JP7418402B2 - 単一のフローセルを使用した多重シークエンシング - Google Patents

Description

相互参照
本出願は、２０１８年７月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／７０３，７６３号（これは、参照により本明細書に完全に組み込まれる）の利益を主張する。

発明の背景
ヒトゲノムをマッピングしたいという要望は、迅速な核酸シークエンシングのための技術への関心を生み出した。しかしながら、最初のヒトゲノムのシークエンシングは約１０億ドルのコストがかかり、完了までに１０年超を要した。核酸シークエンシングに関連する技術は進歩したが、大規模なゲノムプロジェクトは依然として高額である。例えば、全ゲノムシークエンシングは数千ドルのコストがかかる可能性があり、法外なコストをゲノミクス研究プロジェクトに課し得る。加えて、シークエンシングシステムの能力を効率的に利用することは依然として困難であり得る。

技術の発展にもかかわらず、全ゲノムシークエンシングは依然としてコストがかかる可能性がある。効率的および／またはハイスループットな全ゲノムシークエンシングアプローチの必要性を認識して、本開示は、核酸シークエンシングのための方法およびシステムを提供する。このようなシステムおよび方法は、単一のフローセルを使用して、偏りのないおよび／または偏りのあるシークエンシングを実施して、核酸分子のライブラリーを生成し得る。

ゲノムの特定の領域をバイアスする方法は、サンプル数に基づくシークエンシングのコストを削減しながら、特定の疾患の評価または管理（例えば、診断、予後、処置選択、処置モニタリング、再発のモニタリング）に対して比較的大きな重要性を有する領域のシークエンシングアウトプットの信頼性を増強するために用いられ得る。しかしながら、このバイアスの増加はまた、シークエンシングされるサンプルの複雑さを減少させ得、シークエンサーがゲノムの個々の塩基を呼び出すことが困難になり得る。この問題を克服するために、Ｐｈｉ Ｘ １７４バクテリオファージの十分に特性評価されたより小さなコントロールゲノムを、シークエンシングランの全体的な複雑さを増加させるために、目的の偏りのあるサンプルと一緒に利用可能なごく一部の全リードとしてランし得る。しかしながら、このバクテリオファージコントロールを使用することにより、利用可能な全シークエンシングリードのごく一部は、このコントロールゲノムのシークエンシングの実施に向けて失われる可能性がある。

本開示は、ユーザが、最適なシークエンシングラン品質に必要なシークエンシング複雑さを維持しながら、この喪失したシークエンシング能力を回復し得る方法を提供する。偏りのあるサンプル（複数可）と一緒にシークエンシングされた偏りのないサンプル（複数可）は、ユーザが、コントロールゲノムの処理で典型的に喪失する能力を使用することを可能にし得る。これは、並行して複数のアッセイをランする能力をユーザに提供し得るので、シークエンシングの効率および／またはスループットを改善し、それにより、シークエンシングランの成功に必要なサンプル複雑さを維持しながら、全体的なシークエンシングコストおよび時間を節約する。

加えて、市販のシークエンサーのアベイラビリティは、これらのシークエンシング機器で経済的にランされ得るアッセイに制約を加え得る。例えば、より高いシークエンシングアウトプットのために設計されたモデルは、単一のランで多数の検体を多重化せずに偏りのあるシークエンシング用途でランするためには過度にコストがかかる可能性があるが、偏りのないシークエンシングラン当たりのコストを大幅に削減し得る。偏りのあるおよび偏りのない検体の両方を単一のシークエンシングランに組み合わせる能力は、より高出力の機器をより多用途的にし得、その結果、検体当たりのランコストを削減しながら幅広い用途でそれらを使用し得る。

本開示の態様は、シークエンシングのためのサンプルの複雑さを増加させるための方法であって、
所望の程度の複雑さとは異なる第１の程度の複雑さを有する第１の核酸サンプルを提供すること；
第１の程度の複雑さとは異なり、所望の程度の複雑さとは異なる第２の程度の複雑さを有する第２の核酸サンプルを提供すること；
第１の核酸サンプルの少なくとも一部および第２の核酸サンプルの少なくとも一部をプールし、それにより、所望の程度の複雑さを有するプールされた核酸サンプルを生成すること；ならびに
プールされた核酸サンプルの少なくとも一部をシークエンシングすること
を含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、シークエンシングすることは、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を含む。一部の実施形態では、シークエンシングすることは、大規模並列シークエンシングを含む。一部の実施形態では、シークエンシングすることは、フローセル当たり少なくとも約１０億個のリードのアウトプットを含むシークエンシングプラットフォームでシークエンシングすることを含む。一部の実施形態では、シークエンシングすることは、フローセル当たり少なくとも約１５億個のリードのアウトプットを含むシークエンシングプラットフォームでシークエンシングすることを含む。一部の実施形態では、シークエンシングすることは、フローセル当たり少なくとも約２０億個のリードのアウトプットを含むシークエンシングプラットフォームでシークエンシングすることを含む。

本開示の別の態様は、核酸分子をシークエンシングするための方法であって、
第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成すること；
第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成すること；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成すること；ならびに
シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングして、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成すること
を含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、偏りのないシークエンシングは全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を含む。一部の実施形態では、偏りのないシークエンシングは約０．１倍以下、０．５倍以下、約１倍以下、約２倍以下、約３倍以下、約４倍以下、約５倍以下、約６倍以下、約７倍以下、約８倍以下、約９倍以下、約１０倍以下、約１２倍以下、約１４倍以下、約１６倍以下、約１８倍以下、約２０倍以下、約２２倍以下、約２４倍以下、約２６倍以下、約２８倍以下、または約３０倍以下の深度で実施される。一部の実施形態では、偏りのあるシークエンシングは、複数の遺伝子座を含む標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む。一部の実施形態では、標的シークエンシングは標的メチル－ｓｅｑを含む。一部の実施形態では、偏りのないシークエンシングはメチル化シークエンシングを含む。一部の実施形態では、メチル化シークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）またはＴｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）を含む。一部の実施形態では、第２の複数のシークエンシングリードを生成することは、コントロールライブラリーとして第１の複数のライブラリーの少なくとも一部を使用することを含む。一部の実施形態では、方法は、第３の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することをさらに含み、第３の複数のライブラリーは、第１の複数のシークエンシングリードまたは第２の複数のシークエンシングリードを生成するためのコントロールライブラリーを含む。一部の実施形態では、第１の複数の核酸分子および第２の複数の核酸分子はＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、第１の複数の核酸分子および第２の複数の核酸分子はＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、シークエンシングプラットフォームはＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）シークエンサーである。

本開示の別の態様は、核酸分子をシークエンシングするための方法であって、
第１の複数の核酸分子を処理して、第１の偏りのあるシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成すること；
第２の複数の核酸分子を処理して、第２の偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成すること；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成すること；ならびに
シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングして、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成すること
を含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、第１の偏りのあるシークエンシングは、第１の複数の遺伝子座を含む第１の標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含み、第２の偏りのあるシークエンシングは、第２の複数の遺伝子座を含む第２の標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む。

本開示の別の態様は、核酸分子をシークエンシングするための方法であって、
第１の複数の核酸分子を処理して、第１の偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成すること；
第２の複数の核酸分子を処理して、第２の偏りのないシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成すること；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成すること；ならびに
シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングして、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成すること
を含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、第１の偏りのないシークエンシングは全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を含み、第２の偏りのないシークエンシングはメチル化シークエンシングを含む。一部の実施形態では、メチル化シークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）またはＴｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）を含む。一部の実施形態では、偏りのないシークエンシングは約０．１倍以下、０．５倍以下、約１倍以下、約２倍以下、約３倍以下、約４倍以下、約５倍以下、約６倍以下、約７倍以下、約８倍以下、約９倍以下、約１０倍以下、約１２倍以下、約１４倍以下、約１６倍以下、約１８倍以下、約２０倍以下、約２２倍以下、約２４倍以下、約２６倍以下、約２８倍以下、または約３０倍以下の深度で実施される。

一部の実施形態では、核酸分子はサンプルから抽出される。一部の実施形態では、サンプルは生物学的サンプルである。

一部の実施形態では、第１の複数の核酸分子および第２の複数の核酸分子は、同じ初期生物学的サンプルから生成される。

本開示の別の態様は、核酸分子をシークエンシングするためのシステムであって、
１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含むコントローラ；および
コントローラに作動可能に結合した支持体
を含み；
１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサは、
第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示し；
第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示し；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示し；
プールされた複数のライブラリーから、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成し；ならびに、
プールされた複数のライブラリーから、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するように個々にまたは集合的にプログラムされている、システムを提供する。

一部の実施形態では、偏りのないシークエンシングは全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）またはメチル化シークエンシングを含む。一部の実施形態では、メチル化シークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）またはＴｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）を含む。一部の実施形態では、偏りのあるシークエンシングは、複数の遺伝子座を含む標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む。一部の実施形態では、標的シークエンシングは標的メチル－ｓｅｑを含む。

本開示の別の態様は、核酸分子をシークエンシングするためのシステムであって、
１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含むコントローラ；および
コントローラに作動可能に結合した支持体
を含み；
１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサは、
第１の複数の核酸分子を処理して、第１の偏りのあるシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示し；
第２の複数の核酸分子を処理して、第２の偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示し；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示し；
プールされた複数のライブラリーから、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成し；ならびに、
プールされた複数のライブラリーから、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するように個々にまたは集合的にプログラムされている、システムを提供する。

一部の実施形態では、第１の偏りのあるシークエンシングは、第１の複数の遺伝子座を含む第１の標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含み、第２の偏りのあるシークエンシングは、第２の複数の遺伝子座を含む第２の標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む。

本開示の別の態様は、核酸分子をシークエンシングするためのシステムであって、
１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含むコントローラ；および
コントローラに作動可能に結合した支持体
を含み；
１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサは、
第１の複数の核酸分子を処理して、第１の偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示し；
第２の複数の核酸分子を処理して、第２の偏りのないシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示し；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示し；
プールされた複数のライブラリーから、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成し；ならびに、
プールされた複数のライブラリーから、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するように個々にまたは集合的にプログラムされている、システムを提供する。

一部の実施形態では、第１の偏りのないシークエンシングまたは第２の偏りのないシークエンシングは全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）またはメチル化シークエンシングを含む。一部の実施形態では、メチル化シークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）またはＴｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）を含む。

本開示の別の態様は、コンピュータプロセッサにより実行される際の、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、
第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示すること、
第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示すること；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示すること；
プールされた複数のライブラリーから、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成すること；ならびに、
プールされた複数のライブラリーから、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成すること
を含む、非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。

本開示の別の態様は、コンピュータプロセッサにより実行される際の、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、
第１の複数の核酸分子を処理して、第１の偏りのあるシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示すること、
第２の複数の核酸分子を処理して、第２の偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示すること；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示すること；
プールされた複数のライブラリーから、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成すること；ならびに、
プールされた複数のライブラリーから、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成すること
を含む、非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。

本開示の別の態様は、コンピュータプロセッサにより実行される際の、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、
第１の複数の核酸分子を処理して、第１の偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示すること、
第２の複数の核酸分子を処理して、第２の偏りのないシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示すること；
第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示すること；
プールされた複数のライブラリーから、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成すること；ならびに、
プールされた複数のライブラリーから、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成すること
を含む、非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。

本開示のさらなる態様および利点は、本開示の単に例示的な実施形態が示され記載されている以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになる。理解されるように、本開示は他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明白な態様で改変が可能であり、これらはすべて、本開示から逸脱するものではない。したがって、図面および説明は、限定的ではなく例示的な性質のものであるとみなされるべきである。

参照による援用
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願がそれぞれ、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物、特許および特許出願が、本明細書に含まれる本開示と矛盾する程度において、本明細書は、いかなるこのような矛盾材料にも優先しおよび／またはその上位にあることを意図する。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られる。

図１は、本明細書で提供される方法またはシステムを実装するようにプログラムされたかまたは別様に構成されたコンピュータシステムを示す；

図２は、開示される実施形態にしたがって、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを使用して核酸分子をシークエンシングする方法の例を示す；

図３は、開示される実施形態にしたがって、偏りのあるシークエンシングを使用して核酸分子をシークエンシングする方法の例を示す；

図４は、開示される実施形態にしたがって、偏りのないシークエンシングを使用して核酸分子をシークエンシングする方法の例を示す；

図５は、開示される実施形態にしたがって、コントロールライブラリーと共に偏りのあるおよび偏りのないシークエンシングを使用して核酸分子をシークエンシングする方法の例を示す；ならびに

図６は、開示される実施形態にしたがって、偏りのあるおよび／または偏りのないシークエンシングのために調製された核酸分子から得られたシークエンシングリードを元の核酸分子と相関させ得る方法の例を示す。

発明の詳細な説明
本発明の様々な実施形態が本明細書に示され記載されているが、このような実施形態がほんの一例として提供されていることは当業者には明らかである。本発明から逸脱せずに多数の変形、変更および置換を当業者に想起させ得る。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替物が用いられ得ることを理解すべきである。

本明細書で使用される場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、核酸サブユニットまたはヌクレオチドを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）またはそれらのバリアントから選択されるヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、一般に、ヌクレオシドおよび少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多いリン酸（ＰＯ_３）基を含む。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）およびリン酸基を含み得る。

リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択され得るデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などであり得、これらは、検出可能なタグ、例えば発光タグまたはマーカー（例えば、フルオロフォア）を含む。ヌクレオチドは、成長中の核酸鎖に組み込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵであり得るか、または相補的Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵに特異的な、もしくはプリン（すなわち、ＡもしくはＧまたはそれらのバリアント）もしくはピリミジン（すなわち、Ｃ、ＴもしくはＵまたはそれらのバリアント）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの誘導体もしくはバリアントである。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの例では、核酸分子は環状である。

本明細書で使用される場合、「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、様々な長さを有し得るポリヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のいずれかまたはそれらの類似体を指す。核酸分子は、少なくとも約１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂまたはそれを上回る長さを有し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には、４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合のチミン（Ｔ）についてはウラシル（Ｕ））の特定の配列から構成される。したがって、「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記であるか；あるいはこの用語は、ポリヌクレオチド分子それ自体に適用され得る。このアルファベット表記は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースにインプットされ得、バイオインフォマティクス用途、例えば機能的ゲノミクスおよび相同性検索に使用され得る。オリゴヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド（複数可）、ヌクレオチド類似体（複数可）および／または改変ヌクレオチドを含み得る。

本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、一般に、生物学的サンプルを指す。生物学的サンプルの例としては、核酸分子、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂肪またはウイルスが挙げられる。いくつかの場合では、サンプルは標的核酸分子を含有する。例では、生物学的サンプルは、核酸分子（複数可）を含む核酸サンプルである。いくつかの例では、生物学的サンプルは、標的核酸分子（複数可）を含む核酸サンプルである。標的核酸分子は無細胞的であり得るか、または無細胞核酸分子、例えば無細胞ＤＮＡもしくは無細胞ＲＮＡであり得る。標的核酸分子は、ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、類人猿、サル、チンパンジー、爬虫類、両生類または鳥類供給源を含む様々な供給源に由来し得る。さらに、サンプルは、限定されないが、血液、血清、血漿、硝子体、痰、尿、涙、汗、唾液、精液、粘膜排出物、粘液、髄液、羊水、リンパ液などを含む、無細胞配列を含有する様々な動物の体液から抽出され得る。無細胞ポリヌクレオチドは、（妊娠被験体から採取された液体を介して）胎児起源であり得るか、または被験体それ自体の組織に由来し得る。

本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、一般に、処理または分析を受けている生物学的サンプルを有する個体を指す。被験体は、動物または植物であり得る。被験体は、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタまたは齧歯類であり得る。被験体は、例えば、１種もしくは複数種のがん、１種もしくは複数種の感染症、１種もしくは複数種の遺伝的障害または１種もしくは複数種の腫瘍またはそれらの任意の組み合わせなどの疾患を有するまたは有すると疑われる患者であり得る。１種または複数種の腫瘍を有するまたは有すると疑われる被験体について、腫瘍は、１つまたはそれより多くのタイプのものであり得る。

「増幅する」、「増幅」および「核酸増幅」という用語は互換的に使用され、一般に、核酸のコピーを生成することを指す。例えば、ＤＮＡの「増幅」は、一般に、ＤＮＡ分子のコピーを生成することを指す。また、核酸の増幅は、線形的、指数関数的またはそれらの組み合わせであり得る。増幅は、エマルジョンベースであり得るか、または非エマルジョンベースであり得る。核酸増幅方法の非限定的な例としては、逆転写、プライマー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅、非対称増幅、ローリングサークル増幅および多重置換増幅（ＭＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲが使用される場合、任意の形態のＰＣＲが使用され得、非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ダイヤルアウトＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップエクステンションＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲおよびタッチダウンＰＣＲが挙げられる。また、増幅は、増幅に参加するかまたはそれを容易にする様々な成分（例えば、プライマー（複数可）、テンプレート、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、緩衝液成分、補因子など）を含む反応混合物中で行われ得る。いくつかの場合では、反応混合物は緩衝液を含む。このような緩衝液の非限定的な例としては、マグネシウムイオン緩衝液、マンガンイオン緩衝液およびイソクエン酸緩衝液が挙げられる。このような緩衝液のさらなる例はまた、Ｔａｂｏｒ，Ｓら、Ｃ．Ｃ．ＰＮＡＳ，１９８９，８６，４０７６－４０８０ならびに米国特許第５，４０９，８１１号および米国特許第５，６７４，７１６号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

本明細書で使用される場合、「シークエンシング」という用語は、一般に、核酸分子の配列を生成または同定することを指す。シークエンシングは、単一分子シークエンシングまたは合成によるシークエンシングであり得る。シークエンシングは、フローセルなどの支持体上に固定されたテンプレート核酸分子を使用して実施され得る大規模並列アレイシークエンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）シークエンシング）であり得る。例えば、シークエンシングは、第１世代シークエンシング法、例えばマクサム・ギルバートもしくはサンガーシークエンシングまたはハイスループットシークエンシング（例えば、次世代シークエンシングまたはＮＧＳ）法を含み得る。ハイスループットシークエンシング法は、少なくとも約１０，０００、１００，０００、１００万、１０００万、１億、１０億個またはそれより多いポリヌクレオチド分子を同時に（または実質的に同時に）シークエンシングし得る。シークエンシング方法としては、限定されないが、パイロシークエンシング、合成によるシークエンシング、単一分子シークエンシング、ナノポアシークエンシング、半導体シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列シークエンシング、例えばＨｅｌｉｃｏｓ，Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔまたはＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用したシークエンシングが挙げられ得る。

本明細書で使用される場合、「支持体」という用語は、一般に、固体支持体、例えばスライド、ビーズ、樹脂、チップ、アレイ、マトリックス、膜、ナノポアまたはゲルを指す。固体支持体は、例えば、平坦な基板（例えば、ガラス、プラスチック、シリコンなど）上のビーズ、または基板のウェル内のビーズであり得る。基板は、ビーズを所望の位置（例えば、検出器と作動可能に通信する場所）に保持するための表面特性、例えばテクスチャ、パターン、微細構造コーティング、界面活性剤またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。ビーズベースの支持体の検出器は、ビーズのサイズとは無関係に、実質的に同じ読み取り速度を維持するように構成され得る。支持体は、フローセルまたはオープン基板であり得る。さらに、支持体は、生物学的支持体、非生物学的支持体、有機支持体、無機支持体またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。支持体は、検出器と光通信し得るか、検出器と物理的に接触し得るか、検出器から一定距離だけ離され得るか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。支持体は、複数の独立して処理可能な位置を有し得る。核酸分子は、複数の独立して処理可能な位置の所定の独立して処理可能な位置で支持体に固定され得る。支持体への複数の核酸分子のそれぞれの固定は、アダプターの使用により支援され得る。支持体は、検出器に光学的に結合され得る。支持体への固定は、アダプターにより支援され得る。

本明細書で使用される場合、「フローセル」という用語は、一般に、物質がポンピングされ得る小さな流体チャネルを含有する支持体を指す。このような物質は、ポリメラーゼ、核酸分子および緩衝液であり得る。いくつかの例では、支持体は官能化され得る。「フローセル」はまた、一般に、反応が行われ得るチャンバーと、試薬をチャンバーに送達するための入口部と、チャンバーから試薬を除去するための出口部とを有する容器を指し得る。一部の実施形態では、チャンバーは、チャンバー中で（例えば、チャンバーと流体接触する表面上で）起こる反応の検出のために構成される。例えば、チャンバーは、チャンバー中のアレイ、光学的に標識された分子などの光学的検出を可能にする１つまたはそれより多くの透明表面を含み得る。フローセルの例としては、限定されないが、核酸シークエンシング装置で使用されているもの、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により市販されているＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）もしくはＮｏｖａＳｅｑ（商標）プラットフォームのための；またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により市販されているＳＯＬｉＤ（商標）もしくはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）シークエンシングプラットフォームのためのフローセルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「検出器」という用語は、一般に、信号を検出し得る光学的および／または電子的部品を一般に含むデバイスを指す。

本明細書で使用される場合、「全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）」という用語は、一般に、生物のゲノム全体の配列が決定され得るプロセスを指す。このような生物は、ヒト、動物、ウイルスまたは細菌であり得る。

シークエンシングカバレッジは、一般に、既知の参照塩基に一致するリードの平均数を表す。シークエンシングカバレッジ要件は、用途により変動し得る。いくつかの例では、カバレッジの深度は、約０．１倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍または約１０倍より大きくて良い。いくつかの例では、カバレッジの深度は、約１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍または約１００倍より大きくて良い。

本明細書で使用される場合、「標的シークエンシング」という用語は、一般に、遺伝子またはゲノムの領域のサブセットをシークエンシングするプロセスを指す。例えば、遺伝子またはゲノム領域のサブセットに対応する複数の核酸分子は、シークエンシングの前に単離、富化および／または増幅され得る。いくつかの例では、エクソーム、目的の特定の遺伝子、遺伝子内の標的またはミトコンドリアＤＮＡがシークエンシングされる。例えば、目的の特定の遺伝子、遺伝子内の標的またはミトコンドリアＤＮＡに対応する複数の核酸分子は、シークエンシングの前に単離、富化および／または増幅され得る。

本明細書で使用される場合、「標的捕捉パネル」という用語は、一般に、特定の疾患または表現型との関連性を有することが公知であるまたは疑われる遺伝子またはゲノム領域（例えば、遺伝子座）の選択セットを含有するパネルを指す。

本明細書で使用される場合、「遺伝子座」という用語は、一般に、染色体またはゲノム核酸分子の任意の領域上の位置であって、正式な連鎖解析または分子遺伝学的研究の目的で別個の遺伝子単位であるとみなされる位置を指す。

本明細書で使用される場合、「バイサルファイトシークエンシング」という用語は、一般に、亜硫酸水素塩による核酸分子の処理を含むシークエンシング方法（例えば、メチル化シトシン（５－メチルシトシン）残基をインタクトなままにしながら、ＤＮＡ分子の非メチル化シトシン残基をウラシルに選択的に変換すること）を指すバイサルファイトシークエンシングは、（例えば、一塩基分解能で）核酸分子中のメチル化パターンを検出するために使用され得る。

本明細書で使用される場合、「コントロールライブラリー」という用語は、一般に、核酸分子のサンプルを処理して複数のシークエンシングリードを生成するために使用される核酸分子のライブラリーを指す。いくつかの例では、コントロールライブラリーは、偏りのないシークエンシングを使用して生成される。いくつかの例では、コントロールライブラリーは、偏りのあるシークエンシングを使用して生成される。

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」という用語は、一般に、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例としては、限定されないが、核酸ポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは天然に存在するものであり得るか、または合成され得る。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、比較的高い処理能力を有する。例示的なポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼまたはその誘導体である。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。いくつかの場合では、転写酵素またはリガーゼが使用される（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ－Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｅａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、プラチナＴａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、クレノウ断片、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびにそれらのバリアント、改変産物および誘導体が挙げられる。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、単一サブユニットポリメラーゼである。ポリメラーゼは、高い処理能力、すなわち、核酸テンプレートを放出せずにヌクレオチドを核酸テンプレートに連続的に組み込む能力を有し得る。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸を受け入れるように改変されたポリメラーゼ、例えば６６７Ｙ変異を有するＴａｑポリメラーゼである。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、核酸シークエンシングに有用であり得る改変ヌクレオチド結合を有するポリメラーゼであり、非限定的な例としては、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓポリメラーゼ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ポリメラーゼおよびシークエンシング Ｐｏｌポリメラーゼ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。いくつかの場合では、ポリメラーゼは、例えば、ジデオキシヌクレオチドに対する識別力を有するように遺伝子操作されており、例えば、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）である。

偏りのあるサンプルの複雑さ
サンプルに基づくシークエンシングライブラリーをバイアスすると、目的の特定領域周辺において信頼が得られ得るが、いくつかの場合では、バイアスすることは、サンプルをシークエンシングするためにシークエンサーが使用するアルゴリズムの問題をもたらし得る。例えば、いくつかのＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング技術では、初期シークエンシングサイクル（例えば、シークエンシングの最初から５番目のサイクル、シークエンシングの最初の２５サイクルなど）を中心に設計された特定の調整済みフィルタがある。いくつかの例では、シークエンサー上のコンピュータが、初期サイクル（例えば、最初の５サイクル内）において過度に多くの同じ塩基を検出する場合、それは、シークエンシングランのクラッシュをもたらし得る。このようなものとして、いくつかの例では、偏りのあるサンプルがシークエンサーで主にランされ、初期（例えば、最初の５サイクル）の塩基が過度に類似する場合（フローセルの大部分が同じ塩基である場合）、それは、そのフローセル中の個々の塩基を同定する際に矛盾を生じ得る。しかしながら、複雑さを追加することにより、この問題に対処し、情報消失を防止し得る。

いくつかの例では、この情報消失に対処するために、ｐｈｉＸ参照ゲノムなどの標準コントロールを偏りのあるサンプルと一緒にランし得る。標準コントロールの追加は、フローセルの単調性を解消するために使用され得る。このようにして、追加された複雑さは、大量のフローセルにわたって同じ塩基が生じ、シークエンシングリードの決定において問題を引き起こすことを防止し得る。特に、コントロールを利用することにより、ｐｈｉＸゲノムなどの異なる塩基を追加し得、目的のサンプルのシークエンシング中にイメージングプロセスの単調性を解消する。そして、これは、シークエンシングアルゴリズムが継続して機能して、目的の標的ゲノム領域周辺のディープシークエンシング情報を生成することを可能にし得る。

しかしながら、ｐｈｉＸコントロールの使用の考えられる欠点は、フローセル上のｐｈｉＸコントロール専用の空間の喪失を別にすれば、生成され得るシークエンシングデータの量である。ｐｈｉＸコントロールの使用は、複雑さを増加させて目的の特定領域のディープシークエンシングを保証するように機能し得るが、フローセル上の領域の喪失は、特定のサンプルをシークエンシングする効率を減少させ、それによりそのコストを増加させ得、および／または目的の偏りのないサンプルをシークエンシングする能力の低下に相当し得る。

本明細書に記載される方法およびシステムでは、偏りのあるおよび偏りのないライブラリーを組み合わせて、サンプルの所望のラン深度も提供しながら、ある程度の複雑さを生成し得る。偏りのあるおよび偏りのないサンプルを組み合わせることにより、複雑さを増加させるために使用される偏りのないサンプル専用のシークエンサー領域は、望ましいシークエンシング結果をもたらし得る。このようにして、所望の複雑さを達成して、偏りのないサンプルの望ましいシークエンシング結果も生成しながら、所望の深度への偏りのあるサンプルのシークエンシングを可能にし得る。

いくつかの例では、複雑さは、シークエンシングライブラリー内のいくつかのユニークな分子に関連し得る。いくつかの例では、複雑さは、シークエンシングライブラリー内の分子の多様性に関連し得る。フローセル上に存在する各分子の各鎖内では、例えば、保存された領域があり得、より具体的には、読み取られる初期塩基、例えば、その分子に沿って読み取られる約７５塩基、および最初の５～２０塩基は高度に保存されている可能性があり、その結果、イメージングカメラに対して同様に照らす場合に多数のクラスタが失われる可能性がある。例えば、過度に多い分子が照らされる場合、サンプルをイメージングするカメラは、サンプル内の特定の分子を識別することができない可能性があり、これらはすべて、カメラにとって同じものに見える可能性がある。加えて、アッセイに応じて、どの程度のさらなる多様性を追加する必要があるかに関する様々なガイドラインが存在し得る。例えば、偏りのあるライブラリーの標準的なシークエンシングランでは、例えばｐｈｉＸゲノムを使用することにより５～１０％の多様性をシークエンシングランに追加することを推奨するガイドラインが存在し得る。メチル化ベースのシークエンシング、メチルｓｅｑなどの他の用途では、ユーザは、ｐｈｉＸゲノムの使用により、２０～３０％の多様性を追加する必要があり得る。したがって、多様性を導入するために必要な容量は、ランされているアッセイに応じて変動し得、また、サンプルと、分析されている分子内にどの程度の保存が存在するかに依存し得る。

シークエンサーが大量の利用可能なデータを有し得るいくつかの例では、１つより多くの偏りのあるサンプルおよび／または１つより多くの偏りのないサンプルが、サンプルの組み合わせプールに組み込まれ得る。一部の実施形態では、偏りのあるおよび偏りのないサンプルのセットを一緒にランすることにより、十分な複雑さをフローセル内に生成して、偏りのあるおよび偏りのないサンプルの両方の周辺の所望の深度も得ながら、シークエンサーがそのランを成功裏に完了することを可能にし得る。このようにして、所望の複雑さが達成されるだけではなく、無視可能なシークエンシング（例えば、コントロールバクテリオファージのシークエンシング）に対するフローセル上の領域の喪失を伴わずに、２つまたはそれより多くのタイプのシークエンシングライブラリーからデータを得ることができる。

方法
本開示は、核酸分子のプールされたライブラリーを使用することにより、核酸分子をシークエンシングするための方法を提供する。シークエンシングライブラリーを調製する場合、可能な限り合理的にまたは実用的に高い複雑さレベルを得ることが重要であり得る。ライブラリー複雑さは、有限シークエンシングによりサンプリングされたライブラリー中のユニークな分子の数を指し得る。いくつかの例では、シークエンシングライブラリーの調製の前におよびその間に使用され得る特定の方法は、サンプル複雑さを減少させ得る。例えば、サンプル複雑さは、重複を増加させることにより減少され得る。一部の実施形態では、ＰＣＲおよび他のバイアスする方法は、サンプル複雑さを減少させ得る。

いくつかの場合では、核酸分子の少なくとも２つのライブラリーが使用される。核酸分子の各ライブラリーは、偏りのないまたは偏りのあるシークエンシングのいずれかを実施するために処理され得る。いくつかの場合では、偏りのないシークエンシングライブラリーは、全ゲノムアプローチを使用して生成され得る。いくつかの場合では、偏りのないシークエンシングライブラリーは、ショットガンシークエンシングアプローチを使用して生成され得る。いくつかの場合では、偏りのないシークエンシングライブラリーは、ヒトサンプルを採取することにより生成され得、ゲノムの特定の標的領域とは無関係なシークエンシングのためのＤＮＡを調製し得る。

いくつかの場合では、偏りのあるシークエンシングライブラリーは、ゲノム中の特定の領域を特異的にターゲティングすることにより生成され得る。例えば、さらなるシークエンシング深度が、特定の変異（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、挿入もしくは欠失（ｉｎｄｅｌ，）または融合）の評価における信頼性を増加させるために有益である特定の実施形態では、偏りのあるライブラリーが生成され得る。一部の実施形態では、偏りのあるライブラリーは、最初に偏りのないライブラリーを生成し、次いで標的プルダウンを使用して生成された偏りのないライブラリーをバイアスすることにより生成され得る。いくつかの場合では、標的特異的プライマーが目的の領域をプルダウンし得、非標的領域が破棄され、それにより、偏りのあるライブラリーを生成し得る。一部の実施形態では、偏りのあるライブラリーは、アンプリコンベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アプローチを使用して生成され得る。この場合、目的のサンプルを採取し得、ＰＣＲベースのアプローチを目的の領域に使用し、それにより、偏りのあるライブラリーを生成し得る。

別個のライブラリーが生成されたら、ライブラリーは一緒にプールされ得る。このライブラリーのプールを実施する場合、考慮され得る１つの検討事項は質量である。質量を検討する場合、偏りのあるおよび偏りのないサンプルの両方をカバーするために十分なリードがあるかを検討することが重要であり得る。一部の実施形態では、質量は、同じ濃度、例えば同じ数の分子に対してサンプルを正規化することにより検討され得る。例えば、同じまたは類似の濃度を有するいくつかの偏りのあるサンプルを考慮して、プールが個々の偏りのあるサンプルと同じまたは類似の濃度を有する偏りのあるサンプルのプールが生成され得る。同じまたは類似の濃度でサンプルをプールして、所望の濃度を有するプールされたサンプルを生成することに加えて、サンプルはまた、サンプルの十分なリードを保証するためにプールされ得る。特に、偏りのないおよび偏りのあるライブラリーがプールされる場合、各ライブラリーからの寄与率は、各偏りのあるサンプルおよび各偏りのないサンプルのための十分なシークエンシングリードを保証するように設計され得る。

一部の実施形態では、偏りのないサンプル対偏りのあるサンプルのパーセンテージは、用途に応じて柔軟であり得る。いくつかのバイアス標的パネルセットでは、より多くのリードが偏りのあるサンプルに割り当てられる必要があり得るように、偏りのあるサンプルのより大きなパネルが提供され得る。この場合、より少ないリードが偏りのないサンプルに割り当てられるように、偏りのないショットガンサンプルはより低い深度でランされ得る。反対に、一部の実施形態では、トータルシークエンシングランに割り当てられるリードのパーセンテージが１０％程度しか構成し得ないように、小さな標的とされた偏りのあるパネルが提供され得、それにより、より深い偏りのないアプローチのために９０％が利用可能になる。

一部の実施形態では、プールされたライブラリーの成分に起因する寄与率は調整可能であり得る。加えて、いくつかの例では、２つまたはそれより多い固定した偏りのあるプールが、それぞれ２つの異なるパネルセットと共に提供され得る。例では、偏りのないサンプルは、２つの固定した偏りのあるプールに沿ってランされ得る。いくつかの例では、２つの固定した偏りのあるプールは、偏りのないプールを必要とせずに一緒にランされ得る。いくつかの例では、２つの固定した偏りのないプールは、偏りのあるプールからのさらなる寄与を伴わずに、２つの異なるパネルセットと共に提供され得る。このようにして、様々なサンプルタイプにわたっておよびその中で適切な／所望のシークエンシング深度を達成するために、異なる用途が、サンプルおよび用途に基づいて様々なパーセンテージで組み合わされたプールを使用し得る。

いくつかの場合では、核酸分子の各ライブラリーは、核酸分子の他のライブラリーと同じタイプのシークエンシングを実施するために処理され得る。いくつかの場合では、核酸分子の各ライブラリーは、核酸分子の少なくとも１つの他のライブラリーに対して異なるタイプのシークエンシングを実施するために処理され得る。これは、全ゲノムシークエンシングの効率およびコストに関連する問題に対処し得る。

本開示の方法は、２つまたはそれより多い核酸ライブラリーをプールすることを含み得る。いくつかの場合では、フローセル上で十分に複雑さを達成するために、シークエンシング能力の使用を最大化するために、またはそれらの組み合わせのために、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０または５０個より多いライブラリーがプールされ得る。

本開示の方法を用いてプールされ得るライブラリーの非限定的な例としては、ＷＧＳライブラリー、標的ライブラリー、メチル化－Ｓｅｑライブラリー、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー、偏りのあるＲＮＡライブラリーおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの場合では、ＷＧＳライブラリーは、標的ライブラリーと共にプールされる。いくつかの場合では、ＷＧＳライブラリーは、メチル化－ｓｅｑライブラリーと共にプールされる。いくつかの場合では、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、偏りのあるＲＮＡライブラリーと共にプールされる。いくつかの場合では、ＷＧＳライブラリーは、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーと共にプールされる。いくつかの場合では、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、メチル－ｓｅｑライブラリーと共にプールされる。

プールされた偏りのあるおよび偏りのないライブラリーのシークエンシング
態様では、核酸分子をシークエンシングするための方法が本明細書に開示される。前記方法は、第１の複数の核酸分子を処理することを含み得る。これは、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。前記方法は、第２の複数の核酸分子を処理することを含み得る。これは、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。前記方法は、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを含み得る。前記方法は、シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングし得る。これは、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成し得る。

一部の実施形態では、第１および第２の複数のライブラリーをプールすることは、第１および第２の複数のライブラリーの少なくとも１つと比べて、プールされた複数のライブラリーの複雑さを増加させ得る。一部の実施形態では、第１および第２の複数のライブラリーをプールすることは、第１および第２の複数のライブラリーの少なくとも１つと比べて、プールされた複数のライブラリーの複雑さを約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％または２５０％より多く増加させ得る。

一部の実施形態では、第１および第２の複数の核酸分子は、同じサンプルから供給され得る。一部の実施形態では、第１および第２の複数の核酸分子は、同じ患者由来のサンプルから供給され得る。一部の実施形態では、第１および第２の複数の核酸分子は、同じ家族からの患者由来のサンプルから供給され得る。一部の実施形態では、第１および第２の複数の核酸分子は、同じ人種または民族からの患者由来のサンプルから供給され得る。一部の実施形態では、第１および第２の複数の核酸分子は、同じ性または性別の患者由来のサンプルから供給され得る。

第１および第２の複数の核酸分子が同じサンプルに由来する一部の実施形態では、サンプルの一部は、偏りのあるライブラリー内で第１の複数の核酸分子へと処理され得、サンプルの第２の部分は、偏りのないライブラリー内で第２の複数の核酸分子へと処理され得る。このアプローチでは、第１および第２の複数の核酸分子の部分はシークエンサー上で組み合わされ得、シークエンシングされ得る。

一部の実施形態では、単一の偏りのないライブラリーは、各偏りのあるライブラリーのシークエンシングのためのコントロールとして使用され得る。一部の実施形態では、複数の偏りのあるライブラリーは、コントロール偏りのないライブラリーと一緒にシークエンシングされ得る。一部の実施形態では、一般的なシークエンシングコントロールは、偏りのあるサンプルと同じまたは類似の工程を受けた既知のサンプルからコントロールを生成することにより提供され得る。特に、既知のサンプルの工程が公知であれば、既知のサンプルから得られた情報も十分に特性評価され得るので、ｐｈｉＸなどの十分に特性評価されたコントロールの使用は比較的有益ではない可能性がある。さらに、一部の実施形態では、偏りのないサンプルが偏りのあるサンプルのコントロールであり得、および／または偏りのあるサンプルが偏りのないサンプルのコントロールであり得るように、偏りのないおよび偏りのあるサンプルのプールされた混合物は、各サンプルのコントロールと共にシークエンシングされ得る。

いくつかの例では、第１の複数の核酸分子の処理は、必要に応じて、核酸分子の断片化を伴う。いくつかの場合では、例えば、被験体から得られた無細胞核酸については、処理は断片化を伴わなくてもよい。第１の複数の核酸分子の断片化は、物理的方法、酵素的方法または化学的方法により行われ得る。断片化の物理的方法のいくつかの例としては、限定されないが、音響剪断または超音波処理が挙げられる。酵素的方法のいくつかの例としては、限定されないが、非特異的エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応が挙げられる。いくつかの例では、第１の複数の核酸分子の処理は、第１の複数の核酸分子の断片のサイジングを伴う。第１の複数の核酸分子の断片の好ましいサイズは、約５０塩基未満、約１００塩基未満、約２００塩基未満、約４００塩基未満、約６００塩基未満、約８００塩基未満、約１０００塩基未満、約５０塩基もしくはそれよりも多く、約１００塩基もしくはそれよりも多く、約２００塩基もしくはそれよりも多く、約４００塩基もしくはそれよりも多く、約６００塩基もしくはそれよりも多く、約８００塩基もしくはそれよりも多く、約１０塩基～約１０００塩基、約２０塩基～約８００塩基、約３０塩基～約６００塩基、約４０塩基～約４００塩基、約５０塩基～約２００塩基または約４０塩基～約１００であり得る。一部の実施形態では、第１の複数の核酸分子の断片の好ましいサイズはまた、およそ１，０００塩基；１０，０００塩基；１００，０００塩基；１，０００，０００塩基；または１，０００，０００塩基より長い塩基長を有し得る。

いくつかの例では、第１の複数の核酸分子はＤＮＡである。第１の複数の核酸分子の処理は、５’末端の平滑末端化およびリン酸化を伴い得る。５’末端の平滑末端化およびリン酸化は、少なくとも１つの酵素を使用して達成され得る。これらの酵素は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウ大断片であり得る。第１の複数の核酸分子の処理は、３’末端のＡ－テーリングを伴い得る。３’末端のＡ－テーリングは、酵素を使用し得る。これらの酵素は、Ｔａｑポリメラーゼまたはクレノウ断片であり得る。第１の複数の核酸分子の処理は、多重化を伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、タグ付けを伴い得る。タグ付けは、トランスポザーゼ酵素を使用して核酸分子を同時に断片化およびタグ付けすることを伴い得る。

いくつかの例では、第１の複数の核酸分子はＲＮＡである。第１の複数の核酸分子の処理は、ＤＮＡアダプターとのライゲーションを伴い得る。ＤＮＡアダプターは、ブロック３’末端を有するアデニル化ＤＮＡアダプターであり得る。ライゲーションは、トランケート型Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して行われ得る。第１の複数の核酸分子の処理は、アダプターの追加を伴い得る。このアダプターは５’ＲＮＡアダプターであり得る。第１の複数の核酸分子の処理は、プライマーのハイブリダイゼーションを伴い得る。このプライマーは逆転写プライマーであり得る。第１の複数の核酸分子の処理は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成に基づくものであり得る。この合成は、限定されないが、ランダムプライマーもしくはオリゴｄＴプライマーの使用またはアダプターの結合を伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を開始させることを伴い得る。次いで、これは、アダプター配列をｃＤＮＡ分子に追加するテンプレートスイッチングを伴い得る。

第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、増幅の減少を伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、重複リードを減少させることを伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、インデックス付きアダプターの複数の組み合わせを使用することを伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、バッチ効果を軽減することを伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、日ごとのサンプル処理における変動性を減少させることを伴い得る。これは、反応条件、試薬バッチ、ピペッティング精度およびヒューマンエラーの日ごとの変動性を減少させることを伴い得る。

いくつかの例では、第２の複数の核酸分子の処理は、核酸分子の断片化を伴う。第２の複数の核酸分子の断片化は、物理的方法、酵素的方法または化学的方法により行われ得る。断片化の物理的方法のいくつかの例としては、限定されないが、音響剪断または超音波処理が挙げられる。酵素的方法のいくつかの例としては、限定されないが、非特異的エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応が挙げられる。いくつかの例では、第２の複数の核酸分子の処理は、第２の複数の核酸分子の断片のサイジングを伴う。第２の複数の核酸分子の断片の好ましいサイズは、約５０塩基未満、約１００塩基未満、約２００塩基未満、約４００塩基未満、約６００塩基未満、約８００塩基未満、約１０００塩基未満、約５０塩基もしくはそれよりも多く、約１００塩基もしくはそれよりも多く、約２００塩基もしくはそれよりも多く、約４００塩基もしくはそれよりも多く、約６００塩基もしくはそれよりも多く、約８００塩基もしくはそれよりも多く、約１０塩基～約１０００塩基、約２０塩基～約８００塩基、約３０塩基～約６００塩基、約４０塩基～約４００塩基、約５０塩基～約２００塩基または約４０塩基～約１００であり得る。

いくつかの例では、第２の複数の核酸分子はＤＮＡである。第２の複数の核酸分子の処理は、５’末端の平滑末端化およびリン酸化を伴い得る。５’末端の平滑末端化およびリン酸化は、少なくとも１つの酵素を使用して達成され得る。これらの酵素は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウ大断片であり得る。第２の複数の核酸分子の処理は、３’末端のＡ－テーリングを伴い得る。３’末端のＡ－テーリングは、酵素を使用し得る。これらの酵素は、Ｔａｑポリメラーゼまたはクレノウ断片であり得る。第２の複数の核酸分子の処理は、多重化を伴い得る。第２の複数の核酸分子の処理は、タグ付けを伴い得る。タグ付けは、トランスポザーゼ酵素を使用して核酸分子を同時に断片化およびタグ付けすることを伴い得る。

いくつかの例では、第２の複数の核酸分子はＲＮＡである。第２の複数の核酸分子の処理は、ＤＮＡアダプターとのライゲーションを伴い得る。ＤＮＡアダプターは、ブロック３’末端を有するアデニル化ＤＮＡアダプターであり得る。ライゲーションは、トランケート型Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して行われ得る。第２の複数の核酸分子の処理は、アダプターの追加を伴い得る。このアダプターは５’ＲＮＡアダプターであり得る。第２の複数の核酸分子の処理は、プライマーのハイブリダイゼーションを伴い得る。このプライマーは逆転写プライマーであり得る。第２の複数の核酸分子の処理は、ｃＤＮＡ合成に基づくものであり得る。この合成は、限定されないが、ランダムプライマーもしくはオリゴｄＴプライマーの使用またはアダプターの結合を伴い得る。第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を開始させることを伴い得る。次いで、これは、アダプター配列をｃＤＮＡ分子に追加するテンプレートスイッチングを伴い得る。

第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、増幅を増加させることを伴い得る。第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、重複リードを増加させることを伴い得る。第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、インデックス付きアダプターの最小の組み合わせを使用することを伴い得る。第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、バッチ効果を強調することを伴い得る。第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、日ごとのサンプル処理における変動性を増加させることを伴い得る。これは、反応条件、試薬バッチ、ピペッティング精度およびヒューマンエラーの日ごとの変動性を増加させることを伴い得る。

いくつかの例では、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーはプールされる。プールされた複数のライブラリーが生成され得る。プールすることは、限定されないが、混合することを伴い得る。

いくつかの例では、プールされた複数のライブラリーのシークエンシングは、限定されないが、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）、デノボシークエンシング、メイトペアシークエンシング、染色体免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）、ＲＮＡ免疫沈降シークエンシング（ＲＩＰ－ｓｅｑ）、架橋および免疫沈降シークエンシング（ＣＬＩＰ－ｓｅｑ）を伴う。シークエンシングは、限定されないが、フローセルシークエンシングを伴い得る。シークエンシングは、限定されないが、パターン化フローセルシークエンシングを伴い得る。

偏りのないシークエンシングは、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）、デノボシークエンシング、メイトペアシークエンシング、染色体免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）、ＲＮＡ免疫沈降シークエンシング（ＲＩＰ－ｓｅｑ）、架橋および免疫沈降シークエンシング（ＣＬＩＰ－ｓｅｑ）ならびにＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を含み得る。偏りのないシークエンシングは、限定されないが、フローセルシークエンシングを伴い得る。偏りのないシークエンシングは、限定されないが、パターン化フローセルシークエンシングを伴い得る。

偏りのあるシークエンシングは、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）、デノボシークエンシング、メイトペアシークエンシング、染色体免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）、ＲＮＡ免疫沈降シークエンシング（ＲＩＰ－ｓｅｑ）、架橋および免疫沈降シークエンシング（ＣＬＩＰ－ｓｅｑ）を含み得る。偏りのあるシークエンシングは、限定されないが、フローセルシークエンシングを伴い得る。偏りのあるシークエンシングは、限定されないが、パターン化フローセルシークエンシングを伴い得る。

シークエンシング（例えば、偏りのある、偏りのないまたはその両方）は、約０．１倍以下、０．５倍以下、約１倍以下、約２倍以下、約３倍以下、約４倍以下、約５倍以下、約６倍以下、約７倍以下、約８倍以下、約９倍以下、約１０倍以下、約１５倍以下、約２０倍以下、約３０倍以下、約４０倍以下、約５０倍以下、約６０倍以下、約７０倍以下、約８０倍以下、約９０倍以下、約１００倍以下、約２００倍以下、約３００倍以下、約４００倍以下、約５００倍以下、約６００倍以下、約７００倍以下、約８００倍以下、約９００倍以下、約１０００倍以下、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍以下、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、少なくとも約４０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約６０００倍、少なくとも約７０００倍、少なくとも約８０００倍、少なくとも約９０００倍、または少なくとも約１０，０００倍の深度で実施され得る。

一部の実施形態では、偏りのあるシークエンシングは第１の深度で実施され得、偏りのないシークエンシングは第２の深度で実施され得る。一部の実施形態では、第１の深度は、第２の深度と同じまたは実質的に類似であり得る。一部の実施形態では、第１の深度は、第２の深度を超え得る。一部の実施形態では、第２の深度は、第１の深度を超え得る。

一部の実施形態では、第１のライブラリーのシークエンシングは第１の深度で実施され得、第２のライブラリーのシークエンシングは第２の深度で実施され得る。一部の実施形態では、第１の深度は、第２の深度と同じまたは実質的に類似であり得る。一部の実施形態では、第１の深度は、第２の深度を超え得る。一部の実施形態では、第２の深度は、第１の深度を超え得る。一部の実施形態では、複数のライブラリーがシークエンシングされ得、複数のライブラリーの１つまたはそれよりも多くは異なる深度でシークエンシングされる。

偏りのあるシークエンシングは、複数の遺伝子座を含む標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含み得る。例えば、偏りのあるシークエンシングは、標的メチル－ｓｅｑを含み得る。標的シークエンシングは、（ｉ）ハイブリダイゼーション捕捉アプローチ、（ｉｉ）微小液滴ＰＣＴ液滴ライブラリー、（ｉｉｉ）カスタム設計液滴ライブラリーおよび（ｉｖ）アンプリコンシークエンシングの少なくとも１つを含み得る。

偏りのないシークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）、Ｔｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）などを含み得る。亜硫酸水素ナトリウムによる核酸分子の処理は、ウラシルへの非メチル化シトシンの化学的変換をもたらし得、メチル化シトシンは保護され得る。

前記方法は、第２の複数のシークエンシングリードを生成することをさらに含み得る。第２の複数のシークエンシングリードは、コントロールライブラリーとして第１の複数のライブラリーの少なくとも一部を使用することを含み得る。

前記方法は、第３の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することをさらに含み得る。第３の複数のライブラリーは、第１の複数のシークエンシングリードまたは第２の複数のシークエンシングリードを生成するためのコントロールライブラリーを含み得る。

いくつかの例では、第１の複数の核酸分子および第２の複数の核酸分子は、ＤＮＡ分子を含む。いくつかの例では、第１の複数の核酸分子および第２の複数の核酸分子は、ＲＮＡ分子を含む。いくつかの例では、第１の複数の核酸分子および第２の複数の核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の組み合わせを含む。

核酸のシークエンシングは、次世代シークエンシングなどの任意の適切な方法を使用して実施され得る。一部の実施形態では、核酸のシークエンシングは、連鎖停止シークエンシング、ハイブリダイゼーションシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング、イオントレント半導体シークエンシング、質量分光測光シークエンシング（mass spectrophotometry sequencing）、大規模並列シグネチャシークエンシング（ＭＰＳＳ）、マクサム・ギルバートシークエンシング、ナノポアシークエンシング、ポロニーシークエンシング、パイロシークエンシング、ショットガンシークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング、ユニバーサルシークエンシングまたはそれらの任意の組み合わせを使用して実施され得る。一部の実施形態では、シークエンシングはデジタルＰＣＲを含み得る。いくつかの例では、シークエンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）シークエンサーである。一部の実施形態では、シークエンシングプラットフォームは、例えば、フローセル当たり約２０億個より多いリードのアウトプット範囲を含む。一部の実施形態では、シークエンシングプラットフォームはＮｏｖａＳｅｑ（商標）である。

プールされた別個の偏りのあるライブラリーのシークエンシング
態様では、核酸分子をシークエンシングするための方法が本明細書に開示される。前記方法は、第１の複数の核酸分子を処理することを含み得る。これは、第１の偏りのあるシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。前記方法は、第２の複数の核酸分子を処理することを含み得る。これは、第２の偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。前記方法は、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを含み得る。前記方法は、シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングし得る。これは、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成し得る。

いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子の処理は、核酸分子の断片化を伴う。第１および第２の複数の核酸分子の断片化は、物理的方法、酵素的方法または化学的方法により行われ得る。断片化の物理的方法のいくつかの例としては、限定されないが、音響剪断または超音波処理が挙げられる。酵素的方法のいくつかの例としては、限定されないが、非特異的エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応が挙げられる。いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子の処理は、第１の複数の核酸分子の断片のサイジングを伴う。第１の複数の核酸分子の断片の好ましいサイズは、約５０塩基未満、約１００塩基未満、約２００塩基未満、約４００塩基未満、約６００塩基未満、約８００塩基未満、約１０００塩基未満、約５０塩基もしくはそれよりも多く、約１００塩基もしくはそれよりも多く、約２００塩基もしくはそれよりも多く、約４００塩基もしくはそれよりも多く、約６００塩基もしくはそれよりも多く、約８００塩基もしくはそれよりも多く、約１０塩基～約１０００塩基、約２０塩基～約８００塩基、約３０塩基～約６００塩基、約４０塩基～約４００塩基、約５０塩基～約２００塩基または約４０塩基～約１００であり得る。

いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子はＤＮＡである。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、５’末端の平滑末端化およびリン酸化を伴い得る。５’末端の平滑末端化およびリン酸化は、少なくとも１つの酵素を使用して達成され得る。これらの酵素は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウ大断片であり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、３’末端のＡ－テーリングを伴い得る。３’末端のＡ－テーリングは、酵素を使用し得る。これらの酵素は、Ｔａｑポリメラーゼまたはクレノウ断片であり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、多重化を伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、タグ付けを伴い得る。タグ付けは、トランスポザーゼ酵素を使用して核酸分子を同時に断片化およびタグ付けすることを伴い得る。

いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子はＲＮＡである。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、ＤＮＡアダプターとのライゲーションを伴い得る。ＤＮＡアダプターは、ブロック３’末端を有するアデニル化ＤＮＡアダプターであり得る。ライゲーションは、トランケート型Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して行われ得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、アダプターの追加を伴い得る。このアダプターは５’ＲＮＡアダプターであり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、プライマーのハイブリダイゼーションを伴い得る。このプライマーは逆転写プライマーであり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、ｃＤＮＡ合成に基づくものであり得る。この合成は、限定されないが、ランダムプライマーもしくはオリゴｄＴプライマーの使用またはアダプターの結合を伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を開始させることを伴い得る。次いで、これは、アダプター配列をｃＤＮＡ分子に追加するテンプレートスイッチングを伴い得る。

第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、増幅を増加させることを伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、重複リードを増加させることを伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、インデックス付きアダプターの最小の組み合わせを使用することを伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、バッチ効果を強調することを伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、日ごとのサンプル処理における変動性の増加を伴い得る。これは、反応条件、試薬バッチ、ピペッティング精度およびヒューマンエラーの日ごとの変動性の増加を伴い得る。

いくつかの例では、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーはプールされる。プールされた複数のライブラリーが生成され得る。プールすることは、限定されないが、混合することを伴い得る。

いくつかの例では、プールされた複数のライブラリーのシークエンシングは、限定されないが、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）、デノボシークエンシング、メイトペアシークエンシング、染色体免疫沈降シークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）、ＲＮＡ免疫沈降シークエンシング（ＲＩＰ－ｓｅｑ）、架橋および免疫沈降シークエンシング（ＣＬＩＰ－ｓｅｑ）を伴う。シークエンシングは、限定されないが、フローセルシークエンシングを伴い得る。シークエンシングは、限定されないが、パターン化フローセルシークエンシングを伴い得る。

いくつかの例では、第１の偏りのあるシークエンシングは、第１の複数の遺伝子座を含む第１の標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含み得る。例えば、第１の偏りのあるシークエンシングは、標的メチル－ｓｅｑを含み得る。標的シークエンシングは、（ｉ）ハイブリダイゼーション捕捉アプローチ、（ｉｉ）微小液滴ＰＣＴ液滴ライブラリー、（ｉｉｉ）カスタム設計液滴ライブラリーおよび（ｉｖ）アンプリコンシークエンシングの少なくとも１つを含み得る。いくつかの例では、第２の偏りのあるシークエンシングは、第２の複数の遺伝子座を含む第２の標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含み得る。例えば、第２の偏りのあるシークエンシングは、標的メチル－ｓｅｑを含み得る。標的シークエンシングは、（ｉ）ハイブリダイゼーション捕捉アプローチ、（ｉｉ）微小液滴ＰＣＴ液滴ライブラリー、（ｉｉｉ）カスタム設計液滴ライブラリーおよび（ｉｖ）アンプリコンシークエンシングの少なくとも１つを含み得る。

プールされた別個の偏りのないライブラリーのシークエンシング
態様では、核酸分子をシークエンシングするための方法が本明細書に開示される。前記方法は、第１の複数の核酸分子を処理することを含み得る。これは、第１の偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。前記方法は、第２の複数の核酸分子を処理することを含み得る。これは、第２の偏りのないシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。前記方法は、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを含み得る。前記方法は、シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングし得る。これは、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成し得る。

いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子の処理は、必要に応じて、核酸分子の断片化を伴う。いくつかの場合では、例えば、被験体から得られた無細胞核酸については、処理は断片化を伴わなくてもよい。第１および第２の複数の核酸分子の断片化は、物理的方法、酵素的方法または化学的方法により行われ得る。断片化の物理的方法のいくつかの例としては、限定されないが、音響剪断または超音波処理が挙げられる。酵素的方法のいくつかの例としては、限定されないが、非特異的エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応が挙げられる。いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子の処理は、第１の複数の核酸分子の断片のサイジングを伴う。第１の複数の核酸分子の断片の好ましいサイズは、約５０塩基未満、約１００塩基未満、約２００塩基未満、約４００塩基未満、約６００塩基未満、約８００塩基未満、約１０００塩基未満、約５０塩基もしくはそれよりも多く、約１００塩基もしくはそれよりも多く、約２００塩基もしくはそれよりも多く、約４００塩基もしくはそれよりも多く、約６００塩基もしくはそれよりも多く、約８００塩基もしくはそれよりも多く、約１０塩基～約１０００塩基、約２０塩基～約８００塩基、約３０塩基～約６００塩基、約４０塩基～約４００塩基、約５０塩基～約２００塩基または約４０塩基～約１００であり得る。一部の実施形態では、第１の複数の核酸分子の断片の好ましいサイズはまた、およそ１，０００塩基；１０，０００塩基；１００，０００塩基；１，０００，０００塩基；または１，０００，０００塩基より長い塩基長を有し得る。

いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子はＤＮＡである。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、５’末端の平滑末端化およびリン酸化を伴い得る。５’末端の平滑末端化およびリン酸化は、少なくとも１つの酵素を使用して達成され得る。これらの酵素は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウ大断片であり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、３’末端のＡ－テーリングを伴い得る。３’末端のＡ－テーリングは、酵素を使用し得る。これらの酵素は、Ｔａｑポリメラーゼまたはクレノウ断片であり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、多重化を伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、タグ付けを伴い得る。タグ付けは、トランスポザーゼ酵素を使用して核酸分子を同時に断片化およびタグ付けすることを伴い得る。

いくつかの例では、第１および第２の複数の核酸分子はＲＮＡである。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、ＤＮＡアダプターとのライゲーションを伴い得る。ＤＮＡアダプターは、ブロック３’末端を有するアデニル化ＤＮＡアダプターであり得る。ライゲーションは、トランケート型Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を使用して行われ得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、アダプターの追加を伴い得る。このアダプターは５’ＲＮＡアダプターであり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、プライマーのハイブリダイゼーションを伴い得る。このプライマーは逆転写プライマーであり得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、ｃＤＮＡ合成に基づくものであり得る。この合成は、限定されないが、ランダムプライマーもしくはオリゴｄＴプライマーの使用またはアダプターの結合を伴い得る。第１および第２の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を開始させることを伴い得る。次いで、これは、アダプター配列をｃＤＮＡ分子に追加するテンプレートスイッチングを伴い得る。

第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、増幅の減少を伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、重複リードを減少させること（例えば、コンセンサス配列を生成すること）またはリード中の塩基エラーを検出／修正することを伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、インデックス付きアダプターの複数の組み合わせを使用することを伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、バッチ効果を軽減することを伴い得る。第１の複数の核酸分子の処理は、限定されないが、日ごとのサンプル処理における変動性を減少させることを伴い得る。これは、反応条件、試薬バッチ、ピペッティング精度およびヒューマンエラーの日ごとの変動性を減少させることを伴い得る。

いくつかの例では、第１の偏りのないシークエンシングは、全ゲノムシークエンシングを含む。いくつかの例では、第１の偏りのないシークエンシングは、ＲＮＡシークエンシングを含む。いくつかの例では、第１の偏りのないシークエンシングは、全ゲノムシークエンシングおよびＲＮＡシークエンシングを含む。いくつかの例では、第１の偏りのないシークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）、Ｔｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）などを含む。いくつかの例では、第２の偏りのないシークエンシングは、ＲＮＡシークエンシングを含む。いくつかの例では、第２の偏りのないシークエンシングは、全ゲノムシークエンシングおよびＲＮＡシークエンシングを含む。いくつかの例では、第２の偏りのないシークエンシングは、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）、Ｔｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）などを含む。

偏りのないシークエンシングは、約０．１倍以下、０．５倍以下、約１倍以下、約２倍以下、約３倍以下、約４倍以下、約５倍以下、約６倍以下、約７倍以下、約８倍以下、約９倍以下、約１０倍以下、約１５倍以下、約２０倍以下、約３０倍以下、約４０倍以下、約５０倍以下、約６０倍以下、約７０倍以下、約８０倍以下、約９０倍以下、約１００倍以下、約２００倍以下、約３００倍以下、約４００倍以下、約５００倍以下、約６００倍以下、約７００倍以下、約８００倍以下、約９００倍以下、約１０００倍以下、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍以下、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、少なくとも約４０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約６０００倍、少なくとも約７０００倍、少なくとも約８０００倍、少なくとも約９０００倍、または少なくとも約１０，０００倍の深度で実施され得る。

いくつかの例では、本明細書に記載される方法において使用される核酸分子は、サンプルから抽出される。サンプルは、生物学的サンプルであり得る。

システム
別の態様では、核酸分子をシークエンシングするためのシステムが本明細書に開示される。システムはコントローラを含み得る。システムはまた、コントローラに作動可能に結合した支持体を含み得る。コントローラは、１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含み得る。１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサは、第１の複数の核酸分子を処理して、第１の複数のライブラリーを生成することを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。コンピュータプロセッサは、第２の複数の核酸分子を処理して、第２の複数のライブラリーを生成することを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。コンピュータプロセッサは、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールすることを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、プールされた複数のライブラリーを生成し得る。このプールされた複数のライブラリーは、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成するために使用され得る。このプールされた複数のライブラリーはまた、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するために使用され得る。

別の態様では、核酸分子をシークエンシングするためのシステムが本明細書に開示される。システムはコントローラを含み得る。システムはまた、コントローラに作動可能に結合した支持体を含み得る。コントローラは、１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含み得る。１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサは、第１の複数の核酸分子を処理して、第１の複数のライブラリーを生成することを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、第１の偏りのあるシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。コンピュータプロセッサは、第２の複数の核酸分子を処理して、第２の複数のライブラリーを生成することを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、第２の偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。コンピュータプロセッサは、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールすることを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、プールされた複数のライブラリーを生成し得る。このプールされた複数のライブラリーは、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成するために使用され得る。このプールされた複数のライブラリーはまた、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するために使用され得る。

別の態様では、核酸分子をシークエンシングするためのシステムが本明細書に開示される。システムはコントローラを含み得る。システムはまた、コントローラに作動可能に結合した支持体を含み得る。コントローラは、１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含み得る。１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサは、第１の複数の核酸分子を処理して、第１の複数のライブラリーを生成することを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、第１の偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。コンピュータプロセッサは、第２の複数の核酸分子を処理して、第２の複数のライブラリーを生成することを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、第２の偏りのないシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。コンピュータプロセッサは、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールすることを指示するように個々にまたは集合的にプログラムされ得る。これは、プールされた複数のライブラリーを生成し得る。このプールされた複数のライブラリーは、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成するために使用され得る。このプールされた複数のライブラリーはまた、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するために使用され得る。

ソフトウェア
態様では、機械実行可能コードを含み得る非一時的コンピュータ可読媒体が本明細書に記載される。コンピュータプロセッサにより実行される際の、機械実行可能コードは、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装し得る。実装される方法は、第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを含み得る。実装される方法は、第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを含み得る。実装される方法は、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールし得る。実装される方法は、プールされた複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングし得る。実装される方法は、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成し得る。

態様では、機械実行可能コードを含み得る非一時的コンピュータ可読媒体が本明細書に記載される。コンピュータプロセッサにより実行される際の、機械実行可能コードは、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装し得る。実装される方法は、第１の複数の核酸分子を処理し得る。実装される方法は、第１の偏りのあるシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、第２の複数の核酸分子を処理し得る。実装される方法は、第２の偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングし得る。実装される方法は、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成し得る。

態様では、機械実行可能コードを含み得る非一時的コンピュータ可読媒体が本明細書に記載される。１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサにより実行される際の、機械実行可能コードは、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装し得る。実装される方法は、第１の複数の核酸分子を処理し得る。実装される方法は、第１の偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、第２の複数の核酸分子を処理し得る。実装される方法は、第２の偏りのないシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、第１の複数のライブラリーおよび第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成し得る。実装される方法は、シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、プールされた複数のライブラリーをシークエンシングし得る。実装される方法は、第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成し得る。

コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１は、核酸配列および配列分析を実施するなど、本開示の方法またはシステムを実装するようにプログラムされたかまたは別様に構成されたコンピュータシステム１０１を示す。

コンピュータシステム１０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、また本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）１０５を含み得る。コンピュータシステム１０１はまた、メモリまたはメモリ位置１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶装置１１５（例えば、ハードディスク）と、他のシステムと通信するための通信インターフェース１２０（例えば、ネットワークアダプター）と、周辺デバイス１２５、例えばキャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプターとを含む。メモリ１１０、記憶装置１１５、インターフェース１２０および周辺デバイス１２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ １０５と通信する。記憶装置１１５は、データを格納するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１０１は、通信インターフェース１２０の支援により、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３０に作動可能に結合され得る。ネットワーク１３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。いくつかの場合では、ネットワーク１３０は、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得るコンピュータサーバ（複数可）を含み得る。いくつかの場合では、ネットワーク１３０は、コンピュータシステム１０１の支援により、コンピュータシステム１０１に結合されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装し得る。

ＣＰＵ １０５は、プログラムまたはソフトウェアで具体化され得る一連の機械可読命令を実行し得る。命令は、メモリ１１０などのメモリ位置に格納され得る。命令は、ＣＰＵ １０５に指示され得、続いて、これは、本開示の方法を実装するようにＣＰＵ １０５をプログラムまたは別様に構成し得る。ＣＰＵ １０５により実施される操作の例は、フェッチ、デコード、実行およびライトバックを含み得る。

ＣＰＵ １０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム１０１の他の構成要素（複数可）が回路に含められ得る。いくつかの場合では、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

記憶装置１１５は、ファイル、例えばドライバ、ライブラリーおよび保存プログラムを格納し得る。記憶装置１１５は、ユーザデータ、例えばユーザ選択およびユーザプログラムを格納し得る。いくつかの場合では、コンピュータシステム１０１は、コンピュータシステム１０１の外部にある、例えばイントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム１０１と通信するリモートサーバ上に位置するさらなるデータ記憶装置（複数可）を含み得る。

コンピュータシステム１０１は、ネットワーク１３０を介してリモートコンピュータシステムと通信し得る。例えば、コンピュータシステム１０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信し得る。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザは、ネットワーク１３０を介してコンピュータシステム１０１にアクセスし得る。

本明細書に記載される方法は、コンピュータシステム１０１の電子記憶位置に、例えばメモリ１１０または電子記憶装置１１５などに格納された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードにより実装され得る。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形式で提供され得る。使用中、コードは、プロセッサ１０５により実行され得る。いくつかの場合では、コードは記憶装置１１５から取り出され得、プロセッサ１０５による準備ができたアクセスのためにメモリ１１０に格納され得る。いくつかの場合では、電子記憶装置１１５は除外され得、機械実行可能命令はメモリ１１０に格納される。

コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械と共に使用するためにプリコンパイルおよび構成され得るか、またはランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、プリコンパイルまたはコンパイル方式でコードを実行することを可能にするように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。

コンピュータシステム１０１などの本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで具体化され得る。技術の様々な態様は、典型的には、機械可読媒体のタイプで行われるまたは具体化される機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形式の「プロダクト」または「製品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、電子記憶装置、例えばメモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクに格納され得る。「記憶」タイプ媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、またはソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的記憶域を提供し得るそれらの関連モジュール、例えば様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのいずれかまたはすべてを含み得る。ソフトウェアの全部または一部は、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して通信され得る。このような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を保持し得る別のタイプの媒体は、例えば、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを越えて、有線および光固定電話ネットワークを通じて、ならびに様々なエアリンクにわたって使用される光波、電波および電磁波を含む。例えば、有線または無線リンク、光リンクなどのこのような波を運搬する物理的要素もまた、ソフトウェアを保持する媒体と考えられ得る。本明細書で使用される場合、非一時的有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサへの命令の提供に関与する任意の媒体を指す。

したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、限定されないが、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含む多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体としては、例えば、光学または磁気ディスク、例えば図面に示されているデータベースなどを実装するために使用され得る、例えば、任意のコンピュータ（複数可）中の記憶デバイスのいずれかなどが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、このようなコンピュータプラットフォームのダイナミックメモリ、例えばメインメモリが挙げられる。有形伝送媒体としては、同軸ケーブル；コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む銅線および光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号または音響波または光波、例えば無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものの形態をとり得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データまたは命令を転送する搬送波、このような搬送波を転送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために一連の命令をプロセッサに運搬することに関与し得る。

コンピュータシステム１０１は、例えば、核酸シークエンシングの結果（例えば、シークエンスリード、コンセンサス配列など）を提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）１４０を含む電子ディスプレイ１３５を含み得るかまたはそれと通信し得る。ＵＩの例としては、限定されないが、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）およびＷｅｂベースのユーザインターフェースが挙げられる。

本開示の方法およびシステムは、アルゴリズムにより実装され得る。アルゴリズムは、中央処理装置１０５による実行の際にソフトウェアにより実装され得る。アルゴリズムは、例えば、本開示の方法およびシステムを実装し得る。

実施例１：偏りのない／偏りのあるシークエンシングを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図２）。ＤＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＤＮＡを２つのサンプル（第１のサンプル２０２および第２のサンプル２０３）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＤＮＡを操作２０４で処理する。第１のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第１のライブラリーに変換する。この時点まで、第１のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを軽減するための措置を取った。

次いで、第２のサンプル中のＤＮＡを操作２０５で処理する。第２のサンプル中のＤＮＡを断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第２のライブラリーに変換する。この時点まで、第２のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを強調する（exaggerate）ための措置を取った。

第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する（図６）。具体的には、第１のライブラリー６０２の処理されたＤＮＡ ６０３を、第２のライブラリー６０４の処理されたＤＮＡ ６０５と共にプールする。フローセル６０７に入れる前に、第１のライブラリー６０２および第２のライブラリー６０２のプールを行う。第１のライブラリーのＤＮＡおよび第２のライブラリーのＤＮＡのアダプターは、フローセル６０８中のチャネルの表面と相互作用する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプル６１０のＤＮＡおよび第２のサンプル６０９のＤＮＡに相関させる。

実施例２：偏りのある／偏りのあるシークエンシングを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図３）。ＤＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＤＮＡを２つのサンプル（第１のサンプル３０２および第２のサンプル３０３）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＤＮＡを操作３０４で処理する。第１のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第１のライブラリーに変換する。

次いで、第２のサンプル中のＤＮＡを操作３０５で処理する。第２のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第２のライブラリーに変換する。この時点まで、第２のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを強調するための措置を取った。

第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する（図６）。具体的には、第１のライブラリー６０２の処理されたＤＮＡ ６０３を、第２のライブラリー６０４の処理されたＤＮＡ ６０５と共にプールする。フローセル６０７に入れる前に、第１のライブラリー６０２および第２のライブラリー６０２のプールを行う。第１のライブラリーのＤＮＡおよび第２のライブラリーのＤＮＡのアダプターは、フローセル６０８中のチャネルの表面と相互作用する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプル６１０のＤＮＡおよび第２のサンプル６０９のＤＮＡに相関させる。

実施例３：偏りのない／偏りのないシークエンシングを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図４）。ＤＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＤＮＡを２つのサンプル（第１のサンプル４０２および第２のサンプル４０３）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＤＮＡを操作４０４で処理する。第１のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第１のライブラリーに変換する。この時点まで、第１のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを軽減するための措置を取った。

次いで、第２のサンプル中のＤＮＡを操作４０５で処理する。第２のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第２のライブラリーに変換する。

第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する（図６）。具体的には、第１のライブラリー６０２の処理されたＤＮＡ ６０３を、第２のライブラリー６０４の処理されたＤＮＡ ６０５と共にプールする。フローセル６０７に入れる前に、第１のライブラリー６０２および第２のライブラリー６０２のプールを行う。第１のライブラリーのＤＮＡおよび第２のライブラリーのＤＮＡのアダプターは、フローセル６０８中のチャネルの表面と相互作用する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプル６１０のＤＮＡおよび第２のサンプル６０９のＤＮＡに相関させる。

実施例４：偏りのない／偏りのあるシークエンシングを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図２）。ＲＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＲＮＡを２つのサンプル（第１のサンプル２０２および第２のサンプル２０３）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＲＮＡを操作２０４で処理する。第１のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換して第１のライブラリーを生成する。この時点まで、第１のサンプル中のＲＮＡの断片化およびｃＤＮＡ合成のバイアスを軽減するための措置を取った。

次いで、第２のサンプル中のＲＮＡを操作２０５で処理する。第２のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換して第２のライブラリーを生成する。この時点まで、第２のサンプル中のＲＮＡの断片化およびｃＤＮＡ合成のバイアスを強調するための措置を取った。

第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する（図６）。具体的には、第１のライブラリー６０２の処理されたＲＮＡ ６０３を、第２のライブラリー６０４の処理されたＲＮＡ ６０５と共にプールする。フローセル６０７に入れる前に、第１のライブラリー６０２および第２のライブラリー６０２のプールを行う。第１のライブラリーのｃＤＮＡおよび第２のライブラリーのｃＤＮＡは、フローセル６０８中のチャネルの表面と相互作用する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプル６１０のＲＮＡおよび第２のサンプル６０９のＲＮＡに相関させる。

実施例５：偏りのある／偏りのあるシークエンシングを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図３）。ＲＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＲＮＡを２つのサンプル（第１のサンプル３０２および第２のサンプル３０３）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＲＮＡを操作３０４で処理する。第１のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換して第１のライブラリーを生成する。

次いで、第２のサンプル中のＲＮＡを操作３０５で処理する。第２のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換して第２のライブラリーを生成する。この時点まで、第２のサンプル中のＲＮＡの断片化およびｃＤＮＡ合成のバイアスを強調するための措置を取った。

第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する（図６）。具体的には、第１のライブラリー６０２の処理されたＲＮＡ ６０３を、第２のライブラリー６０４の処理されたＲＮＡ ６０５と共にプールする。フローセル６０７に入れる前に、第１のライブラリー６０２および第２のライブラリー６０２のプールを行う。第１のライブラリーのｃＤＮＡおよび第２のライブラリーのｃＤＮＡは、フローセル６０８中のチャネルの表面と相互作用する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばシングルリードまたはペアエンドシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプル６１０のＲＮＡおよび第２のサンプル６０９のＲＮＡに相関させる。

実施例６：偏りのない／偏りのないシークエンシングを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図４）。ＲＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＲＮＡを２つのサンプル（第１のサンプル４０２および第２のサンプル４０３）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＲＮＡを操作４０４で処理する。第１のサンプル中のＲＮＡを断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換して第１のライブラリーを生成する。この時点まで、第１のサンプル中のＲＮＡの断片化およびｃＤＮＡ合成のバイアスを軽減するための措置を取った。

次いで、第２のサンプル中のＲＮＡを操作４０５で処理する。第２のサンプル中のＲＮＡを断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換して第２のライブラリーを生成する。

第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する（図６）。具体的には、第１のライブラリー６０２の処理されたＲＮＡ ６０３を、第２のライブラリー６０４の処理されたＲＮＡ ６０５と共にプールする。フローセル６０７に入れる前に、第１のライブラリー６０２および第２のライブラリー６０２のプールを行う。第１のライブラリーのｃＤＮＡおよび第２のライブラリーのｃＤＮＡは、フローセル６０８中のチャネルの表面と相互作用する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプル６１０のＲＮＡおよび第２のサンプル６０９のＲＮＡに相関させる。

実施例７：偏りのない／偏りのある／偏りのないシークエンシングを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＤＮＡをシークエンシングする方法を提供する（図５）。ＤＮＡを組織または細胞から抽出する。抽出されたＤＮＡを３つのサンプル（第１のサンプル５０２、第２のサンプル５０３および第３のサンプル５０４）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＤＮＡを操作５０５で処理する。第１のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第１のライブラリーに変換する。この時点まで、第１のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを軽減するための措置を取った。

次いで、第２のサンプル中のＤＮＡを操作５０６で処理する。第２のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第２のライブラリーに変換する。この時点まで、第２のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを強調するための措置を取った。

次いで、第３のサンプル中のＤＮＡを操作５０７で処理する。第３のサンプル中のＤＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第３のサンプルの得られたＤＮＡ断片をサイジングする。第３のサンプルのサイジングされたＤＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第３のライブラリーに変換する。この時点まで、第３のサンプル中のＤＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを強調または軽減するための措置を取った。

次いで、第１のライブラリー、第２のライブラリーおよび第３のライブラリーを操作５０８でプールして、プールされたライブラリーを生成する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリード５０９を生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプルのＤＮＡ、第２のサンプルのＤＮＡおよび第３のサンプルのＤＮＡに相関させる。

実施例８：偏りのない／偏りのある／偏りのないシークエンシングを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法
一例では、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用してＲＮＡをシークエンシングする方法が存在する（図５）。ＲＮＡを生物学的サンプルから抽出する。抽出されたＲＮＡを３つのサンプル（第１のサンプル５０２、第２のサンプル５０３および第３のサンプル５０４）に分割する。

次いで、第１のサンプル中のＲＮＡを操作５０５で処理する。第１のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第１のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第１のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第１のライブラリーに変換する。この時点まで、第１のサンプル中のＲＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを軽減するための措置を取った。

次いで、第２のサンプル中のＲＮＡを操作５０６で処理する。第２のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第２のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第２のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第２のライブラリーに変換する。この時点まで、第２のサンプル中のＲＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを強調するための措置を取った。

次いで、第３のサンプル中のＲＮＡを操作５０７で処理する。第３のサンプル中のＲＮＡを必要に応じて断片化に供する。いくつかの断片化方法は、物理的方法（音響剪断または超音波処理）、酵素的方法（エンドヌクレアーゼカクテルまたはトランスポザーゼタグ付け反応）または化学的方法である。第３のサンプルの得られたＲＮＡ断片をサイジングする。第３のサンプルのサイジングされたＲＮＡ断片を、次世代シークエンシングプラットフォームのフローセルの表面と相互作用するように設計された特定の配列を含有するシークエンシングアダプターへのライゲーションにより、第３のライブラリーに変換する。この時点まで、第３のサンプル中のＲＮＡの断片化、サイジングおよびライゲーションのバイアスを強調または軽減するための措置を取った。

次いで、第１のライブラリー、第２のライブラリーおよび第３のライブラリーを操作５０８でプールして、プールされたライブラリーを生成する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリード５０９を生成する。次いで、シークエンシングリードを、第１のサンプルのＲＮＡ、第２のサンプルのＲＮＡおよび第３のサンプルのＲＮＡに相関させる。

実施例９：ＲＮＡの偏りのあるおよびＤＮＡの偏りのないシークエンシングを使用してＤＮＡおよびＲＮＡをシークエンシングする方法
例では、本開示は、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡをシークエンシングする方法を提供する。ＲＮＡを生物学的サンプルから抽出する。ＤＮＡを生物学的サンプルから抽出する。生物学的サンプルは、無細胞核酸、組織、細胞またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

抽出されたＲＮＡを処理して、標的ＲＮＡライブラリーなどの偏りのあるＲＮＡライブラリーを生成する。抽出されたＤＮＡを処理して、ＷＧＳライブラリーなどの偏りのないＤＮＡライブラリーを生成する。ＮＧＳシークエンシングプラットフォームでランするために、例えば、フローセル上の配列とハイブリダイズするように設計された配列を追加することにより、両ライブラリーを調製する。

偏りのあるＲＮＡライブラリーおよび偏りのないＤＮＡライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、偏りのあるライブラリーのＲＮＡおよび偏りのないライブラリーのＤＮＡに相関させる。

実施例１０：ＤＮＡの偏りのあるおよびＲＮＡの偏りのないシークエンシングを使用してＤＮＡおよびＲＮＡをシークエンシングする方法
一例では、偏りのないおよび偏りのあるシークエンシングを実施するために調製されたライブラリーを使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡをシークエンシングする方法が存在する。ＲＮＡを生物学的サンプルから抽出する。ＤＮＡを生物学的サンプルから抽出する。生物学的サンプルは、無細胞核酸、組織、細胞またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

抽出されたＲＮＡを処理して、ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーなどの偏りのないＲＮＡライブラリーを生成する。抽出されたＤＮＡを処理して、標的ライブラリーなどの偏りのあるＤＮＡライブラリーを生成する。ＮＧＳシークエンシングプラットフォームでランするために、例えば、フローセル上の配列とハイブリダイズするように設計された配列を追加することにより、両ライブラリーを調製する。

偏りのないＲＮＡライブラリーおよび偏りのあるＤＮＡライブラリーをプールして、プールされたライブラリーを生成する。プールされたライブラリーを、クラスタ生成を使用したクローン増幅に供する。次いで、プールされたライブラリーを、シークエンシング、例えばペアエンドまたはシングルリードシークエンシングに供して、シークエンシングリードを生成する。次いで、シークエンシングリードを、偏りのないライブラリーのＲＮＡおよび偏りのあるライブラリーのＤＮＡに相関させる。

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明したが、このような実施形態はほんの一例として提供されていることは当業者には明らかである。本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例により限定されることを意図しない。上記本明細書を参照して本発明を説明したが、本明細書の実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図しない。本発明から逸脱せずに多数の変形、変更および置換が当業者には想起される。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載される特定の描写、構成または相対的比率に限定されないことが理解されよう。本発明の実施では、本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替物が用いられ得ることを理解すべきである。したがって、本発明はまた、このような代替物、改変物、変形物または均等物をカバーすることが企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、それによりカバーされることを意図する。

Claims (21)

1. 核酸分子をシークエンシングするための方法であって、
   第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成すること；
   第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することであって、前記偏りのあるシークエンシングが、複数の遺伝子座を含む標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む、前記第２の複数のライブラリーを生成すること；
   前記第１の複数のライブラリーおよび前記第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成すること；ならびに
   シークエンシングプラットフォームの単一のフローセルを使用して、前記プールされた複数のライブラリーをシークエンシングして、前記第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードと、前記第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードとを生成すること
   を含む、方法。
2. 前記偏りのないシークエンシングが全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記偏りのないシークエンシングが約１０倍以下の深度で実施される、請求項２に記載の方法。
4. 前記標的シークエンシングが、前記標的捕捉パネルのハイブリダイゼーション捕捉に続いてシークエンシングを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記標的シークエンシングが標的メチル－ｓｅｑを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記偏りのないシークエンシングがメチル化シークエンシングを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記メチル化シークエンシングが、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）またはＴｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第２の複数のシークエンシングリードを生成することが、コントロールライブラリーとして前記第１の複数のライブラリーの少なくとも一部を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
9. 第３の複数のライブラリーをプールして、前記プールされた複数のライブラリーを生成することをさらに含み、前記第３の複数のライブラリーが、前記第１の複数のシークエンシングリードまたは前記第２の複数のシークエンシングリードを生成するためのコントロールライブラリーを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１の複数の核酸分子および前記第２の複数の核酸分子がＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記第１の複数の核酸分子および前記第２の複数の核酸分子がＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記シークエンシングプラットフォームがＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）シークエンサーである、請求項１に記載の方法。
13. 前記核酸分子がサンプルから抽出される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記第１の複数の核酸分子および前記第２の複数の核酸分子が、同じサンプルから抽出される、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 核酸分子をシークエンシングするためのシステムであって、
    １つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサを含むコントローラ；および
    前記コントローラに作動可能に結合した支持体
    を含み；
    前記１つまたはそれより多くのコンピュータプロセッサが、
    第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示し；
    第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示することであって、前記偏りのあるシークエンシングが、複数の遺伝子座を含む標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む、前記第２の複数のライブラリーを生成することを指示し；
    前記第１の複数のライブラリーおよび前記第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示し；
    前記プールされた複数のライブラリーから、前記第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成し；ならびに、
    前記プールされた複数のライブラリーから、前記第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成するように個々にまたは集合的にプログラムされている、システム。
17. 前記偏りのないシークエンシングが全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）またはメチル化シークエンシングを含む、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記メチル化シークエンシングが、バイサルファイトシークエンシング、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ＷＧＢＳ）、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ、メチル－ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質捕捉、メチル－ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）、メチル化感受性制限酵素シークエンシング（ＭＳＲＥ／ＭＲＥ－Ｓｅｑまたはメチル－Ｓｅｑ）、酸化的バイサルファイトシークエンシング（ｏｘＢＳ－Ｓｅｑ）、還元表示バイサルファイトシークエンシング（ＲＲＢＳ）またはＴｅｔ支援バイサルファイトシークエンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）を含む、請求項１７に記載のシステム。
19. 前記標的シークエンシングが標的メチル－ｓｅｑを含む、請求項１６に記載のシステム。
20. 前記標的シークエンシングが、前記標的捕捉パネルのハイブリダイゼーション捕捉に続いてシークエンシングを行うことを含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. コンピュータプロセッサにより実行される際の、核酸分子をシークエンシングするための方法を実装する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、
    第１の複数の核酸分子を処理して、偏りのないシークエンシングを実施するための第１の複数のライブラリーを生成することを指示すること、
    第２の複数の核酸分子を処理して、偏りのあるシークエンシングを実施するための第２の複数のライブラリーを生成することを指示することであって、前記偏りのあるシークエンシングが、複数の遺伝子座を含む標的捕捉パネルの標的シークエンシングを含む、前記第２の複数のライブラリーを生成することを指示すること；
    前記第１の複数のライブラリーおよび前記第２の複数のライブラリーをプールして、プールされた複数のライブラリーを生成することを指示すること；
    前記プールされた複数のライブラリーから、前記第１の複数の核酸分子に対応する第１の複数のシークエンシングリードを生成すること；ならびに、
    前記プールされた複数のライブラリーから、前記第２の複数の核酸分子に対応する第２の複数のシークエンシングリードを生成すること
    を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。

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