JP7418729B2 - Nucleic acid aptamer, human mesenchymal stem cell adsorbent, human mesenchymal stem cell isolation method, human mesenchymal stem cell detection method - Google Patents
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Description
本発明は、核酸アプタマー、ヒト間葉系幹細胞吸着剤、ヒト間葉系幹細胞の分離方法、ヒト間葉系幹細胞の検出方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid aptamer, a human mesenchymal stem cell adsorbent, a method for separating human mesenchymal stem cells, and a method for detecting human mesenchymal stem cells.
近年、再生医療に関する研究開発が活発化しており、幹細胞を用いた技術はその中核を占めている。幹細胞の中でも、生体内に存在する体性幹細胞の一種である間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；以下、「ＭＳＣ」ともいう。）は、骨、軟骨、筋肉等の多様な細胞への分化能を有し、骨髄、脂肪組織、歯髄等の多様な採取源があることから、再生医療で使用される組織や臓器の細胞供給源として期待されている（非特許文献１）。 In recent years, research and development related to regenerative medicine has become active, and technology using stem cells is at the core of it. Among stem cells, mesenchymal stem cells (hereinafter also referred to as "MSCs"), which are a type of somatic stem cells that exist in the body, have the ability to differentiate into various cells such as bone, cartilage, and muscle. Since there are various collection sources such as bone marrow, adipose tissue, and dental pulp, it is expected to be a cell source for tissues and organs used in regenerative medicine (Non-Patent Document 1).
ＭＳＣは多様な採取源から取得できる一方で、採取源にはＭＳＣ以外の細胞も存在することから、従来より、採取した組織等の細胞集団からＭＳＣのみを効率よく分離する方法が検討されてきた。このような方法として、例えば、ＭＳＣの細胞表面マーカーに対する抗体及びフローサイトメーター等を利用した方法等が挙げられる。 While MSCs can be obtained from a variety of sources, there are also cells other than MSCs in the sources, so methods for efficiently separating only MSCs from cell populations such as collected tissues have been studied. . Examples of such methods include methods using antibodies against cell surface markers of MSCs and a flow cytometer.
しかし、従来の方法では、ＭＳＣを特異的に分離することが困難であり得た。 However, with conventional methods, it can be difficult to specifically separate MSCs.
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、ヒト間葉系幹細胞を特異的に分離できる技術の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above situation, and aims to provide a technique that can specifically isolate human mesenchymal stem cells.
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒト間葉系幹細胞に対して選択的な結合性を有する新規な核酸アプタマーを見出した。さらに、該核酸アプタマーは、ヒト間葉系幹細胞の吸着剤として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下を提供する。 As a result of intensive studies aimed at solving the above-mentioned problems, the present inventors discovered a novel nucleic acid aptamer that selectively binds to human mesenchymal stem cells. Furthermore, the inventors discovered that the nucleic acid aptamer can be used as an adsorbent for human mesenchymal stem cells, leading to the completion of the present invention. Specifically, the present invention provides the following.
（１） 以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含み、且つ、ヒト間葉系幹細胞に結合性を有する核酸アプタマー。
（ａ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列
（ｂ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列
(1) A nucleic acid aptamer containing the following base sequence (a) or (b) and having binding properties to human mesenchymal stem cells.
(a) Base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 8 (b) In the base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 8, 1 to 5 bases are substituted, deleted, inserted, or added. base sequence
（２） 以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含み、且つ、ヒト間葉系幹細胞に結合性を有する核酸アプタマー。
（ｃ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列
（ｄ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列
(2) A nucleic acid aptamer containing the following base sequence (c) or (d) and having binding properties to human mesenchymal stem cells.
(c) Base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 9 to 16 (d) In the base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 9 to 16, 1 to 5 bases are substituted, deleted, inserted, or added. base sequence
（３） 前記核酸アプタマーがＤＮＡアプタマーである、（１）又は（２）に記載の核酸アプタマー。 (3) The nucleic acid aptamer according to (1) or (2), wherein the nucleic acid aptamer is a DNA aptamer.
（４） 前記（ａ）、前記（ｂ）、前記（ｃ）又は前記（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端が修飾されている、（１）から（３）のいずれかに記載の核酸アプタマー。 (4) Any of (1) to (3), wherein the 3' end and/or 5' end of the base sequence of (a), (b), (c), or (d) is modified. A nucleic acid aptamer described in Crab.
（５） （１）から（４）のいずれかに記載の核酸アプタマーを含むヒト間葉系幹細胞吸着剤。 (5) A human mesenchymal stem cell adsorbent comprising the nucleic acid aptamer according to any one of (1) to (4).
（６） さらに、前記核酸アプタマーが固定化された不溶性担体を含む、（５）に記載のヒト間葉系幹細胞吸着剤。 (6) The human mesenchymal stem cell adsorbent according to (5), further comprising an insoluble carrier on which the nucleic acid aptamer is immobilized.
（７） （５）又は（６）に記載のヒト間葉系幹細胞吸着剤を用いる工程を含む、ヒト間葉系幹細胞の分離方法。 (7) A method for isolating human mesenchymal stem cells, comprising the step of using the human mesenchymal stem cell adsorbent according to (5) or (6).
（８） （１）から（４）のいずれかに記載の核酸アプタマーと、ヒト間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む、ヒト間葉系幹細胞の検出方法。 (8) A method for detecting human mesenchymal stem cells, comprising the step of bringing the nucleic acid aptamer according to any one of (1) to (4) into contact with human mesenchymal stem cells.
本発明によれば、ヒト間葉系幹細胞を特異的に分離できる技術が提供される。 According to the present invention, a technique that can specifically isolate human mesenchymal stem cells is provided.
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれに特に限定されない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail, but the present invention is not particularly limited thereto.
＜本発明のアプタマー＞
本発明のアプタマーは、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、ヒト間葉系幹細胞（以下、「ｈＭＳＣ」ともいう。）に結合性を有する核酸アプタマーである。
（ａ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列
（ｂ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列
（ｃ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列
（ｄ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列
<Aptamer of the present invention>
The aptamer of the present invention contains any of the following base sequences (a), (b), (c), or (d), and is compatible with human mesenchymal stem cells (hereinafter also referred to as "hMSC"). It is a nucleic acid aptamer with binding properties.
(a) Base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 8 (b) In the base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 8, 1 to 5 bases are substituted, deleted, inserted, or added. (c) Base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 9 to 16. (d) Substitution, deletion, or insertion of 1 to 5 bases in the nucleotide sequence shown in any of SEQ ID NOs: 9 to 16. or added base sequence
本発明のアプタマーは、本発明者らがＭＳＣと特異的に結合できる分子を探索した結果、「Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法」（Ｇｕｏ，Ｋ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．９：６６８－６７８，２００８等を参照。）を利用して発明されたものである。 The aptamer of the present invention was developed by the "Cell-SELEX method" (Guo, K.T. et al. Int. J. Mol. Sci. 9: 668-678, 2008, etc.).
配列番号１～１６に示される塩基配列を、表１に示す。なお、以下、塩基配列は、５’末端から３’末端の方向に左から右へ記載する。 The base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 16 are shown in Table 1. Hereinafter, the base sequences will be described from left to right in the direction from the 5' end to the 3' end.
なお、配列番号９～１６に示される塩基配列は、それぞれ、配列番号１～８に示される塩基配列の３’末端側に、３塩基のチミンからなる「リンカー配列」（ＴＴＴ）及びポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）で増幅するための１８塩基からなる「プライマー配列」を付加した塩基配列である。 The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 9 to 16 have a "linker sequence" (TTT) consisting of 3 bases of thymine and a polymerase chain reaction sequence on the 3' end side of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 8, respectively. This is a base sequence to which a "primer sequence" consisting of 18 bases is added for amplification by (Polymerase Chain Reaction; PCR).
本発明において、「核酸アプタマー」とは、特定の標的と高い特異性で結合できる核酸分子を意味する。本発明において、核酸アプタマーの標的は、ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；以下、「ｈＭＳＣ」ともいう。）である。 In the present invention, "nucleic acid aptamer" means a nucleic acid molecule that can bind to a specific target with high specificity. In the present invention, the target of the nucleic acid aptamer is human mesenchymal stem cells (hereinafter also referred to as "hMSC").
本発明において、核酸アプタマーを構成する核酸は、任意の核酸であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの混合物が挙げられる。本発明のアプタマーは、加水分解に対する安定性が高い等の取扱いが容易な点から、好ましくはＤＮＡを含むアプタマー（ＤＮＡアプタマー）である。本発明のアプタマーは、より好ましくは、ＤＮＡからなるアプタマーである。 In the present invention, the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer may be any nucleic acid, and includes, for example, DNA, RNA, and mixtures thereof. The aptamer of the present invention is preferably an aptamer containing DNA (DNA aptamer) because it has high stability against hydrolysis and is easy to handle. The aptamer of the present invention is more preferably an aptamer consisting of DNA.
本発明のアプタマーは、上記（ｂ）又は（ｄ）に示されるとおり、ｈＭＳＣに対する結合性を有する限り、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列であってもよい。以下、（ｂ）又は（ｄ）の態様の核酸アプタマーを「改変を含む核酸アプタマー」ともいう。 As shown in (b) or (d) above, the aptamer of the present invention has 1 to 5 base substitutions in the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 16, as long as it has binding property to hMSC. , deletion, insertion, or addition. Hereinafter, the nucleic acid aptamer of embodiment (b) or (d) will also be referred to as "nucleic acid aptamer containing modification."
改変を含む核酸アプタマーがｈＭＳＣに対する結合性を有するかどうかは、実施例に示したフローサイトメトリーやドットプロット等の、ｈＭＳＣに対する結合性を評価できる方法によって容易に特定できる。例えば、ｈＭＳＣに対する結合性が、ｈＭＳＣ以外の細胞に対する結合性よりも相対的に高ければ、改変を含む核酸アプタマーがｈＭＳＣに対する結合性を有すると評価できる。 Whether a nucleic acid aptamer containing a modification has binding property to hMSCs can be easily determined by a method capable of evaluating binding property to hMSCs, such as flow cytometry or dot plot shown in the Examples. For example, if the binding property to hMSC is relatively higher than the binding property to cells other than hMSC, it can be evaluated that the modified nucleic acid aptamer has binding property to hMSC.
改変を含む核酸アプタマーが有する改変（置換、欠失、挿入又は付加）は、ｈＭＳＣに対する結合性を阻害しないように適宜設定できる。例えば、遺伝的アルゴリズム（例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ法（Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．３３， Ｎｏ．１２， ｅ１０８， ２００５））等を用いて、適切な改変を選択できる。 The modification (substitution, deletion, insertion, or addition) of a nucleic acid aptamer containing modification can be appropriately set so as not to inhibit binding to hMSC. For example, an appropriate modification can be selected using a genetic algorithm (e.g., in silico maturation method (Ikebukuro, K. et al. Nucl. Acids Res., Vol. 33, No. 12, e108, 2005)). .
改変を含む核酸アプタマーが有する改変は、核酸アプタマーのｈＭＳＣに対する結合性を大きく損なわない範囲で設定でき、好ましくは３個以下、より好ましくは１個の塩基の改変（置換、欠失、挿入又は付加）である。 The modification that the nucleic acid aptamer has can be set within a range that does not significantly impair the binding of the nucleic acid aptamer to hMSC, and is preferably 3 or less base modifications, more preferably 1 base modification (substitution, deletion, insertion, or addition). ).
本発明のアプタマーは、ＭＳＣに対する結合性を有する限り、核酸アプタマーの安定性を向上させる点や、後述するｈＭＳＣの検出及びｈＭＳＣの吸着剤への応用をしやすくする点等から、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端に任意の配列や修飾が付加されたものであってもよい。付加され得る配列としては、例えば、ＰＣＲで増幅するためのプライマー配列、スペーサー配列、メチル基等が挙げられる。付加され得る修飾としては、ＤＮＡ修飾、標識物質（蛍光性物質等）による修飾、反応性官能基（カルボキシル基等）、ビオチンによる修飾、プライマー配列に対する相補鎖等が挙げられる。これらの配列や修飾の種類や長さは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列の立体構造に大きな影響を与えず、ＭＳＣに対する結合性を損なわない範囲で適宜設定できる。 The aptamer of the present invention improves the stability of the nucleic acid aptamer as long as it has binding properties to MSC, and it facilitates the detection of hMSC and application to an adsorbent for hMSC, which will be described later, from the viewpoints of (a), Any sequence or modification may be added to the 3' end and/or 5' end of the base sequence of (b), (c) or (d). Examples of sequences that can be added include primer sequences for PCR amplification, spacer sequences, methyl groups, and the like. Examples of modifications that can be added include DNA modification, modification with a labeling substance (fluorescent substance, etc.), reactive functional group (carboxyl group, etc.), modification with biotin, complementary strand to the primer sequence, and the like. The types and lengths of these sequences and modifications may be determined as appropriate within the range that does not significantly affect the three-dimensional structure of the base sequences (a), (b), (c), or (d) and do not impair binding to MSC. Can be set.
ＰＣＲで増幅するためのプライマー配列としては、合計１０～３０塩基程度の配列長が好ましく、例えば、配列番号１８や配列番号１９で示される２０塩基程度の配列を挙げることができる。 Primer sequences for amplification by PCR preferably have a total sequence length of about 10 to 30 bases, and include, for example, the sequences of about 20 bases shown in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
スペーサー配列としては、核酸アプタマーの立体構造を維持しやすいという観点から、合計２～１０塩基程度の配列長が好ましい。 The spacer sequence preferably has a total sequence length of about 2 to 10 bases from the viewpoint of easily maintaining the three-dimensional structure of the nucleic acid aptamer.
ＤＮＡ修飾は、本発明のアプタマーの安定性を向上させる観点等から有効である。 DNA modification is effective from the viewpoint of improving the stability of the aptamer of the present invention.
標識物質による修飾は、ｈＭＳＣの検出に利用しやすいという観点等から有効である。標識物質としては、例えば、蛍光性物質、放射性物質、反応性を有するタンパク質（酵素や抗体等）、ビオチン等が挙げられる。これらのうち、修飾や検出が容易である点で、蛍光性物質が好ましい。 Modification with a labeling substance is effective from the viewpoint of ease of use in detecting hMSCs. Examples of the labeling substance include fluorescent substances, radioactive substances, reactive proteins (such as enzymes and antibodies), and biotin. Among these, fluorescent substances are preferred because they are easy to modify and detect.
蛍光性物質としては、当該技術分野において通常使用される蛍光性物質を用いることができ、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシリーズ蛍光色素（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、ＤｙＬｉｇｈｔシリーズ蛍光色素（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、緑色蛍光タンパク質等が挙げられる。 As the fluorescent substance, fluorescent substances commonly used in the technical field can be used, such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, Cy dye, and Alexa Fluor series fluorescent dye (manufactured by Thermo Fisher Scientific). , DyLight series fluorescent dye (manufactured by Thermo Fisher Scientific), green fluorescent protein, and the like.
反応性官能基（カルボキシル基等）、ビオチンによる修飾は、本発明のアプタマーをｈＭＳＣの吸着剤へ応用する際に有効である。 Modification with a reactive functional group (such as a carboxyl group) or biotin is effective when applying the aptamer of the present invention to an adsorbent for hMSC.
プライマー配列に対する相補鎖は、本発明のアプタマーがＰＣＲで増幅するためのプライマー配列を有する場合に、該プライマー配列に対応した配列として適宜設定される。相補鎖は、核酸アプタマーの立体構造を維持しやすいという観点から、合計１０～３０塩基程度の配列長が好ましい。 When the aptamer of the present invention has a primer sequence for amplification by PCR, the complementary strand to the primer sequence is appropriately set as a sequence corresponding to the primer sequence. The complementary strand preferably has a total sequence length of about 10 to 30 bases from the viewpoint of easily maintaining the three-dimensional structure of the nucleic acid aptamer.
本発明のアプタマーが（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含む場合、該塩基配列に含まれるプライマー配列に対する好ましい相補鎖としては、配列番号２１に示される塩基配列からなるものが挙げられる。 When the aptamer of the present invention includes the base sequence (c) or (d), a preferable complementary strand to the primer sequence included in the base sequence includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 21.
本発明のアプタマーの３’末端及び／又は５’末端にプライマー配列や修飾を付加する場合、これらのプライマー配列や修飾は、例えば以下のように配置され得る。
（１）スペーサー配列が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列と、プライマー配列や修飾と、の間に配置される。
（２）プライマー配列に対する相補鎖が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列と、プライマー配列と、の間に配置される。
When adding primer sequences and modifications to the 3' end and/or 5' end of the aptamer of the present invention, these primer sequences and modifications can be arranged, for example, as follows.
(1) A spacer sequence is placed between the base sequence (a), (b), (c), or (d) and the primer sequence or modification.
(2) A complementary strand to the primer sequence is placed between the base sequence of (a), (b), (c) or (d) and the primer sequence.
本発明のアプタマーの長さは、ｈＭＳＣに対する結合性を有する限り特に限定されない。例えば、高い安定性を有する点や容易に製造可能である点から、好ましくは合計１５～１００塩基、より好ましくは合計２０～５０塩基の配列長である。 The length of the aptamer of the present invention is not particularly limited as long as it has binding property to hMSC. For example, the sequence length is preferably 15 to 100 bases in total, more preferably 20 to 50 bases in total, from the viewpoint of high stability and easy production.
＜本発明のアプタマーの製造方法＞
本発明のアプタマーは、当該技術分野において核酸合成方法として知られる公知の方法によって製造できる。
<Method for producing aptamer of the present invention>
The aptamer of the present invention can be produced by a known method known in the art as a nucleic acid synthesis method.
＜本発明のアプタマーの特性＞
本発明のアプタマーは、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）への特異的な結合性を有する。
<Characteristics of the aptamer of the present invention>
The aptamer of the present invention has specific binding to human mesenchymal stem cells (hMSC).
本発明において、「ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）」としては、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等のｈＭＳＣ陽性マーカータンパク質を発現していれば、その由来は特に限定されない。例えば、骨髄由来ＭＳＣ、脂肪組織由来ｈＭＳＣ、歯髄由来ｈＭＳＣ、臍帯血由来ｈＭＳＣ、羊膜由来ｈＭＳＣ等が挙げられる。 In the present invention, the origin of "human mesenchymal stem cells (hMSCs)" is not particularly limited as long as they express hMSC-positive marker proteins such as CD44, CD73, CD90, and CD105. Examples include bone marrow-derived MSC, adipose tissue-derived hMSC, dental pulp-derived hMSC, umbilical cord blood-derived hMSC, amniotic membrane-derived hMSC, and the like.
本発明において、「ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）への特異的な結合性を有する」とは、ｈＭＳＣへの結合性と比較して、ｈＭＳＣ以外の細胞への結合性が低いか、又は結合性が認められないことを意味する。ｈＭＳＣ及びｈＭＳＣ以外の結合性は、実施例に示した結合能の評価方法等で特定できる。
なお、ｈＭＳＣ以外の細胞としては、上記のｈＭＳＣ陽性マーカータンパク質を発現していない細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部類上皮がん）、ＨＬ６０細胞（ヒト急性前骨髄性白血病由来細胞株）、Ｒａｍｏｓ細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞））が挙げられる。
In the present invention, "having specific binding to human mesenchymal stem cells (hMSC)" means that the binding to cells other than hMSC is lower than that to hMSC, or It means that gender is not recognized. Binding to hMSC and non-hMSC can be identified by the binding ability evaluation method shown in the Examples.
Cells other than hMSC include cells that do not express the above hMSC positive marker protein (for example, HeLa cells (human cervical epithelioid carcinoma), HL60 cells (human acute promyelocytic leukemia-derived cell line) , Ramos cells (human Burkitt's lymphoma cells)).
＜ヒト間葉系幹細胞吸着剤＞
本発明のアプタマーは、ｈＭＳＣに対するその特異的な結合性を利用し、ヒト間葉系幹細胞吸着剤として好ましく利用できる。
<Human mesenchymal stem cell adsorbent>
The aptamer of the present invention can be preferably used as a human mesenchymal stem cell adsorbent by utilizing its specific binding property to hMSC.
本発明のヒト間葉系幹細胞吸着剤（以下、「本発明の吸着剤」ともいう。）は、本発明のアプタマーを含む。本発明の吸着剤は、ヒト間葉系幹細胞に対する高い結合能を有する。 The human mesenchymal stem cell adsorbent of the present invention (hereinafter also referred to as "the adsorbent of the present invention") contains the aptamer of the present invention. The adsorbent of the present invention has high binding ability to human mesenchymal stem cells.
本発明の吸着剤は、ヒト間葉系幹細胞の単離が容易になるという観点から、好ましくは、本発明のアプタマーと、該アプタマーが固定化された不溶性担体と、を含む。 The adsorbent of the present invention preferably contains the aptamer of the present invention and an insoluble carrier on which the aptamer is immobilized, from the viewpoint of facilitating the isolation of human mesenchymal stem cells.
不溶性担体としては、本発明のアプタマーを保持できる不溶性物質であれば特に限定されないが、以下が挙げられる。
アガロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、及びプルラン等の多糖類を原料とした多糖系担体、並びに、これらを架橋剤で架橋した架橋多糖系担体；
ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、及びポリスチレン等の合成高分子系担体、並びに、これらを架橋剤で架橋した架橋合成高分子系担体。
上記のうち、親水性が高く、ｈＭＳＣ以外の細胞や生体分子（タンパク質等）との非特異的な吸着を低減しやすいという点で、アガロース、セルロース、デキストラン、及びプルラン等の電荷を有さない多糖系担体、並びに、これらの架橋多糖系担体や、ポリメタクリレート、及びポリビニルアルコール等の親水性合成高分子系担体、並びに、これらの架橋親水性合成高分子系担体が好ましい。
The insoluble carrier is not particularly limited as long as it is an insoluble substance that can retain the aptamer of the present invention, but the following may be mentioned.
Polysaccharide carriers made from polysaccharides such as agarose, cellulose, chitin, chitosan, dextran, and pullulan, and crosslinked polysaccharide carriers made by crosslinking these with a crosslinking agent;
Synthetic polymer carriers such as polymethacrylate, polyvinyl alcohol, polyurethane, and polystyrene, and crosslinked synthetic polymer carriers obtained by crosslinking these with a crosslinking agent.
Among the above, it does not have an electric charge, such as agarose, cellulose, dextran, and pullulan, in that it is highly hydrophilic and easily reduces nonspecific adsorption with cells other than hMSCs and biomolecules (proteins, etc.). Polysaccharide carriers, crosslinked polysaccharide carriers, hydrophilic synthetic polymer carriers such as polymethacrylate and polyvinyl alcohol, and crosslinked hydrophilic synthetic polymer carriers are preferred.
不溶性担体は、多孔性又は無孔性のいずれであってもよい。 Insoluble carriers may be porous or nonporous.
不溶性担体の形状に特に制限はなく、粒子状、スポンジ状、平膜状、平板状、中空状、繊維状等のいずれであってもよい。上記のうち、吸着剤への細胞吸着を効率的に行いやすいという点から、粒子状の担体が好ましく、真球状の粒子状担体がより好ましい。 There is no particular restriction on the shape of the insoluble carrier, and it may be in the form of particles, sponges, flat membranes, plates, hollows, fibers, or the like. Among the above, particulate carriers are preferred, and spherical particulate carriers are more preferred, from the standpoint that cells can be easily adsorbed onto the adsorbent efficiently.
不溶性担体は、本発明のアプタマーを担体に固定化するための修飾が容易に行えるという点で、水酸基を有する粒子状担体であることが好ましい。このような粒子状担体としては、ポリ（メタ）アクリレートを原料とした「トヨパール」（東ソー製）や、アガロースを原料とした「Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」（ＧＥヘルスケア製）、セルロースを原料とした「セルフィア」（旭化成製）等の市販品を使用することもできる。 The insoluble carrier is preferably a particulate carrier having a hydroxyl group, since it can be easily modified to immobilize the aptamer of the present invention on the carrier. Examples of such particulate carriers include "Toyopearl" (manufactured by Tosoh), which is made from poly(meth)acrylate, "Sepharose" (manufactured by GE Healthcare), which is made from agarose, and "Selphia", which is made from cellulose. Commercially available products such as (manufactured by Asahi Kasei) can also be used.
不溶性担体の粒径は、ｈＭＳＣが吸着剤の表面と十分接触でき、且つ、吸着剤に結合しない細胞が吸着剤間の隙間を目詰まりさせずに通過しやすいという点で、好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下であり、より好ましくは１００μｍ以上３００μｍ以下である。粒径が１００μｍ未満の場合には吸着剤に結合しない細胞による目詰まりが発生しやすく、ｈＭＳＣの分離が不十分となる可能性がある。粒径が５００μｍ超の場合には、吸着剤とｈＭＳＣとの接触が不十分となりやすく、ｈＭＳＣの吸着剤への結合量が低下する可能性がある。 The particle size of the insoluble carrier is preferably 100 μm or more and 500 μm, in that hMSCs can make sufficient contact with the surface of the adsorbent, and cells that do not bind to the adsorbent can easily pass through the gaps between the adsorbents without clogging them. or less, more preferably 100 μm or more and 300 μm or less. If the particle size is less than 100 μm, clogging with cells that do not bind to the adsorbent is likely to occur, and hMSC separation may become insufficient. When the particle size exceeds 500 μm, contact between the adsorbent and hMSC tends to be insufficient, and the amount of hMSC bound to the adsorbent may decrease.
不溶性担体の粒径は、例えば、ベックマンコールター（株）製の精密粒度分布測定装置等を用いて測定することができる。 The particle size of the insoluble carrier can be measured using, for example, a precision particle size distribution analyzer manufactured by Beckman Coulter.
本発明のアプタマーを不溶性担体に固定化する方法は、不溶性担体の種類等に応じて、核酸を固定できる任意の方法を採用できる。例えば、共有結合を形成せずに固定化する方法、共有結合を形成させて固定化する方法等が挙げられる。 As a method for immobilizing the aptamer of the present invention on an insoluble carrier, any method capable of immobilizing a nucleic acid can be adopted depending on the type of insoluble carrier. Examples include a method of immobilization without forming a covalent bond, a method of immobilization by forming a covalent bond, and the like.
共有結合を形成せずに固定化する方法は、通常、アフィニティー結合（アビジン－ビオチンのアフィニティー結合等）や配位結合等を利用する。 A method of immobilization without forming a covalent bond usually utilizes affinity bonding (avidin-biotin affinity bonding, etc.), coordinate bonding, or the like.
例えば、アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法は以下のように実施できる。当該技術分野において一般的な方法により３’及び／又は５’末端にビオチンを導入した本発明のアプタマーを、アビジン固定化担体に固定化する方法が、アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法として挙げられる。 For example, a method using avidin-biotin affinity binding can be carried out as follows. A method of immobilizing the aptamer of the present invention into which biotin has been introduced at the 3' and/or 5' end by a method common in the art onto an avidin immobilization carrier is a method that utilizes avidin-biotin affinity bonding. Can be mentioned.
アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法で用いるアビジン固定化担体としては、担体に導入した、アミノ基との反応性を有する官能基（ホルミル基や活性エステル基等）と、アビジン中に存在するリジン残基の側鎖アミノ基とを反応させる方法等の、担体へのタンパク質固定化方法として一般的に使用される方法によりアビジンを固定化した担体を用いることができる。また、「ストレプトアビジンセファロースハイパフォーマンス」（ＧＥヘルスケア製）等の市販品も用いることができる。 The avidin-immobilized carrier used in the method utilizing avidin-biotin affinity bond has a functional group (formyl group, active ester group, etc.) that is reactive with an amino group introduced into the carrier, and a functional group that is present in avidin. A carrier can be used in which avidin is immobilized by a method generally used for immobilizing proteins on a carrier, such as a method of reacting with a side chain amino group of a lysine residue. Additionally, commercially available products such as "Streptavidin Sepharose High Performance" (manufactured by GE Healthcare) can also be used.
アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法で用いるアビジンとしては、ストレプトアビジン、アビジン様組換えタンパク質（「Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２」（富士フイルム、和光純薬等）等）を用いることができる。 As the avidin used in the method utilizing avidin-biotin affinity binding, streptavidin, avidin-like recombinant protein ("Tamavidin 2" (Fuji Film, Wako Pure Chemical, etc.), etc.) can be used.
アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法における、担体へのホルミル基の導入法としては、例えば、水酸基を有する担体を、エピクロロヒドリンやエチレングリコールジグリシジルエーテル等でエポキシ化したのち、アミノ基を有する糖類（Ｄ－グルコサミンやＤ－グルカミン等）を反応させ、隣接する水酸基を担体に導入し、次いで、過ヨウ素酸ナトリウムを作用させる方法が挙げられる。 In a method using avidin-biotin affinity bonding, a formyl group can be introduced into a carrier by, for example, epoxidizing a carrier having a hydroxyl group with epichlorohydrin, ethylene glycol diglycidyl ether, etc., and then adding an amino group to the carrier. Examples include a method in which a saccharide (such as D-glucosamine or D-glucamine) having
アビジン－ビオチンのアフィニティー結合を利用した方法における、担体への活性エステル基の導入法としては、例えば、水酸基を有する担体と、ハロ酢酸（モノクロロ酢酸、モノブロモ酢酸等）とを反応させたのち、縮合剤存在下でＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させる方法が挙げられる。 In a method using avidin-biotin affinity bonding, an active ester group can be introduced into a carrier by, for example, reacting a carrier having a hydroxyl group with a haloacetic acid (monochloroacetic acid, monobromoacetic acid, etc.), and then condensing it. Examples include a method of reacting with N-hydroxysuccinimide in the presence of an agent.
共有結合を形成させて固定化する方法は、通常、本発明のアプタマーに導入した固定化用官能基と、反応性官能基を導入した担体との反応等を利用する。 The method of immobilization by forming a covalent bond usually utilizes a reaction between the immobilization functional group introduced into the aptamer of the present invention and a carrier into which a reactive functional group is introduced.
共有結合を形成させて固定化する方法としては、例えば、当該技術分野において一般的な方法により３’末端及び／又は５’末端にアミノ基を導入した本発明のアプタマーを、アミノ基との反応性を有する反応性官能基（ホルミル基、カルボキシル基、活性エステル基、エポキシ基等）を導入した担体と反応させて固定化する方法が挙げられる。 As a method for immobilization by forming a covalent bond, for example, the aptamer of the present invention having an amino group introduced at the 3' end and/or 5' end by a method common in the technical field may be reacted with an amino group. Examples include a method of immobilization by reaction with a carrier into which a reactive functional group (formyl group, carboxyl group, active ester group, epoxy group, etc.) has been introduced.
＜本発明の吸着剤を用いたヒト間葉系幹細胞の分離方法＞
本発明の吸着剤を用いることで、任意の細胞混合物から、該細胞混合物中のｈＭＳＣを、ｈＭＳＣ以外の細胞から選択的に分離することができる。
<Method for separating human mesenchymal stem cells using the adsorbent of the present invention>
By using the adsorbent of the present invention, hMSCs in any cell mixture can be selectively separated from cells other than hMSCs.
例えば、本発明の吸着剤と、ｈＭＳＣ及びｈＭＳＣ以外の細胞を含む細胞混合液とを接触させた後、細胞は通過するが吸着剤は通過しない大きさの目開きを有するフィルター等を利用して吸着剤に結合しなかった細胞を除去することにより、ｈＭＳＣを吸着剤に結合した形で分離することができる。吸着剤に結合したｈＭＳＣは、例えば、核酸分解酵素を作用させて本発明のアプタマーを分解することにより、回収することができる。 For example, after the adsorbent of the present invention is brought into contact with a cell mixture containing hMSCs and cells other than hMSCs, a filter or the like having openings large enough to allow cells to pass through but not the adsorbent to pass through is used. hMSCs can be separated in adsorbent-bound form by removing cells that are not bound to the adsorbent. The hMSCs bound to the adsorbent can be recovered, for example, by treating the aptamer of the present invention with a nuclease.
本発明の吸着剤と、細胞混合液との接触方法は特に制限されず、細胞混合物中に吸着剤を添加し、一定時間振盪する方法や、吸着剤をカラムに充填して細胞混合物と接触させる方法等が挙げられる。 The method of contacting the adsorbent of the present invention with the cell mixture is not particularly limited, and may include adding the adsorbent to the cell mixture and shaking it for a certain period of time, or filling a column with the adsorbent and bringing it into contact with the cell mixture. Examples include methods.
＜ヒト間葉系幹細胞の検出方法＞
本発明のアプタマーは、ｈＭＳＣに対する特異的な結合性を利用し、ヒト間葉系幹細胞の検出方法において好ましく利用できる。
<Method for detecting human mesenchymal stem cells>
The aptamer of the present invention utilizes its specific binding property to hMSC and can be preferably used in a method for detecting human mesenchymal stem cells.
本発明のヒト間葉系幹細胞の検出方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう。）は、本発明のアプタマーと、ヒト間葉系幹細胞とを接触させる工程を含む。接触させる条件（本発明のアプタマーやｈＭＳＣの量、温度、時間）等は特に限定されず、ｈＭＳＣ表面に本発明のアプタマーが十分に接触できる条件であればよく、例えば、接触時の温度については２０℃から３０℃、接触時間については１０分から３時間を挙げることができる。 The method for detecting human mesenchymal stem cells of the present invention (hereinafter also referred to as "the detection method of the present invention") includes the step of bringing the aptamer of the present invention into contact with human mesenchymal stem cells. The contact conditions (amount of the aptamer of the present invention and hMSC, temperature, time), etc. are not particularly limited, and may be any conditions that allow the aptamer of the present invention to sufficiently contact the hMSC surface. For example, the temperature at the time of contact may be The temperature may be 20°C to 30°C and the contact time may be 10 minutes to 3 hours.
例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列の３’末端及び／又は５’末端に、標識物質（蛍光性物質等）による修飾を有する本発明のアプタマーを利用し、以下のように本発明の検出方法を実施できる。
（１）任意のｈＭＳＣ（組織培養用シャーレ等で培養したｈＭＳＣ、生体から採取した組織や骨髄液中に含まれるｈＭＳＣ等）と、本発明のアプタマーと、を接触させることにより、該アプタマーをｈＭＳＣに結合させる。
（２）接触後、蛍光顕微鏡で観察することにより、ｈＭＳＣを検出する。
For example, the aptamer of the present invention having a labeling substance (fluorescent substance, etc.) modified at the 3' end and/or 5' end of the base sequence (a), (b), (c), or (d) is used. However, the detection method of the present invention can be implemented as follows.
(1) By bringing the aptamer of the present invention into contact with any hMSC (hMSC cultured in a tissue culture dish etc., hMSC contained in tissue or bone marrow fluid collected from a living body, etc.), the aptamer can be used as hMSC. be combined with
(2) After contact, hMSCs are detected by observing with a fluorescence microscope.
以下に、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below based on Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
＜試験１：Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法によるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの探索＞
ランダムＤＮＡライブラリー（配列番号１７、配列長：７２ｍｅｒ、ユーロフィンジェノミクス製）を用い、「Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法」（Ｇｕｏ，Ｋ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．９：６６８－６７８，２００８等を参照。）によりｈＭＳＣ結合性アプタマーの探索を行った。このライブラリーは、３０塩基からなるランダム領域と、その３’末端及び５’末端にリンカーを介して１８塩基からなるプライマー領域と、を含む。
<Test 1: Search for hMSC-binding DNA aptamers by Cell-SELEX method>
Using a random DNA library (SEQ ID NO: 17, sequence length: 72mer, manufactured by Eurofin Genomics), the "Cell-SELEX method" (Guo, K.T. et al. Int. J. Mol. Sci. 9:668- 678, 2008, etc.) to search for hMSC-binding aptamers. This library includes a random region consisting of 30 bases and a primer region consisting of 18 bases via a linker at its 3' and 5' ends.
表２に、以下の試験で用いた、（１）ランダムＤＮＡライブラリー（配列番号１７）、（２）ＰＣＲ増幅に用いたフォワードプライマー（配列番号１８）、及びリバースプライマー（配列番号１９）、並びに、（３）ブロック配列（配列番号２０及び２１）の塩基配列を示す。ランダムＤＮＡライブラリー及びフォワードプライマーは蛍光検出を可能とするため５’末端側をＦＩＴＣ修飾したものを用いた。リバースプライマーは一本鎖ＤＮＡ分子の分離を可能にするため５’末端側をビオチン修飾したものを用いた。 Table 2 shows (1) random DNA library (SEQ ID NO: 17), (2) forward primer (SEQ ID NO: 18) and reverse primer (SEQ ID NO: 19) used in PCR amplification, and , (3) shows the base sequences of the block sequences (SEQ ID NOs: 20 and 21). The random DNA library and forward primer were modified with FITC at the 5' end to enable fluorescence detection. The reverse primer used had its 5' end modified with biotin to enable separation of single-stranded DNA molecules.
なお、表２のランダムＤＮＡライブラリーにおいて、「Ｎ３０」は３０塩基からなるランダム領域を意味し、「ｔｔｔ」は３塩基のチミンからなるリンカー配列を示す。 In the random DNA library shown in Table 2, " N30 " means a random region consisting of 30 bases, and "ttt" indicates a linker sequence consisting of 3 bases of thymine.
以下の試験で用いた各緩衝液の組成を表３に示す。なお、各緩衝液において、溶媒として高純水製造システム（「Ｅｌｉｘ ＵＶ」、メルクミリポア製）で製造した高純水をオートクレーブ滅菌した滅菌水を用いた。 Table 3 shows the composition of each buffer used in the following tests. In each buffer, sterilized water obtained by autoclaving high-purity water produced with a high-purity water production system ("Elix UV", manufactured by Merck Millipore) was used as a solvent.
（ＤＮＡライブラリープール試料の調製）
Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法に使用するランダムＤＮＡライブラリープール試料は、ランダムＤＮＡライブラリーを最終濃度が５μＭとなるように緩衝液Ａに溶解し、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却し、最終濃度が１μＭとなるように緩衝液Ａで希釈することにより調製した。
(Preparation of DNA library pool sample)
For the random DNA library pool sample used in the Cell-SELEX method, a random DNA library was dissolved in buffer A to a final concentration of 5 μM, heated at 95°C for 10 minutes, and then heated for 30 minutes at 25°C. It was prepared by cooling to 0.degree. C. and diluting with buffer A to a final concentration of 1 .mu.M.
（ｈＭＳＣ試料の準備）
Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法に使用するｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）は、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手した。
(Preparation of hMSC sample)
hMSCs (JCRB1133: human bone marrow-derived mesenchymal stem cells) used in the Cell-SELEX method were obtained from the JCRB cell bank.
（ｈＭＳＣ試料の培養）
ｈＭＳＣ試料の培養及び培養物の処理を以下の方法で行った。
(Culture of hMSC sample)
Culture of the hMSC sample and treatment of the culture were performed in the following manner.
［使用培地］
１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製、以下の試験においても同様。）、Ｌ－グルタミン水溶液（富士フイルム和光純薬製、以下の試験においても同様。）及びペニシリン－ストレプトマイシン水溶液（富士フイルム和光純薬製、以下の試験においても同様。）を含むＤ－ＭＥＭ（低グルコース、シグマアルドリッチ製）を用いた。
[Medium used]
10% FBS (manufactured by Biological Industries, same in the following tests), L-glutamine aqueous solution (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical, same in the following tests), and penicillin-streptomycin aqueous solution (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical, same in the following tests). The same applies to the following tests.) D-MEM (low glucose, manufactured by Sigma-Aldrich) was used.
［培養条件］
直径１０ｃｍの組織培養用シャーレ（コーニング製）にｈＭＳＣを播種し、コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養を行った。
[Culture conditions]
hMSCs were seeded in a tissue culture dish (manufactured by Corning) with a diameter of 10 cm, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere until confluent.
［培養物の処理］
培養後、以下の操作を順に行い、ｈＭＳＣに結合性を有する一本鎖ＤＮＡ分子（以下、「ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子」ともいう。）を調製した。
（１）培養後、シャーレから培地を除去したのち、緩衝液Ｂを用いて、培養物を２回洗浄した。
（２）洗浄後のシャーレに、ランダムＤＮＡライブラリープール試料１ｍＬを添加し、室温で１時間放置してｈＭＳＣとランダムＤＮＡライブラリーとを接触させた。次いで、緩衝液Ｂを用いて３回洗浄し、ｈＭＳＣに結合しなかったランダムＤＮＡライブラリーを除去した。
（３）ＤＮＡ分解酵素を含まない水（０．５ｍＬ）をシャーレに添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離して遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで３分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。
（４）遠心分離容器に緩衝液Ｃ（０．１２ｍＬ）を添加してｈＭＳＣを含む沈殿物を懸濁し、９５℃で１０分間加熱処理してｈＭＳＣに結合したＤＮＡ分子を遊離させたのち、１３１００ｇで５分間遠心分離処理を行い、ｈＭＳＣに結合性を有するＤＮＡ分子を含む上清を回収した。
（５）回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却して一本鎖に調製した。
[Culture treatment]
After culturing, the following operations were performed in order to prepare a single-stranded DNA molecule capable of binding to hMSC (hereinafter also referred to as "hMSC-binding DNA molecule").
(1) After culturing, the culture medium was removed from the petri dish, and then the culture was washed twice with buffer B.
(2) 1 mL of random DNA library pool sample was added to the washed petri dish, and the mixture was left at room temperature for 1 hour to bring hMSCs and random DNA library into contact. The random DNA library that did not bind to hMSCs was then washed three times with buffer B to remove the random DNA library.
(3) Add DNA-degrading enzyme-free water (0.5 mL) to the Petri dish, peel the hMSCs from the Petri dish using a cell scraper, add them to a centrifugation container, and centrifuge at 150g for 3 minutes at 4°C. Separation was performed and the supernatant was discarded.
(4) Add Buffer C (0.12 mL) to a centrifugation container to suspend the precipitate containing hMSCs, and heat-treat at 95°C for 10 minutes to release DNA molecules bound to hMSCs. The mixture was centrifuged for 5 minutes, and the supernatant containing DNA molecules capable of binding to hMSCs was collected.
(5) The collected hMSC-binding DNA molecules were heat-treated at 95°C for 10 minutes, and then cooled to 25°C over 30 minutes to prepare a single strand.
（ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のスクリーニング）
上記で回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を、定量ＰＣＲにより増幅することで、該ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の回収量を算出した。
(Screening for hMSC-binding DNA molecules)
The hMSC-binding DNA molecules recovered above were amplified by quantitative PCR to calculate the amount of hMSC-binding DNA molecules recovered.
［定量ＰＣＲの条件］
定量ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ製）を用い、プライマーとして表２に記載のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いた。定量ＰＣＲの条件は用いた試薬や装置に基づき適切に設定した。
[Quantitative PCR conditions]
For quantitative PCR, AmpliTaq Gold DNA polymerase (manufactured by Applied Biosystems) was used as a DNA polymerase, and the forward primer and reverse primer listed in Table 2 were used as primers. Quantitative PCR conditions were appropriately set based on the reagents and equipment used.
（ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の定量－１（１～９ラウンド））
上記「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した１連の操作を「１ラウンド」として繰り返し、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法によるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のスクリーニングを、合計９ラウンド行った。
(Quantification of hMSC-binding DNA molecules-1 (1 to 9 rounds))
The series of operations shown in the above section "(Culture of hMSC sample)" was repeated as "1 round", and a total of 9 rounds of screening for hMSC-binding DNA molecules by the Cell-SELEX method were performed.
なお、４ラウンド目はカウンターセレクションとして、ｈＭＳＣの代わりにＪＣＲＢ細胞バンクより入手したＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ９００４：ヒト子宮頸部類上皮がん細胞）を使用し、ＨｅＬａ細胞に結合しないＤＮＡ分子を回収した。４ラウンド目におけるカウンターセレクションは以下の方法で行った。
（１）ＨｅＬａ細胞の培養は、直径１０ｃｍの組織培養用シャーレ（コーニング製）を用いて、培地として１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミン溶液及びペニシリン－ストレプトマイシン溶液を含むＤ－ＭＥＭ（シグマアルドリッチ製）を用い、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で行った。
（２）ＨｅＬａ細胞をコンフルエントになるまで培養し、シャーレから培地を除去したのち、緩衝液Ｂを用いて２回洗浄した。
（３）洗浄後のシャーレに、３ラウンド目に回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子溶液１ｍＬを添加し、室温で１時間放置してＨｅＬａ細胞とｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子とを接触させたのち、緩衝液Ｂを用いて３回洗浄し、ＨｅＬａ細胞に結合しないｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を回収した。
In addition, in the fourth round, as a counter selection, HeLa cells (JCRB9004: human cervical epithelioid carcinoma cells) obtained from JCRB cell bank were used instead of hMSCs, and DNA molecules that did not bind to HeLa cells were collected. Counter selection in the fourth round was performed in the following manner.
(1) HeLa cells are cultured using D-MEM (manufactured by Sigma-Aldrich) containing 10% FBS, L-glutamine solution, and penicillin-streptomycin solution as a medium using a tissue culture dish (manufactured by Corning) with a diameter of 10 cm. The experiments were carried out at 37° C. under a 5% CO 2 atmosphere.
(2) HeLa cells were cultured until confluent, the medium was removed from the Petri dish, and then washed twice with buffer B.
(3) Add 1 mL of the hMSC-binding DNA molecule solution collected in the third round to the washed petri dish, leave it at room temperature for 1 hour to bring the HeLa cells and hMSC-binding DNA molecules into contact, and then add the buffer solution. The hMSC-binding DNA molecules that did not bind to HeLa cells were collected by washing three times with B.
（ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の定量－２（１０～１３ラウンド））
９ラウンド目で回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子について、下記のカウンターセレクション及びポジティブセレクションを併用した方法により、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ法によるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のスクリーニングを行った。
(Quantification of hMSC-binding DNA molecules-2 (10-13 rounds))
The hMSC-binding DNA molecules collected in the 9th round were screened for hMSC-binding DNA molecules by the Cell-SELEX method using a combination of counter selection and positive selection as described below.
［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のカウンターセレクション］
カウンターセレクションは、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手したＨＬ６０細胞（ＪＣＲＢ００８５：ヒト急性前骨髄性白血病由来細胞）を用いて、以下の方法で行った。
（２）ＨＬ６０細胞の培養は、培地として１０％ＦＢＳとペニシリン－ストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（富士フイルム和光純薬製）を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）にＨＬ６０細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で行った。培養終了後、ＨＬ６０細胞を遠心分離容器に添加したのち、遠心分離処理により細胞を回収し、緩衝液Ｂを用いて２回洗浄した。
（３）洗浄後、９ラウンド目で回収した一本鎖調製後のｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を添加し、室温で１時間放置して、ＨＬ６０細胞と、ランダムＤＮＡライブラリーとを接触させたのち、４℃において１５０ｇで３分間、遠心分離処理を行い、ＨＬ６０細胞に結合しないｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を含む上清を回収した。
[Counterselection of hMSC-binding DNA molecules]
Counter selection was performed by the following method using HL60 cells (JCRB0085: human acute promyelocytic leukemia-derived cells) obtained from JCRB cell bank.
(2) For culturing HL60 cells, use RPMI 1640 medium (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) supplemented with 10% FBS and penicillin-streptomycin solution as a medium, and seed HL60 cells in a petri dish for floating culture (manufactured by Sumitomo Bakelite). The test was carried out at 37° C. under a 5% CO 2 atmosphere. After the culture was completed, the HL60 cells were added to a centrifugation container, and the cells were collected by centrifugation and washed twice with buffer B.
(3) After washing, the single-stranded hMSC-binding DNA molecules recovered in the 9th round were added and left at room temperature for 1 hour to bring the HL60 cells into contact with the random DNA library. Centrifugation was performed at 150 g for 3 minutes at 4° C., and the supernatant containing hMSC-binding DNA molecules that did not bind to HL60 cells was collected.
［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のポジティブセレクション］
ポジティブセレクションは、ｈＭＳＣを用いて、以下の方法で行った。
（１）上記「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、直径１０ｃｍの組織培養用シャーレでｈＭＳＣを培養後、緩衝液Ｂを用いて２回洗浄した。
（２）洗浄後のシャーレに、９ラウンド目で回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を含む上清を添加し、室温で１時間放置して、ｈＭＳＣと、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子とを接触させたのち、緩衝液Ｂを用いて３回洗浄し、ｈＭＳＣに結合しないｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を除去した。
（３）ＤＮＡ分解酵素を含まない水０．５ｍＬをシャーレに添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離して遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで３分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。
（４）遠心分離容器に緩衝液Ｃ（０．１２ｍＬ）を添加してｈＭＳＣを含む沈殿物を懸濁し、９５℃で１０分間加熱処理してｈＭＳＣに結合したＤＮＡ分子を遊離させたのち、１３１００ｇで５分間遠心分離処理を行い、ｈＭＳＣに結合性を有するＤＮＡ分子を含む上清を回収した。
（５）回収したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子は、上記［定量ＰＣＲの条件］の項と同様の条件で定量ＰＣＲを用いた増幅を行ったのち、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の回収量を算出するとともに、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却した。
[Positive selection of hMSC-binding DNA molecules]
Positive selection was performed using hMSCs by the following method.
(1) Similar to the method shown in the above section "(Culture of hMSC sample)", hMSCs were cultured in a tissue culture dish with a diameter of 10 cm, and then washed twice with buffer B.
(2) Add the supernatant containing hMSC-binding DNA molecules collected in the 9th round to the washed petri dish, and leave it at room temperature for 1 hour to bring hMSCs and hMSC-binding DNA molecules into contact. , and washed three times with buffer B to remove hMSC-binding DNA molecules that do not bind to hMSCs.
(3) Add 0.5 mL of DNA-degrading enzyme-free water to the Petri dish, peel the hMSCs from the Petri dish using a cell scraper, add them to a centrifugation container, and centrifuge at 150g for 3 minutes at 4°C. and the supernatant was discarded.
(4) Add Buffer C (0.12 mL) to a centrifugation container to suspend the precipitate containing hMSCs, and heat-treat at 95°C for 10 minutes to release DNA molecules bound to hMSCs. The mixture was centrifuged for 5 minutes, and the supernatant containing DNA molecules capable of binding to hMSCs was collected.
(5) The recovered hMSC-binding DNA molecules are amplified using quantitative PCR under the same conditions as in the above [Quantitative PCR conditions] section, and then the amount of recovered hMSC-binding DNA molecules is calculated, After heat treatment at 95°C for 10 minutes, the mixture was cooled to 25°C over 30 minutes.
上記［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のカウンターセレクション］及び［ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子のポジティブセレクション］に示した一連の操作を「１ラウンド」として繰り返し、合計４ラウンド（１０～１３ラウンド）行った。 The series of operations shown in the above [Counter selection of hMSC-binding DNA molecules] and [Positive selection of hMSC-binding DNA molecules] were repeated as "1 round", and a total of 4 rounds (10 to 13 rounds) were performed.
表４に、各ラウンド（全１３ラウンド）で使用したランダムＤＮＡライブラリー量、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の回収量及び回収率を示す。 Table 4 shows the amount of random DNA library used in each round (all 13 rounds), the amount of hMSC-binding DNA molecules recovered, and the recovery rate.
＜試験２：ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの配列解析＞
上記試験１のスクリーニングで得られたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の配列解析を以下の方法で行った。
（１）ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子を、「Ｅｘ ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ」（タカラバイオ製）を用いてＰＣＲにより増幅し、「ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（日本ジェネティクス製）により精製した。
（２）精製したＰＣＲ増幅産物を、「ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター」（プロメガ製）にＴＡクローニングし、得られたサブクローニングベクターにより、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。
（３）形質転換された大腸菌ＤＨ５αを培養し、生育したコロニーについて「ｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（ＧＥヘルスケア製）を用いて、配列解析用の鋳型を調製し、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の塩基配列を決定した。
（４）塩基配列を決定したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡ分子の中で、重複配列が観察された８種の塩基配列をｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー候補配列として特定した。これらの候補配列を表５（配列番号１～８）に示す。
<Test 2: Sequence analysis of hMSC-binding DNA aptamer>
Sequence analysis of the hMSC-binding DNA molecules obtained in the screening of Test 1 above was performed by the following method.
(1) hMSC-binding DNA molecules were amplified by PCR using "Ex taq DNA polymerase" (manufactured by Takara Bio) and purified using "FastGene Gel/PCR Extraction Kit" (manufactured by Nippon Genetics).
(2) The purified PCR amplification product was TA cloned into "pGEM-T Easy vector" (manufactured by Promega), and Escherichia coli DH5α was transformed with the obtained subcloning vector.
(3) The transformed E. coli DH5α was cultured, and a template for sequence analysis was prepared using “illustra TempliPhi DNA Amplification Kit” (manufactured by GE Healthcare) for the grown colonies, and the base of the hMSC-binding DNA molecule was The sequence was determined.
(4) Among the hMSC-binding DNA molecules whose base sequences were determined, eight types of base sequences in which overlapping sequences were observed were identified as hMSC-binding DNA aptamer candidate sequences. These candidate sequences are shown in Table 5 (Sequence Numbers 1 to 8).
なお、表５において、「Ｇ４」に丸印が付された候補配列は、該配列がＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造（Ｇ４構造）を形成可能であることを示す。Ｇ４構造は一つの配列に対して複数の立体構造を形成可能であり、その中で特定の構造が標的分子に対して強い結合を示す可能性が示唆されている。 Note that in Table 5, candidate sequences with “G4” marked with a circle indicate that the sequences can form a G-quadruplex structure (G4 structure). The G4 structure can form multiple tertiary structures for one sequence, and it has been suggested that a specific structure may exhibit strong binding to a target molecule.
＜試験例３：フローサイトメトリーによるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの結合能評価＞
表５に示した各候補配列（配列番号１～８のいずれかの塩基配列）について、プライマー配列等を付加することでアプタマー（以下、「ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー」ともいう。）を調製し、以下の方法により、ｈＭＳＣに対する結合能をフローサイトメトリーにより評価した。
<Test Example 3: Evaluation of binding ability of hMSC-binding DNA aptamer by flow cytometry>
An aptamer (hereinafter also referred to as "hMSC-binding DNA aptamer") is prepared by adding a primer sequence, etc. to each candidate sequence (any nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 8) shown in Table 5, The binding ability to hMSC was evaluated by flow cytometry according to the following method.
（フローサイトメトリーに用いたアプタマー試料）
図１に、フローサイトメトリーによる評価に使用したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの構成を示す。より詳細には、このアプタマーは、以下の関係を満たすように「アプタマー候補配列」、「ＴＴＴ」、「プライマー配列」、「相補鎖」、「ＦＩＴＣ（フルオレセイン修飾）」を含む。
「アプタマー候補配列」は、各候補配列（配列番号１～８のいずれかの塩基配列）に相当する。
この「アプタマー候補配列」の３’末端側には、３塩基のチミンからなるリンカー配列「ＴＴＴ」を介して、１８塩基からなる「プライマー配列」が付加されている。「アプタマー候補配列」、「ＴＴＴ」、及び「プライマー配列」の塩基配列を表６に示す。
上記プライマー配列に対する「相補鎖」（配列番号２１）を介して、この分子はフルオレセイン修飾（「ＦＩＴＣ」）されている。
以下、フローサイトメトリーによる評価に使用した、図１の構成を有する上記ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、「フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー」ともいう。
(Aptamer sample used for flow cytometry)
FIG. 1 shows the structure of the hMSC-binding DNA aptamer used for evaluation by flow cytometry. More specifically, this aptamer includes an "aptamer candidate sequence", "TTT", "primer sequence", "complementary strand", and "FITC (fluorescein modification)" so as to satisfy the following relationship.
“Aptamer candidate sequence” corresponds to each candidate sequence (any base sequence of SEQ ID NOs: 1 to 8).
A "primer sequence" consisting of 18 bases is added to the 3' end of this "aptamer candidate sequence" via a linker sequence "TTT" consisting of 3 bases of thymine. Table 6 shows the base sequences of the "aptamer candidate sequence", "TTT", and "primer sequence".
This molecule is fluorescein modified ("FITC") via the "complementary strand" (SEQ ID NO: 21) to the above primer sequence.
Hereinafter, the hMSC-binding DNA aptamer having the configuration shown in FIG. 1 used for evaluation by flow cytometry is also referred to as "fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer."
（フローサイトメトリーの方法）
試験１の「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、ｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３）をコンフルエントになるまで培養後、Ｄ－ＰＢＳ（－）１ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離してｈＭＳＣ懸濁液を調製した。
調製したｈＭＳＣ懸濁液を１．５ｍＬ容の遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで４分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。遠心分離容器内のｈＭＳＣを再度Ｄ－ＰＢＳ（－）で懸濁し、懸濁液中のｈＭＳＣ数を測定して細胞数が１．５×１０６個となるように調製した。
得られた細胞懸濁液に、濃度を５００ｎＭに調整したフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液（詳細を後述する。）を添加し、室温で１時間放置して、ｈＭＳＣとフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーとを接触させた。
室温で１時間放置後、Ｄ－ＰＢＳ（－）を用いてｈＭＳＣを３回洗浄し、フローサイトメーター（ＢＤ ＡＣＣＵＲＩ Ｃ６ ＰＬＵＳ、ＢＤバイオサイエンス製）を用いてフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのｈＭＳＣへの結合性を評価した。
また、ｈＭＳＣの代わりにＨＬ６０細胞（ＪＣＲＢ００８５）を用いた以外は前記と同様の方法を行うことにより、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのＨＬ６０細胞への結合性を評価した。
(Flow cytometry method)
Similar to the method shown in the "(Culture of hMSC sample)" section of Test 1, after culturing hMSCs (JCRB1133) until confluence, 1 mL of D-PBS(-) was added, and the petri dish was removed using a cell scraper. An hMSC suspension was prepared by peeling hMSCs from the cells.
After adding the prepared hMSC suspension to a 1.5 mL centrifugation container, centrifugation was performed at 150 g for 4 minutes at 4° C., and the supernatant was discarded. The hMSCs in the centrifugation container were resuspended in D-PBS(-), and the number of hMSCs in the suspension was measured to adjust the number of cells to 1.5×10 6 cells.
A fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer solution (details will be described later) whose concentration was adjusted to 500 nM was added to the obtained cell suspension, and the mixture was left at room temperature for 1 hour to dissolve hMSCs and fluorescein-modified hMSC-binding DNA. was brought into contact with an aptamer.
After leaving it at room temperature for 1 hour, hMSCs were washed three times using D-PBS(-), and the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer was added to hMSCs using a flow cytometer (BD ACCURI C6 PLUS, manufactured by BD Biosciences). The connectivity was evaluated.
Furthermore, the binding of the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer to HL60 cells was evaluated by performing the same method as above except that HL60 cells (JCRB0085) were used instead of hMSCs.
（フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液の調製）
上記のフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液（濃度：５００ｎＭ）は、以下のように調製した。
フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを緩衝液Ｄに溶解し、９５℃で１０分間加熱処理したのち、３０分かけて２５℃まで冷却した。冷却後の溶液を緩衝液Ａで希釈して、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー濃度を５００ｎＭに調製した。
(Preparation of fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer solution)
The above fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer solution (concentration: 500 nM) was prepared as follows.
The fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer was dissolved in buffer D, heated at 95°C for 10 minutes, and then cooled to 25°C over 30 minutes. The cooled solution was diluted with buffer A to adjust the concentration of fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer to 500 nM.
（フローサイトメトリーの結果）
フローサイトメトリーによる評価結果を図２及び図３に示す。
(Flow cytometry results)
The evaluation results by flow cytometry are shown in FIGS. 2 and 3.
図２及び図３において、「ＤＮＡ」と示した実線グラフは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いた結果を示す。「抗体」と示した実線グラフは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いる代わりに、該アプタマーの陽性対照である、ＭＳＣ陽性マーカータンパク質であるＣＤ１０５に対する抗体（フルオレセイン標識抗ＣＤ１０５抗体：サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いた結果を示す。 In FIGS. 2 and 3, the solid line graph labeled "DNA" shows the results using the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer. The solid line graph labeled "Antibody" indicates that instead of using a fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer, an antibody against CD105, an MSC positive marker protein (fluorescein-labeled anti-CD105 antibody: Thermo Fisher Scientific (manufactured by Fick) is shown.
図２及び図３において、破線グラフは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー又はフルオレセイン標識抗ＣＤ１０５抗体を用いる代わりに、これらの陰性対照である２次抗体（フルオレセイン標識抗マウスＩｇＧ抗体）を用いた結果を示す。 In Figures 2 and 3, the dashed line graphs represent the results of using a secondary antibody (fluorescein-labeled anti-mouse IgG antibody), which is a negative control, instead of using a fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer or a fluorescein-labeled anti-CD105 antibody. shows.
図２に、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、ｈＭＳＣと接触させた後のフローサイトメトリーによる評価結果を示す。図２に示すように、「ＤＮＡ」と示した実線グラフは、いずれも、陰性対照である破線グラフよりもピークが右にずれており、評価した８種類全てのフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーが、ｈＭＳＣに結合性を有することが明らかとなった。 FIG. 2 shows the evaluation results by flow cytometry after contacting the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer with hMSCs. As shown in Figure 2, all of the solid line graphs labeled "DNA" have peaks shifted to the right compared to the dashed line graphs that serve as negative controls, indicating that all eight types of fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamers evaluated were , was found to have binding properties to hMSC.
図３に、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、ＨＬ６０細胞と接触させた後のフローサイトメトリーによる評価結果を示す。図３に示すように、「ＤＮＡ」と示した実線グラフは、いずれも、陰性対照である破線グラフとピークの位置がほぼ変わらず、評価した８種類全てのフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーがＨＬ６０細胞に結合しないことが明らかとなった。 FIG. 3 shows the evaluation results by flow cytometry after contacting the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer with HL60 cells. As shown in Figure 3, the peak positions of the solid line graphs labeled "DNA" are almost the same as those of the dashed line graphs that serve as negative controls, and all eight types of fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamers evaluated are HL60. It became clear that it did not bind to cells.
＜試験例４：ドットブロットによるｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの結合能評価＞
表５に示した各候補配列（配列番号１～８のいずれかの塩基配列）について、以下の方法により、ｈＭＳＣに対する結合能をドットブロットにより評価した。
<Test Example 4: Evaluation of binding ability of hMSC-binding DNA aptamer by dot blot>
For each candidate sequence (any nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1 to 8) shown in Table 5, the ability to bind to hMSC was evaluated by dot blot according to the following method.
（ドットブロットに用いたアプタマー試料）
フローサイトメトリーによる評価に使用したｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを含む塩基配列の構成は、図１及び上記「（フローサイトメトリーに用いたアプタマー試料）」の項で説明したものと同様である。
(Aptamer sample used for dot blot)
The structure of the base sequence containing the hMSC-binding DNA aptamer used for evaluation by flow cytometry is the same as that described in FIG. 1 and the above section "(Aptamer sample used for flow cytometry)".
（ドットブロットの方法）
試験１の「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、ｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３）をコンフルエントになるまで培養後、Ｄ－ＰＢＳ（－）１ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いてシャーレからｈＭＳＣを剥離してｈＭＳＣ懸濁液を調製した。
調製したｈＭＳＣ懸濁液を１．５ｍＬ容の遠心分離容器に添加したのち、４℃において１５０ｇで４分間、遠心分離処理を行い、上清を廃棄した。遠心分離容器内のｈＭＳＣを再度Ｄ－ＰＢＳ（－）で懸濁し、懸濁液中のｈＭＳＣ数を測定したのち、細胞数が１．５×１０４個となるようニトロセルロース膜上にｈＭＳＣを固定した。
ｈＭＳＣを固定したニトロセルロース膜を緩衝液Ｅ中で室温において１時間振盪してブロッキングしたのち、再度緩衝液Ｅで洗浄した。
次に、ｈＭＳＣを固定したニトロセルロース膜を、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液（濃度：４００ｎＭ）とともに室温で１時間振盪して、ｈＭＳＣとフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーとを接触させたのち、緩衝液Ｅを用いて３回洗浄した。なお、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液の調製方法は、試験例３の「（フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー溶液の調製）」の項と同様である。
洗浄後のニトロセルロース膜を、画像解析装置（Ｔｙｐｈｏｏｎ８６００、ＧＥヘルスケアライフサイエンス製）を用いて、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのｈＭＳＣへの結合性を評価した。
(Dot blot method)
Similar to the method shown in the "(Culture of hMSC sample)" section of Test 1, after culturing hMSCs (JCRB1133) until confluence, 1 mL of D-PBS(-) was added, and the petri dish was removed using a cell scraper. An hMSC suspension was prepared by peeling hMSCs from the cells.
After adding the prepared hMSC suspension to a 1.5 mL centrifugation container, centrifugation was performed at 150 g for 4 minutes at 4° C., and the supernatant was discarded. After resuspending the hMSCs in the centrifugation container with D-PBS(-) and measuring the number of hMSCs in the suspension, hMSCs were placed on a nitrocellulose membrane so that the number of cells was 1.5 x 104 . Fixed.
The nitrocellulose membrane on which hMSCs were immobilized was blocked in buffer E by shaking at room temperature for 1 hour, and then washed again with buffer E.
Next, the nitrocellulose membrane on which the hMSCs were immobilized was shaken for 1 hour at room temperature with a fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer solution (concentration: 400 nM) to bring the hMSCs and the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer into contact. Washed three times with buffer E. The method for preparing the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer solution is the same as in the section "(Preparation of fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer solution)" in Test Example 3.
After washing, the nitrocellulose membrane was evaluated for binding of the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer to hMSC using an image analyzer (Typhoon 8600, manufactured by GE Healthcare Life Sciences).
また、ｈＭＳＣの代わりにＨＬ６０細胞（ＪＣＲＢ００８５）を用いた以外は前記と同様の方法を行うことにより、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのＨＬ６０細胞への結合性を評価した。 Furthermore, the binding of the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer to HL60 cells was evaluated by performing the same method as above except that HL60 cells (JCRB0085) were used instead of hMSCs.
ドットブロットによる評価結果を図４に示す。ニトロセルロース膜上に明確なブロットが認められることは、フルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーと、細胞（ｈＭＳＣ又はＨＬ６０細胞）との結合性が高いことを意味する。
図４に示されるとおり、評価した８種類全てのフルオレセイン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーがｈＭＳＣに選択的に結合性を有することが明らかとなった。
The evaluation results by dot blot are shown in FIG. 4. Observation of a clear blot on the nitrocellulose membrane means that the fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamer has high binding to cells (hMSC or HL60 cells).
As shown in FIG. 4, it was revealed that all eight types of fluorescein-modified hMSC-binding DNA aptamers evaluated had selective binding to hMSCs.
＜試験例５：ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを不溶性担体に固定化した吸着剤の製造＞
本発明のアプタマーは、ＭＳＣの特異的な吸着剤や回収剤として有用であり得る。そこで、上記試験例３及び４において、ｈＭＳＣに結合能を持つことが確認されたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いて、これを不溶性担体に固定化した吸着剤を調製した。
<Test Example 5: Production of adsorbent in which hMSC-binding DNA aptamer is immobilized on an insoluble carrier>
The aptamer of the present invention may be useful as a specific adsorbent or recovery agent for MSC. Therefore, in Test Examples 3 and 4 above, an adsorbent was prepared by immobilizing the hMSC-binding DNA aptamer on an insoluble carrier using the hMSC-binding DNA aptamer that was confirmed to have the ability to bind to hMSC.
（吸着剤の製造に用いたアプタマー試料）
ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーとしては、図１及び上記試験例３の「（フローサイトメトリーに用いたアプタマー試料）」の項で説明したものと同様の構成を有する試料を用いた。ただし、アプタマー候補配列、ＴＴＴ、及びプライマー配列の塩基配列が、配列番号１１又は配列番号１３の塩基配列であるものを用いた。また、「ＦＩＴＣ（フルオレセイン修飾）」の代わりにビオチン修飾を用いた。
以下、吸着剤の製造に使用した上記ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを、「ビオチン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー」ともいう。
(Aptamer sample used to manufacture adsorbent)
As the hMSC-binding DNA aptamer, a sample having the same structure as that described in FIG. 1 and in the section "(Aptamer sample used for flow cytometry)" in Test Example 3 above was used. However, the base sequences of the aptamer candidate sequence, TTT, and primer sequence were SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 13. Furthermore, biotin modification was used instead of "FITC (fluorescein modification)".
Hereinafter, the hMSC-binding DNA aptamer used in the production of the adsorbent is also referred to as "biotin-modified hMSC-binding DNA aptamer."
（吸着剤の製造に用いた不溶性担体）
不溶性担体として、水に懸濁した「トヨパールＨＷ－４０ＥＣ」（東ソー製、１００－３００μｍ）を、目開きが１５０μｍのステンレス製標準ふるい（東京スクリーン製）と２５０μｍのステンレス製標準ふるい（東京スクリーン製）を用いて分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。
なお、本明細書の実施例において、特段の説明がない限り、不溶性担体を「重量」で記載した場合は、水に懸濁した不溶性担体をグラスフィルターでろ過したのちに秤量した含水重量を意味する。不溶性担体を「容積」で記載した場合は、水に懸濁した不溶性担体を目盛付き容器に添加し、１２時間以上放置したときの沈降容積を目視により測定した値を意味する。
(Insoluble carrier used for manufacturing adsorbent)
As an insoluble carrier, "Toyopearl HW-40EC" (manufactured by Tosoh, 100-300 μm) suspended in water was passed through a stainless steel standard sieve with apertures of 150 μm (manufactured by Tokyo Screen) and a standard stainless steel sieve of 250 μm (manufactured by Tokyo Screen). ) and then filtered through a glass filter before use.
In the examples of this specification, unless otherwise specified, when the insoluble carrier is described by "weight", it means the water-containing weight measured after filtering the insoluble carrier suspended in water with a glass filter. do. When the insoluble carrier is described in terms of "volume", it means the value obtained by visually measuring the sedimentation volume when the insoluble carrier suspended in water is added to a graduated container and left to stand for 12 hours or more.
（吸着剤の製造方法）
上記のアプタマー試料及び不溶性担体を用いて、以下の方法により、吸着剤を製造した。
（１）１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に、２．５ｇのトヨパールＨＷ－４０ＥＣ、３．７５ｍＬの水、０．５ｇの１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（東京化成製）を添加したのち、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で３０分間振盪した。
（２）振盪後、反応容器に４７μＬの４８％ＮａＯＨ水溶液を添加し、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で８時間振盪することにより担体にエポキシ基を導入した。
（３）反応終了後、担体を、グラスフィルター上で、ろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、担体全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加した。
（４）反応容器に５．０ｍＬの０．５Ｍ Ｄ－グルカミン水溶液（東京化成製のＤ－グルカミンから調製）を添加したのち、振盪機内で５０℃、１２０ｒｐｍの条件で３時間振盪することにより担体に隣接する水酸基を導入した。
（５）反応終了後、担体を、グラスフィルター上で、ろ液が中性になるまで水で洗浄したのち、担体全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加した。
（６）反応容器に５．０ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（濃度：５．０ｍｇ／ｍＬ、関東化学製の過ヨウ素酸ナトリウムから調製）を添加したのち、振盪機内で３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより担体のホルミル化を行った。
（７）反応終了後、担体をグラスフィルター上で水、Ｄ－ＰＢＳ（－）で順次洗浄したのち、ホルミル化担体全量を１００ｍＬ容のテフロン（登録商標）製容器に添加した。
（８）ホルミル化担体を添加した反応容器に、３．０ｍＬの緩衝液Ｆと、１．５ｍＬのＴａｍａｖｉｄｉｎ２（富士フイルム和光純薬製、アビジン様組換えタンパク質）のＤ－ＰＢＳ（－）溶液（濃度１．０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、振盪機内で３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪した。次いで、１５０μＬの水素化ホウ素ナトリウム水溶液（濃度４．０ｍｇ／ｍＬ、関東化学製の水素化ホウ素ナトリウムから調製）を添加し、さらに３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより還元アミノ化による担体へのアビジン様組換えタンパク質の固定化を行った。
（９）反応終了後、反応液全量を１５ｍＬ容の容器に移し、Ｄ－ＰＢＳ（－）で繰り返し洗浄することにより、目的のＴａｍａｖｉｄｉｎ２固定化担体を得た。
（１０）Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用い、反応に使用したＴａｍａｖｉｄｉｎ２量から洗浄液中の未反応のＴａｍａｖｉｄｉｎ２量を差し引くことで各担体へのＴａｍａｖｉｄｉｎ２の固定化量を測定した結果、固定化量は０．４５ｍｇ／ｍＬ－吸着剤であった。
（１１）得られたＴａｍａｖｉｄｉｎ２固定化担体５００ｍｇと、ビオチン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーのＤ－ＰＢＳ（－）溶液５００μＬ（濃度：２００ｎＭ）とを５ｍＬ容の容器に添加した。
（１２）容器を振盪機内で３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ２固定化担体へのビオチン修飾ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーの固定化を行った。
（１３）固定化終了後の担体を、遠心分離処理によりＤ－ＰＢＳ（－）で繰り返し洗浄することにより、目的のｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー固定化担体を製造した。
なお、以下、配列番号１１の塩基配列を含むｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー固定化担体を「ｈＭＳＣ吸着剤Ａ」ともいう。配列番号１３の塩基配列を含むｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを用いたｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマー固定化担体を「ｈＭＳＣ吸着剤Ｂ」ともいう。
(Method for producing adsorbent)
An adsorbent was produced using the above aptamer sample and insoluble carrier by the following method.
(1) Add 2.5 g of Toyopearl HW-40EC, 3.75 mL of water, and 0.5 g of 1,4-butanediol diglycidyl ether (manufactured by Tokyo Kasei) to a 100 mL Teflon (registered trademark) container. After that, it was shaken in a shaker at 50° C. and 120 rpm for 30 minutes.
(2) After shaking, 47 μL of 48% NaOH aqueous solution was added to the reaction container, and the mixture was shaken in a shaker at 50° C. and 120 rpm for 8 hours to introduce epoxy groups into the carrier.
(3) After the reaction was completed, the carrier was washed with water on a glass filter until the filtrate became neutral, and then the entire amount of the carrier was added to a 100 mL Teflon (registered trademark) container.
(4) After adding 5.0 mL of 0.5M D-glucamine aqueous solution (prepared from D-glucamine manufactured by Tokyo Kasei) to the reaction container, the carrier was prepared by shaking in a shaker at 50°C and 120 rpm for 3 hours. A hydroxyl group adjacent to was introduced.
(5) After the reaction was completed, the carrier was washed with water on a glass filter until the filtrate became neutral, and then the entire amount of the carrier was added to a 100 mL Teflon (registered trademark) container.
(6) After adding 5.0 mL of sodium periodate aqueous solution (concentration: 5.0 mg/mL, prepared from Kanto Chemical's sodium periodate) to the reaction container, the mixture was heated in a shaker at 30°C and 120 rpm. Formylation of the carrier was performed by shaking for 60 minutes.
(7) After the reaction was completed, the carrier was washed sequentially with water and D-PBS(-) on a glass filter, and then the entire amount of the formylated carrier was added to a 100 mL Teflon (registered trademark) container.
(8) In a reaction vessel containing the formylated carrier, 3.0 mL of buffer F and 1.5 mL of Tamavidin2 (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., avidin-like recombinant protein) in D-PBS (-) solution ( 1.0 mg/mL) was added thereto, and the mixture was shaken in a shaker at 30° C. and 120 rpm for 60 minutes. Next, 150 μL of sodium borohydride aqueous solution (concentration 4.0 mg/mL, prepared from sodium borohydride manufactured by Kanto Kagaku) was added and further shaken at 30° C. and 120 rpm for 60 minutes to perform reductive amination. An avidin-like recombinant protein was immobilized on a carrier.
(9) After the reaction was completed, the entire reaction solution was transferred to a 15 mL container and washed repeatedly with D-PBS(-) to obtain the desired Tamavidin 2-immobilized carrier.
(10) Using Micro BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific), the amount of Tamavidin2 immobilized on each carrier was measured by subtracting the amount of unreacted Tamavidin2 in the washing solution from the amount of Tamavidin2 used in the reaction. As a result, the immobilized amount was 0.45 mg/mL-adsorbent.
(11) 500 mg of the obtained Tamavidin 2-immobilized carrier and 500 μL of a D-PBS(-) solution of a biotin-modified hMSC-binding DNA aptamer (concentration: 200 nM) were added to a 5 mL container.
(12) The biotin-modified hMSC-binding DNA aptamer was immobilized on the Tamavidin 2 immobilization carrier by shaking the container in a shaker at 30° C. and 120 rpm for 60 minutes.
(13) The desired hMSC-binding DNA aptamer-immobilized carrier was produced by repeatedly washing the carrier after immobilization with D-PBS(-) by centrifugation.
In addition, hereinafter, the hMSC-binding DNA aptamer-immobilized carrier using the hMSC-binding DNA aptamer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 is also referred to as "hMSC adsorbent A." The hMSC-binding DNA aptamer-immobilized carrier using the hMSC-binding DNA aptamer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 is also referred to as "hMSC adsorbent B."
＜試験例６：ｈＭＳＣ吸着剤の評価－１＞
以下の方法により、試験例５で製造した２種類のｈＭＳＣ吸着剤について、ｈＭＳＣへの結合能（吸着能）を評価した。
<Test Example 6: Evaluation of hMSC adsorbent-1>
The two types of hMSC adsorbents produced in Test Example 5 were evaluated for their ability to bind to hMSCs (adsorption ability) by the following method.
（１）試験１の「（ｈＭＳＣ試料の培養）」の項に示した方法と同様に、ｈＭＳＣ（ＪＣＲＢ１１３３：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）をコンフルエントになるまで培養後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（シグマアルドリッチ製）で処理することによりｈＭＳＣをシャーレから剥離し、培地で懸濁した。
（２）培地で懸濁したｈＭＳＣを容器に添加したのち、遠心分離処理により細胞を回収し、緩衝液Ｇで再懸濁したのち、３５μｍのセルストレーナー（コーニング製）で処理することによりシングルセル化した。シングルセル化した細胞の密度をコールターカウンターＺ２型（ベックマンコールター製）で測定し、評価用のｈＭＳＣ懸濁液を調製した。
（３）２．５ｍＬ容シリンジ（テルモ製）と注射針（テルモ製、２２Ｇ）との間に目開き１００μｍのポリエステルメッシュフィルター（ＢｉｏＬａｂ製）を装着したカラムを作製した。
（４）ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢをそれぞれ緩衝液Ｇで懸濁することにより、５０％（ｖ／ｖ）懸濁液を調製し、上記（３）で作製したカラムに１．０ｍＬの５０％懸濁液を添加し、各吸着剤をカラムに充填した（吸着剤容量：５００μＬ）。
（５）吸着剤を充填したカラムに、上記（２）で調製したｈＭＳＣ懸濁液（５．０×１０５個／５０μＬ）を添加したのち、カラムに１．０ｍＬの緩衝液Ｇを添加して吸着剤を洗浄し、コールターカウンターを用いて回収した洗浄液中の細胞密度を測定することにより、ｈＭＳＣの回収率を測定した。
(1) Similar to the method shown in the section “(Culture of hMSC sample)” in Test 1, hMSCs (JCRB1133: human bone marrow-derived mesenchymal stem cells) were cultured until confluent, and then trypsin-EDTA solution (Sigma The hMSCs were detached from the petri dish by treatment with a solution (manufactured by Aldrich) and suspended in a medium.
(2) After adding hMSCs suspended in the medium to the container, the cells were collected by centrifugation, resuspended in buffer G, and then treated with a 35 μm cell strainer (manufactured by Corning) to produce single cells. It became. The density of the single cells was measured using Coulter Counter Z2 (manufactured by Beckman Coulter), and an hMSC suspension for evaluation was prepared.
(3) A column was prepared in which a polyester mesh filter (manufactured by BioLab) with an opening of 100 μm was attached between a 2.5 mL syringe (manufactured by Terumo) and an injection needle (manufactured by Terumo, 22G).
(4) Prepare a 50% (v/v) suspension by suspending hMSC adsorbents A and B in buffer G, and add 1.0 mL of 50% suspension to the column prepared in (3) above. The suspension was added and each adsorbent was packed into a column (adsorbent volume: 500 μL).
(5) After adding the hMSC suspension prepared in (2) above (5.0 × 10 cells/50 μL) to the column packed with adsorbent, 1.0 mL of buffer G was added to the column. The recovery rate of hMSCs was measured by washing the adsorbent and measuring the cell density in the collected washing solution using a Coulter counter.
ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢによる、ｈＭＳＣの回収率を表７の「試験例６」の項に示す。以下、「細胞回収率」の値が低いほど、吸着剤のｈＭＳＣへの結合能（吸着能）が高いことを示す。表７の結果から、ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢはいずれもｈＭＳＣへの結合能が高いことがわかった。 The hMSC recovery rates using hMSC adsorbents A and B are shown in the "Test Example 6" section of Table 7. Hereinafter, the lower the value of "cell recovery rate", the higher the binding ability (adsorption ability) of the adsorbent to hMSCs. From the results in Table 7, it was found that hMSC adsorbents A and B both had high binding ability to hMSC.
＜試験例７：ｈＭＳＣ吸着剤の評価－２＞
試験例６では、ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢはいずれもｈＭＳＣへの結合能が示された。この結合能がｈＭＳＣに特異的であるかを評価するために、ｈＭＳＣの代わりに、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手したＲａｍｏｓ細胞（ＪＣＲＢ９１１９：ヒトバーキットリンパ腫細胞）を用いて、以下の方法により、ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢによる結合能を評価した。
<Test Example 7: Evaluation of hMSC adsorbent-2>
In Test Example 6, hMSC adsorbents A and B both showed the ability to bind to hMSCs. In order to evaluate whether this binding ability is specific to hMSCs, we used Ramos cells (JCRB9119: human Burkitt lymphoma cells) obtained from JCRB cell bank instead of hMSCs to adsorb hMSCs by the following method. The binding ability of Agents A and B was evaluated.
（１）培地として１０％ＦＢＳとペニシリン－ストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ １６４０培地を用い、浮遊培養用シャーレ（住友ベークライト製）に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でＲａｍｏｓ細胞の培養を行った。
（２）培養終了後、遠心分離処理により細胞を回収し、試験例６の「（２）」で示した方法と同様に、緩衝液Ｆで再懸濁してシングルセル化した。シングルセル化した細胞の密度をコールターカウンターＺ２型で測定し、評価用のＲａｍｏｓ細胞懸濁液を調製した。
（３）試験例６の「（３）」及び「（４）」で示した方法と同様にカラムの作製及び吸着剤の充填を行った（吸着剤容量：５００μＬ）。
（４）吸着剤を充填したカラムに、上記（２）で調製したＲａｍｏｓ細胞懸濁液（４．９×１０５個／５０μＬ）を添加したのち、カラムに１．０ｍＬの緩衝液Ｇを添加して吸着剤を洗浄し、コールターカウンターを用いて回収した洗浄液中の細胞密度を測定することにより、Ｒａｍｏｓ細胞の回収率を測定した。
(1) Using RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS and penicillin-streptomycin solution as a medium, cells were seeded in a petri dish for floating culture (manufactured by Sumitomo Bakelite), and Ramos cells were grown at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. Culture was performed.
(2) After completion of the culture, cells were collected by centrifugation and resuspended in buffer F to form single cells in the same manner as in Test Example 6 (2). The density of the single cells was measured using a Coulter counter Z2 type, and a Ramos cell suspension for evaluation was prepared.
(3) A column was prepared and filled with an adsorbent in the same manner as in the methods shown in "(3)" and "(4)" of Test Example 6 (adsorbent capacity: 500 μL).
(4) Add the Ramos cell suspension (4.9 x 10 cells/50 μL) prepared in (2) above to the adsorbent-filled column, then add 1.0 mL of buffer G to the column. The recovery rate of Ramos cells was measured by washing the adsorbent and measuring the cell density in the collected washing solution using a Coulter counter.
ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢによる、Ｒａｍｏｓ細胞の回収率を表７の「試験例７」の項に示す。表７に示されるとおり、いずれの結果も細胞回収率の値が高く、ｈＲａｍｏｓ細胞は吸着剤Ａ及びＢに吸着しないことがわかった。 The recovery rate of Ramos cells by hMSC adsorbents A and B is shown in the "Test Example 7" section of Table 7. As shown in Table 7, all results showed high cell recovery rates, indicating that hRamos cells were not adsorbed to adsorbents A and B.
＜試験例８：ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを固定化していない不溶性担体の評価＞
ｈＭＳＣ吸着剤Ａ及びＢの代わりに、ｈＭＳＣ結合性ＤＮＡアプタマーを固定化していない不溶性担体（トヨパールＨＷ－４０ＥＣ（１５０－２５０μｍ））を用いた以外は、試験例６及び７と同様の方法で、ｈＭＳＣとＲａｍｏｓ細胞の回収率を測定した。
<Test Example 8: Evaluation of insoluble carrier on which hMSC-binding DNA aptamer is not immobilized>
In the same manner as Test Examples 6 and 7, except that instead of hMSC adsorbents A and B, an insoluble carrier (Toyopearl HW-40EC (150-250 μm)) on which no hMSC-binding DNA aptamer was immobilized was used. Recovery rates of hMSCs and Ramos cells were determined.
上記不溶性担体による、ｈＭＳＣ及びＲａｍｏｓ細胞の回収率を表７の「試験例８」の項に示す。表７に示されるとおり、いずれの結果も細胞回収率の値が高く、ｈＭＳＣ及びＲａｍｏｓ細胞のいずれも上記不溶性担体に吸着しないことがわかった。 The recovery rate of hMSC and Ramos cells using the above-mentioned insoluble carrier is shown in the "Test Example 8" section of Table 7. As shown in Table 7, all results showed high cell recovery rates, and it was found that neither hMSCs nor Ramos cells were adsorbed to the above-mentioned insoluble carrier.
Claims (8)
（ａ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列
（ｂ）配列番号１～８のいずれかに示される塩基配列において、１～３個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列 A nucleic acid aptamer comprising the following base sequence (a) or (b) and having binding properties to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
(a) Base sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 8 (b) In the base sequence shown in any of SEQ ID NOs 1 to 8, 1 to 3 bases are substituted, deleted, inserted, or added. base sequence
（ｃ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列
（ｄ）配列番号９～１６のいずれかに示される塩基配列において、１～５個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列 A nucleic acid aptamer comprising the following base sequence (c) or (d) and having binding properties to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
(c) Base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 9 to 16 (d) In the base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 9 to 16, 1 to 5 bases are substituted, deleted, inserted, or added. base sequence
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