JP7419073B2 - T細胞および/またはhla受容体の標的化破壊 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年6月16日に出願された米国仮出願第62/521,132号、2017年8月7日に出願された米国仮出願第62/542,052号および2017年10月18日に出願された米国仮出願第62/573,956号の利益を主張し、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
本開示は、リンパ球および幹細胞を含むヒト細胞のゲノム改変の分野にある。
遺伝子治療は、ヒト治療学の新しい時代の莫大な潜在性を秘める。これらの方法論は、標準医療行為によって対処可能ではなかった状態のための処置を可能にする。遺伝子治療は、遺伝子座の破壊(不活性化)もしくは補正、および導入遺伝子に作動可能に連結された特異的外因性プロモーターによって、またはゲノムへの挿入部位で見出される内因性プロモーターによって調節することができる発現可能な導入遺伝子の挿入などの、ゲノム編集技術の多くの変形を含むことができる。
したがって、エフェクターT細胞、制御T細胞、B細胞、NK細胞または幹細胞(例えば造血幹細胞、人工多能性幹細胞および胚性幹細胞)でのTCRおよび/またはHLA発現を改変(例えば、ノックアウト)するために使用することができる方法および組成物の必要性がまだある。
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNAおよび当技術分野の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献において詳細に説明される。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年および第3版、2001年;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期の最新版;シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego;Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press、San Diego、1998年;METHODS IN ENZYMOLOGY、第304巻、「Chromatin」(P.M. WassarmanおよびA. P. Wolffe編)、Academic Press、San Diego、1999年;およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第119巻、「Chromatin Protocols」(P.B. Becker編)、Humana Press、Totowa、1999年を参照のこと。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、直鎖状または環状の立体配座の、および一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものと解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドならびに塩基、糖および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)が修飾されるヌクレオチドの公知の類似体を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する;すなわち、Aの類似体はTと塩基対合する。
遺伝子発現の「モジュレーション」または「改変」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションには、外因性分子(例えば、工学技術で作製された転写因子)の結合を介した遺伝子の改変によるものを含む遺伝子活性化および遺伝子抑制を限定されずに含めることができる。モジュレーションは、ゲノム編集(例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異)を介した遺伝子配列の改変によっても達成することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載される改変されていない細胞と比較したときの、遺伝子発現のいかなる低減も指す。したがって、遺伝子不活性化は部分的であるか、または完全であってもよい。
。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、2ハイブリッドアッセイまたは遺伝子的および生化学的の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Fieldsら(1989年)Nature 340巻:245~246頁;米国特許第5,585,245号および国際特許公開第WO98/44350を参照のこと。
(i)哺乳動物において、具体的にはそのような哺乳動物が状態になりやすい素因を有するが、それを有するとしてまだ診断されていない場合に、疾患または状態の出現を予防すること;
(ii)疾患または状態を抑制すること、すなわちその発症を抑止すること;
(iii)疾患もしくは状態を緩和すること、すなわち疾患もしくは状態の退縮をもたらすこと;または
(iv)疾患もしくは状態から生じる症状を緩和すること、すなわち根底にある疾患もしくは状態に対処すること無く疼痛を緩和すること
が含まれる。
本明細書で、HLA遺伝子またはHLA制御因子を含む任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するDNA結合ドメインを含む組成物が記載される。任意のDNA結合ドメインは、本明細書で開示される組成物および方法において使用することができ、限定されずにジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、CRISPR/CasヌクレアーゼのDNA結合部分(sgRNA)またはメガヌクレアーゼ由来DNA結合ドメインが含まれる。DNA結合ドメインは、限定されずに、本明細書に開示の標的部位(配列番号8~21および/または92~103)のいずれかに示す12またはそれより多いヌクレオチドの標的配列を含む、遺伝子内の任意の標的配列に結合することができる。
本明細書に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE、単一ガイドRNAなどのCRISPR/Cas構成成分)を含み異種制御(機能的)ドメイン(またはその機能性断片)と会合する融合分子も提供される。共通ドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子)、サイレンサー、オンコジーン(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバーなど);DNA修復酵素およびそれらの関連因子およびモディファイヤー;DNA再編成酵素およびそれらの関連因子およびモディファイヤー;クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイヤー(例えばキナーゼ、アセチラーゼおよび脱アセチル化酵素);ならびにDNA改変酵素(例えば、メチル基転移酵素、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)およびそれらの関連因子およびモディファイヤーが含まれる。そのような融合分子には、本明細書に記載されるDNA結合ドメインを含む転写因子および転写制御ドメインならびにDNA結合ドメインを含むヌクレアーゼおよび1つまたは複数のヌクレアーゼドメインが含まれる。
を参照)核内ホルモン受容体(例えばTorchiaら、(1998年)Curr. Opin. Cell. Biol. 10巻:373~383頁を参照);核内因子カッパBのp65サブ
ユニット(Bitko & Barik、(1998年)J. Virol. 72巻:5610~5618頁
およびDoyle & Hunt、(1997年)Neuroreport 8巻:2937~2942頁)
、Liuら、(1998年)Cancer Gene Ther. 5巻:3~28頁)、またはVP64などの人工キメラ機能的ドメイン(Beerliら、(1998年)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95巻:14623~33頁)、およびデグロン(Molinariら、(1999年)EMBO J. 18巻、6439~6447頁)が含まれる。さらなる例示的活性化ドメイン
には、Oct 1、Oct-2A、Sp1、AP-2およびCTF1(Seipelら、(1992年)EMBO J. 11巻、4961~4968頁ならびにp300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2AおよびERF-2が含まれる。例えばRobyrら(
2000年)Mol. Endocrinol. 14巻:329~347頁、Collingwoodら(1999年)J. Mol. Endocrinol. 23巻:255~275頁、Leoら(2000年)Gene 245巻:1~11頁、Manteuffel-Cymborowska (1999年)Acta Biochim. Pol. 46巻:77~89頁、McKennaら(1999年)J. Steroid Biochem. Mol. Biol.
69巻:3~12頁、Malikら(2000年)Trends Biochem. Sci. 25巻:27
7~283頁およびLemonら(1999年)Curr. Opin. Genet. Dev. 9巻:499
~504頁を参照。さらなる例示的活性化ドメインには、OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、-6、-7および-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GPならびにTRAB1が限定されずに含まれる。例えばOgawaら(2000年)Gene 245巻:21~29頁、Okanamiら(1996年)Genes Cells 1巻:87~99頁、Goffら(1991年)Genes Dev. 5巻:298~309頁、Choら(1999年)Plant Mol. Biol. 40巻:419~429頁、Ulmasonら(1999年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96巻:5844~5849頁、Sprenger-Hausselsら(2000年)Plant J. 22巻:1~8頁、Gongら(1999年)Plant Mol. Biol. 41巻
:33~44頁およびHoboら(1999年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96巻:15,348~15,353頁を参照。
338~342頁を参照。さらなる例示的抑制ドメインには、ROM2およびAtHD2Aが限定されずに含まれる。例えばChemら(1996年)Plant Cell 8巻:305~
321頁およびWuら(2000年)Plant J. 22巻:19~27頁を参照。
)由来のものなど)およびエピトープタグ(例えばFLAGおよびヘマグルチニンなど)も任意選択で含む。融合タンパク質(およびそれらをコードする核酸)は、翻訳リーディングフレームが融合物の構成成分内で保存されるように設計される。
ダーとポリペプチドとの間の融合を作製するための方法および組成物が、記載されている。Mappら(2000年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97巻:3930~3935頁。さらにCRISPR/Cas系の単一ガイドRNAは、活性転写制御因子およびヌクレアーゼを形成するように機能的ドメインと会合する。
年ならびに米国特許第6,453,242号および第6,534,261号を参照。
ある特定の実施形態では融合分子は、切断(ヌクレアーゼ)ドメインと会合しているDNA結合ドメインを含む。そのように遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば工学技術で作製されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。工学技術で作製されるヌクレアーゼ技術は、天然に存在するDNA結合タンパク質の工学技術に基づいている。例えば、目的に合わせたDNA結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの工学技術は記載されている。Chamesら(2005年)Nucleic Acids Res 33巻(20号):e178頁、Arnouldら(2006年)J. Mol. Biol. 355巻:443~458頁。さらに、ZFPの工学技術も記載されている。例えば米国特許第6,534,261号、第6,607,882号、第6,824,978号、第6,979,539号、第6,933,113号、第7,163,824号および第7,013,219号を参照。
を示すこともできる。
1997年)Nucleic Acids Res.25巻:3379~3388頁;Dujonら(1989
年)Gene 82巻:115~118頁;Perlerら(1994年)Nucleic Acids Res.22巻、1125~1127頁;Jasin(1996年)Trends Genet.12巻:224~2
28頁;Gimbleら(1996年)J. Mol. Biol.263巻:163~180頁;Argast
ら(1998年)J. Mol. Biol.280巻:345~353頁およびNew England Biolabsカタログも参照。
)、Biochem. Biophysics. Res. Common. 255巻:88~93頁)または認識配列が導入される工学技術で作製される前のゲノムへの改変(Routeら(1994年)、Mol.
Cell. Biol. 14巻:8096~106頁、Chiltonら(2003年)、Plant Physiology. 133巻:956~65頁、Puchtaら(1996年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93巻:5055~60頁、Rongら(2002年)、Genes Dev. 16巻:1568~81頁、Goubleら(2006年)、J. Gene Med. 8巻(5号):616~622頁)に限定されている。したがって、医学的にまたは生物工学的に関連する部位で新規結合特異性を示すメガヌクレアーゼを工学技術で作製する試みがなされている(Porteusら(2005年)、Nat. Biotechnol. 23巻:967~73頁、Sussmanら(20
04年)、J. Mol. Biol. 342巻:31~41頁、Epinatら(2003年)、Nucleic Acids Res. 31巻:2952~62頁、Chevalierら(2002年)Molec. Cell
10巻:895~905頁、Epinatら(2003年)Nucleic Acids Res. 31巻:2952~2962頁、Ashworthら(2006年)Nature 441巻:656~659頁、Paquesら(2007年)Current Gene Therapy 7巻:49~66頁、米国特許出願公開第2007/0117128号、第2006/0206949号、第2006/0153826号、第2006/0078552号および第2004/0002092)。さらに、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは工学技術で作製されたDNA結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン(例えば、FokI)と作動可能に連結することができる、および/またはメガヌクレアーゼ由来の切断ドメインは異種DNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE)と作動可能に連結することができる。
2001年)Ann. Rev. Biochem. 70巻:313~340頁、Isalanら(2001年)Nature Biotechnol. 19巻:656~660頁、Segalら(2001年)Curr. Opin. Biotechnol. 12巻:632~637頁、Chooら(2000年)Curr. Opin. Struct. Biol. 10巻:411~416頁を参照。工学技術で作製されたジンクフィンガ
ー結合ドメインまたはTALEタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。工学技術方法には、合理的な設計および様々な種類の選択が限定されずに含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット(または、クアドルプレット)ヌクレオチド配列および個々の、ジンクフィンガーまたはTALEアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーまたはTALE反復単位の1つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第6,453,242号および第6,534,261号を参照。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、68957、72678、72732、72748(B2M)または68846(TCR)として指定されるZFNに由来するZFP(例えば、ZFP成分)を含む。
と。DNAを切断するさらなる酵素は公知である(例えば、S1ヌクレアーゼ;リョクトウヌクレアーゼ;膵臓のDNアーゼI;ミクロコッカルヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linnら(編)Nucleases、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1993年も参照)。これらの酵素の1つまたは複数(または、それらの機能的断片)は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として使用することができる。
3~887頁;Kimら(1994b)J. Biol. Chem.269巻:31,978~31,
982頁を参照のこと。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、工学技術で作製されてもされなくてもよい、少なくとも1つのIIS型制限酵素からの切断ドメイン(または、切断半ドメイン)、および1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
、本開示のために、開示される融合タンパク質で使用されるFok I酵素の部分は、切断半ドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー-Fok I融合物を使用した標的化二本鎖切断および/または細胞配列の標的化置き換えのために、各々Fok I切断半ドメインを含む2つの融合タンパク質を、触媒活性切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび2つのFokI切断半ドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー-FokI融合物を使用した標的化切断および標的化配列変更のパラメータは、この開示の他の場所で提供される。
年)Nucleic Acids Res.31巻:418~420頁を参照のこと。
e60頁)が、CRISPR/Casヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるCRISPR遺伝子座は、CRISPR関連(Cas)遺伝子の組合せ、ならびにCRISPR媒介核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードRNAエレメントを含有する。
ヌクレアーゼ(複数可)は、標的部位で1つまたは複数の2本鎖および/または1本鎖切断を作製することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒として不活性な切断ドメインを含む(例えば、FokIおよび/またはCasタンパク質)。例えば、米国特許第9,200,266号、および第8,703,489号およびGuillingerら(2014年)Nature Biotech. 32巻(6号):577~582頁を参照。触媒として不活性な切断ドメインは、触媒として活性なドメインと組み合わせて1本鎖切断を作製するためのニッカーゼとして作用することができる。したがって、2つのニッカーゼは特異的領域において2本鎖切断を作製するために組み合わせて使用することができる。さらなるニッカーゼも、当技術分野において公知であり、例えばMcCafferyら(2016年)Nucleic Acids Res. 44巻(2号):e11頁. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19において公知である。加えて、デッドCas(「dCas」)またはCasニッカーゼは、塩基編集系を作製するために塩基改変酵素(例えば、シチジンデアミナーゼ)に融合されてよい(Komorら、(2016年) Nature 533巻:420頁)。これらの系は、DNA中に二重鎖切断を作製せずに塩基編集複合体によるDNA塩基の変更(改変)を可能にする。したがって、一部の実施形態では、ガイドRNA(表2)は、ノックアウトを引き起こすようにTRAC遺伝子中に変異を導入するために使用することができる。
タンパク質(例えば、転写因子、ヌクレアーゼ、TCRおよびCAR分子)、ポリヌクレオチドならびに/または本明細書に記載されるタンパク質および/もしくポリヌクレオチドを含む組成物は、例えばタンパク質および/またはmRNA構成成分の注射によってを含む任意の適する手段によって標的細胞に送達することができる。一部の実施形態では、タンパク質は細胞スクイージングによって細胞に導入される(Kollmannspergerら、(2016年) Nat Comm 7巻、10372頁、doi:10.1038/ncomms10372を参照)。
813頁;NabelおよびFelgner、(1993年)TIBTECH 11巻:211~217頁
;MitaniおよびCaskey、(1993年)TIBTECH 11巻:162~166頁
;Dillon、(1993年)TIBTECH 11巻:167~175頁;Miller、(1992年)Nature 357巻:455~460頁;Van Brunt、(1988年)Biotechnology 6巻(10号
):1149~1154頁;Vigne、(1995年)Restorative Neurology and Neuroscience 8巻:35~36頁;KremerおよびPerricaudet、(1995年)British Medical Bulletin 51巻(1号):31~44頁;Haddadaら、(1995年)Current
Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm(編)
;およびYuら、(1994年)Gene Therapy 1巻:13~26頁を参照のこと
。
巻:647~654頁;Gaoら、(1995年)Gene Therapy 2巻:710~722頁;Ahmadら、(1992年)Cancer Res.52巻:4817~4820頁
;米国特許第4,186,183号、4,217,344号、4,235,871号、4,261,975号、4,485,054号、4,501,728号、4,774,085号、4,837,028号および4,946,787号を参照のこと)。
されたい)。
58~59頁;Wilsonら、(1989年)J. Virol.63巻:2374~2378頁;Millerら、(1991年)J. Virol.65巻:2220~2224頁;国際特許公開第WO1994/026877を参照のこと)。
1頁;Muzyczka、(1994年)J. Clin. Invest.94巻:1351頁を参照のこと。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschinら、(1985年)Mol. Cell. Biol.5巻:3251~3260頁;Tratschinら、(1984年)Mol. Cell. Biol.4巻:2072~2081頁;HermonatおよびMuzyczka、(1984年)PNAS USA 81巻:6466~6470頁;およびSamulskiら、(1989年)J. Virol.63巻:03822~3828頁を含む、いくつかの刊行物に
記載されている。
~480頁)。MFG-Sパッケージベクターで、50%またはそれより高い形質導入効率が観察された。(Ellemら、(1997年)Immunol Immunother.44巻(1号):1
0~20頁;Dranoffら、(1997年)Hum. Gene Ther.1巻:111~2頁。
48~55頁)。AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV8.2、AAV9、AAVrh10ならびにAAV2/8、AAV2/5およびAAV2/6などの偽型化AAVを含む他のAAV血清型を、本発明に従って使用することもできる。
:597~613頁;Topfら、(1998年)Gene Ther.5巻:507~513頁
;Stermanら、(1998年)Hum. Gene Ther.7巻:1083~1089頁が含まれる。
モロニーマウス白血病ウイルスは、gp70に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができること、および組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス-標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、選択される事実上いかなる細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片(例えば、FABまたはFv)を提示するように、工学技術で作製することができる。上の記載はウイルスベクターに主に適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取込みを有利にする、特異的取込み配列を含有するように工学技術で作製することができる。
vivo手順で使用される。幹細胞を使用する有利な点は、in vitroで幹細胞は他の細胞型に分化できること、または哺乳動物(細胞のドナーなど)に導入することができ、そこで幹細胞が骨髄中で生着することである。GM-CSF、IFN-γおよびTNF-αなどのサイトカインを使用して臨床に重要な免疫細胞型にCD34+細胞をin
vitroで分化させるための方法は公知である(Inabaら、(1992年)J. Exp. Med. 176
巻:1693~1702頁を参照)。
しばしば提供することができる。
開示される組成物および方法は、限定されずに、TCRおよび/またはB2Mモジュレーションが望ましい治療用および研究用応用を含む、TCRおよび/またはB2M発現および/または機能性をモジュレートすることが望ましい任意の応用のために使用することができる。例えば、開示される組成物は、養子細胞療法のために1つもしくは複数の外因性CAR、外因性TCR、または他のがん特異的受容体分子を発現し、それによりがんを処置および/または予防するように改変されたT細胞において、内因性TCRおよび/またはB2Mの発現を破壊するためにin vivoおよび/またはex vivo(細胞治療)で使用することができる。T細胞は、エフェクターT細胞または制御T細胞であってよい。さらにそのような状況において、細胞内でのTCR発現の抑止は、健康な、非標的化組織との不必要な交差反応(すなわち移植片対宿主応答)の危険を除去または実質的に低減することができる。本明細書に記載される改変細胞は、限定されずに、前立腺、慢性リンパ性白血病(CLL)および非ホジキンリンパ腫を含むがんの処置のためにも使用することができる。
TCR特異的ヌクレアーゼの設計
TCR特異的ZFNをTCRα(TCRA)遺伝子での二本鎖切断の部位特異的導入を可能にするために構築した。ZFNをUrnovら(2005年)Nature 435巻(7042号):646
~651頁、Lombardoら(2007年)Nat Biotechnol.;25巻(11号):1
298~306頁および米国特許出願公開第2008-0131962号、第2015-016495号、第2014-0120622号、および第2014-0301990号および米国特許第8,956,828号に本質的に記載の通り設計した。ZFN対は、TCRA遺伝子の定常領域中の異なる部位を標的とした(図1を参照)。例示的ZFN対に対する認識ヘリックスならびに標的配列を下の表1に示す。TCRAジンクフィンガー設計の標的部位を第1カラムに示す。ZFP認識ヘリックスによって標的化される標的部位中のヌクレオチドを大文字で示し;非標的化ヌクレオチドを小文字で示す。FokIヌクレアーゼドメインとZFP DNA結合ドメインとを繋ぐために使用されるリンカーも示す(米国特許出願公開第2015/0132269号を参照)。例えばドメインリンカーL0のアミノ酸配列は、DNA結合ドメイン-QLVKS-FokIヌクレアーゼドメイン(配列番号3)である。同様にドメインリンカーN7aについてのアミノ酸配列は、FokIヌクレアーゼドメイン-SGTPHEVGVYTL-DNA結合ドメイン(配列番号6)であり、N7cはFokIヌクレアーゼドメイン-SGAIRCHDEFWF-DNA結合ドメイン(配列番号7)である。
表1に記載されるZFNをK562細胞におけるヌクレアーゼ活性を検査するために使用した。切断活性を検査するために、上に記載されるヒトTCRA-特異的ZFNの対をコードしているプラスミドをプラスミドまたはmRNAを用いてK562細胞にトランスフェクトした。K562細胞は、American Type Culture Collectionから得て、10%認定ウシ胎仔血清(FBS、Cyclone)を補充したRPMI培地(Invitrogen)において推奨される通り成長させた。トランスフェクションのために、表1に列挙する活性ヌクレアーゼについてのORFを5’および3’UTRならびに合成ポリAシグナルを保有するmRNA産生のために最適化した発現ベクターにクローニングした。mRNAを、mMessage mMachine T7 Ultra kit(Ambion)を製造者の指示に従って使用して生成した。ヌクレアーゼmRNAのin vitro合成は、T7プロモーター、適切なヌクレアーゼおよび、in vitro転写反応に続くポリAテールの酵素的付加のためのポリAモチーフを含有するpVAX-ベースベクター、またはT7プロモーター、5’UTR、適切なヌクレアーゼ、3’UTRおよび64bpポリAストレッチを含有するpGEMベースベクター、またはT7プロモーター、5’UTR、適切なヌクレアーゼ、3’UTRおよび60bpポリAストレッチを含有するPCRアンプリコンのいずれかを使用した。K562細胞100万個を250ngまたは500ngのZFNコードmRNAと混合した。細胞をプログラムT-16を使用してAmaxa Nucleofector IITMにおいてトランスフェクトし1.4mLの温めたRPMI培地+10%FBSに回収した。ヌクレアーゼ活性をトランスフェクション3日後に標準的プロトコールによりディープシークエンシング(MiSeq、Illumina)によって評価した。結果を下の表3に示す。
TCRA特異的ZFN対をヌクレアーゼ活性についてヒトT細胞においても検査した。ZFNをコードするmRNAを精製T細胞にトランスフェクトした。簡潔には、T細胞を白血球フェレーシス産物から得て、Miltenyi CliniMACSシステム(CD4およびCD8二重選択)を使用して精製した。次いで、Dynabeads(ThermoFisher)を製造者のプロトコールに従って使用して、これらの細胞を活性化した。活性化3日後、細胞を3種の用量のmRNA(60、120および250μg/mL)を用いてMaxcyte electroporator(Maxcyte)、OC-100、30e6細胞/mL、体積0.1mLを使用してトランスフェクトした。細胞をディープシークエンシング(Miseq、Illumina)を使用してトランスフェクション後10日目にオンターゲットTCRA改変について分析した。細胞生存率および細胞増殖(合計細胞倍加)を培養の13~14日間を通じて測定した。加えて、処理細胞の細胞表面上のTCRを培養10日目にCD3について染色する標準的FACS分析を使用して測定した。
上に記載のヌクレアーゼおよび表5に記載されるB2M標的化ヌクレアーゼ(米国特許出願公開第2017/0173080号も参照)をB2MおよびTCRAを不活性化し、標的化組み込みを介して、ドナー(導入遺伝子)をTCRAまたはB2M遺伝子座のいずれかに導入するために使用した。B2M特異的ZFNを下の表5に示す:
(a)群1(TCRAおよびB2M ZFNのみ、ドナーなし):TCRA 120ug/mL:B2Mのみ60ug/mL;
(b)群2(TCRAおよびB2M ZFNならびにTCRA相同アームを有するドナー):TCRA 120ug/mL;B2M 60ug/mLおよびAAV(TCRA-Site E-hPGK-eGFP-Clone E2)1E5vg/細胞;
(c)群3(TCRAおよびB2M ZFNならびにTCRA相同アームを有するドナー):TCRA 120ug/mL;B2M 60ug/mL;およびAAV(TCRA-Site E-hPGK-eGFP-Clone E2)3E4vg/細胞;
(d)群4(TCRAおよびB2M ZFNならびにB2M相同アームを有するドナー):TCRA 120ug/mL;B2M 60ug/mLおよびAAV(pAAV B2M-hPGK GFP)1E5vg/細胞
(e)群5(TCRAおよびB2M ZFNならびにB2M相同アームを有するドナー)
:TCRA 120ug/mL;B2M 60ug/mLおよびAAV(pAAV B2M-hPGK GFP)3E4vg/細胞。
全ての実験は、3e7細胞/mlの細胞密度で米国特許公開第2017/0137845号に記載のプロトコール(超低温ショック(extreme cold shock))を使用して実施し、電気穿孔後に、30℃、一晩の低温ショックのために培養した。
(a)偽:ZFN mRNAもAAVドナーも添加せずに電気穿孔された細胞;
(b)TRACおよびB2M ZFNのみ、ドナーなし):TRAC 120ug/mL:B2Mのみ30ug/mL;
(c)TRACおよびB2M ZFNおよびB2M相同アームを有するドナー:TRAC 120ug/mL;B2M 30ug/mLおよびAAV6(B2M-部位A-hPGK-eGFP)3E4vg/細胞;
(d)TCACおよびB2M ZFNおよびTRAC相同アームを有するドナー:TRAC 120ug/mL;B2M 30ug/mL;およびAAV6(TCRA-部位E-hPGK-eGFP)3E4vg/細胞。
オフターゲット切断を減少させるために、非特異的リン酸接触がオフターゲット切断の全体的な抑制をもたらすように選択的に除去されるヌクレアーゼ最適化のための戦略(Guilingerら、(2014年) Nat Methods. 11巻(4号):429~35頁。doi: 10.1038/nmeth.2845; Kleinstiverら、(2016年) Nature 529巻(7587号):490~5頁。doi: 10.1038/nature16526; Slaymakerら、(2016年) Science351巻(6268号):84~8頁。doi: 10.1126/science.aad5227)を採用した(米国特許出願公開第2018/0087072号を参照)。アミノ酸置換をDNAのリン酸骨格と相互作用するジンクフィンガーフレームワーク内の1つまたは複数の重要な位置(Pavletich and Pabo (1991年) Science 252巻(5007号):809~17頁; Elrod-Ericksonら、(1996年) Structure 4巻(10号):1171~80頁)およびリン酸接触を作製すると同様に予測される右ZFN FokIドメイン中の位置に作製した。
本明細書に記載されるT細胞を移植片対宿主病および/またはがんの動物モデル(例えば、腫瘍モデルを確立するために多発性骨髄腫などのがん細胞株を注射されたヌードマウス)に投与する。例えば、活性化ヒトT細胞をB2MおよびTRAC-特異的ZFNをコードするmRNAを用いて電気穿孔する、ここで各対は、2A自己切断ペプチドをコードする配列によって分けられている単一のmRNAによってコードされている(MacLeodら、(2017年) Mol Ther. 25巻(4号):949~961頁)。細胞をまた、CARドナー(例えば、CD19 CAR)を含むAAV粒子を用いて形質導入する。次に細胞を培養し、CAR発現およびCD3+細胞の欠失について染色する。全ての残存CD3+細胞を磁気分離によって枯渇させる。NSGマウスにホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞(Raji-ffLuc)を静脈内注射し、4日後、CD3-/抗CD19 CAR T細胞を注射する。Raji-ffLuc細胞の生着および成長は、注射後4日までに明らかであり、未処置マウスにおいて顕著に増加している。処置マウスの血液中のピークCAR T細胞頻度は、8日目に観察され、高用量群の末梢血液中の細胞の約10%に達する。17~19日目までに、対照群の全てのマウスは、顕著な腫瘍負荷の証拠を、特に脊椎および骨髄において示して、完全な後肢麻痺を生じ、安楽死される。対照的に、抗CD19 CAR T細胞を用いて処置したマウスの全ての群は、11日目までに腫瘍増殖の証拠を示さず、研究の32日目を通じて腫瘍は無いままであった。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
68957、72678、72732または72748と呼ばれるZFN由来のZFP;
工学技術で作製されたFokI切断ドメイン;および
前記FokI切断ドメインと前記ZFPとの間のリンカー
を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
(項目2)
以下:57531と呼ばれるZFNおよび72732と呼ばれるZFN;57531と呼ばれるZFNおよび72748と呼ばれるZFN;68957と呼ばれるZFNおよび57071と呼ばれるZFN;68957と呼ばれるZFNおよび72732と呼ばれるZFN;68957と呼ばれるZFNおよび72748と呼ばれるZFN;72678と呼ばれるZFNおよび57071と呼ばれるZFN;72678と呼ばれるZFNおよび72732と呼ばれるZFNの通りの第1および第2のZFN;ならびに72678と呼ばれるZFNおよび727482と呼ばれるZFNを含むZFPを含む、項目1に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。
(項目3)
以下:72678と呼ばれる前記ZFN由来のZFPを含むZFN、および72732と呼ばれる前記ZFN由来のZFPを含むZFNの通りの項目1または2に記載の第1および第2のZFNを含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼ。
(項目4)
項目1から3のいずれかに記載のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド。
(項目5)
第1のZFNをコードする配列と第2のZFNをコードする配列との間に2A配列を含む、項目4に記載のポリヌクレオチド。
(項目6)
項目1から3のいずれかに記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたは項目4もしくは5に記載のポリヌクレオチドを含む細胞であって、前記細胞のゲノムが、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼによって改変される、細胞。
(項目7)
幹細胞または前駆細胞である、項目6に記載の細胞。
(項目8)
ヒト細胞である、項目7に記載の細胞。
(項目9)
ゲノム改変が、挿入、欠失およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目6から8のいずれかに記載の細胞。
(項目10)
1つまたは複数のさらなるゲノム改変をさらに含む、項目6に記載の細胞。
(項目11)
前記さらなるゲノム改変が、T細胞受容体(TCR)遺伝子の改変、HLA-A遺伝子の改変、HLA-B遺伝子の改変、HLA-C遺伝子の改変、TAP遺伝子の改変、CTLA-4遺伝子の改変、PD1遺伝子の改変、CISH遺伝子の改変、tet-2遺伝子の改変、および/または前記ゲノムへの導入遺伝子の挿入を含む、項目10に記載の細胞。
(項目12)
前記導入遺伝子が少なくとも1つのキメラ抗原受容体(CAR)をコードする、項目11に記載の細胞。
(項目13)
エフェクターT細胞または制御T細胞である、項目12に記載の細胞。
(項目14)
項目6から13のいずれかに記載の細胞に由来する細胞または細胞株。
(項目15)
項目4もしくは5に記載のポリヌクレオチドによるジンクフィンガーヌクレアーゼ、または項目12もしくは13に記載の細胞を含む、医薬組成物。
(項目16)
細胞中の内因性ベータ-2-ミクログロブリン(B2M)遺伝子を改変する方法であって、前記内因性B2M遺伝子が改変されるように項目4または5に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に投与するステップを含む、方法。
(項目17)
外因性配列が前記内因性B2M遺伝子に挿入されるように前記外因性配列を前記細胞に導入するステップをさらに含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記改変が欠失を含む、項目16または17に記載の方法。
(項目19)
内因性B2M遺伝子内にゲノム改変を含む、遺伝的に改変された細胞を産生する方法であって、
a)細胞を項目4または5に記載のポリヌクレオチドと接触させるステップ;
b)前記ポリヌクレオチドからの融合タンパク質の発現を促進する条件に前記細胞を供するステップ;および
c)前記遺伝的に改変された細胞を産生するために十分な発現された前記融合タンパク質を用いて、前記内因性B2M遺伝子を改変するステップ
を含む、方法。
(項目20)
項目4または5に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
(項目21)
被験体におけるがんを処置および予防する方法であって、項目6から14のいずれかに記載の細胞または項目15に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目22)
被験体における自己免疫性疾患を処置または予防する方法であって、項目6から14のいずれかに記載の細胞または項目15に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
(項目23)
左のZFNおよび右のZFNを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)であって、前記左のZFNおよび前記右のZFNは、以下:68796と呼ばれるZFNおよび68813と呼ばれるZFN;68796と呼ばれるZFNおよび68861と呼ばれるZFN;68812と呼ばれるZFNおよび68813と呼ばれるZFN;68876と呼ばれるZFNおよび68877と呼ばれるZFN;68815と呼ばれるZFNおよび55266と呼ばれるZFN;68879と呼ばれるZFNおよび55266と呼ばれるZFN;68798と呼ばれるZFNおよび68815と呼ばれるZFN;または68846と呼ばれるZFNおよび53853と呼ばれるZFNの通りである、ZFN。
(項目24)
項目23に記載の1つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、必要に応じてmRNAである、ポリヌクレオチド。
(項目25)
左のZFNをコードする配列と右のZFNをコードする配列との間に2A配列を含む、項目24に記載のポリヌクレオチド。
(項目26)
項目23から25のいずれかに記載のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む細胞であって、前記細胞のゲノムが前記ジンクフィンガーヌクレアーゼによって改変されている、細胞。
(項目27)
幹細胞または前駆細胞である、項目26に記載の細胞。
(項目28)
ヒト細胞である、項目26または27に記載の細胞。
(項目29)
ゲノム改変が、挿入、欠失およびそれらの組合せからなる群より選択される、項目26から28のいずれかに記載の細胞。
(項目30)
1つまたは複数のさらなるゲノム改変をさらに含む、項目29に記載の細胞。
(項目31)
前記さらなるゲノム改変が、B2M遺伝子の改変、HLA-A遺伝子の改変、HLA-B遺伝子の改変、HLA-C遺伝子の改変、TAP遺伝子の改変、CTLA-4遺伝子の改変、PD1遺伝子の改変、および/または前記ゲノムへの導入遺伝子の挿入を含む、項目30に記載の細胞。
(項目32)
前記導入遺伝子が少なくとも1つのキメラ抗原受容体(CAR)をコードする、項目31に記載の細胞。
(項目33)
幹細胞である、項目31または32に記載の細胞。
(項目34)
項目26から33のいずれかに記載の細胞に由来する細胞または細胞株。
(項目35)
項目24もしくは25に記載のポリヌクレオチドによるジンクフィンガーヌクレアーゼ、または項目26から34のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
(項目36)
細胞において内因性T細胞受容体(TCR)遺伝子を改変する方法であって、前記内因性TCR遺伝子が改変されるように項目24または25に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に投与するステップを含む、方法。
(項目37)
外因性配列が前記内因性TCR遺伝子に挿入されるように、前記外因性配列を前記細胞に導入するステップをさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記改変が欠失を含む、項目36に記載の方法。
(項目39)
内因性TCR遺伝子内にゲノム改変を含む遺伝的に改変された細胞を産生する方法であって、
a)細胞を項目24または25に記載のポリヌクレオチドと接触させるステップ;
b)前記ポリヌクレオチドからの融合タンパク質の発現を促進する条件に前記細胞を供するステップ;および
c)前記遺伝的に改変された細胞を産生するために十分な発現された前記融合タンパク質を用いて前記内因性TCR遺伝子を改変するステップ
を含む、方法。
(項目40)
項目24または25に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
(項目41)
がんまたは移植片対宿主病および被験体を処置および予防する方法であって、項目26から34のいずれかの細胞を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
Claims (20)
- 第1のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)および第2のZFNを含むZFNであって、ここで、前記第1のZFNおよび前記第2のZFNは、以下;
ジンクフィンガータンパク質(ZFP);
工学技術で作製されたFokI切断ドメイン;および
前記FokI切断ドメインと前記ZFPとの間のリンカー
を含み、
ここで、前記第1のZFNからの前記ZFPは、F1からF5の順の5つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガードメインは、それぞれ配列番号128、42、129、130および66の認識ヘリックス領域を含み、
ここで、前記第2のZFNからの前記ZFPは、F1からF6の順の6つのジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガードメインは、それぞれ配列番号131、132、22、133、29および134の認識ヘリックス領域を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼ。 - 請求項1に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 前記第1のZFNをコードする配列と前記第2のZFNをコードする配列との間に2A配列を含む、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたは請求項2もしくは3に記載のポリヌクレオチドを含む細胞であって、前記細胞のゲノムが、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼによって改変される、細胞。
- 幹細胞または前駆細胞である、請求項4に記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項5に記載の細胞。
- ゲノム改変が、挿入、欠失およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項4から6のいずれかに記載の細胞。
- 1つまたは複数のさらなるゲノム改変をさらに含む、請求項4に記載の細胞。
- 前記さらなるゲノム改変が、T細胞受容体(TCR)遺伝子の改変、HLA-A遺伝子の改変、HLA-B遺伝子の改変、HLA-C遺伝子の改変、TAP遺伝子の改変、CTLA-4遺伝子の改変、PD1遺伝子の改変、CISH遺伝子の改変、tet-2遺伝子の改変、および/または前記ゲノムへの導入遺伝子の挿入を含む、請求項8に記載の細胞。
- 前記導入遺伝子が少なくとも1つのキメラ抗原受容体(CAR)をコードする、請求項9に記載の細胞。
- エフェクターT細胞または制御T細胞である、請求項10に記載の細胞。
- 請求項4から11のいずれかに記載の細胞の子孫である細胞または細胞株。
- 請求項1に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項2もしくは3に記載のポリヌクレオチド、または請求項10もしくは11に記載の細胞を含む、医薬組成物。
- 細胞中の内因性ベータ-2-ミクログロブリン(B2M)遺伝子を改変する方法において使用するための、請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記方法は、前記内因性B2M遺伝子が改変されるように請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に投与するステップを含む、組成物。
- 前記方法は、外因性配列が前記内因性B2M遺伝子に挿入されるように前記外因性配列を前記細胞に導入するステップをさらに含む、請求項14に記載の組成物。
- 前記改変が欠失を含む、請求項14または15に記載の組成物。
- 内因性B2M遺伝子内にゲノム改変を含む、遺伝的に改変された細胞を産生する方法において使用するための、請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記方法は、
a)細胞を請求項2または3に記載のポリヌクレオチドと接触させるステップ;
b)前記ポリヌクレオチドからの前記ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を促進する条件に前記細胞を供するステップ;および
c)前記遺伝的に改変された細胞を産生するために十分に発現された前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、前記内因性B2M遺伝子を改変するステップ
を含む、組成物。 - 請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
- 被験体におけるがんを処置および予防するための、請求項4から12のいずれかに記載の細胞を含む組成物または請求項13に記載の医薬組成物。
- 被験体における自己免疫性疾患を処置または予防するための、請求項4から12のいずれかに記載の細胞を含む組成物または請求項13に記載の医薬組成物。
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