ ｃｔｃｇａｇｃａｃｇ ｇｔｇｇｇｔｇｔｇｔ ｇａｃｔａｃｃａｔｇ
ｇｃｔａａｇａａｃａ ａｇｃｃｃａｃｇｃｔ ｇｇａｃａｔａｇａｇ ｃｔｔｃａｇａａｇａ ｃｔｇａｇｇｃｃａｃ ｔｃａｇｃｔｇｇｃｇ
ａｃｃｃｔａａｇｇａ ａｇｃｔａｔｇｃａｔ ｔｇａｇｇｇａａａａ ａｔｔａｃｃａａｃａ ｔａａｃａａｃｃｇａ ｃｔｃａａｇａｔｇｔ
ｃｃｃａｃｃｃａａｇ ｇｇｇａａｇｃｇａｔ ｔｔｔａｃｃｔｇａｇ ｇａｇｃａｇｇａｃｃ ａｇａａｃｔａｃｇｔ ｇｔｇｔａａｇｃａｔ
ａｃａｔａｃｇｔｇｇ ａｃａｇａｇｇｃｔｇ ｇｇｇａａａｃｇｇｔ ｔｇｔｇｇｔｔｔｇｔ ｔｔｇｇｃａａｇｇｇ ａａｇｃｔｔｇｇｔｇ
ａｃａｔｇｃｇｃｇａ ａａｔｔｔｃａａｔｇ ｔｔｔａｇａａｔｃａ ａｔａｇａｇｇｇａａ ａａｇｔｇｇｔｇｃａ ａｃａｔｇａｇａａｃ
ｃｔｃａａａｔａｃａ ｃｃｇｔｃａｔｃａｔ ｃａｃａｇｔｇｃａｃ ａｃａｇｇａｇａｃｃ ａａｃａｃｃａｇｇｔ ｇｇｇａａａｔｇａａ
ａｃｇｃａｇｇｇａｇ ｔｔａｃｇｇｃｔｇａ ｇａｔａａｃａｔｃｃ ｃａｇｇｃａｔｃａａ ｃｃｇｃｔｇａａｇｃ ｃａｔｔｔｔａｃｃｔ
ｇａａｔａｔｇｇａａ ｃｃｃｔｃｇｇｇｃｔ ａｇａａｔｇｃｔｃａ ｃｃａｃｇｇａｃａｇ ｇｔｔｔｇｇａｔｔｔ ｃａａｔｇａａａｔｇ
ａｔｔｔｔａｔｔｇａ ｃａａｔｇａａｇａａ ｃａａａｇｃａｔｇｇ ａｔｇｇｔａｃａｔａ ｇａｃａａｔｇｇｔｔ ｃｔｔｔｇａｃｔｔａ
ｃｃｃｃｔａｃｃａｔ ｇｇａｃａｔｃａｇｇ ａｇｃｔａｃａａｃａ ａａａａｃａｃｃａａ ｃｔｔｇｇａａｃａｇ ｇａａａｇａｇｃｔｔ
ｃｔｔｇｔｇａｃａｔ ｔｔａａａａａｔｇｃ ａｃａｔｇｃａａａａ ａａｇｃａａｇａａｇ ｔａｇｔｔｇｔｃｃｔ ｔｇｇａｔｃａｃａａ
ｇａｇｇｇａｇｃａａ ｔｇｃａｔａｃａｇｃ ａｃｔｇａｃａｇｇａ ｇｃｔａｃａｇａｇａ ｔｃｃａａａｃｃｔｃ ａｇｇａｇｇｃａｃａ
ａｇｔａｔｔｔｔｔｇ ｃｇｇｇｇｃａｃｔｔ ａａａａｔｇｔａｇａ ｃｔｃａａｇａｔｇｇ ａｃａａａｔｔｇａａ ａｃｔｃａａｇｇｇｇ
ａｔｇａｇｃｔａｔｇ ｃａａｔｇｔｇｃｔｔ ｇａａｔａｃｃｔｔｔ ｇｔｇｔｔｇａａｇａ ａａｇａａｇｔｃｔｃ ｃｇａａａｃｇｃａｇ
ｃａｔｇｇｇａｃａａ ｔａｃｔｃａｔｔａａ ｇｇｔｔｇａｇｔａｃ ａａａｇｇｇｇａａｇ ａｔｇｃａｃｃｃｔｇ ｃａａｇａｔｔｃｃｔ
ｔｔｃｔｃｃａｃｇｇ ａｇｇａｔｇｇａｃａ ａｇｇｇａａａｇｃｔ ｃａｃａａｔｇｇｃａ ｇａｃｔｇａｔｃａｃ ａｇｃｃａａｔｃｃａ
ｇｔｇｇｔｇａｃｃａ ａｇａａｇｇａｇｇａ ｇｃｃｔｇｔｃａａｃ ａｔｔｇａｇｇｃｔｇ ａａｃｃｔｃｃｔｔｔ ｔｇｇｇｇａａａｇｔ
ａａｔａｔａｇｔａａ ｔｔｇｇａａｔｔｇｇ ａｇａｃａａａｇｃｃ ｃｔｇａａａａｔｃａ ａｃｔｇｇｔａｃａｇ ｇａａｇｇｇａａ
配列番号１３９
エンベロープ外部ドメイン ヌクレオチド配列ＤＥＮＶ４
ｔｔｔｔｃｃｃｔｃａ ｇｃａｃａａｇａｇａ ｔｇｇｃｇａａｃｃｃ ｃｔｃａｔｇａｔａｇ ｔｇｇｃａａａａｃａ ｔｇａａａｇｇｇｇｇ
ａｇａｃｃｔｃｔｃｔ ｔｇｔｔｔａａｇａｃ ａａｃａｇａｇｇｇｇ ａｔｃａａｃａａａｔ ｇｃａｃｔｃｔｃａｔ ｔｇｃｃａｔｇｇａｃ
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配列番号１４０
Ａ１１ 軽鎖
ＱＳＶＬＴＱＰＶＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＮＡＤＴＹＮＬＶＳＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＧＴＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＡＳＫＳＡＴＡＡＳＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＣＳＹＡＴＳＲＴＬＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＶ
配列番号１４１
Ｂ７軽鎖
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配列番号１４２
Ａ１１のｖＨ鎖

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＹＳＮＨＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＲＩＮＳＤＧＳＴＲＮＹＡＤＦＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＴＡＤＤＴＡＶＹＹＣＶＲＤＧＶＲＦＹＹＤＳＴＧＹＹＰＤＳＦＦＫＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ配列番号１４３
ｖＨ Ｂ７
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＨＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＲＴＮＳＤＧＳＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＭＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＨＭＮＧＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＤＧＶＲＹＹＹＤＳＴＧＹＹＰＤＮＦＦＱＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ
配列番号１４４
ｖＨ Ｃ８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＴＹＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＴＧＥＧＤＳＡＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＦＥＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＧＧＹＳＮＦＹＹＹＹＴＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶ
配列番号１４５
ｖＬｉｇｈｔ Ｃ８
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配列番号１４６
ｖＨ Ｃ１０
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配列番号１４７
ｖＬ Ｃ１０

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Ｄｅｎｖ－１の１５０ループ
ＱＨＱＶＧＮＥＴＴＥＨＧ
配列番号１４９
Ｄｅｎｖ ２の１５０ループ
ＥＨＡＶＧＮＤＴＧＫＨＧ
配列番号１５０
Ｄｅｎｖ ３の１５０ループ
ＱＨＱＶＧＮＥＴＱＧ
配列番号１５１
Ｄｅｎｖ ４の１５０ループ
ＴＨＡＶＧＮＤＩＰＮＨＧ
実施例１７
安定したＥ二量体を得るためのＤＶ２ Ｅタンパク質の部位特異的な変異誘発
３Ｄ構造に基づいて、ジスルフィド結合を作製して、Ｅ二量体を安定化させるために、３つの異なるＥ突然変異体を生成した。１つ目はＡ２５９Ｃを有し、２つ目はＳ２５５Ｃを有し、３つ目は２つの同時に起こる変化：Ｌ１０７Ｃ及びＡ３１３Ｃを有した（図３２）。突然変異体は、上述のように、野生型ＤＶ－２ Ｅタンパク質のために開発した同じ手順を用いて、昆虫Ｓ２細胞において発現した。突然変異体Ａ２５９Ｃは、精製した二量体タンパク質の最高収率を得たが、その他の２つの構築物もまた、十分な量の架橋二量体を得た。突然変異体を、抗体結合及びマウス予防接種実験において、野生型と比較した。
１．突然変異体へのＦＬＥ及びＥＤＥ ｍＡｂの結合。
ＦＬＥ（融合ループエピトープ）、ＥＤＥ（エンベロープ二量体エピトープ）、及びその他（非ＦＬＥ）ｍＡｂの一団を、ＥＬＩＳＡによって突然変異体及びＷＴタンパク質において試験した。図３３～３６は、Ａ２５９Ｃ突然変異体及びＷＴにおいてＦＬＥ及びＥＤＥ ｍＡｂの結合活性を示す。
図３７～４０は、Ｌ１０７／Ａ３１３突然変異体及びＷＴにおいてＦＬＥ及びＥＤＥ ｍＡｂの結合活性を示す。
２ Ａ２５９Ｃ突然変異体によるマウス予防接種
マウスを６つの群に設定し、下述のように、プライム予防接種を行い、続いて、ブースター予防接種を行った。
群１ Ｅ ＷＴを用いたプライム及びブースト。Ｅ ＷＴ（単量体／単量体）
群２、Ｅ Ａ２５９Ｃ 突然変異体を用いたプライム及びブースト（二量体／二量体）
群３ ｐｒＭ／Ｅウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いたプライム及びブースト（ＶＬＰ／ＶＬＰ）
群４ Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたプライム、続いて、ＶＬＰを用いたブースト（二量体／ＶＬＰ）
群５ ＶＬＰを用いたプライム、続いて、Ｅ Ａ２５９Ｃ突然変異体を用いたブースト（ＶＬＰ／二量体）
群６ 対照マウス（偽物）
図４１～４６は、抗Ｅ抗体力価、発現Ｅドメイン１～３（３つすべてのドメイン）、ドメイン１～２及びドメイン３を発現する酵母への結合、血清型交差反応性、昆虫及びＤＣウイルスにおける中和反応、ならびに昆虫ウイルスにおけるＡＤＥを示す。
方法
組換え可溶性ＤＥＮＶエンベロープタンパク質結合ＥＬＩＳＡ
組換え可溶性ＤＥＮＶエンベロープタンパク質（ｒＥ）へのヒトモノクローナルＡｂの結合親和性を決定するために、Ｎｕｎｃイモビライザーアミノプレート（４３６００６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６（Ｃ３０４１、Ｓｉｇｍａ）中の１０ｕｇ／ｍｌのうちの５０ｕｌのｒＥ ＤＥＮＶ２ 野生型単量体（ＷＴ）、突然変異体二量体（Ａ２５９ＣもしくはＬ１０７Ｃ／Ａ３１３Ｃ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、陰性対照）で直接コーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、２００ｕｌの遮断緩衝液（ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ）で、室温で１時間遮断し、続いて、遮断緩衝液中の１～１０ｕｇ／ｍｌのうちの５０ｕｌのヒトモノクローナルＡｂで、３７℃で１時間遮断した。その後、プレートを３回再度洗浄し、遮断緩衝液（Ａ９５４４、Ｓｉｇｍａ）中の１：１０，０００希釈の５０ｕｌのＡＬＰ共役抗ヒトＩｇＧで、３７℃で１時間さらにインキュベートした。最後に、３回洗浄した後、１００ｕｌのＰＮＰＰ基質（Ｎ２７７０、Ｓｉｇｍａ）を添加し、室温で１時間放置した。この反応は、４０５ｎｍで測定した。
マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＨａｒｌａｎ ＵＫ（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、ＵＫ）から得た。マウスは、６～８週齢で使用した。すべての動物実験は、英国政府規制（Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｃｔ １９８６）に従って行われ、英国内務省によって承認された。
予防接種実験
マウスに、２％ アルヒドロゲル（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に共吸着した１％ ｖ／ｖの抗原（５μｇ）を腹腔内に投与した。抗原－ミョウバンの混合を注射前に約５分間静置した。プライムから３週間後、ミョウバン上に同様に吸着させた５μｇの抗原を含むブースター注射を打った。血清試料は、ブーストから３週間後に回収し、様々なアッセイについて試験した。ＤＶ２－ＶＬＰ上清を、ｐＨＬｓｅｃ－ｐｒＭ－ＥプラスミドＤＮＡとのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＰＥＩ媒介トランスフェクションによって生成した。ＵｌｔｒａＤｏｍａタンパク質フリー培地（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）中に回収されたＶＬＰ上清を、濃縮し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（１００ＫＤａカットオフ）を用いてＰＢＳに緩衝交換した。Ｅ－タンパク質を、捕捉ＥＬＩＳＡを用いて推定した。簡潔に言えば、ＶＬＰ上清を、マウス抗ＦＬ（４Ｇ２）を用いて捕捉し、Ｅタンパク質、３０－Ｅ２（患者から）に対してＤＥＮＶ特異的ヒト抗体、続いて、ヒトＩｇＧ（Ａ９５４４、Ｓｉｇｍａ）に対してＡＰ共役抗体を用いて検出した。比色分析反応は、ＰＮＰＰ基質を用いて発生させ、吸光度は４０５ｎｍで測定した。ＶＬＰ上清中のＥタンパク質は、精製したＥタンパク質単量体で生成した標準曲線の非線形回帰分析に基づいて定量化した。予防接種のために使用されるＥタンパク質の同等物は、約５ｍｇ／マウスの全タンパク質濃度に対応する約７ｎｇ／マウスであった。ＶＬＰ調製のための全タンパク質濃縮は、基準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄ方法によって行われた。
生ウイルスにおける抗Ｅ抗体の測定
様々なデング熱血清型で感染したＣ６３６細胞の上清からのウイルスは、１０μｇ／ｍｌのヒト抗ｐｒＭ抗体、３－１４７でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート（４４２４０４、ＮＵＮＣ）上で捕捉した。次いで、ウェルを、１％ ＢＳＡ中で希釈した様々な希釈のマウス血清でインキュベートし、続いて、１：２０００希釈のＦｃ特異的なヤギ抗マウスＩｇＧ－アルカリホスファターゼ共役体（Ａ２４２９、Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。反応を、ＰＮＰＰ基質の添加によって可視化し、この反応が０．４Ｎ ＮａＯＨで停止した後、吸光度を４０５ｎｍで読み出した。データをプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ｖ６．０３を用いて分析した。
中和アッセイ
マウス血清の中和の可能性は、感染した病巣の数の低減が対照（抗体なし）と比較する場合に、フォーカス低減中和試験（ＦＲＮＴ）を用いて判定した。ＦＲＮＴのために、＿ＥＮＲＥＦ＿１７ ５５マイクロリットルのＤＥＮＶ由来のＣ６／３６細胞（Ｃ６／３６ ＤＥＮＶ）またはＤＥＮＶ由来のＤＣ（ＤＣ－ＤＥＮＶ）を、等容積の連続３倍希釈（１：５０～１：３６４５０のマウス血清と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、５５マイクロリットルの混合物を、９６ウェルプレート中に２重でベロ細胞単分子層に移し、３７℃で３日間インキュベートした。次いで、フォーカス形成アッセイを、この細胞単分子層を２００ｕｌのＰＢＳで２回洗浄することによって行った。次いで、細胞を、１００ｕｌの３．７％ ホルムアルデヒドで、室温で１０分間固定し、次いで、ＰＢＳ中の１００ｕｌの２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で、室温で１０分間透過処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、５０ｕｌのマウスモノクローナル抗ＤＥＮＶ エンベロープＡｂ（４Ｇ２）を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、ＰＢＳ中の０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０／２％ＦＢＳ中の１：１０，０００希釈の５０ｕｌのＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐ０４４７、Ｄａｋｏ）で、３７℃で１時間インキュベートした。この反応は、ＤＡＢ基質（ＰＢＳ＋０．０５ｇ／ｍｌ ＤＡＢ＋０．０３％ Ｈ２Ｏ２＋０．３２％ ＮｉＣｌ２）の添加によって可視化した。フォーカス低減の割合は、各抗体希釈について計算された。
抗体依存性増強アッセイ
連続希釈した加熱不活性化マウス血清または対照抗体（抗ＦＬ：４Ｇ２）を、ＤＶ２ウイルスで、３７℃で１時間予めインキュベートした。次いで、ウイルス抗体複合体を、１×１０５個の細胞／ウェルに播種されたＵ９３７細胞（Ｆｃ受容体を担持するヒト単球細胞株）に移した。細胞を、ウイルス－抗体複合体で４日間インキュベートし、ウイルス力価は、検出のために、抗ＦＬ、４Ｇ２抗体を用いたフォーカス形成アッセイによって、ベロ細胞での力価によって決定された。ウイルス力価は、１ｍｌ当たりのフォーカス形成単位として読み出し、感染の増強倍率は、抗体の不在下で観察された力価に基づいて計算された。データをプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ｖ６．０３を用いて分析した。
結論
この実施例におけるさらなるデータは、正確に折り畳まれ、ＥＤＥ抗体に結合し、免疫原性である、二量体を作製することができることを示す。
図３２は、単一及び二重部位突然変異の位置を示す。Ａ２５９Ｃ突然変異体は、ＥＤＥ１抗体のパネルに結合する（図３３）。同様に、ＥＤＥ２パネル抗体結合もまた、Ａ２５９Ｃ突然変異体に結合する（図３４）。しかしながら、（図３５）ＦＬＥパネル抗体はまた、Ｅ単量体がＦＬＥへの接近を可能にする中央システイン結合の周りに旋回させることができるため、恐らく結合する（あまり望ましくないと見なされる）。同様に、「非ＦＬＥ」パネルの抗体（マッピングされていない抗体、非融合ループエピトープ（非ＦＬＥ）ｍＡｂ）と称される）は、Ａ２５９Ｃ二量体に結合する（図３６）。
同様に、二重突然変異体Ｌ１０７Ｃ及びＡ３１３Ｃは、ＥＤＥ１抗体（図３７）及びＥＤＥ２抗体（図３８）に結合する安定した二量体を形成する。しかしながら、この二重突然変異体は、両端で固定されており、ＦＬＥ抗体（図３９）によってあまり認識されず、これはＦＬＥ反応の生成を促進しなかった免疫原を好み得る場合に理想的である。非ＦＬＥ認識（図４０）があまりないが、これも良好である。
単量体、二量体、及びｖｌｐの異なる組み合わせを有する一連のマウス予防接種を図４１に示す。二量体＋／－ＶＬＰは、ＤＥＮＶ２ウイルス粒子を認識する良好な血清抗体を生成する（図４１）。ＶＬＰとの組み合わせは、良好な交差反応性のある結合反応を開始し（図４２）、良好な中和反応を提供することが期待される。四価またはプライムブーストアプローチは、広範な中和反応を生成することが必要とされ得る。
ＶＬＰは、５μｇのＥタンパク質当量で使用された、すなわち、Ｅ ＷＴ、突然変異体、及びＶＬＰの量は、５μｇであった。Ｅ ＷＴ及び突然変異体はタンパク質であり、ＯＤに基づいた濃度を測定されるが、一方、ＶＬＰ調製におけるＥ濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定され、ＷＴ Ｅタンパク質は、標準曲線を設定するために使用された。それ故に、Ｅタンパク質を、捕捉ＥＬＩＳＡを用いて推定した。簡潔に言えば、ＶＬＰ上清を、マウス抗ＦＬ（４Ｇ２）を用いて捕捉し、Ｅタンパク質、３０－Ｅ２（患者から）に対してＤＥＮＶ特異的ヒト抗体、続いて、ヒトＩｇＧ（Ａ９５４４、Ｓｉｇｍａ）に対してＡＰ共役抗体を用いて検出した。比色分析反応は、ＰＮＰＰ基質を用いて発生させ、吸光度は４０５ｎｍで測定した。ＶＬＰ上清中のＥタンパク質は、精製したＥタンパク質単量体で生成した標準曲線の非線形回帰分析に基づいて定量化した。５μｇのＶＬＰは、約７ｎｇのＥタンパク質当量を含有する全タンパク質に対応すると見なされる。
ＶＬＰは、単量体または二量体によって誘発されないであろう抗ｐｒＭ活性を誘発し得る。ＶＬＰによって誘発される抗ｐｒＭ活性は、ビリオン結合、交差反応性、ＡＤＥ、及び中和反応の結果の一因となり得る。
ＤＥＮＶ２の中和反応の結果は、昆虫（高ｐｒＭ；図４３）及びＤＣウイルス（低ｐｒＭ；図４４）の両方のウイルスにおいて単量体を上回る二量体からの優れた反応を示す。
図４５は、Ａ２５９Ｃ二量体に対して作り出された抗体が、依然として、ＡＤＥ（ＤＥＮＶ感染の抗体依存性増強）を生じ得ることを示す。Ａ２５９Ｃ二量体はまた、ＦＬ－Ａｂにも反応し、それ故に、強力なＡＤＥを生じ、ＥＤＥ Ａｂを取り換えるＦＬ様Ａｂを引き起こし得る。Ｌ１０７Ｃ／Ａ３１３Ｃ二量体がＡＤＥを誘発するかどうかはまだ知られていない。どの構成成分がＡＤＥには重要であるかを試験する１つの可能性としては、ＤＩＩＩの結合Ａｂからの血清を枯渇させ、再度ＡＤＥ試験を行うことである。
また、所望のＥＤＥ反応を増強し、あまり望ましくないＦＬＥ及び非ＦＬＥ／非ＥＤＥ反応を最小限に抑えるために、安定した二量体へのその他の空洞充填アプローチも行っている。二量体に新しい表面をつける広範囲の変異原性はまた、（あまり望ましくないＦＬＥ及び非ＦＬＥ／非ＥＤＥエピトープ／反応を隠すのに役立てるために）残基の突然変異またはグリカンの添加によって非ＥＤＥ準最適反応の生成をさらに低減するために行われる。
コアＥＤＥエピトープのモデリング及び最適化はまた、最適な配列を生成し、ＢＮＡ（広域中和抗体）を誘発するためにも行われる。
様々な異種技術を用いたプライム及びブーストは、ＥＤＥに集中させることが必要とされ得る。
有用であると見なされるさらなる二量体は、Ａ２５９Ｃ／Ｓ２５５Ｃ二重突然変異体であり、（Ｌ１０７Ｃ／Ｔ３１３Ｃ二重突然変異体と同様に）、ＦＬＥがあまり接近できない二量体を提供し得る。
ｋｌループを再形成し、ビリオン様立体構造を模倣すると見なされるさらなる突然変異は、上で論じられるように、Ｌ２７８Ｆである。単量体間にシステイン結合を構築し、二量体を形成するために、そのような突然変異及び１つ以上の突然変異の組み合わせが有用であり得る。
上述のように、ＥＤＥを提示する分子、例えば安定した二量体は、例えば、広域中和抗体に対してスクリーニングする際に有用であり得る。
実施例１８
ＥＤＥ構築物または結合化合物を最適化するためのさらなる戦略
タンパク質折り畳み
安定した二量体分子の適切な折り畳み及び組み立てを促進するために、ＥＤＥ結合化合物、例えば、Ｅタンパク質と同じ細胞中のＦａｂまたはｓｃＦｖを共発現することは、有用であり得る。これは、タンパク質折り畳みを援助すると見なされ、タンパク質凝集体を排除または低減させるのに役立ち得る。
ｐｒＭレベルの低減
ｐｒＭを欠いているＶＬＰを産生し、それによってそれらの免疫原性を増加させる可能性があることが望ましく、可能であり得る。
ｓｃＦｖの最適化
酵母ディスプレイスクリーニングは、例えば、最適化したｓｃＦｖのスクリーニングをするために使用され得る。既に特定されたｓｃＦｖは、例えば、無作為に（または非無作為に）突然変異され、酵母において発現され得る。４種の血清型からの組換え安定化Ｅ二量体が調製され、それぞれ、異なる色で区別され得る。ｓｃＦｖ発現酵母は、これらのタグ付けタンパク質、及び（ｓｃＦｖが、４種の血清型のそれぞれから安定化したＥ二量体に結合することができる場合に、選択された４色すべての色を持っている酵母細胞を用いて染色することができる。
酵母染色は、以下のことに基づいて遂行され得る。Ｅタンパク質ドメイン１＋２もしくはドメイン３または３つすべてのドメインを発現する酵母細胞を、ＰＢＳで洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ ＦＣＳ、０．５％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）中で再懸濁し、９６ウェルＵ底プレート中でアリコートした。マウス血清試料（１：３００に希釈）を、細胞に添加し、細胞を４℃で一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、１：１５０希釈のウサギ抗マウスＩｇ（Ｄａｋｏ Ｒ０４３９）のＰＥ共役（Ｆａｂ）２断片で染色した。細胞を４℃で３０分間染色し、ＰＢＳ中でウェルを洗浄し、ＰＢＳ中の１％ ＰＦＡを用いて固定した。データは、ＦＡＣＳｖｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ））を用いて分析した。

Claims (11)

  1. Ｅ－二量体であって、安定化組換えデング熱ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（ｓＥ）二量体であり、
    前記Ｅ－二量体は２つのｓＥ単量体間での少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合によって共有結合的に安定化された二量体であって、前記Ｅ－二量体の各単量体の少なくとも一つのアミノ酸がシステイン残基で置き換えられ、
    前記Ｅ－二量体は可溶性Ｅ－二量体であり、
    前記ｓＥ単量体は、
    ａ）突然変異Ａ２５９Ｃを含むまたは突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＡ３１３Ｃを含む、配列番号１３２、配列番号１３３及び配列番号１３５、及び
    ｂ）突然変異Ａ２５９Ｃを含むまたは突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＳ３１３Ｃを含む、配列番号１３４
    からなる群から選択される、Ｅ－二量体。
  2. 以下からなる群から選択される、請求項１に記載のＥ－二量体：
    ａ）請求項１に記載の前記突然変異Ａ２５９Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、前記残基２５９Ｃがジスルフィド鎖間結合を介して一緒に結合している、Ｅ－二量体；及び
    ｂ）請求項１に記載の前記突然変異Ｌ１０７Ｃ及びＡ３１３Ｃをそれぞれ有する突然変異体ｓＥのホモ二量体であり、前記残基１０７Ｃ及び３１３Ｃが、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に結合している、Ｅ－二量体。
  3. 治療有効量の、請求項１または２に記載のＥ－二量体を含む、デング熱ウイルスの免疫原性組成物。
  4. 薬剤として用い、任意にデング熱ウイルス感染を予防及び／または治療するための、請求項１または２に記載のＥ－二量体、または請求項３に記載の免疫原性組成物。
  5. デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種で用いるための、
    請求項１または２に記載のＥ－二量体またはその免疫原性断片；及び／または
    請求項１または２に記載の前記Ｅ－二量体またはその免疫原性断片をコードする核酸；及び／または
    請求項１または２に記載の前記Ｅ－二量体またはその免疫原性断片をコードする核酸を含むベクター；及び／または
    請求項１または２に記載の前記Ｅ－二量体またはその免疫原性断片をコードする核酸、または請求項１または２に記載の前記Ｅ－二量体またはその免疫原性断片をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞、
    を示す、組成物。
  6. 請求項１または２に記載のＥ－二量体に結合する抗体またはその抗原結合部分であって、
    さらに、前記抗体またはその抗原結合部分は、
    ａ）配列番号１の配列を含む重鎖、及び配列番号３７の配列を含む軽鎖；
    ｂ）配列番号２の配列を含む重鎖、及び配列番号３８の配列を含む軽鎖；
    ｃ）配列番号３の配列を含む重鎖、及び配列番号３９の配列を含む軽鎖；
    ｄ）配列番号４の配列を含む重鎖、及び配列番号４０の配列を含む軽鎖；
    ｅ）配列番号４２の配列を含む重鎖、及び配列番号８８の配列を含む軽鎖；
    ｆ）配列番号５６の配列を含む重鎖、及び配列番号１０２の配列を含む軽鎖；
    ｇ）配列番号５７の配列を含む重鎖、及び配列番号１０３の配列を含む軽鎖；
    ｈ）配列番号５８の配列を含む重鎖、及び配列番号１０４の配列を含む軽鎖；
    ｉ）配列番号６１の配列を含む重鎖、及び配列番号１０７の配列を含む軽鎖；
    ｊ）配列番号６４の配列を含む重鎖、及び配列番号１１０の配列を含む軽鎖；
    ｋ）配列番号６５の配列を含む重鎖、及び配列番号１１１の配列を含む軽鎖；
    ｌ）配列番号７０の配列を含む重鎖、及び配列番号１１６の配列を含む軽鎖；
    ｍ）配列番号４１の配列を含む重鎖、及び配列番号８７の配列を含む軽鎖；
    ｎ）配列番号４３の配列を含む重鎖、及び配列番号８９の配列を含む軽鎖；
    ｏ）配列番号４４の配列を含む重鎖、及び配列番号９０の配列を含む軽鎖；
    ｐ）配列番号４７の配列を含む重鎖、及び配列番号９３の配列を含む軽鎖；
    ｑ）配列番号４９の配列を含む重鎖、及び配列番号９５の配列を含む軽鎖；
    ｒ）配列番号５０の配列を含む重鎖、及び配列番号９６の配列を含む軽鎖；
    ｓ）配列番号５１の配列を含む重鎖、及び配列番号９７の配列を含む軽鎖；
    ｔ）配列番号５２の配列を含む重鎖、及び配列番号９８の配列を含む軽鎖；
    ｕ）配列番号６０の配列を含む重鎖、及び配列番号１０６の配列を含む軽鎖；
    ｖ）配列番号６２の配列を含む重鎖、及び配列番号１０８の配列を含む軽鎖；
    ｗ）配列番号６３の配列を含む重鎖、及び配列番号１０９の配列を含む軽鎖；
    ｘ）配列番号６７の配列を含む重鎖、及び配列番号１１３の配列を含む軽鎖；
    ｙ）配列番号７１の配列を含む重鎖、及び配列番号１１７の配列を含む軽鎖；
    ｚ）配列番号７３の配列を含む重鎖、及び配列番号１１９の配列を含む軽鎖；
    ａａ）配列番号７４の配列を含む重鎖、及び配列番号１２０の配列を含む軽鎖；
    ｂｂ）配列番号７５の配列を含む重鎖、及び配列番号１２１の配列を含む軽鎖；
    ｃｃ）配列番号７６の配列を含む重鎖、及び配列番号１２２の配列を含む軽鎖；
    ｄｄ）配列番号７８の配列を含む重鎖、及び配列番号１２４の配列を含む軽鎖；
    ｅｅ）配列番号８０の配列を含む重鎖、及び配列番号１２６の配列を含む軽鎖；または
    ｆｆ）配列番号８１の配列を含む重鎖、及び配列番号１２７の配列を含む軽鎖
    のいずれかを含む、抗体または抗原結合部分。
  7. 請求項６に記載の抗体またはその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  8. 核酸であって、
    請求項６に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードし、
    任意にイントロンを有さない、核酸。
  9. 請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
  10. 請求項８に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含み、任意に、Ｃ６／３６昆虫細胞、ヒト樹状細胞、ＣＨＯ細胞、またはピキア・パストリス細胞である、宿主細胞。
  11. 薬剤として用い、任意にデング熱ウイルス感染を予防及び／または治療するための、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102225009B1 (ko) 2007-09-26 2021-03-08 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
MX2017008978A (es) 2015-02-05 2017-10-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que comprenden un dominio de union al antigeno dependiente de la concentracion ionica, variantes de la region fc, antiocuerpor de union a interleucina 8 (il-8) y usos de los mismos.
JP2018531256A (ja) * 2015-10-07 2018-10-25 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル デングウイルスワクチンおよび診断のための方法および組成物
WO2017142831A1 (en) * 2016-02-16 2017-08-24 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Dengue virus glycoprotein e diii variants and uses thereof
GB2550418A (en) 2016-05-20 2017-11-22 Laing Peter An improved vaccine against flaviviruses avoiding elicitation or stimulation of infection-enhancing antibodies
JP6908299B2 (ja) 2016-06-06 2021-07-21 メディツィニシェ ウニベルジテート ウィーン サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法
GB201610162D0 (en) 2016-06-10 2016-07-27 Imp Innovations Ltd And Inst Pasteur Methods
US11053308B2 (en) 2016-08-05 2021-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for treating IL-8-related diseases
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
CU20210030A7 (es) 2016-10-13 2021-11-04 Massachusetts Inst Technology Anticuerpos que se unen a la proteína de envoltura del virus zika
EP3558353A2 (en) * 2016-12-23 2019-10-30 Expres2ion Biotechnologies ApS New flavivirus vaccine
CN112119090B (zh) 2018-03-15 2023-01-13 中外制药株式会社 对寨卡病毒具有交叉反应性的抗登革热病毒抗体及使用方法
WO2021026372A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for stabilized recombinant flavivirus e protein dimers
EP4214229A1 (en) * 2020-09-15 2023-07-26 Duke University Coronavirus antibodies and uses thereof
GB2603567A (en) * 2021-02-03 2022-08-10 D Silver Joshua Viral load tester and applications thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001511459A (ja) 1997-07-31 2001-08-14 ハワイ バイオテクノロジー グループ， インコーポレイテッド フラビウイルス感染に対抗する組換え二量体エンベロープワクチン
WO2005056600A3 (en) 2003-12-08 2005-10-20 Us Gov Health & Human Serv Monoclonal antibodies that bind or neutralize dengue virus
JP2013542224A (ja) 2010-10-29 2013-11-21 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション デングウイルス組換えサブユニットスワクチン
WO2014074535A2 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Southern Research Institute Flavivirus envelope protein mutations affecting virion disassembly

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002077199A2 (en) 2001-03-27 2002-10-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to fgf dimerization
EP1649002A4 (en) * 2003-07-02 2009-06-03 Ptc Therapeutics Inc RNA PROCESSING PROTEIN COMPLEXES AND USES THEREOF
EP1773303A2 (en) 2004-05-25 2007-04-18 Chimeracore, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
AU2006315500A1 (en) 2005-11-14 2007-05-24 Psma Development Company, Llc. Compositions of and methods of using stabilized PSMA dimers
EP2474613B2 (en) 2008-02-05 2022-02-16 BicycleRD Limited Methods and compositions
US7923016B2 (en) 2008-02-27 2011-04-12 Medical College Of Wisconsin Engineered CXCL12 α locked dimer polypeptide
US20120315270A1 (en) 2009-10-21 2012-12-13 The United States Of America, As Represented By The Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof
US9821050B2 (en) 2012-04-02 2017-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric dengue virus E glycoproteins comprising mutant domain I and domain II hinge regions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001511459A (ja) 1997-07-31 2001-08-14 ハワイ バイオテクノロジー グループ， インコーポレイテッド フラビウイルス感染に対抗する組換え二量体エンベロープワクチン
WO2005056600A3 (en) 2003-12-08 2005-10-20 Us Gov Health & Human Serv Monoclonal antibodies that bind or neutralize dengue virus
JP2013542224A (ja) 2010-10-29 2013-11-21 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション デングウイルス組換えサブユニットスワクチン
WO2014074535A2 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Southern Research Institute Flavivirus envelope protein mutations affecting virion disassembly

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