JP7427583B2 - 固有分子識別子のpcr後度数からのpcr前フラグメント数の推定 - Google Patents
固有分子識別子のpcr後度数からのpcr前フラグメント数の推定 Download PDFInfo
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Description
a) 決定すべきコピー数の核酸を含むサンプルを提供し;
b) 前記核酸に可変的標識を取り付け;
c) 標識付き前記核酸を、核酸複製手順を用いて増幅させ;
d) 増幅された標識付き核酸コピーの量を決定し、各々の量が異なる標識付き核酸コピーについて決定され;
e) ステップd)の決定量に基づいて、ステップa)のサンプル中の核酸コピー数の推定値を提供し、これは
サンプル中の少なくとも2、好ましくは少なくとも4、少なくとも10以上の異なる核酸種について、前記標識が1つの核酸に結合する確率を概算し;この確率は、増幅後の異なる核酸種について前記標識の量を平均し;そして反復的にまたは段階的に
(A)ステップd)において検出された異なる標識の数および1つの核酸に結合する異なる標識の数の期待値(1つの核酸コピーに結合する標識の確率に従う)およびサンプル中の核酸コピーの期待数または推定増幅効率の事前反復値もしくは既定値に基づいて、サンプル中の推定核酸コピー数を精密化し;
または
(B)(i) ステップd)の決定量、1つの核酸に結合する標識の確率、推定増幅効率、またはサンプル中の核酸コピーの期待数に基づいて、そして前記推定増幅効率に依存した複製サイクルあたりの核酸増幅手順において増幅された標識付き核酸コピーの推定複製率に基づいて、増幅された所定の標識付き核酸コピーの量の確率分布をモデル化し、
(ii) 標識付き核酸コピーの決定量が、前記標識付き核酸コピーのモデル化された確率分布に従って起こる尤度を決定し、
(iii) 推定増幅効率またはサンプル中の核酸コピーの期待数を変化させることにより、ステップ(ii)の尤度を最大化し、
(iv) 前記最大化モデルに従ってまたは前記最大化モデルにおける推定増幅効率に従って、サンプル中の核酸コピー数の推定値を提供する
各ステップを含む方法を提供する。
〔発明の詳細な説明〕
次のステップを含む増幅後の〔核酸コピー数〕(K)を推定する方法であって、
a) 決定すべき〔コピー数〕(K)の核酸を含むサンプルを提供し;
b) 可変的標識を前記核酸に付着させ;
c) 前記標識付き核酸を核酸複製手順を用いて増幅させ;
d) 〔増幅された標識付き核酸コピーの量〕(nb)を決定し、その各々の量が、〔異なる〔標識〕(b)を有する核酸コピー〕について決定され(異なるbについてのnb);
e) 以下により決定された〔ステップd)の量〕(nb)に基づいてステップa)の〔サンプル中の核酸コピー数の推定値〕(Kest)を提供し、ここでKestは
サンプル中の少なくとも2、好ましくは少なくとも4、少なくとも10以上の異なる核酸種について、〔1つの核酸に結合する標識の確率〕(pb)を概算することにより決定され;前記pbは増幅後の異なる核酸種について〔前記標識の量〕(nb)を平均化し;そして反復的または段階的に
(A)
〔ステップd)において検出された異なる標識の数〕(DU)、〔核酸コピーに結合する標識の確率〕(pb)に従った核酸に結合する異なる標識の数の期待値および〔サンプル中の核酸コピーの期待数〕(Kest)または〔推定増幅効率〕(pd)の事前反復もしくは既定値に基づいて、〔サンプル中の核酸コピー数の推定または期待数〕(Kest)を精密化(改善)し;または
(B)
(i) 決定された〔ステップd)の量〕(nb)、〔1つの核酸に結合する標識の確率〕(pb)、〔推定増幅効率〕(pd)または〔サンプル中の核酸コピーの期待数〕(Kest)に基づいて、そして前記〔推定増幅効率〕(pd)に依存する複製サイクルあたりの核酸複製手順における増幅された〔標識付き核酸コピー〕(「プール」)の推定複製率に基づいて、〔所定の標識を有する増幅された核酸コピーの量の確率分布〕(p(nb))をモデル化することにより概算し、
(ii) 〔標識付き核酸コピーの決定量〕(nb)が前記〔標識付き核酸コピーのモデル化確率分布〕(p(nb))に従って生じる尤度を決定し、
(iii) 〔推定増幅効率〕(pd)または〔サンプル中の核酸コピーの期待数〕(Kest)を変化させることにより、ステップ(ii)の尤度を最大化し、
(iv) 前記最大化モデルに従ってまたは前記最大化モデルにおける〔推定増幅効率〕(pd)に従って、〔サンプル中の核酸コピー数の推定値〕(Kest)を提供する
ことにより、決定される
ステップを含む方法。
PCR前フラグメントコピー数を推定するための本項目のメソッドは、2つのカテゴリーに入る。項目2.1における第一カテゴリーは、個別観測されたUMIの数をベースにする。これはPCR前後で同じであるため、これらのメソッドはPCRプロセスに依存しない。項目2.2における第二カテゴリーのメソッドは、PCR後のUMIカウント数をベースにする。後者はPCRにより影響を受けるため、これらのメソッドはPCRプロセスについての統計モデルに依存する。項目2.1と2.2のメソッドは、PCR前のUMI分布の情報を必要とする。これは、ヌクレオチドがUMIの各位置に挿入されたことによる仕様からまたはPCR後に入手可能なデータから導き出せる。PCR前のUMI分布はヌクレオチド挿入の頻度により影響を受けるだけでなく、ライゲーションバイアスにも影響されるため、第二のアプローチが好ましいと思われる。該当するメソッドは項目2.3に説明される。
1.準備
2.1.1 観測される個別のUMIのカウント(計数)
UMIカウント数
2.1.2 観測される個別のUMIの度数補正カウント
前の項目と比較して、次のメソッドはPCR後のUMIカウント数の完全ベクトル
2.2.2 二項分布複製
PCRの反復性質は、ポアソンまたは二項分布複製モデルよりもむしろ分岐プロセスによってより適切にモデル化される。よって、本発明者らはガルトン・ワトソンプロセスを選択した。本項目で展開するメソッドには、従って、ガルトン・ワトソンまたはGWの接頭辞が付けられる。子孫分布は
最後の項目のモデルを使用した実験において、ガルトン・ワトソン複製モデルの分布が単一モードでは適切に記述されないことが判明した。従って、本項目では、(25)の混合形態の各成分を別々にモデル化する。PCRをn回実施後にbが検出される確率は、それがk回前に観測されると仮定すると、次の平均と分散を有するという事実を利用する。
式(33)および(34)は、k=0の場合、分布p(n|k,pd,c)はクロネッカーのδ0に等しいことを示す。よって、p(n|K,pd,c)は、小さなKの場合n=0に顕著なピークを有する。p(n|K,pd,c)を一様分布でモデル化するのではなく、2つの事例n=0およびn>0を別々にモデル化するのが妥当である。これはp(n|K,pb,pd,c)を混合形態
例えデルタ分布と単峰型分布の混合形態が小さいKと大きなKの状況を正しく記述しているとしても、本発明者らの実験において中間域Kについて系統的バイアスを発見した。これは、この領域では総和(25)が小さいk項に支配され、そのため負の二項分布またはガンマ分布によるp(n|k,pd,c)の近似値が不正確であるという事実によるものである。これは図6に見ることができ、効率pdの増加とともに近似の不正確さが増加することも示している。事実、1に近いpdについては、これらの図は、全体の形状がより小さいスケールで繰り返される、フラクタル様構造を示す。(25)の混合成分の複雑構造に適応させるために、p(n|K,pb,pd,c)が(33)と(34)によってその平均と分散が示される3つ以上の分布の混合物である、代替モデルを研究した。k=0の場合には、再びクロネッカーのδ0を利用する。k>0の場合、最初に負の二項分布を適合させた。しかしながら、これは小さなkにはうまく適合しないことが判明した。従って、kを小さい値、中程度の値、大きい値の各範囲に分割することに頼った。小さい値の場合には、p(n|k,pd,c)は(24)の助けを借りて各kについて正確に算出し、中間の値の場合には、各kについて(33)と(34)により与えられる平均と分散を有する正規分布を利用し、そして大きいkの部分和には単一の負の二項分布を利用する。kの範囲の区切りには固定境界を選択する。しかしながら、原則的には、それらの境界はモデル分布と真の分布の間の誤差を最小化するように適宜選択することができる。本発明の実験では、小さいkはk=0からk=15までに及び、中間のkはk=16からk=49までに及び、そして大きいkはk=50から始まる範囲内であった。
p(n|k,pd,c)が、n<kのときf(n)>0を有する分布f(n)によりモデル化されるならば、f(n)は範囲n≧kに制限されなければならないことに留意すべきである。これは、
(12)はポアソン、二項分布およびガルトン・ワトソン複製モデルに当てはまるので、これはそれらのモデルから作成されたデータに関して、pbはnbの分布から推定できることを示す。次のように(12)を書き直したものは
3.1 合成データの作成
当該実験では、均等および不均等分散しているB=64およびB=256 UMIを使用した。不均等データについては、UMIの各位置でのヌクレオチド分布は、ディリクレ分布から、すなわち
により、pd_GWから導出される。以下では、λとpd_Binよりもpd_GWを参照し、pd_GWを単純にpdと記すことにする。
B=64とB=256 UMIについてのUMIカウントの結果は図8に見ることができるが、それらの頻度補正したUMIカウントは図9に与えられる。別のメソッドに比較して、UMIカウントの両バージョンは、複製モデルに依存せず(独立であり)、従って複製効率に影響されない。この理由により、効率0.5を有する二項分布モデルの結果のみを含めた。他の複製モデルと効率の結果は同等である。図8は、UMIカウントが、UMIの数BがKよりも相当大きい場合にのみ、良好なKの推定値を生じることを示す。B=64に関しては、推定値がK=10についてのみ妥当な正確さを有する。B=256に関しては、K=100の推定も妥当である。しかしながら、より大きいKの値には、UMIカウントはKを少なくとも50%過小評価する。図8は更に、UMIカウントが不均等データに関してわずかに低い精度を生じる。その一方、図9に記載の頻度補正したカウントは、より広範な領域のKについて偏りのない(バイアスフリーの)より正確な結果をもたらす。しかしながら、大きなKの場合には、観測される個別のUMIの数
Claims (22)
- サンプル中の核酸コピー数を推定する方法であって、
a) 決定すべきコピー数の核酸を含むサンプルを提供し;
b) 前記核酸に可変的ヌクレオチド標識である標識を取り付け;
c) 前記標識付き核酸を、核酸複製手順を用いて増幅させ;
d) 増幅された標識付き核酸コピーの量を決定し、各々の量が異なる標識付き核酸コピーについて決定され;
e) ステップd)の決定量に基づいて、ステップa)のサンプル中の核酸コピー数の推定量を提供するため、コンピューターシステムによりプログラムを実行し、当該システムは、
サンプル中の少なくとも2の異なる核酸種について、前記標識が1つの核酸に結合する確率を概算するプログラムを実行し;これは増幅後の異なる核酸種について前記標識の量を平均し;そして反復的にまたは段階的に
(A)ステップd)において検出された異なる標識の数および1つの核酸コピーに結合する標識の確率に従った1つの核酸に結合する異なる標識の数の期待値、およびサンプル中の核酸コピーの期待数または推定増幅効率の事前反復値または既定値に基づいて、サンプル中の核酸コピーの期待数を精密化し;
または
(B)(i) ステップd)の決定量、1つの核酸に結合する標識の確率、推定増幅効率、またはサンプル中の核酸コピーの期待数に基づいて、そして前記推定増幅効率に依存した複製サイクルあたりの核酸増幅手順での増幅された標識付き核酸コピーの推定複製率に基づいて、増幅された所定の標識付き核酸コピーの量の確率分布をモデル化し、
(ii) 標識付き核酸コピーの決定量が前記標識付き核酸コピーのモデル化された確率分布に従って起こる尤度を決定し、
(iii) 推定増幅効率またはサンプル中の核酸コピーの期待数を変化させることにより、ステップ(ii)の尤度を最大化し、
(iv) 前記最大化された尤度に従ってまたは前記最大化された尤度における推定増幅効率に従って、サンプル中の核酸コピー数の推定値を提供する
各ステップを含む方法。 - ステップe)において実行される前記プログラムが、少なくとも4の異なる核酸種について、前記標識が1つの核酸に結合する確率を概算する、請求項1に記載の方法。
- ステップe)において実行される前記プログラムが、少なくとも10の異なる核酸種について、前記標識が1つの核酸に結合する確率を概算する、請求項1に記載の方法。
- ステップA)において、サンプル中の核酸コピーの期待数の初回反復の既定値に基づいて、推定増幅効率がステップd)の異なる検出標識の数の数値から選択されるかまたは1から増幅核酸コピーの決定量までの範囲の整数より選択される、請求項1に記載の方法。
- ステップB)において、標識付きの増幅核酸コピーの推定複製率が、ガウス分布、負の二項分布、ガンマ分布、ディラックのデルタ分布もしくはガルトン・ワトソン分布の複製確率関数またはその混合形態でモデル化される、請求項1に記載の方法。
- 1つの核酸に結合する標識の確率が
式(12)
推定増幅効率またはサンプル中の核酸コピーの期待数が式(27)
ステップA)において、増幅された所定の標識付き核酸コピーの量の確率分布が、式(5)
ステップB)において、増幅された所定の標識付き核酸コピーの量の確率分布が、式(25)
・Kは核酸コピー数を意味し;
・bは標識を意味し;
・Pbは1つの核酸コピーに結合する標識の確率を意味し;
・Pdは推定増幅効率を意味し;
・Nは増幅された核酸コピーの決定された量を意味し;
・_estは推定値であることを意味し;
・Ki又はKi+1はi又はKi+1回目の反復を意味し;
・DUはステップd)において検出された別個の標識の数を意味し;
・cは複製サイクル数を意味し;
・Fはプールの総数を意味し
・kは増幅前の標識を有する核酸コピーの数を意味し;
・nは標識を有する増幅された核酸コピーの量を意味し;
・bは標識番号を意味し;
・BはUMI即ち標識の総数を意味し;
請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。 - ステップA)において、増幅された所定の標識付き核酸コピーの量の確率分布が、式(4)
- 前記核酸増幅手順において前記標識付き核酸を増幅させる効率が、100%ではない、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸増幅手順において前記標識付き核酸を増幅させる効率が、核酸コピーの異なる種ごとに異なる、請求項8に記載の方法。
- 少なくとも20の、異なる標識が前記核酸に結合される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも30の、異なる標識が前記核酸に結合される、請求項10に記載の方法。
- 少なくとも40の、異なる標識が前記核酸に結合される、請求項10に記載の方法。
- 前記核酸がDNAまたはRNAである、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅がPCRによって行われる、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が少なくとも1の複製サイクル間行われる、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が2,3,4,5,6,7,8またはそれ以上の複製サイクル間行われる、請求項15に記載の方法。
- 前記モデル化が確率分岐モデルを使用することを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 更なる反復が少なくとも2回前の反復に基づき、そしてその更なる反復のサンプル中の核酸コピーの期待数または推定増幅効率が区間によって選択され、ここで前記区間は、前記標識付き核酸コピーの決定量が前記区間内の標識付き核酸コピーのモデル化確率分布に従って出現する尤度を含み、そして前記標識付き核酸コピーの決定量が前記標識付き核酸コピーのモデル化確率分布に従って出現する最大尤度が、前記区間の境界線である、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の核酸コピーの量の推定値を計算するためにコンピューターシステムによって実行されるコンピュータープログラムであって、当該計算が、請求項1のステップe)に従って標識付き核酸の増幅後の決定量に基づいて実行される、コンピュータープログラム。
- ステップe)の結果を可読媒体上に提示または表示させるのに適合した、請求項19に記載のコンピュータープログラム。
- 請求項1に定義されるステップe)をコンピューター上で実行する方法。
- ステップe)の結果を可読媒体上に提示または表示させることを含む、請求項1~18および21のいずれか一項に記載の方法。
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