JP7391349B2 - 正常圧水頭症の発症リスクを試験する方法、及び該方法に用いるキット - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 平成３０年８月２１日 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｈｇ２０１８／ｆｉｌｅｓ／ａｄｏｐｔｉｏｎ－ｊａ．ｐｄｆ（社団法人日本人類遺伝学会第６３回大会）を通じて発表
特許法第３０条第２項適用 平成３０年１０月５日 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｈｇ２０１８／ｆｉｌｅｓ／ｐｒｏｇｒａｍ／ｐｏｓｔｅｒ．ｐｄｆ（社団法人日本人類遺伝学会第６３回大会）を通じて発表
特許法第３０条第２項適用 平成３０年１０月１０日 社団法人日本人類遺伝学会第６３回大会プログラム・抄録集、第３５８頁（Ｐ－２１２ ＣＦＡＰ４３遺伝子の機能喪失性変異は正常圧水頭症のリスク因子の可能性がある）にて発表
特許法第３０条第２項適用 平成３０年１０月１２日 パシフィコ横浜において開催された社団法人日本人類遺伝学会第６３回大会においてポスターにて発表
特許法第３０条第２項適用 平成３１年４月１９日 ｈｔｔｐｓ：／／ｎ．ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ／９２／２０／ｅ２３６４．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．２０，ｅ２３６６，Ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＦＡＰ４３ ｃａｕｓｅｓ ｎｏｒｍａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｗｉｔｈ ｃｉｌｉａｒｙ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）を通じて発表
本発明は、被験者から採取した試料由来のDNAにおいて、CFAP43（cilia- and flagella-associated protein 43）遺伝子の機能減弱型変異の有無を基準として正常圧水頭症の発症リスクを試験する方法に関する。更に本発明は、該方法に使用することができる正常圧水頭症の発症リスクの評価用キットに関する。更に本発明は、CFAP43の機能喪失変異を有する、正常圧水頭症のモデル哺乳動物、及びその用途に関する。
水頭症は脳室内の過剰な脳脊髄液の貯留を特徴とする疾患である。正常な状態では脳室の空洞内では脳脊髄液の産生、循環、吸収の微妙なバランスが保たれている。しかし脳脊髄液が脳室系を流れて通過できなくなったり、血流内に吸収される脳脊髄液の量と産生される脳脊髄液の量のバランスが崩れると、脳脊髄液が脳内に貯留して脳室の拡大が起こり、拡大した脳室が脳を圧迫することにより水頭症が発症する。
正常圧水頭症（normal pressure hydrocephalus：NPH）は水頭症の一種であって、頭蓋内圧が正常範囲（一般的な基準は腰椎穿刺時の髄圧液は１８ｃｍ水柱以下）である水頭症をNPHと呼ぶ。正常圧水頭症患者においても脳室は拡大しているものの、髄液シャント術により症状の改善を期待することができる。NPHは通常は60代や70代の高齢者において発症し、歩行障害、認知症、及び尿失禁の３つが主症状と考えられている。特に、認知症は高齢化社会において深刻な社会問題であるが、その発症リスクを高齢となる前に知ることが可能な遺伝子診断には大きな関心が寄せられている。
NPHは通常は散発的に起こるが、特定の家系に集積して起こる場合も報告されている（非特許文献１、２）。２０１１年には、３世代に亘って、NPHを発症する家系が報告されている（非特許文献３）。そのような家系の遺伝的研究により、NPHの発症に根底には遺伝的因子があることが示唆された。しかしながら、NPHの発症のリスクとなる遺伝的因子はこれまで明らかにされていなかった。
McGirr A et al., Journal neurol Sci, 2012, 321: 82-88
Huovien J et al., Journal neurol Sci, 2016, 368: 11-18
Takahashi Y et al., Journal neurol Sci, 2011, 308: 149-151
従って、本発明の目的は、NPHの発症のリスクとなる遺伝的因子を同定し、更にはその知見に基づき、NPHの診断方法やNPH発症のリスク評価方法を提供することである。更にNPHは認知症を伴うので、認知症のリスクを評価する遺伝子診断の新たな方法を提供することも課題とする。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、NPHの患者が複数存在する家系（その家系については下記の実施例において詳細に述べる）に注目し、NPHの発症のリスクとなる遺伝的因子の検討を行った。具体的には、上記の家系から数人の被験者（NPHを発症している被験者及びNPHを発症していない被験者）を選択し、被験者から採集した試料（血液）を用いて、神経変性疾患の原因となる単一の遺伝子を検出するための強力なツールである、全エキソーム解析（WES）（Funayama M et al., Lancet, 2015, 14: 274-282、Kim HJ et al., Nature, 2013, 495: 467-473）を行った。その結果本発明者らは、CFAP43遺伝子の変異がNPHの発症と関連していることを見出した。
更に本発明者らは、CFAP43遺伝子のノックアウトマウスを作製した。そのノックアウトマウスは、ヒトNPHの症状と同様に、側脳室と第三脳室の明らかな膨張を示した。従って、哺乳動物全般において、CFAP43遺伝子の変異が、NPHの発症に関連していると結論し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕
被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合には正常圧水頭症を発症しやすく、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有さない場合には正常圧水頭症を発症し難いという基準と比較することにより、被験者の正常圧水頭症の発症しやすさを試験する方法。
〔１’〕
被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合には、正常圧水頭症を発症しやすい、若しくは発症していると診断する方法、又は該診断を補助する方法。
〔２〕
前記機能減弱型変異が機能喪失型変異である、〔１〕又は〔１’〕に記載の方法。
〔３〕
前記機能喪失型変異が、CFAP43遺伝子のエクソン35におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異である、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記被験者が、正常圧水頭症患者又はその疑いがある者である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
前記被験者が認知症を発症する、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記試料が血液、血漿、血清又は唾液である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットを含む、正常圧水頭症の発症リスクの評価用キット。
〔７’〕
CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットを含む、正常圧水頭症の診断用キット。
〔８〕
CFAP43遺伝子の特定の位置のヌクレオチドが機能減弱型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、及び該位置のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブをさらに含む、〔７〕又は〔７’〕に記載のキット。
〔９〕
前記ヌクレオチドが、CFAP43遺伝子のエクソン35のヌクレオチドである、〔８〕に記載のキット。
〔１０〕
前記ヌクレオチドが、ヒトCFAP43遺伝子のエクソン35の75番目のヌクレオチドである、〔８〕又は〔９〕に記載のキット。
〔１１〕
前記機能減弱型変異が機能喪失型変異である、〔７〕から〔１０〕のいずれかに記載のキット。
〔１２〕
CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する、正常圧水頭症のモデル哺乳動物。
〔１３〕
前記機能喪失型変異が、CFAP43遺伝子のエクソン35におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異である、〔１１〕又は〔１２〕に記載の哺乳動物。
〔１４〕
以下の工程を含む、正常圧水頭症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
（１）〔１２〕又は〔１３〕に記載の哺乳動物に被験物質を投与する工程、及び
（２）被験物質を投与しなかった対照群と比較して、正常圧水頭症の症状の進行が遅延するかあるいは症状が改善した場合に、該被験物質を正常圧水頭症の治療又は予防薬の候補物質として選別する工程。
〔１〕
被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合には正常圧水頭症を発症しやすく、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有さない場合には正常圧水頭症を発症し難いという基準と比較することにより、被験者の正常圧水頭症の発症しやすさを試験する方法。
〔１’〕
被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合には、正常圧水頭症を発症しやすい、若しくは発症していると診断する方法、又は該診断を補助する方法。
〔２〕
前記機能減弱型変異が機能喪失型変異である、〔１〕又は〔１’〕に記載の方法。
〔３〕
前記機能喪失型変異が、CFAP43遺伝子のエクソン35におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異である、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記被験者が、正常圧水頭症患者又はその疑いがある者である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕
前記被験者が認知症を発症する、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記試料が血液、血漿、血清又は唾液である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットを含む、正常圧水頭症の発症リスクの評価用キット。
〔７’〕
CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットを含む、正常圧水頭症の診断用キット。
〔８〕
CFAP43遺伝子の特定の位置のヌクレオチドが機能減弱型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、及び該位置のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブをさらに含む、〔７〕又は〔７’〕に記載のキット。
〔９〕
前記ヌクレオチドが、CFAP43遺伝子のエクソン35のヌクレオチドである、〔８〕に記載のキット。
〔１０〕
前記ヌクレオチドが、ヒトCFAP43遺伝子のエクソン35の75番目のヌクレオチドである、〔８〕又は〔９〕に記載のキット。
〔１１〕
前記機能減弱型変異が機能喪失型変異である、〔７〕から〔１０〕のいずれかに記載のキット。
〔１２〕
CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する、正常圧水頭症のモデル哺乳動物。
〔１３〕
前記機能喪失型変異が、CFAP43遺伝子のエクソン35におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異である、〔１１〕又は〔１２〕に記載の哺乳動物。
〔１４〕
以下の工程を含む、正常圧水頭症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
（１）〔１２〕又は〔１３〕に記載の哺乳動物に被験物質を投与する工程、及び
（２）被験物質を投与しなかった対照群と比較して、正常圧水頭症の症状の進行が遅延するかあるいは症状が改善した場合に、該被験物質を正常圧水頭症の治療又は予防薬の候補物質として選別する工程。
本発明によれば、被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出することにより、該被験者のNPHの発症リスクを評価することができる。また、被験者のCFAP43遺伝子の機能減弱型変異を検出することで、他の臨床検査の結果（脳のMRI検査の結果等）と併せて、あるいは、かかる臨床結果を用いることなく、NPHか否かを判断し得るため、NPHの診断に有用である。更に、認知症はNPHの主要症状であるため、CFAP43遺伝子の変異を検出することで、認知症のリスクを評価することも可能となる。従って、本発明により、NPHに伴う認知症を早期発見することができ、該認知症の予防又は進行の遅延に有用である。
１．本発明の試験方法
本発明は、被験者のCFAP43遺伝子における変異を検出することで、被験者の正常圧水頭症の発症しやすさを試験する、あるいは正常圧水頭症の発症リスクを評価する方法（以下、「本発明の試験方法」ともいう。）を提供する。具体的には、本発明の試験方法は、被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合には正常圧水頭症を発症しやすく（又は発症リスクが高く）、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有さない場合には正常圧水頭症を発症し難い（又は発症リスクが低い）という基準と比較することにより行うことができる。
本発明は、被験者のCFAP43遺伝子における変異を検出することで、被験者の正常圧水頭症の発症しやすさを試験する、あるいは正常圧水頭症の発症リスクを評価する方法（以下、「本発明の試験方法」ともいう。）を提供する。具体的には、本発明の試験方法は、被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合には正常圧水頭症を発症しやすく（又は発症リスクが高く）、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有さない場合には正常圧水頭症を発症し難い（又は発症リスクが低い）という基準と比較することにより行うことができる。
CFAP43（cilia- and flagella-associated protein 43）は、鞭毛及び繊毛の機能と形態に関連するタンパク質であり、CFAP43遺伝子の異常は精子形成不全に関連していることが知られている。ヒトの場合、CFAP43は1665アミノ酸残基からなり、4998ヌクレオチドからなる核酸によりコードされている。ヒトCFAP43のcDNAのヌクレオチド配列（GenBank Accession No. NM_025145.6）を配列番号１（配列番号１の132番目から5129番目までの領域がCDSである）として、また該CDSにコードされるCFAP43のアミノ酸配列を配列番号２として示す。非ヒト哺乳動物のCFAP43のcDNAの配列も、同様に公知である。例えば、マウスCFPA43のcDNAの配列はGenBank Accession No. NM_027559.2を参照することができ、該配列を配列番号３（配列番号３の35番目から5083番目までの領域がCDSである）として、また該CDSにコードされるCFAP43のアミノ酸配列を配列番号４として示す。また、本明細書では、特にことわらない限り、ヒトCFAP43 cDNAのヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチドの位置等を記載するが、非ヒト哺乳動物オルソログにおける対応するヌクレオチド配列やヌクレオチドの位置等も、当該記載内容に包含されるものである。
下述の実施例で示す通り、被験者のCFAP43遺伝子に生じた機能喪失型変異（即ち、ナンセンス変異又はフレームシフト変異）により、正常圧水頭症の原因となることが強く示唆された。さらに、ヒトの場合には、片方のアレルのCFAP43遺伝子のみにナンセンス変異が存在しているにも関わらず、正常圧水頭症を発症し得ることが示された。即ち、CFAP43遺伝子の変異に起因するヒトの正常圧水頭症は、CFAP43の遺伝子産物（タンパク質、RNA）の量的不足に起因するハプロ不全(haploinsufficiency)により生じる、原発性繊毛機能不全症候群（primary ciliary dyskinesia、PCD）に関連する症状の１つである蓋然性が高いことが示された。従って、機能喪失型変異のみならず、野生型の遺伝子又はタンパク質と比較して、CFAP43の機能の低下及び／又はCFAP43の遺伝子産物の発現量の低下を伴う、ミスセンス変異、スプライシング異常を伴う変異及び遺伝子調節領域（例：プロモーター、エンハンサー）の変異などの機能減弱型変異を有する被験者では、変異を有さない健常者と比較して、正常圧水頭症を発症するリスクが高くなると考えられる。本明細書において、CFAP43の機能の低下とは、繊毛運動の低下、消失若しくは異常を意味する。CFAP43のC末端ドメイン(例えば、テトラヒメナのCFAPタンパク質のアミノ酸残基1354番-1678番目の領域)が、該タンパク質の繊毛への局在に重要であることが知られている（Urbanska P. et al., Cell Mol Life Sci 2018, 75:4479-4493）。従って、テトラヒメナCFAPの上記C末端領域に相当するヒト又はその他の哺乳動物由来のCFAP43の領域に変異有し、CFAP43の繊毛への局在が低下若しくは消失した変異も、上記機能減弱型変異に包含される。なお、本明細書では、機能喪失型変異は、機能減弱型変異に包括されるものとする。
CFAP43の遺伝子産物の発現量、あるいはその局在パターンは、自体公知の方法により評価することができ、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫染色、酵素免疫測定法（例：EIA、ELISA）などによりタンパク質量を測定でき、又はタンパク質の局在を検出することができるし、リアルタイムPCR法やデジタルPCR法などにより、RNA量を測定することができる。繊毛運動の低下は、自体公知の方法により評価することができ、例えば、野生型CFAP43遺伝子を有する動物由来の繊毛と、対象の変異を有するCFAP43遺伝子を有する動物由来の繊毛を比較して、繊毛運動が低下若しくは消失している場合、又は異常な運動が認められる場合、あるいは透過電子顕微鏡などにより繊毛構造の異常（例：「8+2」構造「10+2」構造）が認められる場合に、繊毛運動が低下若しくは消失している、又は繊毛運動の異常が認められると評価することができる。
好ましい態様において、CFAP43遺伝子の機能減弱型変異は、機能喪失型変異であり得る。機能喪失型変異により、野生型CFAP43と比較して短く不完全なCFAP43が生じる。機能喪失型変異を生じる変異位置は、不完全なCFAP43が生じる限り特に限定されないが、例えば、CFAP43遺伝子のエクソン35に存在するヌクレオチドの変異（例：エクソン35の75番目のグアニン(配列番号１の4637番目のヌクレオチドに対応する)のアデニンへの変異）が挙げられる。不完全なCFAP43の遺伝子産物は、mRNAレベル及びタンパク質レベルの両方で分解を受け得ること、及び、CFAP43の繊毛への局在化はC末端ドメインが担うことから、エクソン35の75番目より5’側のヌクレオチドの変異はもとより、75番目より3’側のヌクレオチドの変異であっても、同様に機能喪失型変異となると考えられる。
本発明において「正常圧水頭症」とは、症候性水頭症の一型であり、頭蓋内圧が正常範囲（具体的には、ヒトの場合には、腰椎穿刺時の髄圧液が１８ｃｍ水柱以下）であり、かつ、歩行障害、記銘力障害（認知症）、及び尿失禁の少なくともいずれかの症状を呈する疾患を意味する。あるいは、単に第３脳室や側脳室の膨張の臨床的所見が認められる疾患も、「正常圧水頭症」に包含されるものとする。
本発明において試験対象となる「被験者」は特に限定されるものではない。被験者は正常圧水頭症が疑われる者であってもよいし、正常圧水頭症の症状を全く示さない者であってもよい。検査の時点で正常圧水頭症の症状を示さない者であっても、将来において正常圧水頭症や正常圧水頭症に起因する認知症を発症するリスクを予測できるため、正常圧水頭症の遺伝子診断の手段として本発明を利用することができる。本発明の試験方法により、正常圧水頭症を発症するリスクが高いと予測された被験者に対して、正常圧水頭症の予防措置を行うこともできる。また、下述の実施例で示す通り、ヒトだけでなく、マウスにおいてもCFAP43の変異により、正常圧水頭症を発症することが実証された。従って、更に本発明において試験対象となる「被験者」はヒトに限定されるものではなく、哺乳動物全般である。かかる哺乳動物としては、例えば、イヌ、ネコ等の愛玩動物やウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ等の家畜などが挙げられる。
本発明で用いる試料としては、被験者から採取した試料であれば特に限定されず、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、皮膚、爪、毛髪、骨髄液、口腔粘膜、臓器等が挙げられる。好ましくは、血液、血漿、血清又は唾液である。これらの試料は、自体公知の方法により得ることができ、例えば、血清や血漿は、常法に従って被験者から採血し、液性成分を分離することにより調製することができる。試料中のDNAは、該試料からゲノムDNAを抽出して得ることができ、例えば、通常の採血により被験者から採取した血液からフェノール抽出法などによりゲノムDNAを単離することができる。その際、例えば、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kitなどの市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。
CFAP43遺伝子における変異の検出は、例えば、CFAP43遺伝子や該遺伝子の調節領域の一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るプライマーセットを用いたPCRにより、前記領域を増幅させ、得られた増幅産物を、自体公知の方法により塩基配列を決定することにより、変異を検出することができる。前記プライマーセットについては、下記３．で詳細に説明する。かかる塩基配列を決定する方法としては、例えば、サンガー法や、次世代シークエンサー（NGS）を用いた方法などが挙げられる。次世代シークエンスを用いた方法は、例えば、実験医学別冊「次世代シークエンス解析スタンダード」、2014年（羊土社）等を参照することができる。このような目的に用いられるNGSとしては、イルミナ（illumina）社製の装置（例：MiSeq、HiSeq2500）、ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社製の装置（例：Ion Proton、Ion PGM）、ロッシュ ダイアグノスティックス（Roche Diagnostic）社製の装置（例：GS FLX+、GS Junior）などを挙げることができるが、これらの装置に限定されない。
NGSを用いた塩基配列決定の方法は、NGSの種類によって異なり、例えば、各社のマニュアル(例：NexteraR XT DNA Library Prep Reference Guide)に準じて実施することができる。また、得られたサンプルのシークエンシングには、好ましくはペアエンド解析が用いられる。
あるいは、CFAP43遺伝子における機能減弱型変異の有無は、当分野で公知の任意の多型解析方法によって行うことができ、例えば、PCR法を用いた方法が挙げられる。PCR法を用いた方法としては、分析対象である核酸をPCR法により増幅し、増幅産物の変異を蛍光又は発光によって検出する方法、PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))に代表されるリアルタイムPCR法、デジタルPCR法（例：droplet digital PCR（ddPCR）法、微細孔分配式デジタルPCR法等）などが挙げられる。
その他の方法として、サイクリングプローブ法、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号公報、特開2004-121232号公報など）、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）などが挙げられる。
微量な変異DNAを検出するためには、簡便性や感度の点からPCR法を用いた方法が好ましい。また、従来のリアルタイムPCRとは異なり、増幅効率を気にしなくてよく、絶対定量が可能で、高精度・高感度で処理性能にも優れた次世代PCRであるデジタルPCR（例：ddPCR）が特に好ましい。
プローブを用いた多型解析方法を行う場合、本発明の試験方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。
（１）CFAP43遺伝子の特定の位置のヌクレオチド（以下、「標的ヌクレオチド」ともいう。）と特異的にハイブリダイズするプローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
（３）工程（２）で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
（４）前記（３）の測定結果に基づき、標的ヌクレオチドにおける機能減弱型変異を検出する工程
（１）CFAP43遺伝子の特定の位置のヌクレオチド（以下、「標的ヌクレオチド」ともいう。）と特異的にハイブリダイズするプローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
（３）工程（２）で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
（４）前記（３）の測定結果に基づき、標的ヌクレオチドにおける機能減弱型変異を検出する工程
（１）プローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
前記工程（１）に用いる標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットについては、下記３．で詳細に説明する。前記工程（１）において、該プローブセットと、DNAサンプルとを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、同一溶液中にプローブセットとDNAとを加えることで行うことができる。また、上記溶液中には、通常PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼが含まれる。
前記工程（１）に用いる標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットについては、下記３．で詳細に説明する。前記工程（１）において、該プローブセットと、DNAサンプルとを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、同一溶液中にプローブセットとDNAとを加えることで行うことができる。また、上記溶液中には、通常PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼが含まれる。
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
工程（２）で用いるプライマーセットについては、下記３．で詳細に説明する。前記工程（２）において、標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する方法は特に限定されないが、デジタルPCR法により増幅することが好ましい。デジタルPCRは、例えば、次の手順により行われる。デジタルPCR装置に、プローブセット、DNAサンプル、PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼを含む反応溶液をセットする。ここで各反応液成分の混合比率は、自体公知の範囲で適宜選択し、最適化することができ、使用するプライマーセットやプローブセット等に応じて適宜変更することができる。
工程（２）で用いるプライマーセットについては、下記３．で詳細に説明する。前記工程（２）において、標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する方法は特に限定されないが、デジタルPCR法により増幅することが好ましい。デジタルPCRは、例えば、次の手順により行われる。デジタルPCR装置に、プローブセット、DNAサンプル、PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼを含む反応溶液をセットする。ここで各反応液成分の混合比率は、自体公知の範囲で適宜選択し、最適化することができ、使用するプライマーセットやプローブセット等に応じて適宜変更することができる。
デジタルPCR装置により、反応溶液はチップに設けられた数千から数万という多数の反応ウェルに分配される。反応ウェルは、例えば、開口の大きさが数十μｍである微小なウェルやナノリットルサイズのドロップレットである。反応ミックスをチップに添加すると、チップ上の一部の反応ウェルには標的ヌクレオチドを含む領域が好ましくは１コピー程度含まれ、その他の反応ウェルには該アレルが含まれない状態となるよう、反応ミックスが反応ウェルに分配される。複数の反応ウェルに分配された反応ミックス内でPCRを実施すると、目的の変異が存在する反応ウェルでは、該標的ヌクレオチドを含む領域が増幅され、その際に、DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により、標的ヌクレオチドに結合したプローブが切断され蛍光色素が乖離し、蛍光を発する。
（３）PCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
前記工程（３）における蛍光強度を測定は、例えば、自体公知の蛍光リーダーを用いて行うことができる。前記PCRをデジタルPCRで行った場合には、例えば、デジタルPCR装置のリーダーにより、蛍光が検出された反応ウェルの数を計測することで、蛍光強度が測定できる。蛍光色素が異なる複数のプローブを用いた場合には、各蛍光に由来する蛍光を検出することで、複数の蛍光強度を一度に測定することができる。
前記工程（３）における蛍光強度を測定は、例えば、自体公知の蛍光リーダーを用いて行うことができる。前記PCRをデジタルPCRで行った場合には、例えば、デジタルPCR装置のリーダーにより、蛍光が検出された反応ウェルの数を計測することで、蛍光強度が測定できる。蛍光色素が異なる複数のプローブを用いた場合には、各蛍光に由来する蛍光を検出することで、複数の蛍光強度を一度に測定することができる。
（４）標的ヌクレオチドにおける機能減弱型変異を検出する工程
前記工程（４）において、前記工程（３）の測定結果に基づき、CFAP43遺伝子の標的ヌクレオチドにおける機能減弱型変異を検出することができる。即ち、前記測定結果から、各遺伝子について、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数を求め、変異DNAのコピー数を、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数の和で除すことにより、変異のアレル頻度を算出することができる。
前記工程（４）において、前記工程（３）の測定結果に基づき、CFAP43遺伝子の標的ヌクレオチドにおける機能減弱型変異を検出することができる。即ち、前記測定結果から、各遺伝子について、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数を求め、変異DNAのコピー数を、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数の和で除すことにより、変異のアレル頻度を算出することができる。
２．本発明の診断方法
正常圧水頭症の明確な判断基準は存在しないが、正常圧水頭症の確定診断を行うためには、通常、以下の検査を行う。歩行障害、記銘力障害、及び尿失禁の少なくともいずれかの症状が認められる被験者に対して、画像検査（CTスキャン及び／又はMRI）を行い、この検査により正常圧水頭症の重要な所見（例：側脳室、第三脳室やシルビウス溝の膨張等）が認められた場合に、脳脊髄液排除試験を行う。脳脊髄液排除試験は、まず検査前に見当識障害、歩行障害の程度を評価し、次に脳脊髄液を自然滴下で排除し、髄液を排除した後、見当識障害の程度を検査前に行った同様のテストを行い、改善が得られた場合、正常圧水頭症と確定診断される。このように、正常圧水頭症の確定診断には、多大な労力が必要となる。上述の通り、CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する被験者、特に機能喪失型変異を有する被験者では、変異を有さない健常者と比較して、正常圧水頭症を発症するリスクが高くなる。従って、被験者のCFAP43遺伝子における変異の検出と、他の臨床検査の結果（上記の症状、画像検査や脳髄液排除試験の結果等）の少なくともいずれかと併せて、あるいはかかる臨床検査の結果を用いることなく、正常圧水頭症か否かを診断し得る。例えば、上記記銘力障害などの症状を呈する被験者において、CFAP43遺伝子の変異を検出し、CFAP43遺伝子の機能減弱型変異が認められた場合に、該被験者は正常圧水頭症を発症している、あるいは正常圧水頭症を発症している蓋然性が高いと診断され得る。さらに、上記画像検査の結果等を組み合わせて、診断結果の精度を向上させることもできる。
正常圧水頭症の明確な判断基準は存在しないが、正常圧水頭症の確定診断を行うためには、通常、以下の検査を行う。歩行障害、記銘力障害、及び尿失禁の少なくともいずれかの症状が認められる被験者に対して、画像検査（CTスキャン及び／又はMRI）を行い、この検査により正常圧水頭症の重要な所見（例：側脳室、第三脳室やシルビウス溝の膨張等）が認められた場合に、脳脊髄液排除試験を行う。脳脊髄液排除試験は、まず検査前に見当識障害、歩行障害の程度を評価し、次に脳脊髄液を自然滴下で排除し、髄液を排除した後、見当識障害の程度を検査前に行った同様のテストを行い、改善が得られた場合、正常圧水頭症と確定診断される。このように、正常圧水頭症の確定診断には、多大な労力が必要となる。上述の通り、CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する被験者、特に機能喪失型変異を有する被験者では、変異を有さない健常者と比較して、正常圧水頭症を発症するリスクが高くなる。従って、被験者のCFAP43遺伝子における変異の検出と、他の臨床検査の結果（上記の症状、画像検査や脳髄液排除試験の結果等）の少なくともいずれかと併せて、あるいはかかる臨床検査の結果を用いることなく、正常圧水頭症か否かを診断し得る。例えば、上記記銘力障害などの症状を呈する被験者において、CFAP43遺伝子の変異を検出し、CFAP43遺伝子の機能減弱型変異が認められた場合に、該被験者は正常圧水頭症を発症している、あるいは正常圧水頭症を発症している蓋然性が高いと診断され得る。さらに、上記画像検査の結果等を組み合わせて、診断結果の精度を向上させることもできる。
従って、別の態様において、本発明は、被験者が正常圧水頭症を発症している、若しく発症している蓋然性が高いと診断する方法、又は該診断の補助をする方法（これらを纏めて「本発明の診断方法」と称することがある。）を提供する。具体的には、本発明の診断方法は、被験者由来の試料中のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能減弱型変異の有無を検出し、当該CFAP43遺伝子に機能減弱型変異を有する場合に、必要に応じて他の臨床検査の結果と併せて、正常圧水頭症に発症している又は発症している蓋然性が高いと診断又は該診断の補助を行うことができる。
本発明の診断方法によって、正常圧水頭症を発症している、又は発症している蓋然性が高いと診断された場合、該被験者には、正常圧水頭症の治療を行うことが好ましい。正常圧水頭症に対する有効な内科的治療はないため、外科的治療を行うことが通常必要となる。かかる外科的治療としては、例えば、髄液シャトン術（例：VP（脳室-腹腔）シャント術、LP（腰椎-腹腔）シャント術、VA（脳室-心房）シャント術）などが挙げられる。以上の観点から、本発明はまた、本発明の診断方法を実施すること、その結果、正常圧水頭症を発症している、又は発症している蓋然性が高いと診断された被験者に対して、外科的治療を行うことを含む、正常圧水頭症の診断及び治療方法を提供する。
更に本発明は、被験者から採取した試料由来のDNAにおけるCFAP43遺伝子の機能喪失型変異を検出する工程を含む、正常圧水頭症のリスクを評価するためのデータを収集する方法も提供する。データの収集は、自体公知の方法により行うことができる。
３．正常圧水頭症の診断用キット
本発明は、正常圧水頭症の発症リスクの評価用キット又は正常圧水頭症の診断用キット（これらを纏めて「本発明のキット」と称することがある。）を提供する。当該キットは、上記の本発明の試験方法又は本発明の評価方法を実施するのに適したキットであり、CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットを含む。前記CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットは、CFAP43遺伝子や該遺伝子の調節領域の一部（例えば、CFAP43のエクソン35の領域など）又は全部の領域を特異的に増幅し得る、約15～約30塩基のフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるセットである。かかるプライマーは、自体公知の方法により設計することができる。例えば、CFAP43遺伝子の配列情報に基づき、PCRプライマー設計ツール（例：Primer3等）を用いて設計することができ、具体例として、5’-GGGTAGGGAGAATTTACC-3’（配列番号５）からなるフォワードプライマー、及び5’-AATCATATTATATGGATATC-3’（配列番号６）からなるリバースプライマーからなるプライマーセットを挙げることができるが、これに限定されない。本明細書において、「CFAP43遺伝子の標的領域」には、CFAP43遺伝子の領域及び該遺伝子の調節領域が包含される。
本発明は、正常圧水頭症の発症リスクの評価用キット又は正常圧水頭症の診断用キット（これらを纏めて「本発明のキット」と称することがある。）を提供する。当該キットは、上記の本発明の試験方法又は本発明の評価方法を実施するのに適したキットであり、CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットを含む。前記CFAP43遺伝子の標的領域を増幅し得るPCRプライマーセットは、CFAP43遺伝子や該遺伝子の調節領域の一部（例えば、CFAP43のエクソン35の領域など）又は全部の領域を特異的に増幅し得る、約15～約30塩基のフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるセットである。かかるプライマーは、自体公知の方法により設計することができる。例えば、CFAP43遺伝子の配列情報に基づき、PCRプライマー設計ツール（例：Primer3等）を用いて設計することができ、具体例として、5’-GGGTAGGGAGAATTTACC-3’（配列番号５）からなるフォワードプライマー、及び5’-AATCATATTATATGGATATC-3’（配列番号６）からなるリバースプライマーからなるプライマーセットを挙げることができるが、これに限定されない。本明細書において、「CFAP43遺伝子の標的領域」には、CFAP43遺伝子の領域及び該遺伝子の調節領域が包含される。
上記のPCRプライマーセットの各プライマーは核酸からなるが、該核酸は一本鎖核酸であることが好ましい。上記核酸としては、例えば、DNA、RNA及びRNAとDNAが混合した重合体が挙げられるが、RNAを含む場合には、その塩基配列はDNA配列における「T（チミン）」を「U（ウラシル）」に読み替えるものとする。上記プライマーは、当業者に周知の任意の化学合成法により作製することができ、例えば、ヌクレアーゼ等の酵素を用いて作製することもできるし、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて作製することもできる。これらのプライマーは、構成する核酸にさらに任意の修飾が施されたものでもよい。例えば上記プライマーは、その5'末端又は3'末端に当該プライマーの検出や増幅を容易にするための標識物質（例えば、蛍光分子、色素分子、放射性同位元素、ジゴキシゲニンやビオチン等の有機化合物など）及び／又は付加配列（LAMP法で用いるループプライマー部分等）を含んでいてもよい。上記プライマーは、5'末端でリン酸化又はアミン化されていてもよい。また、上記プライマーは、天然塩基のみを含んでもよいし、修飾塩基を含んでもよい。修飾塩基としては、デオキシイノシン、デオキシウラシル、S化塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記プライマーは、ホスホロチオエート結合やホスホロアミデート結合などを含む任意の誘導体オリゴヌクレオチドを含むものであってもよいし、ペプチド核酸結合を含むペプチド-核酸（PNA）を含んでいてもよい。
これらのプライマーは、乾燥した状態又はアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水又は適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。
発明のキットには、CFAP43遺伝子の変異を検出するためのプローブセットが含まれていてもよい。かかるプローブセットは、（a）標的ヌクレオチドが機能減弱型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、及び（ｂ）該位置のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブを含む。CFAP43遺伝子の標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットとしては、CFAP43遺伝子の標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列とハイブリダイズする約5～約30塩基、好ましくは約7～約20塩基の連続したヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。
上記１．でも述べたように、本発明のキットで検出する標的ヌクレオチドは、CFAP43遺伝子の特定の位置のヌクレオチドに限定されるものではないが、本発明の一態様において、該キットで検出する標的ヌクレオチドはエクソン35に存在し、より具体的には、例えば、エクソン35の75番目のヌクレオチドであり得る。
プローブの配列は、標的配列により適宜設計することができる。例えば、上述のエクソン35の75番目のヌクレオチドの変異を検出するための５又は７ヌクレオチドからなる配列としては、表１のボックスで囲まれた配列、及びその配列に相補的な配列が挙げられる。表中、下線を付したAは変異ヌクレオチドを示し、該変異によりTrpをコードするコドン(TGG)が終止コドン(TGA)に変わる。また、前記プローブの対となる、対応する位置のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブとしては、表２のボックスで囲まれた配列、及びその配列に相補的な配列が挙げられる。従って、一態様において、プローブセットとして、表１に記載のいずれかの配列若しくは該配列に相補的な配列を含む（若しくは、該配列からなる）プローブ、及び表２に記載のいずれかの配列又は該配列に相補的な配列を含む（若しくは、該配列からなる）プローブからなるプローブセットが挙げられるが、該プローブセットはあくまで一例であり、標的配列やその長さ等を考慮して、適宜プローブを設計することができる。
各プローブには標識物質を結合させることができる。該標識物質は、例えば、蛍光色素等が挙げられる。かかる蛍光色素は、種々のものが市販されており、例えば、6-FAM（フルオレセイン）、HEX、TE、Quasar 670、Quasar 570、Quasar 705、Pulsar 650、TET、HEX、VIC、JOE、CAL Fluor Orenge、CAL Fluor Gold、CAL Fluor Red、Texas Red、Cy、Cy5などが挙げられる。正常型プローブに結合される蛍光色素と、変異型プローブに結合される蛍光色素とは、異なるものであることが好ましい。この構成をとることにより、正常な標的ヌクレオチドを有するCFAP43遺伝子断片には正常型プローブが、機能喪失型変異を生じる標的ヌクレオチドを有するCFAP43遺伝子断片には変異型プローブがそれぞれハイブリダイズすることで、各プローブの蛍光色素に由来する2種類の蛍光が検出される。
各プローブは、さらに蛍光物質からの蛍光を消光できるクエンチャーが結合されていることが好ましい。クエンチャーとしては、蛍光色素からの蛍光を消光できるものであれば特に制限されず、蛍光色素であっても非蛍光色素であってもよいが、検出の精度の観点から非蛍光色素が好ましい場合があり得る。具体的なクエンチャーとしては、例えば、6-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、Eclipse Dark Quencher、Iowa black FQ（IBFQ）、minor groove binder（MGB）、非蛍光クエンチャー（NFQ）などが挙げられる。
プローブの構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。前記ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。リボヌクレオチドは、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）及びウラシル（U）（チミン（T）に置き換えることもできる）を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（dA）、グアニン（dG）、シトシン（dC）及びチミン（dT）（ウラシル（dU）に置き換えることもできる）を有する。
本発明のキットは、前記のプライマーセットと、必要に応じて、上記の正常型プローブ及び上記の変異型プローブからなるプローブセットとに加えて、上記の本発明の検出方法におけるPCR反応に使用される試薬類、例えば、DNA抽出用試薬、DNAポリメラーゼ、dNTPs、反応緩衝液、PCRの陽性コントロールとなる標的領域を含む核酸等、さらには、容器、器具、説明書などを含むことができる。また、上記プライマーセット又はプローブセットは、各プライマー又は各プローブを共存状態で保存することにより、反応に悪影響を及ぼさない限り、それらを混合したプローブセット及び／又はプライマーセットとして、キットに含めることができる。
４．疾患モデル及びその用途
下述の実施例で示す通り、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する哺乳動物は、ヒトの正常圧水頭症と類似した、第３脳室や側脳室の膨張の臨床的所見が認められ、更には上皮繊毛の構造に異常をきたす（即ち、正常圧水頭症を発症する）。よって、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する哺乳動物は、正常水頭症のモデルとして用いることができる。即ち、本発明は、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する、正常圧水頭症のモデル哺乳動物（以下、「本発明の正常圧水頭症モデル動物」ともいう。）を提供する。
下述の実施例で示す通り、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する哺乳動物は、ヒトの正常圧水頭症と類似した、第３脳室や側脳室の膨張の臨床的所見が認められ、更には上皮繊毛の構造に異常をきたす（即ち、正常圧水頭症を発症する）。よって、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する哺乳動物は、正常水頭症のモデルとして用いることができる。即ち、本発明は、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異を有する、正常圧水頭症のモデル哺乳動物（以下、「本発明の正常圧水頭症モデル動物」ともいう。）を提供する。
機能喪失型変異を生じるCFAP43遺伝子の変異位置は、不完全なCFAP43が生じる限り特に限定されないが、例えば、CFAP43遺伝子のエクソン35に存在するヌクレオチドの変異（例：マウスの場合、エクソン35の111番目(配列番号３の4627番目のヌクレオチドに対応する)から数ヌクレオチド又は数十ヌクレオチドが欠失したものなど）が挙げられる。不完全なCFAP43の遺伝子産物は、mRNAレベル及びタンパク質レベルの両方で分解を受け得ること、及びCFAP43の繊毛への局在化はC末端ドメインが担うことから、マウスCFAP43遺伝子のエクソン35の111番目より5’側のヌクレオチドの変異はもとより、111番目より3’側のヌクレオチドの変異であっても、同様に機能喪失型変異となると考えられる。一態様において、本発明の正常圧水頭症モデル動物は、CFAP43遺伝子のエクソン21及び22に変異を有さない。また、CFAP43の機能喪失型変異は、片方のアレルのみに存在してもよいし、両方のアレルに存在してもよいが、好ましくは、両方のアレルに存在する。
本発明の正常圧水頭症モデル動物の元となる動物種としては、CFAP43遺伝子に変異を導入することができるヒト以外の哺乳動物であれば特に制限されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類動物、アカゲザル、カニクイザル、ニホンザル、チンパンジーなどの霊長類動物、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどが挙げられる。取り扱いの容易さの観点からは、げっ歯類動物が好ましく、中でもマウスがより好ましい。
本発明の動物モデルの作製方法としては、以下の方法が挙げられる。例えば、CRISPR-Cas9をコードするRNAと、CFAP43遺伝子を標的とするガイドRNAを受精卵に注入し、非相同末端結合に際して生じる欠失、挿入又は置換によりCFAP43遺伝子に変異を導入することができる。また、受精卵に、上記RNAに加えて、予め変異を導入したドナーDNAを導入し、該ドナーDNAとゲノムDNAとの間での相同組み換えにより、CFAP43遺伝子に変異を導入することができる。このようにして得られた受精卵を偽妊娠したメス動物の子宮に移植することにより、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異が導入した動物モデルを得ることができる。あるいは、上記ドナーDNAをES細胞に導入し、該ドナーDNAとゲノムDNAとの間での相同組み換えにより、CFAP43遺伝子に変異を導入されたES細胞を作製する。該ES細をマウスの胚盤胞に注入してキメラ動物を作製し、該キメラ動物を野生型動物と交配すること（必要により、さらに子孫同士を交配すること）で、CFAP43遺伝子に機能喪失型変異が導入した動物モデルが作製される。
以上のようにして作製された本発明の正常圧水頭症モデル動物は、例えば、該正常圧水頭症の治療及び／又は予防薬のスクリーニングに用いることができる。上述の通り、正常圧水頭症の治療又は予防薬は存在していないため、該治療及び／又は予防薬のスクリーニングに用いることができる点で、本発明の正常圧水頭症モデル動物は非常に有用である。即ち、本発明は、正常圧水頭症の治療又は予防薬のスクリーニング方法であって、
（１）本発明の正常圧水頭症モデル動物に被験物質を投与する工程、及び
（２）被験物質を投与しなかった対照群と比較して、正常圧水頭症の症状の進行が遅延するかあるいは症状が改善した場合に、該被験物質を正常圧水頭症の治療又は予防薬の候補物質として選別する工程を含む、方法を提供する。
（１）本発明の正常圧水頭症モデル動物に被験物質を投与する工程、及び
（２）被験物質を投与しなかった対照群と比較して、正常圧水頭症の症状の進行が遅延するかあるいは症状が改善した場合に、該被験物質を正常圧水頭症の治療又は予防薬の候補物質として選別する工程を含む、方法を提供する。
工程（１）における動物への被験物質の投与は、経口的に又は非経口的（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入（例：脳室内投与）、腹腔内投与など）に行うことが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。被験物質は、常套手段に従って医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造してもよい。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液などが挙げられる。
非経口的な投与に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
工程（２）において、「被験物質を投与していない」には、例えば、被験物質を製剤の形態で投与する場合には、該被験物質以外は同一成分を含む製剤を投与すること、該被験物質とは異なる、正常圧水頭症の治療又は予防効果のないことが既知の物質を含む製剤を投与すること、あるいはこれらの剤のいずれも投与しないことなどが包含される。また、工程（２）で対照として用いる被検物質を投与していないモデル動物としては、同様の方法により作製した別個のモデル動物を使用してもよいし、被検物質の投与前の同一のモデル動物を使用してもよい。工程（２）における比較の結果、正常圧水頭症の症状の進行が遅延するか、あるいは症状が改善した被験物質を、正常圧水頭症の治療又は予防薬の候補物質として選別することができる。正常圧水頭症の症状としては、歩行障害、記銘力障害及び尿失禁が挙げられる。かかる症状の進行の遅延、又は症状の改善の評価は、行動実験（例：Y字迷路、新奇物体探索試験等）などの動物を用いた実験に基づき行ってもよく、また正常圧水頭症の重要な所見（例：側脳室、第三脳室やシルビウス溝の膨張等）に基づき行ってもよい。
上記スクリーニングに用いる被験物質としては、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。
上記被験物質はまた、（1）生物学的ライブラリー、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam（1997）Anticancer Drug Des. 12:145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13; Erb et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-6; Zuckermann et al.（1994）J. Med. Chem. 37:2678-85; Cho et al.（1993）Science 261:1303-5; Carell et al.（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al.（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; Gallop et al.（1994）J. Med. Chem. 37:1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten（1992）Bio/Techniques 13:412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam（1991）Nature 354:82-4）、チップ（Fodor（1993）Nature 364:555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al.（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith（1990）Science 249:386-90; Devlin（1990）Science 249:404-6; Cwirla et al.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-82; Felici（1991）J. Mol. Biol. 222:301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
また、上述の通り、本発明の動物モデルは正常圧水頭症を発症するため、正常圧水頭症の発症メカニズムや、該疾患の症状の進展状況などの研究に用いることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：正常圧水頭症患者の家系における遺伝子変異の解析
１．本発明で解析を行った正常圧水頭症の家系
本発明の端緒となったのは55歳の女性の正常圧水頭症（NPH）患者である。その患者の家系には複数のNPH患者が存在しており、その家系図を図１Ａに示す。図１Ａにおいて四角のシンボルは女性であり、丸のシンボルは男性であり、黒色のシンボルはNPHと診断された被験者（I-7、II-1、II-4、II-7）である。斜線を有するシンボルは、本発明が行われた時点で死亡していた被験者である。
１．本発明で解析を行った正常圧水頭症の家系
本発明の端緒となったのは55歳の女性の正常圧水頭症（NPH）患者である。その患者の家系には複数のNPH患者が存在しており、その家系図を図１Ａに示す。図１Ａにおいて四角のシンボルは女性であり、丸のシンボルは男性であり、黒色のシンボルはNPHと診断された被験者（I-7、II-1、II-4、II-7）である。斜線を有するシンボルは、本発明が行われた時点で死亡していた被験者である。
上記被験者（図１のII-1）は主要症状である歩行障害、認知症、及び尿失禁を示し、NPHであると診断された。II-1の被験者の脳のMRIは側脳室、第三脳室とシルビウス溝の膨張と、高位円蓋部くも膜下腔の狭小化（high convexity tightness）を示した。図１ＣはII-1の被験者の脳のコロナルMRIの画像であり、図１ＤはII-1の被験者の脳のサジタルMRIの画像であり、図１Ｅの左から１番目はII-1の被験者の脳のアキシャルMRIの画像である。図１Ｃ、Ｄ、Ｅにおいて矢印は病変が認められる部位を示している。II-1の患者は再発性の気道感染症と慢性副鼻腔炎も有していたが、気管支拡張症と内蔵逆位は示さなかった。この被験者は肺炎で60歳で死亡した。
II-1の被験者の兄弟の中の２人（図１ＡのII-4とII-7）もNPHの主要症状を示した。II-7の患者は44歳で歩行障害、尿失禁、及び認知症を呈し始めた。II-7の被験者の脳のMRIも、側脳室、第三脳室とシルビウス溝の膨張と、高位円蓋部くも膜下腔の狭小化（high convexity tightness）を示し、再発性の気道感染症と慢性副鼻腔炎も有し、NPHであると診断された。図１Ｅの左から２番目はII-7の脳のアキシャルMRIであり、矢印は病変が認められる部位を示している。それらの被験者の母親（図１ＡのI-7）も50歳で水頭症を発症し62歳で死亡した。本家系のNPHを発症している被験者のいずれも、頭部外傷、脳内出血、又は髄膜炎を含む、二次性正常圧水頭症を引き起こす病歴は有していなかった。この家系のNPHを発症している被験者（II-1、II-4、II-7）は結婚しなかったために、不妊に関する情報は得られなかった。他の兄弟の被験者（II-2、II-3、II-5、II-6、及びII-8）はNPHと慢性感染症の症状を示さなかった。図１Ｅの左から３番目と４番目は、NPHを発症していないII-2とII-6の脳のアキシャルMRIの画像である。
２．DNA抽出のための試料
全エキソームシークエンシング（WES）とサンガーシ-クエンシングのために、この家系の５人（II-1、II-2、II-6、II-7、II-8：２人のNPHを発症している被験者と３人のNPHを発症していない被験者）を採用した。各被験者から全10mLの末梢血を採取し、QIAamp DNA Midiキット（Qiagen社）を用いて血液リンパ球からゲノムDNAを抽出した。
全エキソームシークエンシング（WES）とサンガーシ-クエンシングのために、この家系の５人（II-1、II-2、II-6、II-7、II-8：２人のNPHを発症している被験者と３人のNPHを発症していない被験者）を採用した。各被験者から全10mLの末梢血を採取し、QIAamp DNA Midiキット（Qiagen社）を用いて血液リンパ球からゲノムDNAを抽出した。
３．全エキソームシークエンシング
この家系の３人の被験者（II-１、II-6、II-8）について、SureSelect Human All Exon V4+UTRsキット（Agilent Technologies社）を用いて、全エキソームシークエンシング（WES）を行った。5500 SOLiD system（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、超並列シークエンシング（massively pararrel sequensing）も行った。
この家系の３人の被験者（II-１、II-6、II-8）について、SureSelect Human All Exon V4+UTRsキット（Agilent Technologies社）を用いて、全エキソームシークエンシング（WES）を行った。5500 SOLiD system（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、超並列シークエンシング（massively pararrel sequensing）も行った。
４．病因となる変異の選択
WESを行った結果、NPHを発症している被験者のみに見られるバリアントを72個同定した。WESのデータからこの家系の病因となる置換を検出するために、下記の基準に該当する有害なバリアントを病因の候補遺伝子とした。
（１）UCSCゲノムブラウザーからダウンロードしたGENCODEベーシックバージョン19において、ストップゲイン変異、ストップロス変異、非表現突然変異、又はスプライス部位変異をもたらすバリアント
（２）以下のデータベースにおいてバリアント遺伝子座でのオルタナティブアレルの頻度が0.5％以下であるもの
・2014年10月に発表された全人口に関する1000ゲノムプロジェクトのデータ
・NIH国立心肺血液研究所の6515のエキソームデータ（evs.gs.washington.edu/EVS）
・エキソーム・アグリゲーション・コンソーシアム（ExAC）のエキソームデータ
・ヒトゲノミック・バリエーションデータベース（HGVD）の日本で採取された1208個体のエキソームデータ
・2049人の健康な被験者の全ゲノムシークエンシングから採取されたSNVアレル頻度（2KJPN）(ijgvd.megabank.tohoku.ac.jp)
（３）UCSCセグメント重複領域に含まれない変異
（４）機能アノテーションプログラム（Polyhen_2, SIFT, PROVEN又はMutation Taster）により有害であると規定された稀なSNV
この基準で選択した後に、候補として13の遺伝子座が残った。
WESを行った結果、NPHを発症している被験者のみに見られるバリアントを72個同定した。WESのデータからこの家系の病因となる置換を検出するために、下記の基準に該当する有害なバリアントを病因の候補遺伝子とした。
（１）UCSCゲノムブラウザーからダウンロードしたGENCODEベーシックバージョン19において、ストップゲイン変異、ストップロス変異、非表現突然変異、又はスプライス部位変異をもたらすバリアント
（２）以下のデータベースにおいてバリアント遺伝子座でのオルタナティブアレルの頻度が0.5％以下であるもの
・2014年10月に発表された全人口に関する1000ゲノムプロジェクトのデータ
・NIH国立心肺血液研究所の6515のエキソームデータ（evs.gs.washington.edu/EVS）
・エキソーム・アグリゲーション・コンソーシアム（ExAC）のエキソームデータ
・ヒトゲノミック・バリエーションデータベース（HGVD）の日本で採取された1208個体のエキソームデータ
・2049人の健康な被験者の全ゲノムシークエンシングから採取されたSNVアレル頻度（2KJPN）(ijgvd.megabank.tohoku.ac.jp)
（３）UCSCセグメント重複領域に含まれない変異
（４）機能アノテーションプログラム（Polyhen_2, SIFT, PROVEN又はMutation Taster）により有害であると規定された稀なSNV
この基準で選択した後に、候補として13の遺伝子座が残った。
５．サンガーシークエンシング
５人の被験者（II-1、II-2、II-6、II-7、II-8）において、13の候補遺伝子座のサンガーシークエンシングを行った。全てのプライマーはPrimer3を用いて設計した。先に述べた配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるプライマーは、ここで設計されたプライマーの１つである。KOD FX Neoポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて20μL反応液中のPCRで、ゲノムDNA（5ng）を増幅した。BigDye Terminator Cycle Sequencingキットv3.1（Applied Biosystems社）を用いて、メーカーの説明書に従い、シークエンス反応を行った。CleanSEQ（Agen Court社）を用いて洗浄した後に、産物をABI Genetic Analyzer 3130（Applied Biosystems社）上で分離し、4Peaksソフロウェア（nucleobytes.com/4peaks/）を用いて、電気流動図を視覚的に評価した。
５人の被験者（II-1、II-2、II-6、II-7、II-8）において、13の候補遺伝子座のサンガーシークエンシングを行った。全てのプライマーはPrimer3を用いて設計した。先に述べた配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるプライマーと、配列番号６で示されるヌクレオチド配列からなるプライマーは、ここで設計されたプライマーの１つである。KOD FX Neoポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて20μL反応液中のPCRで、ゲノムDNA（5ng）を増幅した。BigDye Terminator Cycle Sequencingキットv3.1（Applied Biosystems社）を用いて、メーカーの説明書に従い、シークエンス反応を行った。CleanSEQ（Agen Court社）を用いて洗浄した後に、産物をABI Genetic Analyzer 3130（Applied Biosystems社）上で分離し、4Peaksソフロウェア（nucleobytes.com/4peaks/）を用いて、電気流動図を視覚的に評価した。
６．病因となる変異の同定
サンガーシークエンシングを行った後に、疾患を呈する被験者から、１つのバリアント（GRIP1の中のchr12:66838468T>C）と、１つのナンセンス変異（CFAF43中のchr10:105893468C>T）を見い出した。GRIP1（glutamate receptpr-interacting protein 1）のホモ接合性変異は、フレイザー症候群の原因遺伝子であると既に報告されていた。この家系のNPHを有する被験者はいずれもフレイザー症候群の兆候を示さないので、DRIP1は原因候補から除外した。一方CFAP43（cilia- and flagella-associated protein 43）は、繊毛の複数の形態学的異常を伴う男性不妊の原因となる遺伝子であると報告されていた。再発性の感染症と水頭症は原発性繊毛機能不全症候症（primary cilia dyskinesia：PCD）において頻繁に観察されているので、この家系のNPHを有する被験者における繊毛の機能不全が病因の背後にある可能性が高いと考えられた。この遺伝子のナンセンス変異はそのタンパク質の切断を引き起こすために、CFAP43はPCDの病因に関連していることが強く示唆された。
サンガーシークエンシングを行った後に、疾患を呈する被験者から、１つのバリアント（GRIP1の中のchr12:66838468T>C）と、１つのナンセンス変異（CFAF43中のchr10:105893468C>T）を見い出した。GRIP1（glutamate receptpr-interacting protein 1）のホモ接合性変異は、フレイザー症候群の原因遺伝子であると既に報告されていた。この家系のNPHを有する被験者はいずれもフレイザー症候群の兆候を示さないので、DRIP1は原因候補から除外した。一方CFAP43（cilia- and flagella-associated protein 43）は、繊毛の複数の形態学的異常を伴う男性不妊の原因となる遺伝子であると報告されていた。再発性の感染症と水頭症は原発性繊毛機能不全症候症（primary cilia dyskinesia：PCD）において頻繁に観察されているので、この家系のNPHを有する被験者における繊毛の機能不全が病因の背後にある可能性が高いと考えられた。この遺伝子のナンセンス変異はそのタンパク質の切断を引き起こすために、CFAP43はPCDの病因に関連していることが強く示唆された。
図１ＢはNPHを発症しているII-1とII-7（左から１番目と２番目）において、CFAP43遺伝子中に見いだされたナンセンス変異（hg19上のchr10:105893468C>T、ENST00000357060.3中のW1502Xの変異）を示す。なお、NPHを発症していないII-2とII-6（図１Ｂの左から３番目と４番目）ではそのような変異は見い出されなかった。図２ＡはCFAP43遺伝子のエクソン35における変異部位を示している。その変異部位は多くの種の間で保存されているSMC_N（N-terminus of structural maintenance of chromosames proteins）の中に位置している。
７．NPHを発症している被験者の繊毛の微細構造解析
NPHを発症している被験者の繊毛の超微細構造を確認するために、透過電子顕微鏡（TEM）により、II-1の被験者の鼻粘膜の繊毛の微細構造を解析した（図２Ｂ）。その結果多くの異常な複合繊毛が見出された。上記で述べた遺伝学的知見とTEMの観察を考慮すると、CFAP43のナンセンス変異がこの家系のNPHの病因に関連していることが強く示唆された。
NPHを発症している被験者の繊毛の超微細構造を確認するために、透過電子顕微鏡（TEM）により、II-1の被験者の鼻粘膜の繊毛の微細構造を解析した（図２Ｂ）。その結果多くの異常な複合繊毛が見出された。上記で述べた遺伝学的知見とTEMの観察を考慮すると、CFAP43のナンセンス変異がこの家系のNPHの病因に関連していることが強く示唆された。
実施例２：CFAP43ノックアウトマウスの作製とその特性解析
１．CRISPR-Cas9遺伝子編集システムを用いたノックアウトマウスの作製
実施例１の家系の変異部位に相当するマウスにおけるCfap43遺伝子のオルソログのエクソン35中の領域にガイドRNAを設計し、マウスCfap43遺伝子をノックアウトした。ATUM gRNA設計ツール（atum.bio/eCommerce/cas9/input）を用いて、シングルガイドRNAを設計した(5’-GATGGAGGACCTAAACCAGA-3’：配列番号９)。シングルガイドRNA、crRNA、及びtracrRNA（FASMAC社）を、顕微注入システムを用いて野生型受精卵に注入した。RNAを注入した後に、受精卵を胞胚の段階までインビトロで培養し、偽妊娠したレシピエントのメスの子宮に移植した。マウスの遺伝子型を確認するためにマウス由来のKOD FXネオポリメラーゼを用いてPCR増幅を行い、配列解析のために、産物をTベクター（タカラバイオ社）中にクローン化した。PCRのプライマーは、forwardが5’-GGGAAATAAGAAAAGAGTCATGGA-3’（配列番号１０）であり、reverseが5’-CACATGCTTTATCCAGGAGGA-3’（配列番号１１）であった。
１．CRISPR-Cas9遺伝子編集システムを用いたノックアウトマウスの作製
実施例１の家系の変異部位に相当するマウスにおけるCfap43遺伝子のオルソログのエクソン35中の領域にガイドRNAを設計し、マウスCfap43遺伝子をノックアウトした。ATUM gRNA設計ツール（atum.bio/eCommerce/cas9/input）を用いて、シングルガイドRNAを設計した(5’-GATGGAGGACCTAAACCAGA-3’：配列番号９)。シングルガイドRNA、crRNA、及びtracrRNA（FASMAC社）を、顕微注入システムを用いて野生型受精卵に注入した。RNAを注入した後に、受精卵を胞胚の段階までインビトロで培養し、偽妊娠したレシピエントのメスの子宮に移植した。マウスの遺伝子型を確認するためにマウス由来のKOD FXネオポリメラーゼを用いてPCR増幅を行い、配列解析のために、産物をTベクター（タカラバイオ社）中にクローン化した。PCRのプライマーは、forwardが5’-GGGAAATAAGAAAAGAGTCATGGA-3’（配列番号１０）であり、reverseが5’-CACATGCTTTATCCAGGAGGA-3’（配列番号１１）であった。
２．ノックアウトマウスにおける欠失の確認
図３Ａは作製されたノックアウトマウスにおいて、Cfap43遺伝子のエクソン35で14塩基対が欠失していることを示す電気泳動図である。この欠失により未熟な停止コドンが作製され、Cfap43の切断が引き起こされた。図３Ｂは14塩基対の欠失により未熟な停止コドンが作製され、切断された機能欠損タンパク質がもたらされることを示している。
図３Ａは作製されたノックアウトマウスにおいて、Cfap43遺伝子のエクソン35で14塩基対が欠失していることを示す電気泳動図である。この欠失により未熟な停止コドンが作製され、Cfap43の切断が引き起こされた。図３Ｂは14塩基対の欠失により未熟な停止コドンが作製され、切断された機能欠損タンパク質がもたらされることを示している。
３．ノックアウトマウスにおけるCfap43 mRNA発現の検討
ノックアウトマウスの脳と気管において、フレームシフトしたCfap43 mRNAが発現していることを、RT-PCRにより確認した（図３Ｃ）。さらに変異したCfap43 mRNAの発現レベルが低いことが、定量的RT-PCRにより確認された（図３Ｄ）。
ノックアウトマウスの脳と気管において、フレームシフトしたCfap43 mRNAが発現していることを、RT-PCRにより確認した（図３Ｃ）。さらに変異したCfap43 mRNAの発現レベルが低いことが、定量的RT-PCRにより確認された（図３Ｄ）。
定量的RT-PCRは以下のプロトコールで行った。マウスの脳と気管から全RNAを抽出し、全RNAの1μgを、ReverTra Ace qPCR RT Master mix with gDNA Remover（東洋紡社）を用いてcDNAに変換した。50ngのcDNAを、THUNDERBIRD SYBRqPCR MiX（東洋紡社）を用いた増幅のための鋳型として用いて、10μLの反応液中でLightCycler 480 System II（ロッシュ社）で発現を定量化した。マウスGapdh（forward、5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’（配列番号１２）：reverse、5’-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3’（配列番号１３））を内部標準として使用し、以下のマウスqPCRプライマーを使用した。
forward、5’-AGGACAAAAGAAAGTTGCTAGCA-3’（配列番号１４）
reverse、5’- TCCAATCTGAATGGCAATCACA-3’（配列番号１５）
forward、5’-AGGACAAAAGAAAGTTGCTAGCA-3’（配列番号１４）
reverse、5’- TCCAATCTGAATGGCAATCACA-3’（配列番号１５）
定量的RT-PCRの結果は、ナンセンス変異により引き起こされたmRNAの分解が、未熟な終始コドンを有するmRNAのレベルを低下させたことを示している。更に交配マウスに由来するCfap43-/-の子孫の数が少ないことは、胚の死亡率又は成長の困難が、ホモ接合性の変異を有する子孫に生じたことを示唆している（表３）。
４．組織染色解析を用いたノックアウトマウスの検討
ヘマトキシリン・エオジン染色を用いて組織染色解析を行ったところ、Cfap43-/-マウスの脳において、第３脳室と側脳室が膨張していることが示された（図４Ａの上段）。更に側脳室、脈絡叢、及び気管の上皮細胞についてヘマトキシリン・エオジン染色を行ったところ、Cfap43-/-マウスは野生型マウスと大きな差を示さなかった（図４Ａの下段と図４Ｂ、図４Ｃ）。図４Ａの下段のCPは脈絡叢を表し、LVは側脳室を表す。精巣と精巣上体組織において、歪んだ精子鞭毛と過剰な細胞質が観察された（図４Ｃ）。Cfap43+/-マウスは、精巣と精巣上体のヘマトキシリン・エオジン染色において、野生型マウスと明らかな差を示さなかった。
ヘマトキシリン・エオジン染色を用いて組織染色解析を行ったところ、Cfap43-/-マウスの脳において、第３脳室と側脳室が膨張していることが示された（図４Ａの上段）。更に側脳室、脈絡叢、及び気管の上皮細胞についてヘマトキシリン・エオジン染色を行ったところ、Cfap43-/-マウスは野生型マウスと大きな差を示さなかった（図４Ａの下段と図４Ｂ、図４Ｃ）。図４Ａの下段のCPは脈絡叢を表し、LVは側脳室を表す。精巣と精巣上体組織において、歪んだ精子鞭毛と過剰な細胞質が観察された（図４Ｃ）。Cfap43+/-マウスは、精巣と精巣上体のヘマトキシリン・エオジン染色において、野生型マウスと明らかな差を示さなかった。
Cfap43-/-マウスの分子欠損の特徴をさらに検討するために、絨毛タンパク質を標的とした抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。過去にCfap43欠損マウスにおいて、精子の軸糸に幾つかのタンパク質が欠損していることが報告されている。免疫蛍光染色において、アセチル化されたチューブリン（繊毛の死亡率のマーカー、ac-tubulin）の数の減少が、Cfap43-/-マウスの脈絡叢において見出された（図５Ａ）。図５Ａで矢印はアセチル化されたチューブリンを示す。
更にCfap43-/-マウスの側脳室と気管の上皮細胞において、Spef2（軸糸中心対のマーカー）とRsph4a（ラジアルスポークのマーカー）の欠損が示された（図５Ｂ、図５Ｃ）。この免疫蛍光染色の結果は、Cfap43欠損マウスの繊毛には異常な複合タンパク質が存在することを示唆している。
更にTEM解析を行うことにより、Cfap43欠損マウスの気管上皮の繊毛の超微細構造の特徴をさらに解析した（図６）。TEM解析により、野生型の気管繊毛の断面に正常な９＋２の軸糸が見られた（図６のＡ～Ｃ）。一方Cfap43-/-においては異常な８＋２又は１０＋２の異常な末梢微小管が見られた（図６のＤ～Ｆ）。加えて野生型マウスでは複合繊毛は観察されなかったが、Cfap43-/-マウスにおいては複合繊毛が観察された（図６のＧ～Ｊ）。この結果は、家族性NPHを有する患者における鼻上皮における観察と一致している（図２Ｂ）。
本発明者らにより、CFAP43遺伝子の機能欠損変異がNPHの発症に関連していることが見出された。この知見を利用して、被験者においてCFAP43遺伝子の機能欠損変異を検出することにより、該被験者におけるNPHの発症リスクを評価することが可能となり、また、他の臨床検査のデータや症状と併せてその被験者の正常圧水頭症の診断を行うことも可能となる。本発明の方法は血液などの被験者のサンプルを用いて比較的に簡便に行える点で有利である。更に本発明の方法を認知症の予測診断に広く適用することも可能であり、高齢化社会で大きな問題となる認知症などのリスクの予測に役立てることもできる。
Claims (10)
- 被験者由来の試料中のＤＮＡにおけるＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５における機能喪失型変異の有無を検出し、当該ＣＦＡＰ４３遺伝子に機能喪失型変異を有する場合には正常圧水頭症を発症しやすく、当該ＣＦＡＰ４３遺伝子に機能喪失型変異を有さない場合には正常圧水頭症を発症し難いという基準と比較することにより、被験者の正常圧水頭症の発症しやすさを試験する方法。
- 前記機能喪失型変異が、ＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異である、請求項１に記載の方法。
- 前記被験者が、正常圧水頭症患者又はその疑いがある者である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記被験者が認知症を発症する、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が血液、血漿、血清又は唾液である、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
- ＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５を含む標的領域を増幅し得るＰＣＲプライマーセットと、
ＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５の特定の位置のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、及び該位置のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブと、
を含む、正常圧水頭症の発症リスクを評価するためのキット。 - 前記ヌクレオチドが、ヒトＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５の７５番目のヌクレオチドである、請求項６に記載のキット。
- ＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５において機能喪失型変異を有する、正常圧水頭症のモデル哺乳動物（但し、ヒト個体を除く）。
- 前記機能喪失型変異が、ＣＦＡＰ４３遺伝子のエクソン３５におけるナンセンス変異又はフレームシフト変異である、請求項８に記載の哺乳動物。
- 以下の工程を含む、正常圧水頭症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
（１）請求項８又は請求項９に記載の哺乳動物に被験物質を投与する工程、及び
（２）被験物質を投与しなかった対照群と比較して、正常圧水頭症の症状の進行が遅延するかあるいは症状が改善した場合に、該被験物質を正常圧水頭症の治療又は予防薬の候補物質として選別する工程
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Non-Patent Citations (3)
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| SPINA, S. and LAWS, S. M.，Insights into the pathogenesis of normal-pressure hydrocephalus，Neurology，2019年，Vol.92, No.20，p.933-934 |
| YOSHIURA, K.，Exome analysis of mendelian disorder and genetic analysis in the near future，医学のあゆみ，2013年，Vol.245, No.5，p.23-28 |
| 小野慎治，繊毛鞭毛関連タンパク遺伝子変異と水頭症および認知機能低下の関連性についての研究 [オンライン] ，2019年，インターネット：＜URL: https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-19K08050＞，[検索日2020.08.11] |
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